Способ ферментативной обработки тканевых продуктов

Группа изобретений относится к медицине, конкретно к способу обработки тканевой матрицы, такой как свиная кожная ткань. Способ включает выбор ткани; приведение ткани в контакт с первым водным раствором алкалазы, имеющей активность, обеспечивающую требуемое увеличение эластичности, измеренной с помощью испытания ткани на драпируемость, без значительного разрушения коллагена; и приведение обработанной алкалазой ткани в контакт со вторым раствором для удаления по меньшей мере некоторых клеток и клеточных компонентов из указанной ткани. Описана бесклеточная свиная кожная ткань, пригодная для имплантации. Повышение эластичности ткани и ее способности к драпировке без возникновения неприемлемых изменений в структуре коллагена или ухудшения других механических свойств ткани обеспечивает стабильность указанной ткани после ее имплантации пациенту. 3 н. и 26 з.п. ф-лы, 15 ил., 3 пр.

 

[0001] Данная заявка согласно Кодексу Соединенных Штатов, раздел 35, статья 120, является частичным продолжением патентной заявки США №14/019274, поданной 5 сентября 2013 г., и которая включена в данный документ во всей своей полноте.

[0002] Настоящее раскрытие относится к тканевым матрицам, и более конкретно - способам регулирования механических и/или биологических свойств тканевых матриц путем обработки матриц протеолитическими ферментами.

[0003] Различные полученные из тканей продукты используют для регенерации, восстановления или другого лечения пораженных заболеванием или поврежденных тканей и органов. Такие продукты могут включать целые трансплантаты тканей и/или бесклеточные или восстановленные бесклеточные ткани (например, бесклеточные тканевые матрицы из кожной, кишечной или других тканей, с посевом клеточной культуры или без него). Обычно механические свойства у таких продуктов определяются происхождением ткани (т.е. типом ткани и от какого животного получена ткань) и условиями обработки, используемой для получения тканевых продуктов. Поскольку тканевые продукты часто используются в хирургических применениях и/или при замене тканей или их наращивании, механические свойства тканевых продуктов имеют важное значение. Например, хирурги обычно предпочитают ткани, которые дают ощущение натуральных тканей и/или с которыми легко обращаться во время хирургических операций. Некоторые тканевые продукты, однако, обладают нежелательной жесткостью и/или ненатуральны на ощупь. Соответственно, предложены способы обработки тканевых продуктов, позволяющие получать наиболее желаемые механические свойства.

[0004] Кроме того, при имплантации в организм, тканевые продукты, полученные из экзогенных материалов (например, тканей других животных или пациентов, а также обработанные ткани любого типа), могут вызывать воспалительную или иммунную реакцию у реципиента. В некоторых случаях, чрезмерная иммунная реакция может быть вредной и вызывать образование нежелательной рубцовой ткани из-за имплантата, или мешать приемлемой регенерации ткани в месте пересадки. Соответственно, предложены способы обработки тканевых продуктов, позволяющие снижать или регулировать иммунную реакцию на тканевые продукты при имплантации.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] Согласно некоторым вариантам осуществления предложен способ обработки тканевой матрицы, такой как свиная кожная ткань. Способ может включать выбор содержащей коллаген ткани и приведение ее в контакт с протеолитическим ферментом в условиях, обеспечивающих получение требуемого уровня эластичности тканевой матрицы.

[0006] Протеолитический фермент представляет собой первый водный раствор алкалазы, имеющий активность, выбранную так, чтобы обеспечить требуемое увеличение эластичности, измеренной с помощью испытания ткани на драпируемость. Способ также может включать приведение обработанной алкалазой ткани в контакт со вторым раствором для удаления по меньшей мере некоторых клеток и клеточных компонентов из указанной ткани.

[0007] В некоторых вариантах осуществления предложена бесклеточная тканевая матрица. Матрицу можно получить способом, аналогичным вышеописанному и дополнительно включающим удаление всех клеток и клеточных компонентов из ткани.

[0008] Согласно некоторым вариантам осуществления предложен способ обработки тканевой матрицы, такой как свиная кожная ткань. Способ может включать выбор кожной ткани; приведение ее в контакт с первым водным раствором алкалазы; приведение обработанной алкалазой кожной ткани в контакт со вторым раствором для удаления по меньшей мере некоторых клеток и клеточных компонентов из указанной ткани; и облучение ткани, причем действие алкалазы осуществляют в условиях, выбранных так, чтобы обеспечить требуемую эластичность тканевой матрицы после облучения.

[0009] Таким образом, согласно данному изобретению обеспечивают приведение ткани в контакт с первым водным раствором алкалазы и приведение обработанной алкалазой кожной ткани в контакт со вторым раствором для удаления по меньшей мере некоторых клеток и клеточных компонентов из указанной ткани.

[0010] Обеспечиваемый при этом технический результат заключается в получении ткани, пригодной для имплантации, с одновременным повышением эластичности ткани и ее способности к драпировке без возникновения неприемлемых изменений в структуре коллагена или ухудшения других механических свойств ткани, что обеспечивает стабильность указанной ткани после ее имплантации пациенту.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0011] На фигурах 1A-1D показаны бесклеточные тканевые матрицы после обработки ферментами, используя способы, описанные в Примере 1, а также необработанные контрольные образцы.

[0012] На фигуре 2 показана ящичковая диаграмма данных испытания предела прочности при растяжении обработанных согласно способам в Примере 1 и контрольных образцов.

[0013] На фигуре 3 показана ящичковая диаграмма данных испытания прочности шва обработанных согласно способам в Примере 1 и контрольных образцов.

[0014] На фигуре 4 показана ящичковая диаграмма данных испытания прочности на разрыв обработанных согласно способам в Примере 1 и контрольных образцов.

[0015] На фигуре 5 показана ящичковая диаграмма данных испытания упругости обработанных согласно способам в Примере 1 и контрольных образцов.

[0016] На фигуре 6 показана ящичковая диаграмма данных испытания сопротивления ползучести обработанных согласно способам в Примере 1 и контрольных образцов.

[0017] На фигуре 7 показаны термограммы ДСК необработанных тканей и тканей, обработанных бромелаином и алкалазой согласно Примеру 2.2.

[0018] На фигурах 8А-8В показаны картины экспрессии маркеров активации CD14 (А) и CD163 (В) в моноцитах, культивированных совместно с различными тканями, используя анализ активации моноцитов, описанный в Примере 2.4.

[0019] На фигурах 9A-F представлены окрашенные гематоксилином и эозином (Н&Е) срезы необработанного pADM (9А-9С) и обработанного ферментом pADM (9D-9F) после извлечения имплантата, как описано в Примере 2.5.

[0020] На фигурах 10A-D представлены окрашенные Н&Е срезы необработанного pADM (9А-9В) и обработанного ферментом pADM (9C-9D) извлеченных имплантатов, как описано в Примере 2.5.

[0021] На Фигуре 11 представлена гистограмма, показывающая результаты испытания на драпируемость тканевых матриц после обработки алкалазой, с использованием способов, описанных в Примере 3, а также необработанных контрольных образцов.

[0022] На Фигуре 12 представлен линейный график, показывающий результаты анализа расщепления коллагеназой тканевых матриц после обработки алкалазой с использованием способов, описанных в Примере 3, а также необработанных контрольных образцов.

[0023] На фигуре 13 показаны результаты ДСК, включая температуру начала разложения необработанных тканей и тканей, обработанных алкалазой в соответствии с Примером 3.

[0024] На Фигуре 14 представлен график доверительных интервалов максимальной нагрузки/ширину образца тканевых матриц после обработки алкалазой с использованием способов, описанных в Примере 3, а также необработанных контрольных образцов.

[0025] На Фигуре 15 представлен график доверительных интервалов упругости тканевых матриц после обработки алкалазой с использованием способов, описанных в Примере 3, а также необработанных контрольных образцов.

ОПИСАНИЕ НЕКОТОРЫХ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0026] Теперь подробно будут описаны некоторые иллюстративные варианты осуществления согласно настоящему раскрытию, некоторые примеры из которых проиллюстрированы в прилагаемых графических материалах. Где возможно во всех графических материалах использованы одни и те же ссылочные позиции для обозначения одних и тех же или подобных элементов.

[0027] В этой заявке использование единственного числа включает в себя множественное число, если специально не оговаривается иначе. В этой заявке использование "или" означает "и/или", если не указано иное. Кроме того, использование выражения "включая", а также других форм, таких как "включает" и "включено", не является ограничительным. Следует понимать, что любой интервал значений, описываемый в данном документе, включает граничные значения и все значения между граничными значениями.

[0028] Рубрикация разделов в данном документе используется исключительно с целью структурирования и не должна рассматриваться как ограничивающая описываемый объект изобретения. Все документы или части документов, цитируемые в данной заявке, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, статьи, книги и научные труды, таким образом однозначно включены путем ссылки во всей своей полноте и для любой цели.

[0029] В данном контексте "тканевый продукт" относится к любой ткани человека или животного, которая содержит белки внеклеточного матрикса. "Тканевые продукты" могут включать бесклеточные или подвергнутые частичной децеллюляризации тканевые матрицы, подвергнутые децеллюляризации тканевые матрицы, вторично заселенные экзогенными клетками, и/или клеточные ткани.

[0030] В данном контексте "тканевая матрица" относится к внеклеточному матриксу, включая коллаген конкретной ткани, где матрица сохраняет взаимосвязанные структурные характеристики коллагеновой матрицы нативного внеклеточного матрикса ткани, из которой он получен. "Бесклеточная тканевая матрица" относится к "тканевой матрице", из которой были удалены клетки нативной ткани.

[0031] При получении продуктов для лечения пациентов можно использовать различные ткани человека и животных. Например, были получены различные тканевые продукты для регенерации, восстановления, наращивания, упрочнения и/или лечения тканей человека, которые были повреждены или утрачены вследствие различных заболеваний и/или структурного повреждения (например, вследствие травмы, хирургической операции, атрофии и/или долговременного износа или дегенерации). Такие продукты могут включать, например, бесклеточные тканевые матрицы, аллотрансплантаты и ксенотрансплантаты тканей и/или реконструированные ткани (т.е. ткани, подвергнутые по меньшей мере частичной децеллюляризации, засеянные клетками для получения различных материалов).

[0032] В случае хирургических применений часто необходимо получать тканевые продукты, обладающие определенными механическими свойствами. Например, тканевый продукт, возможно включающий листовой материал, должен обладать достаточной прочностью для того, чтобы соответствовать требованиям, выдвигаемым предполагаемым использованием. Некоторые тканевые продукты можно применять для исправления дефектов (например, грыж), удерживания окружающих тканей или имплантатов (например, для увеличения и/или восстановления молочной железы), или для замены поврежденных или утраченных тканей (например, после травмы или хирургической резекции). Вне зависимости от конкретного использования тканевые продукты должны иметь достаточную прочность, эластичность и/или другие механические свойства, чтобы обеспечить их функционирование до завершения регенерации и/или восстановления ткани.

[0033] Помимо этого, тканевые продукты должны давать требуемое тактильное ощущение. Например, хирурги обычно предпочитают ткани, которые дают тактильное ощущение натуральных тканей (например, они достаточно мягки, эластичны и/или упруги). Далее, после имплантации желательно, чтобы тканевые продукты были натуральны на ощупь. Например, ткани, используемые для увеличения молочной железы не должны быть чрезмерно жесткими, чтобы при имплантации они давали молочную железу, натуральную на ощупь.

[0034] Некоторые тканевые продукты, однако, могут быть чрезмерно жесткими для некоторых применений. Например, некоторые хирурги отмечают, что полученные от свиней кожные материалы, такие как STRATTICE™, менее эластичны, чем человеческие кожные продукты, такие как ALLODERM®. Однако процессы усовершенствования тактильных качеств таких продуктов не должны отрицательно влиять на биологические и/или механические свойства продуктов. В частности, обработка продуктов с целью улучшения тактильных качеств продуктов не должна приводить к нежелательному ухудшению других механических свойств, таких как прочность на разрыв, и не должна изменять белковую матрицу так, что материал перестанет предоставлять поддержку при регенерации и/или восстановлении тканей.

[0035] В настоящем раскрытии предложены способы обработки тканей с целью регулирования тактильных качеств тканевых продуктов, полученных из тканей. В данном раскрытии также предложены тканевые продукты, полученные с использованием способов обработки. Кроме того, в настоящем раскрытии предложены способы обработки тканей, позволяющие регулировать пористость тканевых продуктов, полученных из тканей. В некоторых случаях, регулирование пористости может позволить улучшить клеточное проникновение и регенерацию и/или восстановление ткани.

[0036] Дополнительно настоящее раскрытие предлагает способы регулирования или снижения иммунной реакции на тканевые матрицы при имплантации в организм. Иммунную реакцию можно количественно оценивать, используя несколько количественных иммунологических анализов, включая количественные анализы активации моноцитов, количественные анализы фагоцитоза и/или количественные анализы окислительных взрывов. Иммуногенность можно также регулировать в ходе обработки ткани с целью улучшения тактильных качеств ткани, регулирования механических свойств ткани (включая любые механические свойства, перечисленные в данном документе), и/или регулирования пористости ткани. После обработки тканевых матриц можно проводить их анализ с целью определения того, произошло или нет требуемое изменение иммунногенности ткани.

[0037] Согласно некоторым вариантам осуществления предложен способ обработки тканевой матрицы. Способ может включать выбор кожной тканевой матрицы; и приведение в контакт кожной тканевой матрицы с алкалазой в условиях, включающих время инкубирования в растворе, имеющем активность алкалазы, выбранную так, чтобы обеспечить требуемое увеличение эластичности тканевой матрицы, измеренной с помощью испытания на драпируемость, при этом не вызывающих значительного разрушения коллагена.

[0038] В некоторых вариантах осуществления условия обработки ферментами выбирают таким образом, чтобы обеспечить требуемое снижение величины драпируемости. В данном контексте "испытание на драпируемость" заключается в размещении (драпировании) круглого образца тканевой матрицы с известной площадью поверх круглой подставки с известным диаметром. Площадь проекции кожной матрицы после драпировки поверх подставки делят на исходную площадь круглого образца тканевой матрицы с целью определения величины драпируемости. Обратите внимание, что площадь подставки вычитают из исходной площади круглого образца и из площади проекции после драпировки до выполнения действия деления этих двух площадей с целью определения драпируемости. Более низкая величина драпируемости соответствует более мягкому (более драпируемому) материалу

[0039] В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой алкалазу, а условия обработки выбирают так, чтобы получить снижение величины драпируемости в размере 10-90%, 20-80%, 30-70%, 40-60% или примерно 50% (например, 45-55%), или не менее 30%, не менее 40%, не менее 50%, не менее 60% или не менее 70% при использовании образца тканевой матрицы диаметром 60 мм и подставки диаметром 19 мм. Далее, в некоторых вариантах осуществления условия выбирают так, чтобы получать величину драпируемости кожной бесклеточной ткани в пределах 0,2-0,4 или в пределах 0,25-0,35, или менее чем 0,4, менее чем 0,35, менее чем 0,3 или менее чем 0,2.

[0040] Различные факторы могут влиять на получаемую в результате величину драпируемости. Например, факторы, которые можно изменять с целью регулирования воздействия на эластичность ткани, могут включать, например, температуру, pH, используемый раствор или буфер, концентрацию фермента, конкретный тип используемой алкалазы, соотношение количества раствора и количества ткани и/или наличие ингибиторов ферментов в растворе.

[0041] Как подробно обсуждается ниже, было найдено, что алкалаза обладает рядом преимуществ при обработке кожных тканевых матриц. Например, было показано, что при относительно коротких временах инкубирования и относительно низкой ферментативной активности, алкалаза обеспечивает значительное увеличение эластичности ткани и улучшение результатов исследования драпируемости тканевой матрицы (т.е. обеспечивает более высокую способность к драпировке), не вызывая неприемлемых изменений в структуре коллагена или ухудшения других свойств ткани, таких как предел прочности при растяжении, упругость, прочность на разрыв, прочность шва, сопротивление ползучести, прочность на продавливание, температура теплового перехода, чувствительность к коллагеназе или их комбинации.

[0042] Как подробно описано в Примере 3, было обнаружено, что обработка алкалазой с последующим облучением (например, в ходе стадии тепловой стерилизации) имеет разное воздействие на механические свойства ткани в зависимости от изменений в условиях обработки ферментом. Например, при относительно низких концентрациях фермента и коротких периодах обработки с последующим облучением получаемые ткани сначала демонстрируют увеличение своей эластичности, которая достигает максимального значения в определенный момент, как показано, например, на Фигуре 11. При дальнейшей обработке алкалазой (например, в течении более длительного периода обработки или при более высокой ферментативной активности), последующее облучение вызывает потерю эластичности. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способы могут включать в себя выбор кожной тканевой матрицы; и приведение в контакт кожной тканевой матрицы с алкалазой; и облучение тканевой матрицы, где действие алкалазы осуществляют в условиях, выбранных так, чтобы обеспечить требуемую эластичность тканевой матрицы после облучения.

[0043] С целью поддержания стабильности имплантированного внеклеточного матрикса in vivo, желательно поддерживать стабильность коллагена неизменной во время обработки. Индикаторами стабильности коллагена являются температура начала разрушения коллагена согласно ДСК и потеря веса в ходе обработки ферментом коллагеназой. В данном контексте выражение "неприемлемое разрушение коллагеновой структуры ткани" означает изменение температуры начала разрушения коллагена согласно ДСК больше чем на 1°C, больше чем на 2°C, больше чем на 3°C или больше чем на 4°C или больше чем на 5°C.

[0044] Можно использовать различные активности алкалазы и продолжительности периода обработки. Например, можно применять раствор алкалазы с активностью, равной от 1×10^-6 единиц Ансона на мл до 0,015 единиц Ансона на мл, с активностью от 1×10^-6 единиц до 1,5×10^-3 единиц Ансона на мл, или с активностью, равной от примерно 2×10^-5 единиц Ансона на мл до примерно 4×10^-5 единиц Ансона на мл. Кроме того, продолжительность периода обработки может изменяться от примерно 4 часов до 5 дней.

[0045] В одном варианте осуществления предложен способ обработки тканевой матрицы. Способ может включать выбор содержащей коллаген тканевой матрицы и приведение тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом в условиях, обеспечивающих получение требуемого уровня эластичности тканевой матрицы. Согласно другому варианту осуществления предложен способ обработки тканевой матрицы. Способ может включать выбор содержащей коллаген бесклеточной тканевой матрицы и приведение тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом в условиях, обеспечивающих получение требуемого уровня эластичности тканевой матрицы и повышение пористости тканевой матрицы. На Фигурах 1A-1D показаны бесклеточные тканевые матрицы (STRATTICE™) после обработки ферментами с использованием способов данного раскрытия, а также необработанные контрольные образцы. Видно, что обработанные образцы являются значительно более эластичными, чем необработанные образцы.

[0046] Согласно некоторым вариантам осуществления предложен способ обработки тканевой матрицы. Способ может включать выбор по меньшей мере одной содержащей коллаген тканевой матрицы; приведение по меньшей мере одной содержащей коллаген тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом; и проведение исследования с целью определения того, привел ли контакт по меньшей мере одной содержащей коллаген тканевой матрицы с по меньшей мере одним протеолитическим ферментом к изменению в по меньшей мере одной содержащей коллаген тканевой матрице в сторону уменьшения иммунной реакции у человека на тканевую матрицу при имплантации тканевой матрицы в организм человека.

[0047] В различных вариантах осуществления обработка тканевых матриц протеолитическими ферментами предоставляет улучшенные механические свойства, не вызывая при этом ухудшения одного или нескольких биологических свойств. Например, благодаря обработке тканевых матриц можно получить требуемые жесткость, ощущение на ощупь, тактильные качества и/или требуемую пористость, не вызывая при этом повышенное воспаление или образование рубцов и/или не вызывая снижения способности тканевых матриц способствовать клеточному прорастанию и регенерации.

[0048] Тканевые матрицы можно выбирать так, чтобы обеспечивать ряд разнообразных биологических и механических свойств. Например, бесклеточную тканевую матрицу или другой тканевый продукт можно выбирать так, чтобы позволять прорастание и трансформирование ткани, что способствует регенерации ткани, которая обычно находится в том месте, куда имплантирована матрица. Например, при имплантации на или в фасцию бесклеточную тканевую матрицу можно выбирать так, чтобы регенерация фасции происходила, не вызывая избыточного роста фиброзной ткани или образования рубцов. В некоторых вариантах осуществления тканевый продукт можно формировать из ALLODERM® или STRATTICE™, которые представляют собой человеческие и свиные бесклеточные кожные матрицы, соответственно. Помимо этого, можно использовать другие подходящие бесклеточные тканевые матрицы, как описано далее. Ткани можно выбирать из ряда источников ткани, включая кожу (дерму или полную кожу), фасцию, перикардиальную ткань, твердую мозговую оболочку, ткань пуповины, плацентарную ткань, ткань сердечного клапана, ткань связки, жировую ткань, ткань сухожилия, артериальную ткань, венозную ткань, нейронную соединительную ткань, ткань мочевого пузыря, ткань мочеточника и ткань кишечника. Описанные в данном документе способы можно применять для обработки любых типов коллагеновой ткани и любых продуктов тканевой матрицы. Например, ряд каркасных биологических материалов описаны в публикации авторов Badylak et al., и способы настоящего раскрытия можно применять для обработки этих или других тканевых продуктов, известных в данной области техники. Badylak et al., "Extracellular Matrix as a Biological Scaffold Material: Structure and Function," Acta Biomaterialia (2008), doi:10.1016/j.actbio.2008.09.013.

[0049] В некоторых случаях тканевый продукт можно получать в виде тканевой матрицы, прошедшей децеллюляризацию. Подходящие бесклеточные тканевые матрицы описаны ниже. В других случаях способ может дополнительно включать обработку исходной ткани с целью удаления клеток или других материалов. Ткани можно подвергать полной или частичной децеллюляризации с целью получения бесклеточных тканевых матриц или внеклеточных тканевых материалов, которые будут использоваться для пациентов. Например, различные ткани, такие как кожная, кишечная, костная, хрящевая, жировая ткань, нервная ткань (например, нервные волокна или твердая мозговая оболочка), сухожилия, связки или другие ткани можно подвергать полной или частичной децеллюляризации с целью получения тканевых продуктов, которые будут использоваться для пациентов. В некоторых случаях эти прошедшие децеллюляризацию продукты можно применять без добавления экзогенных клеточных материалов (например, стволовых клеток). В некоторых случаях эти прошедшие децеллюляризацию продукты можно засевать клетками, полученными от аутологичных источников или других источников, для облегчения обработки. Подходящие способы получения бесклеточных тканевых матриц описаны ниже.

[0050] Для обработки тканевых матриц можно использовать ряд различных ферментов. Например, подходящие ферменты могут включать сульфгидрильные протеазы, такие как бромелаин. Кроме того, они могут включать бромелаин, папаин, фицин, актинидии, алкалазу, трипсин или их комбинации. Ферменты можно приобретать у производителей или экстрагировать из фруктовых источников. Например, одним источником бромелаина является MCCORMICK MEAT TENDERIZER®, но ферменты можно также экстрагировать из ананаса и/или приобрести в виде препарата лечебного класса.

[0051] Ферменты можно приводить в контакт с тканями для повышения эластичности ткани, не вызывая при этом нежелательного ухудшения других механических и/или биологических свойств. Например, при производстве партии материалов с использованием обработок ферментами, обсуждаемых в данном документе, или без них, обработки ферментами не вызовут нежелательного изменения по меньшей мере одного из следующего: предела прочности при растяжении, прочности на разрыв, прочности шва, сопротивления ползучести, эластичности, чувствительности к коллагеназе, прочности на продавливание, температуры теплового перехода или их комбинаций. В некоторых случаях нежелательное изменение представляет собой статистически значимое уменьшение любого одного из предела прочности при растяжении, прочности на разрыв, прочности шва, сопротивления ползучести, содержания гликозаминогликанов, содержания лектинов, прочности на продавливание, повышение чувствительности к коллагеназе или изменение (в сторону увеличения или уменьшения) температуры теплового перехода (измеренной с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии).

[0052] Как отмечено выше, в некоторых вариантах осуществления ткани обрабатывают ферментом с целью повышения пористости ткани. В различных вариантах осуществления повышение пористости ткани выполняют путем повышения числа и/или размера канальцев, которые способны улучшать скорость клеточного проникновения и регенерации тканей.

[0053] В некоторых случаях ферменты выбирают так, чтобы расщепление белков в тканях выполнялось на определенном участке. Например, было найдено, что обработка свиных кожных материалов бромелаином не вызывает дополнительных изменений структуры матрицы после определенной дозы обработки. Поэтому, обработка дермы бромелаином не вызывает дополнительного изменения матрицы при продолжительном воздействии или после длительных периодов времени.

[0054] Кроме того, фермент можно применять к тканям в ряде подходящих для этого растворов. Например, было найдено, что бромелаин эффективен в применении к тканям в нормальном физиологическом растворе, но можно использовать и другие пригодные буферные растворы (например, PBS).

[0055] Как отмечено выше, после обработки ферментом можно выполнить исследование с целью определения того, привел ли контакт по меньшей мере одной содержащей коллаген тканевой матрицы с по меньшей мере одним протеолитическим ферментом к изменению в по меньшей мере одной содержащей коллаген тканевой матрице в сторону уменьшения иммунной реакции у человека на тканевую матрицу при имплантации тканевой матрицы в организм человека. Можно выполнять несколько подходящих для этого случая исследований. Например, подходящие для этого случая исследования могут включать количественные анализы активации моноцитов, количественные анализы фагоцитоза и количественные анализы окислительного взрыва.

[0056] В некоторых вариантах осуществления количественный анализ можно проводить на сегменте или части обработанной ткани, а другие части ткани можно использовать в последующих медицинских или хирургических процедурах. В других вариантах осуществления количественный анализ можно проводить на одном или нескольких образцах из партии нескольких образцов и образцы, не прошедшие анализ, можно впоследствии выбирать для использования в лечении пациента.

[0057] В некоторых вариантах осуществления обработку ферментом выбирают с целью удаления коллагена или других белков из материала, температура теплового перехода которого такова, что его денатурация происходит при температуре тела. Например, в некоторых вариантах осуществления кожные бесклеточнные ткани отобраны, а ферментативную обработку выбирают для того, чтобы устранить тепловой пик, измеренный с помощью ДСК, в интервале от примерно 30 градусов до 40 градусов Цельсия. Вследствие этого небольшого пика ЕСМ будет происходить его спонтанная денатурация при температуре тела человека, что может способствовать различным воспалительным реакциям, возникающим после имплантации.

Бесклеточные тканевые матрицы

[0058] Термин "бесклеточная тканевая матрица" в данном контексте относится в общем к любой тканевой матрице, которая по существу не содержит клеток и/или клеточных компонентов. Кожа, части кожи (например, дерма) и другие ткани, такие как кровеносные сосуды, сердечные клапаны, фасция, хрящ, жировая ткань, кость и нейронная соединительная ткань, можно использовать для создания бесклеточных матриц, охватываемых объемом данного раскрытия. Бесклеточные тканевые матрицы можно разным образом испытывать или оценивать с целью определения по существу наличия или отсутствия в них клеток и/или клеточных компонентов. Например, обработанные ткани можно обследовать, используя оптическую микроскопию, с целью определения наличия остаточных клеток (живых или мертвых) и/или клеточных компонентов. Кроме того, некоторые типы исследований можно использовать для определения наличия клеток или клеточных компонентов. Например, анализы ДНК или других нуклеиновых кислот можно использовать для количественного определения остаточных материалов ядра в тканевых матрицах. В общем случае, отсутствие остаточной ДНК или других нуклеиновых кислот указывает на полную децеллюляризацию (т.е. удаление клеток и/или клеточных компонентов). Наконец, можно использовать и другие количественные анализы, выявляющие специфичные клеткам компоненты (например, поверхностные антигены), для определения того, являются ли тканевые матрицы бесклеточными. Кожа, части кожи (например, дерма) и другие ткани, такие как кровеносные сосуды, сердечные клапаны, фасция, хрящ, кость и нейронная соединительная ткань, можно использовать для создания бесклеточных матриц, охватываемых объемом данного раскрытия.

[0059] В общем, в получении бесклеточной тканевой матрицы используют следующие стадии: изъятие ткани у донора (например, человеческого тела или животного источника) и удаление клеток в условиях, сохраняющих биологическую и структурную функции. В некоторых вариантах осуществления способ включает химическую обработку с целью стабилизировать ткань и избежать биохимического и структурного разрушения одновременно с удалением клеток или до него. В различных вариантах осуществления, стабилизирующий раствор останавливает и предотвращает осмотическое, гипоксическое, аутолитическое и протеолитическое разрушение, защищает от бактериального заражения и снижает механическое разрушение, которое может происходить с тканями, содержащими, например, компоненты гладкой мускулатуры (например, кровеносные сосуды). Стабилизирующий раствор может содержать подходящий буфер, один или несколько антиоксидантов, один или несколько онкотических факторов, один или несколько антибиотиков, один или несколько ингибиторов протеаз и/или один или несколько релаксантов гладкой мускулатуры.

[0060] Ткань затем помещают в раствор для децеллюляризации для удаления жизнеспособных клеток (например, эпителиальных клеток, эндотелиальных клеток, клеток гладкой мускулатуры и фибропластов) из структурной матрицы без повреждения биологической и структурной целостности коллагеновой матрицы. Раствор для децеллюляризации может содержать подходящий буфер, соль, антибиотик, одно или несколько ПАВ, один или несколько агентов, предотвращающих сшивку, один или несколько ингибиторов протеаз и/или один или несколько ферментов. В некоторых вариантах осуществления ткань инкубируют в растворе для децеллюляризации в течение суток при 37°C и осторожном встряхивании со скоростью 90 об/мин. В определенных вариантах осуществления можно использовать дополнительные ПАВ для удаления жира из образца ткани.

[0061] После процесса децеллюляризации образец ткани тщательно промывали. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления, например, при использовании ксеногенного материала, ткань, прошедшую децеллюляризацию, затем обрабатывали раствором деоксирибонуклеазы (ДНазы). Можно использовать любой подходящий буфер при условии, что этот буфер обеспечивает подходящую активность ДНазы.

[0062] В то время как бесклеточную тканевую матрицу можно получить от одной или нескольких особей одного и того же вида, это не обязательно касается получателя трансплантата бесклеточной тканевой матрицы. Так, например, бесклеточную тканевую матрицу можно изготовить из свиной ткани и пересадить пациенту-человеку. Представители биологических видов, которые могут выступать в качестве получателей бесклеточной тканевой матрицы и доноров тканей или органов для изготовления бесклеточной тканевой матрицы, включают, без ограничения, млекопитающих, таких как человек, не относящиеся к человеку приматы (например, обезьяны, бабуины или шимпанзе), свиньи, коровы, лошади, козы, овцы, собаки, кошки, кролики, морские свинки, песчанки, хомяки, крысы или мыши.

[0063] Удаление α-gal эпитопов из содержащего коллаген материала может уменьшить иммунную реакцию на содержащий коллаген материал, α-gal эпитоп экспрессируется у млекопитающих не-приматов и у обезьян Нового Света (обезьяны Южной Америки), а также на макромолекулах, таких как протеогликаны внеклеточных компонентов. U. Galili et al., J. Biol. Chem. 263: 17755 (1988). Однако, этот эпитоп отсутствует у приматов Старого Света (обезьян Азии и Африки и человекообразных обезьян) и человека. Id. Антитела анти-gal продуцируются у человека и приматов в результате иммунной реакции на углеводные структуры α-gal эпитопа на желудочно-кишечных бактериях. U. Galili et al., Infect. Immun. 56: 1730 (1988); R.M. Hamadeh et al., J. Clin. Invest. 89: 1223 (1992).

[0064] Поскольку млекопитающие не-приматы (например, свиньи) продуцируют α-gal эпитопы, ксенотрансплантация содержащего коллаген материала от этих млекопитающих приматам часто приводит к отторжению вследствие связывания антитела анти-Gal приматов с этими эпитопами на содержащем коллаген материале. U. Galili et al., Immunology Today 14: 480 (1993); M. Sandrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11391 (1993); H. Good et al., Transplant. Proc. 24: 559 (1992); В. H. Collins et al., J. Immunol. 154: 5500 (1995). Кроме того, ксенотрансплантация приводит к массивному стимулированию иммунной системы к продуцированию повыщенных количеств антител анти-gal с высокой аффинностью. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, когда в качестве источника тканей используются животные, продуцирующие α-gal эпитопы, достаточное устранение α-gal эпитопов из клеток и из внеклеточных компонентов содержащего коллаген материала и предотвращение повторной экспрессии клеточных α-gal эпитопов может уменьшить иммунную реакцию на содержащий коллаген материал, связанную со связыванием антитела анти-gal с α-gal эпитопами.

[0065] Чтобы удалить α-gal эпитопы, можно проводить одну или несколько ферментативных обработок образца ткани с целью удалить определенные иммуногенные антигены, если они есть в образце. В некоторых вариантах осуществления, образец ткани можно обрабатывать ферментом α-галактозидазой с целью удаления α-gal эпитопов, если они есть в ткани. В некоторых вариантах осуществления, образец ткани обрабатывают α-галактозидазой, имеющей концентрацию 300 Ед/л в 100 мМ фосфатного буфера при pH 6,0. В других вариантах осуществления концентрацию α-галактозидазы повышают до 400 Ед/л для адекватного удаления α-gal эпитопов из изъятой у донора ткани. Можно использовать любые подходящие концентрации фермента и буфер при условии, что они позволяют удовлетворительно удалить антигены.

[0066] Альтернативным образом вместо обработки ткани ферментами в качестве источника ткани можно выбирать генетически модифицированных животных, у которых отсутствуют один или несколько антигенных эпитопов. Например, в качестве источника ткани можно выбирать животных (например, свиней), подвергшихся генетической инженерии, в результате чего у них отсутствует концевая частица α-галактозы. Описание подходящих животных можно найти в одновременно находящейся в рассмотрении патентной заявке США №10/896594 и в патенте США №6166288, раскрытие которых включено в данный документ во всей своей полноте ссылкой. Кроме того, некоторые иллюстративные способы обработки тканей с целью получения бесклеточных матриц со сниженными или без сниженных количеств или вовсе не содержащих частицы альфа-1,3-галактозы описаны в публикации Xu, Hui. et al., "A Porcine-Derived Acellular Dermal Scaffold that Supports Soft Tissue Regeneration: Removal of Terminal Galactose-α-(1,3)-Galactose and Retention of Matrix Structure," Tissue Engineering, Vol.15, 1-13 (2009), которая включена в данный документ во всей своей полноте ссылкой.

[0067] По завершении формирования бесклеточной тканевой матрицы в бесклеточную тканевую матрицу по выбору можно засевать гистологически совместимые жизнеспособные клетки с целью получения имплантата, который в дальнейшем может трансформироваться в организме реципиента. В некоторых вариантах осуществления гистологически совместимые жизнеспособные клетки можно добавлять к матрицам, используя стандартные методики совместного культивирования клеток in vitro перед трансплантацией, или путем вторичного заселения in vivo после трансплантации. Вторичное заселение in vivo может происходить путем миграции собственных клеток реципиента в бесклеточную тканевую матрицу или путем переливания или инъекции клеток, полученных от реципиента, или гистологически совместимых клеток от другого донора в бесклеточную тканевую матрицу in situ. Можно использовать различные типы клеток, включая эмбриональные стволовые клетки, стволовые клетки взрослых (например, мезенхимальные стволовые клетки) и/или нервные клетки. В различных вариантах осуществления клетки можно непосредственно вносить во внутреннюю часть бесклеточной тканевой матрицы сразу перед или после имплантации. В некоторых вариантах осуществления, клетки можно помещать в бесклеточную тканевую матрицу, предназначенную для имплантации, и культивировать перед имплантацией.

Пример 1: Обработка тканевых матриц для повышения эластичности

[0068] Следующий пример иллюстрирует способ обработки материалов, содержащих бесклеточные тканевые матрицы из свиной кожи, бромелаином с целью повышения эластичности материала. Как обсуждается ниже, обработка не вызывала нежелательного изменения различных механических свойств. Кроме того, обработка повышает пористость материала, что может улучшать скорость клеточного проникновения и регенерации тканей.

[0069] Для данного эксперимента использовали STRATTICE™ бесклеточные тканевые матрицы в том виде, в котором их получали от компании LIFECELL CORPORATION (Branchburg, NJ). STRATTICE™ поставляют в эластичной форме или в более жестком варианте. Для данного эксперимента использовали обе формы. Используемые для испытаний образцы разрезали на четыре части и три из них обрабатывали. Необработанные образцы (1 четверть) использовали в качестве контрольных. Контрольные образцы охлаждали во время обработки. STRATTICE™ упакован в растворе и поэтому не нуждается в повторной гидратации. Обработанные образцы помещали в 0,5 литра холодной водопроводной воды, содержащей 55 г MCCORMICK MEAT TENDERIZER.

[0070] На фигурах 1A-1D показаны бесклеточные тканевые матрицы после обработки ферментами, используя способы данного раскрытия, а также необработанные контрольные образцы. На фигурах 2-6 показаны ящичковые диаграммы предела прочности при растяжении, прочности шва, прочности на разрыв, упругости и сопротивления ползучести для каждого обработанного и контрольного образцов. Обработанные образцы были значительно более эластичными по сравнению с контрольными, однако, заметного ухудшения их других механических свойств не было отмечено. Кроме того, не было обнаружено значительного изменения температуры теплового перехода или чувствительности к коллагеназе. В целом парные Т-тесты не показали статистически значимого различия между контрольной и обработанной группами.

Пример 2: Обработка тканевых матриц с целью модулирования иммунной реакции на имплантацию

1. Получение свиной бесклеточной кожной матрицы (pADM)

[0071] Свиную кожу получали со скотобойни, причем эпидермис и подкожный жир удаляли вручную. Оставшуюся кожную ткань подвергали деконтаминации при 37°C в PBS, содержащем антибиотики, в течение 24 часов.

[0072] После деконтаминации, ткани обрабатывали в асептических условиях. Кожную ткань подвергали децеллюляризации в течение 24 часов, используя ПАВ для удаления жизнеспособных клеток, промывали физиологическим раствором и обрабатывали ДНКазой/α-галактозидазой в течение еще 24 часов Разрушенные клетки и остаточные химикаты удаляли промыванием в PBS. Полученную свиную бесклеточную кожную матрицу (pADM) хранили при температуре окружающей среды до использования.

2. Получение обработанной ферментом pADM

[0073] pADM обрабатывали одним или двумя протеазными ферментами (алкалазой или бромелаином) в течение суток при 37°C. Бромелаин с концентрацией, равной 100 единиц/литр применяли для обработки pADM либо до децеллюляризации, либо после стадии обработки ДНКазой/α-галактозидазой. Использовали алкалазу с концентрацией 0,003 единиц Ансона/мл для обработки pADM до стадии децеллюляризации.

3. Дифференциальная сканирующая калориметрия обработанных образцов

[0074] Эффект от обработки ферментом бромелаином внеклеточного матрикса (ЕСМ) свиной ткани количественно оценивали, используя дифференциальный сканирующий калориметрический (ДСК) анализ. Образцы тканей герметично запаивали и сканировали со скоростью 3°C/мин в интервале от 2°C до 120°C. Термограммы ДСК необработанных тканей и тканей, обработанных ферментами (бромелаином и алкалазой) согласно Примеру 2.2 показаны на Фигуре 7. На термограммах видны несколько изменений в ЕСМ тканей после обработки ферментами. Во-первых, в отличие от прошедшего децеллюляризацию, необработанного контрольного образца, обработанный ферментами ЕСМ не имеет небольшого пика (~2%) в интервале от 30°C до 40°C. Ожидается, что вследствие этого небольшого пика ЕСМ будет происходить его спонтанная денатурация при температуре тела человека, что может способствовать различным воспалительным реакциям, вызываемым необработанными и обработанными ферментом pADM. Во-вторых, два основных пика ЕСМ выше 55°C немного понизились в среднем на 0,9°C. В-третьих, суммарная энтальпия денатурации ЕСМ повысилась в среднем на ~7,5% после обработки ферментами.

4. Активация моноцитов in vitro

[0075] Моноциты представляют собой белые кровяные клетки, которые формируют часть врожденной иммунной системы. Они быстро активируются, реагируя на воспалительные агенты, и инициируют воспалительную реакцию. Чтобы спрогнозировать воспалительные реакции человека на обработанные ферментами ткани и необработанные ткани, моноциты выделяли из человеческой периферийной крови и инкубировали с тканями в течение суток. После инкубирования клетки промывали и окрашивали антителами к двум поверхностным меткам, используемым для наблюдения за активацией - CD14 и CD163.

[0076] При активации моноциты снижают экспрессию как CD14, так и CD163 на своих поверхностях. Такую картину экспрессии подтверждали, используя липополисахарид (LPS) - известный активатор моноцитов. На Фигурах 8А-8В показаны картины экспрессии меток активации CD14 (А) и CD163 (В) в моноцитах, совместно культивированных с различными тканями. Уровни экспрессии CD14 и CD163 в моноцитах, не прошедших стимуляцию (отмечено черным), служат в качестве базовой линии отрицательного контроля. Для сравнения, картины экспрессии этих меток в моноцитах, не прошедших стимуляцию, служат в качестве отрицательного контроля. Обработанная ферментом pADM стимулировала значительно более низкий уровень активации, чем необработанная pADM, о чем свидетельствует картина экспрессии обоих меток. В действительности, картина и уровень экспрессии CD14 в моноцитах, подвергнутых действию обработанной ферментом pADM, очень близки к этим показателям для моноцитов, не прошедших стимуляцию. Моноциты, подвергнутые действию обработанной ферментом pADM, демонстрировали немного сниженную экспрессию CD163, но в значительно меньшей степени, чем моноциты, подвергнутые действию либо необработанной pADM, либо LPS.

Результаты указывают на то, что обработанная ферментом pADM вызывает минимальные воспалительные реакции со стороны моноцитов человека. При активации моноцитов экспрессия как CD14, так и CD163, снижается. Такая картина подтверждается на примере клеток, совместно культивируемых с известным активатором моноцитов - липополисахаридом (LPS). Необработанная pADM (показана красным) демонстрирует более низкую экспрессию CD14 и CD163 по сравнению с обработанной ферментом pADM (показана зеленым), что указывает на то, что ферментативная обработка уменьшает активацию моноцитов. Таким образом, обработанная ферментом pADM в меньшей степени вызывает воспалительную реакцию со стороны моноцитов человека.

5. Поведение pADM и обработанных ферментом pADM in vivo

[0077] Для оценки поведения in vivo pADM и обработанных ферментом pADM кусочки pADM и обработанных ферментом pADM размером 1 см × 1 см имплантировали в подкожные ткани иммунокомпетентных крыс. По прошествии двух и четырех недель после имплантации ткани извлекали и исследовали с целью гистологической оценки воспаления, вторичного клеточного заселения и реваскуляризации

[0078] На Фигурах 9A-F представлены окрашенные гематоксилином и эозином (Н&Е) срезы необработанного pADM (9А-9С) и обработанного ферментом pADM (9D-9F) после извлечения имплантата, как описано выше. На Фигурах На фигурах 10A-D представлены окрашенные Н&Е срезы необработанного pADM (9А-9В) и обработанного ферментом pADM (C-D) извлеченных имплантатов, как описано выше. Обработанные ферментом pADM вызывали минимальное воспаление или не вызывали его совсем, в то время как необработанные pADM вызывали воспалительную реакцию от умеренной до сильной, характеризующуюся наличием большого количества иммунных клеток. Кроме того, обработанные ферментом pADM извлеченные имплантаты показали повышенные уровни вторичного клеточного заселения и реваскуляризации по сравнению с необработанными pADM. В необработанных pADM сходные с фибропластами клетки и сосудистые структуры присутствовали в основном на переферийных участках ткани. В отличие от этого, те же самые клетки и сосудистые структуры были обнаружены по всей обработанной ферментами pADM, включая срединные участки ткани.

6. Анализ расщепления коллагеназой

[0079] Различные аликвоты лиофилизированных pADM и обработанных ферментом (с использованием бромелаина, трипсина и алкалазы) pADM взвешивали и расщепляли коллагеназой I типа в течение различных промежутков времени. В каждые определенные моменты времени некоторое количество аликвот расщепленных образцов отделяли от раствора коллагеназы I типа центрифугированием и промывали водой для удаления остаточного раствора коллагеназы I типа Все алиююты снова замораживали и взвешивали. Процентную долю оставшейся к каждому из этих моментов времени матрицы рассчитывали, беря отношение сухого веса расщепленного образца к сухому весу исходного образца.

[0080] Обработка ферментом не оказывала отрицательного влияния на восприимчивость pADM к расщеплению коллагеназой. Как образцы pADM, так и обработанные ферментами pADM подвергались расщеплению коллагеназой I типа до одинаковой степени и с одинаковой скоростью. Соответственно, было обнаружено, что способы настоящего раскрытия позволяют улучшить иммунологические свойства при имплантации, не вызывая ухудшения чувствительности к коллагеназе.

Пример 3: Обработка тканей с использованием регулируемой активности алкалазы

[0081] Свиную кожу обрабатывали алкалазой с активностью, изменяющейся от 3×10^-5 до 0,015 единиц Ансона/мл в водном растворе с примерно нейтральным pH в течение 16 часов. Свиную кожу затем подвергали децеллюляризации, дезинфекции и стерилизации, используя электронный пучок для получения стерильной бесклеточной кожной матрицы. Были проведены различные тесты для исследования действия алкалазы на различные механические, структурные и биологические свойства.

[0082] На Фигуре 11 представлена гистограмма, показывающая результаты испытания на драпируемость тканевых матриц после обработки алкалазой, используя способы, описанные в Примере 3, а также необработанных контрольных образцов. Выполнение испытания на драпируемость заключается в размещении круга кожной матрицы диаметром 60 мм поверх подставки диаметром 19 мм. Площадь проекции кожной матрицы после драпировки поверх подставки делят на исходную площадь круглого образца тканевой матрицы диаметром 60 мм с целью определения величины драпируемости. Обратите внимание, что площадь подставки вычитают из исходной площади круглого образца и из площади проекции после драпировки до выполнения действия деления этих двух площадей с целью определения драпируемости. Более низкая величина драпируемости соответствует более мягкому (более драпируемому) материалу. Согласно данным происходит значительное уменьшение драпируемости (умягчение материала) при самой низкой концентрации фермента, равной 3×10^-5 единиц Ансона/мл. Выше 3×10^-5 единиц Ансона/мл при выбранных времени обработки, температуре и pH, величина драпируемости повышается и выходит на плато выше 1,5×10^-3 единиц Ансона/мл.

[0083] На Фигуре 13 представлен линейный график, показывающий результаты анализа расщепления коллагеназой тканевых матриц после обработки алкалазой с использованием способов, описанных в Примере 3, а также необработанных контрольных образцов. Согласно данным профиль расщепления при самых низких концентрациях алкалазы сходен с профилем для контрольного образца (не обработанной ферментом матрицы), при этом скорость расщепления повышается в случае матриц, подвергшихся действию более высоких концентраций алкалазы.

[0084] На фигуре 14 показаны результаты ДСК, а именно, температура начала разложения необработанных тканей и тканей, обработанных алкалазой в соответствии с Примером 3. Сходным образом, как и в отношении стабильности коллагена, измеренной при испытании чувствительности к коллагеназе (Фигура 13), более низкая температура начала разложения при повышении концентрации алкалазы указывает на снижение стабильности коллагена как функции концентрации при обработке алкалазой.

[0085] На Фигуре 15 представлен график доверительных интервалов максимальной нагрузки/ширину образца тканевых матриц после обработки алкалазой с использованием способов, описанных в Примере 3, а также необработанных контрольных образцов. Эти данные были получены путем испытания на предел прочности при растяжении полосок материалов, шириной примерно 1 см, при этом измеряли приложенное усилие при разрушении образца. Испытание проводили, используя механическую тестирующую систему INSTRON. Данные указывают на примерно одинаковую прочность для всех обработок.

[0086] На Фигуре 16 представлен график доверительных интервалов упругости тканевых матриц после обработки алкалазой с использованием способов, описанных в Примере 3, а также необработанных контрольных образцов. Упругость является количественным показателем жесткости материала при более высоких нагрузках в линейной части кривой зависимости деформация-усилие. Упругость отличается от измерения драпируемости, которое указывает на жесткость при очень низких нагрузках (действие силы тяжести на ткань). Значительных изменений упругости между обработанными группами не наблюдалось.

[0087] Это испытание показывает, что обработка алкалазой эффективно повышает эластичность pADM при начальной обработке, причем эластичность впоследствии повышается при продолжении обработки. Кроме того, действие малых доз алкалазы отрицательно не влияет на величину максимальной нагрузки, чувствительность к коллагеназе и упругость.

1. Способ обработки свиной кожной ткани, включающий:

выбор ткани;

приведение ткани в контакт с первым водным раствором алкалазы, имеющей активность, выбранную так, чтобы обеспечить требуемое увеличение эластичности, измеренной с помощью испытания ткани на драпируемость, без значительного разрушения коллагена; и

приведение обработанной алкалазой ткани в контакт со вторым раствором для удаления по меньшей мере некоторых клеток и клеточных компонентов из указанной ткани.

2. Способ по п. 1, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, не вызывающих нежелательного изменения по меньшей мере одного из следующего: предела прочности при растяжении, прочности на разрыв, прочности шва, сопротивления ползучести, прочности на продавливание, температуры теплового перехода, чувствительности к коллагеназе или их комбинаций.

3. Способ по п. 1, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, выбранных так, чтобы обеспечить по существу максимальное увеличение эластичности ткани.

4. Способ по п. 1, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, не вызывающих нежелательного изменения упругости.

5. Способ по п. 1, включающий удаление всех клеток и клеточных компонентов из ткани.

6. Способ по п. 1, в котором приведение ткани в контакт с алкалазой включает приведение ткани в контакт с водным раствором, содержащим алкалазу с активностью от 1×10^-6 до 0,015 единиц Ансона/мл.

7. Способ по п. 1, в котором приведение ткани в контакт с алкалазой включает приведение ткани в контакт с водным раствором, содержащим алкалазу с активностью от 1×10^-6 до 1,5×10^-3 единиц Ансона/мл.

8. Способ по п. 1, в котором приведение ткани в контакт с алкалазой включает приведение ткани в контакт с водным раствором, содержащим алкалазу с активностью от примерно 2×10^-5 до примерно 4×10^-5 единиц Ансона/мл.

9. Способ по п. 1, включающий упаковку ткани.

10. Способ по п. 1, включающий стерилизацию ткани.

11. Способ по п. 1, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, обеспечивающих уменьшение величины драпируемости, составляющее 30% или не менее 30%.

12. Способ по п. 1, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, обеспечивающих уменьшение величины драпируемости, составляющее 40% или не менее 40%.

13. Способ по п. 1, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, обеспечивающих уменьшение величины драпируемости, составляющее 50% или не менее 50%.

14. Способ по п. 1, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, обеспечивающих уменьшение величины драпируемости, составляющее 60% или не менее 60%.

15. Способ по п. 1, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, обеспечивающих получение величины драпируемости, равной 0,2-0,4.

16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором испытание на драпируемость включает в себя размещение круглого образца ткани с известной площадью поверх круглой подставки с известным диаметром и выполнение действия деления площади проекции ткани после драпировки ее поверх подставки на исходную площадь круглого образца ткани с целью определения величины драпируемости.

17. Бесклеточная свиная кожная ткань, изготовленная способом по п. 5.

18. Способ обработки свиной кожной ткани, включающий:

выбор кожной ткани;

приведение кожной ткани в контакт с первым водным раствором алкалазы;

приведение обработанной алкалазой кожной ткани в контакт со вторым раствором для удаления по меньшей мере некоторых клеток и клеточных компонентов из указанной ткани; и

облучение ткани, причем действие алкалазы осуществляют в условиях, выбранных так, чтобы обеспечить требуемую эластичность ткани после облучения.

19. Способ по п. 18, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, не вызывающих нежелательного изменения по меньшей мере одного из следующего: предела прочности при растяжении, прочности на разрыв, прочности шва, сопротивления ползучести, прочности на продавливание, температуры теплового перехода, чувствительности к коллагеназе или их комбинаций.

20. Способ по п. 18, в котором условия выбирают так, чтобы обеспечить по существу максимальное увеличение эластичности ткани.

21. Способ по п. 18, включающий удаление всех клеток и клеточных компонентов из ткани.

22. Способ по п. 18, в котором эластичность ткани измеряют, используя испытание на драпируемость, которое включает в себя размещение круглого образца ткани с известной площадью поверх круглой подставки с известным диаметром и выполнение действия деления площади проекции ткани после драпировки ее поверх подставки на исходную площадь круглого образца ткани с целью определения величины драпируемости.

23. Способ по п. 22, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, обеспечивающих уменьшение величины драпируемости, составляющее 30% или не менее 30%.

24. Способ по п. 22, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, обеспечивающих уменьшение величины драпируемости, составляющее 40% или не менее 40%.

25. Способ по п. 22, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, обеспечивающих уменьшение величины драпируемости, составляющее 50% или не менее 50%.

26. Способ по п. 22, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, обеспечивающих уменьшение величины драпируемости, составляющее 60% или не менее 60%.

27. Способ по п. 22, в котором ткань приводят в контакт с алкалазой в условиях, обеспечивающих получение величины драпируемости, равной 0,2-0,4.

28. Способ по любому из пп. 18-27, в котором облучение включает в себя облучение электронным пучком.

29. Способ по любому из пп. 18-27, в котором облучение включает в себя облучение гамма-излучением.