Искусственная роговица, представляющая собой мембрану гетерогенной жесткости на основе коллагена, и способ ее получения и применения
Владельцы патента RU 2714943:
Общество с ограниченной ответственностью фирмы "Имтек" (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии. Предложена искусственная роговица, представляющая собой коллагеновую мембрану гетерогенной плотности, подходящую для имплантации в организм человека с целью усиления биомеханических характеристик роговицы человека без потери ее прозрачности; усиления биомеханических характеристик бельм роговицы с целью их подготовки к кератопротезированию; для лечения методом DALK несквозных бельм роговицы, при которых не повреждена десцеметова мембрана и сохранены эндотелиальные клетки, находящиеся на ней; для создания тканеинженерной конструкции аналога роговицы путем формирования слоя эпителиальных клеток роговицы человека на одной из поверхностей мембраны и формирования слоя эндотелиальных клеток роговицы человека на противоположной стороне мембраны. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 пр., 4 табл.
Область техники, к которой относится изобретение
Предлагаемое изобретение относится к категории биодеградируемых имплантатов для введения человеку, в частности к устройствам для восстановления поврежденной роговицы глаза и усилению ее биомеханических характеристик.
Уровень техники
Роговица, роговая оболочка — передняя наиболее выпуклая прозрачная часть глазного яблока, одна из светопреломляющих сред глаза. Роговица у человека занимает примерно 1/16 площади наружной оболочки глаза. Она имеет вид выпукло-вогнутой линзы, обращённой вогнутой частью назад. Диаметр роговицы составляет 10±0,56 мм. Толщина роговицы в центральной части 0,56 - 0,60 мм, по краям — 1,0 - 1,2 мм. Максимальная нагрузка на разрыв нормальной роговицы человека составляет 10-12 Ньютон.
Проблема восстановления поврежденных тканей роговицы, их целостности и прозрачности является актуальной для офтальмологии. Бельмо (лейкома) - патологический процесс, сопровождающийся частичным или полным помутнением роговицы. Наиболее частыми причинами образования бельма являются: кератиты различной этиологии (вирусные, туберкулезные и другие), травмы (ранения, химические и термические ожоги), оперативные вмешательства на глазу. Также встречаются врожденные помутнения роговицы, обусловленные внутриутробным воспалительным процессом.
Для восстановления прозрачности поврежденной роговицы в клинической практике используют пересадку пациенту донорской роговицы, полученной от донора. На данный момент более чем 10 млн людей во всем мире нуждаются в пересадке донорской роговицы. Однако клиническое использование аллогенного материала осложнено ввиду отсутствия необходимого количества донорских роговиц. Более того, в некоторых случаях наблюдается реакция иммунной системы пациента на антигены донорской роговицы, что приводит к помутнению трансплантата. Одним из возможных вариантов решения данной проблемы является разработка материала для кератопластики, биосовместимого с тканями роговицы и обладающего минимальной иммуногенностью. В данном случае идет речь об отказе от использования донорской роговицы и использовании биокомпозитных полимеров.
Последние достижения современной регенеративной медицины обеспечили значительный прогресс в решении данной проблемы. Так, например, в патенте RU 2421185 C2 описана искусственная роговица на основе роговицы животного. В данном патенте искусственную роговицу получают способом, в рамках которого роговая оболочка животного после изъятия подвергается химической обработке для стабилизации материала. Данная искусственная роговица является химически модифицированной тканью животного, поэтому возникает проблема иммуногенности, биосовместимости и продолжительного сохранения оптической прозрачности после имплантации.
Из патента US 5,067,961 известен другой вариант искусственной роговицы, который является небиодеградируемым роговичным имплантатом. В этом патенте предлагается искусственная роговица, состоящая из двух частей. Центральная зона имплантата представлена полимеризованным химически модифицированным коллагеном I и IV типов человека, периферическая - полимеризованным химически модифицированным коллагеном I типа человека. Основным недостатком данного изделия является тот факт, что это изделие не является биодеградируемым и не совместимо с живыми клетками, что через некоторое время приводит к отторжению имплантированного материала и, следовательно, к необходимости повторения операции.
Близкой к заявляемому изобретению по свойствам является искусственная роговица на основе рекомбинантного коллагена человека III типа, описанная в документе WO 2006/020859 A3. Авторы этого изобретения предлагают использовать вместе с коллагеном III типа белки, способствующие адгезии и пролиферации клеток роговицы. Основным недостатком такого изделия является тот факт, что для увеличения прочностных характеристик изделие подвергается химической модификации (в том числе, обработке глютаровым альдегидом), что является причиной повышенной иммуногенности, ограниченной биосовместимости и нарушения оптической прозрачности после имплантации.
Близкой к заявляемому изобретению по способу изготовления является искусственная роговица на основе коллагена крысы I типа: пластически компрессированная коллагеновая мембрана, описанная в статье Xiao X, Pan S, Liu X, Zhu X, Connon CJ, Wu J, и др. «In vivo study of the biocompatibility of a novel compressed collagen hydrogel scaffold for artificial corneas», J. Biomed. Mater. Res., 2013, 102(6), 1782-1787 и статье Mi S., Chen B., Wright B., Connon C.J. «Plastic compression of a collagen gel forms a much improved scaffold for ocular surface tissue engineering over conventional collagen gel», J. Biomed. Mater. Res. A., 2010, 95(2), 447-453. Способ приготовления такой искусственной роговицы состоит из нескольких этапов. На первом этапе в одинаковой пропорции смешиваются 0,2% кислый раствор коллагена крысы I типа, среда для культивирования клеток и 1,0 М раствор NaOH. Далее, для формирования коллагенового гидрогеля полученный нейтральный раствор коллагена разливают в специальные прямоугольные формы и инкубируют при +37°С в течение 30 минут. Полученные коллагеновые гидрогели подвергают пластической компрессии путем приложения к ним постоянной нагрузки в 120 г к большему основания гидрогеля на протяжении 5 минут. Полученная таким образом компрессированная искусственная роговица является полупрозрачной и механически слабой, что ограничивает ее применение для имплантации.
Еще одним близким к заявляемому изобретению по способу изготовления техническим решением является искусственная роговица на основе свиного ателоколлагена в виде коллагеновой мембраны Vitrigel, описанная в статье Calderon-Colon X., Xia Z., Breidenich J.L., Mulreany D.G. и др., «Structure and properties of collagen vitrigel membranes for ocular repair and regeneraition applications», Biomaterials, 2012, 33(33), 8286-8295 и статье Chae JJ, McIntosh Ambrose W, Espinoza FA, Mulreany DG, Ng S, Takezawa T и др., «Regeneration of corneal epithelium utilizing a collagen vitrigel membrane in rabbit models for corneal stromal wound and limbal stem cell deficiency», Acta Ophthalmol., 2014. Способ приготовления такой искусственной роговицы состоит из нескольких этапов. На первом этапе в одинаковой пропорции смешиваются 0,5% кислый раствор коллагена и среда для культивирования клеток (например, DMEM). В результате получается нейтральный раствор 0,25% коллагена, смешанный со средой для культивирования клеток. На втором этапе полученный нейтральный раствор 0,25% коллагена переводится в форму гидрогеля путем инкубации при +37°С. На третьем этапе полученный гидрогель переводится в форму жесткой стеклоподобной мембраны путем высушивания на воздухе. Полученная таким образом искусственная роговица является и биосовместимой, и прозрачной в in vivo условиях. Однако, описываемая искусственная роговица на основе свиного ателоколлагена имеет существенный недостаток, заложенный в самой природе такой искусственной роговицы и технологии ее получения - слишком слабые прочностные характеристики данного изделия, суживающие область применения этого изделия только до лечения поверхностных дефектов эпителия роговицы человека.
Наиболее близким к заявляемой искусственной роговице по технической сущности решением является искусственная роговица, приготовленная из концентрированного раствора коллагена (90 мг/мл), описанная в статье Tidu AL, Ghoubay-Benallaoua D, Lynch B, Haye B, Illoul C, Allain J-M и др. «Development of human corneal epithelium on organized fibrillated transparent collagen matrices synthesized at high concentration», Acta Biomaterialia, 2015, 22(C), 50-58. Авторы этой работы предлагают повышать механические характеристики изделия не за счет его химической модификации, а за счет повышения концентрации коллагена в конечном изделии. Способ приготовления такой искусственной роговицы состоит из концентрирования раствора коллагена при помощи ультрацентрифугирования, а затем перевод раствора коллагена в конечную форму коллагенового гидрогеля, в парах аммиака. В итоге, полученная искусственная роговица является прочной, прозрачной в дистиллированной воде (87% светопропускания в диапазоне длин волн 380-780 нм) и совместимой с клетками роговицы. На такой искусственной роговице успешно культивируются эпителиальные клетки роговицы человека, повторяя свое естественное поведение в in vitro условиях. Однако стоит отметить, что описываемая в этой статье искусственная роговица на основе концентрированного раствора коллагена имеет существенный недостаток, также заложенный в технологии ее получения - значительное помутнение коллагеновых гидрогелей в условиях, максимально приближенных к in vivo (см. статью Achilli M, Mantovani D. «Tailoring Mechanical Properties of Collagen-Based Scaffolds for Vascular Tissue Engineering: The Effects of pH, Temperature and Ionic Strength on Gelation», Polymers, 2010, 2(4), 664-680).
Таким образом, остается актуальной потребность в искусственной роговице, которая является биосовместимой, неиммуногенной, оптически прозрачной и прочной, изготовленной из высокоочищенного биоматериала без применения химической модификации.
Раскрытие сущности изобретения
Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось создание безопасной, биосовместимой, оптически прозрачной, неиммуногенной и прочной искусственной роговицы с использованием стерильного прозрачного раствора коллагена, полученного путем экстракции из тканей человека или животных без химической модификации.
В первом варианте осуществления изобретения предлагается искусственная роговица, представленная коллагеновой мембраной, которая в гидратированном состоянии является коллагеновым гидрогелем гетерогенной плотности, имеющим форму плоского цилиндра, основным компонентом которого является коллаген I типа в концентрации, обеспечивающей необходимую жесткость искусственной роговицы. Помимо коллагена I типа в состав предлагаемой искусственной роговицы входит коллаген V типа. Добавление коллагена V типа позволяет регулировать размер фибрилл в коллагеновом гидрогеле, а следовательно прозрачность готового изделия. Одним из отличительных признаков искусственной роговицы по изобретению является гетерогенная плотность, а именно наличие на периферии области с повышенным содержанием нативного коллагена I типа в форме кольца (называемого также «уплотненным кольцом»), облегчающего фиксацию мембраны в операционном ложе и ускоряющего процесс интеграции искусственной роговицы с окружающими тканями.
Вторым вариантом осуществления изобретения является способ получения описанной выше искусственной роговицы. Процесс приготовления искусственной роговицы разделяется на две стадии: получение гидрогеля из стерильного прозрачного водного раствора коллагена и витрификация гидрогеля при постоянной пластической компрессии.
Для приготовления геля используют стерильный прозрачный водный раствор, содержащий коллаген I типа и коллаген V типа. Например, в рамках способа по изобретению раствор коллагена можно центрифугировать в цилиндрическом сосуде, затем инкубировать в парах аммиака, а затем инкубировать в стерильной очищенной воде с получением геля. На втором этапе осуществляют компрессионную витрификацию гидрогеля. На данном этапе осуществляют сушку коллагенового гидрогеля. Одновременно с сушкой коллагеновый гидрогель цилиндрической формы подвергают пластической компрессии путем приложения к основаниям цилиндрического гидрогеля постоянной нагрузки. В результате витрификации получают стеклоподобную мембрану гетерогенной плотности, включающую структуру уплотненного кольца.
В третьем варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению искусственной роговицы, описанной выше, для усиления биомеханических характеристик роговицы человека без потери ее прозрачности; для усиления биомеханических характеристик бельм роговицы человека с целью их подготовки к кератопротезированию; для лечения методом DALK несквозных бельм роговицы, при которых не повреждена десцеметова мембрана и сохранены эндотелиальные клетки, находящиеся на ней; и/или для создания тканеинженерной конструкции аналога роговицы путем формирования слоя эпителиальных клеток роговицы человека на одной из поверхностей мембраны, и формирования слоя эндотелиальных клеток роговицы человека на противоположной поверхности мембраны.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 приведено схематическое изображение одного из вариантов осуществления процесса пластической компрессии коллагенового гидрогеля по изобретению
На фиг. 2 представлены схематичные изображения искусственной роговицы, где изображение А соответствует виду сверху искусственной роговицы, а изображение Б – поперечному сечению искусственной роговицы. Центральная область искусственной роговицы обозначена цифрой 1, а уплотненное кольцо – цифрой 2.
На фиг. 3 представлена фотография образца искусственной роговицы, представляющей собой коллагеновую мембрану гетерогенной плотности, в соответствии с изобретением. По периферии выделяется уплотненное кольцо, внешний диаметр которого подрезает хирург непосредственно во время операции.
На фиг. 4 представлены фотографии глаза кролика с пересаженной искусственной роговицей по изобретению. Левая фотография - сразу после операции; правая - через 3 недели после операции и снятия швов.
Осуществление изобретения
В настоящем изобретении выражения «содержит» и «включает» и их производные используются взаимозаменяемо и понимаются как неограничивающие, т.е. допускающие присутствие/использование других компонентов, стадий, условий и т.п., помимо тех, что перечислены в явном виде. Напротив, выражения «состоит из» и «составлен из» и их производные предназначены для указания на то, что перечисленные затем компоненты, стадии, условия и т.п. являются исчерпывающими.
В настоящем изобретении, когда для какой-либо величины приводится диапазон возможных значений, подразумевается, что граничные точки этого диапазона также включены в объем настоящего изобретения. Следует понимать, что все поддиапазоны, лежащие в приведенных диапазонах, также включены в объем настоящего изобретения, как если бы они были указаны в явном виде. В случае, когда для какой-либо величины приведены несколько диапазонов возможных значений, все диапазоны, получаемые путем комбинирования различных граничных точек из указанных диапазонов, также включены в настоящее изобретение, как если бы они были указаны в явном виде.
В случае, когда какие-то признаки изобретения раскрыты в настоящем документе для одного варианта осуществления, эти признаки также могут быть использованы и во всех других вариантах осуществления изобретения, при условии, что это не противоречит букве и духу изобретения.
В рамках настоящего изобретения термины в единственном числе охватывают также и соответствующие термины во множественном числе, и наоборот, при условии, что из контекста явно не следует иное.
В настоящем документе выражение «или» следует воспринимать как «и/или», при условии, что это не противоречит контексту, даже несмотря на то, что в некоторых случаях выражение «и/или» может использоваться в явном виде.
За исключением экспериментальной части описания, все численные значения, выражающие какие-либо количества и условия в настоящем изобретении, являются приближенными, и их следует читать, как предваряемые термином «приблизительно» или «около», даже если эти термины и не приводятся в явном виде. Напротив, в экспериментальной части описания все численные величины приведены настолько точно, насколько это возможно, однако следует понимать, что любая экспериментально определенная величина по природе своей несет в себе некоторую погрешность. Таким образом, все численные величины, приведенные в экспериментальной части описания, следует воспринимать с учетом существования указанной экспериментальной погрешности и, по меньшей мере, с учетом количества приведенных значащих цифр и стандартных методик округления.
В настоящем документе все проценты являются массовыми, если явно не указано иное.
Как указано выше, настоящее изобретение основано на искусственной роговице, представленной коллагеновой мембраной, которая в гидратированном состоянии является коллагеновым гидрогелем гетерогенной плотности, имеющим форму плоского цилиндра, основным компонентом которого является коллаген I типа в концентрации, обеспечивающей необходимую жесткость искусственной роговицы.
Помимо коллагена I типа в состав предлагаемой искусственной роговицы входит коллаген V типа, добавление которого позволяет регулировать размер фибрилл в коллагеновом гидрогеле, а следовательно прозрачность готового изделия.
Предпочтительно коллаген I типа и/или коллаген V типа в настоящем изобретении являются нативным коллагеном I типа и/или нативным коллагеном V типа, соответственно. Под нативностью коллагена (в частности, коллагена I типа) в настоящем изобретении понимается то, что данный белок был экстрагирован в раствор из ткани без ферментативной обработки пепсином или другими протеолитическими препаратами.
Коллаген I типа и коллаген V типа для использования в настоящем изобретении могут быть получены известными методами из различных животных, включая свиней, крыс, коров, людей и т.п. В наиболее предпочтительном варианте в рамках настоящего изобретения коллаген является коллагеном свиней.
В предпочтительном варианте осуществления искусственной роговицы по изобретению на коллаген I типа приходится от 75 до 95% мас., наиболее предпочтительно от 85 до 90% мас. от совокупной массы коллагена в искусственной роговице.
В предпочтительном варианте осуществления искусственной роговицы по изобретению на коллаген V типа приходится от 5 до 25% мас., наиболее предпочтительно от 10 до 15% мас. от совокупной массы коллагена в искусственной роговице.
Толщина искусственной роговицы по изобретению в гидратированном состоянии предпочтительно лежит в диапазоне от 0,4 до 1,2 мм, более предпочтительно от 0,5 до 0,8 мм. При этом, в некоторых вариантах осуществления изобретения толщина искусственной роговицы может быть неоднородной, например толщина центральной части искусственной роговицы может быть меньше толщины ее периферической части.
Одним из отличительных признаков искусственной роговицы по изобретению является ее гетерогенная плотность, а именно наличие на периферии роговицы области с повышенным содержанием нативного коллагена I типа в форме кольца (называемого также «уплотненным кольцом»). Такое кольцо облегчает фиксацию мембраны в операционном ложе и ускоряет процесс интеграции искусственной роговицы с окружающими тканями.
Внутренний диаметр уплотненного кольца обычно составляет от 7 до 10 мм. Внешний диаметр уплотненного кольца обычно составляет около 12 мм.
Максимальная нагрузка на разрыв искусственной роговицы по изобретению, как правило, равна 10 Н или более, например максимальная нагрузка на разрыв может лежать в диапазоне от 10 Н до 30 Н, наиболее предпочтительно – в диапазоне от 10 до 25 Н.
Коэффициент пропускания света в диапазоне длин волн от 400 до 780 нм (прозрачность) искусственной роговицы по изобретению, как правило, составляет не менее, чем 85% при толщине искусственной роговицы 1,0 мм, в случае, когда мембрана изготовлена из раствора коллагена с концентрацией 20 мг/мл.
Искусственная роговица по изобретению может быть получена способом получения согласно второму варианту осуществления изобретения, где указанный способ включает стадию образования геля и стадию витрификации при постоянной пластической компрессии.
Стадия образования геля
Для осуществления стадии образования геля наиболее предпочтительно используют стерильный прозрачный водный раствор, содержащий нативный коллаген свиньи I типа и коллаген свиньи V типа, полученный в соответствии с описанием изобретения, приведенным в заявке на выдачу патента РФ на изобретение № 2019106356 от 06.03.2019. Для наглядности, ниже приводится краткое описание способа получения стерильного прозрачного концентрированного раствора биосовместимого коллагена согласно заявке № 2019106356.
Этот способ получения раствора коллагена включает несколько этапов, выполняемых в заданной последовательности:
1) экстракция коллаген-содержащей ткани, такой как сухожилия, плацента млекопитающих животных, таких как бык, свинья, крыса или человек, в раствор разбавленной (не более 0,5 М) органической кислоты после тщательной отмывки от белковых неколлагеновых примесей с использованием щелочных или нейтральных водно-солевых растворов (например, 0,5М Na2HPO4) и от примесных белков, гликопротеинов, жиросодержащих агрегатов с использованием органических растворителей (например, ацетон, этанол, ацетонитрил);
2) многократная (не менее 3 раз) очистка кислого водно-солевого экстракта от потенциально иммуногенных макромолекул путем избирательного осаждения коллагена высокими концентрациями хлорида натрия (до 3М) при низкой температуре раствора (менее 10°С);
3) Очистка кислого водно-солевого экстракта от оставшихся примесей потенциально иммуногенных макромолекул методом адсорбции оставшихся примесей на ДЭАЭ-целлюлозе;
4) Очистка от пирогенных примесей методом адсорбции липосахаридов на аффинном сорбенте (например, с иммобилизованным полимиксином (Affi-Prep®) или специфичными к ЛПС антителами);
5) Очистка от примесей обычных и спорообразующих микроорганизмов, а также надмолекулярных агрегатов коллагена методом микрофильтрации кислых растворов коллагена через мембраны с диаметром пор 0,22-0,45 мкм;
6) Доведение раствора коллагена до требуемой концентрации в нем белка-коллагена, молекулы которого сохраняют структуру тройной спирали и имеют молекулярную массу не менее 300 кДа, одним из известных методов: ультрафильтрация, упаривание, лиофилизация и растворение, или абсорбция воды нерастворимыми гидрофильными полимерами.
Общая концентрация коллагена в водном растворе коллагена, используемом в настоящем изобретении, может быть подобрана специалистом в данной области техники, но обычно она лежит в диапазоне от 5 до 35 мг/мл, наиболее предпочтительно – в диапазоне от 10 до 25 мг/мл.
Получение гидрогеля из водного раствора коллагена может быть осуществлено специалистами согласно известным методикам.
В одном варианте осуществления для формирования коллагенового гидрогеля необходимый объем стерильного прозрачного раствора коллагена аккуратно, избегая появления пузырьков воздуха, добавляют в цилиндрическую чашу. Далее чашу с раствором центрифугируют, например при скорости вращения ротора 3000-5000 об/мин, наиболее предпочтительно 4000 об/мин. Центрифугирование предпочтительно осуществляют при температуре +5°С в течение 30 мин. После завершения центрифугирования форму с раствором коллагена инкубируют в парах аммиака. В предпочтительном варианте осуществления инкубирование в парах аммиака проводят при +4°С в течение 12 часов. Полученный коллагеновый гидрогель извлекают из формы и инкубируют в стерильной очищенной воде. В предпочтительном варианте осуществления инкубирование в стерильной очищенной воде проводят в течение 24 часов при +20°С. В качестве стерильной очищенной воды может быть использована вода, очищенная известными специалисту методами, такими как дистилляция, обратный осмос и т.п.
Следующий этап способа по изобретению представляет собой компрессионную витрификацию. На данном этапе осуществляют сушку коллагенового гидрогеля. В предпочтительном варианте осуществления сушку осуществляют в условиях контролируемой температуры и влажности, например при 20°С и при относительной влажности 60-70%. Одновременно с сушкой коллагеновый гидрогель цилиндрической формы подвергают пластической компрессии, путем приложения к основаниям гидрогеля постоянной нагрузки. В предпочтительно варианте осуществления нагрузку 15-50 г, предпочтительно 30 г, прикладывают на протяжении всего времени сушки (см. Фиг. 1). Прикладывание нагрузки во время сушки позволяет сформировать на периферии мембраны уплотненное кольцо, которое облегчает фиксацию искусственной роговицы в операционном ложе. Размер такого кольца можно регулировать за счет изменения диаметра исходного гидрогеля и/или изменения прикладываемой нагрузки. По окончании процесса витрификации компрессированный коллагеновый гидрогель переходит в форму стеклоподобной мембраны с уплотненным внешним кольцом.
Применение искусственной роговицы, полученной в соответствии с настоящим изобретением, может быть осуществлено специалистом в рассматриваемой области техники согласно известным методикам. В частности, искусственная роговица по изобретению может быть использована для усиления биомеханических характеристик роговицы человека без потери ее прозрачности; для усиления биомеханических характеристик бельм роговицы с целью их подготовки к кератопротезированию; для лечения методом DALK несквозных бельм роговицы, при которых не повреждена десцеметова мембрана и сохранены эндотелиальные клетки, находящиеся на ней; и/или для создания тканеинженерной конструкции аналога роговицы путем формирования слоя эпителиальных клеток роговицы человека на одной из поверхностей искусственной роговицы, и формирования слоя эндотелиальных клеток роговицы человека на противоположной поверхности искусственной роговицы.
Далее в описании более подробно описаны осуществление изобретения, способ изготовления искусственной роговицы и ее применение. Приведенные примеры являются иллюстративными и не должны восприниматься, как основание для ограничения притязаний по изобретению.
Пример 1. Способ изготовления искусственной роговицы.
Для приготовления искусственной роговицы с гетерогенной плотностью был использован стерильный прозрачный водный раствор, содержащий 9 мг/мл нативного коллагена свиньи I типа и 1 мг/мл коллагена свиньи V типа, полученный согласно заявке на патент РФ на изобретение № 2019106356, как раскрыто выше в настоящем изобретении. Для формирования коллагенового гидрогеля 2 мл стерильного прозрачного раствора коллагена аккуратно, избегая появления пузырьков воздуха, добавляют в цилиндрическую чашу с диаметром 15 мм. Далее чашу с раствором центрифугируют на скорости 4000 об/мин при температуре +5°С в течение 30 мин. После чего форму с раствором коллагена инкубируют в парах аммиака при +4°С в течение 12 часов. Полученный коллагеновый гидрогель извлекают из формы и инкубируют в 20 мл стерильной дистиллированной воде в течение 24 часов при +20°С.
Затем производят сушку коллагенового гидрогеля в условиях контролируемой температуры (20°С) и влажности (60-70%). Одновременно с этим коллагеновый гидрогель цилиндрической формы подвергается пластической компрессии путем приложения к основаниям гидрогеля постоянной нагрузки в 30 г на протяжении всего времени сушки. Это позволяет сформировать на периферии мембраны уплотненное кольцо, которое необходимо для фиксации искусственной роговицы в операционном ложе. По окончании процесса витрификации компрессированный коллагеновый гидрогель переходит в форму стеклоподобной мембраны с уплотненным внешним кольцом. Перед применением мембрану регидратировали в 0,1 мл стерильного физиологического раствора. Толщина мембраны после регидратации составила 0,61±0,04 мм, внутренний диаметр уплотненного кольца составил 10 мм (см. Фиг. 3).
Измерение максимальной нагрузки на разрыв
Полученную коллагеновую мембрану зажимали между двух металлических пластин с отверстием 3 мм в центре, таким образом, чтобы отверстие было в центральной области. Готовую конструкцию опускали в физиологический раствор, чтобы препятствовать высыханию мембраны во время исследования. Биомеханические свойства оценивали, используя масштабированный аналог теста ASTM D5748. Исследование состоит в двухосном нагружении коллагеновой мембраны с постоянной скоростью до прокола. Испытания проводили на универсальной испытательной машине фирмы «Instron» модель 5982 с использованием датчика нагрузки ±50 Н серии 2530. По результатам испытаний определялась максимальная нагрузка на разрыв, характеризующая прочность образцов, которая для данной мембраны составила 15±2Н.
Пример 2. Влияние концентрации коллагена в растворе, используемом для приготовления искусственной роговицы, на ее биомеханические свойства.
Для того, чтобы искусственная роговица успешно интегрировалась с окружающими тканями, она должна обладать достаточными механическими свойствами, близкими к свойствам нативной роговицы человека.
Задача состояла в том, чтобы определить максимальную нагрузку, которую необходимо приложить к изделию, чтобы разорвать его. В соответствии с методом, описанном в примере 1, используя исходно стерильные прозрачные растворы коллагена, в которых концентрация коллагена варьировалась от 5 мг/мл до 35 мг/мл, были приготовлены образцы изделия толщиной 500 мкм с различным содержанием коллагена, и следовательно с различными прочностными характеристиками. Как и ожидалось, увеличение содержания коллагена в изделии приводит к усилению его прочностных характеристик. При этом, как видно из таблицы 1, когда концентрация коллагена в растворе, используемом для приготовления изделия, начинает превышать 10 мг/мл, то прочностные характеристики изделия достигают или превышают прочностные характеристики нормальной роговицы человека (максимальная нагрузка на разрыв для нормальной роговицы человека - 12 ±2 H)
Таблица 1
| Максимальная нагрузка на разрыв, Н | Концентрация коллагена в растворе, мг/мл |
| 8,3 ± 0,5 | 5 |
| 10,5 ± 0,5 | 10 |
| 12,2 ± 0,8 | 15 |
| 15,2 ± 0,6 | 20 |
| 17,1 ± 0,3 | 25 |
| 25,2 ± 0,3 | 30 |
| 32,1 ± 0,2 | 35 |
Пример 3. Влияние концентрации коллагена в растворе, используемом для приготовления искусственной роговицы, на ее прозрачность
В соответствии с методом, описанным в примере 1, используя стерильные прозрачные растворы коллагена, в которых концентрация коллагена варьировалась от 5 мг/мл до 35 мг/мл, были приготовлены образцы изделия толщиной 500 мкм и 700 мкм с различным содержанием коллагена. Контроль прозрачности коллагеновых гидрогелей был проведен при помощи планшетного спектрофотометра (xMarkTM, Biorad) в видимом спектре длин волн. Из результатов, представленных в таблице 2, видно, что при концентрации коллагена в растворе, используемом для приготовления изделия, превышающей 25 мг/мл, и при обоих вариантах толщины мембраны, пропускание видимого света становится менее 90%, что не вполне соответствует требованиям прозрачности.
Таблица 2
| Концентрация коллагена в растворе, мг/мл | Пропускание видимого света через изделие толщиной 500 мкм, % | Пропускание видимого света через изделие толщиной 700 мкм, % |
| 5 | 99 | 98 |
| 10 | 97 | 96 |
| 15 | 95 | 94 |
| 20 | 93 | 92 |
| 25 | 92 | 91 |
| 30 | 85 | 82 |
| 35 | 78 | 77 |
Пример 4. Определение оптимального соотношения между коллагеном I типа и коллагеном V типа в искусственной роговице.
По методике, описанной в примере 1, используя стерильные прозрачные растворы коллагена, в которых общее содержание коллагена составляло 25 мг/мл, была приготовлена линейка изделий, имеющих различные соотношения между коллагеном I типа и коллагеном V типа. Полученные изделия исследовали по свойствам прозрачности и биомеханических характеристик. Контроль прозрачности коллагеновых гидрогелей был проведен при помощи планшетного спектрофотометра (xMarkTM, Biorad) в видимом спектре длин волн, а биомеханические характеристики изделий определяли по методике, описанной в примере 1.
Как видно из результатов, представленных в таблице 3, изделие, изготовленное полностью из коллагена I типа, обладает наилучшими прочностными характеристиками, однако прозрачность изделия, процент пропускания видимого света через изделие, не достигал 90%, что считалось неудовлетворительным. Добавление коллагена V типа в состав изделия позволяет улучшить прозрачность, однако при этом ухудшаются прочностные характеристики. Таким образом, оптимальным соотношением между коллагеном I типа и коллагеном V типа в конечном изделии с точки зрения прозрачности и прочности является следующее - коллаген I типа 85-90%, коллаген V типа - 10-15%.
Таблица 3
| Количество коллагена I типа в изделии, % | Количество коллагена V типа в изделии, % | Максимальная нагрузка на разрыв, Н | Пропускание видимого света через изделие толщиной 700 мкм, % |
| 100 | 0 | 23,2 ± 0,6 | 83 |
| 95 | 5 | 19,1 ± 0,7 | 87 |
| 90 | 10 | 17,1 ± 0,3 | 91 |
| 85 | 15 | 13,7 ± 0,8 | 95 |
| 80 | 20 | 9,3 ± 0,5 | 96 |
| 75 | 25 | 8.2 ± 0,5 | 97 |
Пример 5. Способ проведения операции глубокой послойной пересадки роговицы (DALK) с использованием искусственной роговицы по изобретению.
По методике, описанной в примере 1, было изготовлено несколько искусственных роговиц. Эксперимент проводили на 30 кроликах-самцах породы Шиншилла. Операцию на глазах кроликов выполняли под микроскопом фирмы «Leica» при увеличении в 15 раз, использовали расслаиватель и шовный материал фирмы «Mani». Ход операции был следующим. Для анестезии животным выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% ультракаином. При помощи трепана формировалась круговая насечка на роговице на половину ее толщины. Ножом-расслаивателем осуществлялось удаление поверхностных слоев роговицы в пределах сформированного разреза до десцеметовой мембраны. В сформированное ложе имплантировали искусственную роговицу и фиксировали непрерывным швом. Сверху имплантат фиксировали при помощи жесткой линзы для защиты коллагена от смаргивания и других механических повреждений.
Результаты
В первые сутки после операции у животных глаз был умеренно раздражен, передняя камера глаза глубокая, влага передней камеры прозрачная. Было отмечено наличие незначительной перикорнеальной инъекции, полное отсутствие слизистой гнойной отделяемой. Искусственная роговица сохранила прозрачность, сохранялась реакция зрачка на свет, что свидетельствовало о минимальном уровне хирургической травмы. Через две недели после операции отмечалось видимое офтальмоскопически прирастание коллагеновой мембраны к роговице в области контакта. Сама искусственная роговица была полностью покрыта эпителием. Через три недели после операции ситуация с общим состоянием глаза для животных не изменилась. У животных оптический срез роговицы был абсолютно прозрачен во всех секторах зоны операции. Глаз был спокоен, перикорнеальная инъекция, неоваскуляризация, слезотечение и слизистая отделяемая отсутствовали (см. рис. 4).
Пример 6. Преимущества, достигаемые при использовании нативного коллагена I типа.
По методике, описанной в примере 1, было изготовлено две группы искусственных роговиц. В первую группу вошли изделия, изготовленные из раствора нативного коллагена свиньи I типа (полученного согласно заявке на патент РФ на изобретение №2019106356 от 06.03.2019). Во вторую группу вошли изделия, изготовленные из ателоколлагена свиньи I типа (продукт P C11-AD, ООО фирмы «Имтек», Россия), т.е. коллагена, который на этапе изготовления был подвергнут обработке пепсином.
Операцию на глазах кроликов выполняли под микроскопом фирмы «Leica» при увеличении в 15 раз, использовали расслаиватель и шовный материал фирмы «Mani». Ход операции был следующим. Для анестезии животным выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% ультракаином. При помощи трепана формировалась круговая насечка на роговице на половину ее толщины. Ножом-расслаивателем осуществлялось удаление поверхностных слоев роговицы в пределах сформированного разреза до десцеметовой мембраны. В сформированное ложе имплантировали искусственную роговицу и фиксировали непрерывным швом. Сверху имплантат фиксировался при помощи жесткой линзы для защиты коллагена от смаргивания и других механических повреждений.
Результаты
В обеих группах операция проходила без осложнений. В первые сутки после операции у животных из всех групп глаз был умеренно раздражен, передняя камера глаза глубокая, влага передней камеры прозрачная. Было отмечено наличие незначительной перикорнеальной инъекции, полное отсутствие слизистой гнойной отделяемой. Искусственная роговица сохранила прозрачность, сохранялась реакция зрачка на свет, что свидетельствовало о минимальном уровне хирургической травмы. Через две недели после операции у всех прооперированных кроликов, за исключением кроликов, которым имплантировали искусственную роговицу на основе нативного коллагена I типа, наметились прорезания искусственной роговицы в области швов, которые привели к отрыву материала через три-четыре недели после проведения операции. У животных, которым имплантировали искусственную роговицу на основе нативного коллагена, через две недели после операции отмечалось видимое офтальмоскопически прирастание имплантата к роговице в области контакта. Сама искусственная роговица была полностью покрыта эпителием. Таким образом, искусственная роговица, приготовленная из нативного коллагена I типа, обладала более высокой биосовместимостью.
Пример 7. Способ усиления биомеханических характеристик роговицы с использованием искусственной роговицы.
По методике, описанной в примере 1, было изготовлено пятнадцать искусственных роговиц. Операцию на глазах кроликов выполняли микроскопом фирмы «Leica» при увеличении в 15 раз; использовали расслаиватель и шовный материал фирмы «Mani». Ход операции был следующим. Для анестезии животным выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% ультракаином. Производился разрез роговицы протяженностью 5 мм концентрично лимбу. В данной плоскости при помощи расслаивателя формировали роговичный интрастромальный карман «от лимба до лимба». В полость сформированного кармана имплантировали искусственную роговицу, у которой предварительно было удалено уплотненное кольцо. Разрез ушивался с использованием шовного материала. Через неделю после операции оптический срез роговицы был абсолютно прозрачен во всех секторах зоны операции, и ситуация не изменялась на протяжении всего опыта.
Для исследования биомеханических характеристик по пять животных выводились из эксперимента через 1 месяц, 2 месяца и 3 месяца после операции. Глаза животных энуклеировали, роговую оболочку вырезали по окружности, захватывая при этом участок склеры. Полученные таким образом экспериментальные роговицы зажимали между двух металлических пластин с отверстием 3 мм в центре, таким образом, чтобы отверстие было в центральной области. Готовую конструкцию опускали в физиологический раствор, чтобы препятствовать высыханию ткани во время исследования. Биомеханические свойства оценивали, используя масштабированный аналог теста ASTM D5748. Исследование состоит в двухосном нагружении материала с постоянной скоростью до прокола. Испытания проводили на универсальной испытательной машине фирмы «Instron» модель 5982 с использованием датчика нагрузки ±50 Н серии 2530. Полученные результаты представлены в таблице 4. Как видно из таблицы 4, в результате проведенной операции, через 3 месяца после операции биомеханические характеристики роговицы возрастают примерно в три раза, при этом сохраняется оптическая прозрачность оперированной роговицы.
Таблица 4
| Образец | Максимальная нагрузка на разрыв, Н |
| Роговица кролика через 1 месяц после интрастромальной имплантации изделия | 14,8±0,7 |
| Роговица кролика через 2 месяца после интрастромальной имплантации изделия | 20,1±1,1 |
| Роговица кролика через 3 месяца после интрастромальной имплантации изделия | 26,3±1,2 |
| Интактная роговица кролика | 10,2±1,2 |
1. Искусственная роговица, представляющая собой мембрану гетерогенной плотности, изготовленную из коллагена, включающего нативный коллаген I типа и нативный коллаген V типа.
2. Искусственная роговица по п. 1, в которой содержание коллагена I типа составляет от 75 до 95% мас., предпочтительно от 85 до 90% мас. в расчете на совокупную массу коллагена в искусственной роговице, и содержание коллагена V типа составляет от 5 до 25% мас., предпочтительно от 10 до 15% мас. в расчете на совокупную массу коллагена в искусственной роговице.
3. Искусственная роговица по любому из пп. 1, 2, в которой нативный коллаген I типа является нативным коллагеном свиньи I типа, а нативный коллаген V типа является нативным коллагеном свиньи V типа.
4. Искусственная роговица по любому из пп. 1-3, которая является биосовместимой, стерильной и оптически прозрачной.
5. Искусственная роговица по любому из пп. 1-4, прозрачность которой характеризуется коэффициентом пропускания света в диапазоне длин волн от 400 до 780 нм, составляющим не менее 85% при толщине мембраны 1,0 мм, в случае, когда мембрана изготовлена из раствора коллагена с концентрацией 20 мг/мл.
6. Искусственная роговица по любому из пп. 1-5, периферическая часть которой представляет собой уплотненное коллагеновое кольцо с внутренним диаметром от 7 до 10 мм и/или внешним диаметром 12 мм, облегчающее фиксацию изделия швами в зоне операции.
7. Способ получения искусственной роговицы по любому из пп. 1-6, включающий следующие стадии:
а) стадию получения гидрогеля из стерильного прозрачного водного раствора коллагена;
б) стадию витрификации гидрогеля при постоянной пластической компрессии с получением стеклоподобной мембраны гетерогенной плотности, включающей структуру уплотненного кольца.
8. Способ по п. 7, в котором раствор коллагена, используемый для формирования гидрогеля, имеет концентрацию от 5 до 35 мг/мл, предпочтительно от 10 до 25 мг/мл.
9. Способ по п. 7 или 8, в котором раствор коллагена содержит от 75 до 95% мас., предпочтительно от 85 до 90% мас. нативного коллагена I типа в расчете на совокупную массу коллагена в растворе, и от 5 до 25% мас., предпочтительно от 10 до 15% мас. коллагена V типа в расчете на совокупную массу коллагена в растворе.
10. Способ по любому из пп. 7-9, в котором получение гидрогеля осуществляют путем центрифугирования раствора коллагена в цилиндрическом сосуде, инкубирования в парах аммиака с последующим инкубированием в стерильной очищенной воде.
11. Способ по любому из пп. 7-10, в котором стадию витрификации осуществляют в условиях контролируемой температуры и влажности, предпочтительно при температуре 20°С и при относительной влажности 60-70%.
12. Способ по любому из пп. 7-11, в котором пластическую компрессию осуществляют путем приложения к основаниям коллагенового гидрогеля постоянной нагрузки в 15-50 г, предпочтительно 30 г, на протяжении всего времени витрификации.
13. Применение искусственной роговицы по любому из пп. 1-6 для усиления биомеханических характеристик роговицы человека без потери ее прозрачности.
14. Применение искусственной роговицы по любому из пп. 1-6 для усиления биомеханических характеристик бельм роговицы человека с целью их подготовки для кератопротезирования.
15. Применение искусственной роговицы по любому из пп. 1-6 для лечения методом DALK несквозных бельм роговицы, при которых не повреждена десцеметова мембрана и сохранены эндотелиальные клетки, находящиеся на ней.
16. Применение искусственной роговицы по любому из пп. 1-6 для создания тканеинженерной конструкции аналога роговицы путем формирования слоя эпителиальных клеток роговицы человека на одной из поверхностей мембраны и формирования слоя эндотелиальных клеток роговицы человека на противоположной стороне мембраны.
