Комбинация сиросингопина и митохондриальных ингибиторов для лечения рака и для иммуносупрессии
Группа изобретений относится к медицине, фармакологии, фармацевтике и включает фармацевтическую композицию и комбинацию сиросингопина (СС) и митохондриального ингибитора (МИ), где указанный митохондриальный ингибитор представляет собой метформин или фенформин. Соотношение количеств (мас./мас.) СС и МИ может составлять от 1 к 10 до 1 к 1000. Данная комбинация может быть применена при лечении таких видов рака, как карцинома, саркома, лейкоз, миелома, лимфома, различные типы рака нервной системы, или аутоиммунных заболеваний кожи, нервной системы, соединительной ткани, мышц, кроветворной системы, костной ткани и внутренних органов, в качестве иммуносуппрессорной терапии. Группа изобретений также включает способ определения, является ли раковая клетка чувствительной к лечению СС. Для этого (а) получают суспензию одиночных клеток, культивируют раковые клетки в приемлемых средах, (б) инкубируют раковую клетку с СС, (в) инкубируют раковую клетку, полученную на стадии (б), с положительно заряженным флуоресцентным красителем, (г) измеряют интенсивность возбужденной флуоресценции и (д) сравнивают интенсивность флуоресценции, измеренную на стадии (г), с интенсивностью флуоресценции раковой клетки, которую инкубировали только с положительно заряженным флуоресцентным красителем. При этом относительное увеличение интенсивности флуоресценции раковых клеток, предварительно инкубированных с СС, свидетельствует, что клетки чувствительны к обработке СС. Группа изобретений также включает способ лечения рака или аутоиммунного заболевания путем введения теплокровному животному комбинации или композиции СС и указанного МИ в количестве, эффективном в отношении указанного заболевания. Упомянутые комбинации и композиции обеспечивают при использовании синергетический эффект в отношении упомянутых нарушений, прогноз которого, в свою очередь, может быть обеспечен реализацией указанного способа прогнозирования чувствительности раковой клетки к СС. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 пр., 1 табл.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина или олигомицина, и применению комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора для лечения рака и для достижения клинической иммуносупрессии.
Предпосылки создания изобретения
Для противораковой терапии применяют комбинацию терапевтических вмешательств, таких как хирургия, лучевая терапия и химиотерапия. Хирургию и лучевую терапию, как правило, применяют локально в отношении основной области, в которой происходит рост опухоли, а химиотерапию используют для предупреждения повторного роста опухоли или в отношении удаленных опухолевых очагов. Химиотерапевтические средства применяют также для снижения роста опухолей с целью контроля развития болезни, когда не применяют лучевую терапию или хирургию.
Иммунодепрессанты применяют в клинических условиях для подавления патологической иммунной реакции, мишенью которой является собственный организм (аутоиммунитет), или иммунных гиперреакций, наблюдаемых при аллергии. Их применяют также для лечения отторжения трансплантата, вызываемого иммунной системой. Основой иммунных ответов является активация и пролиферация Т-клеток после антигенной стимуляции, которые в свою очередь действуют в качестве клеток-хелперов для В-клеток, регуляторных клеток или эффекторных клеток. Иммунодепрессанты, такие как рапамицин или циклоспорин А, действуют посредством ингибирования на ранней фазе Т-клеточной активации/пролиферации. Поскольку клеточная пролиферация имеет место, как при раке, так и при иммунных ответах, то некоторые средства, например рапамицин или его аналоги, которые первоначально применяли для иммуносупрессии, позднее нашли применение в качестве противораковых средств (Recher и др., Blood, 105, 2005, cc.2527-2534).
Химиотерапевтические лекарственные средства наиболее эффективно используют при осуществлении комбинированной терапии. Основная идея заключается в применении лекарственных средств с различными механизмами действия для снижения вероятности развития устойчивости раковых клеток к лекарственным средствам. Комбинированная терапия позволяет также в случае определенных комбинаций лекарственных средств применять оптимальную объединенную дозу для минимизации побочных действий. Это имеет решающее значение, поскольку мишенью действия стандартных химиотерапевтических средств являются основные клеточные процессы, такие как репликация ДНК, деление клеток или индукция повреждения ДНК, и поэтому они обладают общим цитотоксическим действием. И, наконец, комбинированное применение двух соединений может приводить к возникновению неожиданного синергизма и запускать действия, которые не индуцируются соединением при его индивидуальном применении. В последние годы лекарственные средства применяют также в качестве неоадъювантов, т.е. перед хирургическим вмешательством, для снижения массы опухоли или для повышения продолжительности выживания.
Сиросингопин представляет собой синтетическое производное резерпина, обладающее гипотензивным и антипсихотическим действием средство (J.A.M.A., т.170, №.17, 22 августа, 1959, с.2092). Сиросингопин начали применять в клинической практике в конце 1950-х годов. В настоящее время резерпины применяют редко, поскольку разработаны улучшенные лекарственные средства с меньшими побочными действиями. Резерпин действует посредством ингибирования везикулярного транспорта моноаминов, что приводит к истощению катехоламина, и указанный механизм действия, вероятно, характерен для всех производных резерпина с гипотензивным действием. Сиросингопин, несмотря на то, что его применяли в клинических условиях, изучен относительно слабо по сравнению с резерпином, и его никогда не исследовали в качестве противоракового средства.
Митохондрии содержат систему производства энергии в клетке, посредством которой электроны, образовавшиеся в результате метаболизма, проходят через комплексы I-IV электрон-транспортной цепи (ЭТЦ), приводя к вытеснению протонов из комплексов I, III и IV и к оттоку протонов через комплекс V, что сопровождается образованием химической энергии в форме аденозинтрифосфата (АТФ). Кислород служит в качестве конечного акцептора электронов и восстанавливается с образованием Н2О. Основную роль в этом процессе играет внутренняя митохондриальная мембрана, поскольку протоны, вытесняемые из комплексов, проходят через матрикс в этой мембране в межмембранное пространство, создавая положительный мембранный потенциал 150-200 мВ. Красители, такие как TMRM (сложный метиловый эфир тетраметилродамина), проходят через указанную мембрану и накапливаются в митохондриальном матриксе, при этом интенсивность флуоресцентного сигнала зависит от величины мембранного потенциала. Ряд хорошо изученных агентов ингибирует митохондриальную функцию, и их можно рассматривать в качестве обладающих токсичностью для митохондрий агентов. Так называемые разобщающие агенты, такие как FCCP (карбонилцианид-пара-трифторметоксифенилгидразон), разобщают поток протонов и синтез АТФ, это приводит к падению мембранного потенциала, в результате чего снижается синтез АТФ. Ряд хорошо изученных митохондриальных ингибиторов оказывает направленное воздействие на различные комплексы ЭТЦ, к ним относятся метформин, ротенон, эпиберберин, пиерицидин А (все являются ингибиторами комплекса I), малонат натрия и теноилтрифторацетон (ингибиторы комплекса II), антимицин А (ингибитор комплекса III), цианид калия и азид натрия (ингибиторы комплекса IV) и олигомицин (ингибитор комплекса V). Митохондрии, по-видимому, возникли в результате захвата примитивными клетками бактерий. Они содержат ДНК-геном, кодирующий несколько компонентов ЭТЦ, а также компоненты митохондриальной рибосомы. Агенты, оказывающие направленное воздействие на митохондриальный геном, такие как некоторые ингибиторы ВИЧ из класса нуклеозидных аналогов, например ставудин (D4T), являются токсичными для митохондрий, поскольку они в конце концов разрушают ЭТЦ и митохондриальную систему преобразования энергии.
Метформин представляет собой бигуанидное лекарственное средство, широко применяемое при диабете типа 2. Он родственен буформину и фенформину, двум бигуанидным производным, которые уже не применяют при диабете из-за их токсичности. Метформин является безопасным и хорошо переносимым и применяется для пролонгированного лечения диабета в течение более 50 лет и является наиболее часто предписываемым антидиабетическим лекарственным средством во всем мире. Основным клиническим благоприятным действием метформина при лечении диабета типа 2 является его способность подавлять глюконеогенез в печени, что приводит к снижению гипергликемии и улучшает чувствительность к инсулину; эти действия, вероятно, определяются метформин-зависимой стимуляцией активности АМФ-активируемой протеинкиназы (АМРК). Основой для такого действия является то, что метформин и другие бигуаниды ингибируют комплекс I дыхательной цепи (электрон-транспортной цепи) митохондрий (El-Mir и др., J Biol Chem, 275, 2000, cc.223-228). Мета-анализ, в котором сравнивали страдающих диабетом пациентов, получавших метформин, и пациентов, получавших неродственное антидиабетическое средство, продемонстрировал, что у получающей метформин группы имела место более низкая частота встречаемости рака (Evans и др., BMJ, 330, 2005, cc.1304-1305; Bowker и др., Diabetes Care, 29, 2006, cc.254-258). Эти данные стимулировали современное исследование, касающееся возможности применения метформина в качестве противоракового средства или профилактического средства, в рамках которого в настоящее время проводятся многочисленные исследования и опыты (см. Gonzalez-Angulo и др., Clin Cancer Res, 16, 2010, cc.1695-1700).
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении предложена комбинация сиросингопина и митохондриального ингибитора, например, метформина (и родственных бигуанидов фенформина и буформина) или олигомицина, и фармацевтические композиции, содержащие сиросингопин и митохондриальный ингибитор.
Изобретение относится также к применению комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина (и родственных бигуанидов фенформина и буформина) или олигомицина, и фармацевтических композиций, содержащих сиросингопин и митохондриальный ингибитор, для лечения рака, в частности для лечения карциномы, лейкоза, миеломы и лимфомы, и для достижения иммуносупрессии в случае аутоиммунитета, в связанной с трансплантацией области медицины и в других случаях, когда требуется иммуносупрессия, например при болезнях кожи, в частности при псориазе, заболеваниях нервной системы, в частности при рассеянном склерозе, и заболеваниях гематопоэтической системы, в частности при анемиях; к применению комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина (и родственных бигуанидов фенформина и буформина) или олигомицина, для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения рака и достижения иммуносупрессии, и к способам лечения рака и достижения иммуносупрессии с использованием комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина (и родственных бигуанидов фенформина и буформина) или олигомицина, или фармацевтических композиций, содержащих сиросингопин и митохондриальный ингибитор.
Кроме того, изобретение относится к способу определения, является ли раковая клетка чувствительной к лечению содержащей сиросингопин комбинацией.
Краткое описание чертежей
Фиг.1: Метформин и сиросингопин обладают синергетическим действием в отношении уничтожения опухолевых клеток in vitro
А-З: - различные клеточные линии. М обозначает метформин, S обозначает сиросингопин.
Анализ клеточной пролиферации по превращению реагента AlamarBlue
Клетки высевали в 96-луночные титрационные микропланшеты и добавляли соединения в указанной концентрации. Плотность высеянных клеток составляла от 5000 до 15000 клеток на лунку, и ее определяли эмпирически для каждого типа клеток. Планшеты инкубировали в течение 3 дней и оценивали пролиферацию по превращению AlamarBlue. Рост стандартизовали относительно необработанных контролей и выражали в виде процентов (Y-ось). На панелях А-Д представлены кривые ингибирования, полученные для панели чувствительных клеток, а на панели Е представлена кривая роста, полученная для нечувствительных клеток фибросаркомы линии НТ1080. На панелях Ж-З представлены результаты, полученные с использованием незлокачественных здоровых линий человеческих фибробластов (Fib3 и Fib4). Для каждой клеточной линии на левой панели представлены результаты титрации, полученные с использованием различных концентраций метформина, при этом пунктирной вертикальной линией обозначена концентрация (5 мМ), отобранная для совместной обработки с сиросингопином. На правой панели представлена аналогичная кривая роста, полученная при применении только сиросингопина (сплошная линия) и при обработке сиросингопином в присутствии 5 мМ метформина (пунктирная линия). Все экспериментальные точки получены по трем повторностям.
Фиг.2: Зависимость действия от времени при длительной совместной обработке метформином и сиросингопином
Клетки линий А549 и ОРМ2 высевали, используя первоначальную плотность клеток 10000 клеток/мл и 100000 клеток/мл соответственно, и добавляли соединения (М обозначает метформин, S обозначает сиросингопин) в указанных концентрациях. В качестве контроля клетки инкубировали с растворителем (0,1% ДМСО). В указанные моменты времени из лунок отбирали образцы для подсчета клеток (d обозначает дни после обработки). Данные о плотности клеток откладывали по Y-оси (× 1000 клеток/мл).
Фиг.3: Индукция апоптоза при совместной обработке метформином и сиросингопином
Клетки линии ОРМ2 и RPMI8226 высевали с плотностью 100000 клеток/5 мл среды с добавленными соединениями. ОРМ2: 5 мкМ сиросингопин (S), 2 мМ метформин (М). RPMI8226: 2 мкМ сиросингопин (S), 1 мМ метформин (М). С (т.е. контроль) обозначает отсутствие соединения, S+M обозначает комбинацию сиросингопина и метформина. Через 3 дня собирали 500 мкл культуры, и клетки отмывали и окрашивали йодидом пропидия/аннексином V для FACS-анализа (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции). Аннексии V является маркером апоптоза и его выявляли с использованием сшитого с ФИТЦ антитела в FL1-канале. Одновременно в FL3-канале выявляли жизнеспособные клетки на основе исключения окрашивания йодидом пропидия (PI). При измерении в каждом случае негативные по PI и аннексину V клетки представляли собой популяцию жизнеспособных клеток (белые столбики). Находящиеся на ранней стадии апоптоза клетки представляли собой PI-негативные, аннексии V-позитивные (зашрихованные столбики) клетки, а находящиеся на поздней стадии апоптоза клетки представляли собой PI-позитивные, аннексии V-позитивные (черные столбики) клетки. По Y-оси отложены в виде столбиков данные, выраженные в виде процентов от общей популяции клеток.
Фиг.4: Структурно родственное соединение резерпин не обладает синергетическим действием при применении с метформином
Клетки линий 6.5 и ОРМ2 совместно обрабатывали резерпином (R) и метформином (М) с использованием диапазона концентраций, сходного с диапазоном концентраций применявшегося параллельно сиросингопина (S). На левых панелях представлено действие резерпина на развитие пролиферации при его индивидуальном применении. На правых панелях представлены данные о ингибировании роста сиросингопином (сплошная линия) или резерпином (штриховая линия) в присутствии метформина (5 мМ). Все экспериментальные точки получены по трем повторностям. Рост стандартизовали относительно соответствующих необработанных контролей и выражали в виде процентов (Y-ось).
Фиг.5: Воздействие совместной обработки сиросингопином и метформином при анализе in vivo на мышиной модели сингенной (аутологичной) опухоли
Клетки линии 6.5 (Colombi и др., Oncogene, 30, 2011, cc.1551-1565) инъецировали в боковые области иммуносовместимых мышей линии DBA. Обработку лекарственным средством начинали, когда размер опухолей достигал 100 мм2. Мышей разделяли на группы обработки и инъецировали внутрибрюшинно ежедневно в течение 15 дней ЗФР (горизонтальные полосы), сиросингопин (S, закрашенные ромбы, 2 мг/кг веса тела), метформин (М, закрашенные треугольники, 250 мг/кг веса тела) и метформин плюс сиросингопин (S+M, перечеркнутые квадраты). Мышей умерщвляли, когда размер опухолей становился чрезмерным (день 15), и опухоли иссекали для измерения. (А) На диаграмме представлена площадь опухолей (в мм2), определяемая в процессе обработки, d обозначает дни. (Б) Средняя масса тела (г) мышей в момент умерщвления. Числами (n) над каждым столбиком обозначено количество мышей на группу обработки.
Фиг.6: Сиросингопин обладает синергетическим действием при применении с бигуанидом фенформином
Левая панель: Клетки линии 6.5 обрабатывали аналогом метформина фенформином (Р) в течение 3 дней и оценивали рост с путем анализа клеточной пролиферации. Правая панель: Клетки линии 6.5 совместно обрабатывали сиросингопин (S) и возрастающими концентрациями фенформина. Y-ось: рост (в %) относительно необработанных контролей.
Фиг.7: Совместная обработка метформином и сиросингопином ингибирует стимулированную фитогемагглютинином (РНА) Т-клеточную пролиферацию по результатам измерений в день 3
Лейкоциты периферической крови человека культивировали в присутствии фитогемагглютинина или без него. В присутствии фитогемагглютинина (правая панель) комбинация сиросингопина в возрастающих концентрациях и 4 мМ метформина выраженно ингибировала Т-клеточную пролиферацию при применении сиросингопина в низких концентрациях (штриховая линия), но не ингибировала в отсутствие метформина (сплошная линия). Без стимуляции РНА (левая панель) клетки выживали (по данным микроскопического анализа), но у них отсутствовала пролиферация в день 3. Объединение сиросингопина с метформином оказывало лишь минимальное воздействие на указанное выживание (шриховая линия).
Фиг.8: Сиросингопин обладает синергетическим действием при применении с различными ингибиторами митохондриальной функции
Осуществляли титрование сиросингопина при его применении на мышиных клетках линии 6.5 индивидуально (S, сплошные линии) или в присутствии различных ингибиторов митохондриальной функции (штриховые линии): (А) ротенон 50 нМ, (Б) пиерицидин А 1,25 нМ, (В) эпиберберин 0,625 мкМ, (Г) 2-теноилтрифторацетон (TTFA) 100 мкМ, (Д) малонат натрия 30 мМ, (Е) антимицин А 5 нМ, (Ж) KCN 5 мМ, (З) азид натрия 1,25 мМ, (И) олигомицин 1 нМ, (К) карбонилцианид-пара-трифторметоксифенилгидразон (FCCP) 10 мкМ, (Л) ставудин 200 мкМ. Клетки выращивали в присутствии различных соединений, и ингибирование роста оценивали с помощью анализа пролиферации после обработки в течение 3 дней. Каждую экспериментальную точку получали по трем повторностям, и рост стандартизовали относительно роста необработанных контролей, принятых за 100%.
Фиг.9: Ингибиторы митохондриальной функции при их индивидуальном применении не уничтожают клетки линии 6.5
Изучали воздействие различных агентов, мишенью которых являются митохондрии, на рост клеток линии 6.5 при применении в концентрациях, в которых они обладали синергетическим действием в отношении уничтожения клеток при их применении в смеси с сиросингопином. Рост стандартизовали относительно роста необработанных клеток (черный столбик), который принимали за 100%. Каждую экспериментальную точку получали по трем повторностям, и рост оценивали через 3 дня с помощью анализа пролиферации. (А) ротенон, (Б) пиерицидин А, (В) эпиберберин, (Г) 2-теноилтрифторацетон, (Д) малонат натрия, (Е) антимицин А, (Ж) KCN, (З) азид натрия, (И) олигомицин, (К) карбонилцианид-пара-трифторметоксифенилгидразон (FCCP), (Л) ставудин.
Фиг.10: Синергетическое действие в отношении уничтожения человеческих раковых клеток сиросингопина и олигомицина при их применении в субнаномолярной концентрации
Определяли рост клеток с помощью анализа клеточной пролиферации (3 дня) согласно методу, описанному для фиг.1, для (А) мышиной клеточной линии 6.5, (Б) человеческой клеточной линии промиелоцитарного лейкоза HL60 и (В) человеческой клеточной линии множественной миеломы ОРМ2. Осуществляли титрование с использованием различных концентраций сиросингопина (S) в отсутствие олигомицина (сплошная линия), в присутствии 500 пМ олигомицина (пунктирная линия) и 1 нМ олигомицина (штриховая линия).
Фиг.11: Обработка сиросингопином повышает потенциал митохондриальной мембраны в зависимости от дозы
Мышиные клетки линии 6.5 обрабатывали TMRM (сложный метиловый эфир тетраметилродамина) (панели 1-6) и предварительно инкубировали с FCCP (панель 2) и, кроме того, с сиросингопином в концентрации 0,1 мкМ (панель 3), 0,5 мкМ (панель 4), 2 мкМ (панель 5) или 5 мкМ (панель 6) и измеряли интенсивность флуоресценции. Тонкие линии: интенсивность флуоресценции контрольных клеток или обработанных FCCP клеток (панель 2). Жирными линиями обозначены данные для клеток, которые дополнительно предварительно инкубировали с сиросингопином (панели 3-6). На Х-оси откладывали интенсивность флуоресценции, на Y-оси указано относительное количество клеток. Сдвиг влево пика флуоресценции после обработки FCCP (панель 2) свидетельствует об уменьшении или потере мембранного потенциала, сдвиг вправо (панель 4-6) свидетельствует об увеличении мембранного потенциала после обработки сиросингопином (ср. жирные и тонкие линии).
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина или олигомицина, и к фармацевтическим композициям, содержащим сиросингопин и митохондриальный ингибитор.
Изобретение относится также к применению комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора и фармацевтических композиций, содержащих сиросингопин и митохондриальный ингибитор, для лечения рака, в частности для лечения карциномы, лейкоза, миеломы и лимфомы, и для лечения иммунологических нарушений, таких как аутоиммунитет.
Согласно настоящему изобретению «митохондриальные ингибиторы» представляют собой соединения, которые снижают митохондриальную активность и обладают различной по степени токсичностью для митохондрий. К митохондриальным ингибиторам относятся так называемые разобщающие агенты, которые разобщает поток протонов от синтеза АТФ в митохондриях, и ингибиторы, мишенью которых являются различные комплексы электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) в митохондриях, например комплекс I, комплекс II, комплекс III, комплекс IV и комплекс V электрон-транспортной цепи. Другими соединениями, которые согласно изобретению рассматриваются как митохондриальные ингибиторы, являются обладающие токсичностью для митохондрий соединения, которые оказывают направленное воздействие на митохондриальный геном.
Многие из широко применяемых лекарственных средств обладают побочными действиями, которые обусловлены токсичностью для митохондрий. Эти токсичные для митохондрий лекарственные средства согласно изобретению также рассматриваются как митохондриальные ингибиторы. Указанные обладающие токсичностью для митохондрий или являющиеся митохондриальными ингибиторами лекарственные средства обладают синергетическим действием при применении с сиросингопином и представляют собой противораковые средства при их объединении с сиросингопином. Обладающие токсичностью для митохондрий лекарственные средства применяли для лечения самых различных клинических состояний (Cohen и др., Dev Disabil Res Rev, 16, 2010, сс.189-199).
Согласно изобретению митохондриальные ингибиторы представляют собой:
лекарственные средства, применяемые при заболевании печени или желчного пузыря с побочными воздействиями на митохондрий, такие как тетрациклин, ибупрофен, амиодарон, пирпрофен, тамоксифен, вальпроат, хлороквин, квинидин, хлорпромазин, кетоконазол, циклоспорин А, рифампицин и глибурин;
ингибиторы комплекса I электрон-транспортной цепи, такие как амитал, капсаицин, галоперидол, рисперидон, метформин, буформин, фенформин, бупивакаин, лидокаин, галртан, дантролен, фенитоин, клофибрат и фенофибрат;
ингибиторы комплекса II электрон-транспортной цепи, такие как циклофосфамид и кетоконазол;
ингибиторы комплекса III электрон-транспортной цепи, такие антимицин А, ацетаминофен, изофлуран и севофлуран;
ингибиторы комплекса IV электрон-транспортной цепи, такие как цефалоридин, цефазолин и цефалотин;
ингибиторы синтеза митохондриальной ДНК, такие как AZT (итовудидин), d4T (ставудин), ddI (диданозин) и ddC (залцитабин);
разобщающие агенты окислительного фосфорилирования, такие как пентамидин, индометацин, флуоксетин, пропофол, аспирин, бубивакаин, толкапон и динитрофенол;
агенты, которые восстанавливают молекулярный кислород до супероксида посредством окислительно-восстановительного механизма, такие как доксорубицин, изониазид, гентамицин и фторхинолон; и
ингибиторы транскрипции митохондриальных генов, такие как интерферон-альфа и интерферон-гамма.
Метформин представляет собой гидрохлорид 3-(диаминометилиден)-1,1-диметилгуанидина формулы (1)
Другие рассматриваемые бигуаниды представляют собой, например, фенформин или буформин, предпочтительно фенформин.
Фенформин представляет собой 1-(диаминометилиден)-2-(2-фенилэтил)гуанидин формулы (2)
Сиросингопин является производным резерпина формулы (3),
в котором 4-метоксигруппа 3,4,5-триметоксибензоатного фрагмента резерпина замена на 4-этоксикарбонилоксигруппу, как показано в формуле (4).
Другие митохондриальные ингибиторы, для которых продемонстрировано синергетическое действие при применении с сиросингопином, представляют собой:
(5А) ротенон (ингибитор комплекса I митохондриальной электрон-транспортной цепи):
(5Б) пиерицидин А (ингибитор комплекса I):
(5В) эпиберберин (ингибитор комплекса I):
(5Г) 2-теноилтрифторацетон (ингибитор комплекса II):
(5Д) малонат натрия (ингибитор комплекса II): CH2(COONa)2,
(5Е) антимицин А (ингибитор комплекса III):
(5Ж) цианид калия (ингибитор комплекса IV): KCN,
(5З) азид натрия (ингибитор комплекса IV): NaN3,
(5И) олигомицин (ингибитор комплекса V):
(5К) карбонилцианид-пара-трифторметоксифенилгидразон (FCCP) (разобщающий агент митохондриальной мембраны):
и (5Л) ставудин (митохондриальный генотоксический агент):
Благодаря близкому сходству между основными соединениями и их кислотно-аддитивными солями, можно считать, что метформин, фенформин и другие митохондриальные ингибиторы, имеющие основный атом азота, представляют собой свободное основание или любую его кислотно-аддитивную соль. Малонат натрия, цианид калия и азид натрия являются эквивалентами других солей щелочных металлов, таких, например, как малонат калия, цианид натрия, азид калия, или также их аммониевых солей. Катионное соединение эпиберберин (5В) может нести любой фармацевтически приемлемый анион, например хлорид, кислый сульфат, метансульфонат или первичный кислый фосфат.
Аналогично этому, сиросингопин означает свободное основание или любую его кислотно-аддитивную соль. Соли предпочтительно представляют собой фармацевтически приемлемые соли сиросингопина.
Указанные соли образуются, например, в виде кислотно-аддитивных солей, предпочтительно с органическими или неорганическими кислотами. Приемлемыми неорганическими кислотами являются, например, галогенводородные кислоты, такие как соляная кислота, серная кислота или фосфорная кислота. Приемлемыми органическими кислотами являются, например, карбоновые, фосфоновые, сульфоновые или сульфаминовые кислоты, например уксусная кислота, пропионовая кислота, октановая кислота, декановая кислота, додекановая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, фумаровая кислота, янтарная кислота, адипиновая кислота, пимелиновая кислота, субериновая кислота, азелаиновая кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, аминокислоты, такие как глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, малеиновая кислота, гидроксималеиновая кислота, метилмалеиновая кислота, циклогексанкарбоновая кислота, адамантанкарбоновая кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, 4-аминосалициловая кислота, фталевая кислота, фенилуксусная кислота, миндальная кислота, коричная кислота, метан- или этансульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, этан-1,2-дисульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 1,5-нафталиндисульфоновая кислота, 2-, 3- или 4-метилбензолсульфоновая кислота, метилсерная кислота, этилсерная кислота, додецилсерная кислота, N-циклогексилсульфаминовая кислота, N-метил-, N-этил- или N-пропилсульфаминовая кислота или другие органические протонные кислоты, такие как аскорбиновая кислота.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, представляют собой, например, композиции для энтерального введения, такого как назальное, трансбуккальное, ректальное или предпочтительно оральное введение, и для парентерального введения, такого как внутривенное, внутримышечное или подкожное введение. Композиции содержат сиросингопин и митохондриальный ингибитор, например метформин или олигомицин, индивидуально или предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Доза комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора зависит от подлежащего лечению заболевания и от вида пациента, его возраста, веса и индивидуального состояния, индивидуальных фармакокинетических особенностей и пути введения.
Фармацевтические композиции содержат комбинацию сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина или олигомицина, в количестве от примерно 1 до примерно 95%, формы введения в виде одной дозы, содержащие в предпочтительном варианте осуществления изобретения комбинацию сиросингопина и митохондриального ингибитора в количестве от примерно 20 до примерно 90%, и формы, не относящиеся к типу однодозовых форм, которые содержат в предпочтительном варианте осуществления изобретения комбинацию сиросингопина и митохондриального ингибитора в количестве от примерно 5 до примерно 20%. Формы в виде стандартных доз представляют собой, например, таблетки с покрытием или без него, ампулы, пузырьки, суппозитории или капсулы. Другие лекарственные формы представляют собой, например, мази, кремы, пасты, пены, настойки, капли, спреи и дисперсии. Примерами являются, например, капсулы, содержащие комбинацию сиросингопина и митохондриального ингибитора в количестве от примерно 0,05 до примерно 1,0 г.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, приготавливают хорошо известным методом, например с помощью общепринятых процессов смешения, грануляции, нанесения покрытия, растворения или лиофилизации.
Предпочтительным является применение растворов комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина или олигомицина, а также суспензий или дисперсий, прежде всего изотонических водных растворов, дисперсий или суспензий, которые, как, например, в случае использования лиофилизированных композиций, содержащих комбинацию сиросингопина и митохондриального ингибитора индивидуально или в сочетании с носителем, например маннитом, можно приготавливать перед применением. Фармацевтические композиции могут быть стерилизованы и/или могут содержать эксципиенты, например консерванты, стабилизаторы, смачивающие вещества и/или эмульгаторы, солюбилизаторы, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы, и их приготавливают с помощью хорошо известного метода, например с помощью общепринятых процессов растворения и лиофилизации. Указанные растворы или суспензии могут содержать агенты, повышающие вязкость, как правило, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливинилпирролидон или желатины, или также солюбилизаторы, например Tween 80® (полиоксиэтилен(20)сорбитанмоноолеат).
Суспензии в масле содержат в виде масляного компонента растительные, синтетические или полусинтетические масла, которые можно применять для инъекций. В этой связи специально следует упомянуть жидкие эфиры жирных кислот, которые содержат в качестве кислотного компонента жирную кислоту с длинной цепью, имеющую от 8 до 22, прежде всего от 12 до 22 атомов углерода. Спиртовой компонент указанных эфиров жирных кислот содержит максимум 6 атомов углерода и является одновалентным или многовалентным, например одно-, двух- или трехвалентным спиртом, прежде всего, представляет собой гликоль и глицерин. В качестве смесей эфиров жирных кислот предпочтительно применять растительные масла, такие как хлопковое масло, миндальное масло, оливковое масло, касторовое масло, кунжутное масло, соевое масло и арахисовое масло.
Приготовление предназначенных для инъекций препаратов, как правило, осуществляют в стерильных условиях, как, например, в том случае, когда ими заполняют, например, ампулы или пузырьки и запечатывают контейнеры.
Приемлемыми носителями для предпочтительных твердых оральных лекарственных форм являются, прежде всего, наполнители, такие как сахара, например лактоза, сахароза, маннит или сорбит, препараты целлюлозы и/или фосфаты кальция, например трикальций фосфат или вторичный кислый фосфат кальция, а также связующие вещества, такие как крахмалы, например кукурузный, пшеничный, рисовый или картофельный крахмал, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидон, и/или при необходимости разрыхлители, такие как вышеуказанные крахмалы, а также карбоксиметилкрахмал, сшитый поливинилпирролидон, альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Дополнительными эксципентами являются, прежде всего, регуляторы текучести и замасливатели, например кремневая кислота, тальк, стеариновая кислота или ее соли, такие как стеарат магния или кальция, и/или полиэтиленгликоль, или их производные.
На ядра таблеток можно наносить приемлемые необязательно энтеросолюбильные покрытия, используя среди прочего, концентрированные растворы сахара, которые могут содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, или растворы для нанесения покрытия в приемлемых органических растворителях или смесях растворителей, или для получения энтеросолюбильных покрытий растворы пригодных препаратов целлюлозы, таких как фталат ацетилцеллюлозы или фталат гидроксипропилметилцеллюлозы. К таблеткам или покрытиям для таблеток можно добавлять красители или пигменты, например, с целью идентификации или для обозначения различных доз комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора.
Фармацевтические композиции для орального введения представляют собой также твердые капсулы, состоящие из желатина, а также мягкие запечатываемые капсулы, состоящие из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Твердые капсулы могут содержать комбинацию сиросингопина и митохондриального ингибитора в форме гранул, например, в смеси с наполнителями, такими как кукурузный крахмал, связующими веществами и/или веществами, улучшающими скольжение, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно стабилизаторами. В мягких капсулах комбинация сиросингопина и митохондриального ингибитора предпочтительно растворена или суспендирована в приемлемых жидких эксципиентах, таких как жирные масла, парафиновое масло или жидкие полиэтиленгликоли или эфиры жирных кислот и этилен- или пропиленгликоля, к которым можно добавлять также стабилизаторы и поверхностно-активные вещества, например, типа эфира жирной кислоты и полиоксиэтиленсорбитана.
Фармацевтические композиции, пригодные для ректального введения, представляют собой, например, суппозитории, которые состоят из комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина или олигомицина, и основы суппозитория. Приемлемыми основами суппозитория являются, например, природные или синтетические триглицериды, парафиновые углеводороды, полиэтиленгликоли или высшие жирные спирты.
Для парентерального введения наиболее приемлемыми являются водные растворы, содержащие комбинацию сиросингопина и митохондриального ингибитора, или водные предназначенные для инъекции суспензии, которые содержат повышающие вязкость субстанции, например натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, сорбит и/или декстран, и при необходимости стабилизаторы. Комбинация сиросингопина и митохондриального ингибитора, необязательно в сочетании с эксципиентами, может находиться также в форме лиофилизата, из которого можно приготавливать раствор перед парентеральным введением путем добавления приемлемых растворителей. Растворы, предназначенные, например, для парентерального введения, можно использовать также в качестве растворов для инфузии.
Предпочтительными консервантами являются, например, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, или бактерициды, такие как сорбиновая кислота или бензойная кислота.
С помощью исследований, описанных более подробно ниже, установлено, что комбинация митохондриального ингибитора, например, метформина формулы (1), фенформина формулы (2) или других митохондриальных ингибиторов формулы (5), в частности, олигомицина формулы (5И), и сиросингопина формулы (4), а также фармацевтические композиции, содержащие митохондриальный ингибитор и сиросингопин, предлагаемые в изобретении, обладают терапевтической эффективностью в отношении различных типов рака, включая карциномы, саркомы, глиомы, лейкозы, лимфомы, например эпителиальные неоплазмы, плоскоклеточные неоплазмы, базальноклеточные неоплазмы, переходно-клеточные папилломы и карциномы, аденомы и аденокарциномы, относящиеся к придаткам и кожным отросткам неоплазмы, мукоэпидермоидные неоплазмы, кистозные неоплазмы, слизистые и серозные неоплазмы, относящиеся к протоку, долькам и медуллярные неоплазмы, неоплазмы из гроздевидных (ациарных) клеток, комплексные эпителиальные неоплазмы, специализированные гонадные неоплазмы, параганглиомы и опухоли гломуса, родимые пятна и меланомы, опухоли мягких тканей, включая саркомы, фиброматозные неоплазмы, миксоматозные неоплазмы, липоматозные неоплазмы, миоматозные неоплазмы, комплексные смешанные и стромальные неоплазмы, фиброэпителиальные неоплазмы, неоплазмы синовиального типа, мезотелиальные неоплазмы, герминогенные неоплазмы, трофобластические неоплазмы, мезонефромы, опухоли кровеносных сосудов, опухоли лимфатических сосудов, костные и хондроматозные неоплазмы, гигантоклеточные опухоли, смешанные опухоли костной ткани, глиомы, глиобластомы, олигодендроглиомы, нейроэпителиоматозные неоплазмы, менингиомы, опухоли оболочки нерва, гранулезоклеточные опухоли и альвеолярные мягкотканные саркомы, лимфомы Ходжкина и не-ходжкинские лимфомы, другие лимфоретикулярные неоплазмы, опухоли из плазматических клеток, тучноклеточные опухоли, иммунопролиферативные заболевания, лейкозы, включая острые и хронические лейкозы, смешанные миелопролиферативные нарушения, лимфопролиферативные нарушения и миелодиспластические синдромы.
С помощью исследований, описанных более подробно ниже, установлено, что комбинация митохондриального ингибитора, например метформина формулы (1), фенформина формулы (2) или других митохондриальных ингибиторов формулы (5), в частности олигомицина формулы (5И) и сиросингопина формулы (4), а также фармацевтические композиции, содержащие митохондриальный ингибитор и сиросингопин, предлагаемые в изобретении, обладают терапевтической эффективностью в отношении иммунологических заболеваний, чувствительных к блокаде Т-клеточной пролиферации, включая заболевания соединительной ткани, такие как системная красная волчанка, склеродерма, полимиозит/дерматомиозит, смешанное заболевание соединительной ткани, ревматоидный артрит, синдром Шегрена, нодозный панартериит, грануломатоз Вегенера; системные аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, синдром Гудпасчера, ревматическая полимиалгия, синдром Гийена-Барре, рассеянный склероз; локализованные аутоиммунные заболевания, такие как сахарный диабет типа 1, тироидит Хашимото, болезнь Грейвса, глютеновая блезнь, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, болезнь Аддисона, первичный билиарный цироз, аутоиммунный гепатит и гигантоклеточный артериит.
Комбинацию митохондриального ингибитора и сиросингопина и фармацевтические композиции, содержащие сиросингопин и митохондриальный ингибитор, например метформин или олигомицин, предлагаемые в изобретении, можно применять в форме фиксированных комбинаций. Указанная фиксированная комбинация может содержать сиросингопин и митохондриальный ингибитор, например метформин, в соотношении (мас./мас.), составляющем от 1 к 10 до 1 к 1000, предпочтительно от 1 к 100 до 1 к 200, например комбинацию в соотношении 1 к 130, при этом максимальная рекомендованная суточная доза метформина, основанная на принятой для применения при диабете типа 2, составляет 2550 мг. Фиксированная комбинация сиросингопина и олигомицина может содержать сиросингопин и олигомицин в соотношении (мас./мас.), составляющем от 1000 к 1 до 10000 к 1. Альтернативно этому, можно применять ковалентную связь между сиросингопином и некоторыми митохондриальными ингибиторами, например метформином. Для применения на практике соли, такие как малонат натрия (5Д), цианид калия (5Ж) и азид натрия (5З), хотя они, как установлено, также обладают синергетическим действием при применении с сиросингопином в опытах на клетках, не рассматриваются в качестве входящих в комбинацию с сиросингопином партнеров при создании противораковых средств и иммунодепрессантов.
Альтернативно этому, комбинацию сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина или олигомицина, можно применять в виде двух различных отдельных фармацевтических композиций, необязательно поставляемых вместе в виде набора. Введение сиросингопина и митохондриального ингибитора, например, метформина или олигомицина, может также быть поочередным, или соединения можно вводить независимо друг от друга в течение приемлемого временного «окна».
Фармацевтические композиции, содержащие сиросингопин и митохондриальный ингибитор, например метформин или олигомицин, можно объединять также с другими химиотерапевтическими средствами. Терапевтические средства, которые могут входить в комбинацию, прежде всего представляют собой одно или несколько цитостатических или цитотоксических соединений, например химиотерапевтическое средство, или некоторые соединения, выбранные из группы, включающей индарубицин, цитарабин, интерферон, гидроксимочевину, бисулфан, или ингибитор биосинтеза полиаминов, ингибитор пути mTOR, ингибитор комплекса 1 mTOR или комплекса 2 mTOR, ингибитор протеинкиназы, прежде всего серин/треониновой протеинкиназы, такой как протеинакиназа С, или тирозинпротеинкиназы, такой как тирозинкиназа эпидермального фактора роста, цитокин, негативный регулятор роста, такой как TGF-β или IFN-β, ингибитор ароматазы, классический цитостатик, ингибитор взаимодействия SH2-домена с фосфорилированным белком, ингибитор Bcl-2 и модуляторы из семейства белков Bcl-2, такие как Вах, Bid, Bad, Bim, Nip3 и белки, несущие только ВН3-домен (белки ВН3-только).
Комбинацию сиросингопина и митохондриальных ингибиторов, например метформина или олигомицина, и фармацевтические композиции, содержащие сиросингопин и митохондриальные ингибиторы, можно применять прежде всего для лечения рака в сочетании с лучевой терапией, иммунотерапией, хирургическим вмешательством или их комбинацией. Длительная терапия равным образом может представлять собой адъювантную терапию в контексте других лечебных стратегий или неоадъювантную терапию в сочетании с хирургией. Другие возможные пути лечения представляют собой терапию, предназначенную для поддержания статуса пациента после регресса опухоли, или превентивную химиотерапию, например, для пациентов, имеющих риск заболевания.
В настоящем изобретении предложен также способ лечения рака и иммунологических нарушений, таких как аутоиммунитет, заключающийся в том, что вводят комбинацию сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина или олигомицина, в количестве, эффективном в отношении указанного заболевания, теплокровному животному, нуждающемуся в таком лечении. Комбинацию сиросингопина и митохондриальных ингибиторов, например метформина или олигомицина, можно вводить в чистом виде или в форме фармацевтических композиций с целью профилактики или терапии, предпочтительно в количестве, эффективном в отношении указанных заболеваний, теплокровному животному, например человеку, нуждающемуся в таком лечении. В случае индивидуума весом примерно 70 кг суточная вводимая доза комбинации, предлагаемой в настоящем изобретении, составляет от примерно 0,05 до примерно 3 г, предпочтительно от примерно 0,25 до примерно 1,5 г.
Изобретение относится также к применению комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина или олигомицина, и фармацевтических композиций, содержащих сиросингопин и митохондриальный ингибитор, для лечения рака, в частности для лечения конкретных указанных выше видов рака. Более конкретно, изобретение относится к применению комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора и фармацевтических композиций, содержащих сиросингопин и митохондриальный ингибитор, для лечения карцином, сарком, лейкозов, миелом, лимфом и рака нервной системы. Кроме того, изобретение относится к применению комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора и фармацевтических композиций, содержащих сиросингопин и митохондриальный ингибитор, для достижения иммуносупрессии при аутоиммунитете, в трансплантационной медицине и в других случаях, при которых требуется иммуносупрессия, в частности при иммунологических заболеваниях, чувствительных к блокаде Т-клеточной пролиферации, системных аутоиммунных заболеваниях и локализованных аутоиммунных заболеваниях, указанных выше. Более конкретно, изобретение относится к применению комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина или олигомицина, и фармацевтических композиций, содержащих сиросингопин и митохондриальный ингибитор, для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания кожи, нервной системы, соединительной ткани, мышц, кровеобразующей системы, костной ткани и внутренних органов, в частности псориаза, рассеянного склероза и анемий.
Предпочтительное относительное количество сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина или олигомицина, уровень дозы и тип фармацевтической композиции, применяемые в каждом случае, зависят от типа рака или аутоиммунного заболевания, серьезности и развития заболевания и конкретного состояния пациента, подлежащего лечению, и их определяет специалист-медик, ответственный за лечение.
Изобретение относится также к применению комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина или олигомицина, для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения рака или аутоиммунного заболевания, указанного выше.
В частности, в изобретении предложен способ лечения рака или аутоиммуного заболевания, заключающийся в том, что вводят комбинацию сиросингопина и митохондриального ингибитора, например метформина или олигомицина, или фармацевтическую композицию, содержащую сиросингопин и митохондриальный ингибитор, в количестве, эффективном в отношении указанного заболевания, теплокровному животному, которое нуждается в таком лечении.
Обоснование возможности применения комбинации сиросингопина и метформина или других бигуанидов
Осуществляли скрининг комбинаций путем совместной обработки клеток антидиабетическим средством метформином в сочетании с более чем тысячью лекарственных средств и соединений, подобных лекарственным средствам. Было установлено, что метформин и сиросингопин обладают синергетическим действием в отношении уничтожения различных раковых клеток in vitro и in vivo. Это действие обнаружено только в том случае, когда объединяли оба лекарственных средства, при этом каждое индивидуальное соединение обладало минимальной цитотоксичностью.
Для предварительного скрининга применяли линию мышиных тучных клеток 6.5 (Colombi и др., Oncogene, 30, 2011, cc.1551-1565). Клетки линии 6.5 обладают многими особенностями онкогенной трансформации, такими как уменьшение зависимости от фактора роста (IL3) и зависимость от пути передачи сигналов. С помощью исследований с использованием ингибиторов установлена их зависимость от пути PI3K-mTOR-Akt, а также от пути МАР-киназы. Эти клетки обладают высокой чувствительностью к многим применяемым в клинических условиях лекарственным средствам. На мышиных клетках линии 6.5 осуществляли совместный скрининг с использованием библиотеки поступающих в продажу лекарственных средств (фирма Prestwick Chemical Library) в присутствии метформина (2 мМ) для идентификации соединений, которые могли действовать в качестве применяемого совместно с метформином лекарственного средства, обладая синергетическим действием в отношении уничтожения этих клеток.
Было установлено, что этой цели в наибольшей степени удовлетворял сиросингопин. На фиг.1А продемонстрировано, что метформин при его индивидуальном применении в концентрации 5 мМ обеспечивал 20%-ное ингибирование роста (левая панель), в то время как сиросингопин при его индивидуальном применении практически не обладал ингибирующим действием (правая панель, сплошная линия). Однако, когда сиросингопин в возрастающих концентрациях объединяли с 5 мМ метформином (правая панель, штриховая линия), то обнаружено выраженное ингибирование при применении сиросингопина в концентрации 2,5 мкМ. Аналогичные результаты получали с использованием серий человеческих раковых линий, в частности линии миеломы ОРМ2 (фиг.1Б), линии миеломы RPMI8226 (фиг.1В), линии Т-клеточного лейкоза Jurkat (фиг.1Г), линии хронического миелогенного лейкоза K562 (фиг.1Д). Важно отметить, что в отношении этих клеточных линий объединенная обнаруженная активность была высокой в диапазоне концентраций, в котором каждое соединение при его индивидуальном применении обладало лишь очень незначительным действием. Для линии клеток человеческой фибросаркомы НТ1080 (фиг.1Е), а также двух линий здоровых человеческих фибробластов (фиг.1Ж, З) не было обнаружено ингибирование роста, когда клетки совместно обрабатывали обоими лекарственными средствами. Это коррелирует скорее со специфическим ответом, чем с общей цитотоксичностью, а отсутствие активности в отношении здоровых человеческих фибробластов свидетельствует о том, что действие является специфическим в отношении опухоли. В таблице 1 обобщены данные, касающиеся указанных и дополнительных изученных линий, которые в совокупности свидетельствуют о том, что действие сиросингопина/метформина на раковые клетки проявляется в отношении широкого разнообразия раковых гистотипов, поскольку применяемые клеточные линии широко используются для доклинических исследований рака и представляют собой принятые и репрезентативные модели органспецифического злокачественного нарушения.
| Таблица 1: | ||
| Панель человеческих раковых клеток, изученных в отношении чувствительности к совместной обработке метформином и сиросингопином | ||
| Человеческая раковая клетка | Злокачественность | Чувствительность |
| ОРМ1 | Множественная миелома | Да |
| ОРМ2 | Множественная миелома | Да |
| RPMI8226 | Множественная миелома | Да |
| А549 | Рак легкого (NSCLC) | Да |
| H1299 | Рак легкого (NSCLC) | Да |
| MDA-468 | Рак молочной железы | Да |
| AN3CA | Рак эндометрия | Да |
| Jurkat | Т-клеточный лейкоз | Да |
| K562 | Хронический миелоидный лейкоз | Да |
| HL60 | Промиелоцитарный лейкоз | Да |
| KG1 | Острый миелобластный лейкоз | Да |
| MOLT4 | Острый лимфоцитарный лейкоз | Да |
| HeLa | Рак шейки матки | Да |
| JUSO | Меланома | Да |
| РС3 | Рак предстательной железы | Да |
| DU145 | Рак предстательной железы | Да |
| LnCAP | Рак предстательной железы | Да |
| LN229 | Глиобластома | Да |
| HT1080 | Фибросаркома | Нет |
| MDA-231 | Рак молочной железы | Нет |
| U87 | Глиобластома | Нет |
| ME-59 | Меланома | Нет |
| NA-8 | Меланома | Нет |
Эксперимент по изучению зависимости объединенной обработки от времени осуществляли на двух чувствительных человеческих клеточных линиях ОРМ2 (множественная миелома) и А549 (рак легкого). Не обнаружено увеличения роста после 9-10 дней лечения (фиг.2). Для решения вопроса о том, представляет ли собой ингибирование фактическую клеточную гибель в результате апоптоза, обработанные лекарственными средствами клетки анализировали в отношении экспрессии на поверхности мембраны аннексина V, маркера апоптоза, а также путем окрашивания йодидом пропидия (PI) для подтверждения гибели клеток. Количество клеток, находящихся на стадии апоптоза, возрастало, при этом происходило уменьшение популяции жизнеспособных клеток человеческой множественной миеломы ОРМ2 и RPMI8226, которые подвергали обработке комбинацией лекарственных средств, что свидетельствует о том, что индукция апоптоза является механизмом, обеспечивающим гибель клеток (фиг.3). При индивидуальном применении соединений не обнаружено индукции апоптоза.
Сиросингопин формулы (4) является искусственным производным резерпина формулы (3), гипотензивного средства, и отличается специфическим для растений раувольфии химическим каркасом. Другие соединения, родственные полученным из раувольфии, такие как резерпин, резерпиновая кислота, ресциннамин, йохимбиновая кислота, коринантин·HCl, аймалицин, йохимбин·HCl и рауволсцин·HCl, не обладали значительным взаимодействием с метформином формулы (1) в отношении изученных линий раковых клеток. Для подтверждения специфичности сиросингопина резерпин тестировали с использованием диапазона концентраций на клетках линий 6.5 и ОРМ2. Не обнаружено взаимодействия резерпина с метформином (фиг.4), что позволяет предположить, что механизм действия сиросингопина является новым по сравнению с другими производными раувольфии.
Для решения вопроса о том, сохраняется ли взаимодействие в опытах in vivo, клетки линии 6.5 инъецировали иммуносовместимым мышам линии DBA. Обработку начинали, когда размер опухолей достигал 100 мм2. Мышам ежедневно инъецировали внутрибрюшинно сиросингопин (2 мг/кг веса тела), метформин (250 мг/кг веса тела) или оба соединения в течение 15 дней и животных умерщвляли для иссечения и измерения опухолей. Как продемонстрировано на фиг.5А, обработка двумя соединениями успешно прекращала рост опухолей. Не обнаружено существенного различия веса тела между группами обработки (фиг.5Б) или каких-либо очевидных признаков токсичности.
Метформин представляет собой бигуанид, сходный с фенформином (формула 2), антидиабетическим средством, которое в настоящее время редко применяют в клинических условиях из-за побочных действий (молочный ацидоз). Изучали вопрос, может фенформин также приводить к синергетическому действию при его применении с сиросингопином. Как продемонстрировано на фиг.6, левая панель, обработка только фенформином не приводила к ингибированию роста при его применении в концентрациях вплоть до 10 мкМ. Однако, когда фенформин в указанной концентрации объединяли с применяемым в возрастающих концентрациях сиросингопином (фиг.6, правая панель), то было обнаружено сильное синергетическое действие. Фактически, зависящее от дозы синергетическое действие обнаружено при всех изученных концентрациях фенформина.
Запуск иммунного ответа в результате антигенной стимуляции включает раннюю пролиферацию Т-клеток. Такую Т-клеточную стимуляцию можно имитировать с помощью поликлональных стимуляторов, таких как лектины, например фитогемагглютинин (РНА). Комбинация метформина и сиросингопина ингибировала также стимулированную РНА Т-клеточную пролиферацию. Оценивали лейкоциты, выделенные из периферической крови здоровых людей-доноров, и оценивали пролиферацию в день 3 после инкубации с метформином, сиросингопином или обоими средствами. Как продемонстрировано на фиг.7, правая панель, стимулированная РНА пролиферация является очень чувствительной к ингибированию, когда сиросингопин объединяют с метформином (4 мМ) (пунктирная линия), но обладает существенно меньшей чувствительностью в отсутствие метформина (сплошная линия). На левой панели на фиг.7 продемонстрировано, что для лейкоцитов периферической крови, которые культивировали в течение 3 дней без РНА, характерна слабая пролиферация клеток, но они сохраняли жизнеспособность. На эту жизнеспособность не оказывало воздействие наличие сиросингопина в возрастающих концентрациях в присутствии 4 мМ метформина (пунктирная линия).
Обоснование возможности применения комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора, отличного от метформина
Тот факт, что метформин блокирует комплекс I ЭТЦ, позволяет поставить вопрос о том, могут ли другие ингибиторы ЭТЦ или другие обладающие токсичностью для митохондрий агенты аналогичным образом действовать совместно с сиросингопином в отношении уничтожения клеток. Оценивали серии агентов, для которых хорошо известно, что их мишенью являются митохондрии, и использовали такие концентрации этих агентов, в которых они сами не обладают токсичностью или обладают лишь минимальной токсичностью. Агенты и концентрации представлены на фиг.8 и 9. При оценке в сочетании с возрастающими количествами сиросингопина обнаружено усиленное в результате синергизма уничтожение клеток при применении в сочетании с ингибиторами комплекса I ЭТЦ ротеноном (фиг.8А), пиерицидином А (фиг.8Б), эпиберберином (фиг.8В). Усиленное в результате синергизма уничтожение обнаружено также при использовании ингибиторов комплекса II TTFA (фиг.8Г) и малоната натрия (фиг.8Д), а также ингибитора комплекса III антимицина А (фиг.8Е). Два ингибитора комплекса IV, а именно KCN (фиг.8Ж) и азид натрия (фиг.8З), а также ингибитор комплекса V олигомицин (фиг.8И), также индуцировали усиленное в результате синергизма уничтожение клеток при их применении с сиросингопином. Эти данные демонстрируют, что сиросингопин индуцирует уничтожение клеток при его применении в сочетании с митохондриальными ингибиторами, в данном случае с ингибиторами ЭТЦ. FCCP является агентом, который разобщает ЭТЦ-цепь от синтеза АТФ, Важно отметить, что этот агент также индуцирует усиленнное в результате синергизма уничтожение клеток при их применении с сиросингопином (фиг.8К). Поскольку несколько компонентов ЭТЦ кодируются митохондриальным геномом, можно ожидать, что те агенты, которые повреждают митохондриальный геном, также должны обладать синергизмом при применении с сиросингопином. Изучали обладающее активностью в отношении ВИЧ соединение, такое как ставудин, ингибитор обратной транскриптазы, для которого хорошо известны вредные побочные действия на репликацию митохондриального генома. Как продемонстрировано на фиг.8Л, ставудин действительно индуцировал усиленное в результате синергизма уничтожение клеток сиросингопином. Следует отметить, что ингибитор обратной транскриптазы ВИЧ 3ТС (известный также как ламивудин и у которого отсутствует токсичность в отношении митохондрий) не обладал синергетическим действием при применении в сочетании с сиросингопином. Результаты этих экспериментов позволяют сделать заключение о том, что ингибиторы ЭТЦ в целом, но также и антимитохондриальные агенты, которые косвенно влияют на функцию ЭТЦ, усиливают в результате синергизма действие сиросингопина и представляют собой противораковые агенты и иммунодепрессанты, когда их применяют в нетоксичных концентрациях, но в сочетании с сиросингопином.
Для применения на практике соли, такие как малонат натрия, цианид калия и азид натрия, хотя они, как установлено, обладают синергетическим действием при применении с сиросингопином в опытах на клетках, не рассматриваются в качестве входящих в комбинацию с сиросингопином партнеров при создании противораковых средств и иммунодепрессантов. Однако представляющим интерес партнером для включения в комбинацию с сиросингопином является, например, олигомицин, поскольку даже в концентрации ниже 1 нМ это соединение уничтожает линии человеческих раковых клеток при его применении в сочетании с сиросингопином (фиг.10), не проявляя токсического действия в отсутствии сиросингопина (фиг.9).
Тест in vitro, демонстрирующий чувствительность к сиросингопину
В свете того, что, как описано выше, установлена возможность применения сиросингопина для лечения рака, важно иметь тест in vitro, позволяющий предсказывать чувствительность к нему раковых клеток. Поскольку существуют убедительные причины считать, что функциональной мишенью являются митохондрии (как в случае метформина), то оценивали воздействие сиросингопина на мембранный потенциал внутренней митохондриальной мембраны. У мембраны снаружи (т.е. в межмембранном пространстве) положительный заряд выше, чем внутри (в митохондриальном матриксе), поскольку митохондриальное дыхание включает вытекание протонов из митохондриального матрикса через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство. Матрикс, будучи более отрицательно заряженным, накапливает положительно заряженные липофильные молекулы, такие как TMRM (сложный метиловый эфир тетраметилродамина). Поскольку TMRM обладает флуоресценцией, то он функционирует в качестве потенциометрического красителя и облегчает оценку потенциала митохондриальной мембраны. На фиг.11 (панели 3-6) продемонстрировано, что увеличение количества сиросингопина приводит к повышению флуоресцентного сигнала TMRM (сдвиг вправо), что свидетельствует об увеличении положительной полярности мембраны. Происходит сдвиг пика флуоресценции с 403 (панель 1) до 955 (панель 9) условных единиц. Применение FCCP, разобщающего агента, который применяют в качестве контроля (панель 2), приводит к ожидаемому падению мембранного потенциала (что видно по сдвигу влево пика флуоресценции на 42 условные единицы). Поскольку разрушение этой имеющей решающее значение функции мембраны сиросингопином, по-видимому, вносит вклад в его синергетическую активность при применении в сочетании с метформином, известным слабым митохондриальным ингибитором, то раскрытие митохондриального действия сиросингопина позволяет осуществлять прямой тест чувствительности к сиросингопину раковых клеток.
С учетом указанных результатов изобретение относится также к способу определения того, обладает ли раковая клетка чувствительностью к обработке сиросингопином, заключающемуся в том, что осуществляют стадии, на которых
(а) получают суспензию одиночных клеток и культивируют раковые клетки в приемлемых средах,
(б) инкубируют раковую клетку с сиросингопином,
(в) инкубируют раковую клетку, полученную на стадии (б), с положительно заряженным флуоресцентным красителем,
(г) измеряют интенсивность возбужденной флуоресценции и
(д) сравнивают интенсивность флуоресценции, измеренную на стадии (г), с интенсивностью флуоресценции раковой клетки, которую инкубировали только с положительно заряженным флуоресцентным красителем,
и в котором относительное увеличение интенсивности флуоресценции раковых клеток, предварительно инкубированных с сиросингопином, свидетельствует о том, что клетки чувствительны к обработке сиросингопином.
Для практического применения раковая клетка представляет собой клетку, выделенную из потенциального пациента, подлежащего обработке комбинацией сиросингопина и митохондриального ингибитора. Приемлемые среды для культивирования указанных раковых клеток хорошо известны в данной области и включают, например, среду Дульбекко, модифицированную по методу Искова (IMDM) или среда RPMI 1640. Перед тестированием следует приготавливать суспензию одиночной клетки из полученного ex vivo материала опухоли. И в этом случае также применяют приемлемые стандартизованные коммерциализированные методологии, при осуществлении которых объединяют стадии физического разрушения и ферментативного расщепления (см., например, метод фирмы MiltenyiBiotec (http://www.miltenyibiotec.com/downloads/6760/6764/30501/PDF1.pdf) или фирмы Invitrogen (http://www.invitrogen.com/ЭТЦ/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.18492.File.dat/Dissociation_Cells_Y14477_Dissociation.pdf)). Для тестирования целесообразно предварительно инкубировать раковую клетку с взятым в различных концентрациях сиросингопином, например, от 0,1 мкМ и 10 мкМ, в течение 2-8 ч. Приемлемый положительно заряженный флуоресцентный краситель представляет собой TMRM (перхлорат сложного метилового эфира тетраметилродамина). Другими приемлемыми положительно заряженными красителями являются родамины TMRE (перхлорат сложного этилового эфира тетраметилродамина), родамин 123 (хлорид сложного метилового эфира родамина), родамин В (гидрохлорид тетраэтилродамина), Mito Tracker Red CMXRos® (CAS № 1Н,5Н,11Н,15Н-ксантено[2,3,4-ij:5,6,7-i′j′]дихинолизин-18-ий, 9-[4-(хлорметил)фенил]-2,3,6,7,12,13,16,17-октаногидро-, хлорид) и карбоцианины JC-1 (5,5′,6,6′-тетрахлор-1,1′,3,3′-тетраэтилбензимидазолокарбоцианинйодид) и DiOC6(3) (3,3′-дигексилбензооксазолкарбоцианинйодид).
Окрашивание с использованием предпочтительного флуоресцентного красителя TMRM (сложный метиловый эфир тетраметилродамина) предпочтительно осуществляют стандартными методами, например, которые представлены у поставщика фирма Serotec. Флуоресценцию измеряют при 575 нм после возбуждения при 488 нм, предпочтительно в стандартном поступающем в продажу проточном цитомере.
Если обнаружено, что раковая клетка обладает чувствительностью к сиросингопину, то соответствующего пациента, вероятно, можно эффективно лечить с помощью комбинаций сиросингопина и митохондриального ингибитора. Если раковая клетка не реагирует на сиросингопин при оценке с помощью соответствующего теста для оценки флуоресценции с использованием TMRM, то шансы на то, что пациента можно эффективно лечить с помощью комбинаций сиросингопина и митохондриального ингибитора, малы.
Примеры
Культура клеток
Линию мышиных тучных клеток 6.5 (Colombi и др., Oncogene, 30, 2011, cc.1551-1565) культивировали в среде IMDM, дополненной 10% FCS, 2 мМ L-глутамином, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанолом, добавляли экзогенный IL-3 в виде 1% кондиционированной среды, полученной из клеток линии Х63, секретирующих мышиный IL-3. Линии клеток человеческого лейкоза Jurkat, K562, ОРМ1, ОРМ2, RPMI8226 выращивали в среде RPMI-1640, дополненной 10% FCS, 2 мМ L-глутамином. Для ОРМ2 и RPMI8226 добавляли в среды рекомбинантный человеческий IL-6 (фирма Biomol) в концентрации 10 нг/мл. Другие линии человеческих раковых клеток MDA-468, MDA-231, A549, Н1299, AN3CA, JUSO, HT1080, МЕ-59, HL60, KG1, MOLT4, HeLa, PC3, DU145, LnCAP. LN229, U87 и NA-8 выращивали в среде Искова, содержащей 10% FCS, 2 мМ L-глутамин и 50 мкМ 2-меркаптоэтанол. Все клетки выращивали при 37°С в атмосфере 5% CO2.
Реагенты
Метформин и фенформин (фирма Sigma) приготавливали в виде 1М маточных растворов в ЗФР и выдерживали при 4°C, сиросингопин (фирма Extrasynthese) и резерпин (фирма Sigma) приготавливали в виде 5 мМ маточного раствора в ДМСО и хранили при -20°C. Маточные растворы пиерицидина А, эпиберберина, TTFA, антимицина А, олигомицина (фирма Sigma) и FCCP приготавливали в ДМСО; малонат натрия, KCN и NaN3 растворяли в стерильной дистиллированной воде, а маточные растворы ротенона и ставудина приготавливали в абсолютном этаноле.
Линия мышиных тучных клеток 6.5
Клетки линии 6.5 были охарактеризованы недавно (Colombi и др., Oncogene, 30, 2011, cc.1551-1565). Эти клетки создавали путем обработки тучных клеток линии 15V4 (Nair и др., Oncogene, 7, 1992, cc.1963-1972) мутагеном ICR191, что приводило к утрате супрессорного гена опухолей Pten. Указанная утрата аннулировала зависимость клеток от IL-3 и позволяла получать клетки с автономным ростом, которые образовывали опухоли у сингенных мышей.
Изучение ингибиторов на линии мышиных тучных клеток 6.5
Линия мышиных тучных клеток 6.5 характеризуется зависимостью от пути PI3K-mTOR-Akt, а также от пути МАР-киназы, о чем свидетельствует их чувствительность к наномолярным концентрациям ингибитора mTOR рапамицина (Colombi и др., Oncogene, 30, 2011, cc.1551-1565) или ингибитора MEK UO126.
Анализ клеточной пролиферации
Клетки высевали с требуемой плотностью (5000-15000 клеток на лунку в зависимости от типа клеток, 150 мкл среды на лунку) в плоскодонные 96-луночные планшеты и добавляли соединения в требуемых концентрациях. Через 3 дня анализировали пролиферацию, добавляя 0,1 об. AlamarBlue (фирма Invitrogen), и определяли флуоресценцию при длинах волн возбуждения/испускания 535/595 нм после осуществления цветной реакции в течение 4-6 ч. Результаты стандартизовали относительно результатов, измеренных для необработанных контрольных клеток, и рост выражали в виде процента от роста в контроле.
Анализ апоптоза
Апоптоз оценивали с помощью контрастного окрашивания аннексином V-ФИТЦ (фирма Invitrogen) и йодидом пропидия, и клетки анализировали методом FACS для разделения жизнеспособных/находящихся на ранней стадии апоптоза/находящихся на поздней стадии апоптоза подпопуляций. Клетки высевали с плотностью 100000 клеток/5 мл среды и добавляли указанные соединения. Через 3 дня собирали 500 мкл культуры и клетки промывали и окрашивали PI/аннексином V перед осуществлением FACS-анализа.
Мышиная модель сингенной опухоли
4×105 клеток линии 6.5 инъецировали в 150 мкл ЗФР в боковые области иммуносовместимых мышей линии DBA. Осуществляли мониторинг развития опухолей и обработку начинали, когда размер (в виде площади) опухолей достигал 100 мм2. Мышам ежедневно инъецировали внутрибрюшинно метформин (250 мг/кг веса тела), сиросингопин (2 мг/кг веса тела) или их комбинацию в течение 15 дней, после чего мышей умерщвляли для оценки опухолевой ткани.
Комбинация метформина и сиросингопина вызывает гибель мышиных тучных клеток линии 6.5
Осуществляли совместный скрининг лекарственных средств с использованием поступающей в продажу библиотеки лекарственных средств (фирма Prestwick Chemical Library) на мышиных клетках линии 6.5 в присутствии метформина (2 мМ) для идентификации соединений, которые могут действовать совместно с метформином в качестве дополнительного лекарственного средства, обеспечивая синергетическое уничтожение этих клеток.
Воздействие метформина и сиросингопина на стимулированную фитогемагглютинином Т-клеточную пролиферацию
Клетки лейкоцитарной пленки здорового человека получали из местного центра сдачи крови в соответствии с этическими требованиями. 80 мл крови разводили 200 мл среды Искова и наслаивали на градиент фиколла. Градиент центрифугировали при 1400×g в течение 5 мин для отделения фракции лейкоцитов от эритроцитов. Клетки высевали на сенсибилизированные планшеты для культуры ткани, выдерживали в течение 1 ч для удаления прикрепившихся клеток и оставшуюся клеточную суспензию собирали центрифугированием и подсчитывали с использованием гемоцитометра. Высевали по 50000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты и добавляли соединения в соответствии с различными режимами обработки до достижения конечного объема среды 150 мкл. Для стимуляции добавляли фитогемагглютинин до конечной концентрации 10 мкг/мл. В день 3 оценивали пролиферацию с помощью анализа с использованием AlamarBlue.
Измерение мембранного потенциала митохондриальной мембраны на основе анализа флуоресценции TMRM
Мышиные клетки линии 6.5 обрабатывали в течение 20 мин предназначенным для потенциоматрического анализа флуоресцентным красителем TMRM (сложный метиловый эфир тетраметилродамина, фирма AbD Serotec, 100 нМ) и оценивали интенсивность флуоресценции при длине волны испускания 575 нм после возбуждения при 488 нм с использованием проточного цитометра (фирма CellLabQuanta, Beckman Coulter). Этот краситель накапливается в митохондриальном матриксе, когда потенциал внутренней мембраны является более положительным снаружи вследствие выхода протонов. В качестве контроля клетки предварительно обрабатывали в течение 1 ч разобщающим агентом FCCP (карбонилцианид-пара-трифторметоксифенилгидразон), который приводит к диссипации мембранного потенциала и снижает интенсивность флуоресценции. Действие сиросингопина оценивали путем предварительной инкубации клеток с взятым в указанных возрастающих концентрациях сиросингопином в течение 4 ч и последующего окрашивания TMRM.
1. Фармацевтическая композиция, содержащая сиросингопин и митохондриальный ингибитор, где указанный митохондриальный ингибитор представляет собой метформин или фенформин.
2. Фармацевтическая композиция по п. 1, содержащая сиросингопин и метформин.
3. Фармацевтическая композиция по п. 1 или 2, в которой соотношение количеств (мас./мас.) сиросингопина и митохондриального ингибитора составляет от 1 к 10 до 1 к 1000.
4. Фармацевтическая композиция по п. 2, в которой соотношение количеств (мас./мас.) сиросингопина и метформина составляет от 1 к 10 до 1 к 200.
5. Комбинация сиросингопина и митохондриального ингибитора для применения при лечении рака или аутоиммунных заболеваний, где указанный митохондриальный ингибитор представляет собой метформин или фенформин.
6. Комбинация по п. 5, в которой митохондриальный ингибитор представляет собой метформин.
7. Комбинация сиросингопина и митохондриального ингибитора по п. 5 для применения при лечении карциномы, саркомы, лейкоза, миеломы, лимфомы и различных типов рака нервной системы.
8. Комбинация сиросингопина и митохондриального ингибитора по п. 5 для применения в иммуносуппрессорной терапии.
9. Комбинация сиросингопина и митохондриального ингибитора по п. 8 для применения при лечении аутоиммунных заболеваний кожи, нервной системы, соединительной ткани, мышц, кроветворной системы, костной ткани и внутренних органов.
10. Комбинация сиросингопина и митохондриального ингибитора по одному из пп. 6-9, где сиросингопин и митохондриальный ингибитор являются частью одной и той же фармацевтической композиции.
11. Комбинация сиросингопина и митохондриального ингибитора по одному из пп. 6-9, где сиросингопин и митохондриальный ингибитор находятся в разных фармацевтических композициях.
12. Применение комбинации сиросингопина и митохондриального ингибитора для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения рака или аутоиммунного заболевания, где указанный митохондриальный ингибитор представляет собой метформин или фенформин.
13. Способ определения, является ли раковая клетка чувствительной к лечению сиросингопином, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых
(а) получают суспензию одиночных клеток и культивируют раковые клетки в приемлемых средах,
(б) инкубируют раковую клетку с сиросингопином,
(в) инкубируют раковую клетку, полученную на стадии (б), с положительно заряженным флуоресцентным красителем,
(г) измеряют интенсивность возбужденной флуоресценции и
(д) сравнивают интенсивность флуоресценции, измеренную на стадии (г), с интенсивностью флуоресценции раковой клетки, которую инкубировали только с положительно заряженным флуоресцентным красителем,
и в котором относительное увеличение интенсивности флуоресценции раковых клеток, предварительно инкубированных с сиросингопином, свидетельствует о том, что клетки чувствительны к обработке сиросингопином.
14. Способ лечения рака или аутоиммунного заболевания, заключающийся в том, что вводят теплокровному животному, которое нуждается в таком лечении, комбинацию сиросингопина и митохондриального ингибитора или фармацевтическую композицию, содержащую сиросингопин и митохондриальный ингибитор, в количестве, эффективном в отношении указанного заболевания, где указанный митохондриальный ингибитор представляет собой метформин или фенформин.
