Il-1 альфа и бета биспецифические иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение

Изобретение относится к области биохимии. Заявлены связывающие белки, представляющие собой иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами, которые связывают IL-1α и IL-1β. Кроме того, изобретение относится к способам получения, а также к применению указанных белков, в том числе в составе фармацевтической композиции, для лечения индивидуума от заболевания или нарушения, при котором активность IL-1α и IL-1β или IL-1β является вредоносной. Изобретение позволяет с высокой аффинностью связывать IL-1α и IL-1β. 8 н. и 24 з.п. ф-лы, 2 ил., 24 табл., 2 пр.

 

Перекрестная ссылка на связанную заявку

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявка США с серийным № 61/425671, зарегистрированной 21 декабря 2010 года, содержание которой включено в настоящий документ.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к поливалентным и полиспецифическим связывающим белкам, способам их получения, а особенно их применениям в диагностике, предотвращении и/или лечении острых и хронических воспалительных заболеваний, злокачественных опухолей и других заболеваний.

Уровень техники, предшествующий изобретению

В данной области известны сконструированные белки, такие как полиспецифические антитела, которые связывают два или более антигенов. Такие полиспецифические связывающие белки можно получать с использованием слияния клеток, химической конъюгации или технологии рекомбинантной ДНК.

Биспецифические антитела получали с использованием квадромной технологии (см. Milstein and Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40) на основе соматического слияния двух различных гибридомных клеточных линий, экспрессирующих моноклональные антитела (mAb) мыши с желаемой специфичностью биспецифического антитела. Вследствие случайного спаривания тяжелых и легких цепей двух различных иммуноглобулинов (Ig) в полученной гибрид-гибридомной (или квадромной) клеточной линии образуются до десяти различных видов молекул Ig, из которых только одна представляет собой функциональное биспецифическое антитело. Наличие неправильно спаренных побочных продуктов и значительно сниженные выходы продуктов означают необходимость сложных процедур очистки.

Биспецифические антитела также можно получать посредством химической конъюгации двух различных mAb (см. Staerz et al. (1985) Nature 314(6012):628-31). Этот подход не приводит к получению гомогенного препарата. В других подходах использовали химическую конъюгацию двух различных mAb или более мелких фрагментов антител (см. Brennan et al. (1985) Science 229(4708):81-3).

Другой способ, применяемый для получения биспецифических антител, представляет собой связывание двух исходных антител гетеробифункциональным кросслинкером, но получаемые в результате биспецифические антитела страдают значительной молекулярной гетерогенностью вследствие отсутствия сайт-специфичности реакции кросслинкера с исходными антителами. Для получения более гомогенных препаратов биспецифических антител два различных фрагмента Fab сайт-специфическим способом химически сшивали по их шарнирным остаткам цистеина (см. Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139(7):2367-75). Но этот способ приводил к получению фрагментов Fab'₂, являющихся не совсем молекулами IgG.

Разработан широкий спектр других форматов рекомбинантных биспецифических антител (см. Kriangkum et al. (2001) Biomol. Eng. 18(2):31-40). Среди них наиболее широко используются тандемные молекулы одноцепочечных Fv и диатела и их различные производные. В соответствии с предписанием конструирование этих молекул начинают с двух фрагментов одноцепочечных Fv (scFv), распознающих различные антигены (см. Economides et al. (2003) Nat. Med. 9(l):47-52). Тандемные молекулы scFv (taFv) представляют собой прямолинейный формат, просто соединяющий две молекулы scFv дополнительным пептидным линкером. Два фрагмента scFv, присутствующие в этих тандемных молекулах scFv, формируют отдельно сворачивающиеся структуры. Для связывания двух фрагментов scFv можно использовать различные линкеры и линкеры с длиной до 63 остатков (см. Nakanishi et al. (2001) Ann. Rev. Immunol. 19:423-74). Несмотря на то, что, как правило, исходные фрагменты scFv можно экспрессировать в бактериях в растворимой форме, при этом часто наблюдают, что тандемные молекулы scFv формируют в бактериях нерастворимые агрегаты. Таким образом, для получения растворимых тандемных молекул scFv, как правило, применяют протоколы рефолдинга и использование экспрессирующих систем млекопитающих. Недавно опубликовано исследование экспрессии у трансгенных кроликов и крупного рогатого скота in vivo тандемных scFv к CD28 и ассоциированному с меланомой протеогликану (см. Gracie et al. (1999) J. Clin. Invest. 104(10):1393-401). В этой конструкции две молекулы scFv связывали линкером CH1 и выявляли концентрации биспецифического антитела в сыворотке до 100 мг/л. Для обеспечения экспрессии растворимых форм в бактериях использовали различные стратегии, включая вариации порядка доменов или использование промежуточных линкеров с варьирующей длиной или гибкостью. В настоящее время опубликовано несколько исследований с экспрессией растворимых тандемных молекул scFv в бактериях (см. Leung et al. (2000) J. Immunol. 164(12):6495-502; Ito et al. (2003) J. Immunol. 170(9):4802-9; Kami et al. (2002) J. Neuroimmunol. 125(1-2):134-40) с использованием или очень короткого линкера Ala3, или длинных богатых глицином/серином линкеров. В недавнем исследовании для обогащения молекулами, продуцируемыми в бактериях в растворимой и активной форме, использовали фаговый дисплей репертуара тандемных scFv, содержащих случайные промежуточные линкеры с длиной 3 или 6 остатков. Этот подход привел к выделению молекулы тандемных scFv c линкером из 6 аминокислотных остатков (см. Arndt and Krauss (2003) Methods Mol. Biol. 207:305-21). Остается неясным, представляет ли эта линкерная последовательность общее решение для экспрессии растворимых форм молекул тандемных scFv. Однако это исследование продемонстрировало, что фаговый дисплей молекул тандемных scFv в комбинации с направленным мутагенезом является эффективным способом для обогащения этими молекулами, которые можно экспрессировать в бактериях в активной форме.

В биспецифических диателах (Db) для экспрессии используют формат диатела. Диатела получают из фрагментов scFv, уменьшая длину линкера, связывающего домены VH и VL, приблизительно до 5 остатков (см. Peipp and Valerius (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-11). Это уменьшение размера линкера способствует димеризации двух полипептидных цепей посредством перекрестного спаривания доменов VH и VL. Биспецифические диатела получают посредством экспрессии в одной клетке двух полипептидных цепей со структурами или VHA-VLB и VHB-VLA (конфигурация VH-VL), или VLA-VHB и VLB-VHA (конфигурация VL-VH). В прошлом получено большое разнообразие различных биспецифических диател, и большинство из них экспрессируют в растворимой форме в бактериях. Однако недавнее сравнительное исследование демонстрирует, что ориентация вариабельных доменов может влиять на экспрессию и формирование активных участков связывания (см. Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(15):7021-5). Однако экспрессия растворимых форм в бактериях представляет собой важное преимущество над молекулами тандемных scFv. Однако так как две различные полипептидные цепи экспрессируют в одной клетке, совместно с активными гетеродимерами можно получать неактивные гомодимеры. Это делает необходимым для получения гомогенных препаратов биспецифических диател применение дополнительных этапов очистки. Одним из подходов для форсированного получения биспецифических диател является получение антител с выступами во впадины (см. Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14):6444-8.18). Это продемонстрировано для биспецифического диатела к HER2 и CD3. В домен VH вносили большой выступ посредством замены Val37 на Phe и Leu45 на Trp и получали комплементарную впадину в домене VL посредством мутации Phe98 в Met и Tyr87 в Ala в любом из вариабельных доменов антител к HER2 или к CD3. С применением этого подхода получение биспецифических диател можно увеличить с 72% исходного антитела до более 90% у диатела с выступом во впадину. Важно, что выходы продукции в результате этих мутаций всего лишь незначительно снижаются. Однако для некоторых конструкций наблюдали снижение активности связывания антигена. Таким образом, этот довольно сложный подход для идентификации тех мутаций, которые приводят к получению гетеродимерной молекулы с неизмененной активностью связывания, требует анализа различных конструкций. Кроме того, такой подход требует мутационной модификации последовательности иммуноглобулина в константной области, таким образом, формируя неприродную и неестественную форму последовательности антитела, которая может приводить к увеличенной иммуногенности, плохой стабильности in vivo, а также неподходящей фармакокинетике.

Альтернативной стратегией для улучшения получения подобных биспецифическим диателам молекул являются одноцепочечные диатела (scDb) (см. Holliger and Winter (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4):128-30; Wu et al. (1996) Immunotechnology 2(1):21-36). Биспецифические одноцепочечные диатела получают, связывая две формирующих диатела цепи дополнительным промежуточным линкером с длиной приблизительно 15 аминокислотных остатков. Таким образом, все молекулы с молекулярной массой, соответствующей мономерным одноцепочечным диателам (50-60 кДа), являются биспецифическими. В нескольких исследованиях продемонстрировано, что биспецифические одноцепочечные диатела экспрессируются в бактериях в растворимой и активной форме с большинством очищаемых молекул, представленных в виде мономеров (см. Holliger and Winter (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4):128-30; Wu et al. (1996) Immunotechnol. 2(l):21-36; Pluckthun and Pack (1997) Immunotechnol. 3(2):83-105; Ridgway et al. (1996) Protein Engin. 9(7):617-21). Таким образом, одноцепочечные диатела комбинируют преимущества тандемных scFv (все мономеры являются биспецифическими) и диател (экспрессия растворимых форм в бактериях).

В последнее время диатела сливали с Fc с получением более похожих на Ig молекул, называемых ди-диателами (см. Lu et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(4):2856-65). Кроме того, описаны поливалентные конструкции на основе антител, содержащие два повторяющихся Fab в тяжелой цепи IgG, и связывающие четыре антигенные молекулы (см. публикацию PCT № WO 0177342 и Miller et al. (2003) J. Immunol. 170(9):4854-61).

В данной области существует необходимость в улучшенных поливалентных связывающих белках, связывающих два или более антигенов. В патенте США № 7612181 предоставлено новое семейство связывающих белков, которые с высокой аффинностью связывают два или более антигенов, и которые называют иммуноглобулинами с двойными вариабельными доменами (DVD-Ig™). Настоящее изобретение относится к дополнительным новым связывающим белкам, которые связывают два или более антигенов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к поливалентным связывающим белкам, которые связывают два или более антигенов.

Настоящее изобретение относится к новому семейству связывающих белков, с высокой аффинностью связывающих два или более антигенов.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к связывающему белку, содержащему полипептидную цепь, где полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен, VD2 представляет собой второй вариабельный домен, C представляет собой константный домен, X1 представляет собой аминокислоту или полипептид, X2 представляет собой Fc-область, и n представляет собой 0 или 1. В одном из вариантов осуществления VD1 и VD2 в связывающем белке представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей. В другом варианте осуществления вариабельный домен тяжелой цепи выбран из группы, состоящей из вариабельного домена тяжелой цепи мыши, вариабельного домена тяжелой цепи человека, вариабельного домена тяжелой цепи с привитыми CDR и гуманизированного вариабельного домена тяжелой цепи. В другом варианте осуществления VD1 и VD2 связывают один и тот же антиген. В другом варианте осуществления VD1 и VD2 связывают различные антигены. В другом варианте осуществления C представляет собой константный домен тяжелой цепи. Например, X1 представляет собой линкер при условии, что X1 не представляет собой CH1. Например, X1 представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G₄S)₄ (SEQ ID NO: 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 27) и ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 28). В одном из вариантов осуществления X2 представляет собой Fc-область. В другом варианте осуществления X2 представляет собой вариант Fc-области.

В одном из вариантов осуществления связывающие белки, описываемые в настоящем документе, содержат полипептидную цепь, где полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, C представляет собой константный домен тяжелой цепи, X1 представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, и X2 представляет собой Fc-область.

В одном из вариантов осуществления VD1 и VD2 в связывающем белке представляют собой вариабельные домены легких цепей. В одном из вариантов осуществления вариабельный домен легкой цепи выбран из группы, состоящей из вариабельного домена легкой цепи мыши, вариабельного домена легкой цепи человека, вариабельного домена легкой цепи с привитыми CDR и гуманизированного вариабельного домена легкой цепи. В одном из вариантов осуществления VD1 и VD2 связывают один и тот же антиген. В другом варианте осуществления VD1 и VD2 связывают различные антигены.

В одном из вариантов осуществления C представляет собой константный домен легкой цепи. В другом варианте осуществления X1 представляет собой линкер при условии, что X1 не представляет собой CL1. В одном из вариантов осуществления X1 представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G₄S)₄ (SEQ ID NO: 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 27) и ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 28). В одном из вариантов осуществления связывающий белок не содержит X2.

В одном из вариантов осуществления вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат один и тот же линкер. В другом варианте осуществления вариабельные области тяжелых и вариабельные области легких цепей содержат различные линкеры. В другом варианте осуществления вариабельные области тяжелых цепей и вариабельные области легких цепей содержат короткий (приблизительно 6 аминокислот) линкер. В другом варианте осуществления вариабельные области тяжелых цепей и вариабельные области легких цепей содержат длинный (более 6 аминокислот) линкер. В другом варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит короткий линкер, а вариабельная область легкой цепи содержит длинный линкер. В другом варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит длинный линкер, а вариабельная область легкой цепи содержит короткий линкер.

В одном из вариантов осуществления связывающие белки, описываемые в настоящем документе, содержат полипептидную цепь, где указанная полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, C представляет собой константный домен легкой цепи, X1 представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, и X2 не содержит Fc-область.

В другом варианте осуществления изобретение относится к связывающему белку, содержащему две полипептидные цепи, где указанная первая полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, C представляет собой константный домен тяжелой цепи, X1 представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, и X2 представляет собой Fc-область; и указанная вторая полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, C представляет собой константный домен легкой цепи, X1 представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, и X2 не содержит Fc-область. В конкретном варианте осуществления связывающий белок с двойными вариабельными доменами (DVD) содержит четыре полипептидные цепи, где первые две полипептидные цепи содержат VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, соответственно, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, C представляет собой константный домен тяжелой цепи, X1 представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, и X2 представляет собой Fc-область; и вторые две полипептидные цепи содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, соответственно, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, C представляет собой константный домен легкой цепи, X1 представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, и X2 не содержит Fc-область. Такой связывающий белок с двойными вариабельными доменами (DVD) содержит четыре антигенсвязывающих участка.

В другом варианте осуществления связывающие белки, описываемые в настоящем документе, связывают одну или несколько мишеней. В одном из вариантов осуществления мишень выбрана из группы, состоящей из цитокинов, белков клеточной поверхности, ферментов и рецепторов. В другом варианте осуществления связывающий белок модулирует биологическую функцию одной или нескольких мишеней. В другом варианте осуществления связывающий белок нейтрализует одну или несколько мишеней. Связывающие белки по изобретению связывают цитокины, выбранные из группы, состоящей из лимфокинов, монокинов, полипептидных гормонов, рецепторов или опухолевых маркеров. Например, DVD-Ig по изобретению способны к связыванию двух или более из следующего: интерлейкин-1 альфа (IL-1α) и интерлейкин-1 бета (IL-1β).

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 3) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 52 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 53.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 2) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 56; и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 57. В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 2) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 54 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 55. В другом варианте осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 2) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 56 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 57.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 1) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 60; и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 61. В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 1) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 58 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 59. В другом варианте осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 1) и IL-1β (посл. 1), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 60 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 61.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 3) и IL-1β (посл. 2), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 62 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 63.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 4) и IL-1β (посл. 2), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 64 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 65.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 4) и IL-1β (посл. 3), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 66 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 67.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 4) и IL-1β (посл. 4), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 69.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок, связывающий IL-1α (посл. 4) и IL-1β (посл. 5), содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 70 и аминокислотную последовательность легкой цепи DVD-Ig SEQ ID NO: 71.

В другом варианте осуществления изобретение относится к связывающему белку, содержащему полипептидную цепь, где указанная полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен тяжелой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n представляет собой Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует. В одном из вариантов осуществления Fc-область в связывающем белке отсутствует.

В другом варианте осуществления изобретение относится к связывающему белку, содержащему полипептидную цепь, где указанная полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен легкой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n не содержит Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует. В одном из вариантов осуществления (X2)n в связывающем белке отсутствует.

В другом варианте осуществления связывающий белок по изобретению содержит первую и вторую полипептидные цепи, где указанная первая полипептидная цепь содержит первую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен тяжелой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n представляет собой Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует; и где указанная вторая полипептидная цепь содержит вторую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен легкой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n не содержит Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует. В другом варианте осуществления связывающий белок содержит две первые полипептидные цепи и две вторые полипептидные цепи. В еще одном варианте осуществления (X2)n во втором полипептиде отсутствует. В еще одном варианте осуществления Fc-область, если присутствует в первом полипептиде, выбрана из группы, состоящей из Fc-области с природной последовательностью и Fc-области с вариантом последовательности. В еще одном варианте осуществления Fc-область выбрана из группы, состоящей из Fc-области из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE и IgD.

В другом варианте осуществления связывающий белок по изобретению представляет собой DVD-Ig, связывающий два антигена, содержащий четыре полипептидные цепи, где каждая из первой и третьей полипептидных цепей содержат VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где,VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен тяжелой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n представляет собой Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует; и где каждая из второй и четвертой полипептидных цепей содержат VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен легкой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n не содержит Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует.

Изобретение относится к способу получения связывающего белка DVD-Ig посредством предварительного выбора исходных антител. В одном из вариантов осуществления способ получения иммуноглобулина с двойными вариабельными доменами, связывающего два антигена, включает этапы a) получения первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части, связывающего первый антиген; b) получения второго исходного антитело или его антигенсвязывающей части, связывающего второй антиген; c) конструирования первой и третьей полипептидных цепей, каждая из которых содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из указанного первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из указанного второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен тяжелой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n представляет собой Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует; d) конструирования второй и четвертой полипептидных цепей, каждая из которых содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из указанного первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из указанного второго исходного антитела или его антигенсвязывающей часть, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен легкой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n не содержит Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует; и e) экспрессии указанных первой, второй, третьей и четвертой полипептидных цепей так, что получают молекулу DVD-Ig, связывающую указанный первый и указанный второй антигены.

В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения молекулы DVD-Ig, связывающей два антигена с желаемыми свойствами, включающему этапы a) получения первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части, связывающего первый антиген и обладающего по меньшей мере одним желаемым свойством, проявляемым молекулой DVD-Ig; b) получения второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, связывающего второй антиген и обладающего по меньшей мере одним желаемым свойством, проявляемым молекулой DVD-Ig; c) конструирования первой и третьей полипептидных цепей, содержащих VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из указанного первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из указанного второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен тяжелой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n представляет собой Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует; d) конструирования второй и четвертой полипептидных цепей, содержащих VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из указанного первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из указанного второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела; C представляет собой константный домен легкой цепи; (X1)n представляет собой линкер при условии, что он не представляет собой CH1, где указанная (X1)n присутствует или отсутствует; и (X2)n не содержит Fc-область, где указанная (X2)n присутствует или отсутствует; e) экспрессии указанных первой, второй, третьей и четвертой полипептидных цепей так, что получают иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами, связывающий указанный первый и указанный второй антигены, с желаемыми свойствами.

В одном из вариантов осуществления VD1 первой и второй полипептидных цепей, описываемых в настоящем документе, получают из одного и того же исходного антитела или его антигенсвязывающей части. В другом варианте осуществления VD1 первой и второй полипептидных цепей, описываемых в настоящем документе, получают из различных исходных антител или их антигенсвязывающих частей. В другом варианте осуществления VD2 первой и второй полипептидных цепей, описываемых в настоящем документе, получают из одного и того же исходного антитела или его антигенсвязывающей части. В другом варианте осуществления VD2 первой и второй полипептидных цепей, описываемых в настоящем документе, получают из различных исходных антител или их антигенсвязывающих частей.

В одном из вариантов осуществления первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть являются одним и тем же антителом. В другом варианте осуществления первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть являются различными антителами.

В одном из вариантов осуществления первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает первый антиген, а второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает второй антиген. В конкретном варианте осуществления первый и второй антигены являются одним и тем же антигеном. В другом варианте осуществления исходные антитела связывают различные эпитопы на одном антигене. В другом варианте осуществления первый и второй антигены являются различными антигенами. В другом варианте осуществления первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает первый антиген с активностью, отличной от активности, с которой второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает второй антиген. В еще одном варианте осуществления первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть, связывает первый антиген с аффинностью, отличной от аффинности, с которой второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает второй антиген.

В другом варианте осуществления первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть выбраны из группы, состоящей из антитела человека, антитела с привитыми CDR и гуманизированного антитела. В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающие части выбраны из группы, состоящей из фрагмента Fab, фрагмента F(ab')₂, бивалентного фрагмента, содержащего два фрагмента Fab, связанные в шарнирной области дисульфидным мостиком; фрагмента Fd, состоящего из доменов VH и CH1; фрагмента Fv, состоящего из доменов VL и VH одного плеча антитела, фрагмента dAb, выделенной определяющей комплементарность области (CDR), одноцепочечного антитела и диател.

В другом варианте осуществления связывающий белок по изобретению обладает по меньшей мере одним желаемым свойством, проявляемым первым исходным антителом или его антигенсвязывающей частью или вторым исходным антителом или его антигенсвязывающей частью. Альтернативно, первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть обладают по меньшей мере одним желаемым свойством, проявляемым иммуноглобулином с двойными вариабельными доменами. В одном из вариантов осуществления желаемое свойство выбрано из одного или нескольких параметров антитела. В другом варианте осуществления параметры антитела выбраны из группы, состоящей из следующего: антигенная специфичность, аффинность к антигену, активность, биологическая функция, распознавание эпитопа, стабильность, растворимость, эффективность продукции, иммуногенность, фармакокинетика, биодоступность, тканевая перекрестная реактивность и связывание ортологичных антигенов. В одном из вариантов осуществления связывающий белок является поливалентным. В другом варианте осуществления связывающий белок является полиспецифическим. Поливалентные и/или полиспецифические связывающие белки, описываемые в настоящем документе, обладают желательными свойствами особенно с терапевтической точки зрения. Например, поливалентный и/или полиспецифический связывающий белок может (1) интернализоваться (и/или катаболизироваться) клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связываются антитела, быстрее, чем бивалентное антитело; (2) являться антителом-агонистом и/или (3) индуцировать гибель и/или апоптоз клеток, экспрессирующих антиген, с которым связывается поливалентное антитело. "Исходное антитело", обеспечивающее по меньшей мере одну специфичность связывания антигена поливалентных и/или полиспецифических связывающих белков, может представлять собой антитело, которое интернализуется (и/или катаболизируется) клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связывается антитело; и/или может являться антителом-агонистом, индуцирующим гибель клеток и/или индуцирующим апоптоз антителом, и поливалентный и/или полиспецифический связывающий белок, как описано в настоящем документе, может демонстрировать улучшение(я) одного или нескольких из этих свойств. Кроме того, у исходного антитела может отсутствовать любые одно или несколько из этих свойств, но оно может приобретать их при конструировании в виде поливалентного связывающего белка, как описано в настоящем документе.

В другом варианте осуществления связывающий белок по изобретению обладает константой ассоциации (K_on) в отношении одной или нескольких мишеней, выбранной из группы, состоящей из: по меньшей мере приблизительно 10² M^-1сек^-1; по меньшей мере приблизительно 10³ M^-1сек^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁴ M^-1сек^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁵ M^-1сек^-1; и по меньшей мере приблизительно 10⁶ M^-1сек^-1, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса. В одном из вариантов осуществления связывающий белок по изобретению обладает константой ассоциации (K_on) в отношении одной или нескольких мишеней приблизительно от 10² M^-1сек^-1 до приблизительно 10³ M^-1сек^-1; приблизительно от 10³ M^-1сек^-1 до приблизительно 10⁴ M^-1сек^-1; приблизительно от 10⁴ M^-1сек^-1 до приблизительно 10⁵ M^-1сек^-1 или приблизительно от 10⁵ M^-1сек^-1 до приблизительно 10⁶ M^-1сек^-1, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса.

В другом варианте осуществления связывающий белок обладает константой диссоциации (K_off) в отношении одной или нескольких мишеней, выбранной из группы, состоящей из: максимум приблизительно 10^-3 сек^-1; максимум приблизительно 10^-4 сек^-1; максимум приблизительно 10^-5 сек^-1 и максимум приблизительно 10^-6 сек^-1, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса. В одном из вариантов осуществления связывающий белок по изобретению обладает константой диссоциации (K_off) в отношении одной или нескольких мишеней приблизительно от 10^-3 сек^-1 до приблизительно 10^-4 сек^-1; приблизительно от 10^-4 сек^-1 до приблизительно 10^-5 сек^-1; или приблизительно от 10^-5 сек^-1 до приблизительно 10^-6 сек^-1, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса.

В другом варианте осуществления связывающий белок обладает константой диссоциации (K_D) в отношении одной или нескольких мишеней, выбранной из группы, состоящей из: максимум приблизительно 10^-7 M; максимум приблизительно 10^-8 M; максимум приблизительно 10^-9 M; максимум приблизительно 10^-10 M; максимум приблизительно 10^-11 M; максимум приблизительно 10^-12 M и максимум приблизительно 10^-13 M. В одном из вариантов осуществления связывающий белок по изобретению обладает константой диссоциации (K_D) в отношении его мишеней приблизительно от 10^-7 M до приблизительно 10^-8 M; приблизительно от 10^-8 M до приблизительно 10^-9 M; приблизительно от 10^-9 M до приблизительно 10^-10 M; приблизительно от 10^-10 до приблизительно 10^-11 M; приблизительно от 10^-11 M до приблизительно 10^-12 M или приблизительно от 10^-12 M до приблизительно 10^-13 M.

В другом варианте осуществления связывающие белки, описываемые в настоящем документе, представляют собой конъюгаты, дополнительно содержащие средство, выбранное из группы, состоящей из молекулы иммуноадгезии, визуализирующего средства, терапевтического средства и цитотоксического средства. В одном из вариантов осуществления визуализирующее средство выбрано из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина. В другом варианте осуществления визуализирующее средство представляет собой радиоактивную метку, выбранную из группы, состоящей из: ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho и ¹⁵³Sm. В еще одном варианте осуществления терапевтическое или цитотоксическое средства выбраны из группы, состоящей из антиметаболита, алкилирующего средства, антибиотика, фактора роста, цитокина, антиангиогенного средства, антимитотического средства, антрациклина, токсина и апоптотического средства.

В другом варианте осуществления связывающие белки, описываемые в настоящем документе, связываются с клеточным белком и средством, выбранным из группы, состоящей из молекулы иммуноадгезии, визуализирующего средства, терапевтического средства и цитотоксического средства. В одном из вариантов осуществления визуализирующее средство выбрано из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина. В другом варианте осуществления визуализирующее средство представляет собой радиоактивную метку, выбранную из группы, состоящей из ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho и ^sureSm. В еще одном варианте осуществления терапевтическое или цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из антиметаболита, алкилирующего средства, антибиотика, фактора роста, цитокина, антиангиогенного средства, антимитотического средства, антрациклина, токсина и апоптотического средства.

В другом варианте осуществления связывающие белки, описываемые в настоящем документе, представляют собой кристаллизуемые связывающие белки и существуют в виде кристалла. В одном из вариантов осуществления кристалл представляет собой не содержащий носителя фармацевтический кристалл с контролируемым высвобождением. В еще одном варианте осуществления кристаллизуемый связывающийся белок обладает большим временем полужизни in vivo, чем растворимая копия указанного связывающего белка. В еще одном варианте осуществления кристаллизуемый связывающий белок сохраняет биологическую активность.

В другом варианте осуществления связывающие белки, описываемые в настоящем документе, являются гликозилированными. Например, гликозилирование представляет собой профиль гликозилирования человека.

Один из аспектов изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей любой из связывающих белков, описываемых в настоящем документе. Дополнительный вариант осуществления относится к вектору, содержащему выделенную нуклеиновую кислоту, описываемую в настоящем документе, где указанный вектор выбран из группы, состоящей из pcDNA; pTT (Durocher et al. (2002) Nucl. Acids Res. 30:2; pTT3 (pTT с дополнительным участком множественного клонирования; pEFBOS (Mizushima and Nagata, (1990) Nucl. Acids Res. 18:17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO и pBJ. В одном из вариантов осуществления вектор представляет собой вектор, описанный в патентной публикации США № 20090239259.

В другом аспекте клетка-хозяин трансформирована вектором, описываемым в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку. В другом варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой E. coli. В родственном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. В другом варианте осуществления эукариотическая клетка выбрана из группы, состоящей из клетки одноклеточного организма, клетки животного, клетки растения и клетки гриба. В еще одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, включая в качестве неограничивающих примеров CHO, COS; NS0, SP2, PER.C6 или клетку гриба, такого как Saccharomyces cerevisiae; или клетку насекомого, такую как Sf9.

В одном из вариантов осуществления в одной рекомбинантной клетке-хозяине получают два или более DVD-Ig, например, с различными специфичностями. Например, экспрессия смеси антител названа Oligoclonics™ Merus B.V., The Netherlands; патенты США №№ 7262028 и 7429486.

Другой аспект изобретения относится к способу получения связывающего белка, описываемого в настоящем документе, включающему культивирование любой из клеток-хозяев, также описываемых в настоящем документе, в среде для культивирования в условиях, подходящих для получения связывающего белка. В одном из вариантов осуществления 50%-75% связывающего белка, получаемого этим способом, представляют собой четырехвалентный связывающий белок с двойной специфичностью. В конкретном варианте осуществления 75%-90% связывающего белка, получаемого этим способом, представляют собой четырехвалентный связывающий белок с двойной специфичностью. В конкретном варианте осуществления 90%-95% получаемого связывающего белка представляют собой четырехвалентный связывающий белок с двойной специфичностью.

Один из вариантов осуществления относится к композиции для высвобождения связывающего белка, где композиция содержит состав, который в свою очередь содержит кристаллизуемый связывающий белок, как описано в настоящем документе, и ингредиент и по меньшей мере один полимерный носитель. Например, полимерный носитель содержит один или несколько полимеров, выбранных из группы, состоящей из поли(акриловой кислоты), поли(цианоакрилатов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(депсипептида), сложных полиэфиров, поли(молочной кислоты), сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты или PLGA, поли(β-гидроксибутирата), поли(капролактона), поли(диоксанона); поли(этиленгликоля), поли(гидроксипропил)метакриламида, поли[(органо)фосфазена], сложных поли(ортоэфиров), поли(винилового спирта), поли(винилпирролидона), сополимеров малеинового ангидрида-алкилвинилового эфира, полиолов-плюроников, альбумина, альгината, целлюлозы и производных целлюлозы, коллагена, фибрина, желатина, гиалуроновой кислоты, олигосахаридов, гликаминогликанов, сульфатированных полисахаридов, их смесей и сополимеров. Например, ингредиент выбран из группы, состоящей из альбумина, сахарозы, трегалозы, лактитола, желатина, гидроксипропил-β-циклодекстрина, метоксиполиэтиленгликоля и полиэтиленгликоля. Другой вариант осуществления относится к способу лечения млекопитающего, включающему этап введения млекопитающему эффективного количества композиции, описываемой в настоящем документе.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей связывающий белок, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В дополнительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство для лечения нарушения. Например, дополнительное средство выбрано из группы, состоящей из терапевтического средства, визуализирующего средства, цитотоксического средства, ингибитора ангиогенеза (включая в качестве неограничивающих примеров антитело к VEGF или ловушку VEGF), ингибитора киназы (включая в качестве неограничивающих примеров KDR и ингибитор TIE-2), блокатора костимулирующей молекулы (включая в качестве неограничивающих примеров антитело к B7.1, антитело к B7.2, CTLA4-Ig, антитело к B7.CD20), блокатора молекулы адгезии (включая в качестве неограничивающих примеров антитело к LFA-1, антитело к селектинам E/L, низкомолекулярный ингибитор), антитела к цитокину или его функционального фрагмента (включая в качестве неограничивающих примеров антитело к IL-18, антитело к TNF и антитело к IL-6/антитело к рецептору цитокина), метотрексата, циклоспорина, рапамицина, FK506, детектируемой метки или репортера, антагониста TNF, антиревматического средства, миорелаксанта, наркотического средства, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (NSAID), анальгетика, анестетика, седативного средства, местного анестетика, блокатора нервно-мышечного проведения, противомикробного средства, антипсориатического средства, кортикостероида, анаболического стероида, эритропоэтина, иммунизации, иммуноглобулина, иммуносупрессивного средства, гормона роста, гормонозамещающего лекарственного средства, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, антипсихотического средства, стимулятора, противоастматического средства, агониста бета-рецепторов, ингалируемого стероида, эпинефрина или его аналога, цитокина и антагониста цитокина.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения человека, страдающего нарушением, у которого причиняют ущерб мишень или мишени, способные к связыванию со связывающим белком, описываемым в настоящем документе, включающему введение человеку связывающего белка, описываемого в настоящем документе, так, что происходит ингибирование активности мишени или мишеней у человека и ослабляется один из множества симптомов или достигается лечение. Например, нарушение выбрано из группы, включающей артрит, остеоартрит, юношеский хронический артрит, септический артрит, артрит Лайма, псориатический артрит, реактивный артрит, спондилоартропатию, системную красную волчанку, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, инсулинозависимый сахарный диабет, тиреоидит, астму, аллергические заболевания, псориаз, дерматит, склеродермию, реакцию "трансплантат против хозяина", отторжение трансплантата-органа, острое или хроническое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органа, саркоидоз, атеросклероз, диссеминированное внутрисосудистое свертывание, синдром Кавасаки, болезнь Грейва, нефротический синдром, синдром хронической усталости, гранулематоз Вегенера, пурпуру Шенлейна-Геноха, микроскопический васкулит почек, хронический активный гепатит, увеит, септический шок, синдром токсического шока, септический синдром, кахексию, инфекционные заболевания, паразитарные заболевания, синдром приобретенного иммунодефицита, острый поперечный миелит, хорею Хантингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, инсульт, первичный биллиарный цирроз, гемолитическую анемию, злокачественные новообразования, сердечную недостаточность, инфаркт миокарда, болезнь Аддисона, спорадическую полигландулярную недостаточность типа I и полигландулярную недостаточность типа II, синдром Шмидта, респираторный дистресс-синдром взрослых (острый), алопецию, очаговую алопецию, серонегативную артропатию, артропатию, болезнь Рейтера, псориатическую артропатию, артропатию при язвенном колите, энтеропатический синовит, ассоциированные с хламидиями, иерсиниями и сальмонеллами артропатии, спондилоартропатию, атероматозное заболевание/атеросклероз, атопическую аллергию, аутоиммунное буллезное заболевание, обыкновенную пузырчатку, эксфолиативную пузырчатку, пемфигоид, IgA-зависимый линейный дерматоз, аутоиммунную гемолитическую анемию, гемолитическую анемию с положительным тестом Кумбса, приобретенную пернициозную анемию, юношескую пернициозную анемию, миалгический энцефалит/синдром хронической усталости, хронический кандидоз слизистых и кожи, гигантоклеточный артериит, первичный склерозирующий гепатит, криптогенный аутоиммунный гепатит, синдром приобретенного иммунодефицита, связанные с синдромом приобретенного иммунодефицита заболевания, гепатит B, гепатит C, общий варьирующий иммунодефицит (общую вариабельную гипогаммаглобулинемию), дилатационную кардиомиопатию, женское бесплодие, недостаточность яичников, преждевременную недостаточность яичников, легочный фиброз, криптогенный фиброзирующий альвеолит, поствоспалительную интерстициальную легочную болезнь, интерстициальный пневмонит, интерстициальную легочную болезнь, ассоциированную с болезнями соединительных тканей, легочную болезнь, ассоциированную со смешанными болезнями соединительной ткани, интерстициальную легочную болезнь, ассоциированную с системным склерозом, интерстициальную легочную болезнь, ассоциированную с ревматоидным артритом, легочную болезнь, ассоциированную с системной красной волчанкой, легочную болезнь, ассоциированную с дерматомиозитом/полимиозитом, легочную болезнь, ассоциированную с болезнью Шегрена, легочную болезнь, ассоциированную с анкилозирующим спондилитом, диффузную легочную болезнь с воспалением сосудов, легочную болезнь, ассоциированную с гемосидерозом, интерстициальную легочную болезнь, индуцированную лекарственными средствами, фиброз, лучевой фиброз, облитерирующий бронхиолит, хроническую эозинофильную пневмонию, лимфоцитарную инфильтративную легочную болезнь, постинфекционную интерстициальную легочную болезнь, подагрический артрит, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный гепатит 1 типа (классический аутоиммунный или волчаночный гепатит), аутоиммунный гепатит 2 типа (гепатит с антителами к LKM), опосредованную аутоиммунной реакцией гипогликемию, резистентность к инсулину типа B с акантокератодермией, гипопаратиреоз, острое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органа, хроническое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органа, остеоартроз, первичный склерозирующий холангит, псориаз типа 1, псориаз типа 2, идиопатическую лейкопению, аутоиммунную нейтропению, заболевание почек БДУ, гломерулонефриты, микроскопический васкулит почек, болезнь Лайма, дискоидную красную волчанку, мужское бесплодие, идиопатическое или БДУ, аутоиммунитет на компоненты спермы, рассеянный склероз (все подтипы), симпатическую офтальмию, легочную гипертензию, вторичную относительно болезни соединительных тканей, синдром Гудпасчера, легочные проявления узелкового периартериита, острую ревматическую лихорадку, ревматоидный спондилит, болезнь Стилла, системный склероз, синдром Шегрена, артериит/болезнь Такаясу, аутоиммунную тромбоцитопению, идиопатическую тромбоцитопению, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, гипертиреоз, аутоиммунный гипотиреоз с зобом (болезнь Хашимото), атрофический аутоиммунный гипотиреоз, первичную микседему, факогенный увеит, первичный васкулит, витилиго, острое заболевание печени, хронические заболевания печени, алкогольный цирроз, алкогольное поражение печени, холестаз, аллергическое заболевание печени, индуцированный лекарственными средствами гепатит, неалкогольный стеатогепатит, аллергию и астму, инфекцию стрептококками группы B (GBS), психические расстройства (например, депрессию и шизофрению), опосредуемые типом Th2 и типом Th1 заболевания, острую и хроническую боль (различные формы боли) и злокачественные опухоли, такие как рак легкого, молочной железы, желудка, мочевого пузыря, кишечника, поджелудочной железы, яичника, предстательной железы и прямой кишки и гемопоэтические злокачественные новообразования (лейкоз и лимфома), абеталипопротеинемию, акроцианоз, острые и хронические паразитарные или инфекционные процессы, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелолейкоз (AML), острую или хроническую бактериальную инфекцию, острый панкреатит, острую почечную недостаточность, аденокарциномы, эктопические систолы в полетах, комплекс СПИД/деменция, алкогольный гепатит, аллергический конъюнктивит, аллергический контактный дерматит, аллергический ринит, отторжение аллотрансплантата, недостаточность альфа-1-антитрипсина, боковой амиотрофический склероз, анемию, стенокардию, дегенерацию клеток переднего рога спинного мозга, терапию антителами к cd3, антифосфолипидный синдром, антирецепторные реакции гиперчувствительности, аортальные и периферические аневризмы, расслоение аорты, артериальную гипертензию, атеросклероз, артериовенозный анастомоз, атаксию, фибрилляцию предсердий (устойчивую или пароксизмальную), трепетание предсердий, атриовентрикулярную блокаду, B-клеточную лимфому, отторжение костного трансплантата, отторжение трансплантата костного мозга (BMT), блокаду ножки пучка Гиса, лимфому Беркитта, ожоги, аритмии сердца, синдром сердечного шока, опухоли сердца, кардиомиопатию, воспалительный ответ на сердечно-легочное шунтирование, отторжение трансплантата хряща, виды дегенерации коры мозжечка, мозжечковые нарушения, хаотическую или многофокусную предсердную тахикардию, ассоциированные с химиотерапией нарушения, хронический миелоцитарный лейкоз (CML), хронический алкоголизм, хронические воспалительные патологии, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), хроническую интоксикацию салицилатами, колоректальную карциному, застойную сердечную недостаточность, конъюнктивит, контактный дерматит, легочное сердце, ишемическую болезнь сердца, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, культуронегативный сепсис, кистозный фиброз, ассоциированные с терапией цитокинами нарушения, деменцию боксеров, демиелинизирующие заболевания, геморрагическую лихорадку Денге, дерматит, дерматологические состояния, диабет, сахарный диабет, диабетическую атеросклеротическую болезнь, болезнь диффузных телец Леви, дилатационную застойную кардиомиопатию, нарушения базальных ганглиев, синдром Дауна в среднем возрасте, индуцированные лекарственными средствами нарушения движения, индуцируемые лекарственными средствами, блокирующими дофаминовые рецепторы ЦНС, чувствительность к лекарственным средствам, экзему, энцефаломиелит, эндокардит, эндокринопатию, эпиглоттит, инфекцию вирусом Эпштейна-Барр, эритромелалгию, экстрапирамидальные и мозжечковые нарушения, семейный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, отторжение имплантата эмбрионального тимуса, атаксию Фридрейха, функциональные нарушения периферических артерий, грибковый сепсис, газовую гангрену, язву желудка, гломерулонефрит, отторжение трансплантата любого органа или ткани, грамотрицательный сепсис, грамположительный сепсис, гранулемы, вызываемые внутриклеточными организмами, волосатоклеточный лейкоз, болезнь Галлервордена-Шпатца, тиреоидит Хашимото, сенную лихорадку, отторжение трансплантата сердца, гемохроматоз, гемодиализ, гемолитический уремический синдром/тромболитическую тромбоцитопеническую пурпуру, кровотечение, гепатит (A), аритмии пучка Гиса, инфекцию ВИЧ/ВИЧ-нейропатию, болезнь Ходжкина, гиперкинетические нарушения движения, реакции гиперчувствительности, гиперчувствительный пневмонит, гипертензию, гипокинетические нарушения движения, оценку гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, идиопатическую болезнь Аддисона, идиопатический легочный фиброз, опосредуемую антителами цитотоксичность, астению, спинальную мышечную атрофию детского возраста, воспаление аорты, грипп A, ионизирующее радиоактивное облучение, иридоциклит/увеит/неврит зрительного нерва, реперфузионное повреждение после ишемии, ишемический инсульт, юношеский ревматоидный артрит, юношескую спинальную мышечную атрофию, саркому Капоши, отторжение трансплантата почки, легионеллы, лейшманиоз, лепру, очаги повреждения кортико-спинальной системы, жировой отек, отторжение трансплантата печени, лимфедему, малярию, злокачественную лимфому, злокачественный гистиоцитоз, злокачественную меланому, менингит, менингококкемию, метаболические/идиопатические заболевания, мигренозную головную боль, митохондриальное полисистемное нарушение, смешанное заболевание соединительной ткани, моноклональную гаммапатию, множественную миелому, полисистемные дегенерации (Менцеля Дежерне-Томаса Ши-Драгера и Мачадо-Джозефа), миастению gravis, внутриклеточные Mycobacterium avium, Mycobacterium tuberculosis, миелодиспластический синдром, инфаркт миокарда, ишемические нарушения миокарда, назофарингеальную карциному, неонатальную хроническую легочную болезнь, нефрит, нефроз, нейродегенеративные заболевания, нейрогенные мышечные атрофии I, нейтропеническую лихорадку, неходжкинскую лимфому, окклюзию брюшной аорты и ее ветвей, окклюзивные нарушения артерий, терапию okt3, орхит/эпидидимит, орхит/процедуры реверсивной вазэктомии, органомегалию, остеопороз, отторжение трансплантата поджелудочной железы, карциному поджелудочной железы, паранеопластический синдром/гиперкальциемию злокачественного новообразования, отторжение трансплантата паращитовидной железы, воспалительное заболевание тазовых органов, хронический ринит, перикардиальное заболевание, периферическое атеросклеротическое заболевание, нарушения периферических сосудов, перитонит, пернициозную анемию, пневмонию Pneumocystis carinii, пневмонию, синдром POEMS (полинейропатии, органомегалия, эндокринопатия, моноклональная гаммапатия и синдром кожных изменений), постперфузионный синдром, синдром после вливания, синдром пост-MI-кардиотомии, преэклампсию, прогрессирующий супрануклеарный паралич, первичную легочную гипертензию, лучевую терапию, феномен и болезнь Рейно, болезнь Рейно, болезнь Рефсума, тахикардию с регулярным узким QRS, вазоренальную гипертензию, реперфузионное повреждение, рестриктивную кардиомиопатию, саркомы, склеродермию, сенильную хорею, сенильную деменцию по типу телец Леви, серонегативные артропатии, шок, серповидно-клеточную анемию, отторжение аллотрансплантата кожи, синдром кожных изменений, отторжение трансплантата тонкой кишки, солидные опухоли, специфические аритмии, спинальную атаксию, спиноцеребеллярные дегенерации, стрептококковый миозит, структурные очаги повреждения мозжечка, подострый склерозирующий панэнцефалит, обморок, сифилис сердечно-сосудистой системы, общую анафилактическую реакцию, синдром системного воспалительного ответа, системный ревматоидный артрит с началом в юношеском возрасте, T-клеточный или FAB ALL, телеангиэктазию, облитерирующий тромбангиит, тромбоцитопению, токсичность, трансплантацию, травму/кровотечение, реакции гиперчувствительности типа III, гиперчувствительность IV типа, нестабильную стенокардию, уремию, уросепсис, крапивницу, пороки клапанов сердца, варикозное расширение вен, васкулит, заболевания вен, венозный тромбоз, фибрилляции желудочков, вирусные и грибковые инфекции, вирусный энцефалит/асептический менингит, вирус-ассоциированный гемофагоцитарный синдром, синдром Вернике-Корсакова, болезнь Вильсона, отторжение ксенотрансплантата любого органа или ткани, острые коронарные синдромы, острые идиопатические полиневриты, острую воспалительную демиелинизирующую полирадикулонейропатию, острую ишемию, болезнь Стилла взрослых, очаговую алопецию, анафилаксию, синдром антифосфолипидных антител, апластическую анемию, атеросклероз, атопическую экзему, атопический дерматит, аутоиммунный дерматит, ассоциированное с инфекцией Streptococcus аутоиммунное нарушение, аутоиммунную энтеропатию, аутоиммунную потерю слуха, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (ALPS), аутоиммунный миокардит, аутоиммунную преждевременную недостаточность яичников, блефарит, бронхоэктаз, буллезный пемфигоид, сердечно-сосудистое заболевание, катастрофический антифосфолипидный синдром, глютеиновую болезнь, шейный спондилез, хроническую ишемию, рубцующийся пемфигоид, клинически изолированный синдром (CIS) с риском рассеянного склероза, конъюнктивит, психиатрическое нарушение с началом в детском возрасте, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), дакриоцистит, дерматомиозит, диабетическую ретинопатию, сахарный диабет, грыжу межпозвоночного диска, пролапс межпозвоночного диска, индуцированную лекарственным средством иммунную гемолитическую анемию, эндокардит, эндометриоз, эндофтальмит, эписклерит, полиморфную эритему, большую полиморфную эритему, гестационный пемфигоид, синдром Гийена-Барре (GBS), сенную лихорадку, синдром Хьюза, идиопатическую болезнь Паркинсона, идиопатическую интерстициальную пневмонию, опосредованную IgE аллергию, иммунную гемолитическую анемию, миозит с тельцами включения, инфекционное воспалительное заболевание глаз, воспалительное демиелинизирующее заболевание, воспалительное заболевание сердца, воспалительное заболевание почек, IPF/UIP, ирит, кератит, сухой кератоконъюнктивит, болезнь Куссмауля или болезнь Куссмауля-Мейера, паралич Ландри, гистиоцитоз с клетками Лангерганса, сетчатую мраморную кожу, дегенерацию желтого пятна, микроскопический полиангиит, болезнь Бехтерева, нарушения мотонейронов, пемфигоид слизистой оболочки, полиорганную недостаточность, миастению gravis, миелодиспластический синдром, миокардит, нарушения нервных корешков, нейропатию, гепатит "ни A, ни-B", неврит зрительного нерва, остеолиз, рак яичника, олигосуставной JRA, окклюзионное заболевание периферических артерий (PAOD), заболевание периферических сосудов (PVD), заболевание периферических артерий (PAD), флебит, узелковый периартериит (или узелковый периартериит), полихондрию, ревматическую полимиалгию, полиоз, полисуставной JRA, синдром полиэндокринной недостаточности, полимиозит, ревматическую полимиалгию (PMR), постгемодиализный синдром, первичный паркинсонизм, рак предстательной железы и прямой кишки и гемопоэтические злокачественные новообразования (лейкоз и лимфому), простатит, истинную эритроцитарную аплазию, первичную недостаточность надпочечников, рецидивирующий оптиконейромиелит, рестеноз, ревматический порок сердца, сафо (синовит, акне, пустулез, гиперостоз и остит), склеродермию, вторичный амилоидоз, шоковое легкое, склерит, ишиас, вторичную недостаточность надпочечников, ассоциированное с силиконом заболевание соединительной ткани, дерматоз Снеддона-Уилкинсона, анкилозирующий спондилит, синдром Стивенса-Джонсона (SJS), синдром системного воспалительного ответа, височный артериит, токсоплазмозный ретинит, токсический эпидермальный некролиз, поперечный миелит, TRAPS (рецептор фактора некроза опухоли, аллергическую реакцию 1 типа, диабет II типа, крапивницу, обычную интерстициальную пневмонию (UIP), васкулит, весенний конъюнктивит, вирусный ретинит, синдром Фогта-Коянаги-Харада (синдром VKH), влажную макулодистрофию, заживление ран, ассоциированную с иерсиниями и сальмонеллами артропатию.

В одном из вариантов осуществления заболевания, которые можно лечить или диагностировать композициями и способами по изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают первичные и метастазирующие злокачественные опухоли, включая карциномы молочной железы, кишечника, прямой кишки, легкого, ротоглотки, гортаноглотки, пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря и желчных протоков, тонкого кишечника, мочевыводящих путей (включая почку, мочевой пузырь и уротелий), женских половых путей (включая опухоли шейки матки, матки и яичников, а также хориокарциному и гестационное трофобластическое заболевание), мужских половых путей (включая опухоли предстательной железы, семенных пузырьков, семенников и половых клеток), эндокринных желез (включая щитовидную железу, надпочечник и гипофиз) и кожи, а также гемангиомы, меланомы, саркомы (включая саркомы, образующиеся в костях и мягких тканях, а также саркому Капоши), опухоли головного мозга, нервной ткани, глаз и оболочек головного мозга (включая астроцитомы, глиомы, глиобластомы, ретинобластомы, невромы, нейробластомы, Шванномы и менингиомы), солидные опухоли, образующиеся из гемопоэтических злокачественных новообразований, такие как лейкозы и лимфомы (ходжкинские и неходжкинские лимфомы).

В одном из вариантов осуществления антитела по изобретению или их антигенсвязывающие части используют для лечения злокачественной опухоли или для предотвращения или ингибирования метастазирования опухолей, описываемых в настоящем документе, при использовании отдельно или в комбинации с лучевой терапией и/или другими химиотерапевтическими средствами.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения пациента страдающего от нарушения, включающему этап введения любого из связывающих белков, описываемых в настоящем документе, до, одновременно или после введения второго средства, как описано в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления второе средство выбрано из группы, состоящей из буденозида, эпидермального фактора роста, кортикостероидов, циклоспорина, сульфасалазина, аминосалицилатов, 6-меркаптопурина, азатиоприна, метронидазола, ингибиторов липоксигеназы, месаламина, олсалазина, балсалазида, антиоксидантов, ингибиторов тромбоксана, антагонистов рецепторов IL-1, mAb к IL-1β, mAb к IL-6 или рецепторам IL-6, факторов роста, ингибиторов эластаз, пиридинил-имидазоловых соединений, антител или агонистов к TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-23, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF, антител к CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 или их лигандам, метотрексата, циклоспорина, FK506, рапамицина, мофетила микофенолата, лефлуномида, NSAID, ибупрофена, кортикостероидов, преднизолона, ингибиторов фосфодиэстеразы, агонистов аденозина, антитромботических средств, ингибиторов комплемента, адренергических средств, IRAK, NIK, IKK, p38, ингибиторов MAP-киназ, ингибиторов конвертирующего IL-1β фермента, ингибиторов конвертирующего TNFα фермента, ингибиторов T-клеточной сигнализации, ингибиторов металлопротеиназ, сульфасалазина, азатиоприна, 6-меркаптопуринов, ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента, растворимых рецепторов цитокинов, растворимого рецептора p55 TNF, растворимого рецептора p75 TNF, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, противовоспалительных цитокинов, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFβ.

В конкретном варианте осуществления фармацевтические композиции, описываемые в настоящем документе, вводят пациенту по меньшей мере одним способом, выбранным из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, внутрибрюшного, внутрикапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутрибрюшинного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутрикишечного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, интраперитонеального, интраплеврального, внутрипредстательного, внутрилегочного, интраректального, интраренального, интраретинального, интраспинального, интрасиновиального, интраторакального, внутриматочного, интравезикального, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального и трансдермального.

Один из аспектов изобретения относится по меньшей мере к одному антиидиотипическому антителу по меньшей мере к одному связывающему белку по настоящему изобретению. Антиидиотипические антитела включают любую содержащую белок или пептид молекулу, которая содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, в качестве неограничивающих примеров такую как по меньшей мере одна определяющая комплементарность область (CDR) тяжелой или легкой цепей или ее лигандсвязывающую часть, вариабельная область тяжелой цепи или легкой цепи, константная область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасная область или любая ее часть, которые можно вводить в связывающий белок по настоящему изобретению.

Краткое описание рисунков

Фигура 1A представляет собой схематическое представление конструкций иммуноглобулинов с двойными вариабельными доменами (DVD)-Ig и демонстрирует алгоритм получения DVD-Ig из двух исходных антител;

Фигура 1B представляет собой схематическое представление конструкций DVD1-Ig, DVD2-Ig и двух химерных моноспецифических антител из гибридомных клонов 2D13.E3 (антитело к IL-1α) и 13F5.G5 (антитело к IL-1β).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к поливалентным и/или полиспецифическим связывающим белкам, связывающим два или более антигенов. Конкретно, изобретение относится к иммуноглобулинам с двойными вариабельными доменами (DVD-Ig) и их фармацевтическим композициям, а также к нуклеиновым кислотам, рекомбинантным экспрессирующим векторам и клеткам-хозяевам для получения таких DVD-Ig. Также изобретение относится к способам применения DVD-Ig по изобретению для детекции конкретных антигенов in vitro или in vivo.

Если не определено иначе в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в отношении настоящего изобретения, имеют те же значения, которые, как правило, понимают специалисты в данной области. Значение и объем терминов должен быть понятен, однако, в случае любой неявной неоднозначности определения, предоставляемые в настоящем документе, имеют преимущество над любым словарным или внешним определением. Кроме того, если из контекста не требуется иначе, формы единственного числа должны включать формы множественного числа, а формы множественного числа включают единственное. Если не указано иначе, в настоящей заявке использование "или" означает "и/или". Кроме того, использование термина "включающий", а также другие формы, такие как "включает" и "включенный", не ограничено. Также, если конкретно не указано иначе, такие термины, как "элемент" или "компонент", включают элементы и компоненты, содержащие одну единицу, и элементы и компоненты, содержащие более одной субъединицы.

Как правило, номенклатуры и способы, используемые в отношении культивирования клеток и тканей, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики и химии белков и нуклеиновых кислот и гибридизации, описываемые в настоящем документе, представляют собой номенклатуры и способы, хорошо известные и широко используемые в данной области. Как правило, если не указано иначе, методы и способы по настоящему изобретению проводят в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области и как описано в различных общих и более конкретных источниках, которые цитируют и описывают на всем протяжении настоящего описания. Ферментативные реакции и способы очистки проводят по указаниям производителей, как обычно осуществляют в данной области или как описано в настоящем документе. Номенклатуры и лабораторные процедуры, и способы, используемые в отношении аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описываемые в настоящем документе, представляют собой номенклатуры и лабораторные процедуры и способы, хорошо известные и широко используемые в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, фармацевтического получения, состава и доставки и лечения пациентов используют стандартные способы.

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже определены избранные термины.

Термин "полипептид" относится к любой полимерной цепи аминокислот. Термины "пептид" и "белок" используют взаимозаменяемо с термином полипептид, и они также относятся к полимерной цепи аминокислот. Термин "полипептид" включает природные или искусственные белки, белковые фрагменты и полипептидные аналоги белковых последовательностей. Полипептид может быть мономерным или полимерным. Если из контекста не следует иначе, термин "полипептид" включает полипептид и фрагменты и их варианты (включая фрагменты вариантов). В отношении антигенного полипептида фрагмент полипептида необязательно содержит по меньшей мере один непрерывный или нелинейный эпитоп полипептида. Точные границы по меньшей мере одного эпитопного фрагмента можно подтверждать, с использованием стандартных знаний в данной области. Фрагмент содержит по меньшей мере приблизительно 5 смежных аминокислот, например по меньшей мере приблизительно 10 смежных аминокислот, по меньшей мере приблизительно 15 смежных аминокислот или по меньшей мере приблизительно 20 смежных аминокислот. Вариант полипептида является таким, как описано в настоящем документе.

Термин "выделенный белок" или "выделенный полипептид" представляют собой белок или полипептид, которые в силу своего происхождения или источника получения не ассоциированы с ассоциированными в природе компонентами, которые сопутствуют им в их нативном состоянии; по существу не содержат других белков того же вида; экспрессированы клеткой другого вида или не встречаются в природе. Таким образом, полипептид, синтезированный химически или синтезированный в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он происходит в природе, является "выделенным" из ассоциированных с ним в природе компонентов. Белок также можно сделать по существу не содержащим ассоциированных в природе компонентов посредством выделения способами очистки белков, хорошо известных в данной области.

Термин "восстановление" относится к способу получения химических молекул, таких как полипептид, по существу не содержащих ассоциированные в природе компоненты, посредством выделения, например, способами очистки белков, хорошо известными в данной области.

Термин "биологическая активность" относится к любому одному или нескольким характерным биологическим свойствам молекулы (присутствующим в природе, как выявляют in vivo, или предоставляемым или обеспечиваемым рекомбинантными способами). Биологические свойства в качестве неограничивающих примеров включают связывание рецептора; индукцию клеточной пролиферации, ингибирование роста клеток, индукцию других цитокинов, индукцию апоптоза и ферментативную активность. Биологическая активность также включает активность молекулы Ig.

Термины "специфическое связывание" или "специфически связывающийся" по отношению к взаимодействию антитела, белка или пептида со второй химической молекулой означают, что взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) на химической молекуле; например, антитело распознает и связывает специфическую структуру белка, а не белки вообще. Если антитело специфично к эпитопу "A", присутствие молекулы, содержащей эпитоп A (или чистого, немеченого A), в реакционной смеси, содержащей меченый "A" и антитело, будет снижать количество меченого A, связанного с антителом.

Термин "антитело" в широком смысле относится к любой молекуле иммуноглобулина (Ig), состоящей из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей, или к ее любому функциональному фрагменту, мутанту, варианту или производному, сохраняющему основные характеристики связывания эпитопа молекулы Ig. Такие варианты мутантов, вариантов или производных антител известны в данной области. Их неограничивающие варианты осуществления описаны ниже.

В полноразмерном антителе каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращаемой в настоящем документе как HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращаемой в настоящем документе как LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередующиеся с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к C-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Молекулы иммуноглобулинов могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.

Термин "Fc-область" используют для определения C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которую можно получать посредством расщепления интактного антитела папаином. Fc-область может представлять собой Fc-область с нативной последовательностью или вариант Fc-области. Как правило, Fc-область иммуноглобулина содержит два константных домена, домен CH2 и домен CH3, и необязательно содержит домен CH4. В данной области известны замены аминокислотных остатков в Fc-части для изменения эффекторной функции антитела (патенты США №№ 5648260 и 5624821). Fc-часть антитела опосредует несколько важных эффекторных функций, например, индукцию цитокинов, ADCC, фагоцитоз, обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC) и время полужизни/скорость выведения антитела и комплексов антиген-антитело. В некоторых случаях эти эффекторные функции желательны для терапевтического антитела, но в других случаях они могут быть нежелательными или даже вредными, в зависимости от терапевтических задач. Определенные IgG изотипы человека, в частности IgG1 и IgG3, опосредуют ADCC и CDC, посредством связывания FcγR и компонента системы комплемента C1q, соответственно. Неонатальные рецепторы Fc (FcRn) являются критическими компонентами, определяющими время полужизни антител в кровотоке. В еще одном варианте осуществления в константной области антитела, например, Fc-области антитела, заменен по меньшей мере один аминокислотный остаток так, что изменяются эффекторные функции антитела. Димеризация двух идентичных тяжелых цепей иммуноглобулина опосредована димеризацией доменов CH3 и стабилизирована дисульфидными связями в шарнирной области (Huber et al. (1976) Nature 264:415-20; Thies et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:67-79.). Мутация остатков цистеина в шарнирной области для предотвращения дисульфидных связей тяжелая цепь-тяжелая цепь дестабилизирует димеризацию доменов CH3. Остатки, ответственные за димеризацию CH3, идентифицированы (Dall'Acqua (1998) Biochem. 37:9266-73.). Таким образом, можно получать моновалентные полу-Ig. Примечательно, что эти моновалентные молекулы полу-Ig найдены в природе для подклассов IgG и IgA (Seligman (1978) Ann. Immunol. 129:855-70; Biewenga et al. (1983) Clin. Exp. Immunol. 51:395-400). Определено, что стехиометрия FcRn:Fc-область Ig составляет 2:1 (West et al. (2000) Biochem. 39:9698-708) и половины Fc достаточно для опосредования связывания FcRn (Kim et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:542-548.). Мутации, нарушающие димеризацию домена CH3, могут не иметь большого неблагоприятного воздействия на его связывание с FcRn, так как остатки, важные для димеризации CH3, расположены на внутренней поверхности структуры β-слоя CH3, тогда как область, ответственная за связывание FcRn, расположена на внешней поверхности доменов CH2-CH3. Однако молекула полу-Ig может иметь определенное преимущество при прохождении в ткани вследствие ее меньшего, чем обычное антитело, размера. В одном из вариантов осуществления в константной области связывающего белка по изобретению, например, Fc-области, заменен по меньшей мере один аминокислотный остаток так, что нарушена димеризация тяжелых цепей, что приводит к молекулам полу-DVD-Ig. Противовоспалительная активность IgG полностью зависит от сиалирования N-связанного гликана фрагмента Fc IgG. Определены точные требования в гликанах для противовоспалительной активности так, что можно получать соответствующий фрагмент Fc IgG1, таким образом, получая полностью рекомбинантный, сиалированный Fc IgG1 со значительно увеличенной активностью (Anthony et al. (2008) Science 320:373-376).

Термин "антигенсвязывающая часть" антитела относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию антигена. Показано, что антигенсвязывающую функцию антитела могут осуществлять фрагменты полноразмерного антитела. Такие варианты осуществления антител также могут представлять собой биспецифические форматы, форматы с двойной специфичностью или полиспецифические форматы; специфически связываясь с двумя или более различными антигенами. Примеры связывающих фрагментов, включаемых в термин "антигенсвязывающая часть" антитела, включают (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546, публикация PCT WO 90/05144), содержащий один вариабельный домен; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируют отдельные гены, их рекомбинантными способами можно связывать синтетическим линкером, позволяющим получать их в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с формированием одновалентной молекулы (известной как одноцепочечное Fv (scFv); см. например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также предназначены для включения в термин "антигенсвязывающая часть" антитела. Также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой двухвалентные биспецифические антитела, в которых домены VH и VL экспрессированы в одной полипептидной цепи, но с применением линкера, являющегося слишком коротким, чтобы позволить спаривание двух доменов на одной цепи, таким образом вынуждая спариваться домены с комплементарными доменами другой цепи и формируя два антигенсвязывающих участка (см. например, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Такие связывающие части антител известны в данной области (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)). Кроме того одноцепочечные антитела также включают "линейные антитела", содержащие пару тандемных участков Fv (VH-CH1-VH-CH1), которые совместно с полипептидами комплементарных легких цепей формируют пару антигенсвязывающих областей (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062; и патент США № 5641870).

Термин "поливалентный связывающий белок" используют на всем протяжении этого описания для обозначения связывающего белка, содержащего два или более антигенсвязывающих участков. В одном из вариантов осуществления поливалентный связывающий белок сконструирован так, чтобы содержать три или более антигенсвязывающих участков, и, как правило, является неприродным антителом. Термин "полиспецифический связывающий белок" относится к связывающему белку, связывающему две или более родственных или неродственных мишени. Связывающие белки с двойными вариабельными доменами (DVD) по изобретению содержат два или более антигенсвязывающих участка и являются четырехвалентными или поливалентными связывающими белками. DVD могут быть моноспецифическими, т.е. способными к связыванию одного антигена, или полиспецифическими, т.е. способными к связыванию двух или более антигенов. Связывающие белки с DVD, содержащие два полипептида тяжелой цепи с DVD и два полипептида легкой цепи с DVD, обозначают как DVD-Ig. Каждая половина DVD-Ig содержит полипептид тяжелой цепи с DVD и полипептид легкой цепи с DVD и два антигенсвязывающих участка. Каждый участок связывания содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи всего с 6 CDR, вовлеченных в связывание антигена, на каждый антигенсвязывающий участок.

Термин "биспецифическое антитело" относится к полноразмерным антителам, которые получают посредством квадромной технологии (см. Milstein and Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40), посредством химической конъюгации двух различных моноклональных антител (см. Staerz et al. (1985) Nature 314(6012):628-31) или посредством подхода "выступ во впадину" или сходных подходов с внесением мутаций в Fc-область (см. Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14):6444-8.18), приводящих к получению нескольких различных молекул иммуноглобулинов, из которых только одна представляет собой функциональное биспецифическое антитело. Относительно молекулярной функции биспецифическое антитело на одном из своих двух связывающих плеч (одна пара HC/LC) связывает один антиген (или эпитоп), а на своем втором плече (другая пара HC/LC) связывает другой антиген (или эпитоп). По этому определению биспецифическое антитело содержит два различных антигенсвязывающих плеча (и по специфичности, и по последовательностям CDR) и является одновалентным для каждого антигена, который оно связывает.

Термин "антитело с двойной специфичностью" относится к полноразмерным антителам, которые могут связывать два различных антигена (или эпитопа), в каждом из своих двух связывающих плеч (паре HC/LC) (см. публикацию PCT № WO 02/02773). Таким образом, связывающий белок с двойной специфичностью содержит два идентичных антигенсвязывающих плеча с идентичной специфичностью и идентичными последовательностями CDR и является двухвалентным для каждого антигена, с которым он связывается.

"Функциональный антигенсвязывающий участок" связывающего белка представляет собой участок, связывающий антиген-мишень. Аффинность связывания антигена антигенсвязывающего участка не обязательно является такой же сильной, как у исходного антитела, из которого происходит антигенсвязывающий участок, но способность связывать антиген должна быть измерима любым из множества известных способов оценки связывания антитела с антигеном. Кроме того, аффинность связывания антигена каждым из антигенсвязывающих участков поливалентного антитела в настоящем документе не обязательно должна быть количественно одинаковой.

Термин "цитокин" представляет собой общий термин для белков, высвобождаемых одной клеточной популяцией, действующих на другую клеточную популяцию в качестве межклеточных медиаторов. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и традиционные полипептидные гормоны. В цитокины включены гормон роста, такой как гормон роста человека, N-метионилпроизводное гормона роста человека и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреотропный гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); печеночный фактор роста; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухоли-альфа и -бета; мюллерова ингибирующая субстанция; ассоциированный с гонадотропином мыши пептид; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (TPO); факторы роста нервов, такие как NGF-альфа; тромбоцитарный фактор роста; плацентарный фактор роста, трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-альфа и TGF-бета; инсулиноподобный фактор роста-1 и -11; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-альфа, -бета и -гамма, колониестимулирующие факторы (CSF), такие как макрофагальный CSF (M-CSF); гранулоцитарно-макрофагальный CSF (GM-CSF) и гранулоцитарный CSF (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23 и IL-33; фактор некроза опухоли, такой как TNF-альфа или TNF-бета; и другие полипептидные факторы, включающие LIF и лиганд kit (KL). Термин цитокин включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.

Термин "линкер" используют для обозначения полипептидов, содержащих два или более аминокислотных остатков, связанных пептидными связями, и используемых для связывания одной или нескольких антигенсвязывающих частей. Такие линкерные полипептиды хорошо известны в данной области (см. например, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Иллюстративные линкеры в качестве неограничивающих примеров включают AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G₄S)₄ (SEQ ID NO: 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 27) и ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 28).

Константный домен иммуноглобулина относится к константному домену тяжелой или легкой цепи. Аминокислотные последовательности константных доменов тяжелых цепей и легких цепей IgG человека известны в данной области.

Термин "моноклональное антитело" или "mAb" относится к антителу, получаемому из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию являются идентичными за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, являясь направленными к одному антигену. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные к различным детерминантам (эпитопам), каждое mAb направлено к одной детерминанте на антигене. Модификатор "моноклональное" не следует рассматривать, как требующий получения антител каким-либо конкретным способом.

Термин "антитело человека" включает антитела с вариабельными и константными областями, получаемыми из последовательностей иммуноглобулинов человека зародышевой линии. Антитела человека по изобретению могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемыми последовательностями иммуноглобулинов человека зародышевой линии (например, мутации, вносимые посредством случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или посредством соматической мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. Однако термин "антитело человека" не предназначен для включения антител, в которых в каркасные последовательности человека прививают последовательности CDR, происходящие из зародышевых линий других видов млекопитающих, таких как мышь.

Термин "рекомбинантное антитело человека" включает все антитела человека, которые подготавливают, экспрессируют, получают или выделяют рекомбинантными способами, такие как антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфицируемого в клетку-хозяина (дополнительно описано в разделе II C, ниже), антитела, выделяемые из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител человека (Hoogenboom (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy and Highsmith (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo and Larrick (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21:371-378), антитела, выделяемые у животных (например, мыши), трансгенных по генам иммуноглобулина человека (см., Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann and Green (2002) Current Opin. Biotechnol. 13:593-597; Little et al. (2000) Immunol. Today 21:364-370), или антитела, подготавливаемые, экспрессируемые, получаемые или выделяемые любыми другими способами, которые включают сплайсинг генных последовательностей иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека содержат вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулинов человека зародышевой линии. Однако в определенных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или, когда используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, несмотря на получение из последовательностей VH и VL человека зародышевой линии и родство с ними, в природе могут не присутствовать в репертуаре антител человека зародышевой линии in vivo.

"Аффинно зрелое" антитело представляет собой антитело с одним или несколькими изменениями в одной или нескольких его CDR, приводящих к улучшению аффинности антитела к антигену по сравнению с исходным антителом, в котором нет этого изменения(й). Иллюстративные аффинно зрелые антитела имеют наномолярные или даже пикомолярные аффинности к антигенам-мишеням. Аффинно зрелые антитела получают известными в данной области способами. В Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779-783 описано созревание аффинности посредством перестановки доменов VH и VL. Случайный мутагенез CDR и/или каркасных остатков описан в: Barbas et al. (1994) Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813; Schier et al. (1995) Gene 169:147-155; Yelton et al. (1995) J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol. 154(7):3310-9; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896, а избирательные мутации в избирательных положениях мутагенеза, положениях контакта или гипермутации на усиливающий активность аминокислотный остаток, как описано в патенте США № 6914128.

Термин "химерное антитело" относится к антителам, содержащим последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей одного вида и последовательности константных областей другого вида, таким как антитела, содержащие вариабельные области тяжелых и легких цепей мыши, связанные с константными областями человека.

Термин "антитело с привитыми CDR" относится к антителам, содержащим последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей одного вида, но в которых последовательности одной или нескольких областей CDR VH и/или VL замещены последовательностями CDR другого вида, таким как антитела, содержащие вариабельные области тяжелых и легких цепей мыши, в которых одна или несколько CDR мыши (например, CDR3) замещены последовательностями CDR человека.

Термин "гуманизированное антитело" относится к антителам, содержащим последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей не являющихся человеком видов (например, мыши), но в которых по меньшей мере часть последовательности VH и/или VL заменена так, чтобы являться более "подобной человеческой", т.е. более сходной с последовательностями вариабельных областей зародышевой линии человека. Одним типом гуманизированного антитела является антитело с привитыми CDR, в котором не принадлежащие человеку последовательности CDR введены в последовательности VH и VL человека с заменой соответствующих последовательностей CDR человека. Также "гуманизированное антитело" представляет собой антитело или его вариант, производное, аналог или фрагмент, которые иммуноспецифически связываются с представляющим интерес антигеном и которые содержат каркасную (FR) область по существу с аминокислотной последовательностью антитела человека и определяющую комплементарность область (CDR) по существу с аминокислотной последовательностью не принадлежащего человеку антитела. Термин "по существу" в отношении CDR относится к CDR с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичной аминокислотной последовательности CDR не принадлежащего человеку антитела. Гуманизированное антитело содержит по существу все по меньшей мере из одного, а как правило, двух вариабельных доменов (Fab, Fab', F(ab')₂, FabC, Fv), в которых все или по существу все области CDR соответствуют областям CDR не принадлежащего человеку иммуноглобулина (т.е., донорного антитела), и все или по существу все каркасные области представляют собой каркасные области консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. В одном из вариантов осуществления гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, константной области иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит легкую цепь, а также по меньшей мере один вариабельный домен тяжелой цепи. Антитело также может содержать области CH1, шарнира, CH2, CH3 и CH4 тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированную легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированную тяжелую цепь. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированный вариабельный домен легкой цепи и/или гуманизированную тяжелую цепь.

Термины "нумерация по Kabat", "определения по Kabat" и "маркировка по Kabat" используют в настоящем документе взаимозаменяемо. Эти термины, которые общепризнанны в данной области, относятся к нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е., гипервариабельными), чем другие аминокислотные остатки в вариабельных областях тяжелых и легких цепей антитела или его антигенсвязывающей части (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 и Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). В вариабельной области тяжелой цепи гипервариабельная область находится в диапазоне положений аминокислот от 31 до 35 для CDR1, положений аминокислот от 50 до 65 для CDR2 и положений аминокислот от 95 до 102 для CDR3. В вариабельной области легкой цепи гипервариабельная область находится в диапазоне положений аминокислот от 24 до 34 для CDR1, положений аминокислот от 50 до 56 для CDR2 и положений аминокислот от 89 до 97 для CDR3.

Термин "CDR" относится к определяющей комплементарность области в вариабельных последовательностях антитела. В каждой из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи присутствуют по три CDR, которые для каждой из вариабельных областей обозначают CDR1, CDR2 и CDR3. Термин "набор CDR" относится к группе из трех CDR, которая присутствует в одной вариабельной области, связывающей антиген. Точные границы этих CDR в различных системах определены различно. В системе, описанной Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)), не только предоставлена однозначная система нумерации остатков, применимая для любой вариабельной области антитела, но также предоставлены точные границы остатков, определяющих три CDR. Эти CDR можно обозначать как CDR по Kabat. Chothia с коллегами (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 и Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883) выявили, что определенные подчасти в CDR по Kabat принимают почти идентичные конформации пептидного каркаса, несмотря на наличие большого различия на уровне аминокислотных последовательностей. Эти подчасти обозначили как L1, L2 и L3 или H1, H2 и H3, где "L" и "H" означают области легких цепей и тяжелых цепей, соответственно. Эти области можно обозначать как CDR по Chothia, которые имеют границы, пересекающиеся с CDR по Kabat. Другие границы, определяющие CDR, перекрывающиеся с CDR по Kabat, описаны Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139 и MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-45. Другие определения границ CDR могут нестрого соответствовать одной из систем по настоящему документу, но тем не менее перекрываться с CDR по Kabat, хотя их можно укорачивать или удлинять с учетом прогнозирования или экспериментальных изысканий, что конкретные остатки или группы остатков или даже целые CDR значительного влияния на связывания антигена не оказывают. В способах, применяемых по настоящему документу, можно использовать CDR, определенные в соответствии с любой из этих систем, хотя в определенных вариантах осуществления используют CDR, определенные по Kabat или Chothia.

Термин "каркас" или "каркасная последовательность" относится к оставшимся последовательностям вариабельной области за вычетом CDR. Вследствие того, что точное определение последовательности CDR можно проводить посредством различных систем, содержание каркасной последовательности подчинено соответствующим различным интерпретациям. Шесть CDR (CDR-L1, -L2 и -L3 легкой цепи и CDR-H1, -H2 и -H3 тяжелой цепи) также разделяют каркасные области в легкой цепи и тяжелой цепи на четыре подобласти (FR1, FR2, FR3 и FR4) в каждой цепи, где CDR1 расположена между FR1 и FR2, CDR2 между FR2 и FR3 и CDR3 между FR3 и FR4. Без определения конкретных подобластей как FR1, FR2, FR3 или FR4, каркасная область, как указано в других источниках, представляет комбинированные FR в вариабельной области одной природной цепи иммуноглобулина. FR представляет одну из четырех подобластей, и FR представляют две или более из четырех подобластей, составляющих каркасную область.

Термин "ген антитела зародышевой линии" или "фрагмент гена антитела зародышевой линии" относится к последовательности иммуноглобулина, кодируемой нелимфоидными клетками, которые не претерпели процесса созревания, приводящего к генетической перестановке и мутации для экспрессии конкретного иммуноглобулина. (см., например, Shapiro et al. (2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3):183-200; Marchalonis et al. (2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484:13-30). Одно из преимуществ, предоставляемых различными вариантами осуществления настоящего изобретения, основано на установлении того, что гены антител зародышевой линии с большей вероятностью, чем гены зрелых антител, сохраняют ключевые структуры аминокислотных последовательностей, характерные для индивидуумов вида, таким образом, с меньшей вероятностью распознаются как чужеродные при терапевтическом использовании у этого вида.

Термин "нейтрализующий" относится к биологической активности, противодействующей антигену, когда связывающий белок специфически связывает антиген. В одном из вариантов осуществления нейтрализующий связывающий белок связывает цитокин и снижает его биологическую активность по меньшей мере приблизительно на 20%, 40%, 60%, 80%, 85% или более.

Термин "активность" включает такие виды активности, как специфичность связывания и аффинность DVD-Ig в отношении двух или более антигенов.

Термин "эпитоп" включает любую полипептидную детерминанту, способную к специфическому связыванию с иммуноглобулином или T-клеточным рецептором. В определенных вариантах осуществления эпитопные детерминанты включают химически активные поверхностные группы молекул, таких как аминокислоты, сахарных боковых цепей, фосфорил или сульфонил, и, в определенных вариантах осуществления, могут иметь специфические характеристики трехмерной структуры и/или специфичные характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область антигена, которую связывает антитело. Таким образом, эпитоп состоит из аминокислотных остатков области антигена (или его фрагмента), для которых известно, что они связываются с комплементарным участком на партнере по специфическому связыванию. Антигенный фрагмент может содержать более одного эпитопа. В определенных вариантах осуществления говорят, что антитело специфически связывает антиген, когда оно распознает свой антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул. Говорят, что антитела "связывают тот же эпитоп", если антитела перекрестно конкурируют (одно предотвращает связывание или модулирующее действие другого). Кроме того информативными являются структурные определения эпитопов (перекрывающиеся, сходные, идентичные), но функциональные определения часто являются более значимыми, так как они включают структурные (связывание) и функциональные (модуляция, конкуренция) параметры.

Термин "поверхностный плазмонный резонанс" относится к оптическому явлению, обеспечивающему возможность анализа биоспецифических взаимодействий в реальном времени посредством детекции изменений концентрации белков в матрице биосенсора, например, с использованием системы BIAcore® (BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). Для дополнительного описания см. Jönsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; и Johnnson et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

Термин "K_on" относится к константе скорости прямой реакции для ассоциации связывающего белка (например, антитело) с антигеном с формированием, например, комплекса антитело/антиген, как известно в данной области. "K_on" также известна под терминами "константа скорости ассоциации" или "ka", как взаимозаменяемо используют в настоящем документе. Это значение, означающее скорость связывания антитела с его антигеном-мишенью или скорость формирования комплекса между антителом и антигеном, также представлено уравнением ниже:

Антитело ("Ab") + Антиген ("Ag")→Ab-Ag.

Термин "K_off" относится к константе скорости обратной реакции диссоциации или "константе скорости диссоциации" связывающего белка (например, антитело), например, из комплекса антитело/антиген, как известно в данной области. "K_off" также известна под терминами "константа скорости диссоциации" или "kd", как взаимозаменяемо используют в настоящем документе. Это значение означает скорость диссоциации антитела и антигена-мишени или разделения комплекса Ab-Ag с течением времени на свободное антитело и антиген, как представлено уравнением ниже:

Ab+Ag←Ab-Ag.

Термин "K_D" относится к "равновесной константе диссоциации" или "KD", как взаимозаменяемо используют в настоящем документе, относящихся к значению, получаемому при титриметрическом измерении равновесия или посредством деления константы скорости диссоциации (K_off) на константу скорости ассоциации (K_on). Константу скорости ассоциации, константу скорости диссоциации и равновесную константу диссоциации используют для представления аффинности связывания антитела с антигеном. Способы определения констант скоростей ассоциации и диссоциации хорошо известны в данной области. Использование основанных на флуоресценции способов обеспечивает высокую специфичность и возможность анализировать образцы в физиологических буферах при равновесии. Также можно использовать другие экспериментальные подходы и устройства, такие как анализ BIAcore® (анализ взаимодействия биологических молекул) (например, устройство, доступное в BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden). Кроме того, также можно использовать, анализ KinExA® (анализ кинетического исключения), доступный в Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).

"Метка" и "детектируемая метка" означают молекулу, связанную с партнером по специфическому связыванию, таким как антитело или анализируемое вещество, например, обеспечения детектируемости реакции между участниками пары со специфическим связыванием, такими как антитело и анализируемое вещество, и меченый, таким образом, партнер по специфическому связыванию, например, антитело или анализируемое вещество, обозначают как "детектируемо меченый". Таким образом, термин "меченый связывающий белок" относится к белку с введенной меткой, обеспечивающей идентификацию связывающего белка. В одном из вариантов осуществления метка представляет собой детектируемый маркер, который может обеспечивать сигнал, который можно детектировать визуально или инструментальными способами, например, встраивание радиоактивно меченой аминокислоты или связывание с полипептидом биотинилированных молекул, которые можно детектировать меченым авидином (например, стрептавидином, содержащим флуоресцентный маркер или маркер с ферментативной активностью, которые можно детектировать оптическими или колориметрическими способами). Примеры меток для полипептидов в качестве неограничивающих примеров включают следующие: радиоактивные изотопы или радионуклиды (например, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho или ¹⁵³Sm); хромогены, флуоресцентные метки (например, FITC, родамин, лантанидные люминофоры), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, люцифераза, щелочная фосфатаза); хемилюминесцентные маркеры; биотинильные группы; предопределенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, пары последовательностей лейциновых застежек, участки связывания для вторичных антител, связывающие металлы домены и эпитопные метки); и магнитные средства, такие как гадолиниевые хелаты. Характерные примеры меток, как правило, применяемых для иммунологических анализов, включают молекулы, испускающие свет, например, акридиниевые соединения, и молекулы, обладающие флуоресценцией, например, флуоресцеин. В настоящем документе описаны другие метки. В этом отношении сама молекула может не являться детектируемо меченой, но может становиться детектируемой при реакции с другой молекулой. Использование "детектируемо меченого" предназначено для включения последнего типа детектируемого мечения.

Термин "конъюгат" относится к связывающему белку, такому как антитело, химически связанному со второй химической группой, такой как терапевтическое или цитотоксическое средство. Термин "средство" означает химическое соединение, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт, получаемый из биологических материалов. В одном из вариантов осуществления терапевтические или цитотоксические средства в качестве неограничивающих примеров включают токсин коклюша, таксол, цитохалазин B, грамицидин D, бромистый этидий, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Когда применяют в отношении иммунологического анализа, конъюгат антитела может представлять собой детектируемо меченое антитело, используемое в качестве детекционного антитела.

Термины "кристалл" и "кристаллизуемый" относятся к связывающему белку (например, антителу) или его антигенсвязывающей части, которые существуют в форме кристалла. Кристаллы представляют собой одну из форм твердого состояния вещества, отличающуюся от других форм, таких как аморфное твердое состояние или жидкокристаллическое состояние. Кристаллы состоят из регулярных, повторяющихся, трехмерных решеток атомом, ионов, молекул (например, белков, таких как антитела) или молекулярных агрегатов (например, комплексов антиген/антитело). Эти трехмерные решетки расположены в соответствии с определенными математическими зависимостями, которые хорошо известны в данной области. Основную единицу или строительный блок, который повторяется в кристалле, называют асимметричная единица. Повторение асимметричной единицы в расположении, которое подчиняется заданной, хорошо определенной кристаллографической симметрии, обеспечивает "элементарную ячейку" кристалла. Повторение элементарной ячейки посредством регулярных трансляций во всех трех измерениях, обеспечивает кристалл. См. Giege and Ducruix (1999) Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York.

Термин "полинуклеотид" означает полимерную форму двух или более нуклеотидов, рибонуклеотидов или дезоксинуклеотидов, или модифицированную форму нуклеотидов любого типа. Термин включает одно- и двухцепочечные формы ДНК.

Термин "выделенный полинуклеотид" означает полинуклеотид (например, геномного происхождения, кДНК или синтетического происхождения или любое их сочетание), который в соответствии со своим происхождением не ассоциирован со всем или частью полинуклеотида, с которым "выделенный полинуклеотид" существует в природе; функционально связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе или который не встречается в природе в качестве части большей последовательности.

Термин "вектор" предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной к транспорту другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Одним из типов векторов является "плазмида", которая обозначает замкнутую кольцевую двухцепочечную ДНК, в которую можно лигировать дополнительные участки ДНК. Другим типом векторов является вирусный вектор, где дополнительные участки ДНК можно лигировать в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, содержащие участок начала репликации бактерий и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) при введении в клетку-хозяина могут интегрироваться в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Кроме того, определенные векторы способны контролировать экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем документе обозначают как "рекомбинантные экспрессирующие векторы" (или просто "экспрессирующие векторы"). В основном экспрессирующие векторы, пригодные в технологии рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании "плазмида" и "вектор" можно использовать взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее широко используемой формой вектора. Однако изобретение предназначено для включения других таких форм экспрессирующих векторов, таких как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Термин "функционально связанный" относится к смежному положению, где описанные компоненты находятся в зависимости, позволяющей им функционировать предназначенным для них образом. Контрольная последовательность, "функционально связанная" с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что обеспечивается экспрессия кодирующей последовательности в условиях, подходящих для контрольных последовательностей. "Функционально связанные" последовательности включают последовательности контроля экспрессии, которые расположены рядом с представляющим интерес геном, и последовательности контроля экспрессии, которые действуют в транс-положении или на дистанции от представляющего интерес контролируемого гена. Термин "последовательность контроля экспрессии" относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Последовательности контроля экспрессии включают подходящие последовательности инициации, терминации транскрипции, промоторные и энхансерные последовательности; сигналы эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматические мРНК; последовательности, увеличивающие эффективность трансляции (т.е., консенсусная последовательность Козака); последовательности, увеличивающие стабильность белка; и, когда желательно, последовательности, увеличивающие секрецию белка. Характер таких контрольных последовательностей отличается в зависимости от организма-хозяина: у прокариот такие контрольные последовательности, как правило, включают промотор, участок связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции; у эукариот, как правило, такие контрольные последовательности включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Термин "контрольные последовательности" предназначен для включения компонентов, присутствие которых имеет существенное значение для экспрессии и процессинга, а также может включать дополнительные компоненты, присутствие которых является предпочтительным, например, лидерные последовательности и последовательности партнера по слиянию.

"Трансформация" относится к любому процессу, посредством которого экзогенная ДНК попадает в клетку-хозяина. Трансформация может происходить в природных или искусственных условиях с применением различных способов, хорошо известных в данной области. Трансформация может быть основана на любом известном способе введения чужеродных последовательностей нуклеиновых кислот в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина. Способ выбирают на основе трансформируемой клетки-хозяина, и он в качестве неограничивающих примеров может включать вирусную инфекцию, электропорацию, липофекцию и бомбардировку частицами. Такие "трансформированные" клетки включают стабильно трансформированные клетки, в которых введенная ДНК способна к репликации в качестве автономно реплицирующейся плазмиды или в качестве части хромосомы хозяина. Они также включают клетки, которые транзиторно экспрессируют введенную ДНК или РНК в течение ограниченных периодов времени.

Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") предназначен для обозначения клетки, в которую введена экзогенная ДНК. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин содержит две или более (например, несколько) нуклеиновых кислот, кодирующих антитела, например такие, как клетки-хозяева, описанные в патент США № 7262028. Такие термины предназначены для обозначения не только конкретной индивидуальной клетки, но также потомства такой клетки. Вследствие того, что в последующих поколениях вследствие мутаций или воздействия окружающей среды могут происходить определенные модификации, такое потомство фактически может не быть идентичным родительской клетке, но все еще быть включенным в объем термина "клетка-хозяин". В одном из вариантов осуществления клетки-хозяева включают прокариотические и эукариотические клетки, выбранные из любого из царств живых организмов. В другом варианте осуществления эукариотические клетки включают клетки протистов, грибов, растений и животных. В другом варианте осуществления клетки-хозяева в качестве неограничивающих примеров включают линию прокариотических клеток E.Coli; линии клеток млекопитающих CHO, HEK 293, COS, NS0, SP2 и PER.C6; линию клеток насекомых Sf9 и клетки гриба Saccharomyces cerevisiae.

Для рекомбинантных ДНК, синтеза олигонуклеотидов и культивирования и трансформации тканей можно использовать стандартные способы (например, электропорацию, липофекцию). Ферментативные реакции и способы очистки можно проводить по инструкциям производителей или как обычно проводят в данной области, или как описано в настоящем документе. Указанные выше способы и процедуры, как правило, можно проводить общепринятыми способами, хорошо известными в данной области и как описано в различных общих и более специализированных источниках, которые цитируют и описывают на всем протяжении настоящей заявки. См. например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Как известно в данной области, "трансгенный организм" относится к организму с клетками, содержащими трансген, где с трансгена, введенного в организм (или предка организма), осуществляется экспрессия полипептида, не экспрессируемого в организме в природе. "Трансген" представляет собой конструкцию ДНК, стабильно и функционально интегрированную в геном клетки, из которой развивается трансгенный организм, направляющую экспрессию кодируемого продукта гена в одной или нескольких типах клеток или тканей трансгенного организма.

Термины "регулирует" и "модулирует" относятся к изменению или преобразованию активности представляющей интерес молекулы (например, биологической активности цитокина). Модуляция может представлять собой повышение или снижение уровня определенного вида активности или функции представляющей интерес молекулы.

Иллюстративные виды активности и функции молекулы в качестве неограничивающих примеров включают характеристики связывания, ферментативную активность, активацию клеточного рецептора и передачу сигнала.

Таким образом, термин "модулятор" представляет собой соединение, способное изменять или преобразовывать активность или функцию представляющей интерес молекулы (например, биологическую активность цитокина). Например, модулятор может вызывать повышение или снижение уровня определенного вида активности или функции молекулы по сравнению с величиной активности или функции, наблюдаемых в отсутствие модулятора. В определенных вариантах осуществления модулятор представляет собой ингибитор, снижающий уровень по меньшей мере одного вида активности или функции молекулы. Иллюстративные ингибиторы в качестве неограничивающих примеров включают белки, пептиды, антитела, пептидные антитела, углеводы или низкомолекулярные органические соединения. например, в публикации PCT № WO01/83525 описаны пептидные антитела.

Термин "агонист" относится к модулятору, который при контакте с представляющей интерес молекулой вызывает повышение уровня определенного вида активности или функции молекулы по сравнению с уровнем активности или функции, наблюдаемых в отсутствие агониста. Конкретные представляющие интерес агонисты в качестве неограничивающих примеров могут включать полипептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы или любые другие молекулы, связывающиеся с антигеном

Термин "антагонист" или "ингибитор" относится к модулятору, который при контакте с представляющей интерес молекулой вызывает снижение уровня определенного вида активности или функция молекулы по сравнению с уровнем активности или функции, наблюдаемых в отсутствие антагониста. Конкретные представляющие интерес антагонисты включают антагонисты, которые блокируют или модулируют биологическую или иммунологическую активность антигена. Антагонисты и ингибиторы антигенов в качестве неограничивающих примеров могут включать белки, нуклеиновые кислоты, углеводы или любые другие молекулы, связывающиеся с антигеном.

Термин "эффективное количество" относится к количеству лекарственного средства, которого достаточно для снижения или облегчения тяжести и/или продолжительности нарушения или одного или нескольких его симптомов, ингибирования или предотвращения прогресса нарушения, вызова регресса нарушения, ингибирования или предотвращения рецидива, развития, возникновения или прогресса одного или нескольких симптомов, ассоциированных c нарушением, детекции нарушения или усиления или улучшения профилактического или терапевтического эффекта(ов) другого лекарственного средства (например, профилактического или терапевтического средства).

Термины "пациент" и "индивидуум" в настоящем документе можно использовать взаимозаменяемо для обозначения животного, такого как млекопитающее, включая примата (например, человека, мартышки и шимпанзе), не являющегося приматом животного (например, корову, свинью, верблюда, ламу, лошадь, козу, кролика, овцу, хомяка, морскую свинку, кошку, собаку, крысу, мышь и кита), птицу (например, утку или гуся) и акулу. Предпочтительно пациент или индивидуум представляет собой человека, такого как человек, подвергаемый лечению или исследуемый на наличие заболевания, нарушения или патологического состояния, человек с риском заболевания, нарушения или патологического состояния, человек с заболеванием, нарушением или патологическим состоянием и/или человек, подвергаемый лечению от заболевания, нарушения или патологического состояния.

Термин "образец" используют в его самом широком смысле. "Биологический образец" в качестве неограничивающих примеров включает любое количество вещества из живого организма или ранее живого организма. Такие живые организмы в качестве неограничивающих примеров включают людей, мышей, крыс, обезьян, собак, кроликов и других животных. Такие вещества в качестве неограничивающих примеров включают кровь (например, цельную кровь), плазму, сыворотку, мочу, амниотическую жидкость, синовиальную жидкость, эндотелиальные клетки, лейкоциты, моноциты, другие клетки, органы, ткани, костный мозг, лимфоузлы и селезенку.

"Компонент", "компоненты" и "по меньшей мере один компонент", как правило, относятся к захватывающему антителу, детектируемому или конъюгированному антителу, контролю, калибровочному стандарту, серии калибровочных стандартов, панели чувствительности, контейнеру, буферу, разбавителю, соли, ферменту, кофактору фермента, реагенту для детекции, реагенту для предварительной обработки/раствору, субстрату (например, в виде раствора), останавливающему раствору и т.п., которые можно включать в набор для анализа тестируемого образца, такого как образец мочи, сыворотки или плазмы пациента, способами, описываемыми в настоящем документе, и другими известными в данной области способами. Таким образом, в отношении настоящего описания, "по меньшей мере один компонент", "компонент" и "компоненты" могут включать полипептид или другое анализируемое вещество, как указано выше, такие как композиция, содержащая анализируемое вещество, такое как полипептид, который необязательно иммобилизован на твердой подложке, например, посредством связывания с антителом к анализируемому веществу (например, с антителом к полипептиду). Некоторые компоненты могут находиться в растворе или их можно лиофилизировать с восстановлением для применения в анализе.

"Контроль" относится к композиции, для которой известно, что она не содержит анализируемого вещества ("отрицательный контроль") или содержит анализируемое вещество ("положительный контроль"). Положительный контроль может содержать известную концентрацию анализируемого вещества. "Контроль", "положительный контроль" и "калибровочный стандарт" в настоящем документе можно использовать взаимозаменяемо для обозначения композиции, содержащей известную концентрацию анализируемого вещества. "Положительный контроль" можно использовать для установления характеристик эффективности анализа, и он является эффективным индикатором целостности реагентов (например, анализируемых веществ).

"Предопределенный порог" и "предопределенный уровень", как правило, относятся к пороговому значению при анализе и используют для определения результатов диагностического/прогностического/терапевтического воздействия посредством сравнения результатов анализа с предопределенными порогом/уровнем, где предопределенные порог/уровень уже сцеплены или ассоциированы с различными клиническими параметрами (например, тяжесть заболевания, прогрессирование/отсутствие прогрессирования/улучшение и т.д.). Хотя в настоящем описании могут быть предоставлены иллюстративные предопределенные уровни, хорошо известно, что пороговые значения в зависимости от характера иммунологического анализа (например, применяемых антител и т.д.) могут варьировать. Далее специалист в данной области может адаптировать описание в настоящем документе для других иммунологических анализов с получением на основе этого описания специфичных для иммунологического анализа пороговых значений для других иммунологических анализов. В то время как точное значение предопределенных порога/уровня от анализа к анализу может варьировать, зависимости, описанные в настоящем документе, (если они вообще существуют) должны в основном сохраняться.

Как описано в настоящем документе, "реагент для предварительной обработки", например, реагент для лизиса, осаждения и/или растворения, как применяют в диагностическом анализе, представляет собой реагент, лизирующий любые клетки и/или растворяющий любое анализируемое вещество, присутствующие в тестируемом образце. Как описано далее в настоящем документе, предварительная обработка является необходимой не для всех образцов. В частности, растворение анализируемого вещества (например, представляющего интерес полипептида) может влечь за собой высвобождение анализируемого вещества от любых эндогенных связывающих белков, присутствующих в образце. Реагент для предварительной обработки может быть гомогенным (не требующим этапа разделения) или гетерогенным (требующим этапа разделения). При использовании гетерогенного реагента для предварительной обработки производят удаление из тестируемого образца до проведения следующего этапа анализа любых осаждаемых белков, связывающих анализируемое вещество.

"Реагенты для контроля качества" в отношении иммунологических анализов и наборов, описываемых в настоящем документе, в качестве неограничивающих примеров включают калибровочные стандарты, контроли и панели чувствительности. Как правило "калибровочный стандарт" или "стандарт" используют (например, один или несколько, такие как множество) для установления калибровочных (стандартных) кривых для интерполяции концентраций анализируемого вещества, такого как антитело или анализируемое вещество. Альтернативно, можно использовать один калибровочный стандарт, который находится вблизи предопределенного положительного/отрицательного порога. Можно использовать несколько калибровочных стандартов (т.е., более одного калибровочного стандарта или различные количества калибровочного стандарта(ов)) совместно так, чтобы составить "панель чувствительности".

"Риск" относится к возможности или вероятности конкретного события, происходящего в настоящее время или в определенный момент в будущем. "Выделение групп риска" относится к набору известных клинических факторов риска, который позволяет врачам классифицировать пациентов по низкому, умеренному, высокому или высочайшему риску развития конкретного заболевания, нарушения или патологического состояния.

"Специфичное" и "специфичность" в отношении взаимодействия между участниками пары со специфическим связыванием (например, антигена (или его фрагмента) и антитела (или его антигенно реактивного фрагмента)) относятся к селективной реакционности взаимодействия. Фраза "специфически связывается" и аналогичные фразы относятся к способности антител (или их антигенно реактивных фрагментов) к специфическому связыванию с анализируемым веществом (или его фрагментом) и отсутствию специфического связывания с другими молекулами.

"Партнер по специфическому связыванию" представляет собой участника пары со специфическим связыванием. Пара со специфическим связыванием включает две различные молекулы, которые специфически связываются друг с другом посредством химических или физических взаимодействий. Таким образом, в дополнение к парам антигенов и антител со специфическим связыванием в общих иммунологических анализах, другие пары со специфическим связыванием могут включать биотин и авидин (или стрептавидин), углеводы и лектины, комплементарные нуклеотидные последовательности, молекулы эффекторов и рецепторов, кофакторы и ферменты, ингибиторы ферментов и ферменты и т.п. Кроме того, пары со специфическим связыванием могут включать участников, которые являются аналогами исходных участников специфического связывания, например, аналог анализируемого вещества. Участники иммунореактивного специфического связывания включают антигены, фрагменты антигенов и антитела, включая моноклональные и поликлональные антитела, а также их комплексы, фрагменты и варианты (включая фрагменты вариантов), выделяемые или рекомбинантно получаемые.

"Вариант" означает полипептид, который отличается от данного полипептида (например, полипептида IL-18, BNP, NGAL или ВИЧ или антитела к полипептиду) по аминокислотной последовательности вследствие добавления (например, вставки), делеции или консервативной замены аминокислот, но который сохраняет биологическую активность данного полипептида (например, вариант IL-18 может конкурировать с IL-18 за связывание с антителом к IL-18). Консервативную замену аминокислоты, т.е. замену аминокислоты другой аминокислотой со сходными свойствами (например, гидрофильность и величина и распределение заряженных областей), в данной области считают включающими, как правило, незначительное изменение. Эти незначительные изменения частично можно идентифицировать, анализируя индекс гидрофобности аминокислот, как понимают в данной области (см., например, Kyte et al. (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132). Индекс гидрофобности аминокислоты основан на анализе ее гидрофобности и заряда. В данной области известно, что аминокислоты со сходными индексами гидрофобности можно заменять и все еще сохранять функцию белка. В одном из аспектов заменяют аминокислоты с индексами гидрофобности ±2. Также для выявления замен, которые могут приводить к белкам, сохраняющим биологическую функцию, можно использовать гидрофильность аминокислот. Анализ гидрофильности аминокислот применительно к пептиду позволяет рассчитывать наибольшую среднюю локальную гидрофильность этого пептида, подходящий критерий, который описан, как хорошо коррелирующий с антигенностью и иммуногенностью (см., например, патент США № 4554101). Замена аминокислот со сходными величинами гидрофильности может приводить к пептидам, сохраняющим биологическую активность, например, иммуногенность, как это понимают в данной области. В одном из аспектов замены проводят аминокислотами с величинами гидрофильности в пределах ±2 друг от друга. На индекс гидрофобности и величину гидрофильности аминокислот влияет конкретная боковая цепь аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением следует понимать, что замены аминокислот, которые совместимы с биологической функцией зависят от относительного сходства аминокислот и особенно боковых цепей этих аминокислот, что выявляют по гидрофобности, гидрофильности, заряду, размеру и другим свойствам. "Вариант" также можно использовать для описания полипептида или его фрагмента, который будучи процессирован иным образом, таким как протеолиз, фосфорилирование или другие посттрансляционные модификация, все же сохраняет свою биологическую активность или антигенреактивность, например, способность связываться с IL-18. Если из контекста не следует иначе, термин "вариант" включает фрагменты варианта.

I. Получение связывающего белка с DVD

Изобретение относится к связывающим белкам с двойными вариабельными доменами, связывающим одну или несколько мишеней, и к способам их получения. В одном из вариантов осуществления связывающий белок содержит полипептидную цепь, где указанная полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен, VD2 представляет собой второй вариабельный домен, C представляет собой константный домен, X1 представляет собой аминокислоту или полипептид, X2 представляет собой Fc-область, и n представляет собой 0 или 1. Связывающий белок по изобретению можно получать различными способами. Изобретение относится к экспрессирующим векторам, клеткам-хозяевам и способам получения связывающего белка.

A. Получение исходных моноклональных антител

Вариабельные домены связывающего белка с DVD можно получать из исходных антител, включая поликлональные и mAb, связывающие представляющие интерес антигены. Эти антитела могут являться природными или их можно получать рекомбинантными способами.

MAb можно получать большим разнообразием способов, известных в данной области, включая использование гибридомной, рекомбинантной технологий и технологии фагового дисплея или их сочетания. Например, mAb можно получать гибридомными способами, включая способы, известные в данной области и описанные, например, в Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.); Hammerling et al. (1981) в: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, NY). Термин "моноклональное антитело" не ограничено антителами, получаемыми посредством гибридомной технологии. Термин "моноклональное антитело" относится к антителу, которое получают из одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не способ, которым он получен. Гибридомы выбирают, клонируют и дополнительно подвергают скринингу на желаемые характеристики, включая активный рост гибридомы, высокую продукцию антител и желаемые характеристики антител, как описано в примере 1 ниже. Гибридомы можно культивировать и выращивать in vivo у сингенных животных, у животных с отсутствием иммунной системы, например, у "голых" мышей, или в клеточной культуре in vitro. Способы отбора, клонирования и выращивания гибридом хорошо известны специалистам в данной области. В конкретном варианте осуществления гибридомы представляют собой гибридомы мыши. В другом варианте осуществления гибридомы получают у не являющихся человеком, не являющихся мышью видов, таких как крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади. В другом варианте осуществления гибридомы представляют собой гибридомы человека, у которых несекретирующую миелому человека сливают с клеткой человека, экспрессирующей антитело, связывающее специфический антиген.

Рекомбинантные mAb также получают из одиночных, выделенных лимфоцитов предпочитаемым в данной области способом, таким как способ получения антител из отобранных лимфоцитов (SLAM), как описано в патенте США № 5627052; публикации PCT № WO 92/02551 и Babcock et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. В этом способе идентифицируют одиночные клетки, секретирующие представляющие интерес антитела, например, лимфоциты, получаемые у иммунизированного животного, и посредством ПЦР с обратной транскриптазой получают кДНК вариабельных областей тяжелых и легких цепей из клеток, и затем эти вариабельные области можно экспрессировать в связи с подходящими константными областями иммуноглобулинов (например, константные области человека) в клетках-хозяевах млекопитающих, таких как клетки COS или CHO. Затем клетки-хозяева, трансфицированные амплифицированными последовательностями иммуноглобулинов, полученными из выделенных in vivo лимфоцитов, можно подвергать дальнейшему анализу и отбору in vitro, например, посредством пэннинга трансфицированных клеток с выделением клеток, экспрессирующих антитела к представляющему интерес антигену. Кроме того, амплифицированные последовательности иммуноглобулинов можно обрабатывать in vitro, например, способами созревания аффинности in vitro, такими как способы, описанные в публикациях PCT №№ WO 97/29131 и WO 00/56772.

Также моноклональные антитела получают посредством иммунизации представляющим интерес антигеном не являющегося человеком животного, содержащего некоторые или все локусы иммуноглобулинов человека. В одном из вариантов осуществления не являющееся человеком животное представляет собой трансгенную мышь XENOMOUSE, сконструированную линию мышей, содержащих большие фрагменты локусов иммуноглобулинов человека и с дефицитом продукции антител мыши. См., например, Green et al. (1994) Nature Genet. 7:13-21 и патенты США №№ 5916771; 5939598; 5985615; 5998209; 6075181; 6091001; 6114598 и 6130364. Также см. публикации PCT №№ WO 91/10741; WO 94/02602; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 98/16654; WO 98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031; WO 99/53049; WO 00/09560 и WO 00/037504. Трансгенная мышь XENOMOUSE продуцирует репертуар полностью человеческих антител, подобный репертуару взрослого человека, и продуцирует антигенспецифические моноклональные антитела человека. Трансгенная мышь XENOMOUSE содержит приблизительно 80% репертуара антител человека вследствие введения фрагментов YAC локусов тяжелой цепи и локусов легкой цепи κ (каппа) человека в конфигурации зародышевой линии в размере нескольких мегабаз. См. Mendez et al. (1997) Nature Genet. 15:146-156; Green and Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495.

Также для получения исходных антител можно использовать способы in vitro, где для идентификации антитела с желаемой специфичностью связывания подвергают скринингу библиотеку антител. Способы для такого скрининга библиотек рекомбинантных антител хорошо известны в данной области и включают способы, описанные, например, в патенте США № 5223409; публикациях PCT №№ WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690 и WO 97/29131; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acid Res. 19:4133-4137; и Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 и публикации США № 20030186374.

Также исходные антитела по настоящему изобретению можно получать с использованием различных способов фагового дисплея, известных в данной области. В способах фагового дисплея функциональные домены антитела экспонированы на поверхности фаговых частиц, несущих полинуклеотидные последовательности, кодирующие их. В частности, такой фаг можно использовать для экспонирования антигенсвязывающих доменов, экспрессируемых из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши). Фаг, экспрессирующий антигенсвязывающий домен, связывающий представляющий интерес антиген, можно выбирать или идентифицировать посредством антигена, например, с использованием меченого антигена или антигена, связанного с твердой поверхностью или гранулой или захваченного на них. Как правило, фаг, используемый в этих способах, представляет собой нитевидный фаг, содержащий связывающие домены fd и M13, экспрессируемые с фага с доменами антител Fab, Fv или стабилизированными дисульфидами Fv доменами антител, рекомбинантно слитыми с белками, экспрессируемым с гена III или гена VIII фага. Примеры способов фагового дисплея, которые можно использовать для получения антител по настоящему изобретению, включают способы, описанные в Brinkman et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al. (1997) Gene 187 9-18; Burton et al. (1994) Advances Immunol. 57:191-280; публикациях PCT №№ WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; и WO 95/20401; и патентах США №№ 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 и 5969108.

После отбора фага, кодирующие антитела области фага можно выделять и использовать для получения целых антител, включая антитела человека или любой другой желаемый антигенсвязывающий фрагмент, и экспрессировать в любом желаемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии, например, как подробно описано ниже. Например, также можно применять способы для рекомбинантного получения фрагментов Fab, Fab' и F(ab')₂ известными в данной области способами, такими как способы, описанные в публикации PCT № WO 92/22324; Mullinax et al., (1992) BioTechniques 12(6):864-869; и Sawai et al. (1995) AJRI 34:26-34; и Better et al. (1988) Science 240:1041-1043. Примеры способов, которые можно использовать для получения одноцепочечных Fv и антител, включают способы, описанные в патентах США №№ 4946778 и 5258498; Huston et al. (1991) Methods Enzymol. 203:46-88; Shu et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999; и Skerra et al. (1988) Science 240:1038-1040.

Альтернативно скринингу библиотек рекомбинантных антител посредством фагового дисплея для идентификации исходных антител можно применять другие способы скрининга больших комбинаторных библиотек, известные в данной области. Одним типом альтернативной экспрессирующей системы является тип, в котором рекомбинантную библиотеку антител экспрессируют в виде слияний РНК-белок, как описано в публикации PCT № WO 98/31700 Szostak и Roberts и в Roberts and Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. В этой системе получают ковалентное слияние между мРНК и пептидом или белком, который она кодирует посредством трансляции in vitro синтетической мРНК, несущей на своем 3'-конце пуромицин, антибиотик, являющийся акцептором пептидилов. Таким образом, сложную смесь мРНК (например, комбинаторную библиотеку) можно обогащать конкретной мРНК на основе свойств кодируемого пептида или белка, например, антитела или его части, таких как связывание антитела или части с антигеном с двойной специфичностью. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела или их части, получаемые посредством скрининга таких библиотек, можно экспрессировать рекомбинантными способами, как описано в настоящем документе (например, в клетках-хозяевах млекопитающих) и, кроме того, можно подвергать дальнейшему созреванию аффинности посредством дополнительных циклов скрининга слияний мРНК-пептид, в которых в исходно выбранную последовательность(и) вносят мутации, или другими способами созревания аффинности рекомбинантных антител in vitro, как описано в настоящем документе.

В другом подходе исходные антитела также можно получать с использованием способов дрожжевого дисплея, известных в данной области. В способах дрожжевого дисплея, для связывания доменов антител с клеточной стенкой дрожжей и экспонирования их на поверхности дрожжей используют генетические способы. В частности, такие дрожжи можно использовать для экспонирования антигенсвязывающих доменов, экспрессируемых из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши). Примеры способов дрожжевого дисплея, которые можно использовать для получения исходных антител, включают способы, описанные в патенте США № 6699658.

Антитела, описываемые в настоящем документе, можно дополнительно модифицировать с получением исходных антител с привитыми CDR и гуманизированных исходных антител. Исходные антитела с привитыми CDR содержат последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей из антитела человека, где одна или несколько областей CDR V_H и/или V_L заменены последовательностями CDR антител мыши, связывающих представляющий интерес антиген. В качестве матрицы для прививания CDR может служить каркасная последовательность из любого антитела человека. Однако прямая замена цепи на таком каркасе часто приводит к определенной потере аффинности связывания с антигеном. Чем более гомологичным является антитело человека с исходным антителом мыши, тем менее вероятной является возможность того, что комбинирование CDR мыши с каркасом человека внесет искажения в CDR, которые смогут снизить аффинность. Таким образом, в одном из вариантов осуществления последовательность каркаса вариабельной области человека, который выбирают для замены каркаса вариабельной области мыши за исключением CDR, по меньшей мере на 65% идентична с каркасом вариабельной области антитела мыши. В одном из вариантов осуществления последовательности вариабельных областей человека и мыши за исключением CDR идентичны по меньшей мере на 70%. В конкретном варианте осуществления эти последовательности вариабельных областей человека и мыши за исключением CDR идентичны по меньшей мере на 75%. В другом варианте осуществления последовательности вариабельных областей человека и мыши за исключением CDR идентичны по меньшей мере на 80%. Способы получения таких антител известны в данной области (см. патент Европы № EP 239400; публикацию PCT № WO 91/09967; патенты США №№ 5225539; 5530101 и 5585089), винирование или изменение поверхности (патенты Европы №№ EP 592106 и EP 519596; Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) Protein Engin. 7(6):805-814; Roguska et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973) и перестановка цепей (патент США № 5565352) и идиотипические антитела.

Гуманизированные антитела представляют собой молекулы антител на основе антител не являющихся человеком видов, связывающие желаемый антиген с одной или несколькими определяющими комплементарность областями (CDR) не являющихся человеком видов и каркасными областями молекулы иммуноглобулина человека. Известные последовательности Ig человека описаны, например, в

Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept Health (1983).

Такие импортированные последовательности можно использовать для снижения иммуногенности или уменьшения, увеличения или модификации связывания, аффинности, скорости прямой реакции, скорости обратной реакции, авидности, специфичности, времени полужизни или любой другой подходящей характеристики, как известно в данной области.

Для изменения, например, улучшения, связывания антигена каркасные остатки в каркасных областях человека можно заменять соответствующими остатками из антитела-донора CDR. Эти замены в каркасе определяют хорошо известными в данной области способами, например, посредством моделирования взаимодействий CDR и каркасных остатков с идентификацией каркасных остатков, существенных для связывания антигена и сравнивания последовательностей для идентификации необычных каркасных остатков в конкретных положениях. (см., например, патент США № 5585089; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323). Трехмерные модели иммуноглобулинов являются общедоступными и хорошо известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и демонстрируют возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей-кандидатов иммуноглобулинов. Исследование этих изображений позволяет анализировать возможную роль остатков в функционировании последовательности-кандидата иммуноглобулина, т.е. анализировать остатки, влияющие на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с его антигеном. Таким образом, можно выбирать и комбинировать остатки FR из консенсусных и важных последовательностей так, чтобы достигалась желаемая характеристика антитела, такая как увеличенная аффинность к антигену(ам)-мишени. Как правило, в воздействие на связывание антигена напрямую и наиболее существенно вовлечены остатки CDR. Антитела можно гуманизировать множеством известных в данной области способов, в качестве неограничивающих примеров таких, как описаны в Jones et al. (1986) Nature 321:522; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534; Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901; Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol. 151:2623; Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) Prot. Engin. 7(6):805-814; Roguska et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973; публикации PCT № WO 91/09967, международных заявках №№ PCT/US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; публикациях PCT №№ WO 90/14443; WO 90/14424; WO 90/14430; патентах Европы №№ EP 229246; EP 592106; EP 519596; EP 239400; патентах США №№ 5565332; 5723323; 5976862; 5824514; 5817483; 5814476; 5763192; 5723323; 5766886; 5714352; 6204023; 6180370; 5693762; 5530101; 5585089; 5225539 и 4816567.

B. Критерии для отбора исходных моноклональных антител

Вариант осуществления изобретения относится к отбору исходных антител по меньшей мере с одним или несколькими свойствами, желаемыми в молекуле DVD-Ig. В одном из вариантов осуществления желаемое свойство выбрано из одного или нескольких параметров антитела. В другом варианте осуществления параметры антитела выбраны из группы, состоящей из антигенной специфичности, аффинности к антигену, активности, биологической функции, распознавания эпитопа, стабильности, растворимости, эффективности продукции, иммуногенности, фармакокинетики, биодоступности, тканевой перекрестной реактивности и связывания ортологичных антигенов.

B1. Аффинность к антигену

Желаемая аффинность терапевтического mAb может зависеть от природы антигена и желаемого конечного терапевтического результата. В одном из вариантов осуществления моноклональные антитела обладают более высокими аффинностями (Kd=0,01-0,50 пМ) при блокировании взаимодействий цитокин-рецептор цитокина, так как такие взаимодействия, как правило, являются высокоаффинными взаимодействиями (например, в диапазонах <пМ - <нМ). В таких случаях аффинность mAb к его мишени должна быть равной или лучшей, чем аффинность цитокина (лиганда) к его рецептору. С другой стороны, mAb с менее высокой аффинностью (диапазон >нМ) могут быть терапевтически эффективными, например, при выведении циркулирующих потенциально патогенных белков, например, моноклональные антитела, связывающие, блокирующие и выводящие циркулирующие молекулы амилоида A-β. В других случаях снижение аффинности существующего высокоаффинного mAb посредством сайт-специфического мутагенеза или использование mAb с меньшей аффинностью к его мишени можно использовать во избежание потенциальных побочных эффектов, например, высокоаффинное mAb может блокировать/нейтрализовать всю предназначенную ему мишень, таким образом полностью истощая/устраняя функцию(и) белка-мишени. При этом варианте низкоаффинное mAb может блокировать/нейтрализовать часть мишени, которая может отвечать за симптомы заболевания (патологические или сверхпродуцируемые уровни), таким образом, позволяя части мишени продолжать осуществлять ее нормальную физиологическую функцию(и). Таким образом, можно снижать Kd для подбора дозы и/или снижения побочных эффектов. Аффинность исходного mAb может играть роль в соответствующем направлении к молекулам клеточной поверхности для достижения желаемого терапевтического результата. Например, если мишень экспрессирована с высокой плотностью на злокачественных клетках и с низкой плотностью на нормальных клетках, mAb с меньшей аффинностью будут связываться с большим количеством мишеней на опухолевых клетках, чем на нормальных клетках, приводя к устранению опухолевых клеток посредством ADCC или CDC, и, таким образом, могут обладать желаемым терапевтическим действием. Таким образом, отбор mAb с желаемой аффинностью может подходить и для растворимых, и для поверхностных мишеней.

Передача сигнала через рецептор при взаимодействии с его лигандом может зависеть от аффинности взаимодействия рецептор-лиганд. Подобным образом, понятно, что аффинность mAb к поверхностному рецептору может определять характер межклеточной сигнализации, и может ли mAb передавать агонистический или антагонистический сигнал. Основанный на аффинности характер опосредованной mAb передачи сигнала может иметь влияние на характер его побочных эффектов. Таким образом, желаемую аффинность и желаемые функции терапевтических моноклональных антител необходимо тщательно определять посредством экспериментирования in vitro и in vivo.

Желаемую Kd связывающего белка (например, антитела) можно определять экспериментально в зависимости от желаемого терапевтического результата. В одном из вариантов осуществления выбирают исходные антитела с аффинностью (Kd) к конкретному антигену, равной или лучшей, чем желаемая аффинность DVD-Ig к этому антигену. Исходные антитела для данной молекулы DVD-Ig могут представлять собой одинаковые антитела или разные антитела. Аффинность и кинетику связывания антигена оценивают посредством Biacore или другого сходного способа. В одном из вариантов осуществления константа диссоциации (Kd) каждого исходного антитела к его антигену выбрана из группы, состоящей из: максимум приблизительно 10^-7 M; максимум приблизительно 10^-8 M; максимум приблизительно 10^-9 M; максимум приблизительно 10^-10 M; максимум приблизительно 10^-11 M; максимум приблизительно 10^-12 M и максимум 10^-13 M. Первое исходное антитело, из которого получают VD1, и второе исходное антитело, из которого получают VD2, могут иметь сходную или различную аффинность (K_D) к их соответствующим антигенам. Константа ассоциации (K_on) каждого исходного антитела с его антигеном выбрана из группы, состоящей из: по меньшей мере приблизительно 10² M^-1сек^-1; по меньшей мере приблизительно 10³ M^-1сек^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁴ M^-1сек^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁵ M^-1сек^-1 и по меньшей мере приблизительно 10⁶ M^-1сек^-1, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса. Первое исходное антитело, из которого получают VD1, и второе исходное антитело, из которого получают VD2, могут иметь сходную или различную константу ассоциации (K_on) с соответствующим антигеном. В одном из вариантов осуществления константа диссоциации (K_off) каждого исходного антитела с антигеном выбрана из группы, состоящей из: максимум приблизительно 10^-3 сек^-1; максимум приблизительно 10^-4 сек^-1; максимум приблизительно 10^-5 сек^-1 и максимум приблизительно 10^-6 сек^-1, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса. Первое исходное антитело, из которого получают VD1, и второе исходное антитело, из которого получают VD2, могут иметь сходные или различные константы диссоциации (K_off) с соответствующими антигенами.

B2. Активность

Желаемая аффинность/активность исходных моноклональных антител зависит от желаемого терапевтического результата. Например, для взаимодействия рецептор-лиганд (R-L) аффинность (kd) равна или выше, чем kd R-L (пМ диапазон). Для простого выведения циркулирующего патологического белка kd может находиться в нижнем нМ диапазоне, например, для выведения различных молекул циркулирующего пептида A-β. Кроме того, kd также зависит от того, экспрессирует ли мишень несколько копий одного и того же эпитопа, например, mAb, направленное к конформационному эпитопу в олигомерах Aβ.

Когда VD1 и VD2 связывают один и тот же антиген, но различные эпитопы, DVD-Ig содержит 4 участка связывания одного антигена, таким образом, увеличивая авидность и, таким образом, наблюдаемую kd DVD-Ig. В одном из вариантов осуществления выбирают исходные антитела с равной или меньшей kd, чем желаемое DVD-Ig. Оценка аффинности исходного mAb также может зависеть от того, содержит ли DVD-Ig четыре или более идентичных антигенсвязывающих участков (например, DVD-Ig из одного mAb). В этом случае наблюдаемая kd может быть больше, чем у mAb вследствие авидности. Такие DVD-Ig можно применять для связывания поверхностного рецептора, увеличения нейтрализующей активности, увеличения выведения патологических белков и т.д.

В одном из вариантов осуществления выбирают исходные антитела с нейтрализующей активностью в отношении конкретного антигена, равной или лучшей, чем желаемый нейтрализующий потенциал DVD-Ig в отношении этого антигена. Нейтрализующую активность можно оценивать посредством зависимого от мишени биологического анализа, в котором клетки подходящего типа в ответ на стимуляцию мишени обеспечивают измеримый сигнал (т.е., пролиферацию или продукцию цитокинов), и нейтрализация мишени посредством mAb может снижать сигнал зависимым от дозы способом.

B3. Биологические функции

Моноклональные антитела потенциально могут выполнять несколько функций. Некоторые из этих функций приведены в таблице 1. Эти функции можно оценивать посредством анализов in vitro (например, основанные на клетках и биохимические анализы) и в моделях на животных in vivo.

Таблица 1 Некоторые возможные применения терапевтических антител
Мишень (класс)	Механизм действия (мишень)
Растворимая (цитокины, другое)	Нейтрализация активности (например, цитокина) Увеличение вывода (например, олигомеров Aβ) Увеличение времени полужизни (например, GLP 1)
Клеточная поверхность (рецепторы, другое)	Агонистический (например, GLP1 R; EPO R; и т.д.) Антагонистический (например, интегрины; и т.д.) Цитотоксический (CD 20; и т.д.)
Отложения белков	Увеличение выведения/разрушения (например, бляшек Aβ, отложений амилоида)

Для достижения желаемых терапевтических результатов можно выбирать mAb с различными функциями, описанными в примерах в таблице 1 в настоящем документе. Затем два или более выбранных исходных моноклональных антитела можно использовать в формате DVD-Ig с получением двух различных функций в одной молекуле DVD-Ig. Например, DVD-Ig можно получать, посредством отбора исходного mAb с функцией нейтрализации конкретного цитокина и выбора исходного mAb, увеличивающего выведение патологического белка. Подобным образом, можно выбирать два исходных моноклональных антитела, которые распознают два различных рецептора клеточной поверхности, одно mAb с функцией агониста одного рецептора, а другое mAb с функция антагониста другого рецептора. Эти два выбранных моноклональных антитела, каждое с различной функцией, можно использовать для конструирования одной молекулы DVD-Ig, обладающей двумя различными функциями (агониста и антагониста) выбранных моноклональных антител в одной молекуле. Подобным образом, в формате DVD-Ig можно использовать два антагонистических моноклональных антитела к рецепторам клеточной поверхности, где каждое блокирует связывание лигандов соответствующего рецептора (например, EGF и IGF). С другой стороны, для получения DVD-Ig можно выбирать антагонистическое mAb к рецептору (например, антитело к EGFR) и нейтрализующее mAb к растворимому медиатору (например, антитело к IGF1/2).

B4. Распознавание эпитопов

Различные области белков могут выполнять различные функции. Например, с цитокиновым рецептором взаимодействуют конкретные области цитокина с осуществлением активации рецептора, тогда как другие области белка могут быть необходимыми для стабилизации цитокина. В этом случае можно выбирать mAb, специфически связывающееся с взаимодействующей с рецептором областью(ями) на цитокине, и, таким образом, блокировать взаимодействие цитокин-рецептор. В некоторых случаях, например, в случаях определенных хемокиновых рецепторов, связывающих несколько лигандов, можно выбирать mAb, связывающееся с эпитопом (областью на хемокиновом рецепторе), который взаимодействует только с одним лигандом. В других случаях моноклональные антитела могут связываться с эпитопами на мишенях, которые напрямую не отвечают за физиологические функции белка, но связывание mAb с этими областями может или препятствовать физиологическим функциям (стерическое препятствие), или изменять конформацию белка так, что белок не может функционировать (mAb к рецепторам с несколькими лигандами, которые изменяют конформацию рецептора так, что связаться не может ни один лиганд). Также идентифицированы моноклональные антитела к цитокинам, которые не блокируют связывание цитокина с его рецептором, но блокируют передачу сигнала (например, 125-2H, mAb к IL-18).

Примеры эпитопов и функций mAb в качестве неограничивающих примеров включают блокирование взаимодействия рецептор-лиганд (R-L) (нейтрализующие mAb, связывающие взаимодействующий с R участок); стерическое препятствие, приводящее к снижению или отсутствию связывания с R. Ab может связывать мишень в участке, отличном от участка связывания рецептора, но по-прежнему препятствовать связыванию рецептора и функции мишени посредством индукции конформационных изменений и устранения функции (например, ксолар (Xolair)), связывание R, но блокирование передачи сигнала (125-2H).

В одном из вариантов осуществления исходному mAb для максимальной эффективности необходимо связывать соответствующий эпитоп. Такой эпитоп в DVD-Ig необходимо сохранять. Связываемый mAb эпитоп можно определять несколькими способами, включая совместную кристаллографию, ограниченный протеолиз комплекса mAb-антиген и масс-спектрометрическое картирование пептидов (Legros et al. (2000) Protein Sci. 9:1002-10), экспрессируемые на фагах пептидные библиотеки (O'Connor et al. (2005) J. Immunol. Methods 299:21-35), а также мутагенез (Wu et al. (2003) J. Immunol. 170:5571-7).

B5. Физико-химические и фармацевтические свойства

Терапевтическое лечение антителами часто требует введения высоких доз, часто нескольких мг/кг (вследствие низкой активности в расчете на массу как следствие, как правило, большой молекулярной массы). Для обеспечения соблюдения пациентом схемы лечения и для адекватного направления лечения хронического заболевания и лечения в поликлиниках, желательно проводить подкожное (п/к) или внутримышечное (в/м) введение терапевтических mAb. Например, максимальный желаемый объем для п/к введения составляет ≈1,0 мл, и, таким образом, для ограничения количества инъекций на дозу желательны концентрации >100 мг/мл. В одном из вариантов осуществления терапевтическое антитело вводят одной дозой. Однако разработку таких составов ограничивают белок-белковые взаимодействия (например, агрегация, которая потенциально увеличивает риски иммуногенности) и ограничения при обработке и доставке (например, вязкость). Таким образом, большие количества, необходимые для клинической эффективности, и связанные ограничения при разработке ограничивают полное использование потенциала состава антитела и п/к введения при схемах лечения с высокой дозой. Очевидно, что физико-химические и фармацевтические свойства молекулы белка и раствора белка, например, свойства стабильности, растворимости и вязкости, имеют очень большую важность.

B5.1. Стабильность

"Стабильный" состав антитела представляет собой состав, в котором антитело по существу сохраняет свои физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность при хранении. Стабильность можно измерять при выбранной температуре в течение выбранного периода времени. В одном из вариантов осуществления антитело в составе является стабильным при комнатной температуре (приблизительно 30°C) или при 40°C по меньшей мере в течение 1 месяца и/или стабильным приблизительно при 2-8°C по меньшей мере в течение 1 года, по меньшей мере в течение 2 лет. Кроме того, в одном из вариантов осуществления состав стабилен после замораживания (например, до -70°C) и оттаивания состава, что далее в настоящем документе обозначают как "цикл замораживания/оттаивания". В другом примере "стабильный" состав может представлять собой состав, где в качестве агрегата находятся менее чем приблизительно 10% и менее чем приблизительно 5% белка в составе.

Желательным является DVD-Ig, стабильное in vitro при различных температурах в течение длительных периодов времени. Этого можно достигать посредством быстрого скрининга исходных mAb, стабильных in vitro при повышенной температуре, например, при 40°C, в течение 2-4 недель, а затем оценки стабильности. При хранении при 2-8°C белок демонстрирует стабильность по меньшей мере в течение 12 месяцев, например, по меньшей мере 24 месяца. Стабильность (% от мономерной интактной молекулы) можно оценивать различными способами, такими как катионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография, SDS-PAGE, а также тестирование биологической активности. Для ознакомления с более полным списком аналитических способов, которые можно использовать для анализа ковалентных и конформационных модификаций, см. Jones (1993) Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems. In: Cleland, J. L.; Langer, R., editors. Formulation and delivery of peptides and proteins, 1^st edition, Washington, ACS, pg. 22-45; and Pearlman and Nguyen (1990) Analysis of protein drugs. In: Lee, V. H., editor. Peptide and protein drug delivery, 1st edition, New York, Marcel Dekker, Inc., pg. 247-301.

Гетерогенность и формирование агрегатов: стабильность антитела может быть такой, что в составе можно выявлять менее чем приблизительно 10%, а в одном из вариантов осуществления менее чем приблизительно 5%, в другом варианте осуществления менее чем приблизительно 2% или в одном из вариантов осуществления в диапазоне от 0,5% до 1,5% или менее вещества антитела по GMP, которое присутствует в качестве агрегата. Способом, который является чувствительным, воспроизводимым и очень надежным при детекции агрегатов белка, является эксклюзионная хроматография.

В дополнение к низкому уровню агрегатов, антитело в одном из вариантов осуществления должно быть химически стабильным. Химическую стабильность можно определять посредством ионообменной хроматографии (например, катионо- или анионообменной хроматографии), хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий или другими способами, такими как изоэлектрофокусирование или капиллярный электрофорез. Например, химическая стабильность антитела может являться такой, что после хранения в течение по меньшей мере 12 месяцев при 2-8°C пик, представляющий немодифицированное антитело в катионообменной хроматографии, по сравнению с раствором антитела до тестирования хранения может увеличиваться не более чем на 20%, в одном из вариантов осуществления не более чем на 10% или, в другом варианте осуществления, не более чем на 5%.

В одном из вариантов осуществления исходные антитела демонстрируют целостность структуры; правильное формирование дисульфидных связей и правильное свертывание: химическая нестабильность вследствие изменений вторичной или третичной структуры антитела может влиять на активность антитела. Например, стабильность, как измеряют по активности антитела, может быть такой, что после хранения по меньшей мере в течение 12 месяцев при 2-8°C активность антитела по сравнению с раствором антитела до тестирования хранения может снижаться не более чем на 50%, в одном из вариантов осуществления не более чем на 30% или даже не более чем на 10%, или в одном из вариантов осуществления не более чем на 5% или 1%. Для определения активности антител можно использовать подходящие анализы связывания антигенов.

B5.2. Растворимость

"Растворимость" mAb коррелирует с получением правильно свернутого мономерного IgG. Таким образом, растворимость IgG можно оценивать посредством ВЭЖХ. Например, растворимое (мономерное) IgG приводит к получению одного пика на хроматографе ВЭЖХ, тогда как нерастворимое (например, полимерное и агрегированное) IgG приводит к получению множества пиков. Таким образом, специалист в данной области может определить возрастание или снижение растворимости IgG стандартными способами ВЭЖХ. Для ознакомления с более полным списком аналитических способов, которые можно использовать для анализа растворимости, см. Jones (1993) Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. London, London, UK. Editor(s): Shamlou, P. Ayazi. Process. Solid-Liq. Suspensions, 93-117. Publisher: Butterworth-Heinemann, Oxford, UK and Pearlman and Nguyen (1990) Advances Parenteral Sci. 4:247-301. Растворимость терапевтических mAb является критичной для формулирования в высоких концентрациях, часто необходимых для подходящего дозирования. Как указано в настоящем документе, для обеспечения эффективного дозирования антитела может требоваться растворимость >100 мг/мл. Например, растворимость антитела может составлять не менее чем приблизительно 5 мг/мл на ранних этапах исследования, в одном из вариантов осуществления не менее чем приблизительно 25 мг/мл на продвинутых этапах развития исследования, или, в одном из вариантов осуществления, не менее чем приблизительно 100 мг/мл, или, в одном из вариантов осуществления, не менее чем приблизительно 150 мг/мл. Специалисту в данной области очевидно, что характеристическими свойствами молекулы белка являются важные физико-химические свойства раствора белка, например, стабильность, растворимость, вязкость. Однако специалисту в данной области понятно, что для положительного влияния на характеристики конечного состава белка существует большое разнообразие эксципиентов, которых можно использовать в качестве добавки. Эти эксципиенты могут включать: (i) жидкие растворители, сорастворители (например, спирты, такие как этанол); (ii) буферные средства (например, фосфатный, ацетатный, цитратный, аминокислотный буферы); (iii) сахара или сахарные спирты (например, сахароза, трегалоза, фруктоза, рафиноза, маннит, сорбит, декстраны); (iv) поверхностно-активные вещества (например, полисорбаты 20, 40, 60, 80, полоксамеры); (v) модификаторы для придания изотоничности (например, соли, такие как NaCl, сахара, сахарные спирты) и (vi) другое (например, консерванты, хелатирующие средства, антиоксиданты, хелатирующие вещества (например, ЭДТА), биологически разрушаемые полимеры, молекулы-носители (например, HSA, PEG)).

Вязкость является очень важным параметром в отношении производства антител и обработки антител (например, диафильтрации/ультрафильтрации), способов конечного заполнения (аспекты подачи насосом, аспекты фильтрации) и аспектов доставки (возможность введения через шприц, доставка посредством сложных устройств). Низкие вязкости позволяют жидкому раствору антитела иметь более высокие концентрации. Это обеспечивает то, что ту же самую дозу можно вводить в меньшем объеме. Малый объем инъекции обеспечивает преимущество меньшей боли при ощущениях инъекции и то, что для снижении боли при инъекции пациенту растворы не обязательно должны быть изотоническими. Вязкость раствора антитела может быть такой, что при скорости сдвига 100 (1/сек) вязкость раствора антитела составляет менее 200 мПа·сек, в одном из вариантов осуществления менее 125 мПа·сек, в другом варианте осуществления менее 70 мПа·сек, и еще в одном варианте осуществления менее 25 мПа·сек или даже менее 10 мПа·сек.

B5.3. Эффективность продукции

Получение DVD-Ig, которое эффективно экспрессируется в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка (CHO), в одном из вариантов осуществления требует двух исходных моноклональных антител, которые сами эффективно экспрессируются в клетках млекопитающих. Выход продукции из стабильной линии млекопитающих (т.е., CHO) должен составлять приблизительно более 0,5 г/л, в одном из вариантов осуществления приблизительно более 1 г/л, а в другом варианте осуществления в диапазоне приблизительно от 2 до приблизительно 5 г/л или более (Kipriyanov and Little (1999) Mol. Biotechnol. 12:173-201; Carroll and Al-Rubeai (2004) Expert Opin. Biol. Ther. 4:1821-9).

На получение антител и слитых с Ig белков в клетках млекопитающих влияют несколько факторов. Максимизировать транскрипцию представляющего интерес гена с интегрированной копии вектора может конструирование экспрессирующего вектора со вставкой сильных промоторов, энхансеров и селективных маркеров. Экспрессию белка с вектора может увеличивать идентификация участков интеграции векторов, обеспечивающих высокие уровни транскрипции генов (Wurm et al. (2004) Nature Biotech. 22(11):1393-1398). Кроме того, на уровни продукции влияет отношение тяжелых и легких цепей антител и различные этапы в процессе сборки и секреции белка (Jiang et al. (2006) Biotechnol. Progr. 22(1):313-8).

B6. Иммуногенность

Введение терапевтического mAb может приводить к определенной частоте возникновения иммунного ответа (т.е., образования эндогенных антител к терапевтическому mAb). При отборе исходных моноклональных антител необходимо анализировать потенциальные элементы, которые могут индуцировать иммуногенность, и для снижения такого риска до конструирования DVD-Ig можно проводить этапы оптимизации исходных моноклональных антител. Выявлено, что получаемые у мыши антитела являются высокоиммуногенными у пациентов. Следующим логичным этапом снижения иммуногенности терапевтических антител является получение химерных антител, содержащих вариабельные области мыши и константные области человека (Morrison and Schlom (1990) Import. Adv. Oncol. 3-18). Альтернативно, иммуногенность можно снижать, посредством переноса последовательностей CDR мыши в каркас антитела человека (перестройка/прививка CDR/гуманизация), как описано для терапевтического антитела в Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327. Другой способ обозначают как "изменение поверхности" или "винирование", где, начиная с вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи грызуна, изменяют только доступные на поверхности аминокислоты каркаса, тогда как CDR и внутренние аминокислоты остаются из исходного антитела грызуна (Roguska et al. (1996) Protein Engineer. 9:895-904). При гуманизации другого типа вместо прививания целых CDR в одном из способов прививают только "определяющие специфичность области" (SDR), определяемые как подмножество остатков CDR, которые вовлечены в связывание антитела с его мишенью (Kashmiri et al. (2005) Methods 36(1):25-34). Это делает необходимым идентификацию SDR посредством анализа доступных трехмерных структур комплексов антитело-мишень или мутационного анализа остатков CDR антитела с определением того, какие из них взаимодействуют с мишенью. Альтернативно, сниженную по сравнению с антителами мыши, химерными или гуманизированными антителами иммуногенность могут иметь полностью человеческие антитела.

Другим подходом к снижению иммуногенности терапевтических антител является удаление определенных специфических последовательностей, для которых теоретически рассчитано, что они являются иммуногенными. В одном из подходов после тестирования биологического препарата первого поколения у людей и выявления того, что он является неприемлемо иммуногенным, можно картировать B-клеточные эпитопы, а затем изменять их во избежание определения иммунной системой. В другом подходе используют способ прогноза и удаления потенциальных T-клеточных эпитопов. Разработаны компьютерные способы сканирования и идентификации пептидных последовательностей биологических терапевтических средств с потенциалом к связыванию белками MHC (Desmet et al. (2005) Proteins 58:53-69). Альтернативно, для идентификации CD4⁺ T-клеточных эпитопов в потенциальных белковых аллергенах можно использовать способ на основе дендритных клеток человека (Stickler et al. (2000) J. Immunother. 23:654-60; Morrison and Schlom (1990) Important Adv. Oncol. 3-18; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Roguska et al. (1996) Protein Engineer. 9:895-904; Kashmiri et al. (2005) Methods (San Diego Calif.) 36(1):25-34; Desmet-Johan et al. 2005) Proteins 58:53-69; Stickler et al. (2000) J. Immunother. 23:654-60.)

B7. Эффективность in vivo

Для получения молекулы DVD-Ig с желаемой эффективностью in vivo важно получать и отбирать mAb со сходной желаемой эффективностью in vivo при введении в комбинации. Однако в некоторых случаях DVD-Ig может проявлять эффективность in vivo, которую невозможно достичь с комбинацией двух отдельных mAb. Например, DVD-Ig может приводить две мишени в непосредственную близость, что приводит к активности, которой нельзя достичь с комбинацией двух отдельных mAb. Дополнительные желаемые биологические функции описаны в настоящем документе в разделе B3. Исходные антитела с характеристиками, желательными в молекуле DVD-Ig, можно выбирать на основе таких признаков, как фармакокинетическое t½; распределение в тканях; растворимые мишени или мишени на клеточной поверхности и концентрация для растворимой/плотность для поверхностной мишени.

B8. Распределение в тканях in vivo

Для получения молекулы DVD-Ig с желаемым распределением в тканях in vivo в одном из вариантов осуществления необходимо отбирать исходные mAb со сходным желаемым профилем распределения в тканях in vivo. Альтернативно, основываясь на механизме направления к мишеням с двойной специфичностью, в других случаях определять исходные mAb со сходным желаемым распределением в тканях in vivo при введении в комбинации не требуется. Например, в случае DVD-Ig, когда один связывающий компонент направляет DVD-Ig к конкретному участку, таким образом, направляя второй связывающий компонент к тому же участку мишени. Например, мишенью одной специфичности связывания DVD-Ig может являться поджелудочная железа (островковые клетки), а другая специфичность может привлекать к поджелудочной железе GLP1 для индукции инсулина.

B9. Изотип

Для получения молекулы DVD-Ig с желаемыми свойствами, включая в качестве неограничивающих примеров изотип, эффекторные функции и время полужизни в кровотоке, в одном из вариантов осуществления исходные mAb выбирают с подходящими эффекторными функциями Fc, в зависимости от терапевтического применения и желаемого конечного терапевтического результата. Существуют пять основных классов тяжелых цепей или изотипов, в некоторых из которых существует несколько подклассов, и они определяют эффекторные функции молекул антител. Эти эффекторные функции определяются шарнирной областью, доменами CH2 и CH3 молекулы антитела. Однако на эффекторные функции также могут влиять остатки в других частях молекулы антитела. Эффекторные функции, обусловленные шарнирной областью Fc, включают: (i) антителозависимую клеточную цитотоксичность, (ii) связывание, активацию комплемента (C1q) и обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC), (iii) фагоцитоз/выведение комплексов антиген-антитело и (iv) в некоторых случаях высвобождение цитокинов. Эти эффекторные функции Fc молекулы антитела, опосредованы взаимодействием Fc-области с набором класс-специфических рецепторов клеточной поверхности. Антитела изотипа IgG1 являются наиболее активными, тогда как IgG2 и IgG4 обладают минимальными эффекторными функциями, или эффекторные функции у них отсутствуют. Эффекторные функции антител IgG опосредованы взаимодействиями трех структурно гомологичных типов (и подтипов) клеточных рецепторов Fc (FcgRI, FcgRII и FcgRIII). Эти эффекторные функции IgG1 можно устранять посредством мутации конкретных аминокислотных остатков в нижней шарнирной области (например, L234A, L235A), которые необходимы для связывания FcgR и C1q. Аминокислотные остатки в Fc-области, в частности в доменах CH2-CH3, также определяют время полужизни молекулы антитела в кровотоке. Эта функция Fc опосредована связыванием Fc-области с неонатальным рецептором Fc (FcRn), ответственным за рециркуляцию молекул антител из кислых липосом обратно в общий кровоток.

Должно ли mAb иметь активный или неактивный изотип зависит от желаемого для антитела конечного терапевтического результата. Ниже приведены некоторые примеры использования изотипов и желаемых терапевтических результатов:

a) если желаемым результатом является функциональная нейтрализация растворимого цитокина, тогда можно использовать неактивный изотип;

b) если желаемым результатом является выведение патологического белка, тогда можно использовать активный изотип;

c) если желаемым результатом является выведение агрегатов белка, тогда можно использовать активный изотип;

d) если желаемым результатом является антагонизм поверхностному рецептору, тогда используют неактивный изотип (тисабри, IgG4; OKT3, мутантный IgG1);

e) если желаемым результатом является устранение клеток-мишеней, тогда используют активный изотип (Герцептин, IgG1 и с повышенными эффекторными функциями); и

f) если желаемым результатом является выведение белков из кровотока без попадания в ЦНС, тогда можно использовать изотип IgM (например, выведение циркулирующих молекул пептида Ab).

Эффекторные функции Fc исходного mAb можно определять различными хорошо известными в данной области способами in vitro.

Как описано, выбор изотипа и, таким образом, эффекторной функции зависит от желаемого конечного терапевтического результата. В случаях, когда желательна простая нейтрализация циркулирующей мишени, например, в случае блокирования взаимодействий рецептор-лиганд, эффекторная функции может не требоваться. В таких случаях желаемы изотипы или мутации в Fc-области антитела, которые устраняют эффекторные функции. В других случаях, когда конечным терапевтическим результатом является удаление клеток-мишеней, например, удаление опухолевых клеток, желаемы изотипы или мутации или дефукозилирование в Fc-области, которые усиливают эффекторные функции (Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656; Satoh et al. (2006) Expert Opin. Biol. Ther. 6:1161-1173). Подобным образом, в зависимости от терапевтической пользы, можно увеличивать/продлевать время полужизни молекулы антитела в кровотоке, модулируя взаимодействия антитело-FcRn, внося в Fc-область конкретные мутации (Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514-23524; Petkova et al. (2006) Internal Immunol. 18:1759-1769; Vaccaro et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:18709-18714).

Информацию, опубликованную о различных остатках, влияющих на различные эффекторные функции нормальных терапевтических mAb, для DVD-Ig может являться необходимым подтверждать. Возможным может оказаться, что в формате DVD-Ig важными могут оказаться дополнительные (различные) остатки Fc-области, отличные от остатков, идентифицированных как модулирующих эффекторные функции моноклональных антител.

Суммарно, заключение о том, какие эффекторные функции Fc (изотип) критичны в конечном формате DVD-Ig, зависит от симптомов заболевания, терапевтической мишени, желаемого конечного терапевтического результата и соображений безопасности. Ниже перечислены подходящие иллюстративные константные области тяжелых цепей и легких цепей, включая в качестве неограничивающих примеров:

- IgG1 - аллотип: Glmz

- мутантное IgG1 - A234, A235

- IgG2 - аллотип: G2m(n-)

- Каппа - Km3

- Лямбда

Исследования рецептора Fc и C1q: Возможность нежелательных антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и обусловленной комплементом цитотоксичности (CDC) при образовании антителом комплекса с любой сверхэкспрессированной мишенью на клеточных мембранах можно устранить посредством мутаций в области шарнира (например, L234A, L235A). Ожидают, что эти заменяемые аминокислоты, находящиеся в шарнирной области IgG1 mAb, приведут к уменьшенному связыванию mAb с рецепторами Fc человека (но не с FcRn), так как полагают, что связывание FcgR происходит в пределах перекрывающихся участков в шарнирной области IgG1. Это свойство mAb может приводить к улучшенным показателям безопасности по сравнению с антителами, включающими IgG дикого типа. Связывание mAb с рецепторами Fc человека можно определять посредством экспериментов по проточной цитометрии с использованием клеточных линий (например, THP-1, K562) и сконструированной клеточной линии CHO, экспрессирующей FcgRIIb (или другие FcgR). По сравнению с контрольными моноклональными антителами IgG1, mAb демонстрирует сниженное связывание с FcgRI и FcgRIIa, тогда как связывание с FcgRIIb воздействию не подвергается. Связывание и активация C1q иммунными комплексами антиген/IgG запускает классический каскад реакций комплемента с последующим воспалительным и/или иммунорегуляторным ответом. Участок связывания C1q на IgG расположен в остатках в шарнирной области IgG. Связывание C1q c увеличивающимися концентрациями mAb оценивали посредством ELISA с C1q. Результаты демонстрируют, что, как и ожидалось, mAb неспособно связываться с C1q по сравнению со связыванием контрольного IgG1 дикого типа. Суммарно, мутация шарнирной области L234A, L235A устраняет связывание mAb с FcgRI, FcgRIIa и C1q, но не влияет на взаимодействие mAb с FcgRIIb. Эти данные позволяют предположить, что in vivo mAb c мутантной Fc нормально взаимодействует с ингибирующим FcgRIIb, но вероятно не способен взаимодействовать с активирующими рецепторами FcgRI и FcgRIIa или C1q.

Связывание FcRn человека: Неонатальный рецептор (FcRn) отвечает за транспорт IgG через плаценту и за контроль катаболического времени полужизни молекул IgG. Для улучшения эффективности, снижения дозы или частоты введения или для улучшения локализации по отношению к мишени желательным может являться увеличение конечного времени полужизни антитела. Альтернативно, предпочтительным может являться сделать наоборот, т.е. уменьшить конечное время полужизни антитела для снижения экспозиции для всего организма или для улучшения отношений связывания мишень-немишень. Модификация взаимодействия IgG и его рецептора спасения, FcRn, обеспечивает способ увеличения или уменьшения конечного времени полужизни IgG. Определенные клетки, такие как клетки эндотелия сосудов, посредством микропиноцитоза поглощают из жидкой фазы белки кровотока, включая IgG. IgG в слабокислых условиях (pH 6,0-6,5) могут связываться с FcRn в эндосомах и возвращаться на клеточную поверхность, где они высвобождаются почти в нейтральных условиях (pH 7,0-7,4). Картирование участка связывания Fc-области на FcRn80, 16, 17 продемонстрировало, что за зависимость этого взаимодействия от pH отвечают два остатка гистидина, которые являются консервативными у различных видов, His310 и His435. С применением технологии фагового дисплея идентифицирована мутация Fc-область мыши, которая увеличивает связывание с FcRn и продлевает время полужизни IgG мыши (см. Victor et al. (1997) Nature Biotechnol. 15(7):637-640). Также идентифицированы мутации Fc-области, которые увеличивают аффинность связывания IgG человека с FcRn при pH 6,0, но не при pH 7,4 (см. Dall'Acqua et al. (2002) J. Immunol. 169(9):5171-80). Кроме того, в одном случае сходное pH-зависимое увеличение связывания (до 27 раз) также наблюдали для FcRn макак-резус, и это приводило к двукратному увеличению времени полужизни в сыворотке у макак-резус по сравнению с исходным IgG (см. Hinton et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216). Эти изыскания свидетельствуют, что можно продлевать время полужизни терапевтического антитела в плазме, модифицируя взаимодействие Fc-области с FcRn. В противоположность этому, мутации Fc-области, ослабляющие взаимодействие с FcRn, могут сокращать время полужизни антитела.

B10. Фармакокинетика (PK)

Для получения молекулы DVD-Ig с желаемым фармакокинетическим профилем в одном из вариантов осуществления выбирают исходные mAb со сходным желаемым фармакокинетическим профилем. Одним из рассматриваемых факторов является то, что иммунный ответ на моноклональные антитела (т.е., HAHA, ответ антителами человека к антителам человека; HACA, ответ антителами человека к химерным антителам) дополнительно осложняет фармакокинетику этих терапевтических средств. В одном из вариантов осуществления для конструирования молекул DVD-Ig используют моноклональные антитела с минимальной или отсутствующей иммуногенностью так, что получаемые DVD-Ig также обладают минимальной иммуногенностью или не иммуногенны. Некоторые из факторов, определяющие PK mAb, в качестве неограничивающих примеров включают собственные свойства mAb (аминокислотная последовательность VH); иммуногенность; связывание FcRn и функции Fc.

PK профиль выбранных исходных моноклональных антител можно легко определять у грызунов, так как PK профиль у грызунов хорошо коррелирует (или точно прогнозирует) с PK профилем моноклональных антител у яванских макак и людей. PK профиль определяют, как описано в разделе примеров 1.2.2.3.A.

После выбора исходных моноклональных антител с желаемыми PK характеристиками (и другими желаемыми функциональными свойствами, как описано в настоящем документе) конструируют DVD-Ig. Так как молекулы DVD-Ig содержат два антигенсвязывающих домена из двух исходных моноклональных антитела, также оценивают PK свойства DVD-Ig. Таким образом, при определении PK свойств DVD-Ig, можно использовать PK анализы, определяющие PK профиль на основе функциональности обоих антигенсвязывающих доменов, получаемых из 2 исходных моноклональных антител. PK профиль DVD-Ig можно определять, как описано в примере 1.2.2.3.A. Дополнительные факторы, которые могут влиять на PK профиль DVD-Ig, включают ориентацию антигенсвязывающего домена (CDR); размер линкера и взаимодействия Fc/FcRn. PK характеристики исходных антител можно оценивать, анализируя следующие параметры: всасывание, распределение, метаболизм и выведение.

Всасывание: До настоящего времени введение терапевтических моноклональных антител проводят парентеральными способами (например, внутривенным [в/в], подкожным [п/к] или внутримышечным [в/м]). Всасывание mAb в системный кровоток после п/к или в/м введения из межклеточного пространства происходит преимущественно по лимфатическому руслу. Насыщаемое, пресистемное, протеолитическое разрушение может приводить к различной абсолютной биодоступности после внесосудистого введения. Как правило, при увеличении доз моноклональных антител можно наблюдать увеличение абсолютной биодоступности вследствие насыщенной протеолитической емкости при высоких дозах. Процесс всасывания mAb, как правило, является достаточно медленным, так как лимфатическая жидкость течет в сосудистую систему медленно, и длительность всасывания может составлять от нескольких часов до нескольких суток. Как правило, абсолютная биодоступность моноклональных антител после п/к введения находится в диапазоне от 50% до 100%. В случае опосредующей транспорт структуры на гематоэнцефалическом барьере, к которой направлена конструкция DVD-Ig, время циркуляции в плазме может снижаться вследствие увеличенного трансклеточного транспорта через гематоэнцефалический барьер (BBB) в отдел ЦНС, где DVD-Ig высвобождается с обеспечением взаимодействия посредством его второго участка распознавания антигена.

Распределение: После в/в введения моноклональные антитела, как правило, соответствуют двухфазному профилю концентрации-времени в сыворотке (или плазме), начинающемуся с быстрой фазы распределения с последующей медленной фазой выведения. Как правило, лучше всего этот вид фармакокинетического профиля описывает биэкспоненциальная фармакокинетическая модель. Объем распределения в центральном компартменте (Vc) для mAb, как правило, равен или незначительно превышает объем плазмы (2-3 литра). Четкий двухфазный характер профиля концентрации в сыворотке (плазме) в зависимости от времени может не наблюдаться при других парентеральных маршрутах введения, таких как в/м или п/к, так как фаза распределения кривой концентрация-время в сыворотке (плазме) маскируется длительной фазой всасывания. На биораспределение mAb может оказывать влияние множество факторов, включая физико-химические свойства, сайт-специфический и ориентированный на мишень опосредуемый рецепторами захват, связывающая способность ткани и доза mAb. Некоторые из этих факторов могут вносить вклад в нелинейность биораспределения mAb.

Метаболизм и выведение: Вследствие размера молекул интактные моноклональные антитела не выводятся почками в мочу. Они преимущественно инактивируются посредством метаболизма (например, катаболизма). Как правило, для терапевтических моноклональных антител на основе IgG время полужизни находится в диапазоне от нескольких часов или 1-2 суток до более 20 суток. На выведение mAb может влиять множество факторов, включая в качестве неограничивающих примеров аффинность к рецептору FcRn, иммуногенность mAb, степень гликозилирования mAb, чувствительность mAb к протеолизу и опосредуемое рецептором выведение.

B11. Профиль тканевой перекрестной реактивности у человека и токсикологических видов:

Идентичный профиль окрашивания позволяет предположить, что потенциальную токсичность у человека можно оценивать у токсикологических видов. Токсикологическими видами являются животные, у которых изучают неспецифическую токсичность.

Конкретные антитела выбирают так, чтобы они удовлетворяли двум критериям. (1) Окрашивание тканей соответствуют известной экспрессии мишени антитела и (2) сходный профиль окрашивания тканей одного и того же органа у человека и токсикологических видов.

Критерий 1: Как правило, при иммунизациях и/или отборах антител используют рекомбинантные или синтезированные антигены (белки, углеводы или другие молекулы). Связывание с природными партнерами и обратный скрининг относительно неродственных антигенов часто является частью горловины скрининга для терапевтических антител. Однако скрининг в отношении множества антигенов часто является нецелесообразным. Таким образом, исследования тканевой перекрестной реактивности с тканями человека из большинства органов служит для исключения нежелаемого связывания антитела с любыми неродственными антигенами.

Критерий 2: Сравнительные исследования тканевой перекрестной реактивности с тканями человека и токсикологических видов (яванский макак, собака, возможно грызуны и другие, тестируют те же 36 или 37 тканей как и при исследованиях у человека) помогают подтвердить выбор токсикологических видов. В стандартных исследованиях тканевой перекрестной реактивности на замороженных тканевых срезах терапевтические антитела могут демонстрировать ожидаемое связывание с известным антигеном и/или в меньшей степени связывание с тканями на основе любых низкоуровневых взаимодействий (неспецифическое связывание, низкоуровневое связывание со сходными антигенами, низкоуровневые взаимодействия на основе заряда и т.д.). В любом случае наиболее подходящим токсикологическим видом животного является вид с наибольшей степенью совпадения связывания в тканях человека и животного.

Исследования тканевой перекрестной реактивности следуют соответствующим нормативным рекомендациям, включающим EC CPMP Guideline III/5271/94 "Production and quality control of mAbs" и 1997 US FDA/CBER "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use". Срезы (5 мкм) замороженных образцов тканей человека, полученных при аутопсии или биопсии, фиксировали и высушивали на предметном стекле. Проводили окрашивание тканевых срезов пероксидазой с использованием системы авидин-биотин. Руководство «FDA Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use».

Исследования тканевой перекрестной реактивности часто проводят в два этапа, где первый этап включает получение срезов замороженных образцов 32 тканей (как правило: надпочечник, желудочно-кишечный тракт, предстательная железа, мочевой пузырь, сердце, скелетная мышца, клетки крови, почка, кожа, костный мозг, печень, спинной мозг, молочная железа, легкое, селезенка, мозжечок, лимфоузел, семенники, кора головного мозга, яичник, тимус, кишечник, поджелудочная железа, щитовидная железа, эндотелий, паращитовидная железа, мочеточник, глаз, гипофиз, матка, фаллопиева труба и плацента) одного человека-донора. На втором этапе проводят полное исследование перекрестной реактивности с 38 тканями (включая надпочечник, кровь, кровеносный сосуд, костный мозг, мозжечок, головной мозг, шейку матки, пищевод, глаз, сердце, почка, толстую кишку, печень, легкое, лимфоузел, молочную железу, яичник, маточную трубу, поджелудочную железу, паращитовидную железу, периферический нерв, гипофиз, плаценту, предстательную железу, слюнную железу, кожу, тонкий кишечник, спинной мозг, селезенку, желудок, поперечнополосатую мышцу, семенник, тимус, щитовидную железу, миндалину, мочеточник, мочевой пузырь и матку) 3 неродственных взрослых доноров. Как правило, исследования проводят минимум при двух уровнях дозирования.

Терапевтическое антитело (т.е. тестируемый препарат) и совпадающее по изотипу контрольное антитело можно биотинилировать для детекции комплексом авидин-биотин (ABC); другие способы детекции могут включать детекцию третичным антителом меченного FITC (или иным образом) тестируемого препарата или предварительное образование комплекса немеченого тестируемого препарата с меченым антителом к IgG человека.

В кратком изложении, срезы замороженных образцов (приблизительно 5 мкм) тканей человека, получаемых при аутопсии или биопсии, фиксируют и высушивают на предметном стекле. Проводят окрашивание тканевых срезов пероксидазой с использованием системы авидин-биотин. Сначала (в случае системы детекции с предварительным образованием комплекса) тестируемый препарат инкубируют со вторичным биотинилированным антителом к IgG человека и получают иммунные комплексы. Иммунные комплексы при конечной концентрации тестируемого препарата 2 и 10 мкг/мл добавляют на тканевые срезы на предметном стекле, а затем в течение 30 минут проводят реакцию тканевых срезов с набором авидин-биотин-пероксидаза. Затем для окрашивания тканей на 4 минуты добавляют субстрат для пероксидазной реакции DAB (3,3'-диаминобензидин). В качестве положительного контроля тканевых срезов используют гранулы с антигеном-сефарозой.

Любое специфическое окрашивание оценивают как ожидаемую (например, согласующееся с экспрессией антигена) или неожиданную реакционноспособность в зависимости от известной экспрессии рассматриваемого антигена-мишени. Любое окрашивание, оцененное как специфическое, ранжируют по интенсивности и частоте. В определении того, является ли наблюдаемое окрашивание специфическим или неспецифическим, могут дополнительно помочь исследования конкуренции или блокирования антигенов или сыворотки.

Если выявлено, что два выбранных антитела удовлетворяют критериям отбора - соответствующему окрашиванию тканей, совпадающему окрашиванию специфических тканей человека и токсикологического животного - их можно выбирать для получения DVD-Ig.

Исследование тканевой перекрестной реактивности необходимо повторять с конечной конструкцией DVD-Ig, но хотя эти исследования проводят по тому же протоколу, описанному в настоящем документе, они являются более сложными для оценки, так как любое связывание может происходить из-за любого из двух исходных антител, и любое необъяснимое связывание необходимо подтверждать сложными исследованиями конкуренции антигенов.

Легко понять, что эта сложная последовательность исследований тканевой перекрестной реактивности полиспецифической молекулы, подобной DVD-Ig, значительно упрощается, если два исходных антитела выбраны по (1) отсутствию выявленной неожиданной тканевой перекрестной реактивности и (2) подходящему сходству выявленной тканевой перекрестной реактивности в соответствующих тканях человека и токсикологического животного.

B12. Специфичность и Селективность:

Для получения молекулы DVD-Ig с желаемой специфичностью и селективностью необходимо получать и выбирать исходные mAb со сходным желаемым профилем специфичности и селективности.

Исследования связывания на специфичность и селективность с DVD-Ig могут быть сложными вследствие наличия четырех или более участков связывания, по два на каждый антиген. В кратком изложении, в исследованиях связывания с использованием ELISA, BIAcore, KinExA или другие исследования взаимодействия с DVD-Ig необходимо контролировать связывание с молекулой DVD-Ig одного, двух или более антигенов. В то время как технология BIAcore может различать последовательное независимое связывание нескольких антигенов, более традиционные способы, включая ELISA или более современные способы, подобные KinExA, не могут. Таким образом, тщательная характеристика каждого исходного антитела является критичной. После того, как каждое отдельное антитело охарактеризовано на специфичность, подтверждение сохранения специфичности отдельных участков связывания молекулы DVD-Ig значительно упрощается.

Легко понять, что эта сложная последовательность определения специфичности DVD-Ig значительно упрощается, если два исходных антитела выбраны по специфичности до комбинации в DVD-Ig.

Исследования взаимодействия антиген-антитело могут принимать множество форм, включая множество классических исследований белок-белковых взаимодействий, включая ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), масс-спектрометрию, химическое сшивание, SEC со светорассеянием, равновесный диализ, гель-фильтрацию, ультрафильтрацию, хроматографию в геле, крупнозонную аналитическую SEC, микропрепаративное ультрацентрифугирование (седиментационное равновесие), спектроскопические способы, титрационную микрокалориметрию, седиментационное равновесие (в аналитической ультрацентрифуге), скорость седиментации (в аналитической центрифуге), поверхностный плазмонный резонанс (включая BIAcore). Соответствующие ссылки включают "Current Protocols in Protein Science", Coligan et al. (eds.) Volume 3, chapters 19 and 20, published by John Wiley & Sons Inc. и содержащиеся в ней ссылки, и "Current Protocols in Immunology", Coligan et al. (eds.) published by John Wiley & Sons Inc и соответствующие ссылки, включенные в нее.

Высвобождение цитокинов в цельную кровь: взаимодействие mAb с клетками крови человека можно исследовать посредством анализа высвобождения цитокинов (Wing (1995) Therapeut. Immunol. 2(4):183-190; "Current Protocols in Pharmacology", et al. (eds.) published by John Wiley & Sons Inc; Madhusudan (2004) Clin. Cane. Res. 10(19):6528-6534; Cox (2006) J. Methods 38(4):274-282; Choi (2001) Eur. J. Immunol. 31(1):94-106). В кратком изложении, различные концентрации mAb инкубируют с цельной кровью человека в течение 24 часов. Тестируемые концентрации должны охватывать широкий диапазон, включая конечные концентрации, соответствующие типичным уровням в крови у пациентов (включая в качестве неограничивающих примеров 100 нг/мл-100 мкг/мл). После инкубации супернатанты и клеточные лизаты анализировали на наличие IL-1Rα, TNFα, IL-1β, IL-6 и IL-8. Профили концентрации цитокинов, полученные для mAb, сравнивали с профилями, получаемыми с отрицательным контролем IgG человека и положительным контролем LPS или PHA. Профиль цитокинов из клеточных супернатантов и клеточных лизатов, демонстрируемый при использовании mAb, был сравним с контрольным IgG человека. В одном из вариантов осуществления моноклональное антитело не взаимодействует с клетками крови человека со спонтанным высвобождением воспалительных цитокинов.

Исследования высвобождения цитокинов в отношении DVD-Ig являются сложными вследствие наличия четырех или более участков связывания, по два на каждый антиген. В кратком изложении, в исследованиях высвобождения цитокинов, как описано в настоящем документе, определяют воздействие всей молекулы DVD-Ig на цельную кровь или другие системы клеток, но можно определить, какая часть молекулы вызывает высвобождение цитокинов. После детекции высвобождения цитокинов необходимо определить чистоту препарата DVD-Ig, так как некоторые совместно очищающиеся клеточные компоненты сами могут вызывать высвобождение цитокинов. Если проблемой является не чистота, для деконволюции любых наблюдений может являться необходимым использовать фрагментацию DVD-Ig (включая в качестве неограничивающих примеров удаление Fc-части, разделение участков связывания и т.д.), мутагенез участков связывания или другие способы. Легко понять, что эта сложная последовательность действий значительно упрощается, если два исходных антитела выбраны по отсутствию высвобождения цитокинов до комбинирования в DVD-Ig.

B13. Перекрестная реактивность с другими видами в токсикологических исследованиях:

В одном из вариантов осуществления отдельные выбранные антитела обладают достаточной перекрестной реактивностью у соответствующих токсикологических видов, например, яванского макака. Необходимо, чтобы исходные антитела связывались с мишенью у ортологичного вида (т.е. у яванского макака) и вызывали соответствующий ответ (модуляцию, нейтрализацию, активацию). В одном из вариантов осуществления перекрестная реактивность (аффинность/активность) с мишенью у ортологичного вида должна находиться в пределах величины, в 10 раз большей, чем у мишени у человека. На практике исходные антитела оценивают для нескольких видов, включая мышь, крысу, собаку, мартышку (и других, не являющихся человеком приматов), а также модельные для заболевания виды (т.е., овцу для модели астмы). Приемлемая перекрестная реактивность для токсикологических видов у исходных моноклональных антител позволяет проводить дальнейшие токсикологические исследования DVD-Ig-Ig у этих видов. По этой причине два исходных моноклональных антитела должны обладать приемлемой перекрестной реактивностью у стандартных токсикологических видов, таким образом, позволяя проводить токсикологические исследования DVD-Ig у этих видов.

Исходные mAb можно выбирать из различных mAb, связывающих конкретные мишени и хорошо известных в данной области. В качестве неограничивающих примеров они включают антитело к TNF (патент США № 6258562), антитело к IL-12 и/или антитело к IL-12p40 (патент США № 6914128); антитело к IL-18 (патентная заявка США № 20050147610), антитело к C5, антитело к CBL, антитело к CD147, антитело к gp120, антитело к VLA-4, антитело к CD11a, антитело к CD18, антитело к VEGF, антитело к CD40L, антитело к CD-40 (например, см. публикацию PCT № WO2007124299), антитело к Id, антитело к ICAM-1, антитело к CXCL13, антитело к CD2, антитело к EGFR, антитело к TGF-бета2, антитело к HGF, антитело к cMet, антитело к DLL-4, антитело к NPR1, антитело к PLGF, антитело к ErbB3, антитело к E-селектину, антитело к Fact VII, антитело к Her2/neu, антитело к gp F, антитело к CD11/18, антитело к CD14, антитело к ICAM-3, антитело к RON, антитело к CD-19, антитело к CD80 (например, см. публикацию PCT № WO2003039486), антитело к CD4, антитело к CD3, антитело к CD23, антитело к интегрину бета2, антитело к альфа 4 бета 7, антитело к CD52, антитело к DR HLA, антитело к CD22 (например, см. патент США № 5789554), антитело к CD20, антитело к MIF, антитело к CD64 (FcR), антитело к TCR альфа и бета, антитело к CD2, антитело к Hep B, антитело к CA 125, антитело к EpCAM, антитело к gp120, антитело к CMV, антитело к gpIIbIIa, антитело к IgE, антитело к CD25, антитело к CD33, антитело к HLA, антитело к IGF1,2, антитело к IGFR, антитело к VNR интегрину, антитело к IL-1 альфа, антитело к IL-1 бета, антитело к рецептору IL-1, антитело к рецептору IL-2, антитело к IL-4, антитело к рецептору IL-4, антитело к IL5, антитело к рецептору IL-5, антитело к IL-6, антитело к IL-6R, RANKL, NGF, DKK, альфа V бета3, IL-17A, антитело к IL-8, антитело к IL-9, антитело к IL-13, антитело к рецептору IL-13, антитело к IL-17 и антитело к IL-23; IL-23p19; (см. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731-6 и http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/antibodies.html).

Исходные mAb также можно выбирать из различных терапевтических антител, одобренных для применения в клинических испытаниях или находящихся в разработке для клинического применения. Такие терапевтические антитела в качестве неограничивающих примеров включают ритуксимаб (ритуксан®, IDEC/Genentech/Roche) (см. например, патент США № 5736137), химерное антитело к CD20, одобренное для лечения неходжкинской лимфомы; HuMax-CD20, антитело к CD20, в настоящее время разрабатываемое Genmab, антитело к CD20, описанное в патенте США № 5500362, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel) и PR070769 (заявка PCT № PCT/US2003/040426), трастузумаб (герцептин®, Genentech) (см. например, патент США № 5677171), гуманизированное антитело к Her2/neu, одобренное для лечения рака молочной железы; пертузумаб (rhuMab-2C4, омнитарг®), в настоящее время разрабатываемое Genentech; антитело к Her2, описанное в патенте США № 4753894; цетуксимаб (эрбитукс®, Imclone) (патент США № 4943533; публикация PCT № WO 96/40210), химерное антитело к EGFR, используемое в клинических испытаниях для множества злокачественных опухолей; ABX-EGF (патент США № 6235883), в настоящее время разрабатываемое Abgenix-Immunex-Amgen; HuMax-EGFr (патент США № 7247301), в настоящее время разрабатываемое Genmab; 425, EMD55900, EMD62000 и EMD72000 (Merck KGaA) (патент США № 5558864; Murthy et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al. (1987) J. Cell. Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al. (1991) Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (публикация PCT № WO 95/20045; Modjtahedi et al. (1993) J. Cell Biophys. 22(l-3):129-46; Modjtahedi et al. (1993) Br. J. Cancer 67(2):247-53; Modjtahedi et al. (1996) Br. J. Cancer 73(2):228-35; Modjtahedi et al. (2003) Int. J. Cancer 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (патент США № 5891996; патент США № 6506883; Mateo et al. (1997) Immunotechnol. 3(1):71-81); mAb-806 (Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (публикация PCT № WO 0162931) и SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138); алемтузумаб (кэмпас®, Millenium), гуманизированное mAb, в настоящее время одобренное для лечения B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза; муромонаб-CD3 (Orthoclone OKT3®), антитело к CD3, разработанное Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ибритумомаб тиуксетан (зевалин®), антитело к CD20, разработанное IDEC/Schering AG, гемтузумаб озогамицин (милотарг®), антитело к CD33 (белку p67), разработанное Celltech/Wyeth, алефацепт (Amevive®), слияние антитела к LFA-3 с Fc, разработанное Biogen), абциксимаб (реопро®), разработанный Centocor/Lilly, базиликсимаб (симулект®), разработанный Novartis, паливизумаб (синагис®), разработанный Medimmune, инфликсимаб (ремикейд®), антитело к TNF-альфа, разработанное Centocor, адалимумаб (гумира®), антитело к TNF-альфа, разработанное Abbott, хумикейд®, антитело к TNF-альфа, разработанное Celltech, голимумаб (CNTO-148), полностью человеческое антитело к TNF, разработанное Centocor, этанерцепт (энбрел®), слияние рецептора TNF p75 с Fc, разработанное Immunex/Amgen, ленерцепт, слияние рецептора TNF p55 с Fc, ранее разработанное Roche, ABX-CBL, антитело к CD147, разрабатываемое Abgenix, ABX-IL8, антитело к IL8, разрабатываемое Abgenix, ABX-MA1, антитело к MUC18, разрабатываемое Abgenix, пемтумомаб (R1549, 90Y-muHMFGl), антитело к MUC1, разрабатываемое Antisoma, терекс (R1550), антитело к MUC1, разрабатываемое Antisoma, AngioMab (AS 1405), разрабатываемое Antisoma, HuBC-1, разрабатываемый Antisoma, тиоплатин (AS 1407), разрабатываемый Antisoma, антегрен® (натализумаб), антитело к альфа-4-бета-1 (VLA-4) и альфа-4-бета-7, разрабатываемое Biogen, mAb к VLA-1, антитело к интегрину VLA-1, разрабатываемое Biogen, mAb к LTBR, антитело к рецептору лимфотоксина бета (LTBR), разрабатываемое Biogen, CAT-152, антитело к TGFβ2, разрабатываемое Cambridge Antibody Technology, ABT 874 (J695), антитело к p40 IL-12, разрабатываемое Abbott, CAT-192, антитело к TGFβ1, разрабатываемое Cambridge Antibody Technology и Genzyme, CAT-213, антитело к эотаксину 1, разрабатываемое Cambridge Antibody Technology, лимфостат-B®, антитело к Blys, разрабатываемое Cambridge Antibody Technology и Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1mAb, антитело к TRAIL-R, разрабатываемое Cambridge Antibody Technology и Human Genome Sciences, Inc., авастин® бевацизумаб, rhuMAb-VEGF), антитело к VEGF, разрабатываемое Genentech, антитело к семейству рецепторов HER, разрабатываемое Genentech, антитело к тканевому фактору (ATF), антитело к тканевому фактору, разрабатываемое Genentech, ксолар® (омализумаб), антитело к IgE, разрабатываемое Genentech, раптива® (эфализумаб), антитело к CD11a, разрабатываемое Genentech и Xoma, антитело к MLN-02 (ранее LDP-02), разрабатываемое Genentech и Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, антитело к CD4, разрабатываемое Genmab, HuMax-IL15, антитело к IL15, разрабатываемое Genmab и Amgen, HuMax-воспаление, разрабатываемый Genmab и Medarex, HuMax-злокачественная опухоль, антитело к гепараназе I, разрабатываемое Genmab, и Medarex, и Oxford GcoSciences, HuMax-лимфома, разрабатываемый Genmab и Amgen, HuMax-TAC, разрабатываемый Genmab, IDEC-131 и антитело к CD40L, разрабатываемое IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (кленоликсимаб), антитело к CD4, разрабатываемое IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, антитело к CD80, разрабатываемое IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, антитело к CD23, разрабатываемое IDEC Pharmaceuticals, антитела к фактору миграции макрофагов (MIF), разрабатываемые IDEC Pharmaceuticals, BEC2, антиидиотипическое антитело, разрабатываемое Imclone, IMC-1C11, антитело к KDR, разрабатываемое Imclone, DC101, антитело к flk-1, разрабатываемое Imclone, антитела к VE-кадгерину, разрабатываемые Imclone, CEA-Cide® (лабетузумаб), антитело к раковому эмбриональному антигену (CEA), разрабатываемое Immunomedics, лимфоцид® (эпратузумаб), антитело к CD22, разрабатываемое Immunomedics, AFP-Cide, разрабатываемый Immunomedics, MyelomaCide, разрабатываемый Immunomedics, LkoCide, разрабатываемый Immunomedics, ProstaCide, разрабатываемый Immunomedics, MDX-010, антитело к CTLA4, разрабатываемое Medarex, MDX-060, антитело к CD30, разрабатываемое Medarex, MDX-070, разрабатываемое Medarex, MDX-018, разрабатываемое Medarex, озидем® (IDM-1), и антитело к Her2, разрабатываемое Medarex и Immuno-Designed Molecules, HuMax®-CD4, антитело к CD4, разрабатываемое Medarex и Genmab, HuMax-IL15, антитело к IL15, разрабатываемое Medarex и Genmab, CNTO 148, антитело к TNFα, разрабатываемое Medarex и Centocor/J&J, CNTO 1275, антитело к цитокинам, разрабатываемое Centocor/J&J, MOR10l и MOR102, антитела к молекуле межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) (CD54), разрабатываемые MorphoSys, MOR201, антитело к рецептору фактора роста фибробластов 3 (FGFR-3), разрабатываемое MorphoSys, Nuvion® (визилизумаб), антитело к CD3, разрабатываемое Protein Design Labs, HuZAF®, антитело к интерферону гамма, разрабатываемое Protein Design Labs, антитело к интегрину α5β1, разрабатываемое Protein Design Labs, антитело к IL-12, разрабатываемое Protein Design Labs, ING-1, антитело к Ep-CAM, разрабатываемое Xoma, ксолар® (омализумаб), гуманизированное антитело к IgE, разработанное Genentech и Novartis, и MLN01, антитело к интегрину бета2, разрабатываемое Xoma. В другом варианте осуществления терапевтические средства включают KRN330 (кирин); антитело к huA33 (A33, Ludwig Institute for Cancer Research); CNTO 95 (интегрины альфа V, Centocor); MEDI-522 (интегрин альфа Vβ3, Medimmune); волоциксимаб (интегрин альфа Vβ1, Biogen/PDL); mAb человека 216 (B-клеточный гликированный эпитоп, NCI); BiTE MT103 (биспецифическое антитело к CD19×CD3, Medimmune); 4G7×H22 (биспецифическое антитело к Bce11×FcgammaR1, Medarex/Merck KGa); rM28 (биспецифическое антитело к CD28×MAPG, патент Европы № EP1444268); MDX447 (EMD 82633) (биспецифическое антитело к CD64×EGFR, Medarex); катумаксомаб (ремоваб) (биспецифическое антитело к EpCAM×антителу к CD3, Trion/Fres); эртумаксомаб (биспецифическое антитело к HER2/CD3, Fresenius Biotech); ореговомаб (OvaRex) (CA-125, ViRexx); ренкарекс® (WX G250) (карбоангидраза IX, Wilex); CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (CD105 (эндоглин), Tracon); BMS-663513 (агонист CD137, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19, Medarex); сиплизумаб (MEDI-507) (CD2, Medimmune); офатумумаб (Humax-CD20) (CD20, Genmab); ритуксимаб (ритуксан) (CD20, Genentech); велтузумаб (hA20) (CD20, Immunomedics); эпратузумаб (CD22, Amgen); люмиликсимаб (IDEC 152) (CD23, Biogen); муромонаб-CD3 (CD3, Ortho); HuM291 (рецептор fc CD3, PDL Biopharma); HeFi-1, CD30, NCI); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30, Medarex); SGN-30 (CD30, Seattle Genentics); SGN-33 (Lintuzumab) (CD33, Seattle Genentics); занолимумаб (HuMax-CD4) (CD4, Genmab); HCD122 (CD40, Novartis); SGN-40 (CD40, Seattle Genentics); Campath1h (алемтузумаб) (CD52, Genzyme); MDX-1411 (CD70, Medarex); hLL1 (EPB-1) (CD74,38, Immunomedics); галиксимаб (IDEC-144) (CD80, Biogen); MT293 (TRC093/D93) (расщепленный коллаген, Tracon); HuLuc63 (CS1, PDL Pharma); ипилимумаб (MDX-010) (CTLA4, Brystol Myers Squibb); тремелимумаб (тицилимумаб, CP-675,2) (CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1 (Mapatumumab) (DR4 TRAIL-R (агонист, Human Genome Science/Glaxo Smith Kline); AMG-655 (DR5, Amgen); апомаб (DR5, Genentech); CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo); HGS-ETR2 (лексатумумаб) (агонист DR5 TRAIL-R2, HGS); цетуксимаб (эрбитукс) (EGFR, Imclone); IMC-11F8, (EGFR, Imclone); нимотузумаб (EGFR, YM Bio); панитумумаб (вектабикс) (EGFR, Amgen); залутумумаб (HuMaxEGFr) (EGFR, Genmab); CDX-110 (EGFRvIII, AVANT Immunotherapeutics); адекатумумаб (MT201) (Epcam, Merck); эдреколомаб (Panorex, 17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 (фолатный рецептор a, Morphotech); KW-2871 (ганглиозид GD3, Kyowa); M0RAb-009 (GP-9, Morphotech); CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb, Celldex); трастузумаб (герцептин) (HER2, Celldex); пертузумаб (rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), Genentech); аполизумаб (бета цепь HLA-DR, PDL Pharma); AMG-479 (IGF-1R, Amgen); антитело к IGF-1R R1507 (IGF1-R, Roche); CP 751871 (IGF1-R, Pfizer); IMC-A12 (IGF1-R, Imclone); BIIB022 (IGF-1R, Biogen); Mik-бета-1 (IL-2Rb (CD 122), Hoffman LaRoche); CNTO 328 (IL6, Centocor); антитело к KIR (1-7F9) (Ig-подобный рецептор киллерной клетки (KIR), Novo); Hu3S193 (Lewis (y), Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research); hCBE-11 (LTBR, Biogen); HuHMFGl (MUC1, Antisoma/NCI); RAV12 (эпитоп N-связанных углеводов, Raven); CAL (связанный с паратиреоидным гормоном белок (PTH-rP), University of California); CT-011 (PD1, CureTech); MDX-1106 (ono-4538) (PD1, Medarex/Ono); MAb CT-011 (PD1, Curetech); IMC-3G3 (PDGFRa, Imclone); бавитуксимаб (фосфатидилсерин, Peregrine); huJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); muJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); GC1008 (ингибитор TGFb (всех) (IgG4), Genzyme); инфликсимаб (ремикейд) (TNFα, Centocor); A27,15 (рецептор трансферрина, Salk Institute, INSERN WO 2005/111082); E2,3 (рецептор трансферрина, Salk Institute); бевацизумаб (авастин) (VEGF, Genentech); HuMV833 (VEGF, Tsukuba Research Lab) публикация PCT № WO/2000/034337, University of Texas); IMC-18F1 (VEGFR 1, Imclone); IMC-1121 (VEGFR2, Imclone).

B. Конструирование молекул с DVD:

Молекулу иммуноглобулина с двойными вариабельными доменами (DVD-Ig) конструируют так, чтобы два различных вариабельных домена легких цепей (VL) из двух различных исходных моноклональных антител посредством технологий рекомбинантных ДНК были связаны непосредственно один за другим или посредством короткого линкера с последующим константным доменом легкой цепи и, необязательно, Fc-областью. Подобным образом, тяжелая цепь содержит два различных вариабельных домена тяжелых цепей (VH), связанные один за другим, с последующим константным доменом CH1 и Fc-областью (фигура 1A).

Вариабельные домены можно получать из исходного антитела, получаемого любым из способов, описываемых в настоящем документе, с применением технологий рекомбинантных ДНК. В одном из вариантов осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи мыши. В другом варианте осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи с привитыми CDR или гуманизированный вариабельный домен тяжелой или легкой цепи. В одном из вариантов осуществления вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой или легкой цепи человека.

В одном из вариантов осуществления первый и второй вариабельные домены связаны непосредственно друг с другом с применением технологий рекомбинантных ДНК. В другом варианте осуществления вариабельные домены связаны посредством линкерной последовательности. В одном из вариантов осуществления два вариабельных домена связаны. Также можно непосредственно или посредством линкерной последовательности связывать три или более вариабельных доменов. Вариабельные домены могут связывать один и тот же антиген или могут связывать различные антигены. Молекулы DVD по изобретению могут содержать один иммуноглобулиновый вариабельный домен и один неиммуноглобулиновый вариабельный домен, такой как связывающий лиганд домен рецептора, активный домен фермента. Молекулы с DVD также могут содержать 2 или более не принадлежащих Ig доменов.

Линкерная последовательность может представлять собой одну аминокислоту или полипептидную последовательность. В одном из вариантов осуществления линкерные последовательности выбраны из группы, состоящей из AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26), TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 27) и ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 28). Выбор линкерной последовательности основан на анализе кристаллической структуры нескольких молекул Fab. В молекулярной структуре Fab или антитела существует природная подвижная связывающая последовательность между вариабельным доменом и константным доменом CH1/CL. Эта природная связывающая последовательность содержит приблизительно 10-12 аминокислотных остатков, состоящих из 4-6 остатков с C-конца V-домена и 4-6 остатков с N-конца домена CL/CH1. DVD-Ig по изобретению получали с использованием в качестве линкера 5-6 N-концевых аминокислотных остатков или 11-12 аминокислотных остатков CL или CH1 легкой цепи и тяжелой цепи DVD-Ig, соответственно. N-концевые остатки доменов CL или CH1, в частности первые 5-6 аминокислотных остатков, принимают конформацию петли без значительных вторичных структур, таким образом, они могут действовать в качестве гибких линкеров между двумя вариабельными доменами. N-концевые остатки доменов CL или CH1 являются природным продолжением вариабельных доменов, фактически частью последовательностей Ig, таким образом, минимизируя большую долю какой-либо иммуногенности, потенциально обуславливаемой линкерами и участками соединения.

Другие линкерные последовательности могут содержать любую последовательность доменов CL/CH1 любой длины, но не все остатки доменов CL/CH1; например, первые 5-12 аминокислотных остатков доменов CL/CH1; линкеры легкой цепи можно получать из Ck или Cλ; а линкеры тяжелой цепи можно получать из CH1 любых изотипов, включая Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε и Cμ. Линкерные последовательности также можно получать из других белков, таких как Ig-подобные белки, (например, TCR, FcR, KIR); последовательностей на основе G/S (например, повторы G4S SEQ ID NO: 29); последовательностей шарнирных областей и других природных последовательностей из других белков.

В одном из вариантов осуществления константный домен с применением технологий рекомбинантных ДНК связан с двумя связанными вариабельными доменами. В одном из вариантов осуществления последовательность, содержащая связанные вариабельные домены тяжелых цепей, связана с константным доменом тяжелой цепи, а последовательность, содержащая связанные вариабельные домены легких цепей, связана с константным доменом легкой цепи. В одном из вариантов осуществления константные домены являются константными доменами тяжелой цепи человека и константным доменом легкой цепи человека, соответственно. В одном из вариантов осуществления тяжелая цепь с DVD дополнительно связана с Fc-областью. Fc-область может представлять собой природную последовательность Fc-области или вариант Fc-области. В другом варианте осуществления Fc-область представляет собой Fc-область человека. В другом варианте осуществления Fc-область включает Fc-область из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE или IgD.

В другом варианте осуществления комбинируют два полипептида тяжелых цепей с DVD и два полипептида легких цепей с DVD с формированием молекулы DVD-Ig. В таблице 2 приведены аминокислотные последовательности областей VH и VL, приводимых в качестве примера антител для мишеней, пригодных для лечения заболевания, например, для лечения злокачественной опухоли. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к DVD, содержащему по меньшей мере две из областей VH и/или VL, приведенных в таблице 2, в любой ориентации.

Таблица 2 Список аминокислотных последовательностей областей VH и VL антител для получения DVD-Ig

Подробное описание конкретных молекул DVD-Ig, связывающих конкретные мишени, и способов их получения приведено ниже в разделе примеров.

C. Получение белков с DVD

Связывающие белки по настоящему изобретению можно получать любым из ряда известных в данной области способов. Например, посредством экспрессии из клеток-хозяев, где в клетку-хозяина стандартными способами трансфицируют экспрессирующий вектор(ы), кодирующий тяжелые цепи с DVD и легкие цепи с DVD. Различные формы термина "трансфекция" предназначены для включения широкого спектра способов, широко используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорации, осаждения фосфатом кальция, трансфекции с DEAE-декстраном и т.п. Хотя белки с DVD по изобретению можно экспрессировать в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, белки с DVD экспрессируют в эукариотических клетках, например, клетках-хозяевах млекопитающих, так как в таких эукариотических клетках (и в частности, в клетках млекопитающих) с большей вероятностью, чем в прокариотических клетках будут собираться и секретироваться правильно свернутые и иммунологически активные белки с DVD.

Иллюстративные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки китайского хомяка (клетки CHO) (включая клетки CHO dhfr-, описанные в Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, с использованием селективного маркера DHFR, например, как описано в Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), миеломные клетки NS0, клетки COS, клетки SP2 и PER.C6. Когда в клетки-хозяева млекопитающих вводят рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие белки с DVD, белки с DVD получают посредством культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для обеспечения экспрессии белков с DVD в клетках-хозяевах или секреции белков с DVD в среду для культивирования, в которой выращивают клетки-хозяева. Белки с DVD можно выделять из среды для культивирования стандартными способами очистки белков.

В приводимой в качестве примера системе для рекомбинантной экспрессии белков с DVD по изобретению рекомбинантный экспрессирующий вектор, кодирующий тяжелую цепь с DVD и легкую цепь с DVD, вводят в клетки CHO dhfr- посредством опосредуемой фосфатом кальция трансфекции. В рекомбинантном экспрессирующем векторе каждый из генов тяжелой и легкой цепей с DVD функционально связан с регуляторными элементами энхансером CMV/промотором AdMLP для обеспечения высоких уровней транскрипции генов. Рекомбинантный экспрессирующий вектор также несет ген DHFR, который обеспечивает отбор клеток CHO, трансфицированных вектором с использованием отбора/размножения на метотрексате. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют для обеспечения экспрессии тяжелой и легкой цепей с DVD и из среды для культивирования восстанавливают интактный белок с DVD. Для получения рекомбинантного экспрессирующего вектора трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и восстановления белка с DVD из среды для культивирования используют стандартные способы молекулярной биологии. Кроме того, изобретение относится к способу синтеза белка с DVD по изобретению посредством культивирования клеток-хозяев по изобретению в подходящей среде для культивирования до синтеза белка с DVD по изобретению. Способ может дополнительно включать выделение белка с DVD из среды для культивирования.

Важной характеристикой DVD-Ig является то, что его можно получать и выделять сходным с общепринятыми антителами способом. Получение DVD-Ig приводит к гомогенному одному основному продукту с желаемой двойной специфической активностью без какой-либо модификации последовательности константной области или химических модификаций любого вида. Другие ранее описанные способы получения "биспецифических", "полиспецифических и "полиспецифических поливалентных" полноразмерных связывающих белков не приводят к одному первичному продукту, а вместо этого приводят к получению внутриклеточной или секретируемой смеси собираемых неактивных, моноспецифических, полиспецифических, поливалентных полноразмерных связывающих белков и поливалентных полноразмерных связывающих белков с комбинацией различных участков связывания. В качестве примера на основе конструкции, описываемой в публикации PCT WO2001/077342, существуют 16 возможных комбинаций тяжелых и легких цепей. Таким образом, в желаемой активной форме может находиться только 6,25% белка, и не в виде одного основного продукта или одного первичного продукта по сравнению с другими 15 возможными комбинациями. Выделение желаемых полностью активных форм белка из неактивных и частично активных форм белка стандартными способами хроматографии, как правило, используемыми при производстве в большом масштабе, все еще необходимо продемонстрировать.

Неожиданно конструкция "поливалентных полноразмерных связывающих белков с двойной специфичностью" по настоящему изобретению приводит к легкой цепи с двойным вариабельным доменом и тяжелой цепи с двойным вариабельным доменом, которые преимущественно собираются в желаемые "поливалентные полноразмерные связывающие белки с двойной специфичностью".

По меньшей мере 50%, по меньшей мере 75% и по меньшей мере 90% собранных и экспрессируемых молекул иммуноглобулинов с двойными вариабельными доменами представляют собой желаемый четырехвалентный белок с двойной специфичностью. Этот аспект изобретения особенно увеличивает коммерческую пригодность изобретения. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу экспрессии легкой цепи с двойным вариабельным доменом и тяжелой цепи с двойным вариабельным доменом в одной клетке, приводящему к одному первичному продукту "четырехвалентному полноразмерному связывающему белку с двойной специфичностью".

Настоящее изобретение относится к способам экспрессии легкой цепи с двойным вариабельным доменом и тяжелой цепи с двойным вариабельным доменом в одной клетке, приводящим к "первичному продукту" "четырехвалентного полноразмерного связывающего белка с двойной специфичностью", где "первичный продукт" содержит более 50% от всего собранного белка, содержащего легкую цепь с двойным вариабельным доменом и тяжелую цепь с двойным вариабельным доменом.

Настоящее изобретение относится к способам экспрессии легкой цепи с двойным вариабельным доменом и тяжелой цепи с двойным вариабельным доменом в одной клетке, приводящим к одному "первичному продукту" "четырехвалентного полноразмерного связывающего белка с двойной специфичностью", где "первичный продукт" содержит более 75% от всего собранного белка, содержащего легкую цепь с двойным вариабельным доменом и тяжелую цепь с двойным вариабельным доменом.

Настоящее изобретение относится к способам экспрессии легкой цепи с двойным вариабельным доменом и тяжелой цепи с двойным вариабельным доменом в одной клетке, приводящим к одному "первичному продукту" "четырехвалентного полноразмерного связывающего белка с двойной специфичностью", где "первичный продукт" содержит более 90% от всего собранного белка, содержащего легкую цепь с двойным вариабельным доменом и тяжелую цепь с двойным вариабельным доменом.

II. Дериватизированные связывающие белки с DVD

Один из вариантов осуществления относится к меченому связывающему белку, где связывающий белок по изобретению дериватизирован или связан с другой функциональной молекулой (например, другим пептидом или белком). Например, меченый связывающий белок по изобретению можно получать посредством функционального связывания связывающего белка по изобретению (посредством химического связывания, слияния генов, нековалентной ассоциации или иным способом) с другими одной или несколькими молекулярными структурами, такими как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диатело), детектируемое средство, цитотоксическое средство, фармацевтическое средство и/или белок или пептид, которые могут опосредовать ассоциацию связывающего белка с другой молекулой (такой как коровая область стрептавидина или полигистидиновая метка).

Подходящие детектируемые средства, которыми можно дериватизировать связывающий белок по изобретению, могут включать флуоресцентные соединения. Приводимые в качестве примера флуоресцентные детектируемые средства включают флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталенсульфонилхлорид, фикоэритрин и т.п. Также связывающий белок можно дериватизировать детектируемыми ферментами, такими как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глюкозооксидаза и т.п. Когда связывающий белок дериватизирован детектируемым ферментом, его детектируют, добавляя дополнительные реагенты, которые фермент использует для получения детектируемого продукта реакции. Например, когда присутствует детектируемое средство пероксидаза хрена, добавление пероксида водорода и диаминобензидина приводит к получению окрашенного продукта реакции, который детектируют. Также связывающий белок можно дериватизировать биотином и детектировать посредством непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина.

Другой вариант осуществления изобретения относится к кристаллизуемому связывающему белку и составам и композициям, содержащим такие кристаллы. В одном из вариантов осуществления кристаллизуемый связывающий белок обладает большим временем полужизни in vivo, чем растворимый аналог связывающего белка. В другом варианте осуществления связывающий белок после кристаллизации сохраняет биологическую активность.

Кристаллизуемый связывающий белок по изобретению можно получать известными в данной области способами и как описано в публикации PCT № WO 02072636.

Другой вариант осуществления изобретения относится к гликозилированному связывающему белку, где антитело или его антигенсвязывающая часть содержат один или несколько углеводных остатков. Начинающаяся in vivo продукция белка может переходить в дальнейший процессинг, известный как посттрансляционная модификация. В частности, в процессе, известном как гликозилирование, могут ферментативно добавляться остатки сахаров (гликозилов). Полученные белки, несущие ковалентно связанные олигосахаридные боковые цепи, известны как гликозилированные белки или гликопротеины. Антитела представляют собой гликопротеины с одним или несколькими углеводными остатками в Fc-домене, а также в вариабельном домене. Углеводные остатки в Fc-домене имеют важное значение для эффекторной функции Fc-домена с минимальным влиянием на связывание антигена или время полужизни антитела (Jefferis (2005) Biotechnol. Prog. 21:11-16). В отличие от этого, гликозилирование вариабельного домена может оказывать влияние на антигенсвязывающую активность антитела. Гликозилирование вариабельного домена может иметь отрицательное влияние на аффинность связывания антитела, вероятно, вследствие стерического препятствия (Co et al. (1993) Mol. Immunol. 30:1361-1367), или приводить к увеличению аффинности к антигену (Wallick et al. (1988) Exp. Med. 168:1099-1109; Wright et al. (1991) EMBO J. 10:2717-2723).

Один из аспектов настоящего изобретения относится к получению мутантов по участкам гликозилирования, у которых мутированы O- или N-связанные участки гликозилирования связывающего белка. Специалист в данной области может получать такие мутанты стандартными хорошо известными способами. Другой целью настоящего изобретения являются мутанты по участкам гликозилирования, сохраняющие биологическую активность, но с увеличенной или сниженной активностью связывания.

В еще одном варианте осуществления гликозилирование антитела или антигенсвязывающей части по изобретению модифицировано. Например, можно получать агликозилированное антитело (т.е., антитело с отсутствием гликозилирования). Гликозилирование можно изменять, например, для увеличения аффинности антитела к антигену. Такие модификации углеводов можно проводить, например, изменяя один или несколько участков гликозилирования в последовательности антитела. Например, можно проводить одну или несколько замен аминокислот, что приводит к устранению одного или нескольких участков гликозилирования в вариабельной области, таким образом, устраняя гликозилирование по этому участку. Такое отсутствие гликозилирования может увеличивать аффинность антитела к антигену. Такой подход более подробно описан в публикации PCT № WO2003016466 и патентах США №№ 5714350 и 6350861.

Дополнительно или альтернативно можно получать модифицированный связывающий белок по изобретению с измененным типом гликозилирования, такой как гипофукозилированное антитело с уменьшенными количествами фукозильных остатков (см. Kanda et al. (2007) J. Biotechnol. 130(3):300-310) или антитело с увеличенным количеством разделяемых надвое структур GlcNAc. Показано, что такие измененные профили гликозилирования увеличивают способность антител к ADCC. Такие модификации углеводов можно проводить, например, экспрессируя антитело в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования описаны в данной области, и их можно использовать в качестве клеток-хозяев, для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению, получая, таким образом, антитело с измененным гликозилированием. См., например, Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, а также патент Европы № EP 1176195 и публикации PCT №№ WO 03/035835 и WO 99/5434280.

Гликозилирование белков зависит от аминокислотной последовательности представляющего интерес белка, а также от клетки-хозяина, в которой экспрессируют белок. Различные организмы могут продуцировать различные ферменты гликозилирования (например, гликозилтрансферазы и гликозидазы) и содержат различные доступные субстраты (нуклеотидные сахара). Вследствие этих факторов профиль гликозилирование белков и состав гликозильных остатков может отличаться в зависимости от системы-хозяина, в которой экспрессируется конкретный белок. Гликозильные остатки, пригодные по изобретению, в качестве неограничивающих примеров могут включать глюкозу, галактозу, маннозу, фукозу, н-ацетилглюкозамин и сиаловую кислоту. В одном из вариантов осуществления гликозилированный связывающий белок содержит такие гликозильные остатки, что профиль гликозилирование является таким, как у человека.

Специалистам в данной области известно, что различное гликозилирование белков может приводить к различным характеристикам белков. Например, эффективность терапевтического белка, продуцируемого в хозяине-микроорганизме, таком как дрожжи, и гликозилируемого с использованием эндогенного метаболического пути дрожжей, по сравнению с эффективностью того же белка, экспрессируемого в клетках млекопитающего, таких как клеточная линия CHO, может снижаться. Также такие гликопротеины могут быть иммуногенны у людей и демонстрировать уменьшенное время полужизни in vivo после введения. Специфические рецепторы у людей и других животных могут распознавать конкретные гликозильные остатки и обеспечивать быстрое выведение белка из кровотока. Другие неблагоприятные эффекты могут включать изменения в свертывании белка, растворимости, чувствительности к протеазам, направлении перемещения, транспорте, компартментализации, секреции, распознавании другими белками или факторами, антигенности или аллергенности. Таким образом, специалист-практик может выбирать терапевтический белок с конкретными составом и профилем гликозилирования, например, с составом и профилем гликозилирования, идентичными или по меньшей мере сходными с составом и профилем гликозилирования, получаемыми в клетках человека или в видоспецифичных клетках конкретного заданного животного.

Экспрессии гликозилированных белков, отличной от экспрессии в клетке-хозяине, можно достигать посредством генетической модификации клетки-хозяина с экспрессией гетерологичных ферментов гликозилирования. С применением известных в данной области способов специалист-практик может получать антитела или их антигенсвязывающие части, демонстрирующие гликозилирование белков, как у человека. Например, генетически модифицировали штаммы дрожжей с экспрессией неприродных ферментов гликозилирования так, что получаемые в этих штаммах дрожжей гликозилированные белки (гликопротеины) демонстрировали гликозилирование белков, идентичное гликозилированию в клетках животных, особенно в клетках человека (патенты США №№ 7449308 и 7029872 и публикация PCT № WO2005/100584).

В дополнение к связывающим белкам настоящее изобретение также относится к антиидиотипическим антителам (антителам к Id), специфичным к таким связывающим белкам по изобретению. Антитело к Id представляет собой антитело, распознающее уникальные детерминанты, как правило, ассоциированные с антигенсвязывающей областью другого антитела. Антитела к Id можно получать посредством иммунизации животного связывающим белком или его содержащей CDR областью. Иммунизированное животное распознает и отвечает на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела и продуцирует антитела к Id. Легко понять, что антиидиотипические антитела к двум или более исходным антителам, встроенным в молекулу DVD-Ig, можно получить проще; и подтвердить исследования связывания общепринятыми в данной области способами (например, BIAcore, ELISA) с подтверждением того, что антиидиотипические антитела, специфичные к идиотипу каждого из исходных антител, также распознают идиотип (например, антигенсвязывающий участок) в контексте DVD-Ig. Антиидиотипические антитела, специфичные к каждому из двух или более антигенсвязывающих участков DVD-Ig, являются идеальными реагентами для измерения концентраций DVD-Ig DVD-Ig человека в сыворотке пациента; анализы концентраций DVD-Ig можно проводить с применением "формата анализа ELISA по типу сэндвича" с антителом к первой антигенсвязывающей области, нанесенным на твердую фазу (например, чип BIAcore, планшет для ELISA и т.д.), промыванием промывающим буфером, инкубированием с образцом сыворотки, повторным промыванием и в конечном счете инкубацией с другим антиидиотипическим антителом к другому антигенсвязывающему участку, которое мечено ферментом для количественного анализа реакции связывания. В одном из вариантов осуществления для DVD-Ig с более чем двумя различными участками связывания антиидиотипические антитела к двум внешним участкам связывания (наиболее дистальному и проксимальному от константной области) не только помогают определить концентрацию DVD-Ig в сыворотке человека, но также свидетельствуют о целостности молекулы in vivo. Каждое антитело к Id также можно использовать в качестве "иммуногена" для индукции иммунного ответ у еще одного животного, получая так называемые антитела к антителам к Id.

Кроме того, специалисту в данной области понятно, что представляющий интерес белок можно экспрессировать с использованием библиотеки клеток-хозяев, генетически сконструированных для экспрессии различных ферментов гликозилирования так, что клетки-хозяева, члены библиотеки, продуцируют представляющий интерес белок с различными вариантами профилей гликозилирования. Затем специалист-практик может выбрать и выделить представляющий интерес белок с конкретными новыми профилями гликозилирование. В одном из вариантов осуществления белок с конкретным выбранным новым профилем гликозилирования демонстрирует улучшенные или измененные биологические свойства.

III. Применения DVD-Ig

Учитывая их способность связываться с двумя или более антигенами, связывающие белки по изобретению можно использовать для детекции антигенов (например, в биологическом образце, таком как сыворотка или плазма) с использованием общепринятого иммунологического анализа, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA) или иммуногистохимия тканей. Для упрощения детекции связанного или несвязанного антитела DVD-Ig непосредственно или опосредованно метят детектируемым веществом. Подходящие детектируемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентнных веществ включает люминол и примеры подходящих радиоактивных веществ включают ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho и ¹⁵³Sm.

В одном из вариантов осуществления связывающие белки по изобретению нейтрализуют активность антигенов in vitro и in vivo. Таким образом, такие DVD-Ig можно использовать для ингибирования активности антигенов, например, в клеточной культуре, содержащей антигены, у человека или у других млекопитающих, несущих антигены, с которыми перекрестно реагирует связывающийся белок по изобретению. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу снижения активности антигена у индивидуума, страдающего заболеванием или нарушением, при которых активность этого антигена является вредоносной. Связывающий белок по изобретению можно вводить человеку с терапевтическими целями.

Термин "нарушение, при котором активность антигена является вредоносной" включает заболевания и другие нарушения, при которых показано, что присутствие антигена у индивидуума, страдающего этим нарушением, является или предположительно является ответственным за патофизиологию нарушения или фактором, вносящим вклад в ухудшение нарушения. Таким образом, нарушение, при котором активность антигена является вредоносной, представляет собой нарушение, при котором ожидают, что снижение активности антигена уменьшит симптомы и/или прогрессирование нарушения. Такие нарушения можно подтверждать, например, по увеличению концентрации антигена в биологической жидкости индивидуума, страдающего нарушением (например, увеличение концентрации антигена в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости и т.д. индивидуума). Неограничивающие примеры нарушений, которые можно лечить связывающими белками по изобретению включают нарушения, описываемые ниже и в разделе, относящемся к фармацевтическим композициям антител по изобретению.

DVD-Ig по изобретению могут связывать один антиген или несколько антигенов. Такие антигены в качестве неограничивающих примеров включают мишени, перечисленные в приведенных ниже базах данных, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки. Эти базы данных мишеней включают следующие списки:

терапевтические мишени (http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp);

цитокины и рецепторы цитокинов (http://www.cytokinewebfacts.com/, http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi и http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamotou.ac.jp/CFC/indexR.html);

хемокины (http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html);

рецепторы и GPCR хемокинов (http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/);

обонятельные рецепторы (http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp);

рецепторы (http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm);

злокачественные мишени (http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi);

секретируемые белки в качестве потенциальных мишеней антител (http://spd.cbi.pku.edu.cn/);

протеинкиназы (http://spd.cbi.pku.edu.cn/) и

CD-маркеры человека (http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf) и (Zola (2005) Blood 106:3123-6).

DVD-Ig пригодны в качестве терапевтических средств для одновременного блокирования двух различных мишеней для увеличения эффективности/безопасности и/или увеличения охвата пациентов. Такие мишени могут включать растворимые мишени (например, TNF) и мишени-рецепторы клеточной поверхности (например, VEGFR и EGFR). Также их можно использовать для индукции перенаправленной цитотоксичности T-клеток к опухолевым клеткам и (например, Her2 и CD3) для терапии злокачественных опухолей, или эффекторных клеток к аутореактивным клеткам для лечения аутоиммунных заболеваний или при трансплантации, или эффекторных клеток к любым клеткам-мишеням для устранения вызывающих заболевание клеток при любом данном заболевании.

Кроме того, DVD-Ig можно использовать для запуска кластеризации и активации рецепторов, когда их конструируют, направляя к двум различным эпитопам на одном и том же рецепторе. Это может приносить пользу при получении агонистических и антагонистических терапевтических средств против GPCR. В этом случае DVD-Ig можно использовать для направления к двум различным эпитопам (включая эпитопы в областях петель и во внеклеточном домене) на одной клетке для кластеризации/передачи сигнала (две молекулы клеточной поверхности) или передачи сигнала (на одной молекуле). Подобным образом, молекулу DVD-Ig можно конструировать для запуска сшивки CTLA-4 и передачи отрицательного сигнала посредством направления к двум различным эпитопам (или 2 копиям одного и того же эпитопа) внеклеточного домена CTLA-4, приводящего к подавлению иммунного ответа. CTLA-4 является клинически подтвержденной мишенью для терапевтического лечения ряда иммунологических нарушений. Взаимодействия CTLA-4/B7 отрицательно регулируют активацию T-клеток посредством подавления прохождения клеточного цикла, продукции IL-2 и пролиферации T-клеток после активации, и привлечение CTLA-4 (CD152) может подавлять активацию T-клеток и способствовать индукции иммунологической толерантности. Однако стратегия подавления активации T-клеток посредством привлечения CTLA-4 агонистическим антителом не приводила к успеху, так как активация CTLA-4 требует сшивки. Молекулярное взаимодействие CTLA-4/B7 происходит в положениях "асимметричной застежки", как продемонстрировано посредством анализа кристаллической структуры (Stamper (2001) Nature 410:608). Однако ни один из доступных в настоящее время связывающих CTLA-4 реагентов не обладает сшивающими свойствами, включая mAb к CTLA-4. Проводилось несколько попыток решить эту проблему. В одном случае получали связанное с клеткой-участником одноцепочечное антитело и в значительной степени ингибировали отторжение аллогенного трансплантата у мышей (Hwang (2002) J. Immunol. 169:633). В другом случае получали связанное с поверхностью искусственной APC одноцепочечное антитело к CTLA-4 и продемонстрировали ослабленный T-клеточный ответ (Griffin (2000) J. Immunol. 164:4433). В обоих случаях сшивки CTLA-4 достигали посредством тесно расположенных связанных с участниками антител в искусственных системах. Хотя эти эксперименты предоставляют подтверждение концепции иммунного подавления посредством запуска передачи отрицательного сигнала CTLA-4, реагенты, используемые в этих публикациях, являются неподходящими для терапевтического применения. C этой целью сшивку CTLA-4 можно проводить с применением молекулы DVD-Ig, которая направлена к двум различным эпитопам (или 2 копиям одного и того же эпитопа) внеклеточного домена CTLA-4. Обоснованием является то, что расстояние между двумя участками связывания IgG, приблизительно 150-170Å, является слишком большим для активной сшивки CTLA-4 (30-50 Å между 2 гомодимерами CTLA-4). Однако расстояние между двумя участками связывания на DVD-Ig (на одном плече) является намного более коротким, также находясь в диапазоне 30-50 Å, обеспечивая правильную сшивку CTLA-4.

Подобным образом, DVD-Ig может быть направлено к двум различным участникам рецепторного комплекса на клеточной поверхности (например, к IL-12R альфа и бета). Кроме того, DVD-Ig может быть направлено к CR1 и растворимому белку/патогену, обеспечивая быстрое выведение растворимого белка/патогена, к которому оно направлено.

Кроме того, DVD-Ig по изобретению можно использовать для тканеспецифической доставки (направляя к тканевому маркеру и медиатору заболевания с улучшением локальной PK, таким образом, повышая эффективность и/или снижая токсичность), включая внутриклеточную доставку (направляя к интернализируемому рецептору и внутриклеточной молекуле) и доставку внутрь головного мозга (например, направляя к рецептору трансферрина и медиатору заболевания ЦНС для пересечения гематоэнцефалического барьера). DVD-Ig также может служить в качестве белка-носителя для доставки антигена в конкретное расположение посредством связывания с не нейтрализующим эпитопом этого антигена, а также для увеличения времени полужизни антигена. Кроме того, DVD-Ig можно конструировать как физически связанные с медицинскими устройствами, имплантируемыми пациентам, или как направляемые к этим медицинским устройствам (см. Burke et al. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58(3):37-446); поверхностные покрытия для биологической активации и функционализации медицинских устройств (см. Hildebrand et al. (2006) Surface Coatings Technol. 200(22-23):6318-6324); комбинации лекарственное средство/устройство для локального лекарственного лечения и профилактики инфекций (см. Wu et al. (2006) Biomaterials 27(11):2450-2467); посредника цитокиновой сети при имплантации ортопедических устройств (см. Marques et al. Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), pp. 377-397). В кратком изложении, направление соответствующих типов клеток в область медицинского имплантата может способствовать выздоровлению и восстановлению нормальной функции ткани. Альтернативно, также предоставлено ингибирование медиаторов (включая в качестве неограничивающих примеров цитокины), высвобождаемых при имплантации устройства посредством DVD, связанных с устройством или направленных к нему. Например, в течение нескольких лет в хирургической кардиологии для очищения закупоренных артерий и для улучшения кровотока к сердечной мышце используют стенты. Однако известно, что у некоторых пациентов традиционные стенты из чистого металла вызывают рестеноз (повторное сужение артерии в обрабатываемой области) и могут приводить к тромбам. Недавно описан стент, покрытый антителом к CD34, уменьшающий рестеноз и предотвращающий возникновение тромбов, захватывая эндотелиальные клетки-предшественники (EPC), циркулирующие в крови. Эндотелиальные клетки представляют собой клетки, выстилающие кровеносные сосуды, обеспечивая ровный кровоток. EPC прикрепляются к твердой поверхности стента, формируя ровный слой, который не только способствует выздоровлению, но предотвращает рестеноз и тромбы, осложнения, ранее ассоциированные с использованием стентов (Aoji et al. (2005) J. Am. Coll. Cardiol. 45(10):1574-9). В дополнение к улучшению исходов у пациентов, которым необходимы стенты, также есть роль для пациентов, которым необходимо хирургическое сердечно-сосудистое шунтирование. Например, протезирующая сосудистая трубка (искусственная артерия), покрытая антителами к EPC, может устранить необходимость использования артерий из ног или рук пациентов в качестве трансплантатов для шунтирования. Это может снизить время хирургической операции и анестезии, что в свою очередь уменьшает гибель вследствие коронарной хирургии. DVD-Ig конструируют таким образом, чтобы оно связывалось с поверхностным клеточным маркером (таким как CD34), а также белком (или эпитопом любого вида, включая в качестве неограничивающих примеров белки, липиды и полисахариды), нанесенным на имплантируемое устройство, способствуя привлечению клеток. Также такие подходы можно применять для других медицинских имплантатов в целом. Альтернативно, DVD-Ig можно наносить на медицинские устройства и после имплантации и высвобождения всех DVD из устройства (или любой другой необходимости, которая может требовать дополнительных свежих DVD-Ig, включая окисление и денатурацию уже введенных DVD-Ig) в устройство посредством системного введения пациенту можно повторно вводить свежие DVD-Ig, где DVD-Ig сконструированы для связывания с представляющей интерес мишенью (цитокина, поверхностного клеточного маркера (такого как CD34) и т.д.) у одной группы участков связывания и с мишенью, нанесенной на устройство (включая белок, эпитоп любого вида, включая в качестве неограничивающих примеров липиды, полисахариды и полимеры) у другой группы. Эта технология имеет преимущество увеличения пригодности покрытых имплантатов.

A. Использование DVD-Ig при различных заболеваниях

Молекулы DVD-Ig по изобретению также пригодны в качестве терапевтических молекул для лечения различных заболеваний. Такие молекулы с DVD могут связывать одну или несколько мишеней, вовлеченных в конкретное заболевание. Примеры таких мишеней при различных заболеваниях описаны ниже.

1. Аутоиммунный и воспалительный ответ у человека

В общий аутоиммунный и воспалительный ответы вовлечено множество белков, включая C5, CCL1 (1-309), CCL11 (эотаксин), CCL13 (mcp-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/эотаксин-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (I-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 (цитокин, активирующий эндотелиальные моноциты), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFΑIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2 и RNF110 (ZNF144). В одном из аспектов предоставлены DVD-Ig, связывающиеся с одной или несколькими из перечисленных в этом абзаце мишеней.

Предусмотрены DVD-Ig, связывающие следующие пары мишеней для лечения воспалительного заболевания: IL-1альфа (посл. 3) и IL-1бета (посл. 1); IL-1альфа (посл. 2) и IL-1бета (посл. 1); IL-1альфа (посл. 1) и IL-1бета (посл. 1); IL-1альфа (посл. 3) и IL-1бета (посл. 2); IL-1альфа (посл. 4) и IL-1бета (посл. 2); IL-1альфа (посл. 4) и IL-1бета (посл. 3); IL-1альфа (посл. 4) и IL-1бета (посл. 4); IL-1альфа (посл. 4) и IL-1бета (посл. 5) (см. примеры 2.1-2.8).

2. Астма

Аллергическая астма характеризуется наличием эозинофилии, метаплазией бокаловидных клеток, альтерацией эпителиальных клеток, гиперреактивностью дыхательных путей (AHR) и экспрессией Th2- и Th1-цитокинов, а также повышенными сывороточными уровнями IgE. В настоящее время является общепризнанным, что ключевым фактором, лежащим в основе патогенеза астмы, включающего сложное взаимодействие воспалительных клеток, таких как T-клетки, B-клетки, эозинофилы, тучные клетки и макрофаги, и секретируемых ими медиаторов, включающих цитокины и хемокины, является воспаление дыхательных путей. В настоящее время наиболее важным противовоспалительным лечением астмы являются кортикостероиды, однако их механизм действия является неспецифическим и существуют проблемы безопасности, особенно в группе пациентов юношеского возраста. Таким образом, требуется разработка более специфических и направленных терапевтических средств. Существует возрастающее количество свидетельств, что IL-13 у мышей имитирует множество признаков астмы, включая AHR, гиперсекрецию слизи и фиброз дыхательных путей, независимо от эозинофильного воспаления (Finotto et al. (2005) Int. Immunol. 17(8):993-1007; Padilla et al. (2005) J. Immunol. 174(12):8097-8105).

IL-13 вовлечен, как играющий основную роль в вызове патологического ответа, ассоциированного с астмой. Разработка лечения посредством mAb к IL-13 для снижения воздействия IL-13 в легких является новым перспективным подходом, обеспечивающим значительные перспективы в качестве нового лечение астмы. Однако в патогенез астмы также вовлечены другие медиаторы различных иммунологических путей, и блокирование этих медиаторов, в дополнение к IL-13, может обеспечить дополнительное терапевтическое преимущество. Такие пары мишеней в качестве неограничивающих примеров включают IL-13 и провоспалительный цитокин, такой как фактор некроза опухоли-α (TNFα). TNFα может усиливать воспалительный ответ при астме и может быть связан с тяжестью заболевания (McDonnell et al. (2001) Progr. Respir. Res. 31 (New Drugs for Asthma, Allergy and COPD):247-250.). Это позволяет предположить, что одновременное блокирование IL-13 и TNFα может оказывать положительное воздействие особенно при тяжелом заболевании дыхательных путей. В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает мишени IL-13 и TNFα, и его используют для лечения астмы.

В данной области известны модели на животных, такие как модель индуцируемой OVA астмы у мышей, где можно оценивать и воспаление, и AHR, и их можно использовать для определения способности различных молекул DVD-Ig лечить астму. Модели на животных для исследования астмы описаны в Coffman et al. (2005) J. Exp. Med. 201(12):1875-1879; Lloyd et al. (2001) Adv. Immunol. 77:263-295; Boyce et al. (2005) J. Exp. Med. 201(12):1869-1873 и Snibson et al. (2005) J. Brit. Soc. Allergy Clin. Immunol. 35(2): 146-52. В дополнение к стандартным оценкам безопасности этих пар мишеней могут требоваться и являться полезными в выборе лучших пар мишеней специфичные тесты на степень иммуносупрессии (см. Luster et al. (2004) Toxicol. 92(1-3):229-43; Descotes et al. (1992) Dev. Biol. Standardiz. 77:99-102; Hart et al. (2001) J. Allergy and Clin. Immunol. 108(2):250-257).

На основе обоснования, приводимого в настоящем документе, и используя ту же модель оценки эффективности и безопасности, можно определять другие пары мишеней, с которыми могут связываться молекулы DVD-Ig, и которые могут являться подходящими для лечения астмы. В одном из вариантов осуществления такие мишени в качестве неограничивающих примеров включают IL-13 и IL-1бета, так как IL-1бета также вовлечен в воспалительный ответ при астме; IL-13 и цитокины и хемокины, которые вовлечены в воспаление, такие как IL-13 и IL-9; IL-13 и IL-4; IL-13 и IL-5; IL-13 и IL-25; IL-13 и TARC; IL-13 и MDC; IL-13 и MIF; IL-13 и TGFβ; IL-13 и агонист LHR; IL-13 и CL25; IL-13 и SPRR2a; IL-13 и SPRR2b и IL-13 и ADAM8. Настоящее изобретение также относится к DVD-Ig, связывающимися с одной или несколькими мишенями, вовлеченными в астму, выбранными из группы, состоящей из CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, гистамина и рецепторов гистамина, IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24,CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNF, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR и хитиназы.

3. Ревматоидный артрит

Ревматоидный артрит (RA), системное заболевание, характеризуется хронической воспалительной реакцией в синовиальной оболочке суставов и ассоциирован с разрушением хряща и эрозией околосуставной кости. В пораженных суставах экспрессируется множество провоспалительных цитокинов, включая TNF, хемокины и факторы роста. Показано, что системное введение антител к TNF или слитого белка sTNFR в моделях RA на мышах является противовоспалительным и защищает суставы. Клинические исследования, в которых активность TNF у пациентов с RA блокировали внутривенно вводимым инфликсимабом (Harriman et al. (1999) Ann. Rheum. Dis. 58 Suppl 1:161-4), химерным mAb к TNF, предоставили доказательство, что TNF регулирует продукцию IL-6, IL-8, MCP-1 и VEGF, привлечение в суставы иммунных и воспалительных клеток, ангиогенез и снижение уровней матриксных металлопротеиназ-1 и -3 в крови. Лучшее понимание протекания воспалительного процесса при ревматоидном артрите привело к идентификации других терапевтических мишеней, вовлеченных в ревматоидный артрит. В течение последних лет в рандомизированных контролируемых испытаниях уже протестированы многообещающие лечебные средства, такие как антагонисты интерлейкина-6 (антитело MRA к рецептору IL-6, разработанное Chugai, Roche (см. Nishimoto et al. (2004) Arthritis Rheum. 50(6):1761-1769), CTLA4Ig (абатацепт, Genovese et al. (2005) N. Engl. J. Med. 353:1114-23) и лечебное средство против B-клеток (ритуксимаб, Okamoto (2004) N. Engl. J. Med. 351:1909). Идентифицированы другие цитокины, включая интерлейкин-15 (терапевтическое антитело HuMax-IL_15, AMG 714 см. Baslund et al. (2005) Arthrit. Rheum. 52(9):2686-2692), интерлейкин-17 и интерлейкин-18, и в моделях на животных показано, что они обеспечивают преимущество, и в настоящее время проходят клинические испытания этих средств. Лечение антителами с двойной специфичностью, комбинирующее антитело к TNF и другому медиатору, обладает большим потенциалом в увеличении клинической эффективности и/или охвата пациентов. Например, одновременное блокирование TNF и VEGF потенциально может ликвидировать воспаление и ангиогенез, которые оба вовлечены в патофизиологию RA. Также предусмотрено блокирование других пар мишеней, вовлеченных в RA, включающих в качестве неограничивающих примеров TNF и IL-18; TNF и IL-12; TNF и IL-23; TNF и IL-1бета; TNF и MIF; TNF и IL-17 и TNF и IL-15 специфическими DVD-Ig. В дополнение к стандартным оценкам безопасности этих пар мишеней, могут требоваться и являться полезными в выборе лучших пар мишеней специфичные тесты на степень иммуносупрессии (см. Luster et al. (2004) Toxicol. 92(l-3):229-43; Descotes et al. (1992) Dev. Biol. Standard. 77:99-102; Hart et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 108(2):250-257). Является ли молекула DVD-Ig подходящей для лечения ревматоидного артрита, можно оценивать с использованием преклинических моделей RA на животных, таких как модель индуцированного коллагеном артрита у мышей. Также в данной области известны другие подходящие модели (см. Brand (2005) Comp. Med. 55(2):114-22). На основе перекрестной реактивности исходных антител в отношении ортологов человека и мыши (например, реакционноспособности в отношении TNF человека и мыши, IL-15 человека и мыши и т.д.) можно проводить подтверждающее исследование в модели CIA на мышах с полученными из "совпадающих заместительных антител" молекулами DVD-Ig; в кратком изложении, DVD-Ig на основе двух (или более) специфичных для мишеней мыши антител могут до возможной степени совпадать с характеристиками исходных антител человека или гуманизированных антител, используемых для конструирования DVD-Ig человека (сходная аффинность, сходная нейтрализующая активность, сходное время полужизни и т.д.).

4. SLE

Иммунопатогенным признаком SLE является поликлональная активация B-клеток, приводящая к гиперглобулинемии, продукции аутоантител и формированию иммунных комплексов. По-видимому фундаментальной патологией является неспособность T-клеток подавлять недопустимые B-клеточные клоны вследствие генерализованного нарушения регуляции T-клеток. Кроме того, взаимодействию B- и T-клеток способствуют несколько цитокинов, таких как IL-10, а также костимулирующие молекулы, такие как CD40 и CD40L, B7 и CD28 и CTLA-4, которые инициируют второй сигнал. Эти взаимодействия совместно с нарушенным фагоцитарным выведением иммунных комплексов и апоптозного материала поддерживает иммунный ответ с происходящим в результате повреждением тканей. В SLE могут быть вовлечены и потенциально могут быть использованы для подхода DVD-Ig для терапевтического вмешательства приведенные ниже мишени: лечение, направленное на B-клетки: CD20, CD22, CD19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1, RGS1, SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA, и NT5E.; костимулирующие сигналы: CTLA4 или B7.1/B7.2; ингибирование сохранения жизнеспособности B-клеток: BlyS, BAFF; активация комплемента: C5; модуляция цитокинов: ключевым принципом является то, что суммарный биологический ответ в любой ткани является результатом баланса между локальными уровнями провоспалительных или противовоспалительных цитокинов (см. Sfikakis et al. (2005) Curr. Opin. Rheumatol. 17:550-7). Полагают, что SLE является заболеванием, контролируемым Th-2, с зарегистрированным повышением сывороточных IL-4, IL-6, IL-10. Также предусмотрены DVD-Ig, связывающие одну или несколько мишеней, выбранных из группы, состоящей из IL-4, IL-6, IL-10, IFN-α и TNFα. Комбинация описанных в этом абзаце мишеней увеличивает терапевтическую эффективность в отношении SLE, что можно тестировать в ряде преклинических моделей волчанки (см. Peng (2004) Methods Mol. Med. 102:227-72). Можно проводить подтверждающие исследования в модели волчанки на мышах на основе перекрестной реактивности исходных антител к ортологам человека и мыши (например, реакционноспособности к CD20 человека и мыши, интерферону альфа человека и мыши и т.д.) с полученными из "совпадающих заместительных антител" молекулами DVD-Ig; в кратком изложении, DVD-Ig на основе двух (или более) специфичных для мишеней мыши антител могут до возможной степени совпадать с характеристиками исходных антител человека или гуманизированных антител, используемых для конструирования DVD-Ig человека (сходная аффинность, сходная нейтрализующая активность, сходное время полужизни и т.д.).

5. Рассеянный склероз

Рассеянный склероз (MS) представляет собой комплексное заболевание человека аутоиммунного типа с преимущественно неизвестной этиологией. Основной патологией при рассеянном склерозе является иммунологическое разрушение основного белка миелина (MBP) во всей нервной системе. MS представляет собой заболевание с комплексной патологией, включающей инфильтрацию CD4+ и CD8+ T-клеток и ответ в центральной нервной системе. При MS описана экспрессия в ЦНС цитокинов, реакционноспособных молекул азота и костимулирующих молекул. Основным рассматриваемым фактором являются иммунологические механизмы, которые вносят вклад в развитие аутоиммунитета. В частности, основными областями для идентификации терапевтических мишеней являются экспрессия антигенов, взаимодействия цитокинов и лейкоцитов и регуляторные T-клетки, способствующие поддержанию баланса/модулированию других T-клеток, такие как Th1 и Th2 клетки.

IL-12 представляет собой провоспалительный цитокин, продуцируемый APC и стимулирующий дифференцировку эффекторных Th1-клеток. IL-12 продуцируется в развивающихся очагах повреждения у пациентов с MS, а также у пораженных EAE животных. Ранее показано, что нарушение путей метаболизма IL-12 эффективно предотвращает EAE у грызунов, и что нейтрализация IL-12p40 in vivo с использованием mAb к IL-12 оказывает положительное воздействие в модели индуцированного миелином EAE у обыкновенных игрунок.

TWEAK является представителем семейства TNF, конститутивно экспрессируемым в центральной нервной системе (ЦНС), с провоспалительным, пролиферативным или апоптотическим действием в зависимости от типов клеток. Его рецептор, Fn14, экспрессируют в ЦНС эндотелиальные клетки, реактивные астроциты и нейроны. Экспрессия мРНК TWEAK и Fn14 возрастает в спинном мозге при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (EAE). Лечение мышей C57BL/6 антителом к TWEAK при EAE, индуцированном гликопротеином олигодендроцитов миелином (MOG), приводило к уменьшению тяжести заболевания и инфильтрации лейкоцитов, когда мышей лечили после этапа примирования.

Один из аспектов изобретения относится к молекулам DVD-Ig, связывающим одну или несколько, например, две мишени, выбранные из группы, состоящей из IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFN-гамма, GM-CSF, FGF, C5, CD52 и CCR2. В качестве терапевтического средства, благоприятного для лечения MS, один из вариантов осуществления включает DVD-Ig с двойной специфичностью к IL-12/TWEAK.

В данной области известно несколько моделей на животных для оценки пригодности молекул с DVD для лечения MS (см. Steinman et al. (2005) Trends Immunol. 26(11):565-71; Lublin et al. (1985) Springer Semin. Immunopathol. 8(3):197-208; Genain et al. (1997) J. Mol. Med. 75(3):187-97; Tuohy et al. (1999) J. Exp. Med. 189(7):1033-42; Owens et al. (1995) Neurol. Clin. 13(1):51-73; и Hart et al. (2005) J. Immunol. 175(7):4761-8). На основе перекрестной реактивности исходных антител в отношении ортологов человека и мыши (например, реакционной способности в отношении IL-12 человека и мыши, TWEAK человека и мыши и т.д.) можно проводить подтверждающее исследование в модели EAE на мышах с полученными из "совпадающих заместительных антител" молекулами DVD-Ig; в кратком изложении, DVD-Ig на основе двух (или более) специфичных для мишеней мыши антител могут до возможной степени совпадать с характеристиками исходных антител человека или гуманизированных антител, используемых для конструирования DVD-Ig человека (сходная аффинность, сходная нейтрализующая активность, сходное время полужизни и т.д.). Эту же концепцию применяют для моделей на животных у других, не являющихся грызунами видов, где полученные из "совпадающих заместительных антител" DVD-Ig можно выбирать для планируемых фармакологических исследований и, возможно, исследований безопасности. В дополнение к стандартным оценкам безопасности этих пар мишеней могут требоваться и являться полезными в выборе лучших пар мишеней специфичные тесты на степень иммуносупрессии (см. Luster et al. (1994) Toxicol. 92(l-3):229-43; Descotes et al. (1992) Devel. Biol. Standardiz. 77:99-102; Jones (2000) IDrugs 3(4):442-6).

6. Сепсис

Патофизиологию сепсиса инициируют компоненты наружных мембран грамотрицательных организмов (липополисахарид [LPS], липид A, эндотоксин) и грамположительных организмов (липотейхоевая кислота, пептидогликан). Эти компоненты наружных мембран способны связываться с рецептором CD14 на поверхности моноцитов. Затем посредством недавно описанных Toll-подобных рецепторов сигнал передается в клетку, что приводит к возможной продукции провоспалительных цитокинов фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа) и интерлейкина-1 (IL-1). Крайне избыточный воспалительный и иммунный ответы являются непременными характеристиками септического шока и играют центральную роль в патогенезе повреждения тканей, полиорганной недостаточности и гибели, вызываемых сепсисом. Показано, что ключевыми медиаторами септического шока являются цитокины, особенно фактор некроза опухоли (TNF) и интерлейкин 1 (IL-1). Эти цитокины оказывают прямое токсическое действие на ткани; они также активируют фосфолипазу A2. Эти и другие эффекты приводят к увеличенной концентрации фактора активации тромбоцитов, стимуляции активности синтетазы оксида азота, стимуляции инфильтрации ткани нейтрофилами и стимуляции активности нейтрофилов.

Лечение сепсиса и септического шока остается клинической загадкой, а последние проспективные испытания с модификаторами биологического ответа (т.е., антителом к TNF и антителом к MIF), нацеленными на воспалительный ответ, продемонстрировали только умеренный клинический эффект. Недавно интерес сдвинулся в направлении способов лечения, направленных на реверсию сопровождающих периодов иммуносупрессии. Исследования на экспериментальных животных и критически больных пациентах продемонстрировали, что в эту иммуносупрессию, анергию и дисфункцию систем органов вносит вклад апоптоз лимфоидных органов и некоторых паренхиматозных тканей. При синдромах сепсиса апоптоз лимфоцитов может запускать отсутствие IL-2 или высвобождение глюкокортикоидов, гранзимов, или так называемых цитокинов "смерти": фактора некроза опухоли альфа или Fas-лиганда. Апоптоз проходит посредством аутоактивации цитозольных и/или митохондриальных каспаз, на которые могут влиять про- и антиапоптотические представители семейства Bcl-2. У экспериментальных животных лечение ингибиторами апоптоза может не только предотвращать апоптоз лимфоидных клеток, но оно также может улучшать исход. Хотя клинические испытания антиапоптотических средств остаются отделенными большей частью вследствие технических сложностей, связанных с их введением и направлением в ткани, ингибирование апоптоза лимфоцитов является привлекательной терапевтической мишенью для пациентов с сепсисом. Подобным образом средство с двойной специфичностью, направленное к медиатору воспаления и медиатору апоптоза, может приносить дополнительную пользу. Один из аспектов изобретения относится к DVD-Ig, связывающим одну или несколько мишеней, вовлеченных в сепсис, в одном из вариантов осуществления две мишени, выбранные из группы, состоящей из TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, Toll-подобных рецепторов, TLR-4, тканевого фактора, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL-10, IL-1B, NFKB1, PROC, TNFRSF1A, CSF3, CCR3, IL1RN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, мидкина, IRAKI, NFKB2, SERPINA1, SERPINE1 и TREM1. Эффективность таких DVD-Ig для сепсиса можно оценивать в преклинических моделях на животных, известных в данной области (см. Buras et al. (2005) Nat. Rev. Drug Discov. 4(10):854-65 и Calandra et al. (2000) Nat. Med. 6(2):164-70).

7. Неврологические нарушения

7.1. Нейродегенеративные заболевания

Нейродегенеративные заболевания являются или хроническими, в случае чего они, как правило, зависят от возраста, или острыми (например, инсульт, травматическое повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга и т.д.). Они характеризуются прогрессирующей потерей функций нейронов (гибель нервных клеток, демиелинизация), потерей подвижности и потерей памяти. Появляющиеся знания о механизмах, лежащих в основе хронических нейродегенеративных заболеваний (например, болезни Альцгеймера), демонстрируют комплексную этиологию, и общепризнано, что в их развитие и прогрессирование вносят вклад множество факторов, например, возраст, гликемический статус, продукция и мультимеризация амилоида, накопления конечных продуктов усиленного гликирования (AGE), связывающихся с их рецептором RAGE (рецептор AGE), повышенный окислительный стресс головного мозга, сниженный мозговой кровоток, нейровоспаление, включающее высвобождение воспалительных цитокинов и хемокины, дисфункция нейронов и активация микроглии. Таким образом, эти хронические нейродегенеративные заболевания представляют собой сложное взаимодействие нескольких типов клеток и медиаторов. Стратегии лечения таких заболеваний ограничены и в основном представляют собой или блокирование воспалительных процессов неспецифическими противовоспалительными средствами (например, кортикостероидами, ингибиторами COX), или средства для предотвращения потери нейронов и/или синаптических функций. Эти виды лечения не могут остановить прогрессирование заболевания. Недавние исследования позволяют предположить, что более направленные способы лечения, такие как антитела к растворимому пептиду A-b (включая олигомерные формы A-b), могут не только помочь остановить прогрессирование заболевания, но также могут помочь сохранить память. Эти предварительные наблюдения позволяют предположить, что конкретные лекарственные средства, направленные более чем к одному медиатору заболевания (например, A-b и провоспалительному цитокину, такому как TNF), могут обеспечить даже лучшую терапевтическую эффективность для клинических нейродегенеративных заболеваний, чем наблюдают при воздействии на один механизм заболевания (например, только на растворимый A-b). В данной области известно несколько моделей на животных для оценки пригодности молекул DVD-Ig для лечения MS (см. Steinman et al. (2005) Trends Immunol. 26(11):565-71; Lublin et al. (1985) Springer Semin. Immunopathol. 8(3):197-208; Genain et al. (1997) J. Mol. Med. 75(3):187-97; Tuohy et al. (1999) J. Exp. Med. 189(7):1033-42; Owens et al. (1995) Neurol. Clin. 13(1):51-73; и Hart et al. (2005) J. Immunol. 175(7):4761-8). На основе перекрестной реактивности исходных антител в отношении ортологов человека и мыши (например, реакционной способности в отношении человека и мыши IL-12, человек и мышь TWEAK, и т.д.) можно проводить подтверждающее исследование в модели EAE на мышах с полученными из "совпадающих заместительных антител" молекулами DVD-Ig. В кратком изложении, DVD-Ig на основе двух (или более) специфичных для мишеней мыши антител могут до возможной степени совпадать с характеристиками исходных антител человека или гуманизированных антител, используемых для конструирования DVD-Ig человека (сходная аффинность, сходная нейтрализующая активность, сходное время полужизни и т.д.). Эту же концепцию применяют для моделей на животных у других не являющихся грызунами видов, где полученные из "совпадающих заместительных антител" DVD-Ig можно выбирать для планируемых фармакологических исследований и, возможно, исследований безопасности. В дополнение к стандартным оценкам безопасности этих пар мишеней могут требоваться и являться полезными в выборе лучших пар мишеней специфичные тесты на степень иммуносупрессии (см. Luster et al. (1994) Toxicol. 92(l-3):229-43; Descotes et al. (1992) Devel. Biol. Standardiz. 77:99-102; Jones (2000) IDrugs 3(4):442-6).

Молекулы DVD-Ig по изобретению могут связывать одну или несколько мишеней, вовлеченных в хронические нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера. Такие мишени в качестве неограничивающих примеров включают любой медиатор, растворимый или на клеточной поверхности, вовлеченный в патогенез AD, например, AGE (S100 A, амфотерин), провоспалительные цитокины (например, IL-1), хемокины (например, MCP 1), молекулы, ингибирующие регенерацию нервов (например, Nogo, RGM A), молекулы, усиливающие рост нейритов (нейротрофины), и молекулы, которые могут опосредовать транспорт через гематоэнцефалический барьер (например, рецептор трансферрина, рецептор инсулина или RAGE). Эффективность молекул DVD-Ig можно подтверждать в преклинических моделях на животных, таких как трансгенные мыши, у которых сверхэкспрессируются белок-предшественник амилоида или RAGE и развиваются симптомы, подобные болезни Альцгеймера. Кроме того, молекулы DVD-Ig можно конструировать и тестировать по эффективности в моделях на животных, и лучшие терапевтические DVD-Ig можно выбирать для тестирования у являющихся человеком пациентов. Молекулы DVD-Ig также можно применять для лечения других нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона. В патологию болезни Паркинсона вовлечен альфа-синуклеин. DVD-Ig, направленные к альфа-синуклеину и воспалительным медиаторам, таким как TNF, IL-1, MCP-1, могут обеспечивать эффективную терапию болезни Паркинсона и предусмотрены в изобретении.

7.2. Нейрональная регенерация и повреждение спинного мозга

Несмотря на увеличение знания патологических механизмов, повреждение спинного мозга (SCI) все еще остается тяжелым состоянием и представляет собой медицинское состояние, характеризуемое высокой необходимостью в медицинской помощи. Большинство повреждений спинного мозга представляют собой контузионные или компрессионные повреждения, и первичное повреждение, как правило, сопровождается вторичными повреждающими механизмами (воспалительными медиаторами, например, цитокинами и хемокинами), которые усугубляют исходное повреждение и приводят к значительному расширению области повреждения, иногда более чем в 10 раз. Эти первичные и вторичные механизмы при SCI являются очень сходными с механизмами при повреждениях головного мозга, вызываемых другим образом, например, инсультом. Удовлетворяющего лечения не существует и единственным используемым лечением является болюсная инъекция высокой дозы метилпреднизолона (MP) в узком временном окне в пределах 8 часов после повреждения. Однако это лечение предназначено только для предотвращения вторичного повреждения без обеспечения какого-либо значимого функционального восстановления. Его сильно критикуют за отсутствие однозначной эффективности и тяжелые неблагоприятные воздействия, такие как иммуносупрессия с последующей инфекцией и тяжелые гистопатологические мышечные изменения. Другие лекарственные средства, биологические препараты или низкомолекулярные соединения, стимулирующие эндогенный регенеративный потенциал, не одобрены, но в последние годы в моделях SCI на животных продемонстрировали эффективность перспективные принципы лечения и кандидаты в лекарственные средства. В значительной степени отсутствие функционального восстановления при SCI у человека вызвано факторами, ингибирующими рост невритов в участках повреждения, в ткани рубца, в миелине, а также ассоциированных с повреждением клетках. Такие факторы представляют собой ассоциированные с миелином белки NogoA, OMgp и MAG, RGM A, ассоциированные с рубцами CSPG (хондроитинсульфатпротеогликаны) и ингибирующие факторы на реакционноспособных астроцитах (некоторые семафорины и эфрины). Однако в очаге повреждения обнаружены не только ингибирующие рост молекулы, но также и факторы, стимулирующие рост невритов, такие как нейротрофины, ламинин, L1 и другие. Эта совокупность ингибирующих рост и стимулирующих рост невритов молекул может объяснить, почему блокирование отдельных факторов, таких как NogoA или RGM A, приводит к значительному функциональному восстановлению в модели SCI на грызунах, так как снижение ингибирующего воздействия может сдвигать баланс от ингибирования роста к стимуляции роста. Однако восстановление, наблюдаемое при блокировании одной ингибирующей рост нейритов молекулы, являлось не полным. Для достижения более быстрого и более выраженного восстановления может быть желаемым блокирование двух ингибирующих рост нейритов молекул, например, Nogo и RGM A, или блокирование ингибирующей рост нейритов молекулы и усиление функции увеличивающей рост нейритов молекулы, например, Nogo и нейротрофинов, или блокирование ингибирующей рост нейритов молекулы, например, Nogo, и провоспалительной молекулы, например, TNF (см. McGee et al. (2003) Trends Neurosci. 26:193; Domeniconi et al. (2005) J. Neurol. Sci. 233:43; Makwanal et al. (2005) FEBS J. 272:2628; Dickson (2002) Science 298:1959; Teng, et al. (2005) J. Neurosci. Res. 79:273; Kamezis et al. (2004) Nature Neurosci. 7:736; Xu et al. (2004) J. Neurochem. 91:1018).

В одном из аспектов предоставлены DVD-Ig, связывающие пары мишеней, такие как NgR и RGM A; NogoA и RGM A; MAG и RGM A; OMGp и RGM A; RGM A и RGM B; CSPGs и RGM A; аггрекан, мидкин, нейрокан, версикан, фосфакан, Te38 и TNFα; специфичные к Aβ глобуломерам антитела, комбинируемые с антителами, стимулирующими рост дендритов и аксонов. Патология дендритов является очень ранним признаком AD и известно, что NOGO A ограничивает рост дендритов. Можно комбинировать Ab такого типа с любым Ab к кандидатам для SCI (белкам миелина). Другие мишени DVD-Ig могут включать любую комбинацию NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG или Omgp. Кроме того, мишени также могут включать любой медиатор, растворимый или на клеточной поверхности, вовлеченный в ингибирование нейритов, например, Nogo, Ompg, MAG, RGM A, семафорины, эфрины, растворимый A-b, провоспалительные цитокины (например, IL-1), хемокины (например, MIP 1a), молекулы, ингибирующие регенерацию нервов. Эффективность антитела к nogo/антитела к RGM A или подобных молекул DVD-Ig можно подтверждать в преклинических моделях повреждения спинного мозга на животных. Кроме того, эти молекулы DVD-Ig можно конструировать и тестировать по эффективности в моделях на животных, а лучшие терапевтические DVD-Ig можно выбирать для тестирования у являющихся человеком пациентов. Кроме того, можно конструировать молекулы DVD-Ig, направленные к двум различным участкам связывания лиганда на одном рецепторе, например, рецепторе Nogo, связывающем три лиганда Nogo, Ompg и MAG, и RAGE, связывающем A-b и S100 A. Кроме того, ингибиторы роста нейритов, например, nogo и рецептор nogo, также играют роль в предотвращении регенерации нервов при иммунологических заболеваниях, подобных рассеянному склерозу. Показано, что ингибирование взаимодействия nogo-рецептор nogo увеличивает восстановление в моделях рассеянного склероза на животных. Таким образом, молекулы DVD-Ig, которые могут блокировать функцию одного иммуномедиатора, например, цитокина, такого как IL-12, и молекулу ингибитора роста нейритов, например, nogo или RGM, могут обеспечивать более быстрое и сильное действие, чем блокирование только иммуномедиатора или молекулы ингибитора роста нейритов.

Как правило, антитела эффективным и существенным образом не пересекают гематоэнцефалический барьер (BBB). Однако при некоторых неврологических заболеваниях, например, инсульте, травматическом повреждении головного мозга, рассеянном склерозе и т.д., BBB может нарушаться и позволять повышенное проникновение DVD-Ig и антител в головной мозг. При других патологических неврологических состояниях, где проницаемости BBB не наступает, можно использовать направленность к эндогенным системам транспорта, включая опосредуемые переносчиками транспортеры, такими как переносчики глюкозы и аминокислот и опосредуемые рецептором опосредующие трансцитоз клеточные структуры/рецепторы на эндотелии сосудов BBB, таким образом, обеспечивая транспорт DVD-Ig через BBB. Структуры в BBB, обеспечивающие такой транспорт в качестве неограничивающих примеров включают рецептор инсулина, рецептор трансферрина, LRP и RAGE. Кроме того, эти стратегии позволяют также использовать DVD-Ig в качестве челночного переносчика для транспорта потенциальных лекарственных средств, включающих низкомолекулярные лекарственные средства, наночастицы и нуклеиновые кислоты, в ЦНС (Coloma et al. (2000) Pharm Res. 17(3):266-74; Boado et al. (2007) Bioconjug. Chem. 18(2):447-55).

8. Онкологические нарушения

Лечение моноклональными антителами стало важной терапевтической возможностью для лечения злокачественных опухолей (von Mehren et al. (2003) Annu. Rev. Med. 54:343-69). Антитела могут проявлять противоопухолевое действие, индуцируя апоптоз, перенаправляя цитотоксичность, препятствуя взаимодействиям лиганд-рецептор или предотвращая экспрессию белков, критичных для неопластического фенотипа. Кроме того, антитела можно направлять к компонентам микроокружения опухолей, нарушая жизненно важные структуры, такие как формирование ассоциированной с опухолью сосудистой системы. Антитела также можно направлять к рецепторам, лигандами которых являются факторы роста, таким как рецептор эпидермального фактора роста. Таким образом, антитела, связываясь с опухолевыми клетками-мишенями, ингибируют природные лиганды, которые стимулируют рост клеток. Альтернативно, антитела могут индуцировать антиидиотипическую сеть, опосредуемую комплементом цитотоксичность или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Есть основания полагать, что использования антител с двойной специфичностью, направленных к двум отдельным опухолевым медиаторам, обеспечит дополнительную пользу по сравнению с моноспецифической терапией.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает VEGF и фосфатидилсерин; VEGF и ErbB3; VEGF и PLGF; VEGF и ROBO4; VEGF и BSG2; VEGF и CDCP1; VEGF и ANPEP; VEGF и c-MET; HER-2 и ERB3; HER-2 и BSG2; HER-2 и CDCP1; HER-2 и ANPEP; EGFR и CD64; EGFR и BSG2; EGFR и CDCP1; EGFR и ANPEP; IGF1R и PDGFR; IGF1R и VEGF; IGF1R и CD20; CD20 и CD74; CD20 и CD30; CD20 и DR4; CD20 и VEGFR2; CD20 и CD52; CD20 и CD4; HGF и c-MET; HGF и NRP1; HGF и фосфатидилсерин; ErbB3 и IGF1R; ErbB3 и IGF1,2; c-Met и Her-2; c-Met и NRP1; c-Met и IGF1R; IGF1,2 и PDGFR; IGF1,2 и CD20; IGF1,2 и IGF1R; IGF2 и EGFR; IGF2 и HER2; IGF2 и CD20; IGF2 и VEGF; IGF2 и IGF1R; IGF1 и IGF2; PDGFRa и VEGFR2; PDGFRa и PLGF; PDGFRa и VEGF; PDGFRa и c-Met; PDGFRa и EGFR; PDGFRb и VEGFR2; PDGFRb и c-Met; PDGFRb и EGFR; RON и c-Met; RON и MTSP1; RON и MSP; RON и CDCP1; VGFR1 и PLGF; VGFR1 и RON; VGFR1 и EGFR; VEGFR2 и PLGF; VEGFR2 и NRP1; VEGFR2 и RON; VEGFR2 и DLL4; VEGFR2 и EGFR; VEGFR2 и ROBO4; VEGFR2 и CD55; LPA и SIP; EPHB2 и RON; CTLA4 и VEGF; CD3 и EPCAM; CD40 и IL6; CD40 и IGF; CD40 и CD56; CD40 и CD70; CD40 и VEGFR 1; CD40 и DR5; CD40 и DR4; CD40 и APRIL; CD40 и BCMA; CD40 и RANKL; CD28 и MAPG; CD80 и CD40; CD80 и CD30; CD80 и CD33; CD80 и CD74; CD80 и CD2; CD80 и CD3; CD80 и CD19; CD80 и CD4; CD80 и CD52; CD80 и VEGF; CD80 и DR5; CD80 и VEGFR2; CD22 и CD20; CD22 и CD80; CD22 и CD40; CD22 и CD23; CD22 и CD33; CD22 и CD74; CD22 и CD19; CD22 и DR5; CD22 и DR4; CD22 и VEGF; CD22 и CD52; CD30 и CD20; CD30 и CD22; CD30 и CD23; CD30 и CD40; CD30 и VEGF; CD30 и CD74; CD30 и CD19; CD30 и DR5; CD30 и DR4; CD30 и VEGFR2; CD30 и CD52; CD30 и CD4; CD138 и RANKL; CD33 и FTL3; CD33 и VEGF; CD33 и VEGFR2; CD33 и CD44; CD33 и DR4; CD33 и DR5; DR4 и CD137; DR4 и IGF1,2; DR4 и IGF1R; DR4 и DR5; DR5 и CD40; DR5 и CD137; DR5 и CD20; DR5 и EGFR; DR5 и IGF1,2; DR5 и IGFR, DR5 и HER-2 и EGFR и DLL4. Другие комбинации мишеней включают одного или нескольких представителей семейства EGF/erb-2/erb-3. Другие мишени (одна или несколько), вовлеченные в онкологические заболевания, которые могут связывать DVD-Ig, в качестве неограничивающих примеров включают мишени, выбранные из группы, состоящей из: CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSF10, BMP6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF1R, IL2, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, IL1A, IL1B, ODZ1, PAWR, PLG, TGFB1I1, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, ENO1, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOX5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NR0B1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1, APOC1, BRCA1, CHGA, CHGB, CLU, COL1A1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1, FGF 10, FGF11, FGF 13, FGF14, FGF16, FGF 17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZ1, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1, CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROBO2, CD44, ILK, ITGA1, APC, CD164, COL6A1, MTSS1, PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2, CANT1, CAV1, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB2IP, DES, DNCL1, ELAC2, ENO2, ENO3, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1, GAGEC1, GGT1, GSTP1, HIP1, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAI1, KRT2A, MIB1, PART1, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPM1, TPM2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1, JAG1, KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1, STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAI1, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECAM1, PF4, PROK2, SERPINF1, TNFΑIP2, CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL18A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-кадгерина), CDKN1B (p27Kip1), CDKN2A (p16INK4a), COL6A1, CTNNB1 (b-катепсина), CTSB (катепсина B), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOSL1 (FRA-1), GATA3, GSN (гельзолина), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (гликопротеина 130), ITGA6 (интегрина a6), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), MKI67 (Ki-67), NGFB (NGF), NGFR, NME1 (NM23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, SERPINB5 (маспина), SERPINE1 (PAI-1), TGFA, THBS1 (тромбоспондина 1), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A (топоизомеразы Iia), TP53, AZGP1 (цинк-a-гликопротеина), BPAG1 (плектина), CDKN1A (p21Wap1/CipI), CLDN7 (клаудина-7), CLU (кластерина), ERBB2 (Her-2), FGF1, FLRT1 (фибронектина), GABRP (GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6 (интегрина a6), ITGB4 (интегрина b4), KLF5 (GC Box BP), KRT19 (кератина 19), KRTHB6 (специфичного для волос кератина типа II), MACMARCKS, MT3 (металлотионектина-III), MUC1 (муцина), PTGS2 (COX-2), RAC2 (p21Rac2), S100A2, SCGB1D2 (липофилина B), SCGB2A1 (маммаглобина 2), SCGB2A2 (маммаглобина 1), SPRR1B (Spr1), THBS1, THBS2, THBS4, и TNFΑIP2 (B94), RON, c-Met, CD64, DLL4, PLGF, CTLA4, фосфатидилсерина, ROBO4, CD80, CD22, CD40, CD23, CD28, CD80, CD55, CD38, CD70, CD74, CD30, CD138, CD56, CD33, CD2, CD137, DR4, DR5, RANKL, VEGFR2, PDGFR, VEGFR1, MTSP1, MSP, EPHB2, EPHA1, EPHA2, EpCAM, PGE2, NKG2D, LPA, SIP, APRIL, BCMA, MAPG, FLT3, PDGFR альфа, PDGFR бета, ROR1, PSMA, PSCA, SCD1 и CD59.

IV. Фармацевтические композиции

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим связывающий белок по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции, содержащие связывающие белки по изобретению, предназначены для применения, но не ограничиваясь ими, в диагностике, детекции или мониторинге нарушения, в предотвращении (например, подавлении или задержке начала заболевания, нарушения или другого патологического состояния), лечении, ведении или улучшении состояния нарушения или одного или нескольких его симптомов и/или в исследованиях. В конкретном варианте осуществления композиция содержит один или несколько связывающих белков по изобретению. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит один или несколько связывающих белки по изобретению и одно или несколько профилактических или терапевтических средств, отличных от связывающих белков по изобретению, для лечения нарушения. В одном из вариантов осуществления профилактические или терапевтические средства пригодны или их использовали или в настоящее время используют для предотвращения, лечения, ведения или улучшения состояния нарушения или одного или нескольких его симптомов. В соответствии с этими вариантами осуществления композиция может дополнительно содержать носитель, разбавитель или эксципиент.

Связывающие белки по изобретению можно вводить в фармацевтические композиции, подходящие для введения индивидууму. Как правило, фармацевтическая композиция содержит связывающий белок по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любой и все растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, средства обеспечения изотоничности и задержки всасывания и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают одно или несколько из воды, физиологического раствора, фосфатно-солевого буфера, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также их сочетаний. В некоторых вариантах осуществления в композицию включают средства обеспечения изотоничности, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как средства для смачивания или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность антитела или части антитела.

Известны различные системы доставки, и их можно использовать для введения одного или нескольких антител по изобретению или комбинации одного или нескольких антител по изобретению и профилактического средства или терапевтического средства, пригодных для предотвращения, ведения, лечения или улучшения состояния нарушения или одного или нескольких его симптомов, например, инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать антитело или фрагмент антитела, опосредуемый рецептором эндоцитоз (см., например, Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструкции нуклеиновой кислоты в виде части ретровирусного или другого вектора и т.д. Способы введения профилактического или терапевтического средства по изобретению в качестве неограничивающих примеров включают парентеральное введение (например, интрадермальное, внутримышечное, интраперитонеальное, внутривенное и подкожное), эпидуральное введение, внутриопухолевое введение и введение в слизистую (например, интраназальный и пероральный маршруты). Кроме того, можно использовать легочное введение, например, посредством применения ингалятора или распылителя и состава с образующим аэрозоль средством. См., например, патенты США №№ 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540 и 4880078 и публикации PCT №№ WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346 и WO 99/66903. В одном из вариантов осуществления связывающий белок по изобретению, комбинированное терапевтическое средство или композицию по изобретению вводят с использованием технологии легочной доставки лекарственного средства Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). В конкретном варианте осуществления профилактические или терапевтические средства по изобретению вводят внутримышечно, внутривенно, внутрь опухоли, перорально, интраназально, легочным способом или подкожно. Профилактические или терапевтические средства можно вводить любым подходящим способом, например, посредством инфузии или болюсной инъекции, посредством всасывания через эпителиальные или кожно-слизистые слои (например, слизистую рта, слизистую прямой кишки и остальных отделов кишечника и т.д.), и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным.

В одном из вариантов осуществления для направления к опухолевым клеткам можно использовать специфическое связывание с опухолевыми клетками связанных с антителами углеродных нанотрубок (CNT) in vitro с их последующим высокоспецифичным разрушением светом в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR). Например, биотинилированные полярные липиды можно использовать для получения стабильных, биологически совместимых, нецитотоксичных дисперсий с CNT, которые затем связывают с одним или двумя различными дериватизированными авидином NeutraLite DVD-Ig к одному или нескольким опухолевым антигенам (например, CD22) (Chakravarty et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:8697-8702.

В конкретном варианте осуществления может быть желательным вводить профилактические или терапевтические средства по изобретению местно в область, нуждающуюся в лечении; этого можно достигать, например, а не в качестве ограничения, посредством местной инфузии, посредством инъекции или посредством имплантата, где указанный имплантат является пористым или непористым веществом, содержащим мембраны и матриксы, такие как сиаластовые мембраны, полимеры, волокнистые матриксы (например, Tissuel®) или коллагеновые матриксы. В одном из вариантов осуществления индивидууму в поврежденную область для предотвращения, лечения или ведения и/или улучшения состояния нарушения или его симптомов местно вводят эффективное количество одного или нескольких антител антагонистов по изобретению. В другом варианте осуществления индивидууму в пораженную область для предотвращения, лечения, ведения и/или улучшения состояния нарушения или одного или нескольких его симптомов местно вводят эффективное количество одного или нескольких антител по изобретению в комбинации с эффективным количеством одного или нескольких терапевтических средств (например, одного или нескольких профилактических или терапевтических средств), отличных от связывающего белка по изобретению.

В другом варианте осуществления профилактическое или терапевтическое средство можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением или длительным высвобождением. В одном из вариантов осуществления для достижения контролируемого или длительного высвобождения можно использовать насос (см. Langer, выше; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507; Saudek et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321:574). В другом варианте осуществления для достижения контролируемого или длительного высвобождения терапевтических средств по изобретению можно использовать полимерные материалы (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas (1983) J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105); патенты США №№ 5679377; 5916597; 5912015; 5989463; 5128326; публикации PCT №№ WO 99/15154 и WO 99/20253. Примеры полимеров, используемых в составах с длительным высвобождением, в качестве неограничивающих примеров включают поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(акриловую кислоту), сополимер этилена и винилацетата, поли(метакриловую кислоту), полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли(N-винилпирролидон), поли(виниловый спирт), полиакриламид, поли(этиленгликоль), полилактиды (PLA), сополимеры лактида с гликолидами (PLGA) и сложные полиортоэфиры. В одном из вариантов осуществления полимер, используемый в составе с длительным высвобождением, является инертным, не содержащим водорастворимых примесей, стабильным при хранении, стерильным и биологически разрушаемым. В еще одном варианте осуществления система с контролируемым или длительным высвобождением может находиться вблизи от мишени профилактического или терапевтического лечения, таким образом, требуя только части системной дозы (см., например, Goodson (1984) in Medical Applications of Controlled Release, supra, 2:115-138).

Системы с контролируемым высвобождением описаны в обзоре Langer (1990) Science 249:1527-1533). Для получения составов с длительным высвобождением, содержащих одно или несколько терапевтических средств по изобретению, можно использовать любой известный специалисту в данной области способ. См., например, патент США № 4526938, публикации PCT №№ WO 91/05548 и WO 96/20698, Ning et al. (1996) Radiother. Oncol. 39:179-189, Song et al. (1995) PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50:372-397; Cleek et al. (1997) Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; и Lam et al. (1997) Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.

В конкретном варианте осуществления, где композиция по изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую профилактическое или терапевтическое средство, нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo с обеспечением экспрессии кодируемого ей профилактического или терапевтического средства, конструируя ее как часть подходящего экспрессирующего вектора нуклеиновой кислоты и вводя ее так, чтобы она становилась внутриклеточной, например, используя ретровирусный вектор (см. патент США № 4980286), или посредством прямой инъекции, или используя бомбардировку микрочастицами (например, генную пушку; Biolistic, Dupont), или покрытия с липидами или рецепторами клеточной поверхности или средствами для трансфекции, или вводя ее в связи с гомеобокс-подобным пептидом, для которого известно, что он проникает в ядро (см., например, Joliot et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). Альтернативно, нуклеиновую кислоту для экспрессии можно вводить внутриклеточно и посредством гомологичной рекомбинации встраивать в ДНК клетки-хозяина.

Фармацевтическую композицию по изобретению формулируют так, чтобы она сочеталась с назначенным способом введения. Примеры способов введения в качестве неограничивающих примеров включают парентеральное, например, внутривенное, интрадермальное, подкожное, пероральное, интраназальное (например, ингаляцию), трансдермальное (например, топическое), трансмукозальное и ректальное введение. В конкретном варианте осуществления композицию стандартными способами формулируют в качестве фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного, подкожного, внутримышечного, перорального, интраназального или топического введения человеку. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. Когда необходимо, композиция также может содержать солюбилизатор и местный анестетик, такой как лидокаин, для уменьшения боли в участке инъекции.

Если композиции по изобретению необходимо вводить топически, композиции можно формулировать в форме мази, крема, трансдермального пластыря, лосьона, геля, шампуня, спрея, аэрозоля, раствора, эмульсии или другой формы, хорошо известной специалисту в данной области. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). В одном из вариантов осуществления для нераспыляемых топических лекарственных форм используют от вязких до полутвердых или твердых форм, содержащих носитель или один или несколько эксципиентов, сочетающихся с местным применением и с динамической вязкостью, большей чем у воды. Подходящие составы в качестве неограничивающих примеров включают растворы, суспензии, эмульсии, кремы, мази, порошки, линименты, бальзамы и т.п., которые при желании стерилизуют или смешивают с вспомогательными средствами (например, консервантами, стабилизаторами, средствами для смачивания, буферами или солями) для воздействия на различные свойства, например, такие как осмотическое давление. Другие подходящие топические лекарственные формы включают распыляемые аэрозольные препараты, где в одном из вариантов осуществления активный ингредиент в комбинации с твердым или жидким инертным носителем упаковывают в смеси с находящимся под давлением легкоиспаряющимся компонентом (например, с газом-вытеснителем, таким как фреон) или в бутылке под давлением. Также в фармацевтические композиции и лекарственные формы при желании можно добавлять увлажнители или средства для смачивания. Примеры таких дополнительных ингредиентов хорошо известны в данной области.

Если способ по изобретению включает интраназальное введение композиции, композицию можно формулировать в аэрозольной форме, спрея, аэрозоля или в форме капель. В частности, профилактические или терапевтические средства для применения по настоящему изобретению можно подходящим способом доставлять в форме подачи аэрозольного спрея из упаковок под давлением или распылителя с использованием подходящего газа-вытеснителя (например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа). В случае аэрозоля под давлением единицу дозирования можно определять, предоставляя клапан с подачей дозированного количества. Можно формулировать капсулы и гильзы (например, состоящие из желатина) для применения в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошковую смесь соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.

Если способ по изобретению включает пероральное введение, композиции можно формулировать для перорального приема в форме таблеток, капсул, крахмальных капсул, желатиновых капсул, растворов, суспензий и т.п. Таблетки или капсулы можно получать общепринятыми способами с использованием фармацевтически приемлемых эксципиентов, таких как связывающие средства (например, прежелатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазочные средства (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); дезинтегранты (например, картофельный крахмал или крахмалгликолят натрия) или средства для смачивания (например, лаурилсульфат натрия). На таблетки хорошо известными в данной области способами можно наносить покрытия. Жидкие препараты для перорального введения могут принимать формы, но не ограничиваясь ими, растворов, сиропов или суспензий, или их можно предоставлять в качестве высушенного продукта для восстановления водой или другим подходящим носителем перед применением. Такие жидкие препараты можно получать общепринятыми способами с использованием фармацевтически приемлемых добавок, таких как суспендирующие средства (например, сорбитный сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгаторы (например, лецитин или гуммиарабик); неводные носители (например, миндальное масло, сложные эфиры масел, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Также при необходимости препараты могут содержать буферные соли, ароматизаторы, красители и подсластители. Препараты для перорального введения можно соответствующим способом формулировать для замедленного высвобождения, контролируемого высвобождения или длительного высвобождения профилактических или терапевтических средств(а).

Способ по изобретению может включать легочное введение композиции, формулируемой с образующим аэрозоль средством, например, посредством применения ингалятора или распылителя. См., например, патенты США №№ 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540; и 4880078 и публикации PCT №№ WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346 и WO 99/66903. В конкретном варианте осуществления связывающий белок по изобретению, комбинированное терапевтическое средство и/или композицию по изобретению вводят с использованием технологии легочной доставки лекарственного средства Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).

Способ по изобретению может включать введение композиции, сформулированной для парентерального введения, посредством инъекции (например, посредством болюсной инъекции или непрерывной инфузии). Составы для инъекции можно предоставлять в стандартной лекарственной форме (например, в ампулах или в контейнерах с несколькими дозами) с добавленным консервантом. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы и эмульсии в масляных или водных носителях, и могут содержать средства для формулирования, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, активный ингредиент может находиться в форме порошка для восстановления подходящим носителем (например, стерильной не содержащей пирогенов водой) перед применением.

Способы по изобретению могут дополнительно включать введение композиций, сформулированных в виде депо-препаратов. Такие длительно действующие составы можно вводить посредством имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или посредством внутримышечной инъекции. Таким образом, например, композиции можно формулировать с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде постепенно растворимых производных (например, в виде постепенно растворимой соли).

Способы по изобретению включают введение композиций, сформулированных в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, формируемые с анионами, такими как анионы, происходящие из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и соли, формируемые с катионами, такими как катионы, происходящие из гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.

Как правило, ингредиенты композиций поставляют раздельно или смешанными вместе в стандартной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметически закрытом контейнере, таком как ампула или саше с указанием количества активного средства. Когда способ введения представляет собой инфузию, композицию можно помещать во флакон для инфузий, содержащий стерильную воду фармацевтического качества или физиологический раствор. Когда способ введения представляет собой инъекцию, можно предоставлять ампулу со стерильной водой для инъекции или физиологическим раствором с тем, чтобы можно было смешивать ингредиенты до введения.

В частности, изобретение также относится к тому, что одно или несколько профилактических или терапевтических средств или фармацевтические композиции по изобретению помещают в герметически закрытый контейнер, такой как ампула или саше, с указанием количества средства. В одном из вариантов осуществления одно или несколько профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по изобретению поставляют в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметически закрытом контейнере, и их можно восстанавливать (например, водой или физиологическим раствором) до концентраций, подходящих для введения индивидууму. В одном из вариантов осуществления одно или несколько профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по изобретению поставляют в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметически закрытом контейнере с единицей дозирования по меньшей мере 5 мг, по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 15 мг, по меньшей мере 25 мг, по меньшей мере 35 мг, по меньшей мере 45 мг, по меньшей мере 50 мг, по меньшей мере 75 мг или по меньшей мере 100 мг. Лиофилизированные профилактические или терапевтические средства или фармацевтические композиции по изобретению следует хранить при температурах от 2°C до 8°C в их исходном контейнере, и профилактические или терапевтические средства или фармацевтические композиции по изобретению следует вводить в течение 1 недели, например, в течение 5 суток, в течение 72 часов, в течение 48 часов, в течение 24 часов, в течение 12 часов, в течение 6 часов, в течение 5 часов, в течение 3 часов или в течение 1 часа после восстановления. В альтернативном варианте осуществления одно или несколько профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по изобретению поставляют в жидкой форме в герметически закрытом контейнере с указанием количества и концентрации средства. В одном из вариантов осуществления жидкую форму вводимой композиции поставляют в герметически закрытом контейнере по меньшей мере при 0,25 мг/мл, по меньшей мере при 0,5 мг/мл, по меньшей мере при 1 мг/мл, по меньшей мере при 2,5 мг/мл, по меньшей мере при 5 мг/мл, по меньшей мере при 8 мг/мл, по меньшей мере при 10 мг/мл, по меньшей мере при 15 мг/кг, по меньшей мере при 25 мг/мл, по меньшей мере при 50 мг/мл, по меньшей мере при 75 мг/мл или по меньшей мере при 100 мг/мл. Жидкую форму следует хранить при температурах от 2°C до 8°C в ее исходном контейнере.

Связывающие белки по изобретению можно вводить в фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения. В одном из вариантов осуществления антитело или части антитела получают в виде инъецируемого раствора, содержащего 0,1-250 мг/мл связывающего белка. Инъецируемый раствор может состоять из жидкой или лиофилизированной лекарственной формы во флаконе, ампуле или предварительно заполненном шприце из бесцветного или темного стекла. Буфер может представлять собой L-гистидин (1-50 мМ), оптимально 5-10 мМ, при pH от 5,0 до 7,0 (оптимально pH 6,0). Другие подходящие буферы в качестве неограничивающих примеров включают сукцинат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия или фосфат калия. Для изменения токсичности раствора можно использовать хлорид натрия в концентрации 0-300 мМ (для жидкой лекарственной формы оптимально 150 мМ). В лиофилизированную лекарственную форму можно включать криопротекторы, предпочтительно 0-10% сахарозу (оптимально 0,5-1,0%). Другие подходящие криопротекторы включают трегалозу и лактозу. В лиофилизированную лекарственную форму можно включать наполнители, предпочтительно 1-10% маннит (оптимально 2-4%). В жидкой и лиофилизированной лекарственной формах можно использовать стабилизаторы, предпочтительно 1-50 мМ L-метионин (оптимально 5-10 мМ). Другие подходящие наполнители включают глицин и аргинин, любой из которых можно добавлять в концентрации 0-0,05%, и полисорбат-80 (оптимально добавляемый в концентрации 0,005-0,01%). Фармацевтическая композиция, содержащая связывающие белки по изобретению, получаемая в виде инъецируемого раствора для парентерального введения, может дополнительно содержать средство, пригодное в качестве вспомогательного средства, такое как средства, используемые для усиления всасывания или диспергирования терапевтического белка (например, антитело). Особенно пригодным вспомогательным средством является гиалуронидаза, такая как Hylenex® (рекомбинантная гиалуронидаза человека). Добавление в инъецируемый раствор гиалуронидазы улучшает биодоступность у человека после парентерального введения, в частности подкожного введения. Также оно обеспечивает больший объем участка введения (т.е., более 1 мл) с меньшей болью и дискомфортом, и минимальную частоту реакций в участках инъекции (см. публикацию PCT № WO2004078140 и патентную заявку США № 2006104968).

Композиции по настоящему изобретению могут находиться во множестве форм. Например, они включают жидкую, полутвердую и твердую лекарственную формы, такие как жидкие растворы (например, инъецируемые и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Выбираемая форма зависит от назначенного способа введения и терапевтического применения. Типичные композиции находятся в форме инъецируемых или инфузионных растворов, таких как композиции, подобные тем, что используют для пассивной иммунизации людей другими антителами. Выбранным способом введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, интраперитонеальный, внутримышечный). В одном из вариантов осуществления антитело вводят посредством внутривенных инфузии или инъекции. В другом варианте осуществления антитело вводят посредством внутримышечной или подкожной инъекции.

Как правило, терапевтические композиции в условиях производства и хранения должны быть стерильными и стабильными. Композицию можно формулировать в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные инъецируемые растворы можно получать, вводя требуемое количество активного соединения (т.е., антитела или часть антитела) в подходящий растворитель, при необходимости с одним или комбинацией ингредиентов, приведенных в настоящем документе, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии получают, вводя активное соединение в стерильный носитель, содержащий основную диспергирующую среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных в настоящем документе. В случае стерильных лиофилизированных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов способы получения представляют собой вакуумную сушку и сушку распылением, позволяющие получать порошок активного ингредиента с любым дополнительным желаемым ингредиентом из его предварительно стерилизованного фильтрованием раствора. Надлежащую текучесть раствора можно поддерживать, например, посредством использования покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и посредством использования поверхностно-активного вещества. Длительного всасывания инъецируемых композиций можно добиваться, включая в композицию средства, замедляющие всасывание, например, моностеаратные соли и желатин.

Связывающие белки по настоящему изобретению можно вводить множеством известных в данной области способов, хотя для многих терапевтических применений в одном из вариантов осуществления маршрут/способ введения представляет собой подкожную инъекцию, внутривенную инъекцию или инфузию. Как будет понятно специалисту в данной области, маршрут и/или способ введения варьирует в зависимости от желаемых результатов. В определенных вариантах осуществления активное соединение можно получать с использованием носителя, защищающего соединение от быстрого высвобождения, такого как состав с контролируемым высвобождением, включающий имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биологически разрушаемые, биологически совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Запатентовано или специалистам в данной области общеизвестно множество способов получения таких составов. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

В определенных вариантах осуществления связывающий белок по изобретению можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или усваиваемым съедобным носителем. Соединение (и, при желании, другие ингредиенты) также можно помещать в желатиновые капсулы с твердой или мягкой оболочкой, прессовать в таблетки или вводить индивидууму непосредственно с пищей. Для перорального терапевтического введения соединения можно добавлять с эксципиентами и использовать в форме принимаемых внутрь таблеток, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, пластин и т.п. Для введения соединения по изобретению способом, отличным от парентерального введения, необходимым может являться покрытие соединения или совместное введение соединения с веществом, предотвращающим его инактивацию.

Также в композиции можно добавлять дополнительные активные соединения. В определенных вариантах осуществления связывающий белок по изобретению совместно формулируют и/или совместно вводят с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, пригодными для лечения нарушений со связывающим белком по изобретению. Например, связывающий белок по изобретению можно совместно формулировать и/или совместно вводить с одним или несколькими дополнительными антителами, связывающими другие мишени (например, антитела, связывающие другие цитокины или связывающие молекулы клеточной поверхности). Кроме того, одно или несколько антител по изобретению можно использовать в комбинации с двумя или более из указанных выше терапевтических средств. В таких способах комбинированного лечения предпочтительно можно использовать меньшие дозы вводимых терапевтических средств, таким образом, избегая возможной токсичности или осложнений, ассоциированных с различными видами монотерапии.

В определенных вариантах осуществления связывающий белок связан с увеличивающим время полужизни носителем, известным в данной области. Такие носители в качестве неограничивающих примеров включают домен Fc, полиэтиленгликоль и декстран. Такие носители описаны, например, в патенте США № 6660843 и публикации PCT № WO 99/25044.

В конкретном варианте осуществления вводят последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие связывающий белок по изобретению или другое профилактическое или терапевтическое средство по изобретению, для лечения, предотвращения, ведения или улучшение состояния нарушения или одного или нескольких его симптомов посредством генотерапии. Генотерапия относится к терапии, проводимой посредством введения индивидууму экспрессированной или экспрессируемой нуклеиновой кислоты. В этом варианте осуществления изобретения посредством нуклеиновых кислот получают кодируемое ими антитело или профилактическое или терапевтическое средство по изобретению, которые опосредуют профилактическое или терапевтическое действие.

По настоящему изобретению можно использовать любой из способов генотерапии, доступный в данной области. Для общего обзора способов генотерапии см. Goldspiel et al. (1993) Clin. Pharm. 12:488-505; Wu and Wu (1991) Biother. 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; и Morgan and Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May (1993) TIBTECH 11(5):155-215. Способы, общеизвестные в области технологии рекомбинантных ДНК, которые можно использовать, описаны в Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); и Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Подробное описание различных способов генотерапии приведено в US20090297514.

Связывающие белки по изобретению пригодны для лечения различных заболеваний, где причиняют ущерб мишени, распознаваемые связывающими белками. Такие заболевания в качестве неограничивающих примеров включают ревматоидный артрит, остеоартрит, юношеский хронический артрит, септический артрит, артрит Лайма, псориатический артрит, реактивный артрит, спондилоартропатию, системную красную волчанку, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, инсулинозависимый сахарный диабет, тиреоидит, астму, аллергические заболевания, псориаз, дерматит, склеродермию, реакцию "трансплантат против хозяина", отторжение трансплантата-органа, острое или хроническое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органа, саркоидоз, атеросклероз, диссеминированное внутрисосудистое свертывание, синдром Кавасаки, болезнь Грейва, нефротический синдром, синдром хронической усталости, гранулематоз Вегенера, пурпуру Шенлейна-Геноха, микроскопический васкулит почек, хронический активный гепатит, увеит, септический шок, синдром токсического шока, септический синдром, кахексию, инфекционные заболевания, паразитарные заболевания, синдром приобретенного иммунодефицита, острый поперечный миелит, хорею Хантингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, инсульт, первичный биллиарный цирроз, гемолитическую анемию, злокачественные новообразования, сердечную недостаточность, инфаркт миокарда, болезнь Аддисона, спорадическую полигландулярную недостаточность типа I и полигландулярную недостаточность типа II, синдром Шмидта, респираторный дистресс-синдром взрослых (острый), алопецию, очаговую алопецию, серонегативную артропатию, артропатию, болезнь Рейтера, псориатическую артропатию, артропатию при язвенном колите, энтеропатический синовит, ассоциированные с хламидиями, иерсиниями и сальмонеллами артропатии, спондилоартропатию, атероматозное заболевание/атеросклероз, атопическую аллергию, аутоиммунное буллезное заболевание, обыкновенную пузырчатку, эксфолиативную пузырчатку, пемфигоид, IgA-зависимый линейный дерматоз, аутоиммунную гемолитическую анемию, гемолитическую анемию с положительным тестом Кумбса, приобретенную пернициозную анемию, юношескую пернициозную анемию, миалгический энцефалит/синдром хронической усталости, хронический кандидоз слизистых и кожи, гигантоклеточный артериит, первичный склерозирующий гепатит, криптогенный аутоиммунный гепатит, синдром приобретенного иммунодефицита, связанные с синдромом приобретенного иммунодефицита заболевания, гепатит B, гепатит C, общий варьирующий иммунодефицит (общую вариабельную гипогаммаглобулинемию), дилатационную кардиомиопатию, женское бесплодие, недостаточность яичников, преждевременную недостаточность яичников, легочный фиброз, криптогенный фиброзирующий альвеолит, поствоспалительную интерстициальную легочную болезнь, интерстициальный пневмонит, интерстициальную легочную болезнь, ассоциированную с болезнями соединительных тканей, легочную болезнь, ассоциированную со смешанными болезнями соединительной ткани, интерстициальную легочную болезнь, ассоциированную с системным склерозом, интерстициальную легочную болезнь, ассоциированную с ревматоидным артритом, легочную болезнь, ассоциированную с системной красной волчанкой, легочную болезнь, ассоциированную с дерматомиозитом/полимиозитом, легочную болезнь, ассоциированную с болезнью Шегрена, легочную болезнь, ассоциированную с анкилозирующим спондилитом, диффузную легочную болезнь с воспалением сосудов, легочную болезнь, ассоциированную с гемосидерозом, интерстициальную легочную болезнь, индуцированную лекарственными средствами, фиброз, лучевой фиброз, облитерирующий бронхиолит, хроническую эозинофильную пневмонию, лимфоцитарную инфильтративную легочную болезнь, постинфекционную интерстициальную легочную болезнь, подагрический артрит, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный гепатит 1 типа (классический аутоиммунный или волчаночный гепатит), аутоиммунный гепатит 2 типа (гепатит с антителами к LKM), опосредованную аутоиммунной реакцией гипогликемию, резистентность к инсулину типа B с акантокератодермией, гипопаратиреоз, острое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органа, хроническое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органа, остеоартроз, первичный склерозирующий холангит, псориаз типа 1, псориаз типа 2, идиопатическую лейкопению, аутоиммунную нейтропению, заболевание почек БДУ, гломерулонефриты, микроскопический васкулит почек, болезнь Лайма, дискоидную красную волчанку, мужское бесплодие, идиопатическое или БДУ, аутоиммунитет на компоненты спермы, рассеянный склероз (все подтипы), симпатическую офтальмию, легочную гипертензию, вторичную относительно болезни соединительных тканей, синдром Гудпасчера, легочные проявления узелкового периартериита, острую ревматическую лихорадку, ревматоидный спондилит, болезнь Стилла, системный склероз, синдром Шегрена, артериит/болезнь Такаясу, аутоиммунную тромбоцитопению, идиопатическую тромбоцитопению, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, гипертиреоз, аутоиммунный гипотиреоз с зобом (болезнь Хашимото), атрофический аутоиммунный гипотиреоз, первичную микседему, факогенный увеит, первичный васкулит, витилиго, острое заболевание печени, хронические заболевания печени, алкогольный цирроз, алкогольное поражение печени, холестаз, аллергическое заболевание печени, индуцированный лекарственными средствами гепатит, неалкогольный стеатогепатит, аллергию и астму, инфекцию стрептококками группы B (GBS), психические расстройства (например, депрессию и шизофрению), опосредуемые типом Th2 и типом Th1 заболевания, острую и хроническую боль (различные формы боли) и злокачественные опухоли, такие как рак легкого, молочной железы, желудка, мочевого пузыря, кишечника, поджелудочной железы, яичника, предстательной железы и прямой кишки и гемопоэтические злокачественные новообразования (лейкоз и лимфома), абеталипопротеинемию, акроцианоз, острые и хронические паразитарные или инфекционные процессы, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелолейкоз (AML), острую или хроническую бактериальную инфекцию, острый панкреатит, острую почечную недостаточность, аденокарциномы, эктопические систолы в полетах, комплекс СПИД/деменция, алкогольный гепатит, аллергический конъюнктивит, аллергический контактный дерматит, аллергический ринит, отторжение аллотрансплантата, недостаточность альфа-1-антитрипсина, боковой амиотрофический склероз, анемию, стенокардию, дегенерацию клеток переднего рога спинного мозга, терапию антителами к cd3, антифосфолипидный синдром, антирецепторные реакции гиперчувствительности, аортальные и периферические аневризмы, расслоение аорты, артериальную гипертензию, атеросклероз, артериовенозный анастомоз, атаксию, фибрилляцию предсердий (устойчивую или пароксизмальную), трепетание предсердий, атриовентрикулярную блокаду, B-клеточную лимфому, отторжение костного трансплантата, отторжение трансплантата костного мозга (BMT), блокаду ножки пучка Гиса, лимфому Беркитта, ожоги, аритмии сердца, синдром сердечного шока, опухоли сердца, кардиомиопатию, воспалительный ответ на сердечно-легочное шунтирование, отторжение трансплантата хряща, виды дегенерации коры мозжечка, мозжечковые нарушения, хаотическую или многофокусную предсердную тахикардию, ассоциированные с химиотерапией нарушения, хронический миелоцитарный лейкоз (CML), хронический алкоголизм, хронические воспалительные патологии, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), хроническую интоксикацию салицилатами, колоректальную карциному, застойную сердечную недостаточность, конъюнктивит, контактный дерматит, легочное сердце, ишемическую болезнь сердца, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, культуронегативный сепсис, кистозный фиброз, ассоциированные с терапией цитокинами нарушения, деменцию боксеров, демиелинизирующие заболевания, геморрагическую лихорадку Денге, дерматит, дерматологические состояния, диабет, сахарный диабет, диабетическую атеросклеротическую болезнь, болезнь диффузных телец Леви, дилатационную застойную кардиомиопатию, нарушения базальных ганглиев, синдром Дауна в среднем возрасте, индуцированные лекарственными средствами нарушения движения, индуцируемые лекарственными средствами, блокирующими дофаминовые рецепторы ЦНС, чувствительность к лекарственным средствам, экзему, энцефаломиелит, эндокардит, эндокринопатию, эпиглоттит, инфекцию вирусом Эпштейна-Барр, эритромелалгию, экстрапирамидальные и мозжечковые нарушения, семейный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, отторжение имплантата эмбрионального тимуса, атаксию Фридрейха, функциональные нарушения периферических артерий, грибковый сепсис, газовую гангрену, язву желудка, гломерулонефрит, отторжение трансплантата любого органа или ткани, грамотрицательный сепсис, грамположительный сепсис, гранулемы, вызываемые внутриклеточными организмами, волосатоклеточный лейкоз, болезнь Галлервордена-Шпатца, тиреоидит Хашимото, сенную лихорадку, отторжение трансплантата сердца, гемохроматоз, гемодиализ, гемолитический уремический синдром/тромболитическую тромбоцитопеническую пурпуру, кровотечение, гепатит (A), аритмии пучка Гиса, инфекцию ВИЧ/ВИЧ-нейропатию, болезнь Ходжкина, гиперкинетические нарушения движения, реакции гиперчувствительности, гиперчувствительный пневмонит, гипертензию, гипокинетические нарушения движения, оценку гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, идиопатическую болезнь Аддисона, идиопатический легочный фиброз, опосредуемую антителами цитотоксичность, астению, спинальную мышечную атрофию детского возраста, воспаление аорты, грипп A, ионизирующее радиоактивное облучение, иридоциклит/увеит/неврит зрительного нерва, реперфузионное повреждение после ишемии, ишемический инсульт, юношеский ревматоидный артрит, юношескую спинальную мышечную атрофию, саркому Капоши, отторжение трансплантата почки, легионеллы, лейшманиоз, лепру, очаги повреждения кортико-спинальной системы, жировой отек, отторжение трансплантата печени, лимфедему, малярию, злокачественную лимфому, злокачественный гистиоцитоз, злокачественную меланому, менингит, менингококкемию, метаболические/идиопатические заболевания, мигренозную головную боль, митохондриальное полисистемное нарушение, смешанное заболевание соединительной ткани, моноклональную гаммапатию, множественную миелому, полисистемные дегенерации (Менцеля Дежерне-Томаса Ши-Драгера и Мачадо-Джозефа), миастению gravis, внутриклеточные Mycobacterium avium, Mycobacterium tuberculosis, миелодиспластический синдром, инфаркт миокарда, ишемические нарушения миокарда, назофарингеальную карциному, неонатальную хроническую легочную болезнь, нефрит, нефроз, нейродегенеративные заболевания, нейрогенные мышечные атрофии I, нейтропеническую лихорадку, неходжкинскую лимфому, окклюзию брюшной аорты и ее ветвей, окклюзивные нарушения артерий, терапию okt3, орхит/эпидидимит, орхит/процедуры реверсивной вазэктомии, органомегалию, остеопороз, отторжение трансплантата поджелудочной железы, карциному поджелудочной железы, паранеопластический синдром/гиперкальциемию злокачественного новообразования, отторжение трансплантата паращитовидной железы, воспалительное заболевание тазовых органов, хронический ринит, перикардиальное заболевание, периферическое атеросклеротическое заболевание, нарушения периферических сосудов, перитонит, пернициозную анемию, пневмонию Pneumocystis carinii, пневмонию, синдром POEMS (полинейропатия, органомегалия, эндокринопатия, моноклональная гаммапатия и синдром кожных изменений), постперфузионный синдром, синдром после вливания, синдром пост-MI-кардиотомии, преэклампсию, прогрессирующий супрануклеарный паралич, первичную легочную гипертензию, лучевую терапию, феномен и болезнь Рейно, болезнь Рейно, болезнь Рефсума, тахикардию с регулярным узким QRS, вазоренальную гипертензию, реперфузионное повреждение, рестриктивную кардиомиопатию, саркомы, склеродермию, сенильную хорею, сенильную деменцию по типу телец Леви, серонегативные артропатии, шок, серповидно-клеточную анемию, отторжение аллотрансплантата кожи, синдром кожных изменений, отторжение трансплантата тонкой кишки, солидные опухоли, специфические аритмии, спинальную атаксию, спиноцеребеллярные дегенерации, стрептококковый миозит, структурные очаги повреждения мозжечка, подострый склерозирующий панэнцефалит, обморок, сифилис сердечно-сосудистой системы, общую анафилактическую реакцию, синдром системного воспалительного ответа, системный ревматоидный артрит с началом в юношеском возрасте, T-клеточный или FAB ALL, телеангиэктазию, облитерирующий тромбангиит, тромбоцитопению, токсичность, трансплантацию, травму/кровотечение, реакции гиперчувствительности типа III, гиперчувствительность IV типа, нестабильную стенокардию, уремию, уросепсис, крапивницу, пороки клапанов сердца, варикозное расширение вен, васкулит, заболевания вен, венозный тромбоз, фибрилляции желудочков, вирусные и грибковые инфекции, вирусный энцефалит/асептический менингит, вирус-ассоциированный гемофагоцитарный синдром, синдром Вернике-Корсакова, болезнь Вильсона, отторжение ксенотрансплантата любого органа или ткани (см. публикации PCT №№ WO2002097048, WO9524918 и WO 00/56772A1).

Также посредством DVD-Ig по изобретению можно лечить одно или несколько из следующих заболеваний: острые коронарные синдромы, острые идиопатические полиневриты, острая воспалительная демиелинизирующая полирадикулонейропатия, острая ишемия, болезнь Стилла взрослых, очаговая алопеция, анафилаксия, синдром антифосфолипидных антител, апластическая анемия, атеросклероз, атопическая экзема, атопический дерматит, аутоиммунный дерматит, ассоциированное с инфекцией Streptococcus аутоиммунное нарушение, аутоиммунная потеря волос, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (ALPS), аутоиммунный миокардит, аутоиммунная тромбоцитопения (AITP), блефарит, бронхоэктаз, буллезный пемфигоид, сердечно-сосудистое заболевание, катастрофический антифосфолипидный синдром, глютеиновая болезнь, шейный спондилез, хроническая ишемия, рубцующийся пемфигоид, клинически изолированный синдром (CIS) с риском рассеянного склероза, конъюнктивит, психиатрическое нарушение с началом в детском возрасте, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), дакриоцистит, дерматомиозит, диабетическая ретинопатия, сахарный диабет, грыжа межпозвоночного диска, пролапс межпозвоночного диска, индуцированная лекарственным средством иммунная гемолитическая анемия, эндокардит, эндометриоз, эндофтальмит, эписклерит, полиморфная эритема, большая полиморфная эритема, гестационный пемфигоид, синдром Гийена-Барре (GBS), сенная лихорадка, синдром Хьюза, идиопатическая болезнь Паркинсона, идиопатическая интерстициальная пневмония, опосредованная IgE аллергия, иммунная гемолитическая анемия, миозит с тельцами включения, инфекционное воспалительное заболевание глаз, воспалительное демиелинизирующее заболевание, воспалительное заболевание сердца, воспалительное заболевание почек, IPF/UIP, ирит, кератит, сухой кератоконъюнктивит, болезнь Куссмауля или болезнь Куссмауля-Мейера, паралич Ландри, гистиоцитоз с клетками Лангерганса, сетчатая мраморная кожа, дегенерация желтого пятна, злокачественные новообразования, микроскопический полиангиит, болезнь Бехтерева, нарушения мотонейронов, пемфигоид слизистой оболочки, полиорганная недостаточность, миастения gravis, миелодиспластический синдром, миокардит, нарушения нервных корешков, нейропатия, гепатит "ни A, ни-B", неврит зрительного нерва, остеолиз, рак яичника, олигосуставной JRA, окклюзионное заболевание периферических артерий (PAOD), заболевание периферических сосудов (PVD), заболевание периферических артерий (PAD), флебит, узелковый периартериит (или узелковый периартериит), полихондрия, ревматическая полимиалгия, полиоз, полисуставной JRA, синдром полиэндокринной недостаточности, полимиозит, ревматическая полимиалгия (PMR), постгемодиализный синдром, первичный паркинсонизм, рак предстательной железы и прямой кишки и гемопоэтические злокачественные новообразования (лейкоз и лимфому), простатит, истинную эритроцитарная аплазия, первичная недостаточность надпочечников, рецидивирующий оптиконейромиелит, рестеноз, ревматический порок сердца, сафо (синовит, акне, пустулез, гиперостоз и остит), склеродермию, вторичный амилоидоз, шоковое легкое, склерит, ишиас, вторичная недостаточность надпочечников, ассоциированное с силиконом заболевание соединительной ткани, дерматоз Снеддона-Уилкинсона, анкилозирующий спондилит, синдром Стивенса-Джонсона (SJS), синдром системного воспалительного ответа, височный артериит, токсоплазмозный ретинит, токсический эпидермальный некролиз, поперечный миелит, TRAPS (рецептор фактора некроза опухоли, аллергическая реакция 1 типа, диабет II типа, крапивница, обычная интерстициальная пневмония (UIP), васкулит, весенний конъюнктивит, вирусный ретинит, синдром Фогта-Коянаги-Харада (синдром VKH), влажная макулодистрофия и заживление ран.

Связывающие белки по изобретению можно использовать для лечения людей, страдающих аутоиммунными заболеваниями, в частности, заболеваниями, ассоциированными с воспалением, включая ревматоидный артрит, спондилит, аллергию, аутоиммунный диабет, аутоиммунный увеит. В одном из вариантов осуществления связывающие белки по изобретению или их антигенсвязывающие части используют для лечения ревматоидного артрита, болезни Крона, рассеянного склероза, инсулинозависимого сахарного диабета и псориаза.

В одном из вариантов осуществления заболевания, которые можно лечить или диагностировать композициями и способами по изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают первичные и метастазирующие злокачественные опухоли, включая карциномы молочной железы, кишечника, прямой кишки, легкого, ротоглотки, гортаноглотки, пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря и желчных протоков, тонкого кишечника, мочевыводящих путей (включая почку, мочевой пузырь и уротелий), женских половых путей (включая шейку матки, матку и яичники, а также хориокарциному и гестационное трофобластическое заболевание), мужских половых путей (включая опухоли предстательной железы, семенных пузырьков, семенников и половых клеток), эндокринных желез (включая щитовидную железу, надпочечник и гипофиз) и кожи, а также гемангиомы, меланомы, саркомы (включая саркомы, возникающие в костных и мягких тканях, а также саркому Капоши), опухоли головного мозга, нервов, глаз и оболочек головного мозга (включая астроцитомы, глиомы, глиобластомы, ретинобластомы, невромы, нейробластомы, шванномы и менингиомы), солидные опухоли, возникающие из гемопоэтических злокачественных новообразований, таких как лейкозы и лимфомы (ходжкинские и неходжкинские лимфомы).

В одном из вариантов осуществления антитела по изобретению или их антигенсвязывающие части используют для лечения злокачественной опухоли или для предотвращения или подавления метастазов опухолей, описываемых в настоящем документе, при лечении отдельно или в комбинации с лучевой терапией и/или другими химиотерапевтическими средствами.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает профилактическое или терапевтическое средство и клеточный белок, таким образом обеспечивая локализованную доставку лекарственного средства к конкретному органу-, ткани- или клетке-мишени или классу тканей или клеток. В одном из вариантов осуществления DVD-Ig связывается с клеточным поверхностным антигеном и профилактическим или терапевтическим средством. Профилактическое средство или терапевтическое средство является пригодным для предотвращения, ведения, лечения или улучшения состояния, нарушения или одного или нескольких его симптомов, например, липосомные частицы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать антитело или фрагмент антитела, стволовые клетки, опосредованный рецепторами эндоцитоз (см., например, Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432), пептид, нуклеиновая кислота (например, антисмысловая DND или РНК или другая генная терапия), пептидная нуклеиновая кислота (ПНК), наночастица, радиоактивное терапевтическое средство, ретровирусный или другой вектор, антибактериальное средство, противовирусное средство, противопаразитарное средство или противогрибковое средство, антинеопластические средства, химиотерапевтические средства, такие как алкилирующие ДНК средства, цисплатин, карбоплатин, средства против тубулина, паклитаксел, доцетаксел, таксол, доксорубицин, гемцитабин, гемзар, антрациклины, адриамицин, ингибиторы топоизомеразы I, ингибиторы топоизомеразы II, 5-фторурацил (5-FU), лейковорин, иринотекан, ингибиторы рецепторных тирозинкиназ (например, эрлотиниб, гефитиниб), ингибиторы COX-2 (например, целекоксиб), ингибиторы киназ и миРНК, подавляющие цитокины противовоспалительное лекарственное средство(а) (CSAID).

В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывают метотрексат, 6-MP, азатиоприн, сульфасалазин, месалазин, олсалазин, хлорхинин/гидроксихлороквин, пенцилламин, ауротиомалат, азатиоприн, кохицин, кортикостероиды, агонисты бета-2-адренорецепторов (сальбутамол, тербуталин, сальметерол), ксантины (теофиллин, аминофиллин), кромогликат, недокромил, кетотифен, ипратропий и окситропий, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, NSAID, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозина, антитромботические средства, ингибиторы комплемента, адренергические средства, средства, препятствующие передачи сигнала провоспалительными цитокинами, такими как TNFα или IL-1 (например, IRAK, NIK, IKK, p38 или ингибиторы MAP-киназы), ингибиторы IL-1b-конвертирующего фермента, ингибиторы TNFα-конвертирующего фермента (TACE), ингибиторы передачи сигнала T-клеток, такие как ингибиторы киназ, ингибиторы металлопротеиназ, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые рецепторы TNF p55 или p75 и их производные p75TNFRIgG (энбрел™) и p55TNFRIgG (ленерцепт)), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R), факторы роста, цитокины, цитотоксические белки (например, TNF), противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFβ), целекоксиб, фолиевую кислоту, сульфат гидроксихлороквина, рофекоксиб, антитела или их производные или конъюгаты (например, инфликсимаб или ритуксимаб), напроксен, валдекоксиб, сульфасалазин, метилпреднизолон, мелоксикам, ацетат метилпреднизолона, тиомалат золота натрия, аспирин, ацетонид триамцинолона, напсилат пропоксифена/ацетаминофен, фолат, набуметон, диклофенак, пироксикам, этодолак, диклофенак натрия, оксапрозин, оксикодон HCl, кислую соль винной кислоты гидрокодона/ацетаминофен, диклофенак натрия/мизопростол, фентанил, анакинру, рекомбинант человека, трамадол HCl, салсалат, сулиндак, цианокобаламин/fa/пиридоксин, ацетаминофен, алендронат натрия, преднизолон, сульфат морфина, гидрохлорид лидокаина, индометацин, глюкозамин сульфат/хондроитин, амитриптилин HCl, сульфадиазин, оксикодон HCl/ацетаминофен, олопатадин HCl, мизопростол, напроксен натрия, омепразол, циклофосфамид, ритуксимаб, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, антитело к IL-18, антитело к IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, рофлумиласт, IC-485, CDC-801 и мезопрам.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает нестероидное противовоспалительное лекарственное средство(а) (NSAID); подавляющее цитокины противовоспалительное лекарственное средство(а) (CSAID); антитела или их производные или конъюгаты [например, CDP-571/BAY-10-3356 (гуманизированное антитело к TNFα; Celltech/Bayer); cA2/инфликсимаб (химерное антитело к TNFα; Centocor); 75 kdTNFR-IgG/этанерцепт (слитый белок рецептор TNF 75 кДа-IgG; Immunex); 55 kdTNF-IgG (слитый белок рецептор TNF 55 кДа-IgG; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9,1/SB 210396 (неистощающее приматизированное антитело к CD4; IDEC/SmithKline; DAB 486-IL-2 и/или DAB 389-IL-2 (слитые с IL-2 белки; Seragen); антитело к Tac (гуманизированное антитело к IL-2Ra; Protein Design Labs/Roche)]; IL-4 (антитело к воспалительному цитокину; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; рекомбинантный IL-10, противовоспалительный цитокин; DNAX/Schering); агонисты IL-4; IL-10 и/или IL-4 (например, агонистические антитела); IL-1RA (антагонист рецептора IL-1; Synergen/Amgen); анакинра (кинерет®/Amgen); TNF-bp/s-TNF (связывающий растворимый TNF белок); R973401 (ингибитор фосфодиэстеразы типа IV); MK-966 (ингибитор COX-2); илопрост; метотрексат; талидомид и родственные талидомиду лекарственные средства (например, селген); лефлуномид (противовоспалительное средство и ингибитор цитокинов); транексамовая кислота (ингибитор активации плазминогена); T-614 (ингибитор цитокинов); простагландин E1); тенидап (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); напроксен (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); мелоксикам (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); ибупрофен (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); пироксикам (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); диклофенак (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); индометацин (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); сульфасалазин; азатиоприн); ингибитор ICE (ингибитор интерлейкин-1b-конвертирующего фермента); ингибитор zap-70 и/или lck (ингибитор тирозинкиназы zap-70 или lck); ингибитор VEGF и/или ингибитор VEGF-R (ингибиторы фактора роста клеток эндотелия сосудов или рецептора фактора роста клеток эндотелия сосудов; ингибиторы ангиогенеза); кортикостероидные противовоспалительные лекарственные средства (например, SB203580); ингибиторы TNF-конвертазы; антитело к IL-12 или антитела к IL-18 или их производные или конъюгаты; интерлейкин-11; интерлейкин-13; ингибиторы интерлейкин-17; золото; пеницилламин; хлороквин; хлорамбуцил; гидроксихлороквин; циклоспорин; циклофосфамид; общее облучение лимфоидной ткани; антитело к глобулинам тимоцитов или антитела к CD4 или их производные или конъюгаты; CD5-токсины; перорально вводимые пептиды и коллаген; двунатриевый лобензарит; регулирующие цитокины средства (CRA) HP228 и HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); антисмысловые тиофосфатные олигодезоксинуклеотиды для ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); рецептор растворимого фактора комплемента 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); преднизон; орготеин; полисульфат гликозаминогликана; миноциклин; антитела к IL2R или их производные или конъюгаты; морские и растительные липиды (жирные кислоты рыб и семян растений; см., например, DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); ауранофин; фенилбутазон; меклофенамовую кислоту; флуфенамовую кислоту; внутривенный иммуноглобулин; зилеутон; азарибин; микофеноловую кислоту (RS-61443); такролимус (FK-506); сиролимус (рапамицин); амиприлозу (терафектин); кладрибин (2-хлордезоксиаденозин); метотрексат; ингибиторы bcl-2 (см. Bruncko et al. (2007) J. Med. Chem. 50(4):641-662); противовирусные и иммуномодулирующие средства.

В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает одно из приведенных средств для лечения ревматоидного артрита, например, низкомолекулярный ингибитор KDR, низкомолекулярный ингибитор Tie-2; метотрексат; преднизон; целекоксиб; фолиевую кислоту; сульфат гидроксихлороквина; рофекоксиб; этанерцепт или инфликсимаб или его производные или конъюгаты; лефлуномид; напроксен; валдекоксиб; сульфасалазин; метилпреднизолон; ибупрофен; мелоксикам; ацетат метилпреднизолона; тиомалат золота натрия; аспирин; азатиоприн; ацетонид триамцинолона; напсилат пропоксифена/ацетаминофен; фолат; набуметон; диклофенак; пироксикам; этодолак; диклофенак натрия; оксапрозин; оксикодон HCl; кислую соль винной кислоты гидрокодона/ацетаминофен; диклофенак натрия/мизопростол; фентанил; анакинру, рекомбинант человека; трамадол HCl; салсалат; сулиндак; цианокобаламин/fa/пиридоксин; ацетаминофен; алендронат натрия; преднизолон; сульфат морфина; гидрохлорид лидокаина; индометацин; глюкозамин сульфат/хондроитин; циклоспорин; амитриптилин HCl; сульфадиазин; оксикодон HCl/ацетаминофен; олопатадин HCl; мизопростол; напроксен натрия; омепразол; микофенолат мофетил; циклофосфамид; ритуксимаб или его производные или конъюгаты; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-Ig или его производные или конъюгаты; IL-18 BP; IL-12/23; антитело к IL-18 или его производные или конъюгаты; антитело к IL-15 или его производные или конъюгаты; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; рофлумиласт; IC-485; CDC-801 и мезопрам.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против воспалительного заболевания кишечника, например, буденозид; эпидермальный фактор роста; кортикостероиды; циклоспорин, сульфасалазин; аминосалицилаты; 6-меркаптопурин; азатиоприн; метронидазол; ингибиторы липоксигеназы; месаламин; олсалазин; балсалазид; антиоксиданты; тромбоксан ингибиторы; антагонисты рецептора IL-1; mAb к IL-1b или их производные или конъюгаты; mAb к IL-6 или их производные или конъюгаты; факторы роста; ингибиторы эластазы; пиридинилимидазольные соединения; антитела или их антагонисты к другим цитокинам или факторам роста человека, например, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF или их производные или конъюгаты.

В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает молекулы клеточной поверхности, такие как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, как метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, NSAID, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозина, антитромботические средства, ингибиторы комплемента, адренергические средства, средства, препятствующие передаче сигнала провоспалительными цитокинами, такими как TNFα или IL-1 (например, IRAK, NIK, IKK, p38 или ингибиторы MAP-киназы), ингибиторы IL-1b-конвертирующего фермента, ингибиторы TNFα-конвертирующего фермента, ингибиторы передачи сигнала T-клетками, такие как ингибиторы киназ, ингибиторы металлопротеиназ, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые рецепторы TNF p55 или p75, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) и противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFb) и ингибиторы bcl-2.

В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против болезни Крона, например, антагонисты TNF, например, антитела к TNF, адалимумаб (публикация PCT № WO 97/29131; гумира), CA2 (ремикейд), CDP 571, конструкции TNFR-Ig, (ингибиторы p75TNFRIgG (энбрел) и p55TNFRIgG (ленерцепт)) или их производные или конъюгаты и ингибиторы PDE4. В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает кортикостероиды, например, буденозид и дексаметазон. В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает сульфасалазин, 5-аминосалициловую кислоту и олсалазин и средства, препятствующие синтезу или действию провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, например, ингибиторы IL-1b-конвертирующего фермента и IL-1ra. В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает ингибиторы передачи сигнала T-клетками, например, ингибиторы тирозинкиназ, 6-меркаптопурины. В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает IL-11. В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает месаламин, преднизон, азатиоприн, меркаптопурин, инфликсимаб или его производные или конъюгаты, сукцинат метилпреднизолона натрия, дифеноксилат/сульфат атропина, гидрохлорид лоперамида, метотрексат, омепразол, фолат, ципрофлоксацин/декстрозу-воду, кислую соль винной кислоты гидрокодона/ацетаминофен, гидрохлорид тетрациклина, флуцинонид, метронидазол, тимеросал/борную кислоту, холестирамин/сахарозу, гидрохлорид ципрофлоксацина, сульфат гиосциамина, гидрохлорид меперидина, гидрохлорид мидазолама, оксикодон HCl/ацетаминофен, гидрохлорид прометазина, фосфат натрия, сульфаметоксазол/триметоприм, целекоксиб, поликарбофил, напсилат пропоксифена, гидрокортизон, поливитамины, двунатриевый балсалазид, фосфат кодеина/ацетаминофен, колесевелам HCl, цианокобаламин, фолиевую кислоту, левофлоксацин, метилпреднизолон, натализумаб или его производные или конъюгаты и интерферон-альфа, интерферон-бета и интерферон-гамма.

В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против рассеянного склероза, например, кортикостероиды; преднизолон; метилпреднизолон; азатиоприн; циклофосфамид; циклоспорин; метотрексат; 4-аминопиридин; тизанидин; интерферон-β1a (авонекс; Biogen); интерферон-β1b (бетасерон; Chiron/Berlex); интерферон-α-n3) (Interferon Sciences/Fujimoto), интерферон-α (Alfa Wassermann/J&J), интерферон-β1A-1F (Serono/Inhale Therapeutics), пегинтерферон-α 2b (Enzon/Schering-Plough), сополимер 1 (Cop-1; копаксон; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); гипербарический кислород; внутривенный иммуноглобулин; кладрибин; антитела или антагонисты к другим цитокинам или факторам роста человека и их рецепторам, например, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF или их производные или конъюгаты. В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает молекулы клеточной поверхности, такие как CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 или их лиганды. В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, NSAID, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозина, антитромботические средства, ингибиторы комплемента, адренергические средства, средства, препятствующие передаче сигнала провоспалительными цитокинами, такими как TNFα или IL-1 (например, IRAK, NIK, IKK, p38 или ингибиторы MAP-киназы), ингибиторы IL-1β-конвертирующего фермента, ингибиторы TACE, ингибиторы передачи сигнала T-клетками, такие как ингибиторы киназ, ингибиторы металлопротеиназ, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые рецепторы TNF p55 или p75, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R), противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-13 и TGFβ) и ингибиторы bcl-2.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против рассеянного склероза, например, интерферон-β, например, IFNb1a и IFNb1b; копаксон, кортикостероиды, ингибиторы каспаз, например, ингибиторы каспазы-1, ингибиторы IL-1, ингибиторы TNF и антитела к CD40 и CD80 и их производные или конъюгаты.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает следующие средства или их производные или конъюгаты: алемтузумаб, дронабинол, юнимед, даклизумаб, митоксантрон, гидрохлорид ксалипродена, фампридин, ацетат глатирамера, натализумаб, синнабидол, a-иммунокин NNSO3, ABR-215062, AnergiX.MS, антагонисты рецепторов хемокинов, BBR-2778, калагуалин, CPI-1189, LEM (инкапсулированный в липосомы митоксантрон), THC.CBD (агонист каннабиноидов) MBP-8298, мезопрам (ингибитор PDE4), MNA-715, антитело к рецептору IL-6, нейровакс, пирфенидон аллотрап 1258 (RDP-1258), sTNF-R1, талампанел, терифлуномид, TGF-бета2, типлимотид, антагонисты VLA-4 (например, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), антагонисты интерферона гамма, агонисты IL-4.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против стенокардии, например, нитроглицерин, мононитрат изосорбида, сукцинат метопролола, атенолол, тартрат метопролола, бесилат амлодипина, гидрохлорид дилтиазема, динитрат изосорбида, бисульфат клопидогреля, нифедипин, аторвастатин кальция, хлорид калия, фуросемид, симвастатин, верапамил HCl, дигоксин, гидрохлорид пропранолола, карведилол, лизиноприл, спиронолактон, гидрохлоротиазид, малеат эналаприла, надолол, рамиприл, эноксапарин натрия, гепаринат натрия, валсартан, гидрохлорид соталола, фенофибрат, эзетимиб, буметанид, лозартан калия, лизиноприл/гидрохлоротиазид, фелодипин, каптоприл, фумарат бисопролола.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против анкилозирующего спондилита, например, ибупрофен, диклофенак и мизопростол, напроксен, мелоксикам, индометацин, диклофенак, целекоксиб, рофекоксиб, сульфасалазин, метотрексат, азатиоприн, миноциклин, преднизон, этанерцепт, инфликсимаб и их производные или конъюгаты.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против астмы, например, альбутерол, салметерол/флутиказон, монтелукаст натрия, пропионат флутиказона, будезонид, преднизон, ксинафоат салметерола, левосальбутамол HCl, сульфат альбутерола/ипратропий, преднизолон фосфат натрия, ацетонид триамцинолона, дипропионат беклометазона, ипратропий бромид, азитромицин, ацетат пирбутерола, преднизолон, безводный теофиллин, сукцинат метилпреднизолона натрия, кларитромицин, зафирлукаст, фумарат формотерола, вакцину вируса гриппа, метилпреднизолон, тригидрат амоксициллина, флунизолид, аллергическую инъекцию, кромолин натрия, гидрохлорид фексофенадина, флунизолид/ментол, амоксициллин/клавуланат, левофлоксацин, содействующее ингалятору устройство, гвайфенезин, дексаметазон фосфат натрия, моксифлоксацин HCl, гиклат доксициклина, гвайфенезин/d-меторфан, п-эфедрин/cod/хлорфенир, гатифлоксацин, гидрохлорид цетиризина, фуроат мометазона, ксинафоат салметерола, бензонатат, цефалексин, pe/гидрокодон/хлорфенир, цетиризин HCl/псевдоэфедрин, фенилэфрин/cod/прометазин, кодеин/прометазин, цефпрозил, дексаметазон, гвайфенезин/псевдоэфедрин, хлорфенирамин/гидрокодон, недокромил натрия, сульфат тербуталина, эпинефрин, метилпреднизолон, сульфат метапротеренола.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против COPD, например, сульфат альбутерола/ипратропий, ипратропий бромид, салметерол/флутиказон, альбутерол, ксинафоат салметерола, пропионат флутиказона, преднизон, безводный теофиллин, сукцинат метилпреднизолона натрия, монтелукаст натрия, будезонид, фумарат формотерола, ацетонид триамцинолона, левофлоксацин, гвайфенезин, азитромицин, дипропионат беклометазона, левосальбутамол HCl, флунизолид, цефтриаксон натрия, тригидрат амоксициллина, гатифлоксацин, зафирлукаст, амоксициллин/клавуланат, флунизолид/ментол, хлорфенирамин/гидрокодон, сульфат метапротеренола, метилпреднизолон, фуроат мометазона, п-эфедрин/cod/хлорфенир, ацетат пирбутерола, п-эфедрин/лоратадин, сульфат тербуталина, тиотропий бромид, (R,R)-формотерол, TgAAT, циломиласт, рофлумиласт.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против HCV, например, интерферон-альфа-2a, интерферон-альфа-2b, интерферон-альфа con 1, интерферон-альфа-n1, пегилированный интерферон-альфа-2a, пегилированный интерферон-альфа-2b, рибавирин, пегинтерферон альфа-2b+рибавирин, урсодезоксихолевую кислоту, глицирризиновую кислоту, тималфазин, максамин, VX-497 и любые соединения, которые используют для лечения HCV, посредством препятствия следующим мишеням: полимераза HCV, протеаза HCV, геликаза HCV, IRES (внутренний участок связывания рибосомы) HCV.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против идиопатического легочного фиброза, например, преднизон, азатиоприн, альбутерол, колхицин, сульфат альбутерола, дигоксин, интерферон гамма, сукцинат метилпреднизолона натрия, лоразепам, фуросемид, лизиноприл, нитроглицерин, спиронолактон, циклофосфамид, ипратропий бромид, актиномицин d, альтеплазу, пропионат флутиказона, левофлоксацин, сульфат метапротеренола, сульфат морфина, оксикодон HCl, хлорид калия, ацетонид триамцинолона, безводный такролимус, кальций, интерферон-альфа, метотрексат, микофенолат мофетил, интерферон-гамма-1a.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против инфаркта миокарда, например, аспирин, нитроглицерин, тартрат метопролола, эноксапарин натрия, гепаринат натрия, бисульфат клопидогреля, карведилол, атенолол, сульфат морфина, сукцинат метопролола, варфарин натрия, лизиноприл, мононитрат изосорбида, дигоксин, фуросемид, симвастатин, рамиприл, тенектеплазу, малеат эналаприла, торсемид, ретавазу, лозартан калия, хинаприл HCl/карбонат магния, буметанид, альтеплазу, эналаприлат, гидрохлорид амиодарона, тирофибан HCl m-гидрат, гидрохлорид дилтиазема, каптоприл, ирбесартан, валсартан, гидрохлорид пропранолола, фозиноприл натрия, гидрохлорид лидокаина, эптифибатид, цефазолин натрия, сульфат атропина, аминокапроновую кислоту, спиронолактон, интерферон, гидрохлорид соталола, хлорид калия, докузат натрия, добутамин HCl, алпразолам, правастатин натрия, аторвастатин кальция, гидрохлорид мидазолама, гидрохлорид меперидина, динитрат изосорбида, эпинефрин, гидрохлорид дофамина, бивалирудин, розувастатин, эзетимиб/симвастатин, авазимиб, карипорид, сердечные стволовые клетки и факторы роста.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против псориаза, например, низкомолекулярный ингибитор KDR, низкомолекулярный ингибитор Tie-2, кальципотриен, пропионат клобетазола, ацетонид триамцинолона, пропионат галобетазола, тазаротен, метотрексат, флуцинонид, усиленный дипропионат бетаметазона, ацетонид флуоцинолона, ацитретин, шампунь tar, валерианат бетаметазона, фуроат мометазона, кетоконазол, прамоксин/флуцинолон, валеринат гидрокортизона, флурандренолид, мочевину, бетаметазон, пропионат клобетазола/emoll, пропионат флутиказона, азитромицин, гидрокортизон, увлажняющую формулу, фолиевую кислоту, дезонид, пимекролимус, каменноугольную смолу, диацетат дифлоразона, фолат этанерцепта, молочную кислоту, метоксален, hc/субгаллат висмута/znox/resor, ацетат метилпреднизолона, преднизон, крем от загара, галцинонид, салициловую кислоту, антралин, клокортолон пивалат, экстракт каменного угля, каменноугольную смолу/салициловую кислоту, каменноугольную смолу/салициловую кислоту/серу, дезоксиметазон, диазепам, смягчающее средство, флуцинонид/смягчающее средство, минеральное масло/касторовое масло/лактат натрия, минеральное масло/арахисовое масло, нефть/изопропилмиристат, псорален, салициловую кислоту, мыло/трибромсалан, тимеросал/борную кислоту, целекоксиб, инфликсимаб, циклоспорин, алефацепт, эфализумаб, такролимус, пимекролимус, PUVA, UVB, сульфасалазин.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против псориатического артрита, например, метотрексат, этанерцепт, рофекоксиб, целекоксиб, фолиевую кислоту, сульфасалазин, напроксен, лефлуномид, ацетат метилпреднизолона, индометацин, сульфат гидроксихлороквина, преднизон, сулиндак, усиленный дипропионат бетаметазона, инфликсимаб, метотрексат, фолат, ацетонид триамцинолона, диклофенак, диметилсульфоксид, пироксикам, диклофенак натрия, кетопрофен, мелоксикам, метилпреднизолон, набуметон, толметин натрий, кальципотриен, циклоспорин, диклофенак натрия/мизопростол, флуцинонид, глюкозаминсульфат, тиомалат золота натрия, кислую соль винной кислоты гидрокодона/ацетаминофен, ибупрофен, ризедронат натрия, сульфадиазин, тиогуанин, валдекоксиб, алефацепт, эфализумаб и ингибиторы bcl-2 или их производные или конъюгаты.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против рестеноза, например, сиролимус, паклитаксел, эверолимус, такролимус, зотаролимус, ацетаминофен.

В другом варианте осуществления DVD-Ig по изобретению связывает терапевтические средства против ишиаса, например, кислую соль винной кислоты гидрокодона/ацетаминофен, рофекоксиб, циклобензаприн HCl, метилпреднизолон, напроксен, ибупрофен, оксикодон HCl/ацетаминофен, целекоксиб, валдекоксиб, ацетат метилпреднизолона, преднизон, фосфат кодеина/ацетаминофен, трамадол HCl/ацетаминофен, метаксалон, мелоксикам, метокарбамол, гидрохлорид лидокаина, диклофенак натрия, габапентин, дексаметазон, каризопродол, кеторолак трометамин, индометацин, ацетаминофен, диазепам, набуметон, оксикодон HCl, тизанидин HCl, диклофенак натрия/мизопростол, напсилат пропоксифена/ацетаминофен, asa/оксикодон/оксикодон ter, ибупрофен/гидрокодон bit, трамадол HCl, этодолак, пропоксифен HCl, амитриптилин HCl, каризопродол/фосфат кодеина/asa, сульфат морфина, поливитамины, напроксен натрия, цитрат орфенадрина, темазепам.

В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает средства против SLE (волчанки), например, NSAID, например, диклофенак, напроксен, ибупрофен, пироксикам, индометацин; ингибиторы COX2, например, целекоксиб, рофекоксиб, валдекоксиб; антитело против малярии, например, гидроксихлороквин; стероиды, например, преднизон, преднизолон, буденозид, дексаметазон; цитотоксические средства, например, азатиоприн, циклофосфамид, микофенолат мофетил, метотрексат; ингибиторы PDE4 или ингибитор синтазы пуринов, например, селлсепт. В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает сульфасалазин, 5-аминосалициловую кислоту, олсалазин, имуран и средства, препятствующие синтезу, продукции или действию провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, например, ингибиторы каспаз, подобные ингибиторам IL-1b-конвертирующего фермента и IL-1ra. В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает ингибиторы передачи сигнала T-клетками, например, ингибиторы тирозинкиназ; или молекулы, направленные к молекулам активации T-клеток, например, антитела к CTLA-4-Ig или к семейству B7 или семейству PD-1. В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает IL-11 или антитела к цитокинам, например, фонотолизумаб (антитело к IFNg) или антитела к рецепторам, например, антитело к рецептору IL-6 и антитела к поверхностным молекулам B-клеток. В одном из вариантов осуществления DVD-Ig по изобретению связывает LJP 394 (абетимус), средства, истощающие или инактивирующие B-клетки, например, антитело к CD20 и BlyS, TNF и ингибиторы bcl-2, так как показано, что сверхэкспрессия bcl-2 у трансгенных мышей вызывает сходный с волчанкой фенотип (см. Marquina et al. (2004) J. Immunol. 172(11):7177-7185), таким образом, ожидают, что ингибирование будет оказывать терапевтическое действие.

Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие части можно комбинировать со средствами, которые в качестве неограничивающих примеров включают антинеопластические средства, лучевую терапию, химиотерапию, такую как алкилирующие ДНК средства, цисплатин, карбоплатин, средства против тубулина, паклитаксел, доцетаксел, таксол, доксорубицин, гемцитабин, гемзар, антрациклины, адриамицин, ингибиторы топоизомеразы I, ингибиторы топоизомеразы II, 5-фторурацил (5-FU), лейковорин, иринотекан, ингибиторы рецепторных тирозинкиназ (например, эрлотиниб, гефитиниб), ингибиторы COX-2 (например, целекоксиб), ингибиторы киназ и миРНК.

Связывающий белок по изобретению также можно вводить с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, пригодными для лечения различных заболеваний.

Связывающий белок по изобретению можно использовать отдельно или в комбинации для лечения таких заболеваний. Следует понимать, что связывающие белки можно использовать отдельно или в комбинации с дополнительным средством, например, терапевтическим средством, где указанное дополнительное средство выбирает специалист в данной области для его назначенной цели. Например, дополнительное средство может представлять собой терапевтическое средство, известное в данной области, как пригодное для лечения заболевания или патологического состояния, которое лечат антителом по настоящему изобретению. Также дополнительное средство может представлять собой средство, придающее полезное свойство терапевтической композиции, например, средство, влияющее на вязкость композиции.

Кроме того, следует понимать, что комбинации, которые необходимо включать в настоящее изобретение, представляют собой комбинации, пригодные для их заданной цели. Приведенные ниже средства являются иллюстративными и не предназначены для ограничения. Комбинации, являющиеся частью настоящего изобретения, могут представлять собой антитела по настоящему изобретению и по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из приведенных ниже списков. Также комбинация может содержать более одного дополнительного средства, например, два или три дополнительных средства, если комбинация является такой, что формируемая композиция может выполнять предназначенную ей функцию.

Комбинации для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний представляют нестероидное противовоспалительное лекарственное средство(а), также обозначаемое как NSAID, включающее лекарственные средства, подобные ибупрофену. Другие комбинации представляют кортикостероиды, включающие преднизолон; хорошо известные побочные эффекты использования стероидов можно снижать или даже устранять посредством снижения дозы стероидов, необходимой при лечении пациентов в комбинации с DVD-Ig по настоящему изобретению. Неограничивающие примеры терапевтических средств против ревматоидного артрита, с которыми можно комбинировать антитело или часть антитела по изобретению, включают следующие: подавляющее цитокины противовоспалительное лекарственное средство(а) (CSAID); антитела или антагонисты к другим цитокинам или факторам роста человека, например, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-23, интерферонам, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF. Связывающие белки по изобретению или их антигенсвязывающие части можно комбинировать с антителами к молекулам клеточной поверхности, таким как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA или их лиганды, включая CD154 (gp39 или CD40L).

Комбинации терапевтических средств могут в различных точках препятствовать аутоиммунным и последующим воспалительным каскадам; примеры включают антагонисты TNF, такие как химерные гуманизированные или принадлежащие человеку антитела к TNF, адалимумаб, (публикация PCT № WO 97/29131), CA2 (ремикейд™), CDP 571 и растворимые рецепторы TNF p55 или p75, их производные (p75TNFRIgG (энбрел™) или p55TNFRIgG (ленерцепт)), а также ингибиторы TNFα-конвертирующего фермента (TACE); подобным образом по той же причине могут быть эффективными ингибиторы IL-1 (ингибиторы интерлейкин-1-конвертирующего фермента, IL-1RA и т.д.). Другие комбинации включают интерлейкин-11. Еще одна комбинация включает ключевых участников аутоиммунного ответа, которые могут действовать параллельно, в зависимости от или согласованно с функцией IL-12; особенно антагонисты IL-18, включая антитела к IL-18 или растворимые рецепторы IL-18 или связывающие белки IL-18. Показано, что IL-12 и IL-18 обладают перекрывающимися, но различными функциями, и комбинация антагонистов к обоим может являться наиболее эффективной. Еще одну комбинацию представляют неистощающие ингибиторы CD4. Другие комбинации включают антагонисты костимуляторного пути CD80 (B7.1) или CD86 (B7.2), включая антитела, растворимые рецепторы или антагонистические лиганды.

Также связывающие белки по изобретению можно комбинировать с такими средствами, как метотрексат, 6-MP, азатиоприн сульфасалазин, месалазин, олсалазин хлорхинин/гидроксихлороквин, пенцилламином, ауротиомалатом (внутримышечный и пероральный), азатиоприн, кохицин, кортикостероиды (пероральные, ингалируемые и местная инъекция), агонисты бета-2-адренорецепторов (сальбутамол, тербуталин, сальметерал), ксантины (теофиллин, аминофиллин), кромогликат, недокромил, кетотифен, ипратропий и окситропий, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, NSAID, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозина, антитромботические средства, ингибиторы комплемента, адренергические средства, средства, препятствующие передаче сигнала провоспалительными цитокинами, такими как TNFα или IL-1 (например, IRAK, NIK, IKK, p38 или ингибиторы MAP-киназы), ингибиторы IL-1β-конвертирующего фермента, ингибиторы TNFα-конвертирующего фермента (TACE), ингибиторы передачи сигнала T-клетками, такие как ингибиторы киназ, ингибиторы металлопротеиназ, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые рецепторы TNF p55 или p75 и производные p75TNFRIgG (энбрел™ и p55TNFRIgG (ленерцепт)), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R), противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFβ), целекоксиб, фолиевая кислота, сульфат гидроксихлороквина, рофекоксиб, этанерцепт, инфликсимаб, напроксен, валдекоксиб, сульфасалазин, метилпреднизолон, мелоксикам, ацетат метилпреднизолона, тиомалат золота натрия, аспирин, ацетонид триамцинолона, напсилат пропоксифена/ацетаминофен, фолат, набуметон, диклофенак, пироксикам, этодолак, диклофенак натрия, оксапрозин, оксикодон HCl, кислая соль винной кислоты гидрокодона/ацетаминофен, диклофенак натрия/мизопростол, фентанил, анакинра, рекомбинант человека, трамадол HCl, салсалат, сулиндак, цианокобаламин/fa/пиридоксин, ацетаминофен, алендронат натрия, преднизолон, сульфат морфина, гидрохлорид лидокаина, индометацин, глюкозамин сульфат/хондроитин, амитриптилин HCl, сульфадиазин, оксикодон HCl/ацетаминофен, олопатадин HCl, мизопростол, напроксен натрия, омепразол, циклофосфамид, ритуксимаб, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, антитело к IL-18, антитело к IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, рофлумиласт, IC-485, CDC-801 и мезопрам. Комбинации включают метотрексат или лефлуномид, а в случаях умеренного или тяжелого ревматоидного артрита циклоспорин.

Неограничивающие дополнительные средства, которые также можно использовать в комбинации со связывающим белком для лечения ревматоидного артрита, в качестве неограничивающих примеров включают следующее: нестероидное противовоспалительное лекарственное средство(а) (NSAID); подавляющее цитокины противовоспалительное лекарственное средство(а) (CSAID); CDP-571/BAY-10-3356 (гуманизированное антитело к TNFα; Celltech/Bayer); cA2/инфликсимаб (химерное антитело к TNFα; Centocor); 75 kdTNFR-IgG/этанерцепт (слитый белок рецептор TNF 75 кДа-IgG; Immunex; (1994) Arthritis & Rheumatism 37:S295; (1996) J. Invest. Med. 44:235A); 55 kdTNF-IgG (слитый белок рецептор TNF 55 кДа-IgG; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9,1/SB 210396 (неистощающее приматизированное антитело к CD4; IDEC/SmithKline; (1995) Arthrit. Rheum. 38:S185); DAB 486-IL-2 и/или DAB 389-IL-2 (слитые с IL-2 белки; Seragen; (1993) Arthrit. Rheum. 36:1223); антитело к Tac (гуманизированное антитело к IL-2Rα; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (противовоспалительный цитокин; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; рекомбинантный IL-10, противовоспалительный цитокин; DNAX/Schering); IL-4; IL-10 и/или агонисты IL-4 (например, агонистические антитела); IL-IRA (антагонист рецептора IL-1; Synergen/Amgen); анакинра (кинерет®/Amgen); TNF-bp/s-TNF (растворимый связывающий TNF белок; (1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S284; (1995) Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology 268:37-42); R973401 (ингибитор фосфодиэстеразы типа IV; (1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S282); MK-966 (ингибитор COX-2; (1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S81); илопрост ((1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S82); метотрексат; талидомид ((1996) Arthrit. Rheum.39(9; supplement):S282) и родственные талидомиду лекарственные средства (например, селген); лефлуномид (противовоспалительное и ингибитор цитокинов; (1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S131; (1996) Inflammation Research 45:103-107); транексамовая кислота (ингибитор активации плазминогена; (1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S284); T-614 (ингибитор цитокинов; (1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S282); простагландин E1 ((1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S282); тенидап (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство; (1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S280); напроксен (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство; (1996) Neuro Report 7:1209-1213); мелоксикам (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); ибупрофен (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); пироксикам (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); диклофенак (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); индометацин (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); сульфасалазин ((1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S281); азатиоприн ((1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S281); ингибитор ICE (ингибитор фермента интерлейкин-1β-конвертирующего фермента); ингибитор zap-70 и/или lck (ингибитор тирозинкиназы zap-70 или lck); ингибитор VEGF и/или ингибитор VEGF-R (ингибиторы фактора роста клеток эндотелия сосудов или рецептора фактора роста клеток эндотелия сосудов; ингибиторы ангиогенеза); кортикостероидные противовоспалительные лекарственные средства (например, SB203580); ингибиторы TNF-конвертазы; антитела к IL-12; антитела к IL-18; интерлейкин-11 ((1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S296); интерлейкин-13 ((1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S308); ингибиторы интерлейкина-17 (см. например, (1996) Arthrit. Rheum. 39(9; supplement):S120); золото; пеницилламин; хлороквин; хлорамбуцил; гидроксихлороквин; циклоспорин; циклофосфамид; общее облучение лимфоидной ткани; антитело к глобулинам тимоцитов; антитела к CD4; CD5-токсины; перорально вводимые пептиды и коллаген; двунатриевый лобензарит; регулирующие цитокины средства (CRA) HP228 и HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); антисмысловые тиофосфатные олигодезоксинуклеотиды для ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); рецептор растворимого фактора комплемента 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); преднизон; орготеин; полисульфат гликозаминогликана; миноциклин; антитела к IL2R; морские и растительные липиды (жирные кислоты рыб и семян растений; DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); ауранофин; фенилбутазон; меклофенамовая кислота; флуфенамовая кислота; внутривенный иммуноглобулин; зилеутон; азарибин; микофеноловая кислота (RS-61443); такролимус (FK-506); сиролимус (рапамицин); амиприлоза (терафектин); кладрибин (2-хлордезоксиаденозин); метотрексат; ингибиторы bcl-2 (Bruncko et al.(2007) J. Med. Chem. 50(4):641-662); противовирусные и иммуномодулирующие средства.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок или его антигенсвязывающую часть вводят в комбинации с одним из следующих средств для лечения ревматоидного артрита: низкомолекулярный ингибитор KDR, низкомолекулярный ингибитор Tie-2; метотрексат; преднизон; целекоксиб; фолиевая кислота; сульфат гидроксихлороквина; рофекоксиб; этанерцепт; инфликсимаб; лефлуномид; напроксен; валдекоксиб; сульфасалазин; метилпреднизолон; ибупрофен; мелоксикам; ацетат метилпреднизолона; тиомалат золота натрия; аспирин; азатиоприн; ацетонид триамцинолона; напсилат пропоксифена/ацетаминофен; фолат; набуметон; диклофенак; пироксикам; этодолак; диклофенак натрия; оксапрозин; оксикодон HCl; кислая соль винной кислоты гидрокодона/ацетаминофен; диклофенак натрия/мизопростол; фентанил; анакинра, рекомбинант человека; трамадол HCl; салсалат; сулиндак; цианокобаламин/fa/пиридоксин; ацетаминофен; алендронат натрия; преднизолон; сульфат морфина; гидрохлорид лидокаина; индометацин; глюкозамин сульфат/хондроитин; циклоспорин; амитриптилин HCl; сульфадиазин; оксикодон HCl/ацетаминофен; олопатадин HCl; мизопростол; напроксен натрия; омепразол; микофенолат мофетил; циклофосфамид; ритуксимаб; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; IL-12/23; антитело к IL-18; антитело к IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; рофлумиласт; IC-485; CDC-801 и мезопрам.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против воспалительного заболевания кишечника, с которыми можно комбинировать связывающий белок по изобретению, включают следующее: буденозид; эпидермальный фактор роста; кортикостероиды; циклоспорин, сульфасалазин; аминосалицилаты; 6-меркаптопурин; азатиоприн; метронидазол; ингибиторы липоксигеназы; месаламин; олсалазин; балсалазид; антиоксиданты; тромбоксан ингибиторы; антагонисты рецептора IL-1; mAb к IL-1β; mAb к IL-6; факторы роста; ингибиторы эластазы; пиридинилимидазольные соединения; антитела или антагонисты к другим цитокинам или факторам роста человека, например, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие части можно комбинировать с антителами к молекулам клеточной поверхности, такими как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 или их лиганды. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие части также можно комбинировать с такими средствами, как метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, NSAID, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозина, антитромботические средства, ингибиторы комплемента, адренергические средства, средства, препятствующие передаче сигнала провоспалительными цитокинами, такими как TNFα или IL-1 (например, IRAK, NIK, IKK, p38 или ингибиторы MAP-киназы), ингибиторы IL-1β-конвертирующего фермента, ингибиторы TNFα-конвертирующего фермента, ингибиторы передачи сигнала T-клетками, такие как ингибиторы киназ, ингибиторы металлопротеиназ, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые рецепторы TNF p55 или p75, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) и противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFβ) и ингибиторы bcl-2.

Примеры терапевтических средств против болезни Крона, с которыми можно комбинировать связывающий белок, включают следующее: антагонисты TNF, например, антитела к TNF, адалимумаб (публикация PCT № WO 97/29131; гумира), CA2 (ремикейд), CDP 571, конструкции TNFR-Ig, (p75TNFRIgG (энбрел) и p55TNFRIgG (ленерцепт)) ингибиторы и ингибиторы PDE4. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие части можно комбинировать c кортикостероидами, например, буденозидом и дексаметазоном. Связывающие белки по изобретению или их антигенсвязывающие части также можно комбинировать с такими средствами, как сульфасалазин, 5-аминосалициловая кислота и олсалазин, и средствами, препятствующими синтезу или действию провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, например, ингибиторами IL-1β-конвертирующего фермента и IL-1ra. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие часть также можно использовать с ингибиторами передачи сигнала T-клетками, например, ингибиторами тирозинкиназ 6-меркаптопуринами. Связывающие белки по изобретению или их антигенсвязывающие части можно комбинировать с IL-11. Связывающие белки по изобретению или их антигенсвязывающие части можно комбинировать с месаламином, преднизоном, азатиоприном, меркаптопурином, инфликсимабом, сукцинатом метилпреднизолона натрия, дифеноксилатом/сульфатом атропина, гидрохлоридом лоперамида, метотрексатом, омепразолом, фолатом, ципрофлоксацином/декстрозой-водой, кислой солью винной кислоты гидрокодона/ацетаминофеном, гидрохлоридом тетрациклина, флуцинонидом, метронидазолом, тимеросалом/борной кислотой, холестирамином/сахарозой, гидрохлоридом ципрофлоксацина, сульфатом гиосциамина, гидрохлоридом меперидина, гидрохлоридом мидазолама, оксикодоном HCl/ацетаминофеном, гидрохлоридом прометазина, фосфатом натрия, сульфаметоксазолом/триметопримом, целекоксибом, поликарбофилом, напсилатом пропоксифена, гидрокортизоном, поливитаминами, двунатриевым балсалазидом, фосфатом кодеина/ацетаминофеном, колесевеламом HCl, цианокобаламином, фолиевой кислотой, левофлоксацином, метилпреднизолоном, натализумабом и интерфероном-гамма.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против рассеянного склероза, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: кортикостероиды; преднизолон; метилпреднизолон; азатиоприн; циклофосфамид; циклоспорин; метотрексат; 4-аминопиридин; тизанидин; интерферон-β1a (авонекс; Biogen); интерферон-β1b (бетасерон; Chiron/Berlex); интерферон-α-n3) (Interferon Sciences/Fujimoto), интерферон-α (Alfa Wassermann/J&J), интерферон-β1A-1F (Serono/Inhale Therapeutics), пегинтерферон-α2b (Enzon/Schering-Plough), сополимер 1 (Cop-1; копаксон; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); гипербарический кислород; внутривенный иммуноглобулин; кладрибин; антитела или антагонисты к другим цитокинам или факторам роста человека и их рецепторам, например, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF. Связывающие белки по изобретению можно комбинировать с антителами к молекулам клеточной поверхности, такими как CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 или их лиганды. Связывающие белки по изобретению также можно комбинировать с такими средствами, как метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолат мофетил, лефлуномид, NSAID, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозина, антитромботические средства, ингибиторы комплемента, адренергические средства, средства, препятствующие передаче сигнала провоспалительными цитокинами, такими как TNFα или IL-1 (например, IRAK, NIK, IKK, p38 или ингибиторы MAP-киназы), ингибиторы IL-1β-конвертирующего фермента, ингибиторы TACE, ингибиторы передачи сигнала T-клетками, такие как ингибиторы киназ, ингибиторы металлопротеиназ, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые рецепторы TNF p55 или p75, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R), противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-13 и TGFβ) и ингибиторы bcl-2.

Примеры терапевтических средств против рассеянного склероза, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают интерферон-β, например, IFNβ1a и IFNβ1b; копаксон, кортикостероиды, ингибиторы каспаз, например, ингибиторы каспазы-1, ингибиторы IL-1, ингибиторы TNF и антитела к лиганду CD40 и CD80.

Связывающие белки по изобретению также можно комбинировать с такими средствами, как алемтузумаб, дронабинол, юнимед, даклизумаб, митоксантрон, гидрохлорид ксалипродена, фампридин, ацетат глатирамера, натализумаб, синнабидол, a-иммунокин NNSO3, ABR-215062, AnergiX.MS, антагонисты рецепторов хемокинов, BBR-2778, калагуалин, CPI-1189, LEM (инкапсулированный в липосомы митоксантрон), THC.CBD (агонист каннабиноидов) MBP-8298, мезопрам (ингибитор PDE4), MNA-715, антитело к рецептору IL-6, нейровакс, пирфенидон аллотрап 1258 (RDP-1258), sTNF-R1, талампанел, терифлуномид,TGF-бета2, типлимотид, антагонисты VLA-4 (например, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), антагонисты интерферона гамма и агонисты IL-4.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против стенокардии, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: аспирин, нитроглицерин, мононитрат изосорбида, сукцинат метопролола, атенолол, тартрат метопролола, бесилат амлодипина, гидрохлорид дилтиазема, динитрат изосорбида, бисульфат клопидогреля, нифедипин, аторвастатин кальция, хлорид калия, фуросемид, симвастатин, верапамил HCl, дигоксин, гидрохлорид пропранолола, карведилол, лизиноприл, спиронолактон, гидрохлоротиазид, малеат эналаприла, надолол, рамиприл, эноксапарин натрия, гепаринат натрия, валсартан, гидрохлорид соталола, фенофибрат, эзетимиб, буметанид, лозартан калия, лизиноприл/гидрохлоротиазид, фелодипин, каптоприл и фумарат бисопролола.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против анкилозирующего спондилита, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: ибупрофен, диклофенак и мизопростол, напроксен, мелоксикам, индометацин, диклофенак, целекоксиб, рофекоксиб, сульфасалазин, метотрексат, азатиоприн, миноциклин, преднизон, этанерцепт и инфликсимаб.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против астмы, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: альбутерол, салметерол/флутиказон, монтелукаст натрия, пропионат флутиказона, будезонид, преднизон, ксинафоат салметерола, левосальбутамол HCl, сульфат альбутерола/ипратропий, преднизолон фосфат натрия, ацетонид триамцинолона, дипропионат беклометазона, ипратропий бромид, азитромицин, ацетат пирбутерола, преднизолон, безводный теофиллин, сукцинат метилпреднизолона натрия, кларитромицин, зафирлукаст, фумарат формотерола, вакцина вируса гриппа, метилпреднизолон, тригидрат амоксициллина, флунизолид, аллергическая инъекция, кромолин натрия, гидрохлорид фексофенадина, флунизолид/ментол, амоксициллин/клавуланат, левофлоксацин, содействующее ингалятору устройство, гвайфенезин, дексаметазон фосфат натрия, моксифлоксацин HCl, гиклат доксициклина, гвайфенезин/d-меторфан, п-эфедрин/cod/хлорфенир, гатифлоксацин, гидрохлорид цетиризина, фуроат мометазона, ксинафоат салметерола, бензонатат, цефалексин, pe/гидрокодон/хлорфенир, цетиризин HCl/псевдоэфедрин, фенилэфрин/cod/прометазин, кодеин/прометазин, цефпрозил, дексаметазон, гвайфенезин/псевдоэфедрин, хлорфенирамин/гидрокодон, недокромил натрия, сульфат тербуталина, эпинефрин, метилпреднизолон, сульфат метапротеренола.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против COPD, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: сульфат альбутерола/ипратропий, ипратропий бромид, салметерол/флутиказон, альбутерол, ксинафоат салметерола, пропионат флутиказона, преднизон, безводный теофиллин, сукцинат метилпреднизолона натрия, монтелукаст натрия, будезонид, фумарат формотерола, ацетонид триамцинолона, левофлоксацин, гвайфенезин, азитромицин, дипропионат беклометазона, левосальбутамол HCl, флунизолид, цефтриаксон натрия, тригидрат амоксициллина, гатифлоксацин, зафирлукаст, амоксициллин/клавуланат, флунизолид/ментол, хлорфенирамин/гидрокодон, сульфат метапротеренола, метилпреднизолон, фуроат мометазона, п-эфедрин/cod/хлорфенир, ацетат пирбутерола, п-эфедрин/лоратадин, сульфат тербуталина, тиотропий бромид, (R,R)-формотерол, TgAAT, циломиласт и рофлумиласт.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против HCV, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: интерферон-альфа-2a, интерферон-альфа-2b, интерферон-альфа con1, интерферон-альфа-n1, пегилированный интерферон-альфа-2a, пегилированный интерферон-альфа-2b, рибавирин, пегинтерферон-альфа-2b+рибавирин, урсодезоксихолевая кислота, глицирризиновая кислота, тималфазин, максамин, VX-497 и любые соединения, которые используют для лечения HCV, посредством препятствия следующим мишеням: полимераза HCV, протеаза HCV, геликаза HCV, IRES (внутренний участок связывания рибосомы) HCV.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против идиопатического легочного фиброза, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: преднизон, азатиоприн, альбутерол, колхицин, сульфат альбутерола, дигоксин, интерферон гамма, сукцинат метилпреднизолона натрия, лоразепам, фуросемид, лизиноприл, нитроглицерин, спиронолактон, циклофосфамид, ипратропий бромид, актиномицин d, альтеплаза, пропионат флутиказона, левофлоксацин, сульфат метапротеренола, сульфат морфина, оксикодон HCl, хлорид калия, ацетонид триамцинолона, безводный такролимус, кальций, интерферон-альфа, метотрексат, микофенолат мофетил, интерферон-гамма-1β.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против инфаркта миокарда, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: аспирин, нитроглицерин, тартрат метопролола, эноксапарин натрия, гепаринат натрия, бисульфат клопидогреля, карведилол, атенолол, сульфат морфина, сукцинат метопролола, варфарин натрия, лизиноприл, мононитрат изосорбида, дигоксин, фуросемид, симвастатин, рамиприл, тенектеплаза, малеат эналаприла, торсемид, ретаваза, лозартан калия, хинаприл HCl/карбонат магния, буметанид, альтеплаза, эналаприлат, гидрохлорид амиодарона, м-гидрат тирофибана HCl, гидрохлорид дилтиазема, каптоприл, ирбесартан, валсартан, гидрохлорид пропранолола, фозиноприл натрия, гидрохлорид лидокаина, эптифибатид, цефазолин натрия, сульфат атропина, аминокапроновая кислота, спиронолактон, интерферон, гидрохлорид соталола, хлорид калия, докузат натрия, добутамин HCl, алпразолам, правастатин натрия, аторвастатин кальция, гидрохлорид мидазолама, гидрохлорид меперидина, динитрат изосорбида, эпинефрин, гидрохлорид дофамина, бивалирудин, розувастатин, эзетимиб/симвастатин, авазимиб и карипорид.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против псориаза, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: низкомолекулярный ингибитор KDR, низкомолекулярный ингибитор Tie-2, кальципотриен, пропионат клобетазола, ацетонид триамцинолона, пропионат галобетазола, тазаротен, метотрексат, флуцинонид, усиленный дипропионат бетаметазона, ацетонид флуоцинолона, ацитретин, tar шампунь, валерианат бетаметазона, фуроат мометазона, кетоконазол, прамоксин/флуцинолон, валеринат гидрокортизона, флурандренолид, мочевина, бетаметазон, пропионат клобетазола/emoll, пропионат флутиказона, азитромицин, гидрокортизон, увлажняющую формулу, фолиевая кислота, дезонид, пимекролимус, каменноугольная смола, диацетат дифлоразона, фолат этанерцепта, молочная кислота, метоксален, hc/субгаллат висмута/znox/resor, ацетат метилпреднизолона, преднизон, крем от загара, галцинонид, салициловая кислота, антралин, клокортолон пивалат, экстракт каменного угля, каменноугольная смола/салициловая кислота, каменноугольная смола/салициловая кислота/сера, дезоксиметазон, диазепам, смягчающее средство, флуцинонид/смягчающее средство, минеральное масло/касторовое масло/лактат натрия, минеральное масло/арахисовое масло, нефть/изопропилмиристат, псорален, салициловая кислота, мыло/трибромсалан, тимеросал/борная кислота, целекоксиб, инфликсимаб, циклоспорин, алефацепт, эфализумаб, такролимус, пимекролимус, PUVA, UVB и сульфасалазин.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против псориатического артрита, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: метотрексат, этанерцепт, рофекоксиб, целекоксиб, фолиевая кислота, сульфасалазин, напроксен, лефлуномид, ацетат метилпреднизолона, индометацин, сульфат гидроксихлороквина, преднизон, сулиндак, усиленный дипропионат бетаметазона, инфликсимаб, метотрексат, фолат, ацетонид триамцинолона, диклофенак, диметилсульфоксид, пироксикам, диклофенак натрия, кетопрофен, мелоксикам, метилпреднизолон, набуметон, толметин натрия, кальципотриен, циклоспорин, диклофенак натрия/мизопростол, флуцинонид, глюкозаминсульфат, тиомалат золота натрия, кислая соль винной кислоты гидрокодона/ацетаминофен, ибупрофен, ризедронат натрия, сульфадиазин, тиогуанин, валдекоксиб, алефацепт, эфализумаб и ингибиторы bcl-2.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против рестеноза, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: сиролимус, паклитаксел, эверолимус, такролимус, зотаролимус, ацетаминофен.

Неограничивающие примеры терапевтических средств против ишиаса, с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: кислая соль винной кислоты гидрокодона/ацетаминофен, рофекоксиб, циклобензаприн HCl, метилпреднизолон, напроксен, ибупрофен, оксикодон HCl/ацетаминофен, целекоксиб, валдекоксиб, ацетат метилпреднизолона, преднизон, фосфат кодеина/ацетаминофен, трамадол HCl/ацетаминофен, метаксалон, мелоксикам, метокарбамол, гидрохлорид лидокаина, диклофенак натрия, габапентин, дексаметазон, каризопродол, кеторолак трометамин, индометацин, ацетаминофен, диазепам, набуметон, оксикодон HCl, тизанидин HCl, диклофенак натрия/мизопростол, напсилат пропоксифена/ацетаминофен, asa/оксикодон/оксикодон ter, ибупрофен/гидрокодон bit, трамадол HCl, этодолак, пропоксифен HCl, амитриптилин HCl, каризопродол/фосфат кодеина/asa, сульфат морфина, поливитамины, напроксен натрия, цитрат орфенадрина и темазепам.

Примеры терапевтических средств против SLE (волчанки), с которыми можно комбинировать связывающие белки по изобретению, включают следующее: NSAID, например, диклофенак, напроксен, ибупрофен, пироксикам, индометацин; ингибиторы COX2, например, целекоксиб, рофекоксиб, валдекоксиб; антитело против малярии, например, гидроксихлороквин; стероиды, например, преднизон, преднизолон, буденозид, дексаметазон; цитотоксические средства, например, азатиоприн, циклофосфамид, микофенолат мофетил, метотрексат; ингибиторы PDE4 или ингибитор синтаза пуринов, например, селлсепт. Связывающие белки по изобретению также можно комбинировать с такими средствами, как сульфасалазин, 5-аминосалициловая кислота, олсалазин, имуран и средства, препятствующие синтезу, продукции или действию провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, например, ингибиторы каспаз, такие как ингибиторы IL-1β-конвертирующего фермента и IL-1ra. Связывающие белки по изобретению также можно использовать с ингибиторами передачи сигнала T-клетками, например, ингибиторами тирозинкиназ; или молекулами, направленными к молекулам активации T-клеток, например, CTLA-4-IgG или антитела к B7-семейству, антитела к семейству PD-1. Связывающие белки по изобретению, можно комбинировать с IL-11 или антителами к цитокинам, например, фонотолизумабом (антителом к IFNg) или рецепторными антителами к рецепторам, например, антителом к рецептору IL-6 и антителам к молекулам на поверхности B-клеток. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие части также можно использовать с LJP 394 (абетимус), средствами, истощающими или инактивирующими B-клетки, например, ритуксимабом (антителом к CD20), лимфостатом-B (антителом к BlyS), антагонистами TNF, например, антителами к TNF, адалимумабом (публикация PCT № WO 97/29131; гумира), CA2 (ремикейд), CDP 571, конструкциями TNFR-Ig, (p75TNFRIgG (ENBREL1 и p55TNFRIgG (ленерцепт)) и ингибиторами bcl-2, так как показано, что сверхэкспрессия bcl-2 у трансгенных мышей вызывает сходный с волчанкой фенотип (см. Marquina et al. (2004) J. Immunol. 172(11):7177-7185), таким образом, ожидают, что ингибирование будет оказывать терапевтическое действие.

Фармацевтические композиции по изобретению могут содержать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" связывающего белка по изобретению. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество связывающего белка может определять специалист в данной области, и оно может варьировать в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и масса индивидуума, и способность связывающего белка вызывать у индивидуума желаемый ответ. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором любое токсическое или приносящее вред действие антитела или части антитела перевешивается положительным терапевтическим воздействием. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, так как профилактическую дозу у индивидуумов используют до заболевания или на его ранних стадиях, профилактически эффективное количество является меньшим, чем терапевтически эффективное количество.

Режимы дозирования можно устанавливать так, чтобы обеспечивать оптимальный желаемый ответ (например, терапевтический или профилактический ответ). Например, можно вводить одну болюсную дозу, можно вводить несколько дробных доз в течение времени или дозу можно пропорционально снижать или повышать, как диктуют требования терапевтической ситуации. Особенно предпочтительно формулировать парентеральные композиции в стандартной лекарственной форме для простоты введения и единообразия дозирования. Термин "стандартная лекарственная форма" относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для млекопитающих, подлежащих лечению; где каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в ассоциации с необходимым фармацевтическим носителем. Характеристики стандартных лекарственных форм по изобретению определяются и напрямую зависят от (a) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, который необходимо достичь, и (b) ограничений, существующих в области составления таких активных соединение для лечения чувствительности у индивидуумов.

Иллюстративный неограничивающий диапазон терапевтически или профилактически эффективного количества связывающего белка по изобретению составляет 0,1-20 мг/кг, например, 1-10 мг/кг. Следует отметить что значения доз в зависимости от типа и тяжести патологического состояния, подлежащего улучшению, могут варьировать. Кроме того, также следует понимать, что у конкретного индивидуума конкретные режимы дозирования с течением времени следует регулировать в соответствии с потребностями индивидуума и профессиональным решением лица, осуществляющего или контролирующего введение композиций, и что диапазоны доз, указанные в настоящем документе, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения области или практического применения заявляемой композиции.

Специалисты в данной области легко поймут, что другие подходящие модификации и адаптации способов по изобретению, описываемых в настоящем документе, являются очевидными и их легко произвести с применением подходящих эквивалентов без отклонения от объема изобретения или вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе. Имея подробное описание настоящего изобретение, то же будет более понятным на основе приводимых ниже примеров, которые включены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения.

V. Диагностические средства

В описание в настоящем документе предоставлены диагностические применения. Ниже это описано дополнительно.

I. Способ анализа

В настоящем описании также предоставлен способ определения присутствия, количества или концентрации анализируемого вещества (или его фрагмента) в тестируемом образце с использованием по меньшей мере одного DVD-Ig, как описано в настоящем документе. В способе можно использовать любой подходящий анализ, как известно в данной области. Примеры в качестве неограничивающих примеров включают иммунологический анализ, такой как иммунологический анализ по типу "сэндвича" (например, иммунологические анализы по типу "сэндвич" с моноклональными антителами, поликлональными антителами и/или DVD-Ig или любые их варианты (например, с моноклональными антителами/DVD-Ig, с DVD-Ig/поликлональными антителами и т.д.), включая детекцию радиоактивных изотопов (радиоиммунологический анализ (RIA)) и детекцию ферментов (ферментный иммунологический анализ (EIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) (например, анализы Quantikine ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN)), иммунологический анализ конкурентного ингибирования (например, прямой и обращенный), иммунологический анализ поляризации флуоресценции (FPIA), способ иммунологического анализа с ферментативным усилением (EMIT), резонансный перенос энергии биолюминисценции (BRET) и гомогенный хемилюминесцентный анализ и т.д. В основанном на SELDI иммунологическом анализе захватывающий реагент, который специфически связывает представляющее интерес анализируемое вещество (или его фрагмент), прикреплен к поверхности масс-спектрометрической мишени, такой как чип с предварительно активированным белком. Затем анализируемое вещество (или его фрагмент) специфически захватывается на биочипе и захваченное анализируемое вещество (или его фрагмент) детектируют посредством масс-спектрометрии. Альтернативно, анализируемое вещество (или его фрагмент) можно элюировать из захватывающего реагента и детектировать посредством традиционной MALDI (лазерная десорбция/ионизация с помощью матрицы) или посредством SELDI. Примером предпочтительного иммунологического анализа является хемилюминесцентный иммунологический анализ на микрочастицах, в частности, анализ с применением автоматизированного анализатора ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).

В практическом осуществлении настоящего описания, например, когда в качестве иммунодиагностического реагента и/или в наборе для иммунологического анализа анализируемого вещества используют DVD-Ig, как описано в настоящем документе, используют способы сбора, манипуляции и обработки мочи, крови, сыворотки и плазмы и других жидкостей организма, хорошо известные в данной области. В дополнение к представляющему интерес анализируемому веществу тестируемый образец может содержать дополнительные молекулы, такие как антитела, антигены, гаптены, гормоны, лекарственные средства, ферменты, рецепторы, белки, пептиды, полипептиды, олигонуклеотиды и/или полинуклеотиды. Например, образец может представлять собой образец цельной крови, получаемый у индивидуума. Необходимой или желательной может являться обработка тестируемого образца, в частности цельной крови, перед иммунологическим анализом, как описано в настоящем документе, например, реагентом для предварительной обработки. Даже в тех случаях, когда предварительная обработка не является обязательной (например, большинство образцов мочи), предварительная обработка необязательно может быть проведена (например, как часть протокола на коммерческой платформе).

Реагент для предварительной обработки может представлять собой любой реагент, подходящий для использования в иммунологическом анализе и наборах по изобретению. Предварительная обработка необязательно включает: (a) один или несколько растворителей (например, метанол и этиленгликоль) и, необязательно, соль, (b) один или несколько растворителей и соль и, необязательно, детергент, (c) детергент или (d) детергент и соль. Реагенты для предварительной обработки известны в данной области, и такую предварительную обработку можно применять, например, как применяют для анализов на Abbott TDx, AxSYM®, и анализов ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), как описано в литературе (Yatscoff et al. (1990) Clin. Chem. 36:1969-1973, и Wallemacq et al. (1999) Clin. Chem. 45:432-435), и/или как коммерчески доступно. Кроме того, предварительную обработку можно проводить, как описано в патенте США № 5135875; патентной публикации Европы № EU0471293; патенте США № 6660843 и патентной заявки США № 20080020401. Реагент для предварительной обработки может представлять собой гетерогенное средство или гомогенное средство.

При применении гетерогенного реагента для предварительной обработки реагент для предварительной обработки осаждает связывающий анализируемое вещество белок (например, белок, который может связывать анализируемое вещество или его фрагмент), присутствующий в образце. Такой этап предварительной обработки включает удаление любого связывающего анализируемое вещество белка посредством разделения осаждаемого связывающего анализируемое вещество белка и супернатанта смеси, образуемой добавлением в образец средства для предварительной обработки. В таком анализе используют супернатант смеси, не содержащий какого либо связывающего белка, переходя непосредственно к этапу захвата антителом.

При применении гомогенного реагента для предварительной обработки такой этап разделения отсутствует. Всю смесь тестируемого образца и реагент для предварительной обработки приводят в контакт с меченым партнером анализируемого вещества (или его фрагмента) по специфическому связыванию, таким как меченое антитело к анализируемому веществу (или его антигенно реактивному фрагменту). Как правило, реагент для предварительной обработки, используемый для такого анализа, в смеси предварительно обрабатываемого тестируемого образца до или в течение захвата первым партнером по специфическому связыванию разбавляют. Несмотря на такое разведение, в смеси тестируемого образца при захвате все еще присутствует (или остается) определенное количество реагента для предварительной обработки. В соответствии с изобретением меченый партнер по специфическому связыванию может представлять собой DVD-Ig (или его фрагмент, вариант или фрагмент варианта).

В гетерогенном формате после получения тестируемого образца у индивидуума получают первую смесь. Смесь содержит тестируемый образец, оцениваемый на наличие анализируемого вещества (или его фрагмента) и первого партнера по специфическому связыванию, где первый партнер по специфическому связыванию и любое анализируемое вещество, содержащиеся в тестируемом образце, формируют комплекс первый партнер по специфическому связыванию - анализируемое вещество. Предпочтительно первым партнером по специфическому связыванию является антитело к анализируемому веществу или его фрагмент. Первый партнер по специфическому связыванию может представлять собой DVD-Ig (или его фрагмент, вариант или фрагмент варианта), как описано в настоящем документе. Порядок, в котором тестируемый образец и первого партнера по специфическому связыванию добавляют с формированием смеси, является несущественным. Предпочтительно, первый партнер по специфическому связыванию иммобилизован на твердой фазе. Твердая фаза, используемая в иммунологическом анализе (для первого партнера по специфическому связыванию и, необязательно, второго партнера по специфическому связыванию), может представлять собой любую твердую фазу, известную в данной области, в качестве неограничивающих примеров, такую как, магнитная частица, гранула, тестовая пробирка, планшет для микротитрования, кювета, мембрана, молекула подложки, пленка, фильтровальная бумага, диск и чип.

После формирования смеси, содержащей комплекс первый партнер по специфическому связыванию-анализируемое вещество, из комплекса любым известным в данной области способом удаляют любое несвязанное анализируемое вещество. Например, несвязанное анализируемое вещество можно удалять посредством отмывки. Однако желательно, чтобы первый партнер по специфическому связыванию присутствовал в большем количестве, чем любое анализируемое вещество, находящееся в тестируемом образце, так, чтобы все анализируемое вещество, присутствующее в тестируемом образце, было связано первым партнером по специфическому связыванию.

После удаления любого несвязанного анализируемого вещества в смесь добавляют второго партнера по специфическому связыванию с формированием комплекса первый партнер по специфическому связыванию-анализируемое вещество-второй партнер по специфическому связыванию. Предпочтительно, второй партнер по специфическому связыванию представляет собой антитело к анализируемому веществу, связывающее на анализируемом веществе эпитоп, отличающийся от эпитопа на анализируемом веществе, связываемого первым партнером по специфическому связыванию. Кроме того, также предпочтительно, чтобы второй партнер по специфическому связыванию являлся меченым или содержащим детектируемую метку, как описано выше. Вторым партнером по специфическому связыванию может являться DVD-Ig (или его фрагмент, вариант или фрагмент варианта), как описано в настоящем документе.

Можно использовать любую подходящую детектируемую метку, известную в данной области. Например, детектируемая метка может представлять собой радиоактивную метку (такую как ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, ³²P и ³³P), ферментативную метку (такую как пероксидаза хрена, щелочная пероксидаза, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа и т.п.), хемилюминесцентную метку (такую как сложные акридиниевые эфиры, сложные тиоэфиры или сульфонамиды; люминол, изолюминол, сложные фенантридиниевые эфиры и т.п.), флуоресцентную метку (такую как флуоресцеин (например, 5-флуоресцеин, 6-карбоксифлуоресцеин, 3'6-карбоксифлуоресцеин, 5(6)-карбоксифлуоресцеин, 6-гексахлорфлуоресцеин, 6-тетрахлорфлуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат и т.п.)), родамин, фикобилипротеины, R-фикоэритрин, квантовые точки (например, покрытый сульфидом цинка селенид кадмия), термометрическую метку или иммунную метку полимеразной цепной реакции. Введение в метки, способы мечения и детекции меток находится в Polak and Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2nd ed., Springer Verlag, N.Y. (1997), и в Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), которое является комбинированным руководством и каталогом, опубликованном Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon. Флуоресцентную метку можно использовать в FPIA (патенты США №№ 5593896; 5573904; 5496925; 5359093 и 5352803). Акридиниевое соединение можно использовать в качестве детектируемой метки в гомогенном или гетерогенном хемилюминесцентном анализе (Adamczyk et al. (2006) Bioorg. Med. Chem. Lett. 16:1324-1328; Adamczyk et al. (2004) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:2313-2317; Adamczyk et al. (2004) Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921; и Adamczyk et al. (2003) Org. Lett. 5:3779-3782).

Предпочтительным акридиниевым соединением является акридиний-9-карбоксамид. Способы получения акридиний-9-карбоксамидов описаны в Mattingly (1991) J. Biolumin. Chemilumin. 6:107-114; Adamczyk et al. (1998) J. Org. Chem. 63:5636-5639; Adamczyk et al. (1999) Tetrahedron 55:10899-10914; Adamczyk et al. (1999) Org. Lett. 1:779-781; Adamczyk et al. (2000) Bioconjug. Chem. 11:714-724; Mattingly et al., In Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, Ed. (2002) CRC Press: Boca Raton, pp. 77-105; Adamczyk et al. (2003) Org. Lett. 5:3779-3782; и в патентах США №№ 5468646; 5543524 и 5783699. Другим предпочтительным акридиниевым соединением является сложный акридиний-9-карбоксилатариловый эфир. Пример сложного акридиний-9-карбоксилатарилового сложного эфира является 10-метил-9-(феноксикарбонил)акридинийфторсульфонат (доступный в Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Способы получения сложных акридиний-9-карбоксилатариловых эфиров описаны в McCapra et al. (1965) Photochem. Photobiol. 4:1111-21; Razavi et al. (2000) Luminescence 15:245-249; Razavi et al. (2000) Luminescence 15:239-244; и патенте США № 5241070. Дополнительные подробности относительно сложного акридиний-9-карбоксилатарилового эфира и его применения приведены в патентной публикации США № 20080248493.

Хемилюминесцентные анализы (например, с использованием акридиния, как описано выше, или других хемилюминесцентных средств) можно проводить способами, описанными в Adamczyk et al. (2006) Anal. Chim. Acta 579(1):61-67. Хотя можно использовать любой подходящий формат анализа, быстрый анализ нескольких образцов в малых объемах обеспечивает микропланшетный хемилюминометр (Mithras LB-940, Berthold Technologies USA, LLC, Oak Ridge, TN).

Порядок, в котором тестируемый образец и партнера(ов) по специфическому связыванию добавляют для формирования смеси для хемилюминесцентного анализа, является несущественным. Если первый партнер по специфическому связыванию детектируемо мечен хемилюминесцентным средством, таким как акридиниевое соединение, формируются детектируемо меченые комплексы первый партнер по специфическому связыванию-анализируемое вещество. Альтернативно, если используют второго партнера по специфическому связыванию и второй партнер по специфическому связыванию детектируемо мечен хемилюминесцентным средством, таким как акридиниевое соединение, формируются детектируемо меченые комплексы первый партнер по специфическому связыванию-анализируемое вещество-второй партнер по специфическому связыванию. Любого партнера по специфическому связыванию, меченого или немеченого, можно удалять из смеси любым известным в данной области способом, таким как отмывка.

Пероксид водорода можно получать в смеси in situ или предоставлять или добавлять в смесь (например, источниками пероксида водорода являются один или несколько буферов или других растворов, которые, как известно, содержат пероксид водорода) до, одновременно или после добавления описанного выше акридиниевого соединения. Пероксид водорода можно получать in situ рядом способов, известных специалистам в данной области.

После одновременного или последовательного добавления в образец по меньшей мере одного раствора основания, получают детектируемый сигнал, а именно хемилюминесцентный сигнал, указывающий на присутствие анализируемого вещества. Раствор основания содержит по меньшей мере одно основание, и его pH является большим или равным 10, предпочтительно, большим или равным 12. Примеры растворов оснований в качестве неограничивающих примеров включают гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция, гидроксид аммония, гидроксид магния, карбонат натрия, бикарбонат натрия, гидроксид кальция, карбонат кальция и бикарбонат кальция. Количество раствора основания, добавляемого в образец, зависит от концентрации раствора основания. Специалист в данной области, основываясь на концентрации используемого раствора основания, может легко определить количество раствора основания для добавления в образец.

Получаемый хемилюминесцентный сигнал можно детектировать стандартными способами, известными специалистам в данной области. На основе интенсивности получаемого сигнала можно определять количество анализируемого вещества в образце. Конкретно, количество анализируемого вещества в образце пропорционально интенсивности получаемого сигнала. Количество присутствующего анализируемого вещества можно определять, сравнивая величину получаемого света со стандартной кривой для анализируемого вещества или сравнивая с контрольным стандартом. Стандартную кривую можно получать с использованием серийных разведений или растворов с известными концентрациями анализируемого вещества посредством масс-спектроскопии, гравиметрическими способами и другими известными в данной области способами. Хотя указанное выше описано с упором на использование в качестве хемилюминесцентного средства акридиниевого соединения, специалист в данной области может легко адаптировать это описание для использования других хемилюминесцентных средств.

Как правило, иммунологические анализы анализируемых веществ можно проводить с использованием любого известного в данной области формата, в качестве неограничивающих примеров, такого как формат по типу "сэндвича". Конкретно, в одном из форматов иммунологического анализа для разделения и количественного определения в образце анализируемого вещества, такого как анализируемое вещество человека или его фрагмент, используют по меньшей мере два антитела. Более конкретно, по меньшей мере два антитела связываются с различными эпитопами на анализируемом веществе (или его фрагменте), формируя иммунный комплекс, который обозначают как "сэндвич". Как правило, в иммунологических анализах одно или несколько антител можно использовать для захвата анализируемого вещества (или его фрагмента) из тестируемого образца (эти антитела часто обозначают как "захватывающее" антитело или "захватывающие" антитела), и одно или несколько антител можно использовать для связывания детектируемой (а именно, количественно определяемой) метки c "сэндвичем" (эти антитела часто обозначают как "детекционное антитело", "детекционные антитела", "конъюгат" или "конъюгаты"). Таким образом, в отношении формата иммунологического анализа типа "сэндвич" связывающий белок или DVD-Ig (или его фрагмент, вариант или фрагмент варианта), как описано в настоящем документе, можно использовать в качестве захватывающего антитела, детекционного антитела или обоих. Например, один связывающий белок или DVD-Ig с доменом, который может связывать на анализируемом веществе (или его фрагменте) первый эпитоп, можно использовать в качестве захватывающего антитела и/или другой связывающий белок или DVD-Ig с доменом, который может связывать на анализируемом веществе (или его фрагменте) второй эпитоп, можно использовать в качестве детекционного антитела. В отношении этого, связывающий белок или DVD-Ig с первым доменом, который может связывать на анализируемом веществе (или его фрагменте) первый эпитоп, и вторым доменом, который может связывать на анализируемом веществе (или его фрагменте) второй эпитоп, можно использовать в качестве захватывающего антитела и/или детекционного антитела. Альтернативно, один связывающий белок или DVD-Ig с первым доменом, который может связывать эпитоп на первом анализируемом веществе (или его фрагменте), и вторым доменом, который может связывать эпитоп на втором анализируемом веществе (или его фрагменте), можно использовать в качестве захватывающего антитела и/или детекционного антитела для детекции, и необязательно количественной, двух или более анализируемых веществ. В случае, когда анализируемое вещество может присутствовать в образце более чем в одной форме, такой как мономерная форма и димерная/мультимерная форма, которая может быть гомомерной или гетеромерной, в качестве захватывающих антител и/или детекционных антител можно использовать один связывающий белок или DVD-Ig с доменом, который может связывать эпитоп, который экспонирован только на мономерной форме, и другой связывающий белок или DVD-Ig с доменом, который может связывать эпитоп на другой части димерной/мультимерной формы, таким образом, обеспечивая детекцию и оптимальное количественно определение различных форм данного анализируемого вещества. Кроме того, использование DVD-Ig с различными аффинностями в одном связывающем белке или DVD-Ig и/или у разных связывающих белков или DVD-Ig может обеспечить преимущество аффинности. В отношении иммунологических анализов, как описано в настоящем документе, как правило, полезным или желательным может являться введение в структуру связывающего белка или DVD-Ig одного или нескольких линкеров. Когда он присутствует, линкер оптимально должен обладать достаточной длиной и структурной подвижностью, чтобы обеспечить связывание эпитопа внутренними доменами, а также связывание другого эпитопа внешними доменами. В отношении этого, если связывающий белок или DVD-Ig могут связывать два различных анализируемых вещества, и одно анализируемое вещество является большим, чем другое, желательно, чтобы большее анализируемое вещество связывали внешние домены.

В общем случае образец, тестируемый (например, в котором предполагают наличие) на анализируемое вещество (или его фрагмент), одновременно или последовательно и в любом порядке можно приводить в контакт по меньшей мере с одним захватывающим антителом (или антителами) и по меньшей мере одним детекционным антителом (которое может представлять собой второе детекционное антитело или третье детекционное антитело или даже последовательно пронумерованное антитело, например, когда захватывающие и/или детекционные антитела содержат несколько антител). Например, тестируемый образец сначала можно приводить в контакт по меньшей мере с одним захватывающим антителом, а затем (последовательно) по меньшей мере с одним детекционным антителом. Альтернативно, тестируемые образец можно сначала приводить в контакт по меньшей мере с одним детекционным антителом, а затем (последовательно) по меньшей мере с одним захватывающим антителом. В еще одной альтернативе тестируемый образец можно приводить в контакт одновременно с захватывающим антителом и детекционным антителом.

В формате анализа типа "сэндвич" образец, в котором предполагают наличие анализируемого вещества (или его фрагмента), сначала приводят в контакт по меньшей мере с одним первым захватывающим антителом в условиях, обеспечивающих формирование комплекса первого антитела/анализируемого вещества. Если используют более одного захватывающего антитела, формируется комплекс первого захватывающего антитела/анализируемого вещества, содержащий два или более захватывающих антител. В анализе по типу "сэндвич" антитела, т.е., предпочтительно, по меньшей мере одно захватывающее антитело, используют в молярном избытке относительно максимального количества анализируемого вещества (или его фрагмента), ожидаемого в тестируемом образце. Например, можно использовать приблизительно от 5 мкг до приблизительно 1 мг антитела на мл буфера (например, буфера для покрытия микрочастиц).

Иммунологические анализы конкурентного ингибирования, которые часто используют для измерения небольших анализируемых веществ, так как необходимо связывание только одним антителом, включают последовательный и классический форматы. В последовательном иммунологическом анализе конкурентного ингибирования захватывающее антитело к представляющему интерес анализируемому веществу наносят на лунки планшета для микротитрования или другую твердую подложку. Когда в лунку добавляют образец, содержащий представляющее интерес анализируемое вещество, представляющее интерес анализируемое вещество связывается с захватывающим антителом. После отмывки в лунку добавляют известное количество меченого (например, биотином или пероксидазой хрена (HRP)) анализируемого вещества. Для ферментативной метки для получения сигнала необходим субстрат. Пример подходящего субстрата для HRP представляет собой 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB). После отмывки измеряют полученный сигнал от меченого анализируемого вещества, и он обратно пропорционален количеству анализируемого вещества в образце. В классическом иммунологическом анализе конкурентного ингибирования на твердую подложку наносят антитело к представляющему интерес анализируемому веществу (например, лунку планшета для микротитрования). Однако в отличие от последовательного иммунологического анализа конкурентного ингибирования, образец и меченое анализируемое вещество добавляют в лунку одновременно. Любое анализируемое вещество в образце конкурирует с меченым анализируемым веществом за связывание с захватывающим антителом. После отмывки измеряют сигнал, получаемый от меченого анализируемого вещества, и он обратно пропорционален количеству анализируемого вещества в образце.

Необязательно, перед приведением тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним захватывающим антителом (например, первым захватывающим антителом), по меньшей мере одно захватывающее антитело можно связывать с твердой подложкой, которая облегчает выделение комплекса первого антитела/анализируемого вещества (или его фрагмента) из тестируемого образца. Субстрат, с которым связывают захватывающее антитело, может представлять собой любую подходящую твердую подложку или твердую фазу, которая облегчает выделение комплекса захватывающее антитело-анализируемое вещество из образца.

Примеры включают лунку планшета, такого как планшет для микротитрования, тестовую пробирку, пористый гель (например, силикагель, агароза, декстран, или желатин), полимерную пленку (например, полиакриламид), гранулы (например, полистироловые гранулы или магнитные гранулы), полосу фильтра/мембраны (например, нитроцеллюлозную или нейлоновую), микрочастицы (например, латексные частицы, намагничивающиеся микрочастицы (например, микрочастицы с сердцевинами из оксида железа или оксида хрома и гомо- или гетерополимерными покрытиями и радиусом приблизительно 1-10 микрометров)). Субстрат может содержать подходящий пористый материал с аффинностью поверхности, подходящей для связывания антигенов и достаточной пористостью, чтобы обеспечить посредством детекции антителами. Как правило, предпочтителен микропористый материал, хотя можно использовать гелеобразный материал в гидратированном состоянии. Такие пористые субстраты предпочтительно находятся в форме слоев с толщиной приблизительно от 0,01 до приблизительно 0,5 мм, предпочтительно приблизительно 0,1 мм. Хотя размер пор может существенно варьировать, предпочтительно размер пор составляет приблизительно от 0,025 до приблизительно 15 микрометров, более предпочтительно приблизительно от 0,15 до приблизительно 15 микрометров. Поверхность таких субстратов можно активировать химическими процессами, обеспечивающими ковалентную связь антител с субстратом. Проводят необратимое связывание, как правило, посредством адсорбции вследствие гидрофобных взаимодействий антигена или антитела с субстратом; альтернативно, можно использовать средство для химического связывания или другие средства для ковалентного связывания антитела с субстратом при условии, что такое связывание не препятствует возможности антитела связываться с анализируемым веществом. Альтернативно, антитело можно связывать с микрочастицами, которые ранее были покрыты стрептавидином (например, DYNAL® Magnetic Beads, Invitrogen, Carlsbad, CA) или биотином (например, с использованием покрытых стрептавидином микрочастиц Power-BindTM-SA-MP (Seradyn, Indianapolis, IN)) или видоспецифичными моноклональными антителами. Если необходимо, субстрат можно дериватизировать для обеспечения реакционной способности различных функциональных групп на антителе. Такая дериватизация требует применения определенных связывающих средств, примеры которых в качестве неограничивающих примеров включают малеиновый ангидрид, N-гидроксисукцинимид и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид. При желании, с твердой фазой в различных физических или адресуемых положениях (например, так, как в конфигурации биочипа (см., например, патенты США №№ 6225047; 6329209; и 5242828 и публикации PCT №№ WO 99/51773 и WO 00/56934)) можно связывать один или несколько захватывающих реагентов, таких как антитела (или их фрагменты), каждый из которых специфичен к анализируемому веществу(ам). Если захватывающий реагент в качестве твердой подложки связан с масс-спектрометрической мишенью, количество анализируемого вещества, связанного с мишенью, можно детектировать посредством масс-спектрометрии с лазерной десорбцией-ионизацией. Альтернативно, одну колонку можно упаковывать различными гранулами, дериватизированными одним или несколькими захватывающими реагентами, таким образом захватывая анализируемое вещество в одном положении (см. технологии на основе гранул с дериватизированными антителами, например, технологию xMAP Luminex (Austin, TX)).

После приведения тестируемого образца, оцениваемого на наличие анализируемого вещества (или его фрагмента), в контакт по меньшей мере с одним захватывающим антителом (например, первым захватывающим антителом), смесь инкубируют для обеспечения формирования комплекса первое антитело (или несколько антител)-анализируемое вещество (или его фрагмент). Инкубацию можно проводить при pH приблизительно от 4,5 до приблизительно 10,0, при температуре приблизительно от 2°C до приблизительно 45°C и в течение периода по меньшей мере приблизительно от одной (1) минуты до приблизительно восемнадцати (18) часов, предпочтительно приблизительно от 1 до приблизительно 24 минут, наиболее предпочтительно в течение приблизительно от 4 до приблизительно 18 минут. Иммунологический анализ, описываемый в настоящем документе, можно проводить за один этап (что означает, что тестируемый образец, по меньшей мере одно захватывающее антитело и по меньшей мере одно детекционное антитело все последовательно или одновременно добавляют в реакционный сосуд) или более чем за один этап, например, за два этапа, три этапа и т.д.

После формирования комплекса (первого или нескольких) захватывающего антитела/анализируемого вещества (или его фрагмента), комплекс затем приводят в контакт по меньшей мере с одним детекционным антителом в условиях, обеспечивающих формирование комплекса (первого или нескольких) захватывающего антитела/анализируемого вещества (или его фрагмента)/второго детекционного антитела. Хотя для ясности указывают как "второе" антитело (например, второе детекционное антитело), фактически, когда для захвата и/или детекции используют несколько антител, по меньшей мере одно детекционное антитело может быть вторым, третьим, четвертым и т.д. антителами, используемыми в иммунологическом анализе. Если комплекс захватывающего антитела/анализируемого вещества (или его фрагмента) приводят в контакт более чем с одним детекционным антителом, тогда формируется комплекс (первого или нескольких) захватывающего антитела/анализируемого вещества (или его фрагмента)/(нескольких) детекционного антитела. Как и в случае захватывающего антитела (например, первого захватывающего антитела), когда по меньшей мере одно (например, второе и любое последовательное) детекционное антитело приводят в контакт с комплексом захватывающего антитела/анализируемого вещества (или его фрагмента), для формирования комплекса (первого или нескольких) захватывающего антитела/анализируемого вещества (или его фрагмента)/(второго или нескольких) детекционного антитела необходим период инкубации в условиях, сходных с условиями, описанными выше. Предпочтительно, по меньшей мере одно детекционное антитело содержит детектируемую метку. Детектируемую метку можно связывать по меньшей мере с одним детекционным антителом (например, вторым детекционным антителом) до, одновременно или после формирования комплекса (первого или нескольких) захватывающего антитела/анализируемого вещества (или его фрагмента)/(второго или нескольких) детекционного антитела. Можно использовать любую детектируемую метку, известную в данной области (см. описание выше, включая Polak and Van Noorden (1997) и ссылки в Haugland (1996)).

Детектируемую метку можно связывать с антителами непосредственно или посредством связывающего средства. Примером связывающего средства, которое можно использовать, является EDAC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, гидрохлорид), которое является коммерчески доступным в Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. В данной области известны другие связывающие средства, которые можно использовать. Способы связывания детектируемой метки с антителом известны в данной области. Дополнительно можно приобретать или синтезировать множество детектируемых меток, которые уже содержат концевые группы, которые облегчают связывание детектируемой метки с антителом, таких как CPSP-сложный акридиниевый эфир (т.е., 9-[N-тозил-N-(3-карбоксипропил)]-10-(3-сульфопропил)акридинийкарбоксамид) или SPSP-сложный акридиниевый эфир (т.е., N10-(3-сульфопропил)-N-(3-сульфопропил)-акридиний-9-карбоксамид).

До количественного определения метки комплекс (первого или нескольких) захватывающего антитела/анализируемого вещества/(второго или нескольких) детекционного антитела можно, но не обязательно, отделять от оставшегося тестируемого образца. Например, если по меньшей мере одно захватывающее антитело (например, первое захватывающее антитело) связано с твердой подложкой, такой как лунка или гранула, разделение можно проводить посредством прекращения контакта жидкости (тестируемого образца) с твердой подложкой. Альтернативно, если по меньшей мере первое захватывающее антитело связано с твердой подложкой, его можно одновременно приводить в контакт с содержащим анализируемое вещество образцом и по меньшей мере одним вторым детекционным антителом с формированием комплекса первого (нескольких) антитело/анализируемого вещества/второго (нескольких) антитела с последующим прекращением контакта жидкости (тестируемого образца) с твердой подложкой. Если по меньшей мере одно первое захватывающее антитело не связано с твердой подложкой, тогда комплекс (первого или нескольких) захватывающего антитела/анализируемого вещества/(второго или нескольких) детекционного антитела для количественного определения метки из тестируемого образца удалять не обязательно.

После формирования комплекса меченого захватывающего антитела/анализируемого вещества/детекционного антитела (например, комплекса первого захватывающего антитела/анализируемого вещества/второго детекционного антитела), известными в данной области способами определяют количество метки в комплексе. Например, если используют ферментативную метку, проводят реакцию меченого комплекса с субстратом для метки, что приводит к количественно определяемой реакции, такой как развитие окраски. Если метка представляет собой радиоактивную метку, метку количественно определяют с использованием подходящих средств, таких как сцинтилляционный счетчик. Если метка представляет собой флуоресцентную метку, метку количественно определяют, активируя метку светом одного цвета (который часто известен как "длина волны возбуждения") и детектируя другой цвет (который известен как "длина волны испускания"), который метка испускает в ответ на активацию. Если метка представляет собой хемилюминесцентную метку, метку количественно определяют посредством детекции испускаемого света визуально или с использованием люминометров, рентгеновской пленки, пленки для высокоскоростной фотографии, CCD-камеры и т.д. После определения количества метки в комплексе определяют концентрацию анализируемого вещества или его фрагмента в тестируемом образце подходящими способами, такими как использование стандартной кривой, которую получают с использованием серийных разведений анализируемого вещества или его фрагмента с известной концентрацией. Кроме использования серийных разведений анализируемого вещества или его фрагмента стандартную кривую можно получать гравиметрически, посредством масс-спектроскопии и другими известными в данной области способами.

При хемилюминесцентном анализе микрочастиц, применяемом в анализаторе ARCHITECT®, pH разбавителя конъюгата должен составлять приблизительно 6,0±0,2, буфер для покрытия микрочастиц необходимо поддерживать приблизительно при комнатной температуре (т.е., приблизительно при температуре от 17 до приблизительно 27°C), pH буфера для покрытия микрочастиц должен составлять приблизительно 6,5±0,2, и pH разбавителя микрочастиц должен составлять приблизительно 7,8±0,2. Предпочтительно твердые вещества составляют менее чем приблизительно 0,2%, например, менее чем приблизительно 0,15%, менее чем приблизительно 0,14%, менее чем приблизительно 0,13%, менее чем приблизительно 0,12% или менее чем приблизительно 0,11%, например, приблизительно 0,10%.

FPIA основан на принципах иммунологического анализа конкурентного связывания. Флуоресцентно меченое соединение при возбуждении плоскополяризованным светом испускает флуоресцентное свечение со степенью поляризации, обратно пропорциональной его степени вращения. Когда плоскополяризованным светом возбуждают комплекс флуоресцентно меченый трейсер-антитело, испускаемый свет остается высокополяризованным, так как вращение флуорофора между временем поглощения света и временем испускания света затруднено. Когда плоскополяризованным светом возбуждают "свободное" трейсерное соединение (т.е., соединение, не связанное с антителом), его вращение является намного более быстрым, чем у соответствующего конъюгата трейсер-антитело (или трейсерного связывающего белка и/или трейсерного DVD-Ig), получаемое в иммунологическом анализе конкурентного связывания. FPIA являются более предпочтительными, чем RIA, так как отсутствуют радиоактивные вещества, требующие специальных обращения и ликвидации. Кроме того, FPIA являются гомогенными анализами, которые можно проводить легче и быстрее.

Ввиду указанного выше, предоставлен способ определения присутствия, количества или концентрации анализируемого вещества (или его фрагмента) в тестируемом образце. Способ включает определение в тестируемом образце анализируемого вещества (или его фрагмента) посредством анализа (i) с применением (i') по меньшей мере одного антитела, фрагмента антитела, которые могут связывать анализируемое вещество, варианта антитела, который может связывать анализируемое вещество, фрагмента варианта антитела, который может связывать анализируемое вещество (или трейсерный связывающий белок и/или трейсерное DVD-Ig), и DVD-Ig (или его фрагмент, вариант или фрагмент варианта), которое может связывать анализируемое вещество, и (ii') по меньшей мере одной детектируемой метки, и (ii) включает сравнение сигнала, получаемого с детектируемой метки в качестве прямого или косвенного показателя присутствия, количества или концентрации анализируемого вещества (или его фрагмента) в тестируемом образце, с сигналом, получаемым в качестве прямого или косвенного показателя присутствия, количества или концентрации анализируемого вещества (или его фрагмента) в контроле или калибровочном стандарте. Калибровочный стандарт необязательно представляет собой часть набора калибровочных стандартов, где каждый из калибровочных стандартов отличается от других калибровочных стандартов концентрацией анализируемого вещества.

Способ может включать (i) приведение тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним первым партнером анализируемого вещества (или его фрагмента) по специфическому связыванию, выбранным из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела, которые могут связывать анализируемое вещество, варианта антитела, который может связывать анализируемое вещество, фрагмента варианта антитела, который может связывать анализируемое вещество, и DVD-Ig (или его фрагмента, варианта или фрагмента варианта), которое может связывать анализируемое вещество так, что формируется комплекс первого партнера по специфическому связыванию/анализируемого вещества (или его фрагмента), (ii) приведение комплекса первого партнера по специфическому связыванию/анализируемого вещества (или его фрагмента) в контакт по меньшей мере с одним вторым партнером анализируемого вещества (или его фрагмента) по специфическому связыванию, выбранным из группы, состоящей из детектируемо меченого антитела к анализируемому веществу, детектируемо меченого фрагмента антитела к анализируемому веществу, который может связывать анализируемое вещество, детектируемо меченого варианта антитела к анализируемому веществу, который может связывать анализируемое вещество, детектируемо меченого фрагмента варианта антитела к анализируемому веществу, который может связывать анализируемое вещество, и детектируемо меченого DVD-Ig (или его фрагмента, варианта или фрагмент варианта) так, что формируется комплекс первого партнера по специфическому связыванию/анализируемого вещества (или его фрагмента)/второго партнера по специфическому связыванию, и (iii) определение присутствия, количества или концентрации анализируемого вещества в тестируемом образце посредством детекции или измерения сигнала, продуцируемого детектируемой меткой в комплексе первого партнера по специфическому связыванию/анализируемого вещества (или его фрагмента)/второго партнера по специфическому связыванию, формируемом в (ii). Предпочтительным может являться способ, в котором по меньшей мере один первый партнер анализируемого вещества (или его фрагмента) по специфическому связыванию и/или по меньшей мере один второй партнер анализируемого вещества (или его фрагмента) по специфическому связыванию представляет собой DVD-Ig (или его фрагмент, вариант или фрагмент варианта), как описано в настоящем документе.

Альтернативно, способ может включать приведение тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним первым партнером анализируемого вещества (или его фрагмента) по специфическому связыванию, выбранным из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела, который может связывать анализируемое вещество, варианта антитела, который может связывать анализируемое вещество, фрагмента варианта антитела, который может связывать анализируемое вещество, и DVD-Ig (или его фрагмента, варианта или фрагмента варианта), и одновременное или последовательное, в любом порядке, приведение тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним вторым партнером по специфическому связыванию, который может конкурировать с анализируемым веществом (или его фрагментом) за связывание по меньшей мере с одним первым партнером по специфическому связыванию и который выбран из группы, состоящей из детектируемо меченого анализируемого вещества, детектируемо меченого фрагмента анализируемого вещества, который может связывать первого партнера по специфическому связыванию, детектируемо меченого варианта анализируемого вещества, который может связывать первого партнера по специфическому связыванию, и детектируемо меченого фрагмента варианта анализируемого вещества, который может связывать первого партнера по специфическому связыванию. Любое анализируемое вещество (или его фрагмент), присутствующее в тестируемом образце, и по меньшей мере один второй партнер по специфическому связыванию конкурируют друг с другом за формирование комплекса первого партнера по специфическому связыванию/анализируемого вещества (или его фрагмента) и комплекса первого партнера по специфическому связыванию/второго партнера по специфическому связыванию, соответственно. Способ дополнительно включает определение присутствия, количества или концентрации анализируемого вещества в тестируемом образце посредством детекции или измерения сигнала, продуцируемого детектируемой меткой в комплексе первого партнера по специфическому связыванию/второго партнера по специфическому связыванию, формируемом в (ii), где сигнал, продуцируемый детектируемой меткой в комплексе первого партнера по специфическому связыванию/второго партнера по специфическому связыванию, обратно пропорционален количеству или концентрации анализируемого вещества в тестируемом образце.

Указанные выше способы могут дополнительно включать диагностику, прогноз или оценку эффективности терапевтического/профилактического лечения пациента, у которого получен тестируемый образец. Если способ дополнительно включает оценку эффективности терапевтического/профилактического лечения пациента, у которого получен тестируемый образец, способ по мере необходимости необязательно дополнительно включает изменение терапевтического/профилактического лечения пациента для улучшения эффективности. Способ можно адаптировать для применения в автоматизированной системе или полуавтоматизированной системе.

Более конкретно, предоставлен способ определения присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце. Способ включает анализ тестируемого образца на антиген (или его фрагмент) посредством иммунологического анализа. В иммунологическом анализе (i) используют по меньшей мере один связывающий белок и по меньшей мере одну детектируемую метку и (ii) проводят сравнение сигнала, продуцируемого детектируемой меткой как прямого или косвенного показателя присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце, с сигналом, продуцируемым как прямой или косвенный показатель присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в контроле или калибровочном стандарте. Калибровочный стандарт необязательно представляет собой часть набора калибровочных стандартов, где каждый из калибровочных стандартов отличается от других калибровочных стандартов в наборе концентрацией антигена (или его фрагмента). По меньшей мере один связывающий белок (i') содержит полипептидную цепь, содержащую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, в которой VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из первого исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из второго исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела, C представляет собой константный домен тяжелой цепи, (X1)n представляет собой линкер, который присутствует необязательно и, когда присутствует, отличается от CH1, и (X2)n представляет собой Fc-область, которая присутствует необязательно, и (ii') может связывать пару антигенов. Способ может включать (i) приведение тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним захватывающим средством, которое связывает эпитоп на антигене (или его фрагменте) так, что формируется комплекс захватывающего средства/антигена (или его фрагмента), (ii) приведение комплекса захватывающего средства/антигена (или его фрагмента) в контакт по меньшей мере с одним детектирующим средством, которое содержит детектируемую метку и связывает эпитоп на антигене (или его фрагменте), не связанный захватывающим средством, с формированием комплекса захватывающего средства/антигена (или его фрагмента)/детекционного средства, и (iii) определение присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце на основе сигнала, продуцируемого детектируемой меткой в комплексе захватывающего средства/антигена (или его фрагмента)/детекционного средства, формируемом в (ii), где по меньшей мере одно захватывающее средство и/или по меньшей мере одно детекционное средство представляют собой по меньшей мере один связывающий белок. Альтернативно, способ может включать (i) приведение тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним захватывающим средством, которое связывает эпитоп на антигене (или его фрагменте) так, что формируется комплекс захватывающего средства/антигена (или его фрагмента), и одновременное или последовательное, в любом порядке, приведение тестируемого образца в контакт с детектируемо меченым антигеном (или его фрагментом), который может конкурировать с любым антигеном (или его фрагментом) в тестируемом образце за связывание по меньшей мере с одним захватывающим средством, где любой антиген (или его фрагмент), присутствующий в тестируемом образце, и детектируемо меченый антиген конкурируют друг с другом за формирование комплекса захватывающего средства/антигена (или его фрагмента) и комплекса захватывающего средства/детектируемо меченого антигена (или его фрагмента), соответственно, и (ii) определение присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце на основе сигнала, продуцируемого детектируемой меткой в комплексе захватывающего средства/детектируемо меченого антигена (или его фрагмента), формируемом в (ii), где по меньшей мере одно захватывающее средство представляют собой по меньшей мере один связывающий белок, и где сигнал, продуцируемый детектируемой меткой в комплексе захватывающего средства/детектируемо меченого антигена (или его фрагмента), обратно пропорционален количеству или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце. Тестируемый образец можно получать у пациента, в случае чего способ может дополнительно включать диагностику, прогноз или оценку эффективности терапевтического/профилактического лечения пациента. Если способ дополнительно включает оценку эффективности терапевтического/профилактического лечения пациента, способ по мере необходимости необязательно дополнительно включает изменение терапевтического/профилактического лечения пациента для улучшения эффективности. Способ можно адаптировать для применения в автоматизированной системе или полуавтоматизированной системе.

Предоставлен другой способ определения присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце. Способ включает анализ тестируемого образца на антиген (или его фрагмент) посредством иммунологического анализа. В иммунологическом анализе (i) используют по меньшей мере один связывающий белок и по меньшей мере одну детектируемую метку и (ii) проводят сравнение сигнала, продуцируемого детектируемой меткой как прямого или косвенного показателя присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце, с сигналом, продуцируемым как прямой или косвенный показатель присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в контроле или калибровочном стандарте. Калибровочный стандарт необязательно представляет собой часть набора калибровочных стандартов, где каждый из калибровочных стандартов отличается от других калибровочных стандартов в наборе концентрацией антигена (или его фрагмента). По меньшей мере один связывающий белок (i') содержит полипептидную цепь, содержащую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, в которой VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из первого исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из второго исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела, C представляет собой константный домен легкой цепи, (X1)n представляет собой линкер, который присутствует необязательно и, когда присутствует, отличается от CH1, и (X2)n представляет собой Fc-область, которая присутствует необязательно, и (ii') может связывать пару антигенов. Способ может включать (i) приведение тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним захватывающим средством, которое связывает эпитоп на антигене (или его фрагменте) так, что формируется комплекс захватывающего средства/антигена (или его фрагмента), (ii) приведение комплекса захватывающего средства/антигена (или его фрагмента) в контакт по меньшей мере с одним детектирующим средством, которое содержит детектируемую метку и связывает эпитоп на антигене (или его фрагменте), не связанный захватывающим средством, с формированием комплекса захватывающего средства/антигена (или его фрагмента)/детекционного средства, и (iii) определение присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце на основе сигнала, продуцируемого детектируемой меткой в комплексе захватывающего средства/антигена (или его фрагмента)/детекционного средства, формируемом в (ii), где по меньшей мере одно захватывающее средство и/или по меньшей мере одно детекционное средство представляют собой по меньшей мере один связывающий белок. Альтернативно, способ может включать (i) приведение тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним захватывающим средством, которое связывает эпитоп на антигене (или его фрагменте) так, что формируется комплекс захватывающего средства/антигена (или его фрагмента), и одновременное или последовательное, в любом порядке, приведение тестируемого образца в контакт с детектируемо меченым антигеном (или его фрагментом), который может конкурировать с любым антигеном (или его фрагментом) в тестируемом образце за связывание по меньшей мере с одним захватывающим средством, где любой антиген (или его фрагмент), присутствующий в тестируемом образце, и детектируемо меченый антиген конкурируют друг с другом за формирование комплекса захватывающего средства/антигена (или его фрагмента) и комплекса захватывающего средства/детектируемо меченого антигена (или его фрагмента), соответственно, и (ii) определение присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце на основе сигнала, продуцируемого детектируемой меткой в комплексе захватывающего средства/детектируемо меченого антигена (или его фрагмента), формируемом в (ii), где по меньшей мере одно захватывающее средство представляют собой по меньшей мере один связывающий белок, и где сигнал, продуцируемый детектируемой меткой в комплексе захватывающего средства/детектируемо меченого антигена (или его фрагмента), обратно пропорционален количеству или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце. Если тестируемый образец получают у пациента, способ может дополнительно включать диагностику, прогноз или оценку эффективности терапевтического/профилактического лечения пациента. Если способ дополнительно включает оценку эффективности терапевтического/профилактического лечения пациента, способ по мере необходимости необязательно дополнительно включает изменение терапевтического/профилактического лечения пациента для улучшения эффективности. Способ можно адаптировать для применения в автоматизированной системе или полуавтоматизированной системе.

Предоставлен другой способ определения присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце. Способ включает анализ тестируемого образца на антиген (или его фрагмент) посредством иммунологического анализа. В иммунологическом анализе (i) используют по меньшей мере один связывающий белок и по меньшей мере одну детектируемую метку и (ii) проводят сравнение сигнала, продуцируемого детектируемой меткой как прямого или косвенного показателя присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце, с сигналом, продуцируемым как прямой или косвенный показатель присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в контроле или калибровочном стандарте. Калибровочный стандарт необязательно представляет собой часть набора калибровочных стандартов, где каждый из калибровочных стандартов отличается от других калибровочных стандартов в наборе концентрацией антигена (или его фрагмента). По меньшей мере один связывающий белок (i') содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, где первая полипептидная цепь содержит первую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, в которой VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из первого исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из второго исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела, C представляет собой константный домен тяжелой цепи, (X1)n представляет собой линкер, который присутствует необязательно и, когда присутствует, отличается от CH1, и (X2)n представляет собой Fc-область, которая присутствует необязательно, и где вторая полипептидная цепь содержит вторую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, в которой VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из первого исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из второго исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела, C представляет собой константный домен легкой цепи, (X1)n представляет собой линкер, который присутствует необязательно и, когда присутствует, отличается от CH1, и (X2)n представляет собой Fc-область, которая присутствует необязательно, и (ii') может связывать пару антигенов. Способ может включать (i) приведение тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним захватывающим средством, которое связывает эпитоп на антигене (или его фрагменте) так, что формируется комплекс захватывающего средства/антигена (или его фрагмента), (ii) приведение комплекса захватывающего средства/антигена (или его фрагмента) в контакт по меньшей мере с одним детектирующим средством, которое содержит детектируемую метку и связывает эпитоп на антигене (или его фрагменте), не связанный захватывающим средством, с формированием комплекса захватывающего средства/антигена (или его фрагмента)/детекционного средства, и (iii) определение присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце на основе сигнала, продуцируемого детектируемой меткой в комплексе захватывающего средства/антигена (или его фрагмента)/детекционного средства, формируемом в (ii), где по меньшей мере одно захватывающее средство и/или по меньшей мере одно детекционное средство представляют собой по меньшей мере один связывающий белок. Альтернативно, способ может включать (i) приведение тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним захватывающим средством, которое связывает эпитоп на антигене (или его фрагменте) так, что формируется комплекс захватывающего средства/антигена (или его фрагмента), и одновременное или последовательное, в любом порядке, приведение тестируемого образца в контакт с детектируемо меченым антигеном (или его фрагментом), который может конкурировать с любым антигеном (или его фрагментом) в тестируемом образце за связывание по меньшей мере с одним захватывающим средством, где любой антиген (или его фрагмент), присутствующий в тестируемом образце, и детектируемо меченый антиген конкурируют друг с другом за формирование комплекса захватывающего средства/антигена (или его фрагмента) и комплекса захватывающего средства/детектируемо меченого антигена (или его фрагмента), соответственно, и (ii) определение присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце на основе сигнала, продуцируемого детектируемой меткой в комплексе захватывающего средства/детектируемо меченого антигена (или его фрагмента), формируемом в (ii), где по меньшей мере одно захватывающее средство представляют собой по меньшей мере один связывающий белок, и где сигнал, продуцируемый детектируемой меткой в комплексе захватывающего средства/детектируемо меченого антигена (или его фрагмента), обратно пропорционален количеству или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце. Если тестируемый образец получают у пациента, способ может дополнительно включать диагностику, прогноз или оценку эффективности терапевтического/профилактического лечения пациента. Если способ дополнительно включает оценку эффективности терапевтического/профилактического лечения пациента, способ по мере необходимости необязательно дополнительно включает изменение терапевтического/профилактического лечения пациента для улучшения эффективности. Способ можно адаптировать для применения в автоматизированной системе или полуавтоматизированной системе.

Предоставлен еще один способ определения присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце. Способ включает анализ тестируемого образца на антиген (или его фрагмент) посредством иммунологического анализа. В иммунологическом анализе (i) используют по меньшей мере один DVD-Ig, который может связывать два антигена и по меньшей мере одну детектируемую метку и (ii) проводят сравнение сигнала, продуцируемого детектируемой меткой как прямого или косвенного показателя присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце, с сигналом, продуцируемым как прямой или косвенный показатель присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в контроле или калибровочном стандарте. Калибровочный стандарт необязательно представляет собой часть набора калибровочных стандартов, где каждый из калибровочных стандартов отличается от других калибровочных стандартов в наборе концентрацией антигена (или его фрагмента). По меньшей мере одно из DVD-Ig (i') содержит четыре полипептидных цепи, где первая и третья полипептидные цепи содержат первую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, в которой VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из первого исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из второго исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела, C представляет собой константный домен тяжелой цепи, (X1)n представляет собой линкер, который присутствует необязательно и, когда присутствует, отличается от CH1, и (X2)n представляет собой Fc-область, которая присутствует необязательно, и где вторая и четвертая полипептидные цепи содержат вторую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, в которой VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из первого исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из второго исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела, C представляет собой константный домен легкой цепи, (X1)n представляет собой линкер, который присутствует необязательно и, когда присутствует, отличается от CH1, и (X2)n представляет собой Fc-область, которая присутствует необязательно, и (ii') может связывать два антигена (или их фрагменты). Способ может включать (i) приведение тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним захватывающим средством, которое связывает эпитоп на антигене (или его фрагменте) так, что формируется комплекс захватывающего средства/антигена (или его фрагмента), (ii) приведение в контакт комплекс захватывающего средства/антигена (или его фрагмента) по меньшей мере с одним детектирующим средством, которое содержит детектируемую метку и связывает эпитоп на антигене (или его фрагменте), не связанный захватывающим средством, с формированием комплекса захватывающего средства/антигена (или его фрагмента)/детекционного средства, и (iii) определение присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце на основе сигнала, продуцируемого детектируемой меткой в комплексе захватывающего средства/антигена (или его фрагмента)/детекционного средства, формируемом в (ii), где по меньшей мере одно захватывающее средство и/или по меньшей мере одно детекционное средство представляет собой по меньшей мере одно DVD-Ig. Альтернативно, способ может включать (i) приведение тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним захватывающим средством, которое связывает эпитоп на антигене (или его фрагменте) так, что формируется комплекс захватывающего средства/антигена (или его фрагмента), и одновременное или последовательное, в любом порядке, приведение тестируемого образца в контакт с детектируемо меченым антигеном (или его фрагментом), который может конкурировать с любым антигеном (или его фрагментом) в тестируемом образце за связывание по меньшей мере с одним захватывающим средством, где любой антиген (или его фрагмент), присутствующий в тестируемом образце, и детектируемо меченый антиген конкурируют друг с другом за формирование комплекса захватывающего средства/антигена (или его фрагмента) и комплекса захватывающего средства/детектируемо меченого антигена (или его фрагмента), соответственно, и (ii) определение присутствия, количества или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце на основе сигнала, продуцируемого детектируемой меткой в комплексе захватывающего средства/детектируемо меченого антигена (или его фрагмента), формируемом в (ii), где по меньшей мере одно захватывающее средство представляет собой по меньшей мере один DVD-Ig, и где сигнал, продуцируемый детектируемой меткой в комплексе захватывающего средства/детектируемо меченого антигена (или его фрагмента), обратно пропорционален количеству или концентрации антигена (или его фрагмента) в тестируемом образце. Если тестируемый образец получают у пациента, способ может дополнительно включать диагностику, прогноз или оценку эффективности терапевтического/профилактического лечения пациента. Если способ дополнительно включает оценку эффективности терапевтического/профилактического лечения пациента, способ по мере необходимости необязательно дополнительно включает изменение терапевтического/профилактического лечения пациента для улучшения эффективности. Способ можно адаптировать для применения в автоматизированной системе или полуавтоматизированной системе.

Относительно способов анализа (и набора для них) можно использовать коммерчески доступные антитела к анализируемому веществу или способы получения антител к анализируемому веществу, как описано в литературе. Коммерческие поставщики различных антител в качестве неограничивающих примеров включают Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), GenWay Biotech, Inc. (San Diego, CA) и R&D Systems (RDS; Minneapolis, MN).

Как правило, в качестве контрольной точки, относительно которой оценивают результаты, получаемые после оценки тестируемого образца на анализируемое вещество или его фрагмент, например, для детекции заболевания или риска заболевания, можно использовать предопределенный уровень. Как правило, для проведения такого сравнения предопределенный уровень получают посредством проведения конкретного анализа достаточное количество раз и в подходящих условиях так, чтобы можно было установить сцепление или ассоциацию присутствия, количества или концентрации анализируемого вещества с конкретной стадией или исходом заболевания, нарушения или патологического состояния или с конкретными клиническими показателями. Как правило, предопределенный уровень получают при анализе контрольных индивидуумов (или групп индивидуумов). Измеряемое анализируемое вещество может включать его фрагменты, его продукты разрушения и/или продукты его ферментативного расщепления.

В частности, в отношении предопределенного уровня, как используют для мониторинга прогрессирования и/или лечения заболевания, количество или концентрация анализируемого вещества или его фрагмента могут быть "неизменными", "благоприятными" (или "благоприятно изменяемыми") или "неблагоприятными" (или "неблагоприятно изменяемыми"). "Увеличенные" или "повышенные" относятся к количеству или концентрации в тестируемом образце, которые превышают типичные или нормальные уровни или диапазоны (например, предопределенный уровень), или превышают другой контрольный уровень или диапазон (например, более ранний или исходный образец). Термин "уменьшенные" или "сниженные" относится к количеству или концентрации в тестируемом образце, которые являются меньшими, чем типичные или нормальные уровни или диапазоны (например, предопределенный уровень), или являются меньшими, чем другой контрольный уровень или диапазон (например, более ранний или исходный образец). Термин "измененные" относится к количеству или концентрации в образце, измененным (повышенным или сниженным) относительно типичных или нормальных уровней или диапазонов (например, предопределенного уровня), или относительно другого контрольного уровня или диапазона (например, более раннего или исходного образца).

Типичные или нормальные уровень или диапазон анализируемого вещества определяют стандартными способами. Так как уровни анализируемого вещества в некоторых случаях являются очень низкими, можно считать, что так называемый измененный уровень или изменение имеет место, когда происходит общее изменение по сравнению с типичными или нормальными уровнем или диапазоном или контрольными уровнем или диапазоном, которые нельзя объяснить экспериментальной ошибкой или варьированием образца. Таким образом, уровень, измеряемый в конкретном образце, сравнивают с уровнем или диапазоном уровней, определяемыми в сходных образцах у так называемых нормальных индивидуумов. В этом контексте, "нормальный индивидуум" представляет собой, например, индивидуума без детектируемого заболевания, а "нормальными" (иногда называемые "контрольными") пациентом или группой являются, например, пациент или группа, которые не демонстрируют детектируемого заболевания, соответственно. Кроме того, учитывая, что, как правило, анализируемое вещество у большинства человеческой популяции не находится на высоком уровне, "нормальным индивидуумом" можно считать индивидуума без значительных детектируемых повышенных или увеличенных количеств или концентраций анализируемого вещества, и "нормальными" (иногда называемые "контрольными") пациентом или группой являются пациент или группа, которые не демонстрируют значительных детектируемых повышенных или увеличенных количеств или концентраций анализируемого вещества. "Предположительно нормальный индивидуум" представляет собой индивидуума, у которого анализируемое вещество еще не анализировали или анализируют в настоящее время. Уровень анализируемого вещества указан как "повышенный", когда анализируемое вещество в норме является недетектируемым (например, нормальный уровень является нулевым или в диапазоне приблизительно от 25 до приблизительно 75 процентов нормальной популяции), но его детектируют в тестируемом образце, а также когда анализируемое вещество присутствует в тестируемом образце на уровне, более высоком, чем нормальный. Таким образом, в числе прочего, описание относится к способу скрининга индивидуума с конкретными заболеванием, нарушением или патологическим состоянием или с риском конкретных заболевания, нарушения или патологического состояния. Также способ анализа может включать анализ других маркеров и т.п.

Таким образом, способы, описываемые в настоящем документе, также можно использовать для определения того, страдает ли индивидуум или нет или существует ли у него риск развития данных заболевания, нарушения или патологического состояния. Конкретно, такой способ может включать этапы (a) определения концентрации или количества анализируемого вещества (или его фрагмента) в полученном у индивидуума тестируемом образце (например, способами, описываемыми в настоящем документе, или известными в данной области способами); и (b) сравнения концентрации или количества анализируемого вещества (или его фрагмента), определяемых на этапе (a), с предопределенным уровнем, где, если концентрация или количество анализируемого вещества, определяемых на этапе (a), благоприятно относительно предопределенного уровня, тогда определяют, что индивидуум не страдает или у него нет риска данных заболевания, нарушения или патологического состояния. Однако если концентрация или количество анализируемого вещества, определяемые на этапе (a), неблагоприятны относительно предопределенного уровня, тогда определяют, что индивидуум страдает или у него существует риск развития данных заболевания, нарушения или патологического состояния.

Кроме того, в настоящем документе предоставлен способ мониторинга прогрессирования заболевания у индивидуума. Оптимально способ включает этапы (a) определения концентрации или количества анализируемого вещества в полученном у индивидуума тестируемом образце; (b) определения концентрации или количества анализируемого вещества в полученном у индивидуума последующем тестируемом образце и (c) сравнения концентрации или количества анализируемого вещества, определенных на этапе (b), с концентрацией или количеством анализируемого вещества, определенных на этапе (a), где, если концентрация или количество, определенные на этапе (b), неизменны или неблагоприятны при сравнении с концентрацией или количеством анализируемого вещества, определенных на этапе (a), тогда определяют, что заболевание у индивидуума продолжается, прогрессирует или ухудшается. В сравнении с этим, если концентрация или количество анализируемого вещества, определенные на этапе (b), при сравнении концентрации или количества анализируемого вещества, определенных на этапе (a), благоприятны, тогда определяют, что заболевание у индивидуума прекращается, регрессирует или улучшается.

Необязательно, способ дополнительно включает сравнение концентрации или количества анализируемого вещества, как определенно на этапе (b), например, с предопределенным уровнем. Кроме того, необязательно, способ включает лечение индивидуума одной или несколькими фармацевтическими композициями в течение определенного периода времени, если сравнение демонстрирует, что концентрация или количество анализируемого вещества, как определенно на этапе (b), например, неблагоприятно изменены относительно предопределенного уровня.

Кроме того, способы можно использовать для мониторинга лечения индивидуума, проходящего лечение одной или несколькими фармацевтическими композициями. Конкретно, такие способы включают получение у индивидуума первого тестируемого образца перед введением индивидууму одной или нескольких фармацевтических композиций. Затем, в первом полученном у индивидуума тестируемом образце определяют концентрацию или количество анализируемого вещества (например, способами, описываемыми в настоящем документе, или как известно в данной области). Затем после определения концентрации или количества анализируемого вещества, концентрацию или количество анализируемого вещества необязательно сравнивают с предопределенным уровнем. Если концентрация или количество анализируемого вещества, как определено в первом тестируемом образце, являются ниже, чем предопределенный уровень, тогда индивидуума не лечат одной или несколькими фармацевтическими композициями. Однако если концентрация или количество анализируемого вещества, как определено в первом тестируемом образце, превышают предопределенный уровень, тогда индивидуума лечат одной или несколькими фармацевтическими композициями в течение определенного периода времени. Период времени, в течение которого индивидуума лечат одной или несколькими фармацевтическими композициями, может определить специалист в данной области (например, период времени может оставлять приблизительно от семи (7) суток до приблизительно двух лет, предпочтительно приблизительно от четырнадцати (14) суток до приблизительно одного (1) года).

Затем в течение курса лечения одной или несколькими фармацевтическими композициями у индивидуума получают второй и последующие тестируемые образцы. Количество тестируемых образцов и время, в которое указанные тестируемые образцы получают у индивидуумов, не существенны. Например, второй тестируемый образец можно получать через (7) суток после первого введения индивидууму одной или нескольких фармацевтических композиций, третий тестируемый образец можно получать через две (2) недели после первого введения индивидууму одной или нескольких фармацевтических композиций, четвертый тестируемый образец можно получать через три (3) недели после первого введения индивидууму одной или нескольких фармацевтических композиций, четвертый тестируемый образец можно получать через четыре (4) недели после первого введения индивидууму одной или нескольких фармацевтических композиций и т.д.

После получения у индивидуума каждого второго или последующего тестируемого образца, во втором или последующем тестируемом образце определяют концентрацию или количество анализируемого вещества (например, способами, описываемыми в настоящем документе, или как известно в данной области). Затем концентрацию или количество анализируемого вещества, определенные в каждом из второго и последующих тестируемых образцов, сравнивают с концентрацией или количеством анализируемого вещества, определенных в первом тестируемом образце (например, тестируемом образце, который исходно необязательно сравнивали с предопределенным уровнем). Если концентрация или количество анализируемого вещества, как определенно на этапе (c), являются благоприятными при сравнении с концентрацией или количеством анализируемого вещества, как определено на этапе (a), тогда определяют, что заболевание у индивидуума прекращается, регрессирует или улучшается, и индивидууму следует продолжать вводить одну или несколько фармацевтических композиций из этапа (b). Однако если концентрация или количество, определенные на этапе (c), при сравнении с концентрацией или количеством анализируемого вещества, как определено на этапе (a), не изменяются или являются неблагоприятными, тогда определяют, что заболевание у индивидуума продолжается, прогрессирует или ухудшается и индивидуума следует лечить более высокими концентрациями одной или нескольких фармацевтических композиций, вводимых индивидууму на этапе (b), или индивидуума следует лечить одной или несколькими фармацевтическими композициями, отличающимися от одной или нескольких фармацевтических композиций, вводимых индивидууму на этапе (b). Конкретно, индивидуума можно лечить одной или несколькими фармацевтическими композициями, отличающимися от одной или нескольких фармацевтических композиций, которые индивидуум ранее получал для снижения или уменьшения уровня анализируемого вещества у указанного индивидуума.

Как правило, для анализов, в которых можно проводить повторное тестирование (например, мониторинг прогрессирования заболевания и/или ответа на лечение), второй или последующий тестируемый образец получают через определенный период времени после получения у индивидуума первого тестируемого образца. Конкретно, второй получаемый у индивидуума тестируемый образец можно получать через несколько минут, часов, суток, недель или лет после получения у индивидуума первого тестируемого образца. Например, второй тестируемый образец можно получать у индивидуума через период времени приблизительно 1 минуту, приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 2 часа, приблизительно 3 часа, приблизительно 4 часа, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 час, приблизительно 22 часа, приблизительно 23 часа, приблизительно 24 часа, приблизительно 2 суток, приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 5 суток, приблизительно 6 суток, приблизительно 7 суток, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, приблизительно 4 недели, приблизительно 5 недели, приблизительно 6 недель, приблизительно 7 недель, приблизительно 8 недель, приблизительно 9 недель, приблизительно 10 недель, приблизительно 11 недель, приблизительно 12 недель, приблизительно 13 недель, приблизительно 14 недель, приблизительно 15 недель, приблизительно 16 недель, приблизительно 17 недель, приблизительно 18 недель, приблизительно 19 недель, приблизительно 20 недель, приблизительно 21 неделю, приблизительно 22 недели, приблизительно 23 недели, приблизительно 24 недели, приблизительно 25 недель, приблизительно 26 недель, приблизительно 27 недель, приблизительно 28 недель, приблизительно 29 недель, приблизительно 30 недель, приблизительно 31 неделю приблизительно 32 недели, приблизительно 33 недели, приблизительно 34 недели, приблизительно 35 недель, приблизительно 36 недель, приблизительно 37 недель, приблизительно 38 недель, приблизительно 39 недель, приблизительно 40 недель, приблизительно 41 неделю, приблизительно 42 недели, приблизительно 43 недели, приблизительно 44 недели, приблизительно 45 недель, приблизительно 46 недель, приблизительно 47 недель, приблизительно 48 недель, приблизительно 49 недель, приблизительно 50 недель, приблизительно 51 неделю, приблизительно 52 недели, приблизительно 1,5 года, приблизительно 2 года, приблизительно 2,5 года, приблизительно 3,0 года, приблизительно 3,5 года, приблизительно 4,0 года, приблизительно 4,5 года, приблизительно 5,0 лет, приблизительно 5,5 лет, приблизительно 6,0 лет, приблизительно 6,5 лет, приблизительно 7,0 лет, приблизительно 7,5 лет, приблизительно 8,0 лет, приблизительно 8,5 лет, приблизительно 9,0 лет, приблизительно 9,5 лет или приблизительно 10,0 лет после получения у индивидуума первого тестируемого образца.

При использовании для мониторинга прогрессирования заболевания указанный выше анализ можно использовать для мониторинга прогрессирования заболевания у индивидуумов с острыми состояниями. Острые состояния, также известные как критические состояния, относятся к острым, опасным для жизни заболеваниям или другим критическим медицинским состояниям, в которые вовлечены, например, сердечно-сосудистая система или выделительная система. Как правило, критические состояния относятся к состояниям, требующим срочного медицинского вмешательства в госпитальных условиях (включая в качестве неограничивающих примеров, отделение интенсивной терапии, реанимационное отделение, травмопункт или другие отделения неотложной помощи) или ведение фельдшерским или другим полевым медицинским персоналом. Для критических состояний повторный мониторинг, как правило, проводят в более коротких временных рамках, а именно через несколько минут, часов или суток (например, приблизительно 1 минуту, приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 2 часа, приблизительно 3 часа, приблизительно 4 часа, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 час, приблизительно 22 часа, приблизительно 23 часа, приблизительно 24 часа, приблизительно 2 суток, приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 5 суток, приблизительно 6 суток или приблизительно 7 суток), и, подобным образом, исходный анализ, как правило, проводят в более коротких временных рамках, например, приблизительно несколько минут, часов или суток от начала заболевания или патологического состояния.

Анализы также можно использовать для мониторинга прогрессирования заболевания у индивидуумов, страдающих хроническими или неострыми состояниями. Состояния, не требующие интенсивной терапии или неострые состояния, относятся к состояниям, отличным от острых, опасных для жизни заболеваний или других критических медицинских состояний, в которые вовлечены, например, сердечно-сосудистая система или выделительная система. Как правило, неострые состояния включают состояния длительного или хронического течения. Для неострых состояний повторный мониторинг, как правило, проводят в более длительных временных рамках, например, в течение часов, суток, недель, месяцев или лет (например, приблизительно через 1 час, приблизительно 2 часа, приблизительно 3 часа, приблизительно 4 часа, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 час, приблизительно 22 часа, приблизительно 23 часа, приблизительно 24 часа, приблизительно 2 суток, приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 5 суток, приблизительно 6 суток, приблизительно 7 суток, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, приблизительно 4 недели, приблизительно 5 недель, приблизительно 6 недель, приблизительно 7 недель, приблизительно 8 недель, приблизительно 9 недель, приблизительно 10 недель, приблизительно 11 недель, приблизительно 12 недель, приблизительно 13 недель, приблизительно 14 недель, приблизительно 15 недель, приблизительно 16 недель, приблизительно 17 недель, приблизительно 18 недель, приблизительно 19 недель, приблизительно 20 недель, приблизительно 21 неделю, приблизительно 22 недели, приблизительно 23 недели, приблизительно 24 недели, приблизительно 25 недель, приблизительно 26 недель, приблизительно 27 недель, приблизительно 28 недель, приблизительно 29 недель, приблизительно 30 недель, приблизительно 31 неделю, приблизительно 32 недели, приблизительно 33 недели, приблизительно 34 недели, приблизительно 35 недель, приблизительно 36 недель, приблизительно 37 недель, приблизительно 38 недель, приблизительно 39 недель, приблизительно 40 недель, приблизительно 41 неделю, приблизительно 42 недели, приблизительно 43 недели, приблизительно 44 недели, приблизительно 45 недель, приблизительно 46 недель, приблизительно 47 недель, приблизительно 48 недель, приблизительно 49 недель, приблизительно 50 недель, приблизительно 51 неделю, приблизительно 52 недели, приблизительно 1,5 года, приблизительно 2 года, приблизительно 2,5 года, приблизительно 3,0 года, приблизительно 3,5 года, приблизительно 4,0 года, приблизительно 4,5 года, приблизительно 5,0 лет, приблизительно 5,5 лет, приблизительно 6,0 лет, приблизительно 6,5 лет, приблизительно 7,0 лет, приблизительно 7,5 лет, приблизительно 8,0 лет, приблизительно 8,5 лет, приблизительно 9,0 лет, приблизительно 9,5 лет или приблизительно 10,0 лет), и, подобным образом, исходный анализ, как правило, проводят в более длительные временные рамки, например, приблизительно через несколько часов, суток, месяцев или лет от начала заболевания или патологического состояния.

Кроме того, указанные выше анализы можно проводить с использованием первого тестируемого образца, получаемого у индивидуума, где первый тестируемый образец получают из одного источника, такого как моча, сыворотка или плазма. Необязательно, указанные выше анализы можно затем повторять с использованием второго тестируемого образца, получаемого у индивидуума, где второй тестируемый образец получают из другого источника. Например, если первый тестируемый образец получали из мочи, второй тестируемый образец можно получать из сыворотки или плазмы. Результаты, получаемые при анализах с использованием первого тестируемого образца и второго тестируемого образца, можно сравнивать. Сравнение можно использовать для оценки статуса заболевания или патологического состояния у индивидуума.

Кроме того, настоящее описание также относится к способам определения того, что у индивидуума, предрасположенного к данным заболеванию, нарушению или патологическому состоянию или страдающего ими, лечение будет эффективным. В частности, описание относится к дополнительным способам диагностики и продуктам анализируемого вещества. Таким образом, как описано в настоящем документе, способ "мониторинга лечения заболевания у индивидуума" дополнительно оптимально может включать выбор или идентификацию кандидатов для лечения.

Таким образом, в конкретных вариантах осуществления описание также относится к способу определения того, является индивидуум с наличием или риском данных заболевания, нарушения или патологического состояния кандидатом для лечения. Как правило, индивидуум представляет собой индивидуума с наличием определенного симптома данного заболевания, нарушения или патологического состояния, или у которого уже диагностировали наличие или риск наличия данных заболевания, нарушения или патологического состояния, и/или у которого продемонстрированы неблагоприятные концентрация или количество анализируемого вещества или его фрагмента, как описано в настоящем документе.

Способ необязательно включает анализ, как описано в настоящем документе, где анализируемое вещество оценивают перед и после лечения индивидуума одной или несколькими фармацевтическими композициями (например, в частности фармацевтическим средством, связанным с механизмом действия, включающим анализируемое вещество), иммуносупрессивной терапией или иммуноабсорбционной терапией, или где анализируемое вещество оценивают после такого лечения и концентрацию или количество анализируемого вещества сравнивают с предопределенным уровнем. Неблагоприятные концентрация или количество анализируемого вещества, наблюдаемые после лечение, подтверждают, что индивидуум не получает пользы от проведения дополнительного или дальнейшего лечения, тогда как благоприятные концентрация или количество анализируемого вещества, наблюдаемые после лечения, подтверждают, что индивидуум получает пользу от проведения дополнительного или дальнейшего лечения. Это подтверждение помогает регулировать клинические исследования и предоставление улучшенной помощи пациенту.

Само собой разумеется, что хотя определенные варианты осуществления по настоящему документу предпочтительны, когда их используют для оценки данных заболевания, нарушения или патологического состояния, как описано в настоящем документе, анализы и наборы можно использовать для оценки анализируемого вещества при других заболеваниях, нарушениях и патологических состояниях. Способ анализа также может включать анализ других маркеров и т.п.

Способ анализа также можно использовать для идентификации соединения, улучшающего течение данных заболевания, нарушения или патологического состояния. Например, клетку, экспрессирующую анализируемое вещество, можно приводить в контакт с соединением-кандидатом. Уровень экспрессии анализируемого вещества в клетке, контактирующей с соединением, можно сравнивать с уровнем экспрессии анализируемого вещества в контрольной клетке способом анализа, описываемым в настоящем документе.

II. Набор

Также предоставлен набор для анализа тестируемого образца на присутствие, количество или концентрацию анализируемого вещества (или его фрагмента) в тестируемом образце. Набор содержит по меньшей мере один компонент для анализа тестируемого образца на анализируемое вещество (или его фрагмент) и инструкции для анализа тестируемого образца на анализируемое вещество (или его фрагмент). По меньшей мере один компонент для анализа тестируемого образца на анализируемое вещество (или его фрагмент) может включать композицию, содержащую DVD-Ig к анализируемому веществу (или его фрагмент, вариант или фрагмент варианта), которое необязательно иммобилизовано на твердой фазе.

Набор может содержать по меньшей мере один компонент для анализа тестируемого образца на анализируемое вещество посредством иммунологического анализа, например, хемилюминесцентного иммунологического анализа на микрочастицах, и инструкции для анализа тестируемого образца на анализируемое вещество посредством иммунологического анализа, например, хемилюминесцентного иммунологического анализа на микрочастицах. Например, набор может содержать по меньшей мере одного партнера анализируемого вещества по специфическому связыванию, такого как антитело к анализируемому веществу, моноклональное/поликлональное антитело (или его фрагмент, который может связывать анализируемое вещество, его вариант, который может связывать анализируемое вещество, или фрагмент варианта, который может связывать анализируемое вещество) или DVD-Ig к анализируемому веществу (или его фрагмент, вариант или фрагмент варианта), любое из которых может являться детектируемо меченым. Альтернативно или дополнительно, набор может содержать детектируемо меченое анализируемое вещество (или его фрагмент, который может связывать антитело к анализируемому веществу, моноклональное/поликлональное антитело или DVD-Ig к анализируемому веществу (или его фрагмент, вариант или фрагмент варианта)), которое может конкурировать с любым анализируемым веществом в тестируемом образце за связывание с антителом к анализируемому веществу, моноклональное/поликлональное антитело (или его фрагмент, который может связывать анализируемое вещество, его вариант, который может связывать анализируемое вещество, или фрагмент варианта, который может связывать анализируемое вещество) или DVD-Ig к анализируемому веществу (или его фрагмент, вариант или фрагмент варианта), любое из которых может быть иммобилизовано на твердой подложке. Набор может содержать калибровочный стандарт или контроль, например, выделенное или очищенное анализируемое вещество. Набор может содержать по меньшей мере один контейнер (например, пробирку, планшеты для микротитрования или полоски, которые уже могут быть покрыты, например, первым партнером по специфическому связыванию) для проведения анализа и/или буфер, такой как буфер для анализа или отмывочный буфер, любой из которых может быть предоставлен в виде концентрированного раствора, раствора субстрата для детектируемой метки (например, ферментативной метки) или останавливающего раствора. Предпочтительно, набор содержит все компоненты, т.е., реагенты, стандарты, буферы, разбавители и т.д., которые необходимы для проведения анализа. Инструкции могут быть предоставлены в бумажной форме или в форме для прочтения на компьютере, такой как диск, CD, DVD или т.п.

Более конкретно, предоставлен набор для анализа тестируемого образца на антиген (или его фрагмент). Набор содержит по меньшей мере один компонент для анализа тестируемого образца на антиген (или его фрагмент) и инструкции для анализа тестируемого образца на антиген (или его фрагмент), где по меньшей мере один компонент содержит по меньшей мере одну композицию, содержащую связывающий белок, который (i') содержит полипептидную цепь, содержащую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, в которой VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из первого исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из второго исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела, C представляет собой константный домен тяжелой цепи, (X1)n представляет собой линкер, который присутствует необязательно и, когда присутствует, отличается от CH1, и (X2)n представляет собой Fc-область, которая присутствует необязательно, и (ii') может связывать пару антигенов, где связывающий белок необязательно является детектируемо меченым.

Дополнительно предоставлен другой набор для анализа тестируемого образца на антиген (или его фрагмент). Набор содержит по меньшей мере один компонент для анализа тестируемого образца на антиген (или его фрагмент) и инструкции для анализа тестируемого образца на антиген (или его фрагмент), где по меньшей мере один компонент содержит по меньшей мере одну композицию, содержащую связывающий белок, который (i') содержит полипептидную цепь, содержащую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, в которой VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из первого исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из второго исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела, C представляет собой константный домен легкой цепи, (X1)n представляет собой линкер, который присутствует необязательно и, когда присутствует, отличается от CH1, и (X2)n представляет собой Fc-область, которая присутствует необязательно, и (ii') может связывать пару антигенов, где связывающий белок необязательно является детектируемо меченым.

Дополнительно предоставлен другой набор для анализа тестируемого образца на антиген (или его фрагмент). Набор содержит по меньшей мере один компонент для анализа тестируемого образца на антиген (или его фрагмент) и инструкции для анализа тестируемого образца на антиген (или его фрагмент), где по меньшей мере один компонент содержит по меньшей мере одну композицию, содержащую связывающий белок, который (i') содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, где первая полипептидная цепь содержит первую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, в которой VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из первого исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из второго исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела, C представляет собой константный домен тяжелой цепи, (X1)n представляет собой линкер, который присутствует необязательно и, когда присутствует, отличается от CH1, и (X2)n представляет собой Fc-область, которая присутствует необязательно, и где вторая полипептидная цепь содержит вторую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, в которой VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из первого исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из второго исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела, C представляет собой константный домен легкой цепи, (X1)n представляет собой линкер, который присутствует необязательно и, когда присутствует, отличается от CH1, и (X2)n представляет собой Fc-область, которая присутствует необязательно, и (ii') может связывать пару антигенов, где связывающий белок необязательно является детектируемо меченым.

Дополнительно предоставлен другой набор для анализа тестируемого образца на антиген (или его фрагмент). Набор содержит по меньшей мере один компонент для анализа тестируемого образца на антиген (или его фрагмент) и инструкции для анализа тестируемого образца на антиген (или его фрагмент), где по меньшей мере один компонент содержит по меньшей мере одну композицию, содержащую DVD-Ig, которое (i') содержит четыре полипептидные цепи, где первая и третья полипептидные цепи содержат первую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, в которой VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из первого исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, получаемый из второго исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела, C представляет собой константный домен тяжелой цепи, (X1)n представляет собой линкер, который присутствует необязательно и, когда присутствует, отличается от CH1, и (X2)n представляет собой Fc-область, которая присутствует необязательно, и где вторая и четвертая полипептидные цепи содержат вторую VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, в которой VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, получаемый из первого исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, получаемый из второго исходного антитела (или его антигенсвязывающей части), которое может быть таким же или отличаться от первого исходного антитела, C представляет собой константный домен легкой цепи, (X1)n представляет собой линкер, который присутствует необязательно и, когда присутствует, отличается от CH1, и (X2)n представляет собой Fc-область, которая присутствует необязательно, и (ii') может связывать два антигена (или их фрагменты), где DVD-Ig необязательно является детектируемо меченым.

Любые антитела, такие как антитело к анализируемому веществу или DVD-Ig к анализируемому веществу, или трейсер могут содержать детектируемую метку, такую как флуорофор, радиоактивная группа, фермент, биотиновую/авидиновую метку, хромофор, хемилюминесцентную метка или т.п., или набор может содержать реагенты для проведения мечения детектируемой меткой. Антитела, калибровочные стандарты и/или контроли можно предоставлять в отдельных контейнерах или предварительно помещать в подходящий для анализа формат, например, в планшеты для микротитрования.

Необязательно, набор содержит компоненты для контроля качества (например, панели чувствительности, калибровочные стандарты и положительные контроли). Получение реагентов для контроля качества хорошо известно в данной области и описано во вкладышах для множества иммунодиагностических продуктов. Элементы панели чувствительности необязательно используют для установления функциональных характеристик анализа, и дополнительно необязательно являются пригодными индикаторами целостности реагентов набора для иммунологического анализа, и для стандартизации анализов.

Также набор необязательно может содержать другие реагенты, необходимые для проведения диагностического анализа или облегчения оценки контроля качества, такие как буферы, соли, ферменты, кофакторы ферментов, субстраты ферментов, реагенты для детекции и т.п. Также в набор можно включать другие компоненты, такие как буферы и растворы для выделения и/или обработки тестируемого образца (например, реагенты для предварительной обработки). Набор может дополнительно содержать один или несколько других контролей. Один или несколько компонентов набора могут быть лиофилизированными, в случае чего набор может дополнительно содержать реагенты, подходящие для восстановления лиофилизированных компонентов.

Различные компоненты набора по мере необходимости необязательно предоставлены в подходящих контейнерах, например, в планшете для микротитрования. Дополнительно набор может содержать контейнеры для содержания или хранения образца (например, контейнер или картридж для образца мочи). При необходимости набор необязательно также может содержать реакционные сосуды, сосуды для смешивания и другие компоненты, облегчающие получение реагентов или тестируемого образца. Также набор может содержать один или несколько устройств, способствующих получению тестируемого образца, таких как шприц, пипетка, пинцет, мерная ложка или т.п.

Если детектируемая метка представляет собой по меньшей мере одно акридиниевое соединение, набор может содержать по меньшей мере один акридиний-9-карбоксамид, по меньшей мере один сложный акридиний-9-карбоксилатариловый эфир или любое их сочетание. Если детектируемая метка представляет собой по меньшей мере одно акридиниевое соединение, набор также может содержать источник пероксида водорода, такой как буфер, раствор и/или по меньшей мере один раствор основания. При желании, набор может содержать твердую фазу, такую как магнитные частица, гранулы, тестовую пробирку, планшет для микротитрования, кювету, мембрану, молекулу подложки, пленку, фильтровальную бумагу, диск или чип.

C. Адаптация набора и способа

Набор (или его компоненты), а также способ определения присутствия, количества или концентрации анализируемого вещества в тестируемом образце посредством такого анализа, как иммунологический анализ, можно адаптировать для применения в ряде автоматизированных и полуавтоматизированных систем (включая системы, где твердая фаза содержит микрочастицы), как описано, например, в патентах США №№ 5089424 и 5006309, и коммерчески распространяет, например, Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) в виде ARCHITECT®.

Определенные различия между автоматизированной или полуавтоматизированной системой по сравнению с неавтоматизированной системой (например, ELISA) включают субстрат, к которому прикрепляют первого партнера по специфическому связыванию (например, антитело к анализируемому веществу, моноклональное/поликлональное антитело (или его фрагмент, его вариант или фрагмент его варианта) или DVD-Ig к анализируемому веществу (или его фрагмент, его вариант или фрагмент его варианта); тем или иным способом можно воздействовать на формирование "сэндвича" и реакционноспособность анализируемого вещества), длительность и временной график захвата, детекции и/или необязательных этапов отмывки. В то время как неавтоматизированный формат, такой как ELISA, может требовать относительно более длительного времени инкубации с образцом и захватывающим реагентом (например, приблизительно 2 часа), автоматизированный или полуавтоматизированный формат (например, ARCHITECT®, Abbott Laboratories) могут требовать более короткого периода инкубации (например, приблизительно 18 минут для ARCHITECT®). Подобным образом, в то время как в неавтоматизированном формате, таком как ELISA, детекционное антитело, такое как реагент для конъюгации, можно инкубировать в течение относительно более продолжительного времени инкубации (например, приблизительно 2 часа), автоматизированный или полуавтоматизированный формат (например, ARCHITECT®) могут требовать относительно более короткого периода инкубации (например, приблизительно 4 минуты для ARCHITECT®).

Другие платформы, доступные в Abbott Laboratories, в качестве неограничивающих примеров включают AxSYM®, IMx® (патент США № 5294404), PRISM®, EIA (гранулы) и Quantum™ II, а также другие платформы. Кроме того, анализы, наборы и компоненты наборов можно использовать в других форматах, например, в электрохимических системах анализа или других ручных системах анализа или в системах анализа в месте предоставления помощи. Например, настоящее описание применимо к коммерческой электрохимической системе иммунологического анализа Abbott Point of Care (i-STAT®, Abbott Laboratories), в которой используют иммунологические анализы типа "сэндвич". Иммуносенсоры и способы их производства и применения в одноразовых тестовых устройствах описаны, например, в патентах США №№ 5063081; 7419821 и 7682833 и патентных публикациях США №№ 20040018577 и 20060160164.

В частности, относительно адаптации анализа анализируемого вещества к системе I-STAT®, предпочтительна приведенная ниже конфигурация. Микротехнологическими способами производят силиконовый чип с парой золотых амперометрических рабочих электродов и электродом сравнения серебро-хлорид серебра. На одном из рабочих электродов к полимерному покрытию из нанесенного на электрод поливинилового спирта прикрепляют полистироловые гранулы (диаметром 0,2 мм) с иммобилизованным антителом к анализируемому веществу, моноклональным/поликлональным антителом (или его фрагментом, его вариантом или фрагментом его варианта) или DVD-Ig к анализируемому веществу (или его фрагментом, его вариантом или фрагментом его варианта). Этот чип помещают в картридж I-STAT® с жидкостным форматом, подходящим для иммунологического анализа. На части стенки содержащей образец камеры картриджа находится слой, содержащий партнера анализируемого вещества по специфическому связыванию, такого как антитело к анализируемому веществу, моноклональное/поликлональное антитело (или его фрагмент, его вариант или фрагмент его варианта, которые могут связывать анализируемое вещество) или DVD-Ig к анализируемому веществу (или его фрагмент, его вариант или фрагмент его варианта, которые могут связывать анализируемое вещество), любое из которых может быть детектируемо меченым. В камере картриджа для жидкости находится водный реагент, содержащий п-аминофенолфосфат.

При эксплуатации образец, в котором предполагают наличие анализируемого вещества, добавляют в приемное отделение тестового картриджа и картридж вставляют в устройство считывания I-STAT®. После растворения партнера анализируемого вещества по специфическому связыванию в образце, насосный элемент в картридже нагнетает образец в содержащий канал чип. Здесь производят его осцилляции, способствуя формированию "сэндвича". На предпоследнем этапе анализа, в канал, для отмывки образца с чипа в отделение для отходов, из камеры нагнетают жидкость. На последнем этапе анализа метка в виде щелочной фосфатазы реагирует с п-аминофенолфосфатом с отщеплением фосфатной группы и обеспечением высвобождения п-аминофенола с электрохимическим окислением на рабочем электроде. На основе измеряемого тока посредством встроенного алгоритма и определенной при производстве калибровочной кривой, устройство считывания способно рассчитать количество анализируемого вещества в образце.

Способы и наборы, как описано в настоящем документе, обязательно включают другие реагенты и способы проведения иммунологического анализа. Например, включены различные буферы, такие как известно в данной области и/или которые можно легко получить или оптимизировать для применения, например, для отмывки, в качестве разбавителя конъюгата, разбавителя микрочастиц и/или в качестве разбавителя калибровочного стандарта. Иллюстративный разбавитель конъюгата представляет собой разбавитель конъюгата ARCHITECT®, применяемый в определенных наборах (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) и содержащий 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES), соль, блокатор белка, противомикробное средство и детергент. Иллюстративный разбавитель калибровочного стандарта представляет собой разбавитель калибровочного стандарта человека ARCHITECT®, применяемый в определенных наборах (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), который содержит буфер, содержащий MES, другую соль, блокатор белка и противомикробное средство. Кроме того, как описано в патентной заявке США № 61/142048, зарегистрированной 31 декабря 2008 года, можно добиваться улучшенной продукции сигнала, например, в формате картриджа I-Stat, с использованием последовательности нуклеиновой кислоты, связанной с сигнальным антителом в качестве амплификатора сигнала.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Проектирование, конструирование и анализ молекулы DVD-Ig™

Пример 1.1: Анализы, используемые для идентификации и характеристики молекул исходных антител и DVD-Ig

На всем протяжении примеров для идентификации и характеристики молекул исходных антител и DVD-Ig, если не указано иначе, использовали приведенные ниже анализы.

Пример 1.1.1: Анализы, используемые для определения связывания и аффинности молекул исходных антител и DVD-Ig к их антигену-мишени(ям)

Пример 1.1.1A: ELISA с прямым связыванием

Твердофазный иммуноферментный анализ для скрининга антител, связывающих желаемый антиген-мишень, проводят следующим образом. Планшеты ELISA с высоким связыванием (Corning Costar # 3369, Acton, MA) покрывают при 100 мкл/лунку 10 мкг/мл желаемого антигена-мишени (R&D Systems, Minneapolis, MN), или слитого белка внеклеточного домена желаемого антигена-мишени/FC (R&D Systems, Minneapolis, MN), или моноклонального антитела мыши к полигистидину (R&D Systems # MAB050, Minneapolis, MN) в фосфатно-солевом буфере (10× PBS, Abbott Bioresearch Center, Media Prep# MPS-073, Worcester, MA) в течение ночи при 4°C. Планшеты четыре раза отмывают PBS, содержащим 0,02% Tween 20. Планшеты блокируют, добавляя 300 мкл/лунку блокирующего раствора (порошок нежирного сухого молока, от различных розничных поставщиков, разбавленный в 2% PBS) в течение 1/2 часа при комнатной температуре. После блокирования планшеты четыре раза отмывают PBS, содержащим 0,02% Tween 20.

Альтернативно, в планшеты для ELISA, покрытые, моноклональными антителами мыши к полигистидину, как описано выше, добавляют сто микролитров на лунку 10 мкг/мл меченного гистидином (His) желаемого антигена-мишени (R&D Systems, Minneapolis, MN) и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Лунки четыре раза отмывают PBS, содержащим 0,02% Tween 20.

В планшет с желаемым антигеном-мишенью, или в планшет со слитым белком желаемого антигена-мишени/FC, или в планшет с антителом к полигистидину/желаемым антигеном-мишенью, меченным гистидином, полученные, как описано выше, добавляют сто микролитров препаратов антител или DVD-Ig, разбавленных в блокирующем растворе, как описано выше, и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Лунки четыре раза отмывают PBS, содержащим 0,02% Tween 20.

В каждую лунку планшета с желаемым антигеном-мишенью или планшета с антителом к полигистидину/желаемым антигеном-мишенью, меченным гистидином, добавляют сто микролитров 10 нг/мл специфичного к FC антитела козы к IgG человека, конъюгированного с HRP (Southern Biotech # 2040-05, Birmingham, AL). Альтернативно, в каждую лунку планшета со слитым белком желаемого антигена-мишени/FC добавляют сто микролитров 10 нг/мл специфичного к легкой цепи каппа антитела козы к IgG человека, конъюгированного с HRP (Southern Biotech # 2060-05 Birmingham, AL), и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты 4 раза отмывают PBS, содержащим 0,02% Tween 20.

В каждую лунку добавляют сто микролитров улучшенного раствора TMB (Neogen Corp. #308177, K Blue, Lexington, KY) и инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл 1Н серной кислоты. Планшеты спектрофотометрически считывают при длине волны 450 нм.

В ELISA с прямым связыванием связывания иногда не наблюдают, вероятно потому, что или участок связывания антитела на антигене-мишень "замаскирован", или антиген при нанесении на пластиковую поверхность "искажается". Неспособность молекулы DVD-Ig связывать свою мишень, также может являться результатом стерических ограничений, накладываемых на молекулы DVD-Ig форматом ELISA с прямым связыванием. Исходные антитела и молекулы DVD-Ig, которые не связываются в формате ELISA с прямым связыванием, могут связывать антиген-мишень в других форматах ELISA, таких как FACS, Biacore или биологический анализ. Также связывание молекулы DVD-Ig восстанавливается при корректировке длины линкера между двумя вариабельными доменами молекулы DVD-Ig, как показано ранее.

Пример 1.1.1.B: Захватывающий ELISA

Для определения связывания исходных белков и белков DVD-Ig с IL-1α или IL-1β посредством захватывающего ELISA, планшеты для ELISA (Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY) инкубировали в течение ночи при 4°C с антителом к Fc человека, разбавленным в буфере Pierce Coat до 2 мкг/мл (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Планшеты пять раз отмывали в буфере для отмывки (PBS, содержащий 0,05% Tween 20) и в течение 1 часа при 25°C блокировали 200 мкл на лунку блокирующего буфера SuperBlock (Thermo scientific, #37515). Блокирующий буфер удаляли и в лунки добавляли 100 мкл на лунку 2 мкг/мл каждого антитела или молекулы DVD-Ig в PBS, содержащем 10% SuperBlock, 0,5% Tween-20 и инкубировали при 25°C в течение 1 часа. Лунки пять раз отмывали в 1× PBST и титровали 1 мкг/мл биотинилированного антигена с серийными разведениями 1:6 (в диапазоне от мкг до пг в PBS, содержащем 10% SuperBlock, 0,05% Tween 20). Затем в планшеты добавляли каждого разведения антигена и инкубировали в течение 1 часа при 25°C. Лунки пять раз отмывали в 1× PBST и инкубировали в течение 1 часа при 25°C с поли-HRP-стрептавидином (KPL #474-3000, Gaithersburg, MD). Лунки пять раз отмывали в 1× PBST и добавляли 100 мкл ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL) на лунку. После развития окраски реакцию останавливали 1Н HCl и измеряли оптическую плотность при 450 нМ. В таблице 3 представлены данные захватывающего ELISA для конструкций DVD-Ig, направленных к IL-1α и IL-1β, и числовые значения означают связывание белков антител к IL-1α, антител к IL-1β или DVD-Ig к IL-1α/β человека с IL-1α и/или IL-1β человека.

Таблица 3 Захватывающий ELISA исходных антител и конструкций DVD-Ig к IL-1α и IL-1β

Пример 1.1.1.C: Определение аффинности с использованием технологии BIACORE

Таблица 4 Реагенты, используемые в анализах Biacore
Антиген	Обозначение продавца	Продавец	Каталожный №
IL-1α	Рекомбинантный IL-1α человека	R&D systems	200-LA/CF
IL-1β	Рекомбинантный IL-1β человека	R&D systems	201-LB

Способы BIACORE:

Анализ BIACORE (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) определяет аффинность антител или молекул DVD-Ig посредством кинетических измерений констант скорости прямой реакции и скорости обратной реакции. Связывание антител или молекул DVD-Ig с антигеном-мишенью (например, очищенным рекомбинантным антигеном-мишенью) определяют посредством основанных на поверхностном плазмонном резонансе измерений на устройстве Biacore® 1000 или 3000 (Biacore® AB, Uppsala, Sweden) с использованием буфера для проведения HBS-EP (10 мМ HEPES [pH 7,4], 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,005% поверхностно-активного вещества P20) при 25°C. Все химические реагенты получают в Biacore® AB (Uppsala, Sweden) или иначе из другого источника, как описано в тексте. Например, приблизительно 5000 РЕ антитела козы к IgG мыши, (Fcγ), специфичного к фрагменту поликлонального антитела (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL), разбавленного в 10 мМ ацетате натрия (pH 4,5), непосредственно иммобилизуют на биосенсорном чипе CM5 в степени чистоты для исследований с использованием стандартного набора для связывания аминов по инструкциям и способам производителя при 25 мкг/мл. Непрореагировавшие группы на поверхности биосенсора блокируют этаноламином. В качестве поверхности для реакции используют модифицированную карбоксиметилдекстраном поверхность в проточных кюветах 2 и 4. Немодифицированный карбоксиметилдекстран без антитела козы к IgG мыши в проточных кюветах 1 и 3 используют в качестве контрольной поверхности. Для кинетического анализа уравнения скорости реакции, получаемые на основании модели связывания Ленгмюра 1:1, аппроксимируют одновременно для фаз ассоциации и диссоциации всех восьми инъекций (с использованием анализа глобальной аппроксимации) с использованием программного обеспечения Biaevaluation 4.0.1. Очищенные антитела или молекулы DVD-Ig разбавляют в забуференном HEPES солевом растворе для захвата на специфичных реакционных поверхностях с антителом козы к IgG мыши. Антитела или молекулы DVD-Ig для захвата в качестве лиганда (25 мкг/мл) инъецируют над реакционными матриксами при скорости потока 5 мкл/мин. Константы скорости ассоциации и диссоциации, K_on (M^-1сек^-1) и K_off (сек^-1), определяют при скорости непрерывного потока 25 мкл/минуту. Константы скорости получают, производя измерения кинетики связывания при различных концентрациях антигена в диапазоне 10-200 нМ. Затем на основании кинетических констант скорости рассчитывают равновесную константу диссоциации (M) для реакции антител или молекул DVD-Ig и антигена-мишени по следующей формуле: K_D=K_off/K_on. Связывание регистрируют как функцию от времени и рассчитывают кинетические константы скорости. В этом анализе можно измерять настолько быстрые скорости прямых реакций, как 10⁶ M^-1сек^-1, и настолько низкие скорости обратных реакций, как 10^-6 сек^-1.

Таблица 5 Анализ BIACORE исходных антител и конструкций DVD-Ig

Связывание всех конструкций DVD-Ig, характеризуемое технологией Biacore, сохранялось и было сравнимым со связыванием исходных антител. N-концевые вариабельные домены связывались со сходными с исходными антителами высокими аффинностями.

Таблица 6 Анализ BIACORE исходных антител и конструкций DVD-Ig с IL-1α и IL-1β яванского макака

Связывание всех конструкций DVD-Ig, характеризуемое технологией Biacore, сохранялось и было сравнимым со связыванием исходных антител. N-концевые вариабельные домены связывались со сходными с исходными антителами высокими аффинностями.

Пример 1.1.2: Анализы, используемые для определения функциональной активности исходных антител и молекул DVD-Ig

Пример 1.1.2.A: Биологический анализ цитокинов

Способность исходного антитела к цитокину или к фактору роста или молекулы DVD-Ig, содержащей последовательности антитела к цитокину или антитела к фактору роста, ингибировать или нейтрализовать биологическую активность мишени, цитокина или фактор роста, анализируют, определяя ингибирующий потенциал антитела или молекулы DVD-Ig. Например, можно использовать способность антитела к IL-4 ингибировать опосредованную IL-4 продукцию IgE. Например, из периферической крови человека выделяют наивные B-клетки, соответственно, получают лейкоцитарный слой посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколл-пака, с последующим магнитным разделением с использованием гранул MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) со специфичными к sIgD человека меченными FITC F(ab)₂ антителами козы с последующими гранулами MACS с антителами к FITC. Отсортированные магнитным способом наивные B-клетки доводят до 3×10⁵ клеток на мл в XV15 и вносят по 100 мкл на лунку в 96-луночные планшеты в расположении 6×6 в центре планшета окруженного заполненными PBS лунками на 10 суток культивирования при 37°C в присутствии 5% CO₂. Получают по одному планшету на антитело для тестирования, содержащему по 3 лунки каждого из неиндуцированного и индуцированного контролей и пятикратных повторений титров антитела, начиная от 7 мкг/мл и проходя посредством 3-кратных разведений до 29 нг/мл конечных концентраций, добавляя по 50 мкл в четырехкратно концентрированных предварительных разведениях. Для индукции продукции IgE в каждую лунку по 50 мкл каждого добавляют rhIL-4 при 20 нг/мл и моноклонального антитела к CD40 (Novartis, Basel, Switzerland) при 0,5 мкг/мл конечных концентраций, и в конце периода культивирования способом стандартного ELISA по типу "сэндвич" определяют концентрации IgE.

Пример 1.1.2.B: Анализ высвобождения цитокинов

Анализируют способность исходного антитела или молекулы DVD-Ig вызывать высвобождение цитокинов. У трех здоровых доноров посредством венепункции получают периферическую кровь в гепаринизированных пробирках вакутейнер. Цельную кровь разбавляют в соотношении 1:5 средой RPMI-1640 и помещают в 24-луночные планшеты для культивирования тканей при 0,5 мл на лунку. Антитела к цитокинам (например, антитело к IL-4) разбавляют в RPMI-1640 и добавляют в планшеты при 0,5 мл/лунку с получением конечных концентраций 200, 100, 50, 10 и 1 мкг/мл. Конечное разведение цельной крови в планшетах для культивирования составляет 1:10. В отдельные лунки в качестве положительного контроля высвобождения цитокинов при конечных концентрациях 2 мкг/мл и 5 мкг/мл добавляют LPS и PHA. В качестве антитела отрицательного контроля используют поликлональные IgG человека. Эксперимент проводят в двух повторениях. Планшеты инкубируют при 37°C при 5% CO₂. Через двадцать четыре часа содержимое лунок переносят в тестовые пробирки и центрифугируют в течение 5 минут при 1200 об./мин. Собирают бесклеточные супернатанты и замораживают для анализов цитокинов. Клетки, оставшиеся на планшетах и в пробирках, лизируют 0,5 мл раствора для лизиса и помещают в температуру -20°C и оттаивают. Добавляют 0,5 мл среды (доводя объем до того же уровня, как и образцы бесклеточных супернатантов), и клеточные препараты собирают и замораживают для анализов цитокинов. Бесклеточные супернатанты и клеточные лизаты анализируют на уровни цитокинов, например, уровни IL-8, IL-6, IL-1β, IL-1RA или TNFα, посредством ELISA.

Пример 1.1.2.C: Исследование перекрестной реактивности в отношении цитокинов

Анализируют способность исходного антитела к цитокину или молекулы DVD-Ig к представляющему интерес цитокину(ам) перекрестно реагировать с другими цитокинами. Исходные антитела или молекулу DVD-Ig иммобилизуют на матрице биосенсора Biacore. mAb к Fc человека по свободной аминогруппе ковалентно связывают с декстрановой матрицей посредством первой активированной 100 мМ N-гидроксисукцинимидом (NHS) и 400 мМ N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидгидрохлоридом (EDC) карбоксильной группы на матрице. Приблизительно 50 мкл каждого препарата антитела или DVD-Ig в концентрации 25 мкг/мл, разбавленного в ацетате натрия, pH 4,5, инъецируют на активированный биосенсор, и свободные амины на белке связываются непосредственно с активированными карбоксильными группами. Как правило, иммобилизуют 5000 резонансных единиц (РЕ). Непрореагировавшие сложные эфиры EDC с матрицей деактивируют посредством инъекции 1 M этаноламина. Вторую проточную кювету получают в качестве контрольного стандарта посредством иммобилизации IgG1/K человека с использованием стандартного набора для связывания аминов. Измерения SPR проводят с использованием биосенсорного чипа CM. Все антигены для анализа на поверхности биосенсора разбавляют в буфере для проведения HBS-EP, содержащем 0,01% P20.

Для исследования специфичности связывания цитокинов на исходное антитело или молекулы DVD-Ig к цитокину, иммобилизованные поверхности биосенсора, инъецировали избыток представляющего интерес цитокина (100 нМ, например, растворимого рекомбинанта человека) (время контакта 5 минут). Перед инъекцией представляющего интерес цитокина и непосредственно после нее, через каждую проточную кювету пропускали буфер HBS-EP. Для представления значения конечного связывания берут общую разность сигналов между исходной точкой и точкой, приблизительно соответствующей 30 секундам после завершения инъекции цитокина. Снова измеряют ответ в резонансных единицах. Перед инъекцией следующего образца, когда наблюдают событие связывания, матрицы биосенсора регенерируют с использованием 10 мМ HCl, в ином случае над матрицами инъецируют буфер для проведения. Также одновременно на контрольную поверхность с иммобилизованным IgG1/K мыши инъецировали цитокины человека (например, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-22, IL-23, IL-27, TNFα, TNFβ и IFN-γ) для записи любого фонового неспецифического связывания. Вследствие получения контрольной и реакционной поверхностей, в Biacore можно автоматически вычитать данные контрольной поверхности из данных реакционной поверхности для устранения большинства изменений показателя преломления и инъекционного шума. Таким образом, можно устанавливать действительный ответ связывания, относящийся к реакции связывания антитела или молекулы DVD-Ig к цитокину.

Когда на иммобилизованное антитело к цитокину инъецируют представляющий интерес цитокин, наблюдают значительное связывание. Регенерация 10 мМ HCl полностью удаляет нековалентно ассоциированные белки. Исследование сенсограммы демонстрирует, что связывание иммобилизованного антитела или молекулы DVD-Ig к цитокину с растворимым цитокином является сильным и устойчивым. После подтверждения ожидаемого результата с представляющим интерес цитокином, тестируют панель оставшихся рекомбинантных цитокинов человека, для каждых антитела или молекулы DVD-Ig раздельно. Для каждого цикла инъекций регистрируют количество цитокина, связанного или не связанного с антителом или молекулой DVD-Ig к цитокину. Результаты трех независимых экспериментов используют для определения профиля специфичности каждых антитела или молекулы DVD-Ig. Выбирают антитела или молекулу DVD-Ig с ожидаемым связыванием с представляющим интерес цитокином и отсутствием связывания с другими цитокинами.

Пример 1.1.2.D: Тканевая перекрестная реактивность

Исследования тканевой перекрестной реактивности проводят в три этапа, где первый этап включает срезы замороженных образцов 32 тканей, второй этап включает 38 тканей и 3 этап включает дополнительные ткани 3 неродственных взрослых индивидуумов, как описано ниже. Как правило, исследования проводят при двух уровнях дозирования.

Этап 1: Срезы замороженных образцов (приблизительно 5 мкм) тканей человека (32 ткани (как правило: надпочечник, желудочно-кишечный тракт, предстательная железа, мочевой пузырь, сердце, скелетная мышца, кровь клетки, почка, кожа, костный мозг, печень, спинной мозг, молочная железа, легкое, селезенка, мозжечок, лимфоузел, семенники, кора головного мозга, яичник, тимус, кишечник, поджелудочная железа, щитовидная железа, эндотелий, паращитовидная железа, мочеточник, глаз, гипофиз, матка, фаллопиева труба и плацента), полученные у одного человека-донора при аутопсии или биопсии) фиксируют и высушивают на предметном стекле. Проводят окрашивание тканевых срезов пероксидазой с использованием системы авидин-биотин.

Этап 2: Срезы замороженных образцов (приблизительно 5 мкм) тканей человека (38 тканей (включая надпочечник, кровь, кровеносный сосуд, костный мозг, мозжечок, головной мозг, шейку матки, пищевод, глаз, сердце, почку, толстую кишку, печень, легкое, лимфоузел, молочную железу, яичник, маточную трубу, поджелудочную железу, паращитовидную железу, периферический нерв, гипофиз, плаценту, предстательную железу, слюнную железу, кожу, тонкий кишечник, спинной мозг, селезенку, желудок, поперечнополосатую мышцу, семенник, тимус, щитовидную железу, миндалину, мочеточник, мочевой пузырь и матку), полученные у 3 неродственных взрослых индивидуумов при аутопсии или биопсии) фиксируют и высушивают на предметном стекле. Проводят окрашивание тканевых срезов пероксидазой с использованием системы авидин-биотин.

Этап 3: Срезы замороженных образцов (приблизительно 5 мкм) тканей яванского макака (38 тканей (включая надпочечник, кровь, кровеносный сосуд, костный мозг, мозжечок, головной мозг, шейку матки, пищевод, глаз, сердце, почку, толстую кишку, печень, легкое, лимфоузел, молочную железу, яичник, маточную трубу, поджелудочную железу, паращитовидную железу, периферический нерв, гипофиз, плаценту, предстательную железу, слюнную железу, кожу, тонкий кишечник, спинной мозг, селезенку, желудок, поперечнополосатую мышцу, семенник, тимус, щитовидную железу, миндалину, мочеточник, мочевой пузырь и матку), полученные у 3 неродственных взрослых обезьян при аутопсии или биопсии) фиксируют и высушивают на предметном стекле. Проводят окрашивание тканевых срезов пероксидазой с использованием системы авидин-биотин.

Антитело или молекулу DVD-Ig инкубируют со вторичным биотинилированным антителом к IgG человека и формируют иммунный комплекс. Иммунный комплекс в конечных концентрациях антитела или молекулы DVD-Ig 2 и 10 мкг/мл добавляют на тканевые срезы на предметном стекле, а затем проводят реакцию тканевых срезов с набором авидин-биотин-пероксидаза в течение 30 минут. Затем на 4 минуты добавляют DAB (3,3'-диаминобензидин), субстрат для пероксидазной реакции, для окрашивания ткани. В качестве положительного контроля тканевых срезов используют гранулы с антигеном-сефарозой. В качестве дополнительных контролей служат антиген-мишень и исследования блокирования сыворотки человека. Иммунный комплекс с конечными концентрациями антитела или молекулы DVD-Ig 2 и 10 мкг/мл предварительно инкубируют с антигеном-мишенью (конечная концентрация 100 мкг/мл) или сывороткой человека (конечная концентрация 10%) в течение 30 минут, а затем добавляют на тканевые срезы на предметном стекле, а затем проводят реакцию тканевых срезов в течение 30 минут с набором авидин-биотин-пероксидаза. Затем для окрашивания тканей на 4 минуты добавляют субстрат для пероксидазной реакции DAB (3,3'-диаминобензидин).

Любое специфическое окрашивание оценивают как ожидаемую (например, согласующееся с экспрессией антигена) или неожиданную реакционную способность в зависимости от известной экспрессии рассматриваемого антигена-мишени. Любое окрашивание, оцененное как специфическое, ранжируют по интенсивности и частоте. Окрашивание тканей на этапе 2 (ткани человека) и этапе 3 (ткани яванского макака) оценивают как сходное или различное.

Пример 1.1.2.E: Биологический анализ и анализ нейтрализации IL-1α/β

Пример 1.1.2.E.1: Биологический анализ IL-1α и IL-1β человека в отношении моноклональных антител

Для исследования функциональной активности антител к IL-1 альфа человека и к IL-1 бета человека по изобретению антитела подвергали скринингу в биологическом анализе MRC-5. Клеточная линия MRC-5 представляет собой клеточную линию фибробластов легкого человека, продуцирующую IL-8 человека в ответ на IL-1 альфа или бета человека зависимым от дозы способом. Клеточная линия MRC-5 также перекрестно реагирует с IL-1 альфа и IL-1 бета яванского макака. Активность антитела основана на способности антитела ингибировать индуцированный IL-1 альфа или бета цитокин hIL-8. Клетки MRC-5 (исходно получаемые из ATCC) выращивают и культивируют в полной MEM, содержащей 10% FBS, в инкубаторе при 37°C, 5% CO₂. В сутки перед анализом клетки MRC-5 высевают в объеме 100 мкл в 96-луночный плоскодонный планшет (Costar# 3599) при 1×10⁴, затем инкубируют в течение ночи при 37°C, 5% CO₂. На сутки анализа в полной среде MEM получают исходный рабочий 4× раствор антитела и антигенов IL-1α человека или IL-1β человека или IL-1α яванского макака или IL-1β яванского макака. В блокирующих планшетах для анализа в полной MEM получают восемь точек серийных разведений антитела (диапазон 10-0,0001 нМ). Шестьдесят пять мкл разбавленного антитела в четырех повторениях переносят в 96-луночный планшет с v-образным дном (Costar# 3894), затем в лунки, содержащие антитело, добавляют по 65 мкл 4× исходного раствора соответствующего антигена (200 пг/мл). В лунки для контроля антигена с 65 мкл среды MEM добавляют по шестьдесят пять мкл антигена (200 пг/мл). В лунки для контроля среды добавляют 130 мкл среды MEM. После 1 часа инкубации 100 мкл смеси Ab/Ag добавляют к клеткам MRC-5. Объемы лунок составляют 200 мкл/лунку, и все реагенты находятся в 1× конечной концентрации. После инкубации в течение ночи (16-24 часов) 150 мкл супернатанта переносят в 96-луночный круглодонный планшет (Costar# 3799), и планшеты помещают в холодильник на -20°C. Супернатанты тестируют на уровни hIL-8 с использованием набора ELISA для IL-8 человека (R&D Systems, Minneapolis, MN) или MSD hIL-8 (хемилюминесцентный набор). Нейтрализующую активность антитела определяют, рассчитывая процент ингибирования относительно контрольного значения для одного антигена.

Пример 1.1.2.E.2: Биологический анализ IL-1α/β в отношении белков DVD-Ig к IL-1 α/β

Для исследования функциональной активности белков DVD-Ig к IL-1 альфа и бета человека по изобретению, белки DVD-Ig подвергали биологическому анализу с MRC-5. Клеточная линия MRC-5 представляет собой клеточную линию фибробластов легкого человека, продуцирующую IL-8 человека в ответ на IL-1 альфа и бета человека и IL-1 альфа и бета яванского макака зависимым от дозы способом. Активность молекулы DVD-Ig основана на способности молекулы DVD-Ig ингибировать индуцируемый IL-1 цитокин hIL-8. Клетки MRC-5 (исходно получаемые из ATCC) выращивали и культивировали в полной MEM, содержащей 10% FBS, в инкубаторе при 37°C, 5% CO₂. В сутки перед анализом клетки MRC-5 высевали в объеме 100 мкл в 96-луночный плоскодонный планшет (Costar# 3599) при 1×10⁴, затем инкубировали в течение ночи при 37°C, 5% CO₂. В сутки анализа в полной среде MEM получали исходные рабочие 4× растворы молекулы DVD-Ig, hIL-1α и hIL-1β или IL-1α яванского макака и IL-1β яванского макака. В сутки анализа в блокирующих планшетах для анализа в полной MEM получали восемь точек серийных разведений антитела (диапазон 10-0,0001 нМ). Шестьдесят пять мкл разбавленного антитела в четырех повторениях переносили в 96-луночный планшет с v-образным дном (Costar# 3894), затем в лунки, содержащие молекулу DVD-Ig, добавляли по 65 мкл 4× исходных растворов IL-1α или IL-1β (200 пг/мл). В лунки для контроля антигена с 65 мкл среды MEM добавляли по шестьдесят пять мкл IL-1α (200 пг/мл) или 65 мкл IL-1β (200 пг/мл). В лунки для контроля среды добавляли 130 мкл среды MEM. После 1 часа инкубации 100 мкл смеси DVD-Ig/Ag добавляли к клеткам MRC-5. Объемы лунок составляли 200 мкл/лунку, и все реагенты находились в 1× конечной концентрации. После инкубации в течение ночи (16-24 часов) 150 мкл супернатанта переносили в 96-луночный круглодонный планшет (Costar# 3799), и планшеты помещали в холодильник на -20°C. Супернатанты тестировали на уровни hIL-8 с использованием набора ELISA для IL-8 человека (R&D Systems, Minneapolis, MN) или MSD hIL-8 (хемилюминесцентный набор). Нейтрализующую активность молекулы DVD-Ig определяли, рассчитывая процент ингибирования относительно контрольного значения для одного IL-1α или IL-1β. В таблице 7 представлена нейтрализация IL-1α человека исходным антителом к IL-1α и белками DVD-Ig к IL-1α и IL-1β. В таблице 8 представлена нейтрализация IL-1β человека исходным антителом к IL-1β и белками DVD-Ig к IL-1α и IL-1β. В таблице 9 представлена нейтрализация IL-1α яванского макака исходным антителом к IL-1α и белками DVD-Ig к IL-1α и IL-1β. В таблице 10 представлена нейтрализация IL-1β яванского макака исходным антителом к IL-1β и белками DVD-Ig к IL-1α и IL-1β.

Таблица 7 Анализ нейтрализации IL-1α человека исходным антителом и конструкциями DVD-Ig к IL-1α н.п.: не применимо

Все молекулы DVD-Ig в анализе нейтрализации IL-1α/β MRC5 демонстрировали нейтрализацию.

Таблица 8 Анализ нейтрализации IL-1β человека исходным антителом и конструкциями DVD-Ig к IL-1β н.п.: не применимо

Все молекулы DVD-Ig в анализе нейтрализации IL-1α/β MRC5 демонстрировали нейтрализацию.

Таблица 9 Анализ нейтрализации IL-1α яванского макака исходным антителом и конструкциями DVD-Ig к IL-1α н.п.: не применимо

Все молекулы DVD-Ig в анализе нейтрализации IL-1α/β MRC5 демонстрировали нейтрализацию.

Таблица 10 Анализ нейтрализации IL-1β яванского макака исходным антителом и конструкциями DVD-Ig к IL-1β н.п.: не применимо

Все молекулы DVD-Ig в анализе нейтрализации IL-1α/β MRC5 демонстрировали нейтрализацию.

Пример 1.1.2.F: Ингибирующее рост действие моноклональных антител или молекул DVD-Ig к опухолевому рецептору in vitro

20 мкл моноклональных антител или молекул DVD-Ig к опухолевому рецептору, разбавленных в D-PBS-BSA (фосфатно-солевой буфер Дульбекко с 0,1% BSA), добавляют к 180 мкл опухолевых клеток человека в конечной концентрации 0,01 мкг/мл-100 мкг/мл. Планшеты инкубируют при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO₂ в течение 3 суток. Для определения процента ингибирования роста опухоли определяют количество жизнеспособных клеток в каждой лунке с использованием реагентов MTS по инструкциям производителя (Promega, Madison, WI). Лунки без обработки антителом используют в качестве контролей 0% ингибирования, тогда как лунки без клеток рассматривают, как демонстрирующие 100% ингибирование.

Пример 1.1.2.G: Туморицидное действие исходных антител или молекул DVD-Ig in vitro

Исходные антитела или молекулы DVD-Ig, связывающиеся с антигенами-мишенями на опухолевых клетках, можно анализировать на туморицидную активность. В кратком изложении, исходные антитела или молекулы DVD-Ig разбавляют в D-PBS-BSA (фосфатно-солевой буфер Дульбекко с 0,1% BSA) и добавляют к 200 мкл опухолевых клеток человека в конечных концентрациях от 0,01 мкг/мл до 100 мкг/мл. Планшеты инкубируют при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO₂ в течение 3 суток. Для определения процента ингибирования роста опухоли определяют количество жизнеспособных клеток в каждой лунке с использованием реагентов MTS по инструкциям производителя (Promega, Madison, WI). Лунки без обработки антителом используют в качестве контролей 0% ингибирования, тогда как лунки без клеток рассматривают, как демонстрирующие 100% ингибирование.

Для оценки апоптоза определяют активацию каспазы-3 по следующему протоколу: обработанные антителами клетки в 96-луночных планшетах лизируют в 120 мкл 1× лизирующего буфера (1,67 мМ Hepes, pH 7,4, 7 мМ KCl, 0,83 мМ MgCl₂, 0,11 мМ ЭДТА, 0,11 мМ EGTA, 0,57% CHAPS, 1 мМ DTT, таблетка смеси 1× ингибиторов протеаз; без ЭДТА; Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ) при комнатной температуре с перемешиванием в течение 20 минут. После лизиса клеток добавляют 80 мкл реакционного буфера каспазы-3 (48 мМ Hepes, pH 7,5, 252 мМ сахароза, 0,1% CHAPS, 4 мМ DTT и 20 мкМ субстрат Ac-DEVD-AMC; Biomol Research Labs, Inc., Plymouth Meeting, PA) и планшеты инкубируют в течение 2 часов при 37°C. Планшеты считывают на счетчике 1420 VICTOR Multilabel Counter (Perkin Elmer Life Sciences, Downers Grove, IL) с использованием следующих настроек: возбуждение = 360/40, испускание = 460/40. Показателем апоптоза является увеличение количества единиц флуоресценции у обработанных антителами клеток относительно клеток, обработанных контрольными изотипическими антителами.

Пример 1.1.2.H: Ингибирование клеточной пролиферации исходными антителами и конструкциями DVD-Ig

Опухолевые клетки глиомы человека U87-MG высевают при 2000 клеток/лунку в 100 мкл в 96-луночные чашки в среду RPMI, дополненную 5% эмбриональной телячьей сывороткой, и инкубируют при 37°C, 5% CO₂, в течение ночи. На следующие сутки клетки обрабатывают серийными разведениями антител или молекул DVD-Ig (диапазон доз от 0,013 нМ до 133 нМ) и инкубируют при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO₂ в течение 5 суток. Жизнеспособность/пролиферацию клеток измеряют косвенным образом, анализируя уровни АТФ с использованием набора ATPlite (Perkin Elmer, Waltham, MA) по инструкциям производителя.

Пример 1.1.2.I: Ингибирование фосфорилирования рецепторов исходными антителами или конструкциями DVD-Ig in vitro

Клетки карциномы человека высевают в 96-луночные планшеты при 40000 клеток/лунку в 180 мкл не содержащей сыворотки среды (DMEM+0,1% BSA) и инкубируют в течение ночи при 37°C, 5% CO₂. Планшеты Costar EIA (Lowell, MA) покрывают 100 мкл/лунку захватывающими рецепторы Ab (конечная концентрация 4 мкг/мл) и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре при перемешивании. На следующие сутки покрытые антителами к рецепторам планшеты для ELISA отмывают (три раза PBST=0,05% Tween 20 в PBS, pH 7,2-7,4) и добавляют 200 мкл блокирующего раствора (1% BSA, 0,05% NaN₃ в PBS, pH 7,2-7,4) с блокированием в течение 2 часов при комнатной температуре на качалке. Опухолевые клетки человека совместно инкубируют с антителами или молекулами DVD-Ig и лигандом. К клеткам карциномы человека добавляют моноклональные антитела или молекулы DVD-Ig, разбавленные в D-PBS-BSA (фосфатно-солевой буфер Дульбекко с 0,1% BSA), в конечных концентрациях 0,01 мкг/мл-100 мкг/мл. Одновременно к клеткам добавляют факторы роста при концентрациях 1-100 нг/мл (200 мкл) и клетки инкубируют при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO₂ в течение 1 часа. Клетки лизируют в 120 мкл/лунку холодного буфера для выделения из клеток (10 мМ Tris, pH 7,4, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 1 мМ NaF, 1 мМ ортованадат натрия, 1% Triton X-100, 10% глицерин, 0,1% SDS и смесь ингибиторов протеаз) и инкубируют при 4°C в течение 20 минут с перемешиванием. Клеточные лизаты (100 мкл) добавляют в планшет для ELISA и инкубируют в течение ночи при 4°C с плавным перемешиванием. На следующие сутки планшеты для ELISA отмывают и добавляют 100 мкл/лунку детекционных Ab pTyr-HRP (набор ELISA p-IGF1R, R&D System # DYC1770, Minneapolis, MN) и планшеты инкубируют в течение 2 часов при 25°C в темноте. Планшеты проявляют для определения фосфорилирования по инструкциям производителя.

Пример 1.1.2.J: Эффективность молекул DVD-Ig в отношении роста боковых подкожных ксенотрансплантатов карциномы человека

Клетки эпидермоидной карциномы человека A-431 выращивают in vitro до 99% жизнеспособности, 85% конфлуэнтности во флаконах для тканевых культур. Самкам мышей SCID (Charles Rivers Labs, Wilmington, MA) с массой 19-25 грамм в сутки исследования 0 в правый бок подкожно инъецируют 1×10⁶ опухолевых клеток человека (1:1 с матригелем). Введение (и./п., раз в сутки, 3×/неделю) контрольных IgG человека или молекулы DVD-Ig начинали после разделения мышей на группы по размерам со средними объемами опухолей приблизительно от 200 до 320 мм³. Опухоли измеряют дважды в неделю, начиная приблизительно на сутки 10 после инъекции опухолевых клеток.

Пример 1.2: Получение исходных моноклональных антител к представляющим интерес антигенам человека

Исходные mAb мыши, связывающие и нейтрализующие представляющий интерес антиген человека и его вариант, получают следующим образом:

Пример 1.2.A: Иммунизация мышей представляющими интерес антигенами человека

Пяти мышам Balb/C, пяти мышам C57B/6 и пяти мышам AJ в возрасте 6-8 недель на сутки 1 подкожно инъецируют двенадцать микрограмм рекомбинантного очищенного антигена человека (например, IL-1α или IL-1β), смешанного с полным адъювантом Фрейнда или адъювантом Immunoeasy (Qiagen, Valencia, CA). На сутки 24, 38 и 49 тем же мышам подкожно инъецируют двенадцать микрограмм варианта рекомбинантного очищенного антигена человека, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда или адъювантом Immunoeasy. На сутки 84, или сутки 112, или сутки 144 мышам внутривенно инъецируют 1 мкг рекомбинантного очищенного представляющего интерес антигена человека.

Пример 1.2.B: Получение гибридом

Для получения гибридом спленоциты, получаемые у иммунизированных мышей, описанных в примере 1.2.A, сливают с клетками SP2/0-Ag-14 в соотношении 5:1 широко известным способом, описанным в Kohler, G. and Milstein (1975) Nature, 256:495. Продукты слияния высевают в селекционную среду, содержащую азасерин и гипоксантин, в 96-луночные планшеты при плотности 2,5×10⁶ клеток селезенки на лунку. Через период от семи до десяти дней после слияния наблюдают макроскопические колонии гибридом. Супернатант из каждой лунки, содержащей колонии гибридом, посредством ELISA тестируют на присутствие антител к представляющему интерес антигену (например, как описано в примере 1.1.1.A). Затем супернатанты, демонстрирующие антиген-специфическую активность, тестируют на активность (например, как описано в анализах примера 1.1.2), например, способность нейтрализовать представляющий интерес антиген в биологическом анализе, например, таком как анализ, описанный в примере 1.1.2.E).

Пример 1.2.C: Идентификация и характеристика исходных моноклональных антител к представляющим интерес антигенам-мишеням человека

Пример 1.2.C.1: Анализ нейтрализующей активности исходного моноклонального антитела

Супернатанты гибридом анализируют на присутствие исходных антител, связывающих представляющий интерес антиген, полученный в соответствии с примерами 1.2.A и 1.2.B, а также способных связывать вариант представляющего интерес антигена ("варианта антигена"). Затем супернатанты с антителами, положительными в обоих анализах, тестируют на их нейтрализующую антиген активность, например, в биологическом анализе цитокинов примера 1.1.2.E. Гибридомы, продуцирующие антитела со значениями IC₅₀ в биологическом анализе менее чем 1000 пМ, в одном из вариантов осуществления менее чем 100 пМ, наращивают и клонируют посредством лимитирующего разведения. Гибридомные клетки выращивают в среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки с низким количеством IgG (Hyclone #SH30151, Logan, UT). В среднем, получают, концентрируют и очищают посредством аффинной хроматографии с белком A, как описано в Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, 250 мл супернатанта каждой гибридомы (полученной из популяции клона). Способность очищенных mAb ингибировать активность ее антигена-мишени определяют, например, с использованием биологического анализа цитокинов, как описано в примере 1.1.2.E.

Пример 1.2.C.2: Анализ перекрестной реактивности исходного моноклонального антитела к представляющему интерес антигену-мишени яванского макака

Для определения того, распознают ли выбранные mAb, описываемые в настоящем документе, представляющий интерес антиген яванского макака, проводят анализ BIACORE, как описано в настоящем документе (пример 1.1.1.C), с использованием рекомбинантного антигена-мишени яванского макака. Кроме того, в биологическом анализе цитокинов (пример 1.1.2.E) также можно определять нейтрализующую активность mAb к рекомбинантному представляющему интерес антигену яванского макака. MAb с хорошей перекрестной реактивностью с яванским макаком (в одном из вариантов осуществления в пределах 5-кратной реактивности относительно антигена человека) выбирают для дальнейшей характеристики.

Пример 1.2.D: Определение аминокислотной последовательности вариабельной области каждого моноклонального антитела мыши к антигену человека

Выделение кДНК, экспрессию и характеристику рекомбинантных mAb мыши к антигену человека проводят следующим образом. Для каждого определения аминокислотной последовательности, посредством центрифугирования выделяют приблизительно 1×10⁶ гибридомных клеток и обрабатывают с применением тризола для выделения тотальной РНК (Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA.) по инструкциям производителя. С тотальной РНК проводят синтез первой цепи ДНК с использованием системы SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA) по инструкциям производителя. Для синтеза первой цепи для отбора поли(A)+РНК в качестве праймера используют олиго(dT). Затем продукт синтеза первой цепи кДНК амплифицируют посредством ПЦР с праймерами, сконструированными для амплификации вариабельных областей иммуноглобулинов мышей (Ig-Primer Sets, Novagen, Madison, WI). Продукты ПЦР разделяют на агарозном геле, вырезают, очищают, а затем субклонируют с использованием набора TOPO Cloning в вектор pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) и трансформируют в химически компетентные TOP10 E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA). Для идентификации клонов, содержащих вставку, у трансформантов проводят ПЦР колоний. Из колоний, содержащих вставку, с использованием набора QIAprep Miniprep (Qiagen, Valencia, CA) выделяют плазмидную ДНК. Вставки в плазмидах секвенируют по обеим цепям для определения последовательностей ДНК вариабельных областей тяжелых или вариабельных областей легких цепей с использованием прямого праймера M13 и обратного праймера M13 (Fermentas Life Sciences, Hanover MD). Идентифицируют последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей mAb. В одном из вариантов осуществления критерии отбора для панели первичных mAb для подготовки следующего этапа (гуманизации) включают следующее:

- Антитело не содержит никаких N-связанных участков гликозилирования (NXS), за исключением одного стандартного в CH2

- Антитело не содержит никаких дополнительных остатков цистеина кроме обычных для каждого антитела остатков цистеина

- Последовательность антитела выровнена с ближайшими последовательностями VH и VL зародышевой линии человека и любые необычные аминокислоты следует проверить на встречаемость в других природных антителах человека

- N-концевой остаток глутамина (Q) заменен на остаток глутаминовой кислоты (E), если он не влияет на активность антитела. Это снижает гетерогенность вследствие циклизации Q

- Эффективное отщепление сигнальной последовательности подтверждено масс-спектрометрически. Это можно проводить с использованием материала клеток COS или клеток 293

- Последовательность белка проверена на риск дезамидирования Asn, что может приводить к потере активности

- Антитело обладает низким уровнем агрегации

- Растворимость антитела составляет >5-10 мг/мл (на этапе исследования); >25 мг/мл

- Антитело обладает нормальным размером (5-6 нм) при анализе посредством динамического светорассеяния (DLS)

- Антитело обладает низкой гетерогенностью заряда

- У антитела отсутствует индукция высвобождения цитокинов (см. пример 1.1.2.B)

- У антитела существует специфичность к предопределенному цитокину (см. пример 1.1.2.C)

- У антитела отсутствует неожиданная тканевая перекрестная реактивность (см. пример 1.1.2.D)

- У антитела существует сходство тканевой перекрестной реактивности у человека и яванского макака (см. пример 1.1.2.D)

Пример 1.2.2: Рекомбинантые гуманизированные исходные антитела

Пример 1.2.2.1: Конструирование и экспрессия рекомбинантных химерных исходных антител к антигенам человека

ДНК, кодирующую константные области тяжелых цепей исходных mAb мышей к антигенам человека посредством гомологической рекомбинации у бактерий, заменяли фрагментом кДНК, кодирующим константную область IgG1 человека, содержащую 2 мутации аминокислот шарнирной области. Эти мутации представляют собой замену лейцина на аланин в положении 234 (нумерация EU) и замену лейцина на аланин в положении 235 (Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657). Константную область легкой цепи каждого из этих антител заменяли константной областью цепи каппа человека. Полноразмерные химерные антитела транзиторно экспрессируют в клетках COS посредством совместной трансфекции кДНК химерных тяжелых и легких цепей, лигированных в экспрессионную плазмиду pBOS (Mizushima and Nagata (1990) Nucl. Acids Res. 18:5322). Клеточные супернатанты, содержащие рекомбинантное химерное антитело, очищают посредством хроматографии на сефарозе с белком A, и связанное антитело элюируют посредством добавления кислотного буфера. Антитела нейтрализуют и диализуют в PBS.

кДНК тяжелой цепи, кодирующую химерное mAb, котрансфицируют с кДНК химерной легкой цепи (обе лигированы в вектор pBOS) в клетки COS. Клеточный супернатант, содержащий рекомбинантное химерное антитело, очищают посредством хроматографии на сефарозе с белком A, и связанное антитело элюируют посредством добавления кислотного буфера. Антитела нейтрализуют и диализируют в PBS.

Затем очищенные химерные исходные mAb к антигенам человека тестируют на их способность связываться (посредством Biacore) и на функциональную активность, например, как описано в примерах 1.1.1.C и 1.1.2.B. Химерные mAb, сохраняющие активность исходных гибридомных mAb, выбирают для дальнейшей модификации.

Пример 1.2.2.2: Конструирование и экспрессия гуманизированных исходных антител к антигенам человека

Пример 1.2.2.2.A: Отбор каркасов антител человека

Последовательность каждого гена вариабельной области тяжелой и вариабельной области легкой цепей мыши раздельно выравнивают относительно последовательностей 44 вариабельных областей тяжелых цепей зародышевой линии или 46 вариабельных областей легких цепей зародышевой линии иммуноглобулинов человека (полученных с веб-сайта NCBI Ig Blast на странице http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.) с использованием программного обеспечения Vector NTI.

Гуманизация основана на гомологии аминокислотных последовательностей, кластерном анализе CDR, частоте использования в экспрессируемых антителах человека и доступной информации о кристаллических структурах антител человека. Учитывая возможное влияние на связывание антитела, спаривание VH-VL и другие факторы, остатки мышей подвергают мутации в принадлежащие человеку остатки, когда каркасные остатки мыши и человека отличаются с небольшими исключениями. Дополнительные стратегии гуманизации разрабатывают на основе анализа последовательностей антител зародышевой линии человека или их подгруппы, что сохраняет высокую степень гомологии, т.е. сходства последовательностей, с фактическими аминокислотными последовательностями вариабельных областей антител мыши.

Для идентификации уникальных остатков в последовательностях антител мыши, для которых теоретически рассчитано, что они являются критичными для структуры связывающих участков антитела, CDR, используют моделирование гомологии. Моделирование гомологии представляет собой компьютерный способ, посредством которого для белка получают приблизительные трехмерные координаты. Источником начальных координат и руководством для их дальнейшего уточнения является второй белок, эталонный белок, для которого известны трехмерные координаты и последовательность которого родственна последовательности первого белка. Родственность последовательностей двух белков используют для получения соответствия между эталонным белком и белком, для которого желательно получить координаты, белком-мишенью. Первичные последовательности эталонного белка и белка-мишени выравнивают с координатами идентичных частей двух белков, переносимых непосредственно с эталонного белка на белок-мишень. Координаты несовпадающих частей двух белков, например, вследствие мутаций, вставок или делеций остатков, строят на основе общих структурных шаблонов, и уточняют энергию для обеспечения согласованности с уже перенесенными координатами модели. Эту рассчитанную на компьютере структуру белка можно дополнительно уточнять или непосредственно использовать в моделировании. Качество структуры модели определяется правильностью утверждения, что эталонный белок и белок-мишень являются родственными, и точностью, с которой проводят выравнивание последовательностей.

Для mAb мышей для идентификации подходящих эталонных структур используют комбинацию поиска BLAST и визуального исследования. Минимально необходимой для осуществления попытки моделирования гомологии считают идентичность последовательностей аминокислотных последовательностей эталона и мишени 25%. Выравнивание последовательностей проводят вручную, и координаты модели получают с использованием программы Jackal (см. Petrey et al. (2003) Proteins 53 (Suppl. 6):430-435).

Первичные последовательности каркасных областей выбранных антител мыши и человека обладают значительной идентичностью. Положения отличающихся остатков являются кандидатами на включения остатков мыши в гуманизированную последовательность для сохранения наблюдаемой активности связывания антитела мыши. Список каркасных остатков, отличающихся в последовательностях человека и мыши, конструируют вручную. В таблице 11 представлены каркасные последовательности, выбранные для этого исследования.

Таблица 11 Последовательность константного домена тяжелой цепи и константного домена легкой цепи IgG человека

Вероятность того, что данный каркасный остаток будет влиять на свойства связывания антитела, зависит от близости к остаткам CDR. Таким образом, используя структуры модели, остатки, отличающиеся в последовательностях мыши и человека, ранжируют по их расстоянию от любого из атомов в CDR. Остатки, попадающие в 4,5 Å от любого из атомов CDR, идентифицируют как наиболее важные и рекомендуют их в кандидаты для сохранения остатка мыши в гуманизированном антителе (т.е., обратной мутации).

Сконструированные in silico гуманизированные антитела конструируют с использованием олигонуклеотидов. Для каждой кДНК вариабельной области конструируют 6 олигонуклеотидов по 60-80 нуклеотидов каждый, с перекрыванием друг друга на 20 нуклеотидов на 5'- и/или 3'-конце каждого олигонуклеотида. В реакции отжига все 6 олигонуклеотидов комбинируют, доводят до кипения и отжигают в присутствии dNTP. Для достройки пропусков между перекрывающимися олигонуклеотидами длиной приблизительно 40 п.н. добавляют ДНК-полимеразу I, большой фрагмент (Кленова) (New England Biolabs #M0210, Beverley, MA.). Для амплификации всего гена вариабельной области с использованием двух внешних праймеров, содержащих перекрывающиеся последовательности, комплементарные участку множественного клонирования в модифицированном векторе pBOS (Mizushima andNagata (1990) Nucl. Acids Res. 18:17), проводят ПЦР. Продукты ПЦР, полученные с каждой конструкции кДНК, разделяют на агарозном геле, и полосу, соответствующую теоретически рассчитанному размеру вариабельной области кДНК, вырезают и очищают. Вариабельную область тяжелой цепи посредством гомологической рекомбинации у бактерий вставляют в рамку считывания фрагмента кДНК, кодирующего константную область IgG1 человека, содержащую 2 мутации аминокислот шарнирной области. Эти мутации представляют собой замену лейцина на аланин в положении 234 (нумерация EU) и замену лейцина на аланин в положении 235 (Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657). Вариабельную область легкой цепи посредством гомологической рекомбинации вставляют в рамку считывания с константной областью цепи каппа человека. Выделяют бактериальные колонии и выделяют плазмидную ДНК. Вставки кДНК полностью секвенируют. Корректные гуманизированные тяжелые и легкие цепи, соответствующие каждому антителу, котрансфицируют в клетки COS для транзиторной продукции полноразмерного гуманизированного антитела к антигену человека. Клеточные супернатанты, содержащие рекомбинантное химерное антитело, очищают посредством хроматографии на сефарозе с белком A, и связанное антитело элюируют посредством добавления кислотного буфера. Антитела нейтрализуют и диализируют в PBS.

Пример 1.2.2.3: Характеристика гуманизированных антител

Способность очищенных гуманизированных антител ингибировать функциональную активность определяют, например, с использованием биологического анализа цитокинов, как описано в примерах 1.1.2.A. Аффинности связывания гуманизированных антител с рекомбинантными антигенами человека определяют с использованием измерений поверхностного плазмонного резонанса (Biacore®), как описано в примере 1.1.1.B. Значения IC₅₀, полученные посредством биологических анализов, и аффинность гуманизированных антител ранжируют. Гуманизированные mAb, полностью сохраняющие активность исходных гибридомных mAb, выбирают в качестве кандидатов для дальнейшей модификации. 2-3 наиболее подходящих гуманизированных mAb охарактеризованы дополнительно.

Пример 1.2.2.3.A: Фармакокинетический анализ гуманизированных антител

Фармакокинетические исследования проводят на крысах Sprague-Dawley и яванских макаках. Самцам и самкам крыс и яванских макак внутривенно или подкожно дозируют однократную дозу 4 мг/кг mAb, и образцы анализируют с использованием ELISA захватывания антигенов, а фармакокинетические параметры определяют посредством бескомпартментного анализа. В кратком изложении, планшеты для ELISA покрывают антителом козы к биотину (5 мг/мл, 4°C, в течение ночи), блокируют SuperBlock (Pierce) и инкубируют с биотинилированным антигеном человека при 50 нг/мл в 10% SuperBlock TTBS при комнатной температуре в течение 2 часов. Образцы сыворотки серийно разводят (0,5% сыворотка, 10% SuperBlock в TTBS) и инкубируют на планшете в течение 30 минут при комнатной температуре. Детекцию проводят с меченным HRP антителом козы к антителу человека, и концентрации определяют с помощью стандартных кривых с использованием четырехпараметрического логистического аппроксимирования. Значения фармакокинетических параметров определяют посредством бескомпартментной модели с использованием программного обеспечения WinNonlin (Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Выбирают гуманизированные mAb с хорошим фармакокинетическим профилем (T_1/2 составляет 8-13 суток или лучше, с низким клиренсом и очень хорошей биодоступностью 50-100%).

Пример 1.2.2.3.B: Физико-химический анализ и анализ стабильности гуманизированных моноклональных антител in vitro

Эксклюзионная хроматография

Антитела разбавляют водой до 2,5 мг/мл и 20 мл анализируют в системе ВЭЖХ Shimadzu с использованием колонки TSK gel G3000 SWXL (Tosoh Bioscience, кат. № k5539-05k). Образцы элюируют с колонки 211 мМ сульфатом натрия, 92 мМ фосфатом натрия, pH 7,0, при скорости потока 0,3 мл/минуту. Рабочие параметры системы ВЭЖХ представляют собой следующее: подвижная фаза: 211 мМ Na₂SO₄, 92 мМ Na₂HPO₄×7H₂O, pH 7,0, градиент: изократический, скорость потока: 0,3 мл/минуту, длина волны детектора: 280 нм, температура охладителя автоматического дозатора: 4°C, температура колоночного термостата: температура окружающей среды, время выполнения: 50 минут.

В таблице 12 приведены данные о чистоте исходных антител и конструкций DVD-Ig, выражаемые в виде процента мономера (неагрегированного белка ожидаемой молекулярной массы), как определяют по приведенному выше протоколу.

Таблица 12 Чистота исходных антител и конструкций DVD-Ig, как определяют посредством эксклюзионной хроматографии

Молекулы DVD-Ig продемонстрировали очень хороший профиль SEC с большинством молекул DVD-Ig, продемонстрировавших >94% мономера. Этот профиль DVD-Ig сходен с профилем, наблюдаемым для исходных антител.

SDS-PAGE

Антитела анализируют посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. В качестве контроля используют партию адалимумаба AFP04C. В восстановительных условиях образцы смешивают 1:1 с 2× Tris-глициновым буфером SDS-PAGE для образцов (Invitrogen, кат. № LC2676, № партии 1323208) с 100 мМ DTT и нагревают при 60°C в течение 30 минут. В невосстанавливающих условиях образцы смешивают 1:1 с буфером для образцов и нагревают при 100°C в течение 5 минут. Восстановленные образцы (10 мг на дорожку) наносят на 12% предварительно полученный Tris-глициновый гель (Invitrogen, кат. № EC6005box, № партии 6111021), а невосстановленные образцы (10 мг на дорожку) наносят на 8%-16% предварительно полученный Tris-глициновый гель (Invitrogen, кат. № EC6045box, № партии 6111021). В качестве маркера молекулярной массы используют SeeBlue Plus 2 (Invitrogen, кат. № LC5925, № партии 1351542). Гели запускают в боксе для гелей с мини-камерой XCell SureLock (Invitrogen, кат. № EI0001), и белки разделяют посредством начального приложения напряжения 75 для вхождения образцов в гель с последующим постоянным напряжением 125 до достижения фронтом красителя нижней границы геля. Используемый буфер для запуска представляет собой 1× Tris-глициновый буфер для SDS, получаемый из 10× Tris-глицинового буфера для SDS (ABC, MPS-79-080106)). Гели в течение ночи окрашивают красителем коллоидным синим (Invitrogen кат. № 46-7015, 46-7016), и краситель удаляют водой Milli-Q до обесцвечивания фона. Затем окрашенные гели сканируют с использованием сканера Epson Expression (модель 1680, S/N DASX003641).

Анализ скорости седиментации

Антитела вносят в камеру для образцов каждого из трех стандартных двухсекторных углеродно-эпоксидных основных элементов. У этих основных элементов длина оптического пути составляет 1,2 см и их конструируют с сапфировыми окнами. В качестве эталонного буфера используют PBS, и каждая камера содержит 140 мкл. Все образцы исследуют одновременно с использованием ротора с 4 отверстиями (AN-60Ti) в аналитической центрифуге Beckman ProteomeLab XL-I (серийный № PL106C01).

Программируют условия запуска, и контроль за центрифугой проводят с использованием ProteomeLab (версия 5.6). Образцам и ротору в течение одного часа до анализа позволяют приходить в термическое равновесие (20,0±0,1°C). Подтверждение правильной загрузки камеры проводят при 3000 об./мин, и для каждой камеры проводят одно считывание. Условия скорости седиментации являются следующими:

Объем камеры для образцов: 420 мл

Объем камеры для эталона: 420 мл

Температура: 20°C

Скорость ротора: 35000 об./мин

Время: 8:00 часов

Длина волны УФ-излучения: 280 нм

Размер радиального шага: 0,003 см

Сбор данных: Одна точка данных на шаг без усреднения сигнала

Общее количество считываний: 100

Измерения молекулярной массы интактных антител посредством LC-MS

Молекулярную массу интактных антител анализируют посредством LC-MS. Каждое антитело разбавляют водой приблизительно до 1 мг/мл. Используют систему ВЭЖХ 1100 (Agilent) с микроловушкой белков (Michrom Bioresources, Inc, кат. № 004/25109/03) для обессоливания и введения 5 мг образца в масс-спектрометр API Qstar pulsar i (Applied Biosystems). Для элюции образцов используют короткий градиент. Градиент проводят с подвижной фазой A (0,08% FA, 0,02% TFA в воде для ВЭЖХ) и подвижной фазой B (0,08% FA и 0,02% TFA в ацетонитриле) при скорости потока 50 мл/минуту. Масс-спектрометр эксплуатируют при напряжении спрея 4,5 киловольт с диапазоном сканирования отношения массы к заряду от 2000 до 3500.

Измерение молекулярной массы легких и тяжелых цепей антител посредством LC-MS

Измерение молекулярной массы легких цепей (LC), тяжелых цепей (HC) и дегликозилированных HC антител проводят посредством LC-MS. Антитело разбавляют водой до 1 мг/мл, и образец восстанавливают до LC и HC с конечной концентрацией DTT 10 мМ в течение 30 минут при 37°C. Для дегликозилирования антитела 100 мг антитела инкубируют с 2 мл ПНГазы F, 5 мл 10% N-октилглюкозида в общий объеме 100 мл в течение ночи при 37°C. После дегликозилирования образец восстанавливают с конечной концентрацией DTT 10 мМ в течение 30 минут при 37°C. Используют систему ВЭЖХ Agilent 1100 с колонкой C4 column (Vydac, кат. № 214TP5115, S/N 060206537204069) для обессоливания и введения образца (5 мг) в масс-спектрометр API Qstar pulsar i (Applied Biosystems). Для элюции образцов используют короткий градиент. Градиент проводят с подвижной фазой A (0,08% FA, 0,02% TFA в воде для ВЭЖХ) и подвижной фазой B (0,08% FA и 0,02% TFA в ацетонитриле) при скорости потока 50 мл/минуту. Масс-спектрометр эксплуатируют при напряжении спрея 4,5 киловольт с диапазоном сканирования отношения массы к заряду от 800 до 3500.

Пептидное картирование

Антитело денатурируют в течение 15 минут при комнатной температуре с конечной концентрацией гуанидингидрохлорида 6 М в 75 мМ бикарбонате аммония. Денатурированные образцы восстанавливают с конечной концентрацией DTT 10 мМ при 37°C в течение 60 минут с последующим алкилированием 50 мМ йодуксусной кислотой (IAA) в темноте при 37°C в течение 30 минут. После алкилирования образец подвергают диализу в течение ночи против четырех литров 10 мМ бикарбоната аммония при 4°C. Диализованный образец разбавляют до 1 мг/мл 10 мМ бикарбонатом аммония, pH 7,8, и 100 мг антитела расщепляют трипсином (Promega, кат. № V5111) или Lys-C (Roche, кат. № 11047825001) при соотношении трипсин/Lys-C:антитело 1:20 (масс./масс.) при 37°C в течение 4 час. Гидролизаты гасят 1 мл 1Н HCl. Для пептидного картирования с масс-спектрометрической детекцией 40 мл гидролизатов разделяли посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ВЭЖХ-ОФ) на колонке C18 (Vydac, кат. № 218TP51, S/N NE9606 10.3.5) в системе ВЭЖХ Agilent 1100. Разделение пептидов проводили с градиентом с использованием подвижной фазой A (0,02% TFA и 0,08% FA в воде в степени очистки для ВЭЖХ) и подвижной фазой B (0,02% TFA и 0,08% FA в ацетонитриле) при скорости потока 50 мл/минуту. Масс-спектрометр API QSTAR Pulsar i эксплуатируют в положительном режиме при напряжении спрея 4,5 киловольт и диапазоне сканирования отношения массы к заряду от 800 до 2500.

Картирование дисульфидных связей

Для денатурации антитела 100 мл антитела смешивают с 300 мл 8 M гуанидина HCl в 100 мМ бикарбонате аммония. Проверяют pH для гарантии того, что он составляет от 7 до 8, и образцы денатурируют в течение 15 минут при комнатной температуре в конечной концентрации гуанидина HCl 6 M. Часть денатурированного образца (100 мл) разбавляют до 600 мл водой Milli-Q с получением конечной концентрации гуанидина HCl 1 M. Образец (220 мг) расщепляют трипсином (Promega, каталожный № V5111, № партии 22265901) или Lys-C (Roche, кат. № 11047825001, № партии 12808000) при соотношениях трипсина или Lys-C:антитело (масс./масс.) 1:50 (4,4 мг фермента:220 мг образца) при 37°C в течение приблизительно 16 часов. Дополнительно к образцам добавляют 5 мг трипсина или Lys-C и расщеплению позволяют продолжаться в течение дополнительных 2 часов при 37°C. Расщепление останавливают, добавляя к каждому образцу 1 мл TFA. Расщепленные образцы разделяют посредством ВЭЖХ-ОФ с использованием колонки C18 (Vydac, кат. № 218TP51 S/NNE020630-4-1A) на системе ВЭЖХ Agilent. Разделение проводят с тем же градиентом, который использовали для пептидного картирования с использованием подвижной фазы A (0,02% TFA и 0,08% FA в воде в степени очистки для ВЭЖХ) и подвижной фазы B (0,02% TFA и 0,08% FA в ацетонитриле) при скорости потока 50 мл/минуту. Рабочие параметры системы ВЭЖХ являются такими же, как рабочие параметры, используемые для пептидного картирования. Масс-спектрометр API QSTAR Pulsar i эксплуатируют в положительном режиме при напряжении спрея 4,5 киловольт и диапазоне сканирования отношения массы к заряду от 800 до 2500. Дисульфидные связи определяют сравнением наблюдаемых MW пептидов с теоретически рассчитанными MW триптических или Lys-C-пептидов, связанных дисульфидными связями.

Определение свободных сульфгидрильных групп

Способ, используемый для количественного определения свободных остатков цистеина в антителе, основан на реакции с реагентом Эллмана, 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой) (DTNB), с сульфгидрильными группами (SH), что приводит к характерному хромофорному продукту, 5-тио-(2-нитробензойной кислоте) (TNB). Реакцию можно проиллюстрировать формулой:

DTNB+RSH ® RS-TNB+TNB-+H+

Оптическую плотность TNB- измеряют при 412 нм с использованием спектрофотометра Cary 50. Кривую оптической плотности наносят на график с использованием разведений 2 меркаптоэтанола (b-ME) как стандарта свободных SH и концентрации свободных сульфгидрильных групп в белке определяют на основе оптической плотности образца при 412 нм.

Исходный раствор стандарта b-ME получают посредством серийного разведения 14,2 M b-ME водой степени очистки для ВЭЖХ до конечной концентрации 0,142 мМ. Затем получают стандарты в трех повторениях для каждой концентрации. Антитело концентрируют до 10 мг/мл с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra 10000 MWCO (Millipore, кат. № UFC801096, № партии L3KN5251) и буфер заменяют на буфер для состава, используемый для адалимумаба (5,57 мМ одноосновный фосфат натрия, 8,69 мМ двухосновный фосфат натрия, 106,69 мМ NaCl, 1,07 мМ цитрат натрия, 6,45 мМ лимонная кислота, 66,68 мМ маннит, pH 5,2, 0,1% (масс./об.) Tween). Образцы смешивают в вибрационной мешалке при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем в каждый образец и стандарт добавляют 180 мл 100 мМ буфера Tris, pH 8,1, с последующим добавлением 300 мл 2 мМ DTNB в 10 мМ фосфатном буфере, pH 8,1. После тщательного перемешивания образцы и стандарты измеряют по поглощению при 412 нм на спектрофотометре Cary 50. Стандартную кривую получают посредством нанесения на график количества свободных SH и OD_412нм стандартов b-ME. Содержание свободных SH в образцах рассчитывают на основе этой кривой после вычитания фона.

Катионообменная хроматография на основе слабых катионов

Антитело разбавляют до 1 мг/мл 10 мМ фосфатом натрия, pH 6,0. Гетерогенность заряда анализируют с использованием системы ВЭЖХ Shimadzu с аналитической колонкой WCX-10 ProPac (Dionex, кат. № 054993, S/N 02722). Образцы наносят на колонку в 80% подвижной фазе A (10 мМ фосфат натрия, pH 6,0) и 20% подвижной фазе B (10 мМ фосфат натрия, 500 мМ NaCl, pH 6,0) и элюируют при скорости потока 1,0 мл/минуту.

Профилирование олигосахаридов

Олигосахариды, высвобождаемые после обработки антитела ПНГазой F, дериватизируют реагентом для мечения 2-аминобензамидом (2-AB). Флуоресцентно меченые олигосахариды разделяют посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии с прямой фазой (ВЭЖХ-ПФ), и различные формы олигосахаридов характеризуют на основе сравнения времени удержания с известными стандартами.

Сначала антитело обрабатывают ПНГазой F с отщеплением от Fc-части тяжелой цепи N-связанных олигосахаридов. Антитело (200 мг) помещают в 500-мл пробирку Eppendorf вместе с 2 мл ПНГазы F и 3 мл 10% N-октилглюкозида. Добавляют фосфатно-солевой буфер для доведения конечного объема до 60 мл. Образец инкубируют в течение ночи при 37°C в термомиксере Eppendorf, установленном на 700 об./мин. В качестве контроля ПНГазой F также расщепляют адалимумаб, партия AFP04C.

После обработки ПНГазой F образцы инкубируют при 95°C в течение 5 минут в термомиксере Eppendorf, установленном на 750 об./мин, для выпадения белков в осадок, затем образцы помещают в центрифугу Eppendorf на 2 минуты при 10000 об./мин для осаждения выпавших в осадок белков. Супернатант, содержащий олигосахариды, переносят в 500-мл пробирку Eppendorf и сушат на центрифуге типа "speed-vac" при 65°C.

Олигосахариды метят 2AB с использованием набора для мечения 2AB, приобретаемого в Prozyme (кат. № GKK-404, № партии 132026). Реагент для мечения получают по инструкциям производителя. Уксусную кислоту (150 мл, предоставляемую в наборе) добавляют во флакон с DMSO (предоставляемый в наборе) и смешивают посредством нескольких пипетирований. Смесь уксусная кислота/DMSO (100 мл) переносят во флакон с красителем 2-AB (непосредственно перед использованием) и смешивают до полного растворения красителя. Затем раствор красителя добавляют во флакон восстановителя (предоставляемого в наборе) и хорошо смешивают (реагент для мечения). Реагент для мечения (5 мл) добавляют в каждый флакон с высушенным образцом олигосахарида и тщательно смешивают. Реакционные пробирки помещают в термомиксер Eppendorf, установленный на 65°C и 700-800 об./мин, для реакции в течение 2 часов.

После реакции мечения избыток флуоресцентного красителя удаляют с использованием картриджей GlycoClean S из Prozyme (кат. № GKI-4726). Перед добавлением образцов картриджи промывают 1 мл воды Milli-Q с последующими 5 разами по 1 мл 30% раствора уксусной кислоты. Непосредственно перед добавлением образцов в картриджи добавляют 1 мл ацетонитрила (Burdick and Jackson, кат. № AH015-4).

После пропускания через картридж всего ацетонитрила образец точечно наносят в центр свежепромытого диска и позволяют адсорбироваться на диск в течение 10 минут. Диск отмывают 1 мл ацетонитрила с последующими пятью разами по 1 мл 96% ацетонитрила. Картриджи помещают в 1,5-мл пробирку Eppendorf, и меченные 2-AB олигосахариды элюируют 3 раза (400 мл каждый раз) воды Milli-Q.

Олигосахариды разделяют с использованием колонки для ВЭЖХ Glycosep N (кат. № GKI-4728) соединенной с системой ВЭЖХ Shimadzu. Система ВЭЖХ Shimadzu состоит из контроллера системы, дегазатора, бинарных насосов, автодозатора с охладителем образцов и детектора флуоресценции.

Стабильность при повышенных температурах

Буфер для антитела представляет собой 5,57 мМ одноосновный фосфат натрия, 8,69 мМ двухосновный фосфат натрия, 106,69 мМ NaCl, 1,07 мМ цитрат натрия, 6,45 мМ лимонная кислота, 66,68 мМ маннит, 0,1% (масс./об.) Tween, pH 5,2, или 10 мМ гистидин, 10 мМ метионин, 4% маннит, pH 5,9, с использованием фильтров для ультрацентрифуги Amicon. Конечную концентрацию антител доводят до 2 мг/мл соответствующими буферами. Затем растворы антител стерилизуют посредством фильтрации и в стерильных условиях получают аликвоты по 0,25 мл. Аликвоты оставляют при -80°C, 5°C, 25°C или 40°C в течение 1, 2 или 3 недель. В конце периода инкубации образцы анализируют посредством эксклюзионной хроматографии и SDS-PAGE.

Стабильность образцов анализируют посредством SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Используемый способ является таким же, как описано в настоящем документе. Гели окрашивают в течение ночи красителем коллоидным синим (Invitrogen кат. № 46-7015, 46-7016), и краситель удаляют водой Milli-Q до обесцвечивания фона. Затем окрашенные гели сканируют с использованием сканера Epson Expression (модель 1680, S/N DASX003641). Для обеспечения большей чувствительности эти же гели окрашивают серебром с использованием набора для окрашивания серебром (Owl Scientific) и используют способы, предлагаемые производителем.

Пример 1.2.2.3.C: Действие гуманизированного моноклонального антитела самостоятельно или в комбинации с химиотерапией на рост ксенотрансплантатов карциномы человека

Злокачественные клетки человека выращивают in vitro до 99% жизнеспособности, 85% конфлуэнтности во флаконах для тканевых культур. Самок или самцов мышей SCID (Charles Rivers Labs) с массой 19-25 грамм метят на ушах и бреют. Затем в сутки исследования 0 мышам подкожно в правый бок инокулируют 0,2 мл 2×10⁶ опухолевых клеток человека (1:1 с матригелем). Введение (IP, Q3D/неделю) носителя (PBS), гуманизированного антитела и/или проведение химиотерапии начинают после того, как мышей распределяют по размерам в отдельные клетки со средним размером опухолей приблизительно от 150 до 200 мм³. Опухоли измеряют циркулем дважды в неделю, начиная приблизительно на сутки 10 после инокуляции, и объемы опухолей рассчитывают по формуле V=L×W²/2 (V: объем, мм³; L: длина, мм; W: ширина, мм). У животных, обрабатываемых mAb отдельно или в комбинации с химиотерапией, наблюдали уменьшение объема опухоли относительно опухолей у животных, получавших только носитель или изотипическое контрольное mAb.

Пример 1.2.2.3.D: Анализ перенаправленной цитотоксичности (rCTL) на основе FACS

CD3+ T-клетки человека выделяют из ранее замороженных выделенных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) посредством обогащающей колонки с отрицательным отбором (R&D Systems, Minneapolis, MN; Кат. №HTCC-525). T-клетки стимулируют в течение 4 суток в колбах (с вентиляционной крышкой, Coming, Acton, MA), покрытых 10 мкг/мл антитела к CD3 (OKT-3, eBioscience, Inc., San Diego, CA) и 2 мкг/мл антитела к CD28 (CD28,2, eBioscience, Inc., San Diego, CA) в D-PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA), и культивируют с 30 Ед/мл IL-2 (Roche) в полной среде RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) с L-глутамином, 55 мМ β-ME, Pen/Strep, 10% FBS). Затем T-клетки перед использованием в анализе оставляют в течение ночи с 30 Ед/мл IL-2. Клетки-мишени DoHH2 или Raji метят PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) по инструкциям производителя. Во время всего анализа rCTL используют среду RPMI 1640 (без фенола, Invitrogen, Carlsbad, CA), содержащую L-глутамин и 10% FBS (Hyclone, Logan, UT). (См. Dreier et al. (2002) Int. J. Cancer 100:690).

Эффекторные T-клетки (E) и мишени (T) высевают в конечной концентрация клеток 10⁵ и 10⁴ клеток/лунку в 96-луночные планшеты (Costar #3799, Acton, MA), соответственно, с получением отношения E:T 10:1. Молекулы DVD-Ig разбавляют для получения зависимых от концентрации кривых титрования. После инкубации в течение ночи клетки осаждают и однократно отмывают D-PBS с последующим ресуспендированием в буфере для FACS, содержащем 0,1% BSA (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,1% азид натрия и 0,5 мкг/мл йодида пропидия (BD) в D-PBS. Данные FACS получают на устройстве FACS Canto II (Becton Dickinson, San Jose, CA) и анализируют в Flowjo (Treestar). Для определения процента специфического лизиса рассчитывают процент жизнеспособных мишеней в обработанных молекулами DVD-Ig образцах, деленный на процент всех мишеней (контроль, без обработки). IC₅₀ рассчитывают в Prism (Graphpad).

Пример 1.4: Получение молекул DVD-Ig

Молекулы DVD-Ig, способные к связыванию двух антигенов, конструируют с использованием двух исходных моноклональных антител, одно к антигену человека A, а другое к антигену человека B, выбранных, как описано в настоящем документе.

Пример 1.4.1: Получение молекул DVD-Ig с двумя длинами линкеров

Используют константную область, содержащую Fc μ1 с мутациями в 234 и 235 для устранения эффекторных функций ADCC/CDC. Получают четыре различных конструкции DVD-Ig к A/B: 2 с коротким линкером и 2 с длинным линкером, каждую с двумя ориентациями доменов: V_A-V_B-C и V_B-V_A-C (см. таблицу 13). Линкерные последовательности, полученные из N-концевой последовательности Cl/Ck или домена CH1 человека, являются следующими:

Для конструкций DVDAB:

Легкая цепь (если фрагмент к A содержит λ): короткий линкер: QPKAAP (SEQ ID NO: 15); длинный линкер: QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16)

Легкая цепь (если фрагмент к A содержит κ): короткий линкер: TVAAP (SEQ ID NO: 13); длинный линкер: TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14)

Тяжелая цепь (γ1): короткий линкер: ASTKGP (SEQ ID NO: 21); длинный линкер: ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22)

Для конструкций DVDBA:

Легкая цепь (если фрагмент к B содержит λ): короткий линкер: QPKAAP (SEQ ID NO: 15); длинный линкер: QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16)

Легкая цепь (если фрагмент к B содержит k): короткий линкер: TVAAP (SEQ ID NO: 13); длинный линкер: TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14)

Тяжелая цепь (γ1): короткий линкер: ASTKGP (SEQ ID NO: 21); длинный линкер: ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22)

Конструкции тяжелых и легких цепей субклонируют в экспрессирующий вектор pBOS и экспрессируют в клетках COS с последующей очисткой посредством хроматографии с белком A. Очищенные вещества подвергают анализам SDS-PAGE и SEC.

В таблице 13 приведены конструкции тяжелых цепей и легких цепей, используемые для экспрессии каждого из белков DVD-Ig к A/B.

Таблица 13 Конструкции DVD-Ig A/B
Белок DVD-Ig	Конструкция тяжелой цепи	Конструкция легкой цепи
DVDABSL	DVDABHC-SL	DVDABLC-SL
DVDABLL	DVDABHC-LL	DVDABLC-LL
DVDBASL	DVDBAHC-SL	DVDBALC-SL
DVDBALL	DVDBAHC-LL	DVDBALC-LL

Пример 1.4.2: Молекулярное клонирование конструкций ДНК для DVDABSL и DVDABLL

Для получения конструкций тяжелых цепей DVDABHC-LL и DVDABHC-SL домен VH антитела A амплифицируют посредством ПЦР с использованием специфичных праймеров (3'-праймеры содержат короткие/длинные направляющие последовательности для конструкций SL/LL, соответственно); тогда как домен VH антитела B амплифицируют с использованием специфичных праймеров (5'-праймеры содержат короткие/длинные направляющие последовательности для конструкций SL/LL, соответственно). Обе реакции ПЦР проводят стандартными способами и процедурами ПЦР. Два продукта ПЦР очищают на геле и используют совместно в качестве перекрывающейся матрицы для реакции ПЦР с перекрыванием последовательностей. Перекрывающиеся продукты ПЦР субклонируют в дважды расщепленный SrfI и SalI экспрессирующий вектор, не используемый у млекопитающих, pBOS-hCγ1,z (Abbott) с использованием стандартного подхода гомологичной рекомбинации.

Для получения конструкций легких цепей DVDABLC-LL и DVDABLC-SL домен VL антитела A амплифицируют посредством ПЦР с использованием специфичных праймеров (3'-праймеры содержат короткие/длинные направляющие последовательности для конструкций SL/LL, соответственно); тогда как домен VL антитела B амплифицируют с использованием специфичных праймеров (5'-праймеры содержат короткие/длинные направляющие последовательности для конструкций SL/LL, соответственно). Обе реакции ПЦР проводят стандартными способами и процедурами ПЦР. Два продукта ПЦР очищают на геле и используют совместно в качестве перекрывающейся матрицы для реакции ПЦР с перекрыванием последовательностей с использованием стандартных условий ПЦР. Перекрывающиеся продукты ПЦР субклонируют в дважды расщепленный SrfI и SalI экспрессирующий вектор pBOS-hCk млекопитающих (Abbott) с использованием стандартного подхода гомологичной рекомбинации. Для получения DVDBASL и DVDBALL использовали сходный подход, как описано ниже.

Пример 1.4.3: Молекулярное клонирование конструкций ДНК для DVDBASL и DVDBALL

Для получения конструкций тяжелых цепей DVDBAHC-LL и DVDBAHC-SL домен VH антитела B амплифицируют посредством ПЦР с использованием специфичных праймеров (3'-праймеры содержат короткие/длинные направляющие последовательности для конструкций SL/LL, соответственно); тогда как домен VH антитела A амплифицируют с использованием специфичных праймеров (5'-праймеры содержат короткие/длинные направляющие последовательности для конструкций SL/LL, соответственно). Обе реакции ПЦР проводят стандартными способами и процедурами ПЦР. Два продукта ПЦР очищают на геле и используют совместно в качестве перекрывающейся матрицы для реакции ПЦР с перекрыванием последовательностей с использованием стандартных условий ПЦР. Перекрывающиеся продукты ПЦР субклонируют в дважды расщепленный SrfI и SalI экспрессирующий вектор, не используемый у млекопитающих, pBOS-hCγ1,z (Abbott) с использованием стандартного подхода гомологичной рекомбинации.

Для получения конструкций легких цепей DVDBALC-LL и DVDBALC-SL домен VL антитела B амплифицируют посредством ПЦР с использованием специфичных праймеров (3'-праймеры содержат короткие/длинные направляющие последовательности для конструкций SL/LL, соответственно); тогда как домен VL антитела A амплифицируют с использованием специфичных праймеров (5'-праймеры содержат короткие/длинные направляющие последовательности для конструкций SL/LL, соответственно). Обе реакции ПЦР проводят стандартными способами и процедурами ПЦР. Два продукта ПЦР очищают на геле и используют совместно в качестве перекрывающейся матрицы для реакции ПЦР с перекрыванием последовательностей с использованием стандартных условий ПЦР. Перекрывающиеся продукты ПЦР субклонируют в дважды расщепленный SrfI и SalI экспрессирующий вектор pBOS-hCk млекопитающих (Abbott) с использованием стандартного подхода гомологичной рекомбинации.

Пример 1.4.4: Конструкция и экспрессия дополнительных молекул DVD-Ig

Пример 1.4.4.1: Получение векторных конструкций DVD-Ig

Аминокислотные последовательности исходных антител для конкретных антител, распознающих конкретные антигены или их эпитопы, для встраивания в молекулу DVD-Ig можно получать посредством получения гибридом, как описано выше, или можно получать посредством секвенирования известных белков или нуклеиновых кислот антител. Кроме того, можно получать известные из литературы последовательности. Последовательности можно использовать для синтеза нуклеиновых кислот с использованием стандартного синтеза ДНК или технологий амплификации и сборки желаемых фрагментов антител в экспрессирующие векторы с использованием стандартной технологии рекомбинантных ДНК для экспрессии в клетках.

Например, определяли кодоны нуклеиновой кислоты на основе аминокислотных последовательностей и синтезировали олигонуклеотидные ДНК посредством Blue Heron Biotechnology, Inc. (www.blueheronbio.com) Bothell, WA USA. Олигонуклеотиды объединяли в двухцепочечные ДНК фрагменты длиной 300-2000 пар нуклеотидов, клонировали в плазмидный вектор и подтверждали последовательность. Клонированные фрагменты объединяли с использованием ферментативного процесса с получением полного гена и субклонировали в экспрессирующий вектор. (см. 7306914; 7297541; 7279159; 7150969; 20080115243; 20080102475; 20080081379; 20080075690; 20080063780; 20080050506; 20080038777; 20080022422; 20070289033; 20070287170; 20070254338; 20070243194; 20070225227; 20070207171; 20070150976; 20070135620; 20070128190; 20070104722; 20070092484; 20070037196; 20070028321; 20060172404; 20060162026; 20060153791; 20030215458; 20030157643).

Для клонирования молекул исходных антител и DVD-Ig использовали группу векторов pHybE (патентная заявка США с серийным № 61/021282). Для клонирования тяжелых цепей антител и DVD с константной областью дикого типа использовали V1, полученный из pJP183; pHybE-hCg1,z,non-a V2. Для клонирования легких цепей антител и DVD с константной областью каппа использовали V2, полученный из pJPl91; pHybE-hCk V2. Для клонирования легких цепей антител и DVD с константной областью лямбда использовали V3, полученный из pJPl92; pHybE-hC1 V2. Для клонирования легких цепей DVD с гибридным V-доменом лямбда-каппа использовали V4, построенный с сигнальным пептидом лямбда и константной областью каппа. Для клонирования легких цепей DVD с гибридным V-доменом каппа-лямбда использовали V5, построенный с сигнальным пептидом каппа и константной областью лямбда. Для клонирования тяжелых цепей с мутантной константной областью (234,235 AA) использовали V7, полученный из pJPl83; pHybE-hCg1,z,non-a V2.

Со ссылкой на таблицу 14 в клонировании цепей VH и VL молекул исходных антител и DVD-Ig использовали ряд векторов.

Таблица 14 Векторы, используемые для клонирования исходных антител и молекул DVD-Ig

Пример 1.4.4.2: Трансфекция и экспрессия в клетках 293

Экспрессию молекул эталонных антител и DVD-Ig проводили посредством транзиторной котрансфекции в клетки HEK293 (EBNA) плазмид, содержащих соответствующие нуклеиновые кислоты для легких цепей (LC) и тяжелых цепей (HC). Клетки HEK293 (EBNA) выращивали в среде Freestyle 293 (Invitrogen, Carlsbad CA) в 0,5 л масштабе в колбах (2 л Corning кат. № 431198), перемешиваемых в инкубаторе CO₂ (8% CO₂, 125 об./мин, 37°C). Когда культуры достигали плотности 1×10⁶ клеток/мл, клетки трансфицировали трансфекционным комплексом. Трансфекционный комплекс получали посредством начального смешивания 150 мкг плазмиды с LC и 100 мкг плазмиды с HC в 25 мл среды Freestyle, с последующим добавлением 500 мкл исходного раствора PEI [исходный раствор: 1 мг/мл (pH 7,0) линейного 25 кДа PEI, Polysciences Кат. № 23966]. Трансфекционный комплекс смешивали посредством переворачиваний и оставляли инкубироваться при комнатной температуре в течение 10 минут с последующим добавлением в клеточную культуру. После трансфекции культуры продолжали выращивать в инкубаторе CO₂ (8% CO₂, 125 об./мин, 37°C). Через двадцать четыре часа после трансфекции культуры дополняли 25 мл 10% раствора триптона N1 (Organo Technie, La Coumeuve France Кат. № 19553). Через девять суток после трансфекции клетки удаляли из культур посредством центрифугирования (16000 g, 10 минут), а оставшийся супернатант стерилизовали фильтрованием (Millipore HV Durapore Stericup, 0,45um) и помещали на 4°C до начала этапа очистки.

Каждую молекулу антитела или DVD-Ig отдельно очищают с использованием одноразовых 1 мл наполненной колонки (наполненной Orochem Technologies), содержащей смолу MabSelect SuRe (GE Healthcare). Колонки предварительно уравновешивали в PBS, а затем в них вносили собранные 0,55 л образцов в течение ночи (15 часов) при 1 мл/минута с фильтратом, повторно возвращаемым в подающий контейнер. После этапа внесения колонки отмывали 20 мл PBS, и белок элюировали посредством вводимого буфера для элюции [50 мМ лимонная кислота pH 3,5] при 4 мл/мин, и фракции (1 мл) собирали в пробирки, уже содержащие 0,2 мл 1,5 M Tris pH 8,2 (доводя конечный pH приблизительно до 6,0). Фракции, содержащие антитело, объединяли на основе хроматограмм и диализовали в конечный буфер для хранения [10 мМ лимонная кислота, 10 мМ Na₂HPO₄, pH 6,0]. После диализа образцы фильтровали через 0,22-мкм Steriflip (Millipore) и концентрацию белка определяли посредством оптической плотности [спектрофотометр Hewlett Packard 8453 с диодной матрицей]. Анализ SDS-PAGE (восстанавливающий и невосстанавливающий) проводили на аналитических образцах для оценки конечной чистоты, подтверждения присутствия полос тяжелых и легких цепей соответствующего размера и подтверждения отсутствия значительных количеств свободной (например, несвязанной) легкой цепи (в невосстанавливающих образцах).

Таблица 15 содержит данные о выходе исходных антител или конструкций DVD-Ig, выражаемом в виде миллиграмм на литр в клетках 293.

Таблица 15 Транзиторная экспрессия в выходах исходных антител и конструкций DVD-Ig в клетках 293

Все DVD хорошо экспрессировались в клетках 293. DVD можно легко очищать на колонке с белком A. В большинстве случаев из супернатантов клеток 293 легко можно получать >5 мг/л очищенной молекулы DVD-Ig.

Пример 1.4.5: Характеристика и первичный отбор молекул DVD-Ig A/B

Аффинности связывания молекул DVD-Ig к A/B анализируют на Biacore в отношении белка A и белка B. Свойство четырехвалентности молекулы DVD-Ig исследуют посредством нескольких исследований связывания на Biacore. При этом оценивают нейтрализующую активность молекул DVD-Ig в отношении белка A и белка B посредством биологических анализов, соответственно, как описано в настоящем документе. Молекулы DVD-Ig, которые лучше всего сохраняют аффинность и активность исходных mAb, выбирают для всесторонней физико-химической и биоаналитической (PK у крыс) характеристики для каждого mAb, как описано в настоящем документе. На основе набора анализов конечную первичную молекулу DVD-Ig выбирают для разработки стабильной линии клеток CHO, и полученный из CHO материал применяют в исследованиях стабильности, фармакокинетики и эффективности у яванского макака, и активности перед составлением.

Пример 2: Получение и характеристика молекул иммуноглобулинов с двойными вариабельными доменами (DVD-Ig)

Молекулы иммуноглобулинов с двойными вариабельными доменами (DVD-Ig) с использованием исходных антител с известными аминокислотными последовательностями получали посредством синтеза полинуклеотидных фрагментов, кодирующих последовательности вариабельных областей тяжелых цепей DVD-Ig и вариабельных областей легких цепей DVD-Ig, и клонирования фрагментов в вектор pHybC-D2 в соответствии с примером 1.4.4.1. Конструкции DVD-Ig клонировали в клетки 293 и экспрессировали в них, как описано в примере 1.4.4.2. Белок DVD-Ig очищали стандартными способами. Функциональные характеристики определяли способами, описанными в примерах 1.1.1 и 1.1.2, как указано. Ниже приведены цепи VH и VL DVD-Ig молекул DVD-Ig по изобретению.

Пример 2.1: Получение молекул DVD-Ig к IL-1альфа (посл. 3) и IL-1бета (посл. 1) с набором линкеров 1

Таблица 16

Пример 2.2: Получение молекул DVD-Ig к IL-1альфа (посл. 2) и IL-1бета (посл. 1) с наборами линкеров 1 и 2

Таблица 17

Пример 2.3: Получение молекул DVD-Ig к IL-1альфа (посл. 1) и IL-1бета (посл. 1) с набором линкеров 1 и 2

Таблица 18

Пример 2.4: Получение молекул DVD-Ig к IL-1альфа (посл. 3) и IL-1бета (посл. 2) с набором линкеров 1

Таблица 19

Пример 2.5: Получение молекул DVD-Ig к IL-1альфа (посл. 4) и IL-1бета (посл. 2) с набором линкеров 1

Таблица 20

Пример 2.6: Получение молекул DVD-Ig к IL-1альфа (посл. 4) и IL-1бета (посл. 3) с набором линкеров 1

Таблица 21

Пример 2.7: Получение молекул DVD-Ig к IL-1альфа (посл. 4) и IL-1бета (посл. 4) с набором линкеров 1

Таблица 22

Пример 2.8: Получение молекул DVD-Ig к IL-1альфа (посл. 4) и IL-1бета (посл. 5) с набором линкеров 1

Таблица 23

Пример 2.9: Последовательности клонирующих векторов, используемые для клонирования последовательностей исходных антител и DVD-Ig

Таблица 24

Настоящее изобретение в качестве ссылки полностью включает способы, хорошо известные в области молекулярной биологии и доставки лекарственных средств. Эти способы в качестве неограничивающих примеров включают способы, описанные в следующих публикациях:

Включение в качестве ссылки

Содержания всех цитируемых ссылок (включая ссылки на литературу, патенты, патентные заявки и веб-сайты), которые могли быть цитированы на всем протяжении этой заявки, таким образом, явно включены полностью в качестве ссылки для любой цели, также как и цитируемые в них ссылки. Если не указано иначе, в практическом осуществлении настоящего изобретения используют общепринятые способы иммунологии, молекулярной биологии и клеточной биологии, которые хорошо известны в данной области.

Эквиваленты

Изобретение можно осуществлять в других конкретных формах без отклонения от его сущности или основных характеристик. Таким образом, указанные выше варианты осуществления следует во всех отношениях считать иллюстративными, а не ограничивающими изобретение, описываемое в настоящем документе. Таким образом, объем изобретения указан прилагаемой формулой изобретения, а не приведенным выше описанием, и, таким образом, все изменения, которые проводят в пределах значения и диапазона эквивалентности формулы изобретения, предназначены для включения в настоящий документ.

1. Связывающий белок, представляющий собой иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами, который связывает IL-1α и IL-1β, содержащий первую и вторую полипептидные цепи,

где первая полипептидная цепь содержит первую VD1-X1-VD2-С-Х2, где

VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи;

VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи;

С представляет собой константный домен тяжелой цепи;

X1 представляет собой линкер;

Х2 представляет собой Fc-область;

и

где вторая полипептидная цепь содержит вторую VD1-X1-VD2-C, где

VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи;

VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи;

С представляет собой константный домен легкой цепи;

X1 представляет собой линкер;

где либо вариабельный домен VD1 тяжелой и легкой цепей, либо вариабельный домен VD2 тяжелой и легкой цепей образуют домен, связывающий антиген IL-1бета, который связывает антиген IL-1бета и содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 30 и 31 или SEQ ID NO: 32 и 33, где SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 32 являются вариабельными доменами тяжелой цепи и где последовательности SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 33 являются вариабельными доменами легкой цепи, и

где отличные от VD1 или VD2 вариабельные домены тяжелой и легкой цепей образуют домен, связывающий антиген IL-1альфа, который связывает антиген IL-1альфа.

2. Связывающий белок по п.1, где вариабельный домен тяжелой цепи антигенсвязывающего домена, который связывает IL-1альфа, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 42, 44 и 46, и где вариабельный домен легкой цепи антигенсвязывающего домена, который связывает IL-1альфа, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41, 43, 45 и 47.

3. Связывающий белок по п.1, где X1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-29.

4. Связывающий белок по п.1, где связывающий белок содержит две первые полипептидные цепи и две вторые полипептидные цепи.

5. Связывающий белок по п.1, где Fc-область представляет собой вариант последовательности Fc-области.

6. Связывающий белок по п.5, в котором вариант последовательности Fc-области представляет собой вариант последовательности Fc-области, содержащий мутации в шарнирной области L234A и L235A.

7. Связывающий белок по п.1, в котором С-Х2 в первой полипептидной цепи содержит SEQ ID NO: 49 и С во второй полипептидной цепи содержит SEQ ID NO: 50.

8. Связывающий белок по п.1, в котором вариабельные домены тяжелой и легкой цепей VD1 содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 30 и 31.

9. Связывающий белок по п.7, в котором вариабельные домены тяжелой и легкой цепей VD1 содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 30 и 31.

10. Связывающий белок, представляющий собой иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами, который связывает IL-1α и IL-1β, содержащий четыре полипептидные цепи,

где две полипептидные цепи содержат VD1-X1-VD2-С-Х2, где

VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи;

VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи;

С представляет собой константный домен тяжелой цепи;

X1 представляет собой линкер;

Х2 представляет собой Fc-область;

и

где две полипептидные цепи содержат VD1-X1-VD2-С, где

VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи;

VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи;

С представляет собой константный домен легкой цепи;

X1 представляет собой линкер;

где вариабельные домены VD1 тяжелой и легкой цепей образуют домен, связывающий антиген IL-1бета, который связывает антиген IL-1бета и содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 30 и 31 или SEQ ID NO: 32 и 33, где SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 32 являются вариабельными доменами тяжелой цепи и где последовательности SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 33 являются вариабельными доменами легкой цепи; и

где вариабельные домены VD2 тяжелой и легкой цепей образуют домен, связывающий антиген IL-1альфа, который связывает антиген IL-1альфа.

11. Связывающий белок по п.10, в котором Fc-область представляет собой вариант последовательности Fc-области.

12. Связывающий белок по п.11, в котором вариант последовательности Fc-области представляет собой вариант последовательности Fc-области, содержащий мутации в шарнирной области L234A и L235A.

13. Связывающий белок по п.10, в котором С-Х2 в первой полипептидной цепи содержит SEQ ID NO: 49 и С во второй полипептидной цепи содержит SEQ ID NO: 50.

14. Связывающий белок по п.10, в котором вариабельные домены тяжелой и легкой цепей VD1 содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 30 и 31.

15. Связывающий белок по п.13, в котором вариабельные домены тяжелой и легкой цепей VD1 содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 30 и 31.

16. Связывающий белок по любому из пп.1-15, где связывающий белок обладает константой ассоциации (K_on) в отношении антигена IL-1бета, выбранной из группы, состоящей из: по меньшей мере приблизительно 10² М^-1сек^-1; по меньшей мере приблизительно 10³ М^-1сек^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁴ М^-1сек^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁵ М^-1сек^-1 и по меньшей мере приблизительно 10⁶ М^-1сек^-1, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса.

17. Связывающий белок по любому из пп.1-15, где связывающий белок обладает константой диссоциации (K_off) в отношении антигена IL-1бета, выбранной из группы, состоящей из: максимум приблизительно 10^-3 сек^-1; максимум приблизительно 10^-4 сек^-1; максимум приблизительно 10^-5 сек^-1 и максимум приблизительно 10^-6 сек^-1, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса.

18. Связывающий белок по любому из пп.1-15, где связывающий белок обладает константой диссоциации (K_D) в отношении антигена IL-1бета, выбранной из группы, состоящей из: максимум приблизительно 10^-7 М; максимум приблизительно 10^-8 М; максимум приблизительно 10^-9 М; максимум приблизительно 10^-10 М; максимум приблизительно 10^-11 М; максимум приблизительно 10^-12 М и максимум 10^-13 М.

19. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая связывающий белок, представляющий собой иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами, где связывающий белок содержит аминокислотную последовательность в соответствии с любым из пп.1-15.

20. Вектор, кодирующий тяжелую цепь иммуноглобулина с двойными вариабельными доменами и легкую цепь иммуноглобулина с двойными вариабельными доменами, где вектор содержит выделенную нуклеиновую кислоту по п.19.

21. Клетка-хозяин для экспрессии связывающего белка, представляющего собой иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами, содержащая вектор по п. 20, где клетка-хозяин не является человеческой клеткой.

22. Клетка-хозяин по п.21, где клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.

23. Клетка-хозяин по п.22, где клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.

24. Клетка-хозяин по п.22, где клетка-хозяин представляет собой COS.

25. Способ получения связывающего белка, представляющего собой иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами, включающий культивирование клеток-хозяев, указанных в любом из пп.21-24, в среде для культивирования в условиях, достаточных для получения связывающего белка; и выделение связывающего белка из среды для культивирования.

26. Способ по п.25, где 50%-75% получаемого связывающего белка представляют собой четырехвалентный связывающий белок с двойной специфичностью.

27. Способ по п.25, где 75%-90% получаемого связывающего белка представляют собой четырехвалентный связывающий белок с двойной специфичностью.

28. Способ по п.25, где 90%-95% получаемого связывающего белка представляют собой четырехвалентный связывающий белок с двойной специфичностью.

29. Фармацевтическая композиция иммуноглобулина с двойными вариабельными доменами для лечения индивидуума от заболевания или нарушения, при котором активность IL-1α и IL-1β или IL-1β является вредоносной, содержащая связывающий белок по любому из пп.1-15 и фармацевтически приемлемый носитель.

30. Фармацевтическая композиция по п.29, дополнительно содержащая по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.

31. Способ лечения индивидуума от заболевания или нарушения, при котором активность IL-1α и IL-1β или IL-1β является вредоносной, включающий введение терапевтически эффективного количества связывающего белка по любому из пп.1-15.

32. Способ по п.31, в котором указанное заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из: ревматоидного артрита, остеоартрита, юношеского хронического артрита, септического артрита, артрита Лайма, псориатического артрита и реактивного артрита.