Новый штамм glomus iranicum вида tenuihypharum var. nov. и его использование в качестве биостимулянта
Группа изобретений относится к биотехнологии. Штамм Glomus iranicum вида Tenuihypharum var. nov., который может быть использован как биостимулятор, способствующий повышению урожайности сельскохозяйственных культур, депонированный в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов под номером 54871, включающий последовательность SEQ ID №:1. Предложены композиция, включающая споры и внематричный мицелий указанного штамма и смектитные глины 2:1, и ее применение в качестве бионематоцида. Указанная композиция может включать фунгициды, биофунгициды, инсектициды, биоинсектициды, нематоциды и бионематоциды. Изобретения обеспечивают увеличение урожайности сельскохозяйственных культур в условиях интенсивного ведения сельского хозяйства. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 7 табл., 2 пр.
Область изобретения
Изобретение относится к агрономии. В частности, настоящее изобретение относится к композиции, состоящей из штамма Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. и прочих компонентов, используемой в качестве био стимулянта.
Уровень техники
Микоризные композиции, имеющиеся на настоящий момент, имеют естественное ограниченное количество микоризных отростков. Указанное количество главным образом ограничивается за счет используемого штамма и способа получения микоризных композиций. Не все виды микоризных грибов, описываемых в литературе, имеют постоянную и положительную микоризную активность в сельскохозяйственных культурах.
Микоризообразующие грибы, описываемые при существующем уровне техники, не имеют постоянного положительного воздействия на урожайность за счет недостаточной эффективности микоризной колонизации при всех грунтовых условиях и уровнях плодородия. Высокий уровень микоризной колонизации и высокий темп роста мицелия, которые имеет штамм, описываемый в настоящей заявке, при разной степени засоленности почвы позволит обеспечить более широкое применение данной технологии в сфере интенсивного земледелия, что приведет к более рациональному использованию водных ресурсов, более эффективному усвоению питательных веществ и общему увеличению урожайности. Более того, данный штамм имеет положительное воздействие при внесении большого количества удобрений.
Описание изобретения
Один вариант осуществления изобретения представляет собой штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., депонированный под депонентным номером 54871 в Бельгийских координированных коллекциях микроорганизмов (ВССМ), включающий последовательность, обозначаемую идентификатором последовательности SEQ ID №: 1, далее - штамм изобретения.
Штамм изобретения Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., выделенный из засоленной натриевой почвы в г. Фортуна, Мурсия (Испания), депонирован 19.04.2013 в международном органе по депонированию - Бельгийские координированные коллекции микроорганизмов (ВССМ), расположенном по адресу: Лувенский католический университет, кафедра микологии Лувенского католического университета (MUCL), Круа дю Сюд 2, а/я L7.05.06, 1348 Лувен-ла-Нёв, компанией Symborg, S.L. («Сумборг, С.Л.»), расположенной по адресу: корпус Ceeim, территория университета, б/н, 30100 Мурсия, Испания.
Штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. идентифицирован депонентом по ссылочному номеру SYMBORG-001 и получил депонентный номер 54871, присвоенный международным органом по депонированию.
Спорокарпии штамма изобретения Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. неизвестны. Споры указанного штамма встречаются поодиночке или в рыхлых гроздьях в почве, они также могут время от времени формироваться в корнях. Споры от прозрачного до светлого красновато-желтого цвета, округлой до шаровидной (редко неровной) формы, имеют относительно небольшой диаметр (24,0) 30,7±3,7 (42) микрон, а их стенки (толщиной 1-4 м) состоят из двух слоев: внутреннего расщепленного компактного слоя (0,5-1,5 м) и внешнего полупостоянного слоя с шероховатостью в местах образования молодых спор и несколько шероховатого в местах нахождения взрослых спор, в толщину достигающего от 0,5 до 2,0 м. Стенки внутреннего слоя молодых спор имеют красновато-коричневый цвет, который придает им реагент Мельцера, но цвет взрослых спор менее выражен, споры имеют слабый оттенок. Гифа, удерживающая спору, от прозрачного до бледного красновато-желтого цвета, в диаметре достигает от 2,5 до 4,5 микрон (в среднем 3,0 микрон), имеет ровную или неровную, цилиндрическую и в некоторых местах конусообразную форму, соединяется со слоями открытых спор споровой стенки, которую как минимум образуют взрослые споры. Структура прорастания: ростковая трубочка, которая растет и развивается через соединенную гифу и спору. Она образует пузырчатые древовидные микоризы.
Мицелий образует обширную сеть. Внематричный мицелий от прозрачного до бледно-желтого цвета, массивный, и споры всегда появляются в почвенной основе, образуя большое количество спорокарпиев в группе (от 2 до 8 отдельных спор). Уникальной особенностью этого вида является расширенная внешняя сеть мицелия и неспособность расти в лабораторных условиях вместе с трансформированными корнями.
Штамм был выделен из засоленной оглеенной почвы (солонца). Главной особенностью этих почв является то, что они очень переувлажнены, уплотнены и имеют большое количество солевых отложений на поверхности.
Штамм был выделен из почвы, расположенной в городе Фортуна, Мурсия (Испания).
В следующей таблице приведены некоторые химические свойства изначальной почвы, из которой был выделен штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov.
Согласно принципам филогенетики, на основании 813 пар оснований гена 18S рибосомной РНК (частичная последовательность), ITS1 (внутренний транскрибирующийся спейсер 1, полная последовательность) и гена 5.8S рибосомной РНК 5. (частичная последовательность), штамм изобретения относится к категории монофилетического таксона, состоящего из Rhizophagus (перед группой Glomus Ab, представленной грибами Rhizophagus irregularis, Glomus intraradices и Rhizophagus bistratum).
Согласно принципам филогенетики, грибы Glomus indicum и Glomus achrum являются ближайшими родственниками. Около пятидесяти последовательностей некультивированных копий Glomus spp. с высокой идентичностью (99%) с последовательностью штамма изобретения можно найти на сервере Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (банка генов).
Поэтому получается, что новый таксон распространен повсеместно и имеет широкий круг хозяев. Очень похожие последовательности возникли в Японии (Огура-Тсудзита Й. и соавт. 2013. Формирование древовидной микоризы в сердцевидных гаметофитах двух папоротников - Angiopteris lygodiifolia и Osmunda japonica. Журнал «Journal of Plant Research». 126 (1): 41-50; Ямато M. и соавт. 2011. Древовидные микоризные грибы в корнях нефотосинтезирующих растений - Sciaphila japonica и Sciaphila tosaensis (Риурисовые). Журнал «Mycoscience» 52: 217-223), Новой Зеландии, Африке и Северной Америке (Апполони С. и соавт. 2008. Молекулярный анализ сообщества древовидных микоризных грибов в корнях, находящихся в геотермальных почвах в Йеллоустонском национальном парке (США). Журнал «Microbial Ecology» 56 (4): 649-659).
Наиболее поразительным морфологическим признаком штамма изобретения является небольшой размер спор и цвет в диапазоне от прозрачного до светлого красновато-желтого, а также то, что грибы этого штамма встречаются по отдельности или небольшими группами в почве.
Единственным штаммом грибов Glomus sp. с прозрачными спорами, которые похожи по размеру и цвету на штамм изобретения, является Glomus iranicum (Блажковский Я. и соавт. (2010) Glomus africanum и G. iranicum - два новых вида древовидных микоризных грибов (Гломеромицеты). Журнал «Mycologia» 102: 1450-1462.) (Таблица 1). Три слоя споровой стенки морфологически неотличимы от трех слоев стенки спор штамма изобретения. Существует четкое отличие штамма изобретения, и оно заключается в очень маленьком размере гиф, прикрепленных к споре.
1 слой споровой стенки Glomus iranicum (Блажковский Я. и соавт. (2010) Glomus africanum и G. iranicum - два новых вида древовидных микоризных грибов (Гломеромицеты). Журнал «Mycologia» 102: 1450-1462.) разрушается быстро и последовательно, с сильной гликогенной активностью, однако в случае штамма изобретения, это явление наблюдается только в очень молодых спорах, таким образом, можно сделать вывод о том, это разновидность Glomus iranicum, и мы предлагаем новую разновидность tenuihypharum.
Это штамм, который приспосабливается и хорошо переносит соленую среду и жидкие удобрения с высокой электропроводимостью.
Вид образует большое количество внематричного мицелия, обеспечивающего надлежащее симбиотическое функционирование.
Вид достигает высоких концентраций внутренней колонизации за короткие промежутки времени, особенно в сельскохозяйственных культурах в условиях интенсивного ведения сельского хозяйства, что свидетельствует о его высокой эффективности в этих условиях.
Благодаря небольшому размеру спор и большому количеству внематричного мицелия, а также способности к восстановлению вида из-за физических повреждений, штамм можно обработать и измельчить до менее 80 микрон, при этом он будет оставаться полностью жизнеспособным в глинистом субстрате в течение более чем двух лет с доказанной эффективностью в диапазоне от 1,2×104 до 1×108 контагиозных ростков/100 мл-1 почвы.
Применение этого вида способствует эффективному увеличению урожайности сельскохозяйственных культур при интенсивном ведении сельского хозяйства, и сохраняет высокий уровень физиологической активности за счет небольших затрат энергии, учитывая малую величину транспирации, что способствует рациональному и эффективному использованию воды.
Штамм способствует радикальному изменению строения корня, способствуя развитию другой корневой системы, развивая ее в горизонтальном направлении и с большим дихотомическим ветвлением, что вызвано быстрой внутренней и внешней микоризной колонизацией, и потребностью в большем количестве корневых клеток-хозяев, которые также способствуют лучшему развитию корней в краткосрочной и долгосрочной перспективе.
Другим важным аспектом, который предстоит оценить, является микробная активность, осуществляемая этим организмом в ризосфере. Этот штамм вызывает постоянную стимуляцию ризосферных микробиотов в обработанных растениях. Этот факт обусловлен выделением собственных питательных элементов через мелкие корни, микоризы и гифы, стимулирующих как активность микроризосферы, так активность ризосферы в непосредственной близости от внешнего мицелия штамма Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., создающего более высокую микробную концентрацию в каждый момент испытания.
Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. - вид грибов, который прекрасно формирует микоризу.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой композицию, далее - композиция изобретения, которая содержит штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov, депонированный под депонентным номером 54871 в ВССМ, содержащий последовательность, обозначаемую идентификатором SEQ ID №:1, и смектитные глины 2:1. В частности, указанные смектитные глины 2:1 являются диоктаэдрическими или триоктаэдрическими. Кроме того, в частности, указанные смектитные глины 2:1 выбраны из группы, состоящей из сепиолита, аттапульгита, нонтронита и сапонита.
В настоящем изобретении используется глина типа диоктаэдрического или триоктаэдрического смектита, сепиолита и аттапульгита, каждый из которых обладает высокой пластичностью при смачивании и состоит из очень тонкого зернистого материала, состоящего из очень мелких частиц, размер которых составляет менее 4 микрон, и его основным свойством является расширение в системах с небольшим количеством воды, поскольку он может служить субстратом для размножения микоризных грибов. С другой стороны, это очень важно для образования и распада коллоидных частиц при наличии большого количества воды в случае применения в локальных оросительных системах. Эти типы глин по завершении одного из этапов образования инокулянта обеспечивают образование микоризных ростков со спорами, внематричным мицелием и колонизированными мелкими корнями; возникновение стрессовых ситуаций способствует последующему ускорению процессов проращивания сразу после инокуляции в условиях интенсивного и экологического выращивания сельскохозяйственных культур.
В примере 1 настоящего изобретения было установлено, что эффекты, которые имеет штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., по всем изученным показателям были лучше, чем эффекты, получаемые от видов Glomus mosseae и Glomus intraradices.
Благодаря микоризной экспрессии гена, необходимо подчеркнуть образование большого количества внематричного мицелия и легко извлекаемого гломалина, которое происходит при наличии вида Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. независимо от используемого удобрения, что свидетельствует об адаптации данного микроорганизма к различным соленым средам.
У растений, обработанных Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., увеличивается скорость образования листьев и корневой биомассы, что в свою очередь связано с более высокой концентрацией питательных веществ в листьях при наибольших дозах удобрений, что свидетельствует о высокой переносимости этих условий.
Полное удобрительное орошение растений с добавлением штаммов Glomus mosseae и Glomus intraradices не показало никаких существенных различий по сравнению с контрольными растениями с точки зрения образования свежей биомассы. Их активность снизилась с момента увеличения доз удобрений.
Применение Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. приводит к высокой фотосинтетической активности за счет меньшей скорости испарения, в результате чего обработанные растения более эффективно используют воду на протяжении всего периода созревания урожая при 50% и 100% дозах используемого удобрения.
Штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. обладает высокой активностью по отношению к остальной части инокулянтов, используемых в примере 1, что, возможно, обусловлено природой самого вида как высокосимбиотического суперпродуцента внематричного мицелия, гломалина, и сильной внутренней колонизацией, которая, в свою очередь, приводит к надлежащей физиологической активности с низкой устьичной проводимостью, что приводит к эффективному использованию воды и высокой производительности даже при более высоких дозах удобрения.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой композицию изобретения, в которой концентрация указанного штамма Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. составляет от 0,05 до 4% по весу. В частности, указанная концентрация составляет от 0,1 до 3% по весу.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой композицию изобретения, в которой указанная композиция представлена в форме порошка, эмульгируемого концентрата или гранул.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой композицию изобретения, в которой указанная композиция представляет собой жидкость, твердое вещество или гель.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой композицию изобретения, содержащую по меньшей мере один фунгицид, по меньшей мере один биофунгицид, по меньшей мере один инсектицид, по меньшей мере один биоинсектицид, по меньшей мере один нематоцид и/или по меньшей мере один биостимулятор.
В частности, указанный фунгицид выбран из группы, включающей манеб, манкозеб, металаксил-ридомил, миклобутанил, олпизан, пропамокарб, квинтозин, стрептомицин, серу, тиофанатметил, тирам, трифорин, винклозолин, окись цинка, цинеб, цирам, банрот, связанную медь, хлорталонил, каптан, хлорнеб, ципроконазол, этилен цинка, бисдитиокарбамат, этридиазол, фенаминосульф, фенаримол, флутоланил, фолпет, фосетил алюминия и ипродион.
В частности, указанный биофунгицид выбран из группы, включающей Trichodermas sp, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Streptomyces sp, Coniothyrium minitans и Pythium oligandrum.
В частности, указанный инсектицид выбран из группы, включающей органофосфат, карбамат и неоникотиноид.
В частности, указанный биоинсектицид выбран из группы, включающей Bacillus sp., Chromobacterium sp., Beauveria sp. и Metarhizium sp..
В частности, указанный нематоцид представляет собой органофосфат или карбамат.
В частности, указанный бионематоцид представляет собой Pasteuria sp.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ получения композиции изобретения, включающий:
(a) инокуляцию оболочки семени растения-хозяина штаммом Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., депонированным под депонентным номером 54871 в всем,
(b) выращивание указанного растения с циклами полива от 7 до 10 дней на репродуктивном субстрате, содержащем смектитовые глины, которые в процентном соотношении составляют более 52% от общего веса указанного субстрата,
(c) прекращение указанного полива в течение периода, равного или более 20 дней,
(d) удаление надземной части растения и удаление субстрата, и
(e) измельчение указанного субстрата до менее 80 микрон при температуре от 25 до 30°С для получения указанной композиции.
Другим вариантом осуществления изобретения является использование композиции изобретения в качестве био стимулянта.
Штамм изобретения выполняет функцию перемещения питательных веществ, получая эти питательные вещества из почвы или субстрата, и, используя указанные питательные вещества в метаболической системе, он перемещает указанные питательные вещества из сети мицелия, которые впоследствии попадают в клетки корней. Это явление можно описать термином «биостимуляция», и именно поэтому одним из вариантов осуществления изобретения является использование микоризной композиции изобретения в качестве био стимулянта.
В данном описании изобретения следует понимать, что термин «удобрение» находится в рамках более широкого термина «био стимулянт».
Другой вариант осуществления изобретения заключается в использовании данного изобретения, в котором композицию изобретения применяют к растению путем обработки семян, корней, погружения корней в эмульсию, добавления в воду для полива, полива, применения порошка в корневой системе или впрыскивания эмульсии в корневую систему.
Предпочтительные варианты осуществления изобретения
Пример 1
Генетическая идентификация штамма изобретения
Выделение ДНК
Выделенные гифы и споры переносили в пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл со стеклянными шариками массой 0,2 г (2 мм в диаметре) и 100 мкл буферного раствора ЦТАБ (2% ЦТАБ = Цетил-триметил аммония бромид, 1,4 М NaCl, 0,1 М Трис-HCl рН 7,5, 0,2 М Na-ЭДТА).
Данную смесь гармонизировали с помощью шаровой мельницы типа Retsch ММ301 на полной скорости в течение 30 секунд. Добавили еще 400 мкл буферного раствора ЦТАБ, и смесь выдерживали в термостате при температуре 65°С в течение одного часа. Затем добавили 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1) и размешали смесь, перевернув реакционные пробирки, и центрифугировали смесь в течение 5 минут при 10000×г, а верхний слой собрали в чистую пробирку Эппендорфа. Данный этап повторили два раза. В данную суспензию добавили 200 мкл 5 М ацетата аммония, смесь выдержали в термостате при температуре 4°С в течение 30 минут, после чего ее подвергли центрифугованию в течение 20 минут при температуре 4°С и скорости 13000 об/мин. ДНК осаждалась всю ночь с помощью 700 мкл изопропанола при температуре -20°С. Полученную осажденную ДНК выделили с помощью изопропанола и промыли ледяным 70% этиловым спиртом, высушили и повторно растворили в 50 мкл буферного раствора Трис этилендиамина (10 мМ Трис, 10 мМ ЭДТА, рН 8) +4,5 U РНКаза/мл.
Условия полимеразной цепной реакции
Для ПЦР-амплификации и секвенирования внутренних транскрибируемых участков-спейсеров гена 18S рРНК использовались праймеры Glom1310 и ITS4i (Редекер, 2000). Амплификации проводились в 0,2 мМ смеси dNTP, 1 мМ каждого праймера, 10% рабочем буферном растворе ПЦР и дважды дистиллированной стерильной воде. ДНК-полимеразу GoTaq® (Promega, Мангейм, Германия) добавили в 3,75 u/100 мкл реакционной смеси; 2 мкл матрицы геномной ДНК использовали в каждых 20 мкл/реакционная смесь. Амплификации проводились в усовершенствованном термоблоке Primus 96 (peqLab Biotechnology) в 200 реакционных пробирках (мкл) (изначальная денатурация проводилась при температуре 94°С в течение 120 с, после которой проводились 30 циклов при температуре 94°С в течение 15 с, при температуре 52°С в течение 30 с, при температуре 72°С в течение 45 с, а окончательный скошенный агар выдерживался при 72°С в течение 120 с).
Анализ данных
Выравнивание осуществлялось первоначально с использованием компьютерной программы BioEdit 7.0. Филогенетический анализ методом максимального правдоподобия (МП) был проведен с помощью программы PHYML. Модель замены нуклеотидов семейства GTR использовалась с оценками МП базовых частот. Доля неизменных участков была оценена и оптимизирована. Были разработаны четыре категории нормы замещения, и оценен и оптимизирован параметр гамма-распределения. Был использован бутстрэп-анализ со 100 повторами для проверки статистической поддержки ветвей.
Секвенирование
Избыточные праймеры и dNTP извлекались с помощью колоночной хроматографии (MicroSpin S-300 HR, Amersham Biosciences). Для частичного секвенирования области 18S-ITS1-5. 8S использовались праймеры Glom1310 и ITS4i в концентрации 1,6 мМ. Секвенирование проводилось с помощью набора для циклического секвенирования PRISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit от компании ABI (Applied Biosystems) в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Параметры для секвенирования: задержка 18 секунд при 96°С, а затем 25 циклов по 18 сек при 96°С, 5 секунд при 50°С и 4 мин при 60°С. Анализ последовательности проводили с использованием автоматического анализатора последовательностей (ABI PRISM 3130, Applied Biosystems) в сочетании с программным обеспечением ABI Prism ™ Auto Assembler (версия 140, Applied Biosystems).
Последовательность рибосомной РНК 18S (частичная последовательность), ITS1 (полная последовательность) и ген 5.8S рибосомной РНК (частичная последовательность) были получены из штамма изобретения, последовательность которого обозначается идентификатором SEQ ID №: 1.
Пример 2
Эффективность воздействия композиции изобретения на урожай салата-латука
Исследуемым видом растений был римский салат Lactuca sativa L - однолетнее растение, цикл роста которого составляет 90 дней. Высадка растений осуществлялась путем пересадки в период с января по март в горшочки размером 75 см × 15 см × 15 см, в каждом горшочке по три саженца. Данные химического анализа почвы, которые использовались при испытании, приведены ниже (Таблица 2).
В данном исследовании мы использовали три вида микоризных грибов: Glomus mosseae (Николсон и Гердеман) Гердеман и Трапп, Glomus intraradices (НК Шенк и ГС См. 1982) и Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov.
Способ получения инокулянтов подразумевал распространение различных видов Glomus в глиняном минеральном субстрате с многолетним растением-хозяином Lollium в течение 5 месяцев. В конце жизненного цикла видов растений корневая система и микоризные отростки, споры, мицелий и колонизированые мелкие корни гомогенизировали и использовали из расчета 2 г на растение.
Конечная концентрация штаммов была следующей: Glomus mosseae: 45 спор г-1 и 123 мг внематричного мицелия г-1, Glomus intraradices: 166 спор г-1 и 200 мг внематричного мицелия г-1 и Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov.: 200 спор г-1 и 430 мг внематричного мицелия г-1 (что установлено с помощью методов Джованетти и Мосса, 1980; Эррера и соавт., 1986, соответственно.).
Была установлена система орошения, и скорость падения капель в каждый горшок составляла 2 л ч-1, который был оборудован устройством для гомогенизации воды, подаваемой на всю поверхность субстрата. В данном анализе были изучены два условия внесения удобрений: 100% и 50% от общего количества удобрений.
Процесс внесения удобрений, с одной стороны, включал использование одной части основного удобрения серийного производства (500 кг/га-1), в состав которого вошло: 7% общего азота (5% аммиачного азота, 2% карбамидного азота); 10% фосфора (4% растворимого в воде); 6% калия; 25% серы и 2% магния, а, с другой стороны, в течение всего эксперимента два раза в неделю использовался раствор для удобрительного орошения с рН 7, 90 и электропроводимостью 2106 мкСм/см-1, общее содержание растворимых твердых веществ в котором составляло 0,93 г/л-1, KNO3 (15000 г), Са (NO3)2 (1000 г), Н3РО4 (508 г), HNO3 (452 г). В случае обработки удобрением в 50% дозе, для нее использовалась половина основного удобрения (250 кг/га-1) и половина питательных веществ раствора для удобрительного орошения. Растения поливались с той же частотой, что и при использовании 100% дозы. Растения поливались одинаково при всех обработках (3 раза в неделю).
В эксперименте использовалось 8 обработок, 10 горшков на обработку и 3 растения на горшок. В процессе эксперимента изучался штамм микоризообразующих грибов и необработанное контрольное растение в сравнении с двумя дозами удобрения - 100% и 50%.
Были изучены следующие виды обработок:
T1. Glomus mosseae (Внесение 100% дозы удобрения).
Т2. Glomus intraradices (Внесение 100% дозы удобрения).
Т3. Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. (Внесение 100% дозы удобрения).
T4. Контрольные растения (Внесение 100% дозы удобрения).
Т5. Glomus mosseae (Внесение 50% дозы удобрения).
Т6. Glomus intraradices (Внесение 50% дозы удобрения).
Т7. Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. (Внесение 50% дозы удобрения).
T8. Контрольные растения (Внесение 50% дозы удобрения).
Оценивалось количество грибка Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., имеющегося при обработках, в котором производилась инокуляция грибка. От 1 до 5 граммов мицелия и спор этого вида было получено в 1 кг почвы, что находится в диапазоне от 0,1 до 0,5%. С другой стороны, корневая система, в которой был получен мицелий и споры, достигла 10% от общего веса (100 г). Масса мелких корешков, связанных с микоризообразующими грибами, составила 40 г на 1 кг почвы, то есть 4% от общего веса. Из этих мелких корешков только 75% имеют микоризные ростки, следовательно, процент микоризы в одном килограмме почвы составил 3%.
Развитие микоризы изучалось путем анализа корней 5 растений на обработку после 75 дней обработки. Эти корни промыли водой, и для их обнаружения использовался метод, основанный на девитальном окрашивании трипановым синим. Этот метод позволил сравнить количество живой грибковой биомассы в микоризной системе. Во всех случаях образцы, представляющие собой живую грибковую биомассу, изучались под микроскопом Olympus (СХ21).
Внематричный мицелий измеряли путем оценки количества в мг, присутствующего в данной области, с поправочным коэффициентом. Также был обнаружен легко извлекаемый гломалин.
Вес листьев в сыром виде (LFW), вес листьев в сухом виде (LDW), вес корней в сыром виде (RFW) и вес корней в сухом виде (RDW) оценивались в течение 90 дней после начала обработки. Для этого исследования взяли 5 растений на обработку, разделили их на различные органы и взвесили на весах модели Sartorius. Для получения веса в сухом виде образцы поместили в сушильный шкаф при 80°С до получения постоянного веса.
Были измерены параметры газообмена (наблюдаемый фотосинтез, Аn и устьичная проводимость, Gs) 10 растений на каждую обработку с помощью портативной системы анализа процессов фотосинтеза Licor LI-6400 (LI-COR Inc., Линкольн, штат Небраска, США, модель Li-6400). Все измерения проводились в солнечный полдень и дважды в течение периода анализа (40 и 75 день). Коэффициент водопользования (КВП) определялся отношением An/Gs.
Измерение содержания хлорофилла в SPAD единицах проводили на 10 растениях дважды (40 и 75 день) на время анализа. Его определяли с помощью портативного прибора (Измеритель содержания хлорофилла SPAD-502, Konica Minolta). Устройство проводит мгновенные и неразрушающие измерения, называемые относительным хлорофилльным индексом (ОХИ, SPAD единицы), который определяет коэффициент поглощения максимального диапазона длин волн при 650 нм (красный), излучаемых листьями, который представляет собой область высокого поглощения благодаря молекулам хлорофилла.
Данные содержания ионов в листьях были получены методом оптической эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (спектрометр Iris Intrepid II XDL, OribaSci.) в Службе иономики Центра прикладного почвоведения и биологии Сегуры Национального научно-исследовательского университета Испании, Мурсия, в течение 75 дней после начала обработки.
Было измерено содержание следующих ионов:
- Макроэлементы: азот (N), фосфор (Р), калий (K) и кальций (Са)
- Микроэлементы: марганец (Mn), железо (Fe) и цинк (Zn).
Содержание ионов определялось на сухом материале, измельченном до момента достижения размера частиц, при котором они способны проходить через сито с диаметром отверстий 0,5 мм, который хранился в пластмассовых контейнерах до следующего химического анализа.
В Таблице 3 приведены результаты, полученные при оценке микоризной активности трех штаммов при исследовании с использованием двух доз удобрений. Быстрый анализ результатов показывает, что при любой используемой дозе удобрения микоризообразующие грибы имеют более выраженную экспрессию относительно микоризной колонизации, мицелия и образования гломалина по сравнению с контрольными растениями, которые, произрастая в естественном плодородном слое земли, имеют микоризообразующие грибы, но с более низкими значениями при наличии используемых доз удобрений.
При анализе отдельных параметров мы можем увидеть, что, касательно внутренней микоризной колонизации, самые высокие значения имеют штаммы микоризообразующих грибов, среди которых значительно выделяется штамм Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., полученный из натриевой засоленной почвы, достигая максимальных значений в растениях, обработанных удобрением в 100% дозе (78%), хотя этот показатель несущественно отличается от обработки удобрением в 50% дозе (70%). Тем не менее, такая активность не наблюдалась у двух остальных штаммов.
Как Glomus mosseae, так и Glomus intraradices достигли наибольших значений, свидетельствующих об их внутреннем присутствии, при меньших дозах удобрения (43 и 53,7%, соответственно), но при больших дозах удобрения эти значения снизились до 21,24 и 24,0%, соответственно, и были близки к значениям, которые достигли контрольные растения при этих условиях (Таблица 3).
Таблица 3. Внематричный мицелий (мг/кг-1), микоризная колонизация (%) и концентрация легко извлекаемого гломалина (мг/г-1 почвы) в салате-латуке, инокулированном Glomus mosseae (G.m), Glomus intraradices (G.i) и Glomus iranicum var tenuihypharum var. nov. (G. iranicum), и в необработанных растениях (С) на 75 день после посадки с внесением удобрения в дозе 100% и 50%.
*** Обозначает уровень значимости 0, 001. Разные буквы в одном столбце соответствуют значимо различным значениям. Согласно критерию множественного сравнения Дункана (Р<0,05).
Неожиданно были отмечены значительные различия значений, касающихся внематричного мицелия различных видов грибов, при двух исследуемых условиях внесения удобрения. В этом случае также наблюдались наибольшие значения микомассы эктофитов у вида, выделенного из натриевой засоленной почвы (Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov.), которые достигали 850 мг/кг почвы при наибольшей дозе удобрения. В данном случае это значение значительно отличается от случая использования наименьшей дозы удобрения и составляет 765,9 мг/кг почвы. Тем не менее, в сравнении с другими обработками, различия были очень значительными. В данном случае остальные штаммы имели большую бактериальную массу, чем необработанные контрольные растения в какой-либо из ситуаций, наилучшим значимо различным сочетанием стало сочетание, при котором растения обрабатывались химическими удобрениями в дозе 50%. При более высоких дозах штаммы развивались менее интенсивно, и даже Glomus mosseae произвел малое количество мицелия в сравнении с местными штаммами, у которых наблюдалось малое количество произведенного мицелия.
Этот эффект также наблюдался при выработке гломалина, легко извлекаемого из почвы. В данном случае и как следствие микоризной активности эктофитов, наибольшие уровни гломалина, являющегося нерастворимым гликопротеином, выделяемым внематричным мицелием микоризообразующих грибов, были достигнуты при обработках с образованием большего количества мицелия, содержащего практически точные характеристики активности мицелия. В этом случае также наблюдались наибольшие значения при наличии штамма Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov.; в данном случае нет значительных различий между используемыми дозами удобрения 467,1 (100%) и 422,3 (50%) мг/г почвы, и именно этот вид выделил больше белка в среду, после которого идут два других вида, которые снова показали свой наибольший потенциал при меньших дозах удобрения (50%): 345 мг/г почвы для Glomus intraradices и 209 мг/г почвы для Glomus mosseae.
Этот эффект, обнаруженный при микоризной активности, сохранялся в процессе изменения концентраций хлорофилла и измерения газообмена, производимого в процессе выращивания сельскохозяйственных культур.
В Таблице 4 и 5 показаны результаты изменения измерений SPAD, наблюдаемого фотосинтеза (An), устьичной проводимости (Gs) и коэффициента водопользования (W/Gs) на 40 и 75 день у обработанных растений, инокулированных микоризообразующими грибами, и необработанных растений при внесении химических удобрений в 50% и 100% дозах.
Таблица 4. SPAD, наблюдаемый фотосинтез (An) (мкмоль СО2 м-2 с-1), устьичная проводимость (Gs) (ммоль Н2О м-2 с-1) и коэффициент водопользования (КВП, мкмоль СО2 ммоль-1 Н2О) в инокулированных и контрольных саженцах салата-латука при внесении удобрений в 100% и 50% дозах (40 дней).
*** Обозначает уровень значимости 0,001. Разные буквы в одном столбце соответствуют значимо различным значениям. Согласно критерию множественного сравнения Дункана (Р<0,05).
Так же, как и в случае микоризной активности, получены более высокие значения SPAD по сравнению с контрольными растениями в вариантах, обработанных различными видами микоризных грибов через 40 дней после посадки салата. Значение SPAD для вида Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. составило 31. Это способствовало получению более высоких значений SPAD при самой высокой дозе удобрения для обработанных растений, что означает самую высокую продуктивность, после которого идет Glomus mosseae, значение SPAD которого составляет 25; тем не менее, в случае растений, обработанных Glomus intraradices, наблюдалась противоположная активность, при которой были получены более высокие значения SPAD при 50% дозе. Тем не менее, это значение означает косвенную концентрацию хлорофилла, а также может быть показателем лучшего усвоения азота, но поскольку это косвенное измерение, оно не является переменной, обозначающей конкретный тип функционирования, а является показателем концентрации света, излучаемого листом, что в свою очередь связано с пластидами, имеющимися в фотосинтезирующих клетках. Таким образом, его анализ должен быть всегда взаимосвязан с газообменом.
В остальных измеренных параметрах газообмена значения фотосинтеза всегда были выше в случае штаммов микоризообразующих грибов и растений, обработанных Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., в которых были достигнуты самые высокие показатели поглощения СО2 10,33 (100%) и 10,66 (50%) в любом из вариантов и, в свою очередь, самые низкие показатели устьичной проводимости 117 (100%) и 119 (50%), что в конечном итоге отображает самые высокие значения коэффициента водопользования 88,29 в случае внесения удобрений в 100% дозе и 89,27 при 50% дозе.
Эти значения увеличились через 75 дней после посадки (Таблица 5). В этот период не только они снова были самыми высокими, но и растения имели более высокую фотосинтетическую активность в абсолютном выражении за счет низкой устьичной проводимости, достигнутой путем правильного физиологического функционирования и более эффективного водопользования порядка 106,3 в случае внесения удобрений в 100% дозе и 95,77 при 50% дозе.
Таблица 5. SPAD, наблюдаемый фотосинтез (An) (мкмоль СО2 м-2 с-1), устьичная проводимость (Gs) (ммоль Н2О м-1 с-1) и коэффициент водопользования (КВП, мкмоль СО2 ммоль-1 Н2О) в инокулированных и контрольных саженцах салата-латука при внесении удобрений в дозах 100% и 50% (75 дней)
*** Обозначает уровень значимости 0,001. Разные буквы в одном столбце соответствуют значимо различным значениям. Согласно критерию множественного сравнения Дункана (Р<0,05).
Другие штаммы имели более низкие показатели, чем Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. при обоих условиях внесения удобрения, и хотя они имели более высокую фотосинтетическую активность на 75 день, в отношении предыдущих изменений у них наблюдалась повышенная устьичная проводимость, за счет чего коэффициент водопользования был снижен в сравнении не только со штаммом Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., но и с их собственной активностью в течение 40 дней, что может быть связано со снижением микоризной активности, как было отмечено ранее, и со снижением микоризной колонизации при более высоких дозах удобрения.
Хотя контрольные растения, в общем, имели более низкий коэффициент водопользования на 40 день, данный эффект отличался в конце цикла. В случае обработки растений удобрением в 50% дозе, контрольные растения имели более низкие показатели в сравнении с растениями, обработанными микоризообразующими грибами, но при обработке растений удобрением в 100% дозе только растения, обработанные Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. имели более высокий коэффициент водопользования. Коэффициент водопользования контрольных растений достиг своего максимума (67, 76) и незначительно отличался от коэффициента водопользования растений, обработанных двумя остальными видами древовидных микоризных грибов (ДМГ) (67,07 и 65,09), даже в случае обработки Glomus intraradices. Данное значение ниже значения, отмеченного у контрольных растений, хотя оно является незначительным, свидетельствуя о фотосинтетическом несоответствии, которое возможно возникло по причине симбиотических отношений, неподходящих для данного этапа развития сельскохозяйственной культуры.
Очевидно, что данный анализ физиологической активности оцениваемых растений тесно связан с производительностью и уровнями питания, достигнутыми растениях, обработанных ДМГ. В Таблице 6 и 7 показаны значения веса листьев и корней в сыром виде и значения веса листьев и корней в сухом виде, полученные при различных обработках в период сбора урожая, а также питательные элементы после 75 дней выращивания.
Анализ лиственной и корневой биомассы показывает положительный эффект от применения ДМГ. Как в условиях внесения удобрения в максимальной дозе, так и при стандартных условиях внесения удобрения штаммы микоризообразующих грибов образовывали большую биомассу по сравнению с их необработанными аналогами, но другим способом.
В случае штамма Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. помимо надлежащего микоризного функционирования и физиологического потенциала, которые он обеспечил обработанным растениям, у него наблюдались самые высокие значения биомассы при обоих условиях; тем не менее, он достиг самых высоких значений при внесении максимальной дозы удобрения (Таблица 5).
Таблица 6. Вес листьев в сыром виде (г), вес листьев в сухом виде (г), вес корней в сыром виде (г) и вес корней в сухом виде (г) саженцев салата-латука, инокулированных Glomus mosseae (G.m), Glomus intraradices (G.i) и Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. (G. iranicum), и необработанных (С) саженцев через 90 дней после посадки при внесении удобрения в 100% и 50% дозах.
*** Обозначает уровень значимости 0,001. Разные буквы в одном столбце соответствуют значимо различным значениям. Согласно критерию множественного сравнения Дункана (Р<0,05).
Тем не менее, оставшиеся штаммы достигли наибольшего потенциала развития при обработке удобрением в 50% дозе, со снижением своей продуктивности при увеличении дозы удобрения в почвенном растворе. В случае необработанных контрольных растений наивысшие значения биомассы достигались при наличии наивысших доз удобрений.
Анализ концентрации питательных веществ в листьях через 75 дней после посадки подтвердил результаты, полученные при изучении других переменных (Таблица 6). В данном случае у обработанных растений были найдены значительные различия по большинству элементов, за исключением содержания K и Zn в листьях. В данном случае также наблюдаются наибольшие значения у обработанных растений, достигших наибольшего развития биомассы и физиологической активности, при этом на первый план выходят растения, обработанные видом Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., при наличии наибольших доз удобрений.
Важно отметить значения найденных микроэлементов - Fe (компонент хлорофилла) и Mn (Кофактор фермента процесса фотосинтеза и роста в целом), которые тесно связаны с фотосинтетической активностью растений. Их высокая концентрация в растениях, обработанных Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., значительно отличающаяся от концентрации остальных растений, обработанных или необработанных ДМГ, означает не только сильную реакцию на поглощение этого элемента, но и потребность в симбиозе для повышения их концентраций в ответ на высокую фотосинтетическую активность в общем.
Таблица 7. Концентрации некоторых питательных элементов (мкг/г) в саженцах салата-латука, инокулированных Glomus mosseae (G.m), Glomus intraradices (G.i) и Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. (G. iranicum), и необработанных саженцах (С) через 75 дней после посадки при внесении удобрения в 100% и 50% дозах
**, *** и незн. обозначают уровень значимости 0,05, 0,001, незначительную концентрацию, соответственно. Разные буквы в одном столбце соответствуют значимо различным значениям. Согласно критерию множественного сравнения Дункана (Р<0,05).
В отношении остальных элементов наблюдалась тенденция, присущая остальным анализируемым переменным. Наибольшие уровни питательных веществ наблюдаются у растений, обработанных удобрением в дозе 50% и штаммами Glomus intraradices и Glomus mosseae, но при увеличении дозы удобрения эти значения совпали даже со значениями, характерными для контрольных растений, что свидетельствует о низкой эффективности поглощения этих элементов при высоких дозах солей в питательном растворе.
У вида ДМГ Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov., предварительного извлеченного из натриевой засоленной экосистемы с рН 8,4 и высокой концентрацией Са и Mg, наблюдалась высокая эффективность при высокой концентрации солей в питательном растворе, которая отличалась не только от контрольных растений, у которых можно было бы ожидать худшей реакции, но и от остальных видов микоризообразующих грибов, у которых наблюдалась худшая реакция и сниженная эффективность при несении 100% дозы удобрения, и некоторые переменные были ниже, чем у контрольных растений.
1. Штамм Glomus iranicum вида Tenuihypharum var. nov., депонированный под депонентным номером 54871 в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов, отличающийся тем, что он включает последовательность, обозначаемую идентификатором SEQ ID №: 1, который может быть использован в качестве биостимулянта, способствующего повышению урожайности.
2. Композиция, отличающаяся тем, что она включает споры и внематричный мицелий Glomus iranicum вида Tenuihypharum var. nov., депонированного под депонентным номером 54871 в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов, включающего последовательность, обозначаемую идентификатором SEQ ID №: 1, и смектитные глины 2:1, отличающаяся тем, что концентрация указанных спор и внематричного мицелия указанного Glomus iranicum вида Tenuihypharum var. nov. 0.05 составляет от 0.05 до 4% по весу, при этом указанная композиция может быть использована в качестве биостимулянта, способствующего повышению урожайности.
3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что указанные смектитные глины 2:1 являются диоктаэдрическими или триоктаэдрическими.
4. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что указанные смектитные глины 2:1 выбраны из группы, состоящей из сепиолита, аттапульгита, нонтронита и сапонита.
5. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что указанная концентрация составляет от 0,1 до 3% по весу.
6. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что указанная композиция представлена в форме порошка, эмульгируемого концентрата или гранул.
7. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что указанная композиция представляет собой жидкость, твердое вещество или гель.
8. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере, один фунгицид, по меньшей мере, один биофунгицид, по меньшей мере, один инсектицид, по меньшей мере, один биоинсектицид, по меньшей мере, один нематоцид и/или, по меньшей мере, один бионематоцид.
9. Композиция по п. 8, отличающаяся тем, что указанный фунгицид выбран из группы, включающей манеб, манкозеб, металаксил-ридомил, миклобутанил, олпизан, пропамокарб, квинтозин, стрептомицин, серу, тиофанатметил, тирам, трифорин, винклозолин, окись цинка, цинеб, цирам, банрот, связанную медь, хлорталонил, каптан, хлорнеб, ципроконазол, этилен цинка, бисдитиокарбамат, этридиазол, фенаминосульф, фенаримол, флутоланил, фолпет, фосетил алюминия и ипродион.
10. Композиция по п. 8, отличающаяся тем, что указанный биофунгицид выбран из группы, включающей Trichodermas sp, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Streptomyces sp, Coniothyrium minitans и Pythium oligandrum.
11. Композиция по п. 8, отличающаяся тем, что указанный инсектицид выбран из группы, включающей органофосфат, карбамат и неоникотиноид.
12. Композиция по п. 8, отличающаяся тем, что указанный биоинсектицид выбран из группы, включающей Bacillus sp. Chromobacterium sp., Beauveria sp. и Metarhizium sp.
13. Композиция по п. 8, отличающаяся тем, что указанный нематоцид представляет собой органофосфат или карбамат.
14. Композиция по п. 8, отличающаяся тем, что указанный бионематоцид представляет собой Pasteuria sp.
15. Применение композиции по любому из пп. 2-14 в качестве бионематоцида.
16. Применение по п. 15, отличающееся тем, что указанную композицию применяют к растению путем обработки семян, корней, погружения корней в эмульсию, добавления в воду для полива, полива, применения порошка в корневой системе или впрыскивания эмульсии в корневую систему.
