Композиции и способы модулирования экспрессии аполипопротеина (а)

Авторы патента:

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая соединение, специфически ингибирующее экспрессию нуклеиновой кислоты аро(а) и/или белка аро(а), композиция для лечения, предупреждения или замедления прогрессирования заболевания, связанного с повышенной экспрессией аро(а) и/или повышенной экспрессией Lp(a), содержащая терапевтически эффективное количество соединения, cпособ предупреждения, лечения, облегчения или замедления прогрессирования заболевания, связанного с повышенной экспрессией аро(а) и/или повышенной экспрессией Lp(a), включающий введение животному вышеуказанного соединения или композиции. В одном из вариантов изобретения соединение содержит модифицированный олигонуклеотид и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов, нацеленных на аро(а). Изобретение расширяет арсенал средств для ингибирования экспрессии нуклеиновой кислоты аро(а) и/или белка аро(а). 5 н. и 32 з.п. ф-лы, 185 табл., 124 пр.

Настоящее изобретение зарегистрировано вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла под названием BIOL0250WOSEQ_ST25.txt, созданного 1 мая 2014 года, размером 432 Кб. Информация о перечне последовательностей в электронном формате в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Принцип, лежащий в основе антисмысловой технологии, заключается в том, что антисмысловое соединение гибридизуется с целевой нуклеиновой кислотой и модулирует количество, активность и/или функцию целевой нуклеиновой кислоты. Например, в некоторых случаях антисмысловые соединения приводят к изменению транскрипции или трансляции мишени. Такое модулирование экспрессии может быть достигнуто, например, разрушением мРНК-мишени или ингибированием на основании оккупации. Пример модулирования целевой функции РНК за счет разрушения представляет собой разрушение за счет РНКазы Н целевой РНК при гибридизации с ДНК-подобным антисмысловым соединением. Другой пример модулирования генной экспрессии за счет разрушения мишени представляет собой РНК-интерференция (РНКи). РНКи относится к антисмысл-опосредованному сайленсингу гена по механизму, в котором применяется РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC). Дополнительный пример модулирования целевой функции РНК представляет собой механизм на основании оккупации, такой как использует в естественных условиях микроРНК. МикроРНК представляют собой небольшие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию РНК, кодирующих белки. Связывание антисмыслового соединения с микроРНК препятствует связыванию микроРНК с ее матричными РНК мишенями, и, следовательно, затрудняет функцию микроРНК. МикроРНК-миметики могут усиливать естественную функцию микроРНК. Некоторые антисмысловые соединения изменяют сплайсинг пре-мРНК. Независимо от конкретного механизма, специфичность в отношении последовательностей делает антисмысловые соединения перспективными в качестве средств для подтверждения нацеленности и функционализации генов, а также в качестве терапевтических средств для селективного модулирования

экспрессии генов, участвующих в патогенезе заболеваний.

Антисмысловая технология представляет собой эффективный способ модулирования экспрессии одного или более специфических генных продуктов и, следовательно, может быть признана исключительно подходящей в ряде терапевтических, диагностических и исследовательских применений. Химически модифицированные нуклеозиды могут быть внедрены в антисмысловые соединения для усиления одного или более свойств, таких как устойчивость к нуклеазе, фармакокинетика или аффинность к целевой нуклеиновой кислоте. В 1998 году антисмысловое соединение Vitravene® (фомивирсен; разработанный компанией Isis Pharmaceuticals Inc., Карлсбад, штат Калифорния) стал первым антисмысловым лекарством, получившим разрешение на продажу от Администрации США по пищевым продуктам и лекарственным веществам (FDA), и в настоящее время представляет собой средство для лечения вызванного цитомегаловирусом (CMV) ретинита у пациентов со СПИДом.

Новые химические модификации обладают улучшенной активностью и эффективностью антисмысловых соединений, раскрывая потенциал для пероральной доставки, а также для усовершенствования подкожного введения, снижения возможных побочных эффектов, и являются более удобными для пациента. Химические модификации, усиливающие активность антисмысловых соединений, позволяют осуществлять введение более низких доз, что снижает возможность токсичности, а также уменьшает общую стоимость лечения. Модификации, увеличивающие устойчивость к разрушению, приводят к более медленному выведению из организма, обеспечивая возможность менее частого введения доз. Различные типы химических модификаций могут быть комбинированы в одном соединении для дальнейшей оптимизации эффективности соединения.

Липопротеины представляют собой глобулярные мицеллоподобные частицы, которые состоят из неполярного ядра из ацилглицеринов и холестериловых сложных эфиров, окруженного амфифильной оболочкой из белков, фосфолипидов и холестерина. Липопротеины классифицируют на пять крупных категорий по их функциональным и физическим свойствам: хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности (VLDL), липопротеины средней плотности (IDL), липопротеины низкой плотности (LDL) и липопротеины высокой плотности (HDL). Хиломикроны переносят пищевые липиды из кишечника к ткани. VLDL, IDL и LDL переносят триацилглицерины и холестерин из печени к тканям. HDL переносят эндогенный холестерин от тканей к печени.

Частицы липопротеинов подвергаются непрерывной метаболической переработке и имеют различные свойства и состав. Плотность липопротеинов увеличивается без увеличения диаметра частицы, поскольку плотность их внешней оболочки меньше, чем плотность внутреннего ядра. Белковые компоненты липопротеинов известны также как аполипопротеины. В различных липопротеинах человека в значительных количествах содержатся по меньшей мере девять аполипопротеинов.

Частица липопротеина (a) [Lp(a)] была идентифицирована около 50 лет назад, и она состоит из весьма уникальной частицы LDL, в которой один белок аполипопротеина В (ароВ) связан дисульфидной связью с одним белком аполипопротеина (а) [аро(а)]. Белок аро(а) имеет высокую степень гомологии с плазминогеном, особенно в повторяющемся крингл домене IV 2 типа. Уровни циркулирующего Lp(a) обратно пропорциональны количеству вариабельных повторов крингл IV 2 типа в молекуле и, поскольку у индивидуума совместно экспрессируются обе аллели, могут демонстрировать гетерозиготные профили изоформ плазмы (Kraft et al., Eur J Hum Genet, 1996; 4(2): 74-87). Предполагают, что этот повторяющийся крингл домен в аро(а) может отвечать за его протромботические и антифибринолитические свойства, потенциально усиливая атеросклеротическое прогрессирование.

Аро(а) транскрипционно регулируется IL-6, а в исследованиях на пациентах с ревматоидным артритом, которых лечили ингибитором IL-6 (тоцилизумабом), уровни в плазме были снижены на 30% спустя 3 месяца лечения (Schultz et al., PLoS One 2010; 5:el4328).

Было показано, что apo(a) предпочтительно связывает окисленные фосфолипиды и потенцирует сосудистое воспаление (Bergmark et al., J Lipid Res 2008; 49:2230-2239; Tsimikas et al., Circulation. 2009; 119(13):1711-1719).

Кроме того, выполненные исследования позволяют предположить, что частица Lp(a) также может стимулировать эндотелиальную проницаемость, инициировать экспрессию ингибитора плазминогенного активатора типа 1 и активировать секрецию макрофагального интерлейкина-8 (Koschinsky and Marcovina, Curr Opin Lipidol 2004; 15:167-174). Важно отметить, что в недавних исследованиях генетической связи было выявлено, что Lp(a) представляет собой независимый фактор риска для инфаркта миокарда, инсульта, болезни периферических сосудов и аневризмы брюшной аорты (Rifai et al., Clin Chem 2004; 50:1364-71; Erqou et al., JAMA 2009;302:412-23; Kamstrup et al., Circulation 2008; 117:176-84). Более того, в недавнем исследовании преждевременной болезни коронарных артерий

(PROCARDIS), Clarke et al. (Clarke et al., NEJM (2009)361; 2518-2528), описаны прочные и независимые связи между коронарной болезнью серца и концентрациями Lp(a) в плазме. Кроме того, ученые Solfrizzi et al., предположили, что повышенное содержание Lp(а) в сыворотке может быть связано с повышенным риском болезни Альцгеймера (AD) (Solfrizzi et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002, 72:732-736. В настоящее время, в клинических, условиях примеры косвенных ингибиторов аро(а) для лечения сердечно-сосудистых. заболеваний включают аспирин, ниаспан, мипомерсен, анацетрапиб, эпиротиром и ломитапид, которые снижают уровни Lp(a) в плазме на 18%, 39%, 32%, 36%, 43% и 17%, соответственно. Кроме того, в клинических условиях может быть использован аферез Lp(a) для снижения содержания аро(а)-содержащих частиц Lp(a).

В настоящее время существует ограниченное число терапевтических стратегий для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, прямо нацеленных на уровни аро(а).. Были разработаны рибозимные олигонуклеотиды (патент США 5877022) и антисмысловые олигонуклеотиды (WO 2005/000201; WO 2003/014397; WO 2013/177468; US 20040242516; патенты США №8138328, 8673632 и 7259150; Merki et al., J Am Coll Cardiol 2011; 57:1611-1621; каждая публикация включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме), но ни один из них не был одобрен для промышленного применения.

Следовательно, сохраняется очевидная неудовлетворенная медицинская потребность в новых агентах, которые могут эффективно и селективно снижать уровни аро(а) у пациентов с повышенным риском сердечно-сосудистых явлений из-за хронически повышенных уровней Lp(a) в плазме.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе представлены композиции и способы модулирования экспрессии мРНК и белка аро(а). В некоторых вариантах реализации изобретения специфический ингибитор аро(а) снижает экспрессию мРНК и белка аро(а). В настоящем документе представлены композиции и способы модулирования экспрессии уровней Lp(a).

В некоторых вариантах реализации изобретения композиция представляет собой специфический ингибитор аро(а). В некоторых вариантах реализации специфический ингибитор аро(а) представляет собой нуклеиновую кислоту, белок или небольшую молекулу. В некоторых вариантах реализации специфический ингибитор аро(а) представляет собой антисмысловый олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгат. В некоторых вариантах реализации специфический ингибитор аро(а) представляет собой модифицированный

олигонуклеотид и конъюгат, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и содержит последовательность азотистых оснований, содержащую часть из по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований, комплементарную равной по длине части азотистых оснований3901-3920 в SEQ ID NO:1, причем указанная последовательность азотистых оснований модифицированного олигонуклеотида поменьшей мере на 80% комплементарна SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах реализации специфический ингибитор аро(а) представляет собой модифицированный олигонуклеотид и конъюгат, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых основанийпоследовательности азотистых оснований SEQ ID NO: 1-130, 133, 134. В некоторых вариантах реализации специфический ингибитор аро(а) представляет собой модифицированный олигонуклеотид и конъюгат, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных азотистых основанийлюбой из SEQ ID NO: 58, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: (а) сегмент гэп состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; (b) сегмент 5'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; (с) сегмент 3'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и при этом, сегмент гэп находится между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла, и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, и по меньшей мере одна межнуклеозидных связей представляет собой тиофосфатную связь, а каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.

В некоторых вариантах реализации изобретения приведена композиция, содержащая конъюгированное антисмысловое соединение, описанное в настоящем документе, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В некоторых вариантах реализации модулирование экспрессии аро(а) происходит в клетке или ткани. В некоторых вариантах реализации модулирование происходит в клетке или ткани животного. В некоторых вариантах реализации животное представляет собой человека. В некоторых вариантах реализации модулирование представляет собой снижение уровня мРНК аро(а). В некоторых вариантах реализации модулирование представляет собой снижение уровня белка аро(а). В некоторых вариантах реализации снижаются и уровни

мРНК, и уровни белка аро(а). В некоторых вариантах реализации модулирование представляет собой снижение уровня Lp(a). Такое снижение может происходить в зависимости от времени или в зависимости от дозы.

В некоторых вариантах реализации приведены конъюгированные антисмысловые композиции и способы их применения в терапии. В некоторых вариантах реализации приведены композиции и способы предупреждения, лечения, отсрочки, замедления прогрессирования и/или облегчения заболеваний, расстройств и состояний, связанных с аро(а). В некоторых вариантах реализации приведены композиции и способы предупреждения, лечения, отсрочки, замедления прогрессирования и/или облегчения заболеваний, расстройств и состояний, связанных с Lp(a). В некоторых вариантах реализации такие заболевания, расстройства и состояния представляют собой воспалительные, сердечнососудистые и/или метаболические заболевания, расстройства и состояния. В некоторых вариантах реализации композиции и способы терапии включают введение аро(а)-специфического ингибитора индивидууму, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах реализации аро(а)-специфический ингибитор представляет собой нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение представлявляет собой модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение представляет собой модифицированный олигонуклеотид с конъюгатом.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания представлены конъюгированные антисмысловые соединения. В некоторых вариантах реализации настоящего описания представлены конъюгированные антисмысловые соединения, содержащие антисмысловый олигонуклеотид, комплементарный транскрипту нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации настоящего описания представлены способы, включающие контакт клетки с конъюгированным антисмысловым соединением, содержащим антисмысловый олигонуклеотид, комплементарный транскрипту нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации настоящего описания представлены способы, включающие контакт клетки с конъюгированным антисмысловым соединением, содержащим антисмысловый олигонуклеотид, и уменьшение количества или активности транскрипта нуклеиновой кислоты в клетке.

Ранее был описан асиалогликопротеиновый рецептор (ASGP-R). См., например, Park et al., PNAS, том 102, №47, cc. 17125-17129 (2005). Такие рецепторы экспрессируются на

клетках печени, в частности, гепатоцитах. Кроме того, было показано, что соединения, содержащие кластеры трех N-ацетилгалактозаминовых (GalNAc) лигандов, способны связываться с ASGP-R, приводя к захвату указанного соединения в клетку. См., например, Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, cc. 5216-5231 (май, 2008). Соответственно, конъюгаты, содержащие такие кластеры GalNAc, применяли для облегчения захвата некоторых соединений в клетки печени, в частности, гепатоциты. Например, было показано, что некоторые GalNAc-содержащие конъюгаты увеличивают активность дуплексных миРНК соединений в клетках печени in vivo. В таких случаях GalNAc-содержащий конъюгат, как правило, прикрепляется к смысловой спирали дуплекса миРНК. Поскольку смысловая спираль отбрасывается перед окончательной гибридизацией антисмысловой спирали с целевой нуклеиновой кислотой, то маловероятно, что такси конъюгат будет влиять на активность. Как правило, конъюгат присоединяется к 3'-концу смысловой спирали миРНК. См., например, патент США 8106022. Некоторые конъюгирующие группы, описанные в настоящем документе, более активны и/или синтезируются легче, чем конъюгирующие группы, описанные ранее.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения конъюгаты присоединяются к односпиральным антисмысловым соединениям, включая, но не ограничиваясь ими, антисмысловые соединения на основе РНКазы Н и антисмысловые соединения, которые изменяют сплайсинг целевой нуклеиновой кислоты пре-мРНК. В такик вариантах реализации конъюгат должен оставаться присоединенным к антисмысловому соединению достаточно долго для обеспечения преимущества (улучшенного захвата в клетки), но затем он должен либо расщепляться, либо иным образом не препятствовать последующим стадиям, необходимым для активности, таким как гибридизация с целевой нуклеиновой кислотой и взаимодействие с РНКазой Н или ферментами, связанными со сплайсингом или модулированием сплайсинга. Такой баланс свойств более важен при осаждении односпиральных антисмысловых соединений, чем соединений миРНК, где конъюгат может быть просто присоединен к смысловой спирали. В настоящем документе описаны односпиральные антисмысловые соединения, обладающие улучшенной активностью в клетках печени in vivo, по сравнению с таким же антисмысловым соединением, не имеющим конъюгата. Учитывая необходимый баланс свойств для этих соединений, такая улучшенная активность является неожиданной.

В некоторых вариантах реализации конъюгирующие группы по настоящему документу содержат расщепляемый фрагмент. Как было отмечено, не ограничиваясь каким-либо

механизмом, логично, что конъюгат должен сохраняться у соединения достаточно долго для обеспечения усиления захвата, но после этого желательно, чтобы некоторая его часть или, в идеале, весь конъюгат расщеплялся, выделяя исходное соединение (например, антисмысловое соединение) в его наиболее активной форме. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент представляет собой расщепляемый нуклеозид. Такие варианты реализации обладают преимуществом эндогенных нуклеаз в клетке за счет присоединения остальной части конъюгата (кластера) к антисмысловому олигонуклеотиду через нуклеозид при помощи одной или более расщепляемых связей, таких как фосфодиэфирные связи. В некоторых вариантах реализации кластер связан с расщепляемым нуклеозидом через фосфодиэфирную связь. В некоторых вариантах реализации расщепляемый нуклеозид присоединен к антисмысловому олигонуклеотиду (антисмысловому соединению) фосфодиэфирной связью. В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа может содержать два или три расщепляемых нуклеозида. В таких вариантах реализации указанные расщепляемые нуклеозиды связаны друг с другом, с антисмысловым соединением и/или с кластером посредством расщепляемых связей (таких как фосфодиэфирная связь). Некоторые конъюгаты по настоящему документу не содержат расщепляемый нуклеозид, а вместо этого содержат расщепляемую связь. Показано, что достаточное расщепление конъюгата из олигонуклеотида обеспечивается по меньшей мере за счет одной связи, которая легко поддается расщеплению в клетке (расщепляемая связь).

В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения представляют собой пролекарства. Такие пролекарства вводят животному, и они в конечном итоге метаболизируются до более активной формы. Например, конъюгированные антисмысловые соединения расщепляются с удалением всего или части конъюгата, приводя к активной (или более активной) форме антисмыслового соединения, не содержащего всего или части конъюгата.

В некоторых вариантах реализации конъюгаты присоединены на 5'-конце олигонуклеотида. Некоторые такие 5'-конъюгаты расщепляются более эффективно, чем аналоги, имеющие такую же конъюгирующую группу, присоединенную на 3'-конце. В некоторых вариантах реализации улучшенная активность может коррелировать с улучшенным расщеплением. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды, содержащие конъюгат на 5'-конце, обладают более высокой эффективностью, чем олигонуклеотиды, содержащие конъюгат на 3'-конце (см., например, Примеры 56, 81, 83 и 84). Кроме того, 5'-присоединение обеспечивает более простой синтез олигонуклеотида. Как

правило, олигонуклеотиды синтезируют на твердой подложке в направлении от 3' к 5'. Для получения 3'-конъюгированного олигонуклеотида, как правило присоединяют предварительно конъюгированный 3'-нуклеозид к твердой подложке, а затем обычным путем создают олигонуклеотид. Однако присоединение такого конъюгированного нуклеозида к твердой подложке усложняет синтез. Кроме того, применяя такой подход, конъюгат затем присутствует в ходе всего синтеза олигонуклеотида и может разрушаться во время последующих стадий или может ограничивать типы реакций и реагентов, которые можно применять. Применяя структуры и методики, описанные в настоящем документе для 5'-конъюгированных олигонуклеотидов, можно синтезировать олигонуклеотид при помощи стандартных автоматизированных методик и внедрять в конъюгат окончательный (5'-ближайший) нуклеозид или после отделения олигонуклеотида от твердой подложки.

С учетом известного уровня техники и настоящего описания, специалисты в данной области техники могут легко получить любые из конъюгатов и конъюгированных олигонуклеотидов, описанных в настоящем документе. Кроме того, синтез некоторых таких конъюгатов и конъюгированных олигонуклеотидов, описанных в настоящем документе, проще и/или требует меньше стадий и, следовательно, менее дорогой, чем синтез ранее описанных конъюгатов, что дает преимущество при производстве. Например, синтез некоторых конъюгирующих групп состоит из меньшего количество синтетических стадий, что приводит к увеличению выхода, по сравнению с ранее описанными конъюгирующими группами. Конъюгирующие группы, такие как GalNAc3-10 в Примере 46 и GalNAc3-7 в Примере 48, гораздо проще, чем ранее описанные конъюгаты, такие как описаны в публикациях U.S. 8106022 или U.S. 7262177, для которых необходима сборка большего количества химических промежуточных соединений. Соответственно, эти и другие конъюгаты, описанные в настоящем документе, обладают преимуществом по сравнению с ранее описанными соединениями для применения с любым олигонуклеотидом, включая односпиральные олигонуклеотиды и любую спираль двухспиральных олигонуклеотидов (например, миРНК).

Точно так же в настоящем документе описаны конъюгирующие группы, имеющие только один или два лиганда GalNAc. Как показано, такие конъюгированные группы усиливают активность антисмысловых соединений. Такие соединения гораздо проще получить, чем конъюгаты, содержащие три лиганда GalNAc. Конъюгирующие группы, содержащие один или два лиганда GalNAc, могут быть присоединены к любым антисмысловым соединениям, включая односпиральные олигонуклеотиды и любую спираль

двухспиральных олигонуклеотидов (например, миРНК).

В некоторых вариантах реализации конъюгаты, описанные в настоящем документе, существенно не изменяют некоторые показатели переносимости. Например, в настоящем документе показано, что конъюгированные антисмысловые соединения являются не более иммуногенными, чем не конъюгированные исходные соединения. Поскольку активность улучшается, то варианты реализации, в которых переносимость остается такой же (или, в действительности, если даже переносимость ухудшается лишь незначительно, по сравнению с приростом активности), обладают улучшенными характеристиками для терапии.

В некоторых вариантах реализации конъюгация позволяет изменять антисмысловые соединения так, чтобы они обладали менее выраженными последствиями в отсутствие конъюгации. Например, в некоторых вариантах реализации замена одной или более тиофосфатных связей полностью тиофосфатного антисмыслового соединения на фосфодиэфирные связи приводит к улучшению некоторых показателей переносимости. Например, в некоторых случаях такие антисмысловые соединения, имеющие один или более фосфодиэфиров, являются менее иммуногенными, чем такие же соединения, в которых каждая связь представляет собой тиофосфат. Однако в некоторых случаях, как показано в Примере 26, такое же замещение одной или более тиофсофатных связей на фосфодиэфирные связи приводит также к снижению клеточного захвата и/или к снижению активности. В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения, описанные в настоящем документе, допускают такое изменение связей с небольшим снижением или без снижения захвата и активности, по сравнению с конъюгированным полностью тиофосфатным аналогом. В действительности, в некоторых вариантах реализации, например, в Примерах 44, 57, 59 и 86, олигонуклеотиды, содержащие конъюгат и по меньшей мере одну фосфодиэфирную межнуклеозидную связь, фактически демонстрируют повышенную активность in vivo даже по сравнению с полностью тиофосфатным аналогом, также содержащим такой же конъюгат. Более того, поскольку конъюгация приводит к значительному увеличению захвата/активности, то небольшое снижение такого существенного прироста может быть приемлемым для достижения улучшенной переносимости. Соответственно, в некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь.

В некоторых вариантах реализации конъюгация антисмысловых соединений по настоящему документу приводит к улучшенной доставке, захвату и активности в гепатоцитах. Следовательно, в ткань печени доставляется большее количество соединения.

Однако в некоторых вариантах реализации изобретения такая улучшенная доставка сама по себе не объясняет общего увеличения активности. В некоторых таких вариантах реализации изобретения большее количество соединения поступает в гепатоциты. В некоторых вариантах реализации изобретения даже такой улучшенный захват гепатоцитов сам по себе не объясняет общего увеличения активности. В таких вариантах реализации изобретения увеличивается продуктивный захват конъюгированного соединения. Например, как показано в Примере 102, некоторые варианты реализации GalNAc-содержащих конъюгатов увеличивают обогащение антисмысловых олигонуклеотидов в гепатоцитах, по сравнению с не паренхимальными клетками. Такое обогащение преимущественно для олигонуклеотидов, которые нацелены на гены, экспрессируемые в гепатоцитах.

В некоторых вариантах реализации конъюгированные антисмысловые соединения по настоящему документу приводят к уменьшению воздействия на почки. Например, как показано в Примере 20, концентрации антисмысловых олигонуклеотидов, содержащих некоторые варианты реализации GalNAc-содержащих конъюгатов, в почках ниже, чем концентрации антисмысловых олигонуклеотидов, не имеющих GalNAc-содержащего конъюгата. Это имеет несколько преимущественных терапевтических применений. Для терапевтических показаний, в которых не требуется проявление активности в почках, воздействие на почки подвергает их риску токсичности без соответствующей пользы. Более того, высокая концентрация в почках обычно приводит к выводу соединения с мочой, обеспечивая более быстрое выведение. Соответственно, для внепочечных мишеней накопление в почках является нежелательным.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания представлены конъюгированные антисмысловые соединения, представленные формулой:

где

А представляет собой антисмысловый олигонуклеотид;

В представляет собой расщепляемый фрагмент;

С представляет собой конъюгирующий линкер;

D представляет собой группу ветвления;

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

На представленной выше схеме и в аналогичных схемах в настоящем документе группа ветвления «D» разветвляется такое количество раз, которое необходимо для соответствия количеству групп (E-F), указанному количеством «q». Так, если q=1, то формула представляет собой:

если q=2, то формула представляет собой:

если q=3, то формула представляет собой:

если q=4, то формула представляет собой:

если q=5, то формула представляет собой:

В некоторых вариантах реализации изобретения приведены конъюгированные антисмысловые соединения, имеющие структуру:

В настоящем описании представлены следующие не ограниченные нумерованные варианты реализации изобретения:

В вариантах реализации, имеющих более одной конкретной переменной (например, более одного «m» или «n»), если не указано иное, каждая такая конкретная переменная выбрана независимо. Следовательно, для структуры, имеющей более одного n, каждый n выбран независимо, так что они могут быть или не быть одинаковыми между собой.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены конъюгированные антисмысловые соединения, представленные следующей структурой. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение содержит модифицированный олигонуклеотид ISIS 494372 с 5'-Х, где X представляет собой конъюгированную группу, содержащую GalNAc. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение состоит из модифицированного олигонуклеотида ISIS 494372 с 5'-Х, где X представляет собой конъюгированную группу, содержащую GalNAc.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания приведены конъюгированные антисмысловые соединения, представленные следующей структурой. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение содержит конъюгированный модифицированный олигонуклеотид ISIS 681251. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение состоит из конъюгированного модифицированного олигонуклеотида ISIS 681251.

В некоторых вариантах реализации изобретения в настоящем описании приведены конъюгированные антисмысловые соединения, представленные следующей структурой. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение содержит конъюгированный модифицированный олигонуклеотид ISIS 681257. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение состоит из конъюгированного модифицированного олигонуклеотида ISIS 681257.

В некоторых вариантах реализации изобретения в настоящем описании приведены конъюгированные антисмысловые соединения, представленные следующей структурой. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение содержит модифицированный олигонуклеотид с SEQ ID NO: 58 с 5'-GalNAc с вариабельностью в сахарных структурах крыльев. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение состоит из модифицированного олигонуклеотида с SEQ ID NO: 58 с 5'-GalNAc с вариабельностью в сахарных структурах крыльев.

где либо R¹ представляет собой -ОСН²СН²ОСН³ (МОЕ), и R² представляет собой Н; либо R¹ и R² вместе образуют мостик, где R¹ представляет собой -О-, и R² представляет собой -СН₂-, -СН(СН₃)- или -СН₂СН₂-, и R¹ и R² связаны напрямую, так что образующийся мостик выбран из: -O-СН₂-, -O-СН(СН₃)- и -O-СН₂СН₂-;

и для каждой пары R³ и R⁴ у одного кольца, независимо для каждого кольца: либо R³ выбран из Н и -ОСН₂СН₂ОСН₃, и R⁴ представляет собой Н; либо R³ и R⁴ вместе образуют мостик, где R³ представляет собой -О-, и R₄ представляет собой -СН₂-, -СН(СН₃)- или -СН₂СН₂-, и R³ и R⁴ связаны напрямую, так что образующийся мостик выбран из: -О-СН²-, -О-СН(СН₃)- и -O-СН₂СН₂-;

и R⁵ выбран из Н и - СН₃;

и Z выбран из S^- и О^-.

В настоящем описании приведены следующие неограничивающие нумерованные варианты реализации изобретения:

Подробное описание

Следует понимать, что и представленное выше общее описание, и следующее подробное описание являются лишь типичными и пояснительными, и они не ограничивают настоящее описание. В настоящем документе использование единственного числа включает множественное число, если специально не указано иное. При использовании в настоящем документе, термин «или» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, использование термина «включая», а также других форм, таких как «включает» и «включенный», не является ограничивающим. Также, такие термины как «элемент» или «компонент» охватывают как элементы и компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы и компоненты, которые содержат более одной субъединицы, если специально не указано иное.

Названия разделов, используемые в настоящем документе, предназначены лишь для организационных целей, и их не следует толковать как ограничение описанного объекта изобретения. Все документы или части документов, цитируемые в настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, статьи, книги и монографии, в явной форме включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

А. Определения

При отсутствии конкретных определений, номенклатура, используемая в связи с ними, а также в связи с приемами и методиками аналитической химии, синтетической органической химии, а также медицинской и фармацевтической химии, описанная в настоящем документе, является общеизвестной и общепринятой в данной области техники. Для химического синтеза и химического анализа могут быть использованы стандартные методики. Некоторые такие методики и приемы представлены, например, в публикациях "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" под редакцией Sangvi и Cook, American Chemical Society, федеральный округ Вашингтон, 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co.; Истон, штат Пенсильвания, 21^е издание, 2005; и "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" под

редакцией Stanley Т. Crooke, CRC Press, Бока-Ратон, штат Флорида; а также в книге Sambrook et al., "Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2^е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, которые включены в настоящий документ посредством ссылки для всех целей.

Если это допустимо, все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации, а также другие данные, упоминаемые в тексте настоящего описания, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Если не указано иное, следующие термины имеют следующие значения:

При использовании в настоящем документе, «нуклеозид» означает соединение, содержащее фрагмент азотистого основанияи сахарный фрагмент. Нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, природные нуклеозиды (которые находятся в ДНК и РНК) и модифицированные нуклеозиды. Нуклеозиды могут быть связаны с фосфатным фрагментом.

При использовании в настоящем документе, «химическая модификация» означает химическое отличие в соединении, по сравнению с природным аналогом. Химические модификации олигонуклеотидов включают нуклеозидные модификации (включая модификации сахарного фрагмента и модификации азотистого основания) и модификации межнуклеозидных связей. В отношении олигонуклеотида химическая модификация включает не только отличия в последовательности азотистых оснований.

При использовании в настоящем документе, «фуранозил» означает структуру, содержащую 5-членное кольцо, содержащее четыре атома углерода и один атом кислорода.

При использовании в настоящем документе, «природный сахарный фрагмент» означает рибофуранозил, встречающийся в природной РНК, или дезоксирибофуранозил, встречающийся в природной ДНК.

При использовании в настоящем документе, «сахарный фрагмент» означает природный сахарный фрагмент или модифицированный сахарный фрагмент нуклеозида.

При использовании в настоящем документе, «модифицированный сахарный фрагмент» означает замещенный сахарный фрагмент или заменитель сахара.

При использовании в настоящем документе, «замещенный сахарный фрагмент» означает фуранозил, который не является природным сахарным фрагментом. Замещенные сахарные фрагменты включают, но не ограничиваются ими, фуранозилы, содержащие заместители в 2'-положении, 3'-положении, 5'-положении и/или 4'-положении. Некоторые замещенные сахарные фрагменты представляют собой бициклические сахарные фрагменты.

При использовании в настоящем документе, «2'-замещенный сахарный фрагмент» означает фуранозил, содержащий заместитель в 2'-положении, отличный от Н или ОН. Если не указано иное, то 2'-замещенный сахарный фрагмент не является бициклическим сахарным фрагментом (т.е. 2'-заместитель 2'-замещенного сахарного фрагмента не образует мостик с другим атомом радикала фуранозного кольца).

При использовании в настоящем документе, «МОЕ» означает -ОСН₂СН₂ОСН₃.

При использовании в настоящем документе, «2'-F нуклеозид» относится к нуклеозиду, содержащему сахар, который содержит фтор в 2'-положении. Если не указано иное, то фтор в 2'-F нуклеозиде находится в рибо-положении (заменяя ОН природной рибозы).

При использовании в настоящем документе, термин «заменитель сахара» означает структуру, которая не содержит фуранозила и способна заменять природный сахарный

фрагмент нуклеозида, так что образующиеся нуклеозидные субъединицы могут связываться вместе и/или связываться с другими нуклеозидами с образованием олигомерного соединения, которое может гибридизоваться с комплементарным олигомерным соединением. Такие струтуры включают кольца, содержащие другое количество атомов, чем фуранозил (например, 4, 6 или 7-членные кольца); замену кислорода фуранозила некислородным атомом (например, углеродом, серой или азотом); или одновременное изменение количество атомов и замену кислорода. Такие структуры также могут содержать замещения, соответствующие замещениям, описанным для замещенных сахарных фрагментов (например, 6-членные карбоциклические бициклические заменители сахара, необязательно содержащие дополнительные заместители). Заменители сахара включают также более сложные сахарные заместители (например, некольцевые системы пептидной нуклеиновой кислоты). Заменители сахара включают, без ограничения, морфолино, циклогексенилы и циклогекситолы.

При использовании в настоящем документе, «бициклический сахарный фрагмент» означает модифицированный сахарный фрагмент, содержащий 4-7-членное кольцо (включая, но не ограничиваясь фуранозилом), содержащее мостик, связывающий два атома 4-7-членного кольца с образованием второго кольца, что приводит к получению бициклической структуры. В некоторых вариантах реализации 4-7-членное кольцо представляет собой сахарное кольцо. В некоторых вариантах реализации 4-7-членное кольцо представляет собой фуранозил. В некоторых таких вариантах реализации мостик соединяет 2'-углерод и 4'-углерод фуранозила.

Используемый в настоящем документе термин «нуклеиновая кислота» относится к молекулам, состоящим из мономерных нуклеотидов. «Нуклеиновая кислота» включает рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты (оцДНК), двухцепочечные нуклеиновые кислоты (дцДНК), малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (миРНК) и микроРНК (микроРНК). Нуклеиновая кислота может также содержать любую комбинацию этих элементов в одной молекуле.

При использовании в настоящем документе, «нуклеотид» означает нуклеозид, дополнительно содержащий фосфатную связывающую группу. При использовании в настоящем документе, «связанные нуклеозиды» могут быть или не быть связаны фосфатными связями и, следовательно, включают, но не ограничиваются ими, «связанные нуклеотиды». При использовании в настоящем документе; «связанные нуклеозиды» представляют собой нуклеозиды, которые связаны в непрерывную последовательность (т.е. между связанными нуклеозидами нет дополнительных нуклеозидов).

При использовании в настоящем документе, «азотистое основание» означает группу атомов, которая может быть связана с сахарным фрагментом с образованием нуклеозида, который может быть внедрен в олигонуклеотид, и при этом указанная группа атомов может связываться с комплементарным природным азотистым основанием другого олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты. Азотистые основания могут быть природными или могут быть модифицированными. При использовании в настоящем документе

«последовательность азотистых оснований» обозначает порядок смежных азотистых оснований, независимый от какого-либо сахара, связи или модификации азотистого основания.

При использовании в настоящем документ, термины «немодифицированное азотистое основание» или «природное азотистое основание» означают природные гетероциклические азотистые основания РНК или ДНК: пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) (включая 5-метил С) и урацил (U).

При использовании в настоящем документе, «модифицированное азотистое основание» означает любое азотистое основание, которое не является природным азотистым основанием.

При использовании в настоящем документе, «модифицированный нуклеозид» означает нуклеозид, содержащий по меньшей мере одну химическую модификацию, по сравнению с природными нуклеозидами РНК или ДНК. Модифицированные нуклеозиды содержат модифицированный сахарный фрагмент и/или модифицированное азотистое основание.

При использовании в настоящем документе, «бициклический нуклеозид» или «BNA» означает нуклеозид, содержащий бициклический сахарный фрагмент.

При использовании в настоящем документе, «стерически затрудненный этил-нуклеозид» или «cEt» означает нуклеозид, содержащий бициклический сахарный фрагмент, который содержит мостик 4'-СН(СН₃)-O-2'.

При использовании в настоящем документе, «нуклеозид закрытой нуклеиновой кислоты» или «LNA» означает нуклеозид, содержащий бициклический сахарный фрагмент, который содержит мостик 4'-СН₂-O-2'.

При использовании в настоящем документе, «2'-замещенный нуклеозид» означает нуклеозид, содержащий заместитель в 2'-положении, отличный от Н или ОН. Если не указано иное, то 2'-замещенный нуклеозид не является бициклическим нуклеозидом.

При использовании в настоящем документе, «дезоксинуклеозид» означает нуклеозид, содержащий 2'-Н фуранозильный сахарный фрагмент, находящийся в природных дезоксирибонуклеозидах (ДНК). В некоторых вариантах реализации 2'-дезоксинуклеозид может содержать модифицированное азотистое основание или может содержать азотистое основание РНК (например, урацил).

При использовании в настоящем документе, «олигонуклеотид» означает соединение, содержащее множество связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит один или более немодифицированных рибонуклеозидов (РНК) и/или немодифицированных дезоксирибонуклеозидов (ДНК), и/или один или более модифицированных нуклеозидов.

При использовании в настоящем документе, «олигонуклеозид» означает олигонуклеотид, в котором ни один из межнуклеозидных связей не содержит атом фосфора. При использовании в настоящем документе, олигонуклеотиды включают олигонуклеозиды.

При использовании в настоящем документе, «модифицированный олигонуклеотид» означает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один модифицированный нуклеозид и/или по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.

При использовании в настоящем документе, «связь» или «связывающая группа» означает группу атомов, которая связывает вместе две или более других групп атомов.

При использовании в настоящем документе, «межнуклеозидная связь» означает ковалентную связь между соседними нуклеозидами в олигонуклеотиде.

При использовании в настоящем документе, «природная межнуклеозидная связь» означает фосфодиэфирную связь 3' с 5'.

При использовании в настоящем документе, «модифицированная межнуклеозидная связь» означает любую межнуклеозидную связь, отличную от природной межнуклеозидной связи.

При использовании в настоящем документе, «концевая межнуклеозидная связь» означает связь между последними двумя нуклеозидами олигонуклеотида или его определенной области.

При использовании в настоящем документе, «фосфорная связывающая группа» означает связывающую группу, содержащую атом фосфора. Фосфорные связывающие группы включают, без ограничения, группы, имеющие формулу:

где:

R_a и R_d, каждый независимо, представляют собой О, S, СН₂, NH или NJ₁, где J₁ представляет собой С₁-С₆ алкил или замещенный С₁-С₆ алкил;

R_b представляет собой О или S;

R_c представляет собой ОН, SH, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси, замещенный C₁-С₆ алкокси, амино или замещенный амино; и

J₁представляет собой R₆ представляет собой О или S.

Фосфорные связывающие группы включают, без ограничения, фосфодиэфир, тиофосфат, дитиофосфат, фосфонат, фосфорамидат, фосфортиоамидат, тионоалкил-фосфонат, фосфотриэфиры, тионоалкил-фосфотриэфиры и боранофосфат.

При использовании в настоящем документе, «межнуклеозидная фосфорная связывающая группа» означает фосфорную связывающую группу, которая напрямую связывает два нуклеозида.

При использовании в настоящем документе, «не межнуклеозидная фосфорная связывающая группа» означает фосфорную связывающую группу, которая не связывает напрямую два нуклеозида. В некоторых вариантах реализации не межнуклеозидная

фосфорная связывающая группа связывает нуклеозид с группой, отличной от нуклеозида. В некоторых вариантах реализации не межнуклеозидная фосфорная связывающая группа связывает две группы, ни одна из которых не является нуклеозидом.

При использовании в настоящем документе, «нейтральная связывающая группа» означает связывающую группу, которая не имеет заряда. Нейтральные связывающие группы включают, без ограничения, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, MMI (-СН₂-N(СН₃)-O-), амид-3 (-CH₂-C(=O)-N(H)-), амид-4 (-CH₂-N(H)-C(=O)-), формацеталь (-O-СН₂-O-) и тиоформацеталь (-S-CH₂-O-). Дополнительные нейтральные связывающие группы включают неионные связи, содержащие силоксан (диалкилсилоксан), карбоксильный эфир, карбоксамид, сульфид, сульфоновый эфир и амиды (см., например: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; под ред. Y.S. Sanghvi и P.D. Cook, ACS Symposium, серия 580; главы 3 и 4, (cc. 40-65)). Дополнительные нейтральные связывающие группы включают неионные связи, содержащие смешанные составные части N, О, S и СН₂.

При использовании в настоящем документе, «межнуклеозидная нейтральная связывающая группа» означает нейтральную связывающую группу, которая напрямую связывает два нуклеозида.

При использовании в настоящем документе, «не межнуклеозидная нейтральная связывающая группа» означает нейтральную связывающую группу, которая не связывает напрямую два нуклеозида. В некоторых вариантах реализации не межнуклеозидная нейтральная связывающая группа связывает нуклеозид с группой, отличной от нуклеозида. В некоторых вариантах реализации не межнуклеозидная нейтральная связывающая группа связывает две группы, ни одна из которых не является нуклеозидом.

При использовании в настоящем документе, «олигомерное соединение» означает полимерную структуру, содержащую две или более субструктур. В некоторых вариантах реализации олигомерное соединение содержит олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации олигомерное соединение содержит одну или более конъюгированных групп и/или концевых групп. В некоторых вариантах реализации олигомерное соединение состоит из олигонуклеотида. Олигомерные соединения включают также природные нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах реализации олигомерное соединение содержит скелет одной или более связанных мономерных субъединиц, при этом каждая связанная мономерная субъединица прямо или косвенно присоединена к гетероциклическому основному фрагменту. В некоторых вариантах реализации олигомерные соединения могут содержать также мономерные субъединицы, которые не связаны с гетероциклическим основным фрагментом, обеспечивая таким образом сайты с удаленными основаниями. В

некоторых вариантах реализации связи, соединяющие мономерные субъединицы, сахарные фрагменты или заменители и гетероциклические основные фрагменты, могут быть независимо модифицированы. В некоторых вариантах реализации единица связь-сахар, которая может содержать или не содержать гетероциклическое основание, может быть замещена миметиком, таким как мономеры в пептидных нуклеиновых кислотах.

При использовании в настоящем документе, «концевая группа» означает один или более атомов, присоединенных к любому или к обоим 3'- или 5'-концам олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации концевая группа представляет собой конъюгирующую группу. В некоторых вариантах реализации концевая группа содержит один или более нуклеозидов концевой группы.

При использовании в настоящем документе, «конъюгат» или «конъюгирующая группа» означает атом или группу атомов, связанную с олигонуклеотидом или олигомерным соединением. Как правило, конъюгирующие группы модифицируют одно или более свойств соединения, к которому они присоединены, включая, но не ограничиваясь ими, свойства фармакодинамики, фармакокинетики, связывания, поглощения, клеточного распределения, клеточного захвата, заряда и/или выведения.

При использовании в настоящем документе, «конъюгирующий линкер» или «линкер» в контексте конъюгирующие группы означает часть конъюгирующие группы, содержащую любой атом или группу атомов и ковалентно связывающую (1) олигонуклеотид с другой частью конъюгирующие группы или (2) две или более частей конъюгирующие группы.

Конъюгирующие группы показаны в настоящем документе как радикалы, обеспечивающие связь для образования ковалентного присоединения к олигомерному соединению, такому как антисмысловый олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации точка присоединения у олигомерного соединения представляет собой 3'-атом кислорода 3'-гидроксильной группы 3'-концевого нуклеозида олигомерного соединения. В некоторых вариантах реализации точка присоединения у олигомерного соединения представляет собой 5'-атом кислорода 5'-гидроксильной группы 5'-концевого нуклеозида олигомерного соединения. В некоторых вариантах реализации связь для образования присоединения к олигомерному соединению представляет собой расщепляемую связь. В некоторых таких вариантах реализации такая расщепляемая связь составляет весь или часть расщепляемого фрагмента.

В некоторых вариантах реализации конъюгирующие группы содержат расщепляемый фрагмент (например, расщепляемую связь или расщепляемый нуклеозид) и часть углеводного кластера, такую как часть кластера GalNAc. Такая часть углеводного кластера содержит: нацеливающий фрагмент и, необязательно, конъюгирующий линкер. В некоторых вариантах реализации часть углеводного кластера определяют по количеству и сущности лиганда. Например, в некоторых вариантах реализации часть углеводного кластера содержит три группы GalNAc и обозначена «GalNAc₃». В некоторых вариантах реализации часть углеводного кластера содержит 4 группы GalNAc и обозначена «GalNAc₄». Конкретные части углеводных кластеров (имеющие конкретную связку, группы ветвления и конъюгирующего линкера) описаны в настоящем документе

и обозначены римской цифрой с последующим нижним индексом «а». Соответственно, «GalNac3-1_a» относится к конкретной части углеводного кластера конъюгирующие группы, имеющей 3 группы GalNac и конкретно определенную связку, группы ветвления и линкера. Такой фрагмент углеводного кластера присоединен к олигомерному соединению через расщепляемый фрагмент, такой как расщепляемая связь или расщепляемый нуклеозид.

При использовании в настоящем документе, «расщепляемый фрагмент» означает связь или группу, которая может быть расщеплена при физиологических условиях. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент расщепляется внутри клетки или во внутриклеточных отделах, таких как лизосома. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент расщепляется эндогенными ферментами, такими как нуклеазы. В некоторых вариантах реализации расщепляемый фрагмент содержит группу атомов, имеющую один, два, три, четыре или более четырех расщепляемых связей.

При использовании в настоящем документе, «расщепляемая связь» означает любую химическую связь, которая может быть расщеплена. В некоторых вариантах реализации расщепляемая связь выбрана из: амида, полиамида, сложного эфира, эфира, одного или обоих сложных эфиров фосфодиэфира, фосфатного сложного эфира, карбамата, дисульфида или пептида.

При использовании в настоящем документе, «углеводный кластер» означает соединение, имеющее один или более углеводных остатков, присоединенных к скелету или связывающей группе, (см., например, публикацию Maier et al., "Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting," Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18-29, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки, или Rensen et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor," J. Med. Chem. 2004, (47): 5798-5808, где представлены примеры углеводных конъюгированных кластеров).

При использовании в настоящем документе, «модифицированный углевод» означает любой углевод, имеющий одну или более модификаций, по сравнению с природными углеводами.

При использовании в настоящем документе, «производное углевода» означает любое соединение, которое может быть синтезировано с использованием углевода в качестве исходного материала или промежуточного соединения.

При использовании в настоящем документе, «углевод» означает природный углевод, модифицированный углевод или производное углевода.

При использовании в настоящем документе, «защитная группа» означает любое соединение или защитную группу, известную специалистам в данной области техники. Не ограничивающие примеры защитных групп представлены в публикации "Protective Groups in Organic Chemistry", Т. W. Greene, P. G. M. Wuts, ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc Нью-Йорк, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

При использовании в настоящем документе, «односпиральное» означает олигомерное соединение, которое не гибридизовано с его комплементом и которое не имеет достаточной самокомплементарностью для образования усточивого собственного дуплекса.

При использовании в настоящем документе, «двухспиральное» означает пару олигомерных соединений, которые гибридизованы друг с другом, или одно самокомплементарное олигомерное соединение, которое образует шпилечную структуру. В некоторых вариантах реализации двухспиральное олигомерное соединение содержит первое и второе олигомерное соединение.

При использовании в настоящем документе, «антисмысловое соединение» означает соединение, содержащее или состоящее из олигонуклеотида, по меньшей мере часть которого комплементарна целевой нуклеиновой кислоте, с которой возможна его гибридизация, что приводит к получению по меньшей мере одной антисмысловой активности.

При использовании в настоящем документе, «антисмысловая активность» означает любое обнаруживаемое и/или измеримое изменение, обусловленное гибридизацией антисмыслового соединения с его целевой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации антисмысловая активность включает модулирование количества или активности транскрипта целевой нуклеиновой кислоты (например, мРНК). В некоторых вариантах реализации антисмысловая активность включает модулирование сплайсинга пре-мРНК.

При использовании в настоящем документе, «антисмысловое соединение на основе РНКазы Н» означает антисмысловое соединение, в котором по меньшей мере часть антисмысловой активности антисмыслового соединения обусловлена гибридизацией антисмыслового соединения с целевой нуклеиновой кислотой и последующим расщеплением целевой нуклеиновой кислоты под действием РНКазы Н.

При использовании в настоящем документе, «антисмысловое соединение на основе RISC» означает антисмысловое соединение, в котором по меньшей мере часть антисмысловой активности антисмыслового соединения обусловлена РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC).

При использовании в настоящем документе, «обнаружение» или «измерение» означает, что выполнено испытание или анализ для обнаружения или измерения. Такое обнаружение и/или измерение может приводить к результату с нулевым значением. Следовательно, даже если испытание для обнаружения или измерения приводит к обнаружению отсутствия активности (нулевой активности), то стадия обнаружения или измерения активности была выполнена.

При использовании в настоящем документе, «обнаруживаемая и/или измеримая активность» означает статистически значимую активность, которая не является нулевой.

При использовании в настоящем документе, «по существу не измененный» означает небольшое или

отсутствие изменения конкретного параметра, в частности, по сравнению с другим параметром, который изменился гораздо больше. В некоторых вариантах реализации параметр является по существу не измененным, если его изменение составило менее 5%. В некоторых вариантах реализации параметр является по существу не измененным, если его изменение составило менее двух раз, тогда как изменение другого параметра составило по меньшей мере десять раз. Например, в некоторых вариантах реализации антисмысловая активность представляет собой изменение количества целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых таких вариантах реализации количество нецелевой нуклеиновой кислоты является по существу не измененным если оно изменяется гораздо меньше, чем изменяется количество целевой нуклеиновой кислоты, но это изменение не обязательно должно быть нулевым.

При использовании в настоящем документе, «экспрессия» означает процесс, посредством которого ген в конечном итоге преобразуется в белок. Экспрессия включает, но не ограничивается этим, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию (например, сплайсинг, полиаденилирование, добавление 5'-кэпа) и трансляцию.

При использовании в настоящем документе, «целевая нуклеиновая кислота» означает молекулу нуклеиновой кислоты, с которой предполагается гибридизация антисмыслового соединения с получением желаемой антисмысловой активности. Антисмысловые олигонуклеотиды обладают достаточной комплементарностью с их целевыми нуклеиновыми кислотами для обеспечения гибридизации при физиологических условиях.

При использовании в настоящем документе, «комплементарность азотистого основания» или «комплементарность» в отношении азотистых оснований означает азотистое основание, которое способно к спариванию оснований с другим азотистое основанием. Например, в ДНК аденин (А) комплементарен тимину (Т). Например, в РНК аденин (А) комплементарен урацилу (U). В некоторых вариантах реализации комплементарное азотистое основание означает азотистое основание антисмыслового соединения, которое способно к спариванию оснований с азотистым основанием его целевой нуклеиновой кислоты. Например, если азотистое основание в определенном положении антисмыслового соединения способно к водородному связыванию с азотистым основанием в определенном положении целевой нуклеиновой кислоты, то это положение водородного связывания между олигонуклеотидом и целевой нуклеиновой кислотой считается комплементарным по этой паре азотистых оснований. Азотистые основания, содержащие определенные модификации, могут сохранять способность к спариванию с противоположным азотистым основанием и, следовательно, все еще могут обладать комплементарностью азотистых оснований.

При использовании в настоящем документе, «не комплементарные» в отношении азотистых оснований означает пару азотистых оснований, которые не образуют водородные связи друг с другом.

При использовании в настоящем документе, «комплементарные» в отношении олигомерных соединений (например, связанных нуклеозидов, олигонуклеотидов или нуклеиновых кислот) означает способность таких олигомерных соединений или их областей к гибридизации с другим олигомерным соединением или его областью за счет комплементарности азотистых оснований. Комплементарные олигомерные соединения не обязательно должны обладать комплементарностью азотистых оснований в каждом нуклеозиде. До не которой степени допустимы некоторые несоответствия. В некоторых вариантах реализации

комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны по 70% азотистых оснований (комплементарность 70%). В некоторых вариантах реализации комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны на 80%. В некоторых вариантах реализации комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны на 90%. В некоторых вариантах реализации комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны на 95%. В некоторых вариантах реализации комплементарные олигомерные соединения или области комплементарны на 100%.

При использовании в настоящем документе, «несоответствие» означает азотистое основание первого олигомерного соединения, которое не способно спариваться с азотистым основанием в соответствующем положении второго олигомерного соединения при выравнивании первого и второго олигомерного соединения. Любое или оба первое и второе олигомерные соединения могут быть олигонуклеотидами.

При использовании в настоящем документе, «гибридизация» означает спаривание комплементарных олигомерных соединений (например, антисмыслового соединения и его целевой нуклеиновой кислоты). Не ограничиваясь конкретным механизмом, наиболее распространенный механизм спаривания включает водородное связывание, которое может представлять собой уотсон-криковское, хугстиновское или обратное хугстиновское водородное связывание между комплементарными азотистыми основаниями.

При использовании в настоящем документе, «специфически гибридизуется» означает способность олигомерного соединения гибридизоваться с одним сайтом нуклеиновой кислоты с большей аффинностью, чем оно гибридизуется с другим сайтом нуклеиновой кислоты.

При использовании в настоящем документе, «полностью комплементарный» в отношении олигонуклеотида или его части означает, что каждое азотистое основание олигонуклеотида или его части способно к спариванию с азотистым основанием комплементарной нуклеиновой кислоты или ее непрерывной частью. Следовательно, полностью комплементарная область не содержит несоответствий или не гибридизованных азотистых оснований в обеих спиралях.

При использовании в настоящем документе, «процент комплементарности» означает процент азотистых оснований олигомерного соединения, которые комплементарны равной по длине части целевой нуклеиновой кислоты. Процент комплементарности рассчитывают делением количества азотистых оснований олигомерного соединения, которые комплементарны азотистым основаниям в соответствующих положениях целевой нуклеиновой кислоты, на общую длину олигомерного соединения.

При использовании в настоящем документе, «процент идентичности» означает количество азотистых оснований в первой нуклеиновой кислоте, которые относятся к тому же типу (независимо от химической модификации), что и азотистые основания в соответствующих положениях второй нуклеиновой кислоты, деленное на общее количество азотистых оснований в первой нуклеиновой кислоте.

При использовании в настоящем документе, «модулирование» означает изменение количества или качества молекулы, функции или активности, по сравнению с количеством или качеством молекулы, функции или активности до модулирования. Например, модулирование включает изменение, как увеличение (стимуляцию или индукцию), так и снижение (ингибирование или уменьшение) генной экспрессии. В качестве дополнительного примера, модулирование экспрессии может включать изменение выбора сайта сплайсинга при процессинге пре-мРНК, что приводит к изменению абсолютного или относительного количества определенного сплайс-варианта, по сравнению с его количеством в отсутствие модулирования.

При использовании в настоящем документе, «химический мотив» означает характерный участок химических модификаций в олигонуклеотиде или его области. Мотивы могут быть определены по модификациям в определенных нуклеозидах и/или в определенных связывающих группах олигонуклеотида.

При использовании в настоящем документе, «нуклеозидный мотив» означает характерный участок нуклеозидных модификаций в олигонуклеотиде или его области. Связи такого олигонуклеотида могут быть модифицированными или немодифицированными. Если не указано иное, мотивы, описывающие в настоящем документе только нуклеозиды, представляют собой нуклеозидные мотивы. Следовательно, в таких случаях связи не ограничены.

При использовании в настоящем документе, «сахарный мотив» означает характерный участок сахарных модификаций в олигонуклеотиде или его области.

При использовании в настоящем документе, «связывающий мотив» означает характерный участок связывающих модификаций в олигонуклеотиде или его области. Нуклеозиды такого олигонуклеотида могут быть модифицированными или немодифицированными. Если не указано иное, мотивы, описывающие в настоящем документе только связи, представляют собой связывающие мотивы. Следовательно, в таких случаях нуклеозиды не ограничены.

При использовании в настоящем документе, «мотив модификации азотистого основания» означает характерный участок модификаций азотистых оснований вдоль олигонуклеотида. Если не указано иное, то мотив модификации азотистого основания не зависит от последовательности азотистых оснований.

При использовании в настоящем документе, «мотив последовательности» означает характерный участок азотистых оснований, расположенных вдоль олигонуклеотида или его

части. Если не указано иное, то мотив последовательности не зависит от химических модификаций и, следовательно, может иметь любую комбинацию химических модификация, включая отсутствие химических модификаций.

При использовании в настоящем документе, «тип модификации» в отношении нуклеозида или нуклеозида определенного «типа» означает химическую модификацию нуклеозида и включает модифицированные и немодифицированные нуклеозиды. Соответственно, если не указано иное, «нуклеозид, имеющий модификацию первого типа» может быть немодифицированным нуклеозидом.

При использовании в настоящем документе, «по-разному модифицированные» означает химические модификации или химические заместители, которые отличны друг от друга, включая их отсутствие или модификации. Так, например, МОЕ нуклеозид и немодифицированный нуклеозид ДНК являются «по-разному модифицированными», даже несмотря на то, что нуклеозид ДНК является немодифицированным. Точно так же ДНК и РНК являются «по-разному модифицированными», даже несмотря на то, что оба представляют собой природные немодифицированные нуклеозиды. Нуклеозиды, которые являются одинаковыми но содержат различные азотистые основания, не являются по-разному модифицированными. Например, нуклеозид, содержащий 2'-ОМе модифицированный сахар и немодифицированное адениновое азотистое основание, и нуклеозид, содержащий 2'-ОМе модифицированный сахар и немодифицированное тиминовое азотистое основание, не являются по-разному модифицированными.

При использовании в настоящем документе, «модификации одного типа» относится к модификациям, которые являются одинаковыми друг относительно друга, включая отсутствие модификаций. Так, например, два немодифицированных нуклеозида ДНК имеют «модификацию одного типа», даже несмотря на то, что нуклеозид ДНК является немодифицированным. Такие нуклеозиды, имеющие модификацию одного типа, могут содержать различные азотистые основания.

При использовании в настоящем документе, «отдельные области» означает части олигонуклеотида, в которых химические модификации или мотив химических модификаций любой из соседних частей содержит по меньшей мере одно отличие для обеспечения возможности различать области друг от друга.

При использовании в настоящем документе, «фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель» означает любое вещество, подходящее для использования при введении животному. В некоторых вариантах реализации фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель представляет собой стерильный соленой раствор. В некоторых вариантах реализации такой стерильный солевой раствор представляет собой солевой раствор фармацевтической марки.

При использовании в настоящем документе, термин «метаболическое расстройство» означает заболевание или состояние, которое характеризуется, прежде всего, дисрегуляцией метаболизма - сложного набора химических реакций, связанных с расщеплением пищи с выработкой энергии.

При использовании в настоящем документе, термин «сердечно-сосудистое расстройство» означает заболевание или состояние, которое характеризуется, прежде всего, ухудшенной функцией сердца или кровеносных сосудов.

При использовании в настоящем документе, термин «моно- или полициклическая кольцевая система» включает все кольцевые системы, выбранные из одиночных или

полициклических радикальных кольцевых систем, в которых указанные кольца конденсированы или связаны, и включает одиночные или смешанные кольцевые системы, индивидуально выбранные из алифатических, алициклических, арильных, гетероарильных, аралкильных, арилалкильных, гетероциклических, гетероарильных, гетероароматических и гетероарилалкильных. Такие моно- и полициклические структуры могут содержать кольца, каждое из которых имеет одинаковую степень насыщенности, или каждое независимо имеет переменные степени насыщенности, включая полностью насыщенные, частично насыщенные или полностью ненасыщенные. Каждое кольцо может содержать кольцевые атомы, выбранные из С, N, О и S с образованием гетероциклических колец, а также колец, содержащих только кольцевые атомы С, которые могут быть представлены в смешанном мотиве, как, например, в бензимидазоле, в котором одно кольцо имеет только кольцевые атомы углерода, а конденсированное кольцо имеет два атома азота. Моно- или полициклическая кольцевая система может быть дополнительно замещена группами заместителей, как, например, фталимид, который имеет две группы=O, присоединенные к одному из колец. Моно- или полициклические кольцевые системы могут быть присоединены к исходным молекулам при помощи различных способов, таких как непосредственно через кольцевой атом, путем конденсации через несколько кольцевых атомов, через группу заместителя или через бифункциональный связывающий фрагмент.

При использовании в настоящем документе, «пролекарство» означает неактивную или менее активную форму соединения, которая при введении субъекту метаболизируется с образованием активного или более активного соединения (например, лекарства).

При использовании в настоящем документе, «заместитель» и «группа заместителя» означает атом или группу, которая вытесняет атом или группу указанного исходного соединения. Например, заместитель модифицированного нуклеозида представляет собой любой атом или группу, которая отлична от атома или группы, находящейся в природном нуклеозиде (например, модифицированный 2'-заместитель представляет собой любой атом или группу в 2'-положении нуклеозида, отличную от Н или ОН). Группы заместителей могут быть защищенными или не защищенными. В некоторых вариантах реализации соединения настоящего описания имеют заместители в одном или более чем в одном положении исходного соединения. Заместители также могут быть дополнительно замещены другими группами заместителей и могут быть присоединены напрямую или через связывающую группу, такую как алкильная или углеводородная группа, к исходному соединению.

Точно так же, при использовании в настоящем документе, «заместитель» в отношении химической функциональной группы означает атом или группу атомов, которая отлична от атома или группы атомов, обычно содержащихся в указанной функциональной группе. В некоторых вариантах реализации заместитель вытесняет атом водорода функциональной группы (например, в некоторых вариантах реализации заместитель замещенной метильной группы представляет собой атом или группу, отличную от водорода, которая вытесняет один или более атомов водорода незамещенной метильной группы). Если не указано иное, группы, которые могут быть использованы в качестве заместителей, включают, без ограничения, галоген, гидроксил, алкил, алкенил, алкинил, ацил (-C(O)R_aa), карбоксил (-C(O)O-R_aa), алифатические группы, алициклические группы, алкокси, замещенный окси (-O-R_aa), арил, аралкил, гетероциклический радикал, гетероарил, гетероарилалкил, амино (-N(R_bb)(R_cc)), имино (=NR_bb), амидо (-C(O)N(R_bb)(R_cc) или -N(R_bb)C(O)R_aa), азидо (-N₃), нитро (-NO₂), циано (-CN), карбамидо (-OC(O)N(R_bb)(R_cc) или -N(R_bb)C(O)OR_aa), уреидо (-N(R_bb)C(O)N(R_bb)(R_cc)), тиоуреидо (-N(R_bb)C(S)N(R_bb)(R_cc)), гуанидинил (-N(R_bb)C(=NR_bb)N(R_bb)(R_cc)), амидинил (-C(=NR_bb)N(R_bb)(R_cc) или -N(R_bb)C(=NR_bb)(R_aa)), тиол (-SR_bb), сульфинил (-S(O)R_bb), сульфонил (-S(O)₂R_bb) и сульфонамидил (-S(O)₂N(R_bb)(R_cc) или -N(R_bb)S(O)₂R_bb). Где каждый R_aa, R_bb и R_cc независимо представляет собой Н, необязательно связанную химическую функциональную группу или дополнительную группу заместителя, при этом предпочтительный перечень включает, без ограничения, алкил, алкенил, алкинил, алифатические, алококси, ацил, арил, аралкил, гетероарил, алициклические, гетероциклические и гетероарилалкил. Выбранные заместители с соединениями, описанными в настоящем документе, находятся в рекурсивной степени.

При использовании в настоящем документе, «алкил», используемый в настоящем документе, означает насыщенный прямой или разветвленный углеводородный радикал, содержащий до двадцати четырех атомов углерода. Примеры алкильных групп включают, без ограничения, метил, этил, пропил, бутил, изопропил, н-гексил, октил, децил, додецил и т.п. Алкильные группы обычно содержат от 1 до около 24 атомов углерода, более часто от 1 до около 12 атомов углерода (С₁-С₁₂ алкил), при этом более предпочтительно от 1 до около 6 атомов углерода.

При использовании в настоящем документе, «алкенил» означает прямой или разветвленный углеводородный радикал, содержащий до двадцати четырех атомов углерода и имеющий по меньшей мере одну двойную углерод-углеродную связь. Примеры

алкенильных групп включают, без ограничения, этенил, пропенил, бутенил, 1-метил-2-бутен-1-ил, диены, такие как 1,3-бутадиен и т.п. Алкенильные группы обычно содержат от 2 до около 24 атомов углерода, более часто от 2 до около 12 атомов углерода, при этом более предпочтительно от 2 до около 6 атомов углерода. Алкенильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать одну или более дополнительных групп заместителей.

При использовании в настоящем документе, «алкинил» означает прямой или разветвленный углеводородный радикал, содержащий до двадцати четырех атомов углерода и имеющий по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь. Примеры алкинильных групп включают, без ограничения, этинил, 1-пропинил, 1-бутинил и т.п. Алкинильные группы обычно содержат от 2 до около 24 атомов углерода, более часто от 2 до около 12 атомов углерода, при этом более предпочтительно от 2 до около 6 атомов углерода. Алкинильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать одну или более дополнительных групп заместителей.

При использовании в настоящем документе, «ацил» означает радикал, образованный за счет удаления гидроксильной группы от органической кислоты, и имеет общую формулу -С(O)-Х, где X обычно является алифатическим, алициклическим или ароматическим. Примеры включают алифатические карбонилы, ароматические карбонилы, алифатические сульфонилы, ароматические сульфинилы, алифатические сульфинилы, ароматические фосфаты, алифатические фосфаты и т.п. Ацильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.

При использовании в настоящем документе, «алициклическая» означает циклическую кольцевую систему, в которой кольцо является алифатическим. Кольцевая система может содержать одно или более колец, при этом по меньшей мере одно кольцо является алифатическим. Предпочтительные алициклические системы включают кольца, имеющие от около 5 до около 9 атомов углерода в кольце. Алициклические группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.

При использовании в настоящем документе, «алифатический» означает прямой или разветвленный углеводородный радикал, содержащий до двадцати четырех атомов углерода, в котором насыщенность между любыми двумя атомами углерода представляет собой

одинарную, двойную или тройную связь. Алифатическая группа предпочтительно содержит от 1 до около 24 атомов углерода, более часто от 1 до около 12 атомов углерода, при этом более предпочтительно от 1 до около 6 атомов углерода. Прямая или разветвленная цепь алифатической группы может быть прервана одним или более гетероатомами, которые включают азот, кислород, серу и фосфор. Такие алифатические группы, прерванные гетероатомами, включают, без ограничения, полиалкокси, такие как полиалкиленгликоли, полиамины и полиимины. Алифатические группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.

При использовании в настоящем документе, «алкокси» означает радикал, образованный между алкильной группой и атомом кислорода, при этом атом кислорода используется для присоединения алкокси-группы к исходной молекуле. Примеры алкокси-групп включают, без ограничения, метокси, этокси, пропокси, изопропокси, н-бутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, н-пентокси, неопентокси, н-гексокси и т.п. Алкокси-группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.

При использовании в настоящем документе, «аминоалкил» означает аминезамещенный С₁-С₁₂алкильный радикал. Алкильная часть указанного радикала образует ковалентную связь с исходной молекулой. Аминогруппа может быть расположена в любом положении, и аминоалкильная группа может быть замещена дополнительной группой заместителя в алкильной и/или амино-части.

При использовании в настоящем документе, «аралкил» и «арилалкил» означает ароматическую группу, которая ковалентно связана с С₁-С₁₂ алкильным радикалом. Часть алкильного радикала образовавшейся аралкильной (или арилалкильной) группы образует ковалентную связь с исходной молекулой. Примеры включают, без ограничения, бензил, фенетил и т.п. Аралкильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей, присоединенные к алкильной, арильной или к обеим группам, которые образуют указанную радикальную группу.

При использовании в настоящем документе, «арил» и «ароматический» означат, радикалы моно- или полициклической карбоциклической кольцевой системы, имеющие одно или более ароматических колец. Примеры арильных групп включают, без ограничения,

фенил, нафтил, тетрагидронафтил, инданил, инденил и т.п. Предпочтительные арильные кольцевые системы имеют от около 5 до около 20 атомов углерода в одном или более кольцах. Арильные группы, используемые в настоящем документе, могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.

При использовании в настоящем документе, «галогено» и «галоген» означает атом, выбранный из фтора, хлора, брома и йода.

При использовании в настоящем документе, «гетероарил» и «гетероароматический» означает радикал, содержащий моно- или полициклическое ароматическое кольцо, кольцевую систему или конденсированную кольцевую систему, в котором по меньшей мере одно из колец является ароматическим и содержит один или более гетероатомов. Гетероарил включает также конденсированные кольцевые системы, включая системы, в которых одно или более из конденсированных колец не содержат гетероатомов. Гетероарильные группы, как правило, содержат один кольцевой атом, выбранный из серы, азота или кислорода. Примеры гетероарильных групп включают, без ограничения, пиридинил, пиразинил, пиримидинил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тиазолил, оксазолил, изооксазолил, тиадиазолил, оксадиазолил, тиофенил, фуранил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, бензоксазолил, хиноксалинил и т.п. Гетероарильные радикалы могут быть присоединены к исходной молекуле напрямую или через связывающий фрагмент, такой как алифатическая группа или гетероатом. Гетероарильные группы, используемые в настоящем документе могут необязательно содержать дополнительные группы заместителей.

При использовзании в настоящем документе, «конъюгированное соединение» означает любые атомы, группы атомов или группу связанных атомов, подходящую для применения в качестве конъюгирующие группы. В некоторых вариантах реализации конъюгированные соединения могут обладать или влиять на одно или более свойств, включая, но не ограничиваясь этим, свойства фармакодинамики, фармакокинетики, связывания, адсорбции, клеточного распределения, клеточного захвата, заряда и/или выведения.

При использовании в настоящем документе, если не указано или немодифицировано иным образом, «двухспиральные» относится к двум отдельным олигомерным соединениям, которые гибридизованы друг с другом. Такие двухспиральные соединения могут иметь один или более не гибридизованных нуклеозидов у одного или обоих концов одной или обеих спиралей (выступы) и/или один или более внутреннийх не

гибридизованных нуклеозидов (несоответствий), при условии, что существует достаточная комплементарность для сохранения гибридизации при физиологически релевантных условиях.

При использовании в настоящем документе «5'-сайт-мишень» относится к нуклеотиду целевой нуклеиновой кислоты, который комплементарен 5'-основному нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.

При использовании в настоящем документе термин «около» обозначает в пределах ± 10% от значения. Например, если указано, что «маркер может быть увеличен на около 50%», то подразумевается, что маркер может быть увеличен на значение в диапазоне 45%-55%.

При использовании в настоящем документе выражение «введенные параллельно» относится к совместному введению двух средств любым способом, при котором фармакологическое действие обоих средств проявляется у пациента одновременно. При параллельном введении не требуется, чтобы оба агенты были введены в одной фармацевтической композиции, в одной лекарственной форме или одним способом введения. Действие обоих средств не обязательно должно проявляться одновременно. Их действие должно лишь перекрываться в течение определенного периода времени, и оно не обязательно должно иметь одинаковую протяженность по времени.

При использовании в настоящем документе термин «введение» обозначает предоставление фармацевтического агента индивидууму, и включает, но не ограничивается этим, введение медицинским специалистом или самостоятельное введение. Введение фармацевтического агента индивидууму может быть непрерывным, хроническим, кратковременным или периодическим. Введение может быть парентеральным или не парентеральным.

При использовании в настоящем документе «агент» обозначает активное вещество, которое может обеспечивать благоприятный терапевтический эффект при введении животному. «Первый агент» обозначает терапевтическое соединение согласно настоящему изобретению. Например, первое средство может быть антисмысловым олигонуклеотидом, нацеленным на аро(а). «Второй агент» обозначает второе терапевтическое соединение согласно настоящему изобретению (например, второй антисмысловый олигонуклеотид, нацеленный на аро(а)) и/или не-аро(а) терапевтическое соединение.

При использовании в настоящем документе «улучшение» или «улучшать», или «улучшающий» относится к снижению по меньшей мере одного показателя, признака или симптома ассоциированного заболевания, расстройства или состояния. Тяжесть показателей может быть определена при помощи субъективных или объективных оценок, известных специалистам в данной области.

Используемый в настоящем документе термин «животное» относится к человеку или животному, не являющемуся человеком, включая, но не ограничиваясь ими, мышей, крыс, кроликов, собак, котов, свиней и приматов, не являющихся человеком, включая, но не ограничиваясь ими, обезьян и шимпанзе.

При использовании в настоящем документе «apo(a)» означает любую последовательность нуклеиновых кислот или белковую последовательность, кодирующую аро(а). Например, в некоторых вариантах реализации аро(а) включает последовательность ДНК, кодирующую аро(а), последовательность РНК, транскрибированную из ДНК, кодирующей аро(а) (включая геномную ДНК, содержащую интроны и экзоны), последовательность мРНК, кодирующую аро(а), или пептидную последовательность, кодирующую аро(а).

При использовании в настоящем документе «нуклеиновая кислота аро(а)» означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую аро(а). Например, в некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота аро(а) включает последовательность ДНК, кодирующую аро(а), последовательность РНК, транскрибированную из ДНК, кодирующей аро(а) (включая геномную ДНК, содержащую интроны и экзоны), и последовательность мРНК, кодирующую аро(а).

При использовании в настоящем документе «мРНК аро(а)» означает мРНК, кодирующую белок аро(а).

При использовании в настоящем документе «белок аро(а)» означает любую белковую последовательность, кодирующую Аро(а).

При использовании в настоящем документе «специфический ингибитор аро(а)» относится к любому агенту, способному специфически ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты аро(а) и/или белка аро(а). Например, специфические ингибиторы аро(а) включают нуклеиновые кислоты (в том числе антисмысловые соединения), пептиды, антитела, небольшие молекулы и другие агенты, способные ингибировать экспрессию нуклеиновую кислоту аро(а) и/или белка аро(а). В некоторых вариантах реализации изобретения за счет специфического модулирования экспрессии нуклеиновой кислоты аро(а)

и/или экспрессии белка аро(а), специфические ингибиторы аро(а) могут влиять на другие компоненты липидной транспортной системы, включая последующие компоненты. Точно так же, в некоторых вариантах реализации специфические ингибиторы аро(а) могут влиять на другие молекулярные процессы у животного.

При использовании в настоящем документе «атеросклероз» означает затвердевание артерий, поражающее крупные и средние артерии, и характеризуется наличием жировых отложений. Жировые отложения называют «атеромами» или «бляшками», которые состоят, в основном, из холестерина и других жиров, кальция и рубцовой ткани, и они повреждают выстилку артерий.

При использовании в настоящем документе «коронарная болезнь сердца (CHD)» означает сужение мелких кровяных сосудов, которые поставляют кровь и кислород в сердце, что зачастую приводит к атеросклерозу.

При использовании в настоящем документе «сахарный диабет» или «диабет» представляет собой синдром, характеризующийся нарушенным метаболизмом и патологически высоким содержанием сахара в крови (гипергликемией) из-за недостаточного содержания инсулина или сниженной чувствительности к инсулину. Характерные симптомы представляют собой избыточное выделение мочи (полиурия) из-за высокого содержания глюкозы в крови, избыточную жажду и повышенное потребление жидкости (полидипсия) в попытке компенсировать усиленное мочевыделение, расплывчатое зрение из-за того, что высокое содержание глюкозы в крови влияет на оптические свойства глаз, необъяснимую потерю веса и летаргию.

При использовании в настоящем документе «диабетическая дислипидемия» или «диабет 2 типа с дислипидемией» означает состояние, характеризующееся диабетом 2 типа, сниженным содержанием HDL-C, повышенным уровнем триглицеридов (TG) и повышенным уровнем мелких, плотных частиц LDL.

При использовании в настоящем документе «разбавитель» обозначает ингредиент в композиции, который не обладает фармакологической активностью, но является фармацевтически необходимым или желательным. Например, разбавитель в композиции для инъекций может быть жидкостью, например, солевым раствором.

При использовании в настоящем документе «дислипидемия» относится к нарушению метаболизма липидов и/или липопротеинов, включая избыточную выработку или дефицит липидов и/или липопротеинов. Дислипидемия может проявляться в повышении содержания

липидов, таких как хиломикрон, холестерин и триглицериды, а также липопротеинов, таких как холестерин липопротеинов низкой плотности (LDL).

При использовании в настоящем документе «лекарственная форма» означает форму, в которой представлен фармацевтический агент, например, пилюлю, таблетку или другую лекарственную форму, известную в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения лекарственная форма представляет собой ампулу, содержащую лиофилизированный антисмысловый олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации лекарственная форма представляет собой ампулу, содержащую восстановленный антисмысловый олигонуклеотид.

При использовании в настоящем документе «доза» обозначает определенное количество фармацевтического агента, которое обеспечивается при разовом введении или в течение определенного периода времени. В некоторых вариантах реализации доза может быть введена одним, двумя или более болюсами, таблетками или инъекциями. Например, в некоторых вариантах реализации, в которых желательно подкожное введение, для требуемой дозы необходим объем, который трудно ввести за одну инъекцию, поэтому можно использовать две или более инъекций для достижения требуемой дозы. В некоторых вариантах реализации фармацевтический агент вводят инфузией в течение продолжительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть определены как количество фармацевтического средства в час, день, неделю или месяц. Дозы также могут быть указаны в мг/кг или г/кг.

При использовании в настоящем документе «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» означает количество активного фармацевтического агента, достаточное для достижения желаемого физиологического результата у индивидуума, нуждающегося в таком агенте. Эффективное количество может варьироваться у различных индивидуумов в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, таксономической группы индвидуумов, подлежащих лечению, состава композиции, оценки индивидуального, состояния здоровья и других релевантных факторов.

При использовании в настоящем документе «полная комплементарность» или «100% комплементарность» означает, что каждое азотистое основание последовательности азотистых оснований первой нуклеиновой кислоты имеет комплементарное азотистое основание во второй последовательности азотистых оснований второй нуклеиновой кислоты В некоторых вариантах реализации первая нуклеиновая кислота представляет собой

антисмысловое соединение, а вторая нуклеиновая кислота представляет собой целевую нуклеиновую кислоту.

При использовании в настоящем документе «глюкоза» представляет собой моносахарид, используемый клетками в качестве источника энергии и воспалительного посредника. «Глюкоза в плазме» относится к содержанию глюкозы в плазме.

При использовании в настоящем документе «холестерин липопротеина высокой плотности» или «HDL-С» означает холестерин, связанный с частицами липопротеина высокой плотности. Концентрацию HDL-С в сыворотке (или в плазме) обычно определяют в мг/дл или в нмоль/л. «HDL-С в сыворотке» и «HDL-С в плазме» означает содержание HDL-С в сыворотке и плазме, соответственно.

При использовании в настоящем документе «ингибитор редуктазы HMG-СоА» означает агент, который действует за счет ингибирования фермента редуктазы HMG-CoA, такой как аторвастатин, розувастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин и симвастатин.

При использовании в настоящем документе «гиперхолестеринемия» означает патологическое состояние, характеризующееся повышенным холестерином или циркулирующим холестерином (в плазме), LDL-холестерином и VLDL-холестерином, согласно указаниям Заключения экспертной группы Национальной холестериновой образовательной программы (NCEP) по определению, оценке и лечению высокого уровня холестерина у взрослых людей (см., Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39).

При использовании в настоящем документе «гиперлипидемия» или «гиперлипемия» представляет собой патологическое состояние, характеризующееся повышенным, содержанием липидов в сыворотке или циркулирующих липидов (в плазме). Это состояние проявляется в патологически высоких концентрациях жиров. Липидная фракция в циркулирующей крови представляет собой холестерин, липопротеины низкой плотности, липопротеины очень низкой плотности, хиломикроны и триглицериды. Классификация гиперлипидемий по Фредриксону основана на каскаде TG и содержании богатых на холестерин липопротеиновых частиц, измеренном электрофорезом или ультрацентрифугированием и обычно используемом для характеристики основных причин гиперлипидемий, таких как гипертриглицеридемия (Fredrickson and Lee, Circulation. 1965, 31:321-327; Fredrickson et al., New Eng J Med, 1967,276 (1): 34-42).

При использовании в настоящем документе «гипертриглицеридемия» означает состояние, характеризующееся повышенными уровнями триглицеридов. Ее этиология включает первичные (т.е. генетические причины) и вторичные (другие первопричины, такие

как диабет, метаболический синдром/инсулинорезистентность, ожирение, физическая инертность, табакокурение, избыточное употребление алкоголя и пищи с очень высоким содержанием углеводов) факторы или, более часто, комбинацию обоих факторов (Yuan et al. CMAJ, 2007, 176:1113-1120).

При использовании в настоящем документе «идентификация» или «выбор животного с метаболическим или сердечно-сосудистым заболеванием» означает определение или выбор субъекта, предрасположенного или диагностированного с метаболическим заболеванием, сердечно-сосудистым заболеванием или метаболическим синдромом; или определение или выбор субъекта, имеющего любой симптом метаболического заболевания, сердечно-сосудистого заболевания или метаболического синдрома, включая, но не ограничиваясь ими, гиперхолестеринемию, гипергликемию, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию, гипертонию, повышенную инсулинорезистентность, пониженную чувствительность к инсулину, увеличенную массу тела и/или увеличенное содержание жира у, или любую их комбинацию. Такая идентификация может быть выполнена любым способом, включая, но не ограничиваясь ими, стандартные клинические испытания или оценки, такие как измерение холестерина в сыворотке или циркулирующего холестерина (в плазме), измерение глюкозы в сыворотке или циркулирующей глюкозы (в плазме), измерение триглицеридов в сыворотке или циркулирующих триглицеридов (в плазме), измерение кровяного давления, измерение содержания жира у, измерение массы тела и т.п.

При использовании в настоящем документе, «улучшенный сердечно-сосудистый результат» означает снижение возникновения неблагоприятных сердечно-сосудистых явлений или их риска. Примеры неблагоприятных сердечно-сосудистых явлений включают, без ограничения, смерть, повторный инфаркт, инсульт, кардиогенный шок, отек легких, остановку сердца и атриальную аритмию.

При использовании в настоящем документе «непосредственно рядом» означает, что между элементами, расположенными непосредственно рядом, не существует промежуточных элементов, например, между областями, сегментами, нуклеотидами и/или нуклеозидами.

При использовании в настоящем документе «увеличение HDL» или «повышение HDL» означает повышение уровня HDL у животного после введения по меньшей мере одного соединения согласно настоящему изобретению, по сравнению с уровнем HDL у животного, которому не вводили ни одного соединения.

При использовании в настоящем документе «индивидуум» или «субъект», или «животное» означает человека или животное, не являющееся человеком, выбранное для лечения или терапии.

При использовании в настоящем документе «индивидуум, нуждающийся в этом» относится к человеку или животному, не являющемуся человеком, выбранному для лечения или терапии, которое нуждается в таком лечении или терапии.

При использовании в настоящем документе «вызывает», «ингибирует», «потенцирует», «повышает», «увеличивает», «снижает», «уменьшает» или подобные термины означают количественное различие между двумя состояниями. Например, «количество, эффективное для ингибирования активности или экспрессии аро(а)», обозначает, что уровень активности или экспрессии аро(а) в обработанном образце отличается от уровня активности или экспрессии аро(а) в необработанном образце. Такие термины применяют, например, к уровням экспрессии и уровням активности.

При использовании в настоящем документе «воспалительное состояние» относится к заболеванию, болезненному состоянию, синдрому или другому состоянию, приводящему к воспалению. Например, ревматоидный артрит и фиброз печени представляют собой воспалительные состояния. Другие примеры воспалительных состояний включают сепсис, ишемию миокарда/реперфузионное повреждение, респираторный дистресс-синдром взрослых, нефрит, отторжение трансплантата, воспалительную болезнь кишечника, рассеянный склероза, артериосклероз, атеросклероз и васкулит.

При использовании в настоящем документе «ингибирование экспрессии или активности» относится к снижению или блокированию экспрессии или активности РНК или белка и не обязательно обозначает полное исключение экспрессии или активности.

При использовании в настоящем документе «инсулинорезистентность» определяется как состояние, при котором нормальные количества инсулина недостаточны для получения нормального ответа на инсулин от жировых, мышечных и печеночных клеток. Инсулинорезистентность в жировых клетках приводит к гидролизу запасенных триглицеридов, что повышает содержание свободных жирных кислот в плазме крови. Инсулинорезистентность в мышцах снижает поглощение глюкозы, а инсулинорезистентность в печени снижает запас глюкозы, и оба эффекта приводят к повышению глюкозы в крови. Высокие уровни инсулина и глюкозы в плазме из-за инсулинорезистентности зачастую приводят к метаболическому синдрому и диабету 2 типа.

При использовании в настоящем документе «чувствительность к инсулину» представляет собой меру эффективности переработки глюкозы у индивидуума. Индивидуум

с высокой чувствительностью к инсулину эффективно перерабатывает глюкозу, тогда как индивидумм с низкой чувствительностью к инсулину перерабатывает глюкозу неэффективно.

При использовании в настоящем документе «понижение содержания липидов» означает уменьшение содержания одного или более липидов (например, LDL, VLDL) у субъекта. «Повышение содержания липидов» означает увеличение содержания липидов (например, HDL) у субъекта. Понижение или повышение уровня липидов может возникать при введении одной или более доз с течением времени.

При использовании в настоящем документе «терапия для понижения содержания липидов» или «агент для понижения содержания липидов» означает терапевтический режим, предоставленный субъекту для снижения содержания одного или более липидов у субъекта. В некоторых вариантах реализации терапия для понижения содержания липидов предоставлена для снижения одного или более из аро(а), СЕТР, ароВ, общего холестерина, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, не-HDL-C, триглицеридов, мелких плотных частиц LDL и Lp(a) у субъекта. Примеры терапии для понижения содержания липидов включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы ароВ, статины, фибраты и ингибиторы МТР.

При использовании в настоящем документе «липопротеин», такой как VLDL, LDL и HDL, относится к группе белков, находящихся в сыворотке, плазме и лимфе, которые важны для транспорта липидов. Химический состав каждого липопротеина различен, например, HDL имеет более высокое содержание белка по сравнению с липидом, a VLDL имеет более низкое содержание белка по сравнению с липидом.

При использовании в настоящем документе термин «Lp(a)» включает аро(а) и LDL-подобные частицы, содержащие ароВ. Аро(а) связан с ароВ дисульфидной связью.

При использовании в настоящем документе «холестерин липопротеина низкой плотности (LDL-C)» означает холестерин, содержащийся в частицах липопротеина низкой плотности. Концентрацию LDL-C в сыворотке (или в плазме) обычно определяют в м.г/дл или в нмоль/л. «LDL-С в сыворотке» и «LDL-С в плазме» означает содержание LDL-C в сыворотке и плазме, соответственно.

При использовании в настоящем документе «основные факторы риска» относится к факторам, которые способствуют высокому риску конкретного заболевания или состояния. В некоторых вариантах реализации изобретения основные факторы риска для коронарной болезни сердца включают, без ограничения, табакокурение, гипертонию, высокое содержание LDL, низкое содержание HDL-C, семейный анамнез коронарной болезни сердца, возраст и другие факторы, описанные в настоящем документе.

При использовании в настоящем документе «метаболическое расстройство» или «метаболическое заболевание» относится к состоянию, характеризующемуся изменением или

нарушением метаболической функции. «Метаболический» и «метаболизм» представляют собой термины, общеизвестные в данной области техники, и обычно включают весь диапазон биохимических процессов, происходящих в живом организме. Метаболические расстройства включают, но не ограничиваются ими, гипергликемию, преддиабет, диабет (типа 1 и типа 2), ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром и дислипидемию на фоне диабета 2 типа.

При использовании в настоящем документе «метаболический синдром» означает состояние, характеризующееся кластерообразование липидных и нелипидных сердечно-сосудистых факторов риска метаболического происхождения. В некоторых вариантах реализации изобретения метаболический синдром определяют по наличию любых 3 из следующих факторов: окружность талии более 102 см у мужчин или более 88 см у женщин; содержание триглицеридов в сыворотке по меньшей мере 150 мг/дл; содержание HDL-C менее 40 мг/дл у мужчин или менее 50 мг/дл у женщин; кровяное давление по меньшей мере 130/85 мм рт. ст.; и содержание глюкозы натощак по меньшей мере 110 мг/дл. Эти детерминанты могут быть легко измерены в клинической практике (JAMA, 2001, 285: 2486 - 2497).

«Парентеральное введение» обозначает введение инъекцией или инфузией. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например, интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение. Введение может быть непрерывным, хроническим, кратковременным или периодическим.

При использовании в настоящем документе «пептид» обозначает молекулу, образованную связыванием по меньшей мере двух аминокислот амидными связями. Пептид относится к полипептидам и белкам.

При использовании в настоящем документе «фармацевтический агент» обозначает вещество, которое обеспечивает благоприятный терапевтический эффект при введении индивидууму. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловый олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), представляет собой фармацевтический агент.

При использовании в настоящем документе «фармацевтическая композиция» или «композиция» означает смесь веществ, подходящая для введения индивидууму. Например, фармацевтическая композиция может содержать один или более активных агентов и фармацевтический носитель, например, стерильный водный раствор.

При использовании в настоящем документе «фармацевтически приемлемое производное» включает производные соединений, описанных в настоящем документе, такие как сольваты, гидраты, сложные эфиры, пролекарства, полиморфы, изомеры, меченные изотопами разновидности, фармацевтически приемлемые соли и другие производные, известные в данной области техники.

При использовании в настоящем документе «фармацевтически приемлемые соли» обозначает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, то есть соли, которые сохраняют желаемую биологическую активность исходного соединения и не наделяют его нежелательным токсикологическим действием. Термин «фармацевтически приемлемая соль» или «соль» включает соль, полученную из фармацевтически приемлемых нетоксичных кислот или оснований, включая неорганические или органические кислоты и основания. «Фармацевтически приемлемые соли» соединений, описанных в настоящем документе, могут быть получены по общеизвестным в данной области техники способам. Обзор фармацевтически приемлемых солей представлен в публикации Stahl и Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Вайнхайм, Германия, 2002). Натриевые соли антисмысловых олигонуклеотидов являются пригодными и приемлемыми для терапевтического введения людям. Соответственно, в одном из вариантов реализации соединения, описанные в настоящем документе, представлены в форме натриевой соли.

При использовании в настоящем документе «часть» обозначает определенное количество смежных (то есть связанных) азотистых оснований нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации часть является определенным количеством смежных азотистых оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации часть является определенным количеством смежных азотистых оснований антисмыслового соединения.

При использовании в настоящем документе «предупреждать» или «предупреждение» относится к отсрочке или предотвращению возникновения или развития заболевания, расстройства или состояния в течение периода времени от нескольких минут до бесконечности. Предупреждение означает также снижение риска развития заболевания, расстройства или состояния.

При использовании в настоящем документе «повышение» означает увеличение количества. Например, повышение уровня HDL в плазме означает увеличение количества HDL в плазме.

При использовании в настоящем документе «снижение» означает уменьшение до меньшей степени, размера, количества или числа. Например, снижение уровня триглицеридов в плазме означает уменьшение количества триглицеридов в плазме.

При использовании в настоящем документе «область» или «целевая область» определяют как часть целевой нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере одну идентифицируемую структуру, функцию или характеристику. Например, целевая область может охватывать 3' нетранслируемую область (UTR), 5' нетранслируемую область, экзон, интрон, экзон-интронное сочленение, кодирующую область, область инициации трансляции, область обрыва трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Структурно определенные области для аро(а) могут быть получены по номеру доступа из базы данных последовательностей, такой как NCBI, и такая информация включена в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах реализации целевая область может охватывать последовательность от 5' сайта-мишени любого целевого сегмента в пределах целевой области от 3' сайта-мишени другого целевого сегмента в пределах целевой области.

При использовании в настоящем документе «второй агент» или «второй терапевтический агент» означает агент, который может быть использован в комбинации с «первым агентом». Второй терапевтический агент может включать, но не ограничивается ими, антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на аро(а) или ароВ. Второй агент также может включать анти-аро(а) антитела, ингибиторы пептида аро(а), агенты для понижения холестерина, агенты для понижения липидов, агенты для понижения глюкозы и противовоспалительные агенты.

При использовании в настоящем документе «сегменты» определяют как более мелкие или субфрагменты областей нуклеиновой кислоты. Например, «целевой сегмент» обозначает последовательность нуклеотидов целевой нуклеиновой кислоты, на которую нацелено одно или несколько антисмысловых соединений. «Сайт-мишень 5'» относится к 5'-основному нуклеотиду целевого сегмента.«Сайт-мишень 3'» относится к 3'-основному нуклеотиду целевого сегмента. Альтернативно, «сайт инициации» может относиться к 5'-основному нуклеотиду целевого сегмента, а «терминирующий сайт» относится к 3'-основному нуклеотиду целевого сегмента. Целевой сегмент также может начинаться с «сайта инициации» одной последовательности и заканчиваться у «терминирующего сайта» другой последовательности.

При использовании в настоящем документе «статин» означает агент, который подавляет активность редуктазы HMG-CoA.

При использовании в настоящем документе «подкожное введение» обозначает введение непосредственно под кожу.

При использовании в настоящем документе «субъект» обозначает человека или животное, не являющееся человеком, выбранное для лечения или терапии.

При использовании в настоящем документе «симптом сердечно-сосудистого заболевания или расстройства» означает явление, которое возникает в результате и сопутствует сердечно-сосудистому заболеванию или расстройству и служит его признаком. Например, симптомы сердечно-сосудистого заболевания или расстройства представляют собой стенокардия; боль в груди, одышка, учащенное сердцебиение; слабость; головокружение; тошнота; потоотделение; тахикардия; брадикардия; аритмия; мерцательная аритмия; опухание нижних конечностей; цианоз; усталость; обморок; онемение лица; онемение конечностей, хромота или судороги мышц; вздутие живота; или лихорадка.

При использовании в настоящем документе «нацеливание» или «нацеленный» обозначает процесс разработки и выбора антисмыслового соединения, которое будет специфически гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой и вызывать требуемый эффект.

При использовании в настоящем документе «терапевтически эффективное количество» обозначает количество фармацевтического агента, которое обеспечивает индивидууму благоприятный терапевтический эффект.

При использовании в настоящем документе «терапевтическое изменение образа жизни» означает изменение питания и образа жизни, направленное на снижение массы жировой/адипозной ткани и/или холестерина. Такое изменение может снижать риск развития сердечного заболевания и может включать рекомендации по диетическому употреблению общих суточных калорий, общих жиров, насыщенных жиров, полиненасыщенных жиров, мононенасыщенных жиров, углеводов, белков, холестерина, нерастворимых волокон, а также рекомендации по физической активности.

При использовании в настоящем документе «лечить» или «лечение» относится к введению соединения, описанного в настоящем документе, для обеспечения изменения или облегчения заболевания, расстройства или состояния.

При использовании в настоящем документе «триглицерид» или «TG» обозначает липид или нейтральный жир, состоящий из глицерина, связанного с тремя молекулами жирной кислоты.

При использовании в настоящем документе «диабет 2 типа» (известный также как «сахарный диабет 2 типа», «сахарный диабет, 2 тип», «инсулинонезависимый диабет», «NIDDM», «диабет на фоне ожирения» или «диабет взрослого возраста») представляет, собой метаболическое расстройство, которое характеризуется, главным образом, инсулинорезистентностью, относительным дефицитом инсулина и гипергликемией.

Некоторые варианты реализации изобретения

В некоторых вариантах реализации соединение содержит миРНК или антисмысловый олигонуклеотид, нацеленный на аполипопротеин (а) (аро(а)), известный в данной области техники, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на аро(а), которые подходят для конъюгации, включают, но не ограничиваются ими, те, которые описаны в WO 2013/177468; US 8,673,632; US 7,259,150; и публикации заявки на патент США №US 2004/0242516; полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 12-130, 133, 134, описанных в WO 2013/177468, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 11-45 и 85-96, описанных в US 8673632, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 11-45, описанных в US 7259150, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации соединение содержит антисмысловый олигонуклеотид, имеющий последовательность азотистых оснований любой из SEQ ID NO 7-41, описанных в публикации заявки на патент США №US 2004/0242516, и конъюгирующую группу, описанную в настоящем документе. Последовательности азотистых оснований всех вышеупомянутых справочных SEQ ID NO включены в настоящий документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации изобретения приведены соединения и способы снижения экспрессии мРНК и белка аро(а). В некоторых вариантах реализации соединение представляет собой специфический ингибитор аро(а) для лечения, предупреждения или облегчения заболевания, связанного с аро(а). В некоторых вариантах реализации соединение представляет собой антисмысловый олигонуклеотид, нацеленный на аро(а). В некоторых вариантах реализации соединение представляет собой антисмысловый олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу.

В некоторых вариантах реализации приведены соединения и способы снижения уровней Lp(a). В некоторых вариантах реализации соединение представляет собой специфический ингибитор аро(а) для лечения, предупреждения или облегчения заболевания, связанного с Lp(a). В некоторых вариантах реализации соединение представляет собой антисмысловый олигонуклеотид, нацеленный на аро(а). В некоторых вариантах реализации соединение представляет собой антисмысловый олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации модифицированный олигонуклеотид с конъюгирующей группой состоит из 15-30, 18-24, 19-22, 13-25, 14-25, 15-25 связанных нуклеозидов, в некоторых вариантах реализации модифицированный олигонуклеотид с конъюгирующей группой содержит по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29 или 30 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации модифицированный олигонуклеотид с конъюгирующей группой состоит из 20 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а) и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей

мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований, комплементарных равной по длине части любой из SEQ ID NO: 1-4.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на сегмент аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований, комплементарных равной по длине части любого из целевых сегментов, представленных, например, в Примерах 114 и 117. В этих таблицах «сайт инициации» относится к 5'-основному нуклеотиду целевого сегмента, а «терминирующий сайт» относится к 3'-основному нуклеотиду целевого сегмента. Целевой сегмент может иметь длину от сайта инициации до терминирующего сайта каждой последовательности, перечисленной в таблицах. Альтернативно, целевой сегмент может иметь длину от сайта инициации одной последовательности до конца терминирующего сайта другой последовательности. Например, как показано в Таблице 125, целевой сегмент может иметь длину от 3901 до 3920, от сайта инициации до терминирующего сайта SEQ ID NO: 58. В другом примере, как показано в Таблице 125, целевой сегмент может иметь длину от 3900 до 3923, от сайта инициации SEQ ID NO: 57 до терминирующего сайта SEQ ID NO: 61.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом последовательность азотистых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарна любой из SEQ ID NO: 1-4. В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом последовательность азотистых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарна любому из целевых сегментов, представленных, например, в Примерах 114 и 117.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и содержит последовательность азотистых оснований, содержащую часть из по меньшей мере

8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований, комплементарных равной по длине части азотистых оснований 3901-3920 SEQ ID NO:1, причем указанная последовательность азотистых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 80% комплементарна к SEQ ID NO:1.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и содержит последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29 или 30 смежных азотистых оснований, комплементарных равной по длине части азотистых оснований 3900-3923 SEQ ID NO:1, причем указанная последовательность азотистых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 80% комплементарна к SEQ ID NO:1.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO: 12-130, 133, 134. В некоторых вариантах реализации модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:12-130, 133,134. В некоторых вариантах реализации соединение состоит из любой из SEQ ID NO:12-130, 133, 134 и конъюгирующие группы.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:12-20, 22-33, 35-44, 47-50, 51, 53, 57-62, 65-66, 68, 70-79, 81, 85-86, 89-90, 92-94, 97, 105-110, 103-104, 133-134. В некоторых вариантах реализации соединение состоит из любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:12-20, 22-33, 35-44, 47-50, 51, 53, 57-62, 65-66, 68, 70-79, 81, 85-86, 89-90, 92-94, 97, 105-110, 103-104, 133-134 и конъюгирующие группы.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:12-19, 26-30, 32, 35, 38-44, 46-47, 50, 57-58, 61, 64-66, 68, 72-74, 76-77, 92-94, 103-110. В некоторых вариантах реализации соединение состоит из любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:12-19, 26-30, 32, 35, 38-44, 46-47, 50, 57-58, 61, 64-66, 68, 72-74, 76-77, 92-94, 103-110 и конъюгирующие группы.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:111, 114-121, 123-129. В некоторых

вариантах реализации соединение состоит из любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:111, 114-121, 123-129 и конъюгирующие группы.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:14, 17, 18, 26-28, 39, 71, 106-107. В некоторых вариантах реализации соединение состоит из любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:14, 17, 18, 26-28, 39, 71, 106-107 и конъюгирующие группы.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:14,26-29, 39-40, 82. В некоторых вариантах реализации соединение состоит из любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO: 14,26-29, 39-40, 82 и конъюгирующие группы.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей море 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:14, 16-18. В некоторых вариантах реализации соединение состоит из любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:14, 16-18 и конъюгирующие группы.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований любой из ' последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO: 26-27, 107. В некоторых вариантах реализации соединение состоит из любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:26-27, 107 и конъюгирующие группы.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по, меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:28-29, 39-40, 47. В некоторых вариантах реализации соединение состоит из любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO::28-29, 39-40, 47 и конъюгирующие группы.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:28, 93, 104, 134. В некоторых вариантах реализации соединение состоит из любой из последовательностей азотистых оснований SEQ ID NO:28, 93, 104, 134 и конъюгирующие группы.

последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных азотистых оснований последовательности азотистых оснований SEQ ID NO:58. В некоторых вариантах реализации модифицированный олигонуклеотид с конъюгирующей группой имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований последовательности азотистых оснований SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах реализации соединение состоит из SEQ ID NO: 58 и конъюгирующие группы.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания представлены конъюгированные антисмысловые соединения, представленные следующей структурой. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение содержит модифицированный олигонуклеотид ISIS 494372 с 5'-Х, где X представляет собой конъюгирующую группу, содержащую GalNAc. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение состоит из модифицированного олигонуклеотида ISIS 494372 с 5'-Х, где X представляет собой конъюгирующую группу, содержащую GalNAc.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания представлены конъюгированные антисмысловые соединения, представленные следующей структурой. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение содержит конъюгированный модифицированный олигонуклеотид ISIS 681251. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение состоит из конъюгированного модифицированного олигонуклеотида ISIS 681251.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания представлены конъюгированные антисмысловые соединения, представленные следующей структурой. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение содержит конъюгированный модифицированный олигонуклеотид ISIS 681257. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение состоит из конъюгированного модифицированного олигонуклеотида ISIS 681257.

В некоторых вариантах реализации настоящего описания представлены конъюгированные антисмысловые соединения, представленные следующей структурой. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение содержит модифицированный олигонуклеотид с последовательностью азотистых оснований SEQ ID NO: 58 с 5'-GalNAc с вариабельностью в сахарных структурах крыльев. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение состоит из модифицированного олигонуклеотида с последовательностью азотистых оснований SEQ ID NO:58 с 5'-GalNAc с вариабельностью в сахарных структурах крыльев.

где либо R¹ представляет собой -ОСН₂СН₂ОСН₃ (МОЕ), и R² представляет собой Н; либо R¹ и R² вместе образуют мостик, где R¹ представляет собой -О-, и R² представляет собой -СН₂-, -СН(СН₃)- или -СН₂СН₂-, и R¹ и R² связаны напрямую, так что образующийся мостик выбран из: -O-СН₂-, -O-СН(СН₃)- и -O-СН₂СН₂-;

и для каждой пары R³ и R⁴ у одного кольца, независимо для каждого кольца: либо R³выбран из Н и -ОСН₂СН₂ОСН₃, и R⁴ представляет собой Н; либо R³ и R⁴ вместе образуют мостик, где R³ представляет собой -О-, и R⁴ представляет собой -СН₂-, -СН(СН₃)- или -СН₂СН₂-, и R³ и R⁴ связаны напрямую, так что образующийся мостик выбран из: -О-СН₂-, -О-СН(СН₃)- и -О-СН₂СН₂-;

и R⁵ выбран из Н и -СН₃;

и Z выбран из S^- и О^-.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах реализации, модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 межнуклеозидных связей указанного модифицированного олигонуклеотида представляют собой тиофосфатные межнуклеозидные связи. В некоторых вариантах реализации каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах реализации модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 фосфодиэфирных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида выбрана из фосфодиэфирной межнуклеозидной связи и тиофосфатной межнуклеозидной связи.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при

этом по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированное азотистое основание. В некоторых вариантах реализации, модифицированнле азотистое основание представляет собой 5-метилцитозин.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный сахар. В некоторых вариантах реализации модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар. В некоторых вариантах реализации модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтиловый, стерически затрудненный этиловый, 3'-фтор-ГНК (hexitol nucleic acid (HNA)) или 4'-(CH₂)_n-O-2' мостик, где n равен 1 или 2.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов и содержит: (а) сегмент гэп, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов; (b) сегмент 5'-крыла, состоящий из связанных нуклеозидов; (с) сегмент 3'-крыла, состоящий из связанных нуклеозидов; и при этом сегмент гэп находится между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла, и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит модифицированный сахар.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующую группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов и содержит: (а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; (b) сегмент 5'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; (с) сегмент 3'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и при этом сегмент гэп находится между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла, и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, и по меньшей мере одна межнуклеозидных связей представляет собой тиофосфатную связь, а каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.

азотистых оснований любой из SEQ ID NO:12-130, 133, 134, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: (а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; (b) сегмент 5'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; (с) сегмент 3'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и при этом сегмент гэп находится между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла, и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, и по меньшей мере одна межнуклеозидных связей представляет собой тиофосфатную связь, а каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.

В некоторых вариантах реализации приведено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгированную группу, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов и имеет последовательность азотистых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных азотистых оснований SEQ ID NO:58, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: (а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; (b) сегмент 5'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; (с) сегмент 3'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и при этом сегмент гэп находится между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла, и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, и по меньшей мере одна межнуклеозидных связей представляет собой тиофосфатную связь, а каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.

В некоторых вариантах реализации приведен модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на аро(а), и конъюгирующая группа, при этом модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов с последовательностью азотистых оснований SEQ ID NO:58, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: (а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; (b) сегмент 5'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; (с) сегмент 3'-крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и при этом сегмент гэп находится между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла, и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O- метоксиэтиловый сахар, и по меньшей мере одна межнуклеозидных связей представляет собой тиофосфатную связь, а каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.

В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа связана с модифицированным олигонуклеотидом на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида. В

некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа связана с модифицированным олигонуклеотидом на 3'-конце модифицированного олигонуклеотида.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа содержит один или более лигандов. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа содержит два или более лигандов. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа содержит три или более лигандов. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа содержит три лиганда. В некоторых вариантах реализации каждый лиганд выбран из: полисахарида, модифицированного полисахарида, маннозы, галактозы, производного маннозы, производного галактозы, D-маннопиранозы, L-маннопиранозы, D-арабинозы, L-галактозы, D-ксилофуранозы, L-ксилофуранозы, D-глюкозы, L-глюкозы, D-галактозы, L-галактозы, α-D-маннофуранозы, β-D-маннофуранозы, α-D-маннопиранозы, β-D-маннопиранозы, α-D-глюкопиранозы, β-D-глюкопиранозы, α-D-глюкофуранозы, β-D-глюкофуранозы, α-D-фруктофуранозы, α-D-фруктопиранозы, α-D-галактопиранозы, β-D-галактопиранозы, α-D-галактофуранозы, β-D-галактофуранозы, глюкозамина, сиаловой кислоты, α-D-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, 2-амино-3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-2-дезокси-β-D-глюкопиранозы, 2-дезокси-2-метиламино-L-глюкопиранозы, 4,6-дидезокси-4-формамидо-2,3-ди-O-метил-D-маннопиранозы, 2-дезокси-2-сульфоамино-D-глюкопиранозы, N-гликолоил-α-нейраминовой кислоты, 5-тио-β-D-глюкопиранозы, метил-2,3,4-три-O-ацетил-1-тио-6-O-тритил-α-D-глюкопиранозида, 4-тио-β-D-галактопиранозы, этил-3,4,6,7-тетра-O-ацетил-2-дезокси-1,5-дитио-α-D-глюко-гептопиранозида, 2,5-ангидро-D-аллононитрила, рибозы, D-рибозы, D-4-тиорибозы, L-рибозы, L-4-тиорибозы. В некоторых вариантах реализации каждый лиганд представляет собой N-ацетилгалактозамин.

В некоторых вариантах реализации каждый лиганд представляет собой N-ацетилгалактозамин.

В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа содержит:

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа содержит по меньшей мере одну фосфорную связывающую группу или нейтральную связывающую группу.

В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа содержит структуру, выбранную из:

; ;

;

где n равен от 1 до 12; и

где m равен от 1 до 12.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа содержит связку, имеющую структуру, выбранную из:

где L представляет собой либо фосфорную связывающую группу, либо нейтральную связывающую группу;

Z1 представляет собой C(=O)O-R2;

Z2 представляет собой Н, С1-С6 алкил или замещенный С1-С6 алкил;

R2 представляет собой Н, С1-С6 алкил или замещенный С1-С6 алкил;

и каждый m₁ независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m₁ больше 0 для каждой связки.

где Z2 представляет собой Н или СН3; и

каждый m1 независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m1 больше 0 для каждой связки.

; ;

;

где n равен от 1 до 12; и

где m равен от 1 до 12.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа ковалентно связана с модифицированным олигонуклеотидом.

В некоторых вариантах реализации соединение имеет структуру, представленную формулой:

где

А представляет собой модифицированный олигонуклеотид;

В представляет собой расщепляемый фрагмент

С представляет собой конъюгирующий линкер

D представляет собой группу ветвления

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах реализации соединение имеет структуру, представленную формулой:

где:

А представляет собой модифицированный олигонуклеотид;

В представляет собой расщепляемый фрагмент

С представляет собой конъюгирующий линкер

D представляет собой группу ветвления

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд;

каждый n независимо равен 0 или 1; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах реализации соединение имеет структуру, представленную формулой:

где

А представляет собой модифицированный олигонуклеотид;

В представляет собой расщепляемый фрагмент;

С представляет собой конъюгирующий линкер;

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах реализации соединение имеет структуру, представленную формулой:

где

А представляет собой модифицированный олигонуклеотид;

С представляет собой конъюгирующий линкер;

D представляет собой группу ветвления;

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах реализации соединение имеет структуру, представленную формулой:

где

А представляет собой модифицированный олигонуклеотид;

С представляет собой конъюгирующий линкер;

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах реализации соединение имеет структуру, представленную формулой:

где

А представляет собой модифицированный олигонуклеотид;

В представляет собой расщепляемый фрагмент;

D представляет собой группу ветвления;

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах реализации соединение имеет структуру, представленную формулой:

где

А представляет собой модифицированный олигонуклеотид;

В представляет собой расщепляемый фрагмент;

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах реализации соединение имеет структуру, представленную формулой:

где

А представляет собой модифицированный олигонуклеотид;

D представляет собой группу ветвления;

каждый Е представляет собой связку;

каждый F представляет собой лиганд; и

q представляет собой целое число от 1 до 5.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет структуру, выбранную из:

;

и .

где каждый L независимо представляет собой либо фосфорную связывающую группу, либо нейтральную связывающую группу; и

каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет структуру, выбранную из:

;

; ;

;

; ; ;

; ;

; и

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет следующую структуру:

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет структуру, выбранную из:

; ; и .

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет структуру, выбранную

из: и .

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет структуру, выбранную из:

; ; и

В некоторых вариантах реализации конъюгирующий линкер содержит пирролидин. В некоторых вариантах реализации конъюгирующий линкер не содержит пирролидин. В некоторых вариантах реализации конъюгирующий линкер содержит ПЭГ. В некоторых вариантах реализации конъюгирующий линкер содержит амид. В некоторых вариантах реализации конъюгирующий линкер содержит по меньшей мере два амида. В некоторых вариантах реализации конъюгирующий линкер не содержит амид. В некоторых вариантах реализации конъюгирующий линкер содержит полиамид. В некоторых вариантах реализации конъюгирующий линкер содержит амин. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер содержит одну или более дисульфидных связей. В некоторых

вариантах реализации конъюгирующий линкер содержит белок-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах реализации белок-связывающий фрагмент содержит липид.

В некоторых вариантах реализации каждый белок-связывающий фрагмент выбран из: холестерина, холевой кислоты, адамантан-уксусной кислоты, 1-пиренмасляной кислоты, дигидротестостерона, 1,3-бис-O(гексадецил)глицерина, геранилоксигексиловой группы, гексадецилглицерина, борнеола, ментола, 1,3-пропандиола, гептадециловой группы, пальмитиновой кислоты, миристиновой кислоты, O3-(олеоил)литохолевой кислоты, O3-(олеил)холеновой кислоты, диметокситритила или феноксазина, витамина (например, фолата, витамина А, витамина Е, биотина, пиридоксаля), пептида, углевода (например, моносахарида, дисахарида, трисахарида, тетрасахарида, олигосахарида, полисахарида), эндосомолитического компонента, стероида (например, уваола, гецигенина, диосгенина), терпена (например, тритерпена, например, сарсасапогенина, фриделина, эпифриделанол-дериватизованной литохолевой кислоты) или катионного липида.

В некоторых вариантах реализации каждый белок-связывающий фрагмент выбран из: насыщенной или ненасыщенной жирной кислоты с длиной цепи С16-С22, холестерина, холевой кислоты, витамина Е, адамантана или 1-пентафторпропила.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет структуру, выбранную из:

;

; ; ;

;

; и .

где каждый n независимо равен от 1 до 20; и р равен от 1 до 6.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет структуру, выбранную

из:

; ;

; ; и

где каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет структуру, выбранную из:

;

; и .

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет структуру, выбранную из:

где n равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет структуру, выбранную из:

и .

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет структуру, выбранную из:

и ;

где каждый n независимо равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующий линкер имеет следующую структуру:

В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет одну из следующих структур:

; и

где каждый A₁ независимо представляет собой О, S, С=O или NH; и

каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет одну из следующих структур:

где каждый А1 независимо представляет собой О, S, С=O или NH; и

каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет следующую структуру:

В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления содержит простой эфир.

В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет следующую структуру:

;

; и

каждый n независимо равен от 1 до 20; и

m равен от 2 до 6.

В некоторых вариантах реализации изобретения группа ветвления имеет следующую структуру:

;

; и

В некоторых вариантах реализации изобретения грауппа ветвления имеет следующую структуру:

В некоторых вариантах реализации группа ветвления содержит:

или ;

где каждый j представляет собой целое число от 1 до 3; и

где каждый n представляет собой целое число от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации группа ветвления содержит:

, , ,

или .

В некоторых вариантах реализации каждая связка выбрана из:

где L выбран из фосфорной связывающей группы и нейтральной связывающей группы;

Z1 представляет собой C(=O)O-R2;

Z2 представляет собой Н, С1-С6 алкил или замещенный С1-С6 алкил;

R2 представляет собой Н, С1-С6 алкил или замещенный С1-С6 алкил; и

каждый m₁ независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m₁ больше 0 для каждой связки.

В некоторых вариантах реализации каждая связка выбрана из:

где Z2 представляет собой Н или СН3; и

каждый m2 независимо равен от 0 до 20, при этом по меньшей мере один m2 больше 0 для каждой связки.

В некоторых вариантах реализации каждая связка выбрана из:

; ;

;

где n равен от 1 до 12; и

где m равен от 1 до 12.

В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере одна связка содержит этиленгликоль. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере одна связка содержит амид. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере одна связка содержит полиамид. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере одна связка содержит амин. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере две связки отличны друг от друга. В некоторых вариантах реализации все связки являются одинаковыми.В некоторых вариантах реализации каждая связка выбрана из:

;

; и

где каждый n независимо равен от 1 до 20; и

каждый р равен от 1 до около 6.

В некоторых вариантах реализации каждая связка выбрана из:

;

; и .

В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка имеет следующую структуру:

где каждый n независимо равен от 1 до 20. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая связка имеет следующую структуру:

В некоторых вариантах реализации изобретения связка имеет структуру, выбранную из:

или , где каждый n независимо равен 0, 1,2, 3, 4, 5, 6 или 7.

В некоторых вариантах реализации изобретения связка имеет структуру, выбранную из:

В некоторых вариантах реализации изобретения лиганд представляет собой галактозу. В некоторых вариантах реализации изобретения лиганд представляет собой манноза-6-фосфат.

В некоторых вариантах реализации каждый лиганд выбран из:

где каждый R1 выбран из ОН и NHCOOH.

В некоторых вариантах реализации каждый лиганд выбран из:

;

; и

В некоторых вариантах реализации изобретения каждый лиганд имеет следующую структуру:

В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа содержит фрагмент, нацеливающий на клетку.

В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа содержит фрагмент, нацеливающий на клетку, имеющий следующую структуру:

где каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:

где каждый n независимо равен от 1 до 20.

В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, имеет следующую структуру:

В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент, нацеливающий на клетку, содержит:

;

где каждый Y выбран из О, S, замещенного или незамещенного С1-С10 алкила, амино, замещенного амино, азидо, алкенила или алкинила.

В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа содержит:

;

В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа содержит:

;

В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа содержит:

В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа содержит фрагмент, выбранный из: фосфодиэфира, амида или сложного эфира.

В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа содержит фосфодиэфирный расщепляемый фрагмент.

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгирующая группа не содержит расщепляемого фрагмента, и при этом конъюгирующая группа содержит тиофосфатную связь между конъюгирующей группой и олигонуклеотидом. В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа содержит амидный расщепляемый фрагмент.В некоторых вариантах реализации конъюгирующая группа содержит сложноэфирный расщепляемый фрагмент.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение имеет следующую структуру:

где каждый n независимо равен от 1 до 20;

Q13 представляет собой Н или O(СН2)2-ОСН3;

А представляет собой модифицированный олигонуклеотид; и