Способ определения микробиологической чистоты фармацевтической субстанции, произведенной биотехнологическим путем
Владельцы патента RU 2596399:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к фармацевтике и микробиологии. Способ определения микробиологической чистоты фармацевтической субстанции предусматривает подготовку образца фармацевтической субстанции путем разбавления его в триптиказо-соевом бульоне или среде №8. Проводят посев образца на жидкую накопительную селективную среду с последующим инкубированием на ней. Проводят пересев на диагностические питательные среды с последующей биохимической идентификацией выделенных микроорганизмов. Изобретение позволяет повысить точность определения микробиологической чистоты и сократить время анализа фармацевтических субстанций биотехнологического происхождения по показателю «Микробиологическая чистота» и количество используемого образца. 6 пр.
Изобретение относится к методам измерения или испытания, использующим жизнеспособные микроорганизмы, и касается способа определения микробиологической чистоты фармацевтических субстанций, произведенных биотехнологическими методами.
Наиболее близким к заявленному является способ определения микробиологической чистоты лекарственных средств [1], который позволяет количественно определять жизнеспособные клетки бактерий и грибов по их способности размножаться и образовывать колонии на плотной питательной среде. При этом каждая колония является результатом размножения одной клетки. Для выявления отдельных видов патогенных микроорганизмов используют комплекс жидких и плотных питательных сред, соответствующих специфическим потребностям определяемых микроорганизмов, а также биохимические тесты для их идентификации.
Способ включает стадии:
- пробоподготовка образца лекарственного средства (не менее 20 г);
- добавление 10 г образца к 100 мл лактозного бульона, с последующей инкубацией в течение 2-5 ч;
- пересев количества, соответствующего 1 г лекарственного средства, на жидкую накопительную селективную среду для выделения энтеробактерий;
- добавление оставшихся 10 г измельченного образца к 100 мл фосфатно-буферного раствора и посев в 4 чашки Петри, а также в жидкую неселективную накопительную среду для определения патогенных бактерий;
- инкубация посевов с питательными средами для выделения бактерий при температуре (32,5±2,5)°С, для выращивания дрожжевых и плесневых грибов - при температуре (22,5±2,5)°С;
- пересев на диагностические питательные среды;
- микроскопическое исследование;
- биохимическая идентификация выделенных микроорганизмов;
- количественный и качественный учет результатов.
К недостаткам данного способа определения микробиологической чистоты биотехнологических лекарственных средств относятся неточность, длительность проведения анализа, значительное количество образца для испытания.
Между совокупностью существенных признаков заявляемого способа и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, а именно: использование триптиказо-соевого бульона или питательной среды №8 в качестве универсального разбавителя (растворителя) и среды для культивирования уменьшенного количества лекарственного средства позволяет:
- повысить точность - за счет увеличения количества параллельных измерений (10 чашек Петри для определения аэробных бактерий и грибов),
- сократить время анализа - за счет исключения стадии предварительной инкубации.
Предлагаемое техническое решение отличается от известного [1] тем, что на стадии пробоподготовки используется уменьшенное количество образца. Для количественного определения жизнеспособных бактерий и микроскопических (дрожжевых и плесневых) грибов лекарственное средство разбавляют фосфатно-буферным раствором, а для выделения отдельных видов патогенных бактерий - неселективной питательной средой. Для количественного определения используют 10 чашек Петри.
Задачей изобретения является повышение точности количественного определения микроорганизмов, сокращение времени анализа и количества образца для оценки качества по показателю «Микробиологическая чистота».
Поставленная задача решается благодаря применению неселективной питательной среды в качестве разбавителя уменьшенного количества образца при определении отдельных видов патогенных бактерий.
Питательные среды, описанные в [1], являются универсальными, свободными от ингибиторов и индикаторов, предназначенными для широкого спектра микробиологических задач. Богатая питательная основа данных сред подходит для культивирования большинства микроорганизмов, в том числе требовательных к условиям роста.
Предложенное изменение позволяет повысить точность результата, сократить время анализа фармацевтических субстанций биотехнологического происхождения по показателю «Микробиологическая чистота» и количество используемого образца.
Сущность предложенного изобретения заключается в следующем:
- образец в количестве 1 г разбавляют в 10 мл фосфатно-буферного раствора;
- полученные 10 мл используют для количественного определения аэробных бактерий и микроскопических грибов, производя посев в 10 стерильных чашек Петри (по 1 мл в каждую), 5 из которых заливают плотной питательной средой для выращивания бактерий, оставшиеся - средой для выращивания дрожжевых и плесневых грибов;
- образец в количестве 2 г разбавляют 20 мл триптиказо-соевого бульона или среды №8.
- 10 мл разведения переносят в 90 мл бульона Мосселя или среды №3 для выделения энтеробактерий;
- оставшиеся 10 мл разведения используют для выделения P.aeruginosa и S.aureus.
Стадию инкубации и последующие операции выполняют так же, как в известном способе [1].
Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение точности, уменьшение объема пробы и расширение арсенала способов оценки качества фармацевтических субстанций, произведенных биотехнологическими методами, по показателю «Микробиологическая чистота».
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.
Средства и методы.
При доказательстве возможности определения микробиологической чистоты фармацевтических субстанций, применяемых для производства стерильных препаратов, использовали:
1. Тест-штаммы микроорганизмов:
- Candida albicans АТСС 10231,
- Escherichia coli АТСС 8739,
- Bacillus subtilis АТСС 6633,
- Aspergillus brasiliensis АТСС 16404,
- Staphylococcus aureus ATCC 6538,
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027.
2. Питательные среды:
2.1. производства фирмы «Биомерье», Франция
- триптиказо-соевый агар;
- триптиказо-соевый бульон;
- агар Сабуро;
- бульон Мосселя;
- агар Мосселя;
- агар Берда-Паркера;
- цетримидный агар.
2.2. производства ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (п. Оболенск, Россия):
- среда №1 ГРМ;
- среда №2 ГРМ (Сабуро);
- среда для выделения энтеробактерий (агар Эндо ГРМ);
- среда №8 ГРМ;
- среда №3 ГРМ;
- среда №9 ГРМ;
- среда №10 ГРМ.
3. Реактивы: фосфатно-буферный раствор (рН 7,0), раствор натрия хлорида 0,9%.
4. Расходные материалы: стерильные пробирки биологические; пипетки серологические 1, 5, 10 мл; флаконы стерильные одноразовые 125 мл; чашки Петри 90 мм стерильные одноразовые.
5. Аттестованное и проверенное оборудование: инкубаторы фирмы Binder (Германия), ламинарный шкаф класс II тип А2 фирмы Labconco (США), счетчик колоний Scan 100 фирмы Interscience (Франция).
При доказательстве возможности применения заявляемого изобретения проводили расчет коэффициента восстановления (R) микроорганизмов по формуле (1):
N - количество колоний, выделенных в ходе анализа (КОЕ);
N0 - количество внесенных клеток микроорганизмов (КОЕ).
Пример 1. Определение микробиологической чистоты субстанции ритуксимаб, растворенной в триптиказо-соевом бульоне, инокулированной смесью тест-штаммов в количестве 50 КОЕ/г каждого микроорганизма.
Отбирали 3 г вещества. Образец растворяли в 30 мл триптиказо-соевого бульона. Вносили тест-штаммы в количестве 50 КОЕ/г каждого микроорганизма.
Из инокулированного образца отбирали 10 мл и переносили в бульон Мосселя.
10 мл подготовленного образца вносили в 10 чашек Петри (по 1 мл в каждую), 5 из которых заливали 10-15 мл триптиказо-соевого агара - для определения содержания аэробных микроорганизмов, а 5 оставшихся - 10-15 мл агара Сабуро для выделения дрожжевых и плесневых грибов.
Посевы на бульоне Мосселя, а также оставшиеся 10 мл раствора образца инкубировали при температуре (32,5±2.5)°С течение 48 ч. Чашки Петри, залитые триптиказо-соевым агаром и агаром Сабуро, инкубировали в течение 120 ч при температурах (32,5±2.5)°С и (22,5±2.5)°С соответственно.
После инкубации на агаризованных питательных средах подсчитывали количество колоний микроорганизмов и рассчитывали коэффициент восстановления выделенных микроорганизмов.
Из бульона Мосселя бактериологической петлей производили пересев на агар Мосселя, инкубировали в течение 48 ч при температуре (32,5±2.5)°С, после чего наблюдали типичный рост колоний энтеробактерий (Escherichia coli).
По истечении периода инкубации посевов в 10 мл триптиказо-соевого бульона бактериологической петлей производили пересев на агар Берда-Паркера и цетримидный агар для определения Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa соответственно, инкубировали в течение 48 ч при температуре (32,5±2.5)°С, после чего наблюдали рост колоний указанных микроорганизмов.
Результат: в процессе испытания было проведено количественное определение бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, которыми был инокулирован образец фармацевтической субстанции ритуксимаба. Коэффициент восстановления аэробных микроорганизмов составил 82%, дрожжевых и плесневых грибов - 76%. С применением предлагаемого способа из контаминированного лекарственного средства были выделены энтеробактерии, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Пример 2. Определение микробиологической чистоты фармацевтической субстанции инсулин гларгин, растворенного в среде №8 ГРМ, инокулированного смесью тест-штаммов в количестве 50 КОЕ/г каждого микроорганизма.
Отбирали 3 г вещества. Образец растворяли в жидкой питательной среде №8 ГРМ. Вносили тест-штаммы в количестве 50 КОЕ/г каждого микроорганизма. Из инокулированного образца отбирали 10 мл и переносили в среду №3 ГРМ для обогащения энтеробактерий.
10 мл подготовленного образца субстанции инсулин гларгин вносили в 10 чашек Петри (по 1 мл в каждую), 5 из которых заливали 10-15 мл среды №1 ГРМ - для определения содержания аэробных микроорганизмов, а 5 оставшихся - 10-15 мл среды №2 ГРМ для выделения дрожжевых и плесневых грибов.
Посевы на среде №3 ГРМ, а также оставшиеся 10 мл раствора образца инкубировали при температуре (32,5±2.5)°С в течение 48 ч. Чашки Петри, залитые средами №1 ГРМ и №2 ГРМ, инкубировали в течение 120 ч при температурах (32,5±2.5)°С и (22,5±2.5)°С соответственно.
После инкубации на агаризованных питательных средах подсчитывали количество колоний микроорганизмов и рассчитывали коэффициент восстановления выделенных микроорганизмов.
Из среды №3 ГРМ бактериологической петлей производили пересев на агар Эндо, инкубировали в течение 48 ч при температуре (32,5±2.5)°С, после чего наблюдали типичный рост колоний энтеробактерий (Escherichia coli).
По истечении периода инкубации посевов в 10 мл среды №8 ГРМ бактериологической петлей производили пересев на питательные среды №10 ГРМ и №9 ГРМ для определения Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa соответственно, инкубировали в течение 48 ч при температуре (32,5±2.5)°С, после чего наблюдали рост колоний указанных микроорганизмов.
Результат: в процессе испытания было проведено количественное определение бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, которыми был инокулирован образец фармацевтической субстанции инсулин гларгин. Коэффициент восстановления аэробных микроорганизмов составил 78%, дрожжевых и плесневых грибов - 90%. С применением предлагаемого способа из контаминированного лекарственного средства были выделены энтеробактерий, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Пример 3. Определение микробиологической чистоты фармацевтической субстанции инсулин лизпро, растворенного в триптиказо-соевом бульоне, инокулированного смесью тест-штаммов в количестве 5 КОЕ/г каждого микроорганизма.
Отбирали 3 г вещества. Образец растворяли в 30 мл триптиказо-соевого бульона. Вносили тест-штаммы в количестве 5 КОЕ/г каждого микроорганизма. Из инокулированного образца отбирали 10 мл и переносили в бульон Мосселя.
10 мл подготовленного образца вносили в 10 чашек Петри (по 1 мл в каждую), 5 из которых заливали 10-15 мл триптиказо-соевого агара - для определения содержания аэробных микроорганизмов, а 5 оставшихся - 10-15 мл агара Сабуро для выделения дрожжевых и плесневых грибов.
Посевы на бульоне Мосселя, а также оставшиеся 10 мл раствора образца инкубировали при температуре (32,5±2.5)°С в течение 48 ч. Чашки Петри, залитые триптиказо-соевым агаром и агаром Сабуро, инкубировали в течение 120 ч при температурах (32,5±2.5)°С и (22,5±2.5)°С соответственно.
После инкубации на агаризованных питательных средах подсчитывали количество колоний микроорганизмов и рассчитывали коэффициент восстановления выделенных микроорганизмов.
Из бульона Мосселя бактериологической петлей производили пересев на агар Мосселя, инкубировали в течение 48 ч при температуре (32,5±2.5)°С, после чего наблюдали типичный рост колоний энтеробактерий (Escherichia coli).
По истечении периода инкубации посевов в 10 мл триптиказо-соевого бульона бактериологической петлей производили пересев на агар Берда-Паркера и цетримидный агар для определения Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa соответственно, инкубировали в течение 48 ч при температуре (32,5±2.5)°С, после чего наблюдали рост колоний указанных микроорганизмов.
Результат: в процессе испытания было проведено количественное определение бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, которыми был инокулирован образец фармацевтической субстанции инсулин лизпро. Коэффициент восстановления аэробных микроорганизмов составил 59%, дрожжевых и плесневых грибов - 63%. С применением предлагаемого способа из контаминированного лекарственного средства были выделены энтеробактерий, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Пример 4. Определения микробиологической чистоты фармацевтической субстанции ритуксимаб, растворенного в среде №8 ГРМ, инокулированного смесью тест-штаммов в количестве 5 КОЕ/г каждого микроорганизма.
Отбирали 3 г вещества. Образец растворяли в жидкой питательной среде №8 ГРМ. Вносили тест-штаммы в количестве 5 КОЕ/г каждого микроорганизма. Из инокулированного образца отбирали 10 мл и переносили в среду №3 ГРМ для обогащения энтеробактерий.
10 мл подготовленного образца субстанции инсулин гларгин вносили в 10 чашек Петри (по 1 мл в каждую), 5 из которых заливали 10-15 мл среды №1 ГРМ - для определения содержания аэробных микроорганизмов, а 5 оставшихся - 10-15 мл среды №2 ГРМ для выделения дрожжевых и плесневых грибов.
Посевы на среде №3 ГРМ, а также оставшиеся 10 мл раствора образца инкубировали при температуре (32,5±2.5)°С в течение 48 ч. Чашки Петри, залитые средами №1 ГРМ и №2 ГРМ, инкубировали в течение 120 ч при температурах (32,5±2.5)°С и (22,5±2.5)°С соответственно.
После инкубации на агаризованных питательных средах подсчитывали количество колоний микроорганизмов и рассчитывали коэффициент восстановления выделенных микроорганизмов.
Из среды №3 ГРМ бактериологической петлей производили пересев на агар Эндо, инкубировали в течение 48 ч при температуре (32,5±2.5)°С, после чего наблюдали типичный рост колоний энтеробактерий (Escherichia coli).
По истечении периода инкубации посевов в 10 мл среды №8 ГРМ бактериологической петлей производили пересев на питательные среды №10 ГРМ и №9 ГРМ для определения Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa соответственно, инкубировали в течение 48 ч при температуре (32,5±2.5)°С, после чего наблюдали рост колоний указанных микроорганизмов.
Результат: в процессе испытания было проведено количественное определение бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, которыми был инокулирован образец фармацевтической субстанции ритуксимаб. Коэффициент восстановления аэробных микроорганизмов составил 93%, дрожжевых и плесневых грибов - 62%. С применением предлагаемого способа из контаминированного лекарственного средства были выделены энтеробактерий, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Пример 5. Определение микробиологической чистоты фармацевтической субстанции инсулин лизпро, растворенного в среде №8 ГРМ, инокулированного смесью тест-штаммов в количестве 50 КОЕ/г каждого микроорганизма.
Отбирали 3 г вещества. Образец растворяли в жидкой питательной среде №8 ГРМ. Вносили тест-штаммы в количестве 50 КОЕ/г каждого микроорганизма. Из инокулированного образца отбирали 10 мл и переносили в среду №3 ГРМ для обогащения энтеробактерий.
10 мл подготовленного образца субстанции инсулин лизпро вносили в 10 чашек Петри (по 1 мл в каждую), 5 из которых заливали 10-15 мл среды №1 ГРМ - для определения содержания аэробных микроорганизмов, а 5 оставшихся - 10-15 мл среды №2 ГРМ для выделения дрожжевых и плесневых грибов.
Посевы на среде №3 ГРМ, а также оставшиеся 10 мл раствора образца инкубировали при температуре (32,5±2.5)°С в течение 48 ч. Чашки Петри, залитые средами №1 ГРМ и №2 ГРМ, инкубировали в течение 120 ч при температурах (32,5±2.5)°С и (22,5±2.5)°С соответственно.
После инкубации на агаризованных питательных средах подсчитывали количество колоний микроорганизмов и по формуле (1) рассчитывали коэффициент восстановления выделенных микроорганизмы.
Из среды №3 ГРМ бактериологической петлей производили пересев на агар Эндо, инкубировали в течение 48 ч при температуре (32,5±2.5)°С, после чего наблюдали типичный рост колоний энтеробактерий (Escherichia coli).
По истечении периода инкубации посевов в 10 мл среды №8 ГРМ бактериологической петлей производили пересев на питательные среды №10 ГРМ и №9 ГРМ для определения Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa соответственно, инкубировали в течение 48 ч при температуре (32,5±2.5)°С, после чего наблюдали рост колоний указанных микроорганизмов.
Результат: в процессе испытания было проведено количественное определение бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, которыми был инокулирован образец фармацевтической субстанции инсулин лизпро. Коэффициент восстановления аэробных микроорганизмов составил 70%, дрожжевых и плесневых грибов - 73%. С применением предлагаемого способа из контаминированного лекарственного средства были выделены энтеробактерий, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Пример 6. Определение микробиологической чистоты фармацевтической субстанции инсулин гларгин, растворенного в триптиказо-соевом бульоне, инокулированного смесью тест-штаммов в количестве 5 КОЕ/г каждого микроорганизма.
Отбирали 3 г вещества. Образец растворяли в 30 мл триптиказо-соевого бульона. Вносили тест-штаммы в количестве 5 КОЕ/г каждого микроорганизма. Из инокулированного образца отбирали 10 мл и переносили в бульон Мосселя.
10 мл подготовленного образца вносили в 10 чашек Петри (по 1 мл в каждую), 5 из которых заливали 10-15 мл триптиказо-соевого агара - для определения содержания аэробных микроорганизмов, а 5 оставшихся - 10-15 мл агара Сабуро для выделения дрожжевых и плесневых грибов.
Посевы на бульоне Мосселя, а также оставшиеся 10 мл раствора образца инкубировали при температуре (32,5±2.5)°С в течение 48 ч. Чашки Петри, залитые триптиказо-соевым агаром и агаром Сабуро, инкубировали в течение 120 ч при температурах (32,5±2.5)°С и (22,5±2.5)°С соответственно.
После инкубации на агаризованных питательных средах подсчитывали количество колоний микроорганизмов и по формуле (1) рассчитывали коэффициент восстановления выделенных микроорганизмов.
Из бульона Мосселя бактериологической петлей производили пересев на агар Мосселя, инкубировали в течение 48 ч при температуре (32,5±2.5)°С, после чего наблюдали типичный рост колоний энтеробактерий (Escherichia coli).
По истечении периода инкубации посевов в 10 мл триптиказо-соевого бульона бактериологической петлей производили пересев на агар Берда-Паркера и цетримидный агар для определения Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa соответственно, инкубировали в течение 48 ч при температуре (32,5±2.5)°С, после чего наблюдали рост колоний указанных микроорганизмов.
Результат: в процессе испытания было проведено количественное определение бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, которыми был инокулирован образец фармацевтической субстанции инсулин гларгин. Коэффициент восстановления аэробных микроорганизмов составил 90%, дрожжевых и плесневых грибов - 64%. С применением предлагаемого способа из контаминированного лекарственного средства были выделены энтеробактерий, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Сопоставительный анализ предлагаемого решения с существующим методом показывает, что изобретение позволяет объективно, точно и быстро провести качественное и количественное определение микроорганизмов, предусмотренное требованиями нормативной документации.
Литература
1. Государственная фармакопея РФ XII изд. Часть 1. М.: Медицина, 2007: 704.
Способ определения микробиологической чистоты фармацевтической субстанции, произведенной биотехнологическим путем, включающий пробоподготовку образца фармацевтической субстанции; пересев и инкубирование на жидкой накопительной селективной среде, пересев на диагностические питательные среды с последующей биохимической идентификацией выделенных микроорганизмов, отличающийся тем, что при пробоподготовке образца фармацевтической субстанции в качестве разбавителя используют триптиказо-соевый бульон или среду № 8.
