Способ приготовления посевных культур в технологии сибиреязвенных вакцин
Владельцы патента RU 2694597:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ приготовления посевных культур сибиреязвенного микроба. Способ включает культивирование эталонной культуры штамма Bacillus anthracis СТИ-1 глубинным способом при температуре 32-34°С в течение 36-40 ч при аэрировании и перемешивании с использованием питательных сред на основе гидролизатов рыбной муки. При достижении в культуре 70-75% свободно расположенных спор и проспор содержимое ферментера подогревают до 36-37°С и выдерживают без аэрации в течение 3-5 ч до достижения 90% спор, окрашенных по Цилю-Нильсену, далее проводят концентрирование и отмывку нативной культуры. Способ обеспечивает увеличение количества посевного материала. 1 ил., 2 табл., 2 пр.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к технологии медицинских иммунобиологических препаратов и предназначено для получения сибиреязвенных вакцин, содержащих живые споры вакцинных штаммов Bacillus anthracis.
В технологии производства вакцинных препаратов против сибирской язвы (авторское свидетельство СССР №125875, 30h, 6, 1960) традиционно применяют посевные культуры, приготовленные «поверхностным» способом. Этот способ состоит из двух основных этапов:
- получение вегетативной формы сибиреязвенного микроба в жидкой питательной среде;
- получение споровой формы на плотной питательной среде (Воронин Е.С. Биотехнология. - М.: ГИОРД, 2005. - 762 с., регламент ПР 08461522-12-14).
Недостатками традиционного способа получения посевных культур при производстве сибиреязвенных вакцин являются трудоемкость и длительность процесса культивирования, низкая продуктивность и необходимость использования большого числа инокуляторов, что существенно повышает риск контаминации посевных культур посторонней микрофлорой, а также использование достаточно большого количества питательной среды.
Основные недостатки обусловлены тем, что для выращивания посевных культур сибиреязвенного микроба используется большое количество емкостей из стекла (матрацев), выражена многоэтапность процесса с большим количеством манипуляций при засеве и смыве споровой культуры с матрацев, приводящая довольно часто к появлению посторонней микрофлоры, а также использованием достаточно большого количества питательной среды.
Большей части изложенных недостатков традиционного способа лишен глубинный способ приготовления посевных культур в ферментерах, который успешно используется при получении различных биотехнологических продуктов.
Известны способы глубинного выращивания посевного материала мицелия съедобных грибов рода Azospirillum и бактерий рода Brucella (см., например, патент РФ RU 2361610 С1, 20.03.2008, патент РФ RU 2249614 С2, 21.03.2003).
Данные способы не могут быть применены для выращивания B. anthracis в силу различия питательных потребностей и родовой принадлежности указанных микроорганизмов.
Задачами изобретения являются увеличение концентрации спор штамма B. anthracis СТИ-1 в посевных культурах, снижение риска контаминации посевных культур посторонней микрофлорой, сокращение продолжительности процесса ее приготовления с использованием меньшего количества питательной среды, увеличение количества посевных доз, а также снижение брака за счет меньшего количества инокуляторов и манипуляций в предлагаемом для внедрения способе.
Решение задач достигается использованием глубинного способа приготовления посевных культур в лабораторном ферментере с последующим концентрированием на установке микрофильтрации и отмывкой спор дистиллированной водой.
Технический результат, который может быть достигнут при использовании предполагаемого способа, позволяет:
- сократить продолжительность приготовления посевных культур;
- увеличить количество спор в 1 см3 концентрированием нативной культуры на установке микрофильтрации;
- уменьшить брак снижением риска контаминации посевных культур посторонней микрофлорой на этапах ее приготовления;
увеличить количество посевных доз и, соответственно, циклов культивирования в промышленном ферментере;
- сократить расход питательной среды.
Возможность осуществления заявленного изобретения показана следующими примерами:
Пример 1. Приготовление посевных культур для сибиреязвенных вакцин (существующий способ).
Для приготовления одной серии посевной культуры сибиреязвенного микроба «поверхностным» способом эталонную культуру засевают в две бутыли с бульоном Хоттингера не менее чем на одни сутки, затем осуществляют пересев на агаризированную среду на основе перевара Хоттингера. Причем для этого используют не менее 100 матрацев, содержащих не менее 30 дм3 плотной питательной среды. На 4-5 сутки выращивания микробную культуру проверяют на полноту спорообразования, и при наличии 90% нормально окрашенных по Цилю-Нильсену спор осуществляют смыв культуры с поверхности плотной питательной среды. В итоге максимально получают примерно 800 см3 споровой культуры с общей концентрацией порядка 3,5 млрд спор в 1 см3, что соответствует 135-220 посевным дозам для аппарата-культиватора объемом 100 дм3.
Пример 2. Приготовление посевных культур для сибиреязвенных вакцин (предлагаемый способ).
Для получения серии посевных культур используют лабораторный ферментер АК-0,012. В аппарат вводят 6 дм3 стерильной жидкой питательной среды на основе 1% солянокислотного гидролизата рыбной кормовой муки (с содержанием общего азота (1,36±0,20) г/л и аминного азота (0,45±0,15) г/л. Аппарат засевают эталонной культурой штамма B.anthracis СТИ-1, полученной из ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Для этого эталонную культуру ресуспендируют в дистиллированной воде и прогревают при температуре (70±1)°С в течение 30 минут для активации прорастания спор. Процесс культивирования осуществляют при температуре (33±1)°С в течение 36-40 часов, при аэрировании 0,2-0,4 объемов атмосферного стерильного воздуха на единицу объема питательной среды в минуту и перемешивании культуральной жидкости с частотой, равной 300-320 об./мин.
Полноту спорообразования оценивают микроскопически в мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену. При наличии в культуре 70-75% свободно расположенных спор и проспор содержимое ферментера подогревают до температуры 36-37°С и выдерживают при этой температуре без аэрации в течение (4±1) ч.
При наличии не менее 90% спор, нормально окрашенных по Цилю-Нильсену, проводят концентрирование нативной культуры с отмывкой дистиллированной водой на установке микрофильтрации «Сартокон-мини» с использованием полипропиленовых модулей с диаметром пор 0,2 мкм.
Сравнительная характеристика споровых суспензий штамма B. anthracis СТИ-1 для приготовления посевных культур, полученных существующим и заявленным способами, представлена в таблице 1.
Споровую суспензию смешивают с дистиллированной водой и глицеролом и разливают в ампулы. Полученные таким образом посевные культуры обладают характерными для бескапсульного вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 культурально-морфологическими иммунобиологическими и биохимическими свойствами с высокой иммуногенностью (не менее 25000 усл. ед. для морских свинок) и низкой реактогенностью при отсутствии протеолитической активности.
В результате дополнительно проведенных электронно-микроскопических сравнительных исследований ультратонких срезов спор посевных культур производственного штамма B.anthracis СТИ-1, приготовленных различными способами выращивания, показано, что экзоспориум, споровые оболочки, кортекс, спороплазма и нуклеоид спор, полученных путем глубинного выращивания в аппарате-культиваторе и на поверхности агаризованной питательной среды, не различаются по ультраструктурной организации (фиг. 1).
При использовании посевных культур, приготовленных по заявленному способу, получены экспериментальные серии сибиреязвенной вакцины, не отличающиеся по показателям качества от производимых по существующей технологии (таблица 2). Живая сибиреязвенная вакцина представляет собой пористую массу желтовато-белого цвета с коричневым оттенком, растворяющуюся в течение пяти минут. После растворения - непрозрачная гомогенная суспензия серовато-белого цвета без посторонних включений.
Заявляемый глубинный способ приготовления посевных культур позволяет получить сибиреязвенные вакцины, удовлетворяющие требованиям фармакопейной статьи предприятия Р №001273/01-230911 «Вакцина сибиреязвенная живая» и регламента производства ПР 08461522-12-14 «Вакцина сибиреязвенная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для подкожного введения и накожного скарификационного нанесения».
Способ приготовления посевных культур сибиреязвенного микроба с использованием питательных сред на основе гидролизатов рыбной муки, отличающийся тем, что эталонную культуру штамма Bacillus anthracis СТИ-1 ресуспендируют в дистиллированной воде и прогревают при температуре 69-71°С в течение 30 минут и культивируют глубинным способом в лабораторном ферментере емкостью 12 дм3 при температуре 32-34°С в течение 36-40 ч при аэрировании 0,2-0,4 объемов атмосферного стерильного воздуха на единицу объема питательной среды в минуту и перемешивании 300-320 об/мин, затем при достижении в культуре 70-75% свободно расположенных спор и проспор содержимое ферментера подогревают до 36-37°С и выдерживают без аэрации в течение 3-5 ч до достижения 90% спор, окрашенных по Цилю-Нильсену, далее проводят концентрирование и отмывку дистиллированной водой на установке микрофильтрации «Сартокон-мини» с использованием полипропиленовых модулей с диаметром пор 0,2 мкм.
