Способ оценки генетической полноценности сперматозоидов

Авторы патента:

Трофимов Александр Владимирович (RU)

Трофимов Владимир Александрович (RU)

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

Владельцы патента RU 2568845:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва" (RU)
Общество с ограниченной ответственностью "Генетико-селекционный исследовательский центр "Генология-МГУ" (RU)

Изобретение относится к области ветеринарии и животноводства и может быть использовано при искусственном осеменении для выявления генетически неполноценных сперматозоидов. Способ включает добавление в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления перекиси водорода в концентрации 0,5-1,0 мМоль с последующим выявлением и определением в сперматозоидах первичных морфологических признаков апоптоза, одноцепочечных разрывов и фрагментации ДНК, интенсивности процессов перекисного окисления липидов. При этом при выявлении низкого процента апоптотически гибнущих сперматозоидов до 10-15% достаточно яркого и выраженного свечения Гало, возрастания содержания ТБК-реактивных продуктов не более чем на 30-40% по отношению к контролю, оценивают сперматозоиды как генетически полноценные. Использование изобретения позволяет улучшить диагностику патологических нарушений в сперматозоидах на хроматиновом уровне.

Способ оценки генетической полноценности сперматозоидов

Известны различные способы оценки активности и прогнозирования оплодотворяющей способности спермы. В практике искусственного осеменения наибольшее применение получила оценка качества спермы по органолептическим признакам, концентрации, подвижности и переживаемости сперматозоидов [ABS Global, Inc. Руководство по искусственному осеменению. Пятое издание, 2002]. Также известны способы оценки качества спермы путем определения процента сперматозоидов с аномальной морфологией, осмотической резистентности, устойчивости (толерантности) к холодовому и другим видам стресса, содержания высокоэнергетических молекул, активности различных дегидрогеназ и гидролаз (гиалуронидазы, акрозина и другие) [Руководство ВОЗ для лабораторного исследования и обработки человеческой спермы, 2010]. Для выявления фертильности и аномальных сперматозоидов предложено определение статуса метилирования ДНК. Данный подход направлен на выявление эпигенетических нарушений в сперматозоидах, зависимых от многих факторов (в том числе, возраста), и требует применения сложной дорогостоящей аппаратуры и не может быть воспроизведен в зоотехнических и ветеринарных лабораториях [US Patent No. WO 2009059327, G01N 33/48, 30 December, 2009].

Одним из важнейших подходов к анализу генетической полноценности сперматозоидов является определение фрагментации (целостности) окрашенного хроматина/ДНК сперматозоидов путем измерения размера гало [Ferna′ndez J.L., Muriel L., Rivero M.T., Goyanes V., Va′zquez R. et al. // The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation // J. Androl., 2003; 24: 59-66].

Известен способ определения суммарной антиокислительной активности спермоплазмы для оценки оплодотворяющей способности сперматозоидов путем регистрации железо-индуцируемой хемилюминисценции модельной системы до и после добавления спермоплазмы [RU 2278382, МПК G01N 33/487, опубл. 20.06.2006 г.].

Недостатком известных способов является отсутствие комплексного подхода, позволяющего учесть широкий спектр нарушений в генетическом аппарате сперматозоидов, неоднозначность оценки генетического аппарата и целесообразности применения для искусственного осеменения.

Необходимость применения комплексного подхода к оценке генетической полноценности сперматозоидов обусловлена многообразием факторов, влияющих на структурно-функциональное состояние хроматина и, как следствие, на оплодотворяющую способность сперматозоидов, жизнеспособность и полноценность потомства. К их числу в первую очередь следует отнести: окислительные модификации ДНК, образование сшивок, одноцепочечные и двухцепочечные разрывы (фрагментация хроматина), обусловленные высоким уровнем свободнорадикальных процессов, включая перекисное окисление липидов и образование активных форм кислорода; стимуляцию и запуск процессов апоптоза в сперматозоидах.

При этом современные методы оценки патологических нарушений в сперматозоидах основаны на выявлении уже имеющихся клеточных и молекулярных дефектов, не позволяя выявлять «скрытые» нарушения, связанные с недостаточностью антиоксидантной и репарационной систем, что ограничивает возможности диагностики на генетическом уровне.

Технический результат заключается в повышении диагностики патологических нарушений в сперматозоидах на хроматиновом уровне посредством оценки генетической полноценности сперматозоидов и целесообразности дальнейшего их использования для оплодотворения.

Сущность изобретения заключается в том, что в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют перекись водорода в концентрации 0,5-1,0 мМоль с последующим выявлением в сперматозоидах первичных морфологических признаков апоптоза, одноцепочечных разрывов и фрагментации ДНК, интенсивности процессов перекисного окисления липидов. При выявлении низкого процента апоптотически гибнущих сперматозоидов до 10-15%, достаточно яркого и выраженного свечения Гало, возрастания содержания ТБК-реактивных продуктов не более чем на 30-40% по отношению к контролю, оценивают сперматозоиды как генетически полноценные.

Для оценки генетической полноценности сперматозоидов использован прием воздействия на сперматозоиды генотоксикантом, в качестве которого применяется перекись водорода, приводящая к окислительной модификации биомолекул (включая белки, липиды и ДНК). В высоких концентрациях и при продолжительном воздействии перекись водорода приводит к развитию окислительного стресса, сопровождающегося повреждением ДНК (образование сшивок, разрыв цепей), которые проявляются при наличии нарушений в репарационной системе клетки и недостаточности антиоксидантной системы.

Реакция сперматозоидов на действие перекиси водорода оценивается с помощью комплекса методик и сравнивается с аналогичными показателями сперматозоидов контрольной группы.

Первоначальный отбор генетически полноценных сперматозоидов может осуществляться путем обследования нативных, не подвергающихся влиянию перекиси водорода сперматозоидов контрольной группы. Изначально высокий процент гибнущих клеток и высокий апоптотический индекс (ниже 80%), фрагментация хроматина, высокое содержание ТБК-реактивных продуктов в сперматозоидах контрольной группы уже указывают на то, что в их геномах могут быть генетические нарушения, обусловленные недостаточной активностью антиоксидантной и репарационной систем дефектных сперматозоидов, то есть их можно отнести к генетически неполноценным.

При воздействии на сперматозоиды перекисью водорода величины показателей, определяемых с помощью комплекса методик и характеризующих проапоптическую активность, фрагментацию хроматина, интенсивность процессов перекисного окисления липидов может возрастать в пределах не более 10-20% от исходных величин. В этом случае сперматозоиды характеризуются как генетически полноценные, обладающие нормальной функциональной активностью.

Другой вариант реакции сперматозоидов на действие перекиси водорода заключается в том, что ответ клеток на воздействие генотоксиканта связан с резким повышением процента гибнущих клеток, усилением процессов фрагментации хроматина и активизацией перекисного окисления липидов, свидетельствующих о наличии генетических дефектов, обуславливающих генетическую неполноценность сперматозоидов.

Если концентрация перекиси водорода будет меньше 0,5 мМоль, то прооксидантное действие будет недостаточным для выявления генетической неполноценности сперматозоидов. Если концентрация перекиси водорода будет выше 1 мМоль, то вследствие повышения прооксидантной активности отмечается повышенная гибель сперматозоидов.

Способ осуществляется следующим образом. Для определения качества спермы исследования проводят при температуре 38-40°C. Полученный препарат спермы разбавляют в среде для разбавления и делят на две равные части. Одну пробу оставляют в нативном состоянии (контроль), а ко второй добавляют перекись водорода в концентрации 0,5-1,0 мМоль с последующим выявлением и определением в сперматозоидах, полученных образцов, с помощью комплекса методик структурно-функциональных изменений ядра и хроматина, одноцепочечных разрывов ДНК, уровня процессов перекисного окисления липидов. При оценке генетической полноценности сперматозоидов используются методики морфологической оценки структурного состояния ядра и хроматина с помощью флуоресцентного ядерного красителя Hoechst 33258, определяется фрагментация ДНК методом Гало, анализируется интенсивность перекисного окисления липидов с помощью ТБК-теста [Mikhailenko V.M., Philchenkov A.A. Analysis of 1Н NMR-detectable mobile lipid domains for assessment of apoptosis induced by inhibitors of DNA synthesis and replication // Cell Biology International, 2005, 29, 33-39; Fernandez J. L. The Sperm Chromatin Dispersion Test: A Simple Method for the Determination of Sperm DNA Fragmentation // Journal of Andrology. Volume 24, Issue 1, January-February, 2003, pages 59-66; Janero D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury // Free Radical Biology and Medicine. Volume 9, Issue 6, 1990, Pages 515-540].

Генетически полноценные сперматозоиды не имеют патологических аномалий и дефектов, характеризуются отсутствием или слабой степенью агглютинации, слабой склонностью к апоптозу (не более 10-15%), отсутствием разрывов в ДНК, ярким и выраженным свечением Гало, низким уровнем содержания ТБК-реактивных продуктов (0,24±0,05 мкМоль/л).

При действии перекиси водорода генетически полноценные сперматозоиды характеризуются высокой жизнеспособностью (количество гибнущих сперматозоидов возрастает в среднем на 20%), имеют достаточно яркое и выраженное свечение Гало, при этом содержание ТБК-реактивных продуктов возрастает не более чем на 30-40% по отношению к контролю.

Генетически неполноценные сперматозоиды могут иметь патологические аномалии и дефекты, склонны к индуцированному или спонтанному апоптозу, имеют высокую частоту встречаемости одноцепочечных разрывов в ДНК и менее яркое и выраженное свечение Гало, а также высокий уровень ТБК-реактивных продуктов, чем генетически полноценные сперматозоиды.

При действии перекиси водорода у генетически неполноценных сперматозоидов возрастает склонность к индуцированному апоптозу (процент гибнущих сперматозоидов возрастает на 50% и более), подавляется свечение Гало, отмечается резкое повышение содержания ТБК-реактивных продуктов на 50-80% и выше по отношению к контролю.

По сравнению с известными решениями предлагаемое позволяет повысить диагностику патологических нарушений в сперматозоидах на хроматиновом уровне посредством оценки генетической полноценности сперматозоидов и целесообразности дальнейшего их использования для оплодотворения.

Способ оценки генетической полноценности сперматозоидов, заключающийся в том, что в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют перекись водорода в концентрации 0,5-1,0 мМоль с последующим выявлением и определением в сперматозоидах первичных морфологических признаков апоптоза, одноцепочечных разрывов и фрагментации ДНК, интенсивности процессов перекисного окисления липидов, при этом при выявлении низкого процента апоптотически гибнущих сперматозоидов до 10-15% достаточно яркого и выраженного свечения Гало, возрастания содержания ТБК-реактивных продуктов не более чем на 30-40% по отношению к контролю, оценивают сперматозоиды как генетически полноценные.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования риска развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных ишемической болезнью сердца с ишемической и/или постинфарктной дисфункцией миокарда на фоне хронической сердечной недостаточности.

Неинвазивный способ диагностики степени фиброза печени // 2567846

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии, и может быть использовано в гепатологии и гастроэнтерологии для диагностики фибротических процессов печени.

Способ выделения личинок t.canis методом переваривания паренхимы легких и печени плотоядных животных // 2567845

(57) Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для посмертной диагностики токсокароза плотоядных животных. Способ включает отбор проб массой 50,0 г.

Способ прогноза тромбоцитопении у больных хроническим гепатитом с, получающих комбинированную противовирусную терапию // 2567818

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, и может быть использовано для прогноза тромбоцитопении у больных хроническим гепатитом С (ХГС) в результате проведения комбинированной противовирусной терапии (КПТ).

Способ оценки эффективности антибактериальной терапии при диализном перитоните // 2567732

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ оценки эффективности антибактериальной терапии при диализном перитоните, включающий введение антибактериальных препаратов в пакет с диализным раствором с последующим введением в брюшную полость, морфологическое исследование диализата, отличающийся тем, что после проведения цикла обмена диализирующего раствора проводят исследование диализата методом клиновидной дегидратации, при этом диализат центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10-15 минут и отбирают 2 пробы - первую из верхней половины пробирки, вторую - из нижней, выявляют структуру кристаллов солей в диализате и при наличии линейных кристаллов в центральной зоне фаций обеих проб оценивают эффективность терапии как удовлетворительную и не требующую ее продолжения, при наличии линейных кристаллов только в первой пробе оценивают эффективность терапии как удовлетворительную и требующую ее продолжения, при их отсутствии - как неудовлетворительную.

Способ определения глубины залегания липидных ядер атеросклеротических бляшек методом ик-фурье спектроскопии // 2567729

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения глубины залегания липидных ядер, являющихся центром атеросклеротических бляшек. Изобретение представляет способ определения глубины залегания липидных ядер атеросклеротических бляшек методом ИК-Фурье спектроскопии, заключающийся в том, что подготавливаются срезы атеросклеротически измененного участка сосудистого русла, записываются инфракрасные спектры пропускания подготовленных срезов, идентифицируются характеристические пики поглощения, отличающийся тем, что определяется срез, имеющий максимальное поглощение в диапазоне 1720-1760 см-1, соответствующем валентным колебаниям связей C=O сложных эфиров холестерина, который отвечает глубине залегания липидного ядра.

Способ определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека методом иммуноферментного анализа // 2567724

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности иммунологии, и предназначено для определения аутоантител к прогестерону в сыворотке и плазме крови человека.

Способ получения подложек с мнонослойным покрытием на основе полиэлектролитных микрокапсул, содержащих биологически активные материалы // 2567320

Изобретение относится к способу получения многослойных покрытий на основе полиэлектролитных микрокапсул, содержащих биологически активные материалы, для применения в областях диагностики и медицины.

Способ оценки подавляющего действия цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации на активность цитохромоксидазы в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, приводящей к нарастанию числа ядер в состоянии апоптоза // 2567042

Изобретение относится к медицине, а именно к способу оценки угрозы гибели ворсинок плаценты и неполноценного развития плода при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации.

Способ прогнозирования степени риска развития инфекционно-воспалительных заболеваний у новорожденных, рожденных от матерей с внутриутробной инфекцией // 2567037

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и перинатологии, может быть использовано для прогнозирования развития инфекционно-воспалительных заболеваний у новорожденных.

Способ определения оксима пиностробина в плазме крови // 2568876

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано для количественного определения оксима пиностробина в плазме крови. Для этого проводят определение оксима пиностробина в плазме крови методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии с использованием смеси плазмы крови с оксимом пиностробина и внутреннего стандарта - вещества, близкого по строению молекулы к анализируемому веществу. Разделение продуктов проводят методом обращенно-фазной хроматографии на колонке размером 4,6×100 мм, термостатируемой при 30°C, скорость элюирования 0,5 мл/мин. В качестве элюента используют смесь 10 мМ ацетата аммония и ацетонитрила в соотношении 10:90 соответственно. Пик оксима пиностробина детектируют по иону с m/z 269.10, образующемуся в результате фрагментации иона оксима пиностробина с m/z 286.10, а его концентрацию рассчитывают по формуле: Coxime=2,073299×RS, где Coxime - концентрация оксима пиностробина (мкг/мл); RS - отношение площади хроматографического пика оксима пиностробина к площади пика внутреннего стандарта. Изобретение обеспечивает метод количественного определения оксима пиностробина в плазме крови для использования в экспериментальной и клинической фармакокинетике. 2 табл., 6 ил.

Компенсация невязки для биодатчика // 2568884

Группа изобретений относится к анализу биологических жидкостей с помощью биосенсорных систем. Способ определения концентрации анализируемого вещества в образце включает: генерацию выходного сигнала, соответствующего концентрации анализируемого вещества в образце и входному сигналу; компенсацию выходного сигнала с помощью основной функции и первой функции невязки для определения скомпенсированного выходного сигнала, причем основная функция предназначена для компенсации основной ошибки в выходном сигнале, а первая функция невязки предназначена для компенсации оставшейся ошибки в выходном сигнале; и определение концентрации анализируемого вещества в образце по скомпенсированному выходному сигналу. Также описана биосенсорная система аналогичного назначения. Достигается повышение точности и надежности анализа. 2 н. и 28 з.п. ф-лы, 25 ил., 8 табл.

Укупорка реакционных кювет для биоаффинных исследований // 2568885

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для укупорки реакционных кювет, содержащих высушенные реагенты для биоаффинных исследований. Система (20) для биоанализа содержит картридж (4) для биоанализа с реакционной камерой (6) и прокалываемую герметичную крышку (2). Крышка (2) содержит верхний слой (8), средний слой (10), нижний слой (12) и места (14), предназначенные для прокалывания. Крышка (2) имеет в местах (14), предназначенных для прокалывания, полость (18) между верхним слоем (8) и нижним слоем (12), причем верхний слой (8) герметичен до прокалывания, а нижний слой (12) предварительно надрезан так, что при прокалывании иглой прокол не является газонепроницаемым, а позволяет газу свободно вытекать из реакционной камеры (6), и упомянутый слой (12) обеспечивает плотное смыкание следа иглы после отведения упомянутой иглы. Изобретение позволяет исключить перекрестное загрязнение, вызванное случайными переливами или испарением реагента. 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 пр.

Способ оценки анаболического действия лекарственных препаратов // 2568903

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, гистологии и патологической анатомии, и может быть использовано для оценки анаболического действия лекарственных препаратов. Сущность заявляемого способа заключается в том, что дополнительно определяют интенсивность биосинтетических процессов в миосимпластах путем подсчета среднего количества гранул серебра на 1 ядро и определения процентного содержания ядер с 1, 2, 3 и более гранулами, на основании которого делают заключение об анаболическом действии лекарственных препаратов. Осуществление изобретения обеспечивает повышение точности морфологической оценки анаболического действия лекарственных препаратов за счет применения комплекса современных методов исследования (гистологического, гистохимического и морфометрического). Заявляемый способ обладает высокой точностью, прост в применении, эффективен и легко выполним в любой гистологической лаборатории. 2 пр.

Способ прогнозирования перинатального поражения цнс у недоношенных новорожденных // 2568914

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования перинатального поражения ЦНС у недоношенных новорожденных, включающий исследование биологического материала, отличающийся тем, что в 10% гомогенате плаценты, взятой сразу после преждевременных родов, методом капиллярного электрофореза определяют содержание глутамата и агматина, рассчитывают их соотношение и при величине коэффициента, равного 1,70 и ниже, прогнозируют перинатальное поражение ЦНС у недоношенных новорожденных. Осуществление изобретения позволяет повысить точность прогнозирования перинатального поражения ЦНС у недоношенных новорожденных. 2 пр.

Способ прогнозирования перинатального поражения цнс у недоношенных новорожденных // 2568914

Способ прогнозирования ишемически-геморрагических церебральных осложнений у новорожденных из группы высокого перинатального риска // 2568915

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования ишемически-геморрагических церебральных осложнений у новорожденных. Сущность способа состоит в том, что в пуповинной крови определяют уровни 6-keto-простагландина F1α (6-KetoPGF-1α) и тромбоксана В2 (ТХВ2) и рассчитывают их соотношение К=6-KetoPGF-1α/TXB2. При значении коэффициента К равном 0,04 и менее прогнозируют возникновение ишемически-геморрагических церебральных осложнений. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность прогнозирования ишемически-геморрагических церебральных осложнений у новорожденных из группы высокого перинатального риска. 2 пр.

Сканирующий цитометр // 2569053

Изобретение относится к области исследования и анализа биологических материалов и касается способа для подсчета биологических объектов в пробе и сканирующего цитометра на его основе. Для осуществления подсчета биологических объектов пробу помещают в прямоугольный капилляр, выполненный с возможностью отражения сигнала флуоресценции от верхней поверхности прямоугольного капилляра. Дополнительный сбор сигнала флуоресценции обеспечивают с помощью параболического отражателя, в фокусе которого устанавливают исследуемую зону капилляра, при этом смену исследуемых зон с биологическими объектами осуществляют за счет перемещения капилляра вдоль его оси. Детектируемый световой поток разделяют по длине волны и направляют на первый и второй фотоумножители, выходные сигналы которых пропорциональны световому потоку и сигналу флуоресценции. С выхода фотоумножителей сигналы поступают на амплитудный и фазовый преобразователи для одновременной обработки и последующего перемножения массивов данных, полученных с выходов амплитудного и фазового преобразователей сигналов в микропроцессоре. Технический результат заключается в повышении точности и упрощении способа измерений, а также в уменьшении габаритов и повышении мобильности устройства. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 4 ил.

Способ определения провоспалительных и проаллергических интерлейкинов в назальном секрете у детей раннего и дошкольного возраста для диагностики этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов // 2569054

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ диагностики этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов у детей раннего и дошкольного возраста, включающий определение в назальном секрете провоспалительных и проаллергических интерлейкинов, а именно интерлейкина-1-бэта (IL-1beta), интерлейкина-4 (IL-4), рецепторного антагониста интерлейкина-1 (IL-1RA), интерферона-альфа (INF-alpha) и фактора некроза опухоли - альфа (TNF-alpha), отличающийся тем, что увеличение содержания INF-alpha, TNF-alpha и IL-1beta более чем в 2 раза по отношению к нормальным значениям является диагностическим критерием вирусной этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов, а увеличение содержания IL-4 выше 26 нг/мл и IL-1RA выше 1000 нг/мл является диагностическим критерием для инфекционно-аллергической этиологии рецидивирующих острых ринофарингитов и аденоидитов. Осуществление изобретения обеспечивает повышение эффективности диагностики. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл., 2 пр.

Повышающие точность влагопоглотители // 2569753

Группа изобретений относится к электрохимическим датчикам и может быть использована для определения концентрации аналита в образце. Биосенсорная система включает в себя множество тестовых датчиков, контейнер. При этом каждый тестовый датчик включается в себя по меньшей мере два проводника и композицию реагентов, а контейнер содержит влагопоглотитель, поддерживающий остаточный уровень влаги. Данная биосеснорная система позволяет измерить концентрацию аналита с систематической ошибкой в пределах ±10 мг/дл или ±10%. Также раскрывается биосенсорная система, позволяющая сохранить по меньшей мере 75% активности окислительно-восстановительного фермента. Группа изобретений обеспечивает повышение срока годности биосенсора, повышение точности, воспроизводимости анализа, а также уменьшение времени его проведения. 2 н. и 23 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл.