Способ проведения пцр в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и в гена csn3



Способ проведения пцр в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и в гена csn3
Способ проведения пцр в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и в гена csn3
Способ проведения пцр в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и в гена csn3
Способ проведения пцр в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и в гена csn3
Способ проведения пцр в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и в гена csn3

Владельцы патента RU 2701648:

Вафин Рамиль Ришадович (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии и генетики сельскохозяйственных животных. Предложен способ проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3, в котором используют 5'-флуоресцентно-меченый прямой А-аллель-специфический праймер CSN3-A: 5'-FAM-ACTGTAGCTACTCTAGACGA-3', 5'-флуоресцентно-меченый прямой B-аллель-специфический праймер CSN3-B: 5'-VIC-ACTGTAGCTACTCTAGATGC-3', обратный общий праймер CSN3-R: 5'-GCTCTCAATAACTTCTGGAGAA-3', анти-праймер CSN3-S, меченый гасителем флуоресценции с 3'-конца олигонуклеотида: 5'-TCTAGAGTAGCTACAGT-3'-BHQ1. Изобретение позволяет эффективно осуществить генотипирование крупного рогатого скота по гену CSN3 на основе ПЦР в реальном времени в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции. 2 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к области генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма гена CSN3 (kappa-casein, каппа-казеин) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.

Разработанный нами способ проведения ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции вместе с его ближайшим прототипом [1] относится к разновидности анти-праймер-опосредованной количественной ПЦР в реальном времени (anti-primer-based quantitative real-time PCR, aQRT-PCR), предложенной J. Li & G.M. Makrigiorgos (2009) [2], способной эффективно идентифицировать однонуклеотидный полиморфизм.

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по гену CSN3 на основе ПЦР в реальном времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

Нами разработан способ проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции, предусматривающий использование двух 5'-флуоресцентно-меченых прямых аллель-специфических праймеров (CSN3-A и SCN3-B), одного обратного общего праймера (CSN3-R), и одного анти-праймера (CSN3-S), меченого гасителем флуоресценции с 3/-конца олигонуклеотида (табл. 1, фиг. 1).

Основным отличием разработанного нами способа от прототипа [1] является конструктивная особенность 5'-флуоресцентно-меченых прямых аллель-специфических праймеров, полностью состоящих из генспецифичных последовательностей, на которых, в том числе и путем конкурентной гибридизации, отжигается комплементарный анти-праймер меньшей длины, меченый гасителем флуоресценции с 3'-конца олигонуклеотида.

Условия проведения реакции.

Экстракция нуклеиновой кислоты из образцов цельной крови крупного рогатого скота, консервированной 10 мМ ЭДТА-Na2, осуществлена сорбционным способом («ДНК-сорб В», ЦНИИ Эпидемиологии, Россия).

Разработанный способ проведения ПНР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 выполняли на амплификаторе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) согласно протоколу, представленному в табл. 1.

В работе использованы реактивы для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим» (Россия) и ООО «ДНК-синтез» (Россия).

Апробацию разработанного способа проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 провели на пробах ДНК от 70 быков-производителей ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан Российской Федерации.

Заключение

В результате практических исследований, направленных на апробацию разработанного способа проведения ПНР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции, нами получен обеспечиваемый предложенным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации искомых генотипов (АА, ВВ, АВ) ввиду корректной интерпретации данных кривых увеличения интенсивности флуоресценции (фиг. 2).

Источники информации

2. Rashydov, A.N. Identification of allele variants of cattle milk productivity genes using PCR and the anti-primer method / A.N. Rashydov, V.G. Spiridonov, O.N. Konoval, M.D. Melnychuk // Cytology and Genetics. - 2010. - V. 44. - N. 5. - P. 272-275.

2. Li, J. Anti-primer quenching-based real-time PCR for simplex or multiplex DNA quantification and single-nucleotide polymorphism genotyping / J. Li, G.M. Makrigiorgos // Nature protocols. - 2007. - V. 2. - N. 1. - P. 50-58.

Краткое описание графических материалов

Пояснение к фиг. 1.

Выравнивание фланкируемых с праймерами CSN3-A + CSN3-B + CSN3-R нуклеотидных последовательностей аллелей An В гена CSN3 Bos Taurus

Пояснение к фиг. 2.

Результат предложенного способа проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 (праймеры CSN3-A + CSN3-B + CSN3-R и анти-праймер CSN3-S)

Обозначения:

Слева - канал детекции Green. Справа - канал детекции Yellow. Кривые роста флуоресценции для генотипов АА (1-3), АВ (7-9) и ВВ (4-6). ОКО (10).

Способ проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3, отличающийся тем, что используются:

5/-флуоресцентно-меченый прямой А-аллель-специфический праймер CSN3-А: 5/-FAM-ACTGTAGCTACTCTAGACGA-3' (SEQ ID NO: 1),

5/-флуоресцентно-меченый прямой B-аллель-специфический праймер CSN3-В: 5/-VIC-ACTGTAGCTACTCTAGATGC-3/ (SEQ ID NO: 2),

обратный общий праймер CSN3-R: 5/-GCTCTCAATAACTTCTGGAGАА-3/ (SEQ ID NO: 3),

анти-праймер CSN3-S, меченый гасителем флуоресценции с 3/-конца олигонуклеотида: 5/-TCTAGAGTAGCTACAGT-3/-BHQ1 (SEQ ID NO: 4).



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к медицине, в частности к способам отбора больных и прогнозирования злокачественного заболевания. Способ идентификации индивидуума со злокачественной опухолью, который с большей вероятностью будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с PD-L1, включает: определение наличия или уровня биомаркера PD-L1 в образце от индивидуума, при этом по наличию или уровню биомаркера PD-L1 в образце идентифицируют индивидуума как такого, который вероятно будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с PD-L1, и предоставление рекомендации по поводу того, что индивидуум вероятно будет отвечать на лечение антагонистом, связывающимся с PD-L1.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и генетики. Предложен способ определения генотипа человека по мутации с.496A>G в 6 экзоне гена DPYD, включающий проведение ПЦР в режиме реального времени с детекцией результатов с помощью метода анализа кривых плавления (HRM) и оптимизацией ПЦР с помощью применения адаптированного буфера для Taq-полимеразы состава Трис-HCl 67 mM, (NH4)2SO4 166 mM, tween-20 0,1%, глицерин 1%, рН 8,7.
Изобретение относится к области молекулярной биологии, лабораторной диагностики, вирусологии и эпидемиологии и предназначено для генотипирования энтеровирусов методом секвенирования 1A-1B участка генома.

Изобретение относится к области медицины, в частности к педиатрии и эндокринологии, и предназначено для определения предрасположенности к развитию ожирения у детей в условиях избыточной контаминации алюминием.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей, включающий выделение РНК из биологического материала инфицированных особей сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контролей образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией - Threshold, согласно изобретению для выделения РНК используют биологический материал животных по выбору: в виде выделений из носа, глаз, фекалий, крови, спермы и фрагментов внутренних органов и тканей, взятых от лошадей, инфицированных возбудителем вируса артериита (Equine arteritis virus), при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя вируса артериита лошадей (Equine arteritis virus) и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1, FAM/Green для специфического сигнала; Cy5/Red для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считают положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции – отрицательный.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест-систему для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах в тест-системе для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах, включающем пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, специфичных для участка генома ДНК нескольких видов мяса олигонуклеотидных праймеров, зондов, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага и положительных контрольных образцов - содержащих фрагменты геномов ДНК нескольких видов мяса, согласно изобретению в качестве генома ДНК мяса используют ткани курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa), при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца – смесь, содержащую фрагменты геномов тканей курицы ({Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa) и бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1:1.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах, включающий выделение сорбционным методом ДНК из тканей курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa), постановку полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации с использованием специфичных для участка генома ДНК ткани курицы (Gallus gallus) и свиньи (Sus scrofa) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей, внутреннего контрольного образца и положительных контрольных образцов, измерение специфических сигналов и сигнала контролей и интерпретацию результатов, согласно изобретению проводят одноэтапную полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для тканей свиньи (Sus scrofa); FAM/Green - тканей курицы (Gallus gallus) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца, интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца – смесь, содержащую фрагменты геномов тканей курицы (Gallus gallus), тканей свиньи (Sus scrofa) и бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1:1.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных, включающий выделение нуклеиновой кислоты из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение по каналу JOE(HEX)/Yellow, накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.), а по каналу FAM/Green накопление сигнала внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) присутствует и результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) отсутствует и результат реакции отрицательный, где для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.Lpts) и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест-систему для обнаружения ДНК генома возбудителя Brucella spp инфекции у сельскохозяйственных животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающую пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена возбудителя Brucella spp, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды, меченные красителями, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца - смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК Brucella spp и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выявления ДНК сальмонелл (Salmonella spp.) в биологическом материале, продуктах питания и кормах животного и растительного происхождения, включающий выделение ДНК сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома сальмонелл (Salmonella spp.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2018-02-19 2019-10-01T14:00:46
Наверх