Способы диагностики неоплазий женских репродуктивных органов
Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для анализа наличия неоплазии женских репродуктивных органов или озлокачествления неоплазии женских репродуктивных органов с учетом гиперметилирования одного или нескольких маркерных генов. Для этого из образца цервикального соскоба определяют статус метилирования по меньшей мере одного гена-мишени, выбранного из группы BHLHE22, CELF4, CLVS2 и THY1. Гиперметилирование одного из них свидетельствует о карциноме эндометрия. Также предложены способы анализа карциномы яичников и карциномы кишечника при определении гиперметилирования гена CLVS2 в образце от индивидуума. Группа изобретений позволяет поставить диагноз до развития злокачественного новообразования в более злокачественную стадию. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл., 3 пр.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] 1. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Настоящее изобретение относится к диагностике злокачественных новообразований. Более конкретно, изобретение относится к способу диагностики злокачественных новообразований с учетом статуса метилирования выбранных маркеров.
[0003] 2. ОПИСАНИЕ СВЯЗАННОЙ ОБЛАСТИ
[0004] Злокачественные новообразования женских репродуктивных органов представляют собой неконтролируемый рост аномальных клеток, происходящих из женских репродуктивных органов. Множество типов злокачественных новообразований женских репродуктивных органов включает злокачественные новообразования шейки матки, яичников, эндометрия/матки (далее в настоящем описании обозначаемых как рак эндометрия), влагалища и наружных половых органов, в то время как некоторые редкие злокачественные новообразования женских репродуктивных органов включают гестационную трофобластическую болезнь (GTD) и первичный рак брюшины.
[0005] Рак эндометрия (EC) является основным гинекологическим злокачественным новообразованием в США и шестым по частоте диагностики злокачественным новообразованием у женщин во всем мире. Согласно проекту GLOBOCAN Всемирной организации здравоохранения, в 2012 году частота и смертность при EC составляли приблизительно 310000 и 76000, соответственно, и ожидают более 380000 новых случаев и 93000 случаев гибели от EC в 2020 году.
[0006] Большинство случаев рака эндометрия обнаруживают у женщин, проходящих или прошедших период менопаузы. Однако, в случае тех, у кого не наблюдают каких-либо признаков или симптомов, нет простых и надежных способов тестирования на рак матки. В случае пациентов, у которых наблюдают симптомы или имеющих более высокий риск рака эндометрия, для облегчения диагностики или исключения рака матки можно осуществлять биопсию эндометрия или трансвагинальное ультразвуковое исследование.
[0007] EC можно приблизительно классифицировать на два типа посредством гистопатологической оценки. EC типа I включает хорошо или умеренно дифференцированные (степени 1-2) эндометриоидные аденокарциномы. EC типа II включает серозные, светлоклеточные и плохо дифференцированные (степени 3) формы эндометриоидного типа. Большинство EC типа I диагностируют на ранних стадиях (стадии I или II), и они имеют благоприятный исход, в то время как EC типа II, как правило, диагностируют на поздних стадиях, и они имеют относительно неблагоприятный прогноз. Хотя большинство пациентов с EC эндометриоидного типа диагностируют на ранних стадиях, 15% пациентов с эндометриоидным EC на поздних стадиях имеют плохой 5-летний коэффициент выживаемости, составляющий менее 50% (40-50% для стадии III, 15-20% для стадии IV). Ранняя диагностика остается лучшим способом улучшения исхода. Однако в настоящее время не существует удовлетворительных способов скрининга EC.
[0008] Аномальное маточное кровотечение является наиболее частым симптомом EC, но многие другие нарушения имеют тот же симптом. Даже когда кровотечение происходит у женщин после менопаузы, только 10% его случаев вызвано EC. Выбор идеальной стратегии диагностики зависит от чувствительности, специфичности, точности и затрат. Для исключения используют EC трансвагинальное ультразвуковое исследование (TVU). Однако, пороговое значение при TVU у женщин перед менопаузой с симптомами и женщин, подвергаемых гормонозаместительной терапии, является более низким из-за изменений толщины эндометрия под действием циркулирующих женских стероидных гормонов. В случае образцов эндометрия, получаемых посредством вакуумного выскабливания в амбулаторных условиях, можно достигать более высокой чувствительности и специфичности по сравнению с TVU. Кроме того, частота ошибок при этой инвазивной процедуре может составлять до 54%. В клинических руководствах рекомендуют фракционную дилатацию и выскабливание (D & C) под анестезией, если анализ образца эндометрия является недостаточным или не исключает диагноз. Таким образом, многих пациентов подвергают повторным инвазивным анализам посредством получения образца эндометрия или D & C, что является неудобным, вызывающим стресс и затратным.
[0009] С другой стороны, диагностическая точность гистероскопии может достигать общей чувствительности 86,4% и специфичности 99,2% у женщин до и после менопаузы. Несмотря на это, существует дискуссия вокруг лучшего порогового значения толщины эндометрия, определяемой с использованием TVU, обосновывающей получение образца эндометрия или гистероскопии. Неинвазивными способами детекции наличия или отсутствия EC являются измерения концентраций антигена злокачественной опухоли 125 (CA-125) в сыворотке и в шейке матке и влагалище. Точности при использовании CA-125 в качестве индикатора мешают доброкачественные состояния, такие как аденомиоз, миомы матки и эндометриоз. Для детекции EC также используют цитологический анализ цервикальных соскобов, но коэффициент аномальных результатов составляет от 32,3% до 86,0% в случае EC типа I и от 57,1% до 100% в случае EC типа II.
[0010] В свете изложенного выше, с этой области существует потребность в способах для применения в диагностике опухолей женских репродуктивных органов, в частности, рака эндометрия.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Далее представлена упрощенная сущность изобретения для обеспечения базового понимания читателем. Эту сущность не представляет собой обширный обзор изобретения, и в нем не определены ключевые/критические элементы настоящего изобретения или объем настоящего изобретения. Единственной целью является представление некоторых идей, представленных в настоящем описании, в упрощенной форме в качестве вступления к более подробному описанию, представленному ниже.
[0012] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу оценки того, имеет ли индивидуум рак эндометрия (EC).
[0013] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает следующие стадии:
(a) получения образца из индивидуума;
(b) определения статуса метилирования по меньшей мере одного гена-мишени в образце, где по меньшей мере один ген-мишень является BHLHE22 (SEQ ID NO: 1) или THY1 (SEQ ID NO: 2) или и тем, и другим;
(c) определения того, является ли по меньшей мере один ген-мишень гиперметилированным; и
(d) оценки того, имеет ли индивидуум EC с учетом результатов стадии (c), где гиперметилирование по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум имеет EC.
[0014] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения образец является образцом, полученным из индивидуума, предпочтительно - человека, или находящимся в индивидууме, предпочтительно - человеке. Например, образец получают из образцов ткани или клеток эндометрия (например, клеток цервикального соскоба) индивидуума.
[0015] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один ген-мишень дополнительно включает по меньшей мере один из следующих дополнительных генов: ADARB2 (SEQ ID NO: 3), CDO1 (SEQ ID NO: 4), CELF4 (SEQ ID NO: 5), CLVS2 (SEQ ID NO: 6), GATA4 (SEQ ID NO: 7), HOXA9 (SEQ ID NO: 8), MTMR7 (SEQ ID NO: 9), NTM (SEQ ID NO: 10), PRKCDBP (SEQ ID NO: 11), TBX5 (SEQ ID NO: 12) и ZNF662 (SEQ ID NO: 13). В этих вариантах осуществления определяют статус метилирования BHLHE22 и/или THY1 и статус метилирования по меньшей мере одного из дополнительных генов, и на стадии (d) анализ осуществляют с учетом статуса гиперметилирования указанных выбранных генов.
[0016] В других вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22, CDO1, THY1, CELF4, CLVS2, GATA4, NTM, PRKCDBP и TBX5.
[0017] В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22 и CDO1. В других случаях по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22 и CELF4. Альтернативно, по меньшей мере один ген включает BHLHE22, CDO1 и CELF. В этих случаях на стадии (b) определяют статус метилирования BHLHE22 и одного или обоих из CDO1 и CELF4, и на стадии (d) анализ осуществляют с учетом статуса гиперметилирования BHLHE22 и одного или обоих из CDO1 и CELF4. В необязательных вариантах осуществления настоящего изобретения образец получают из клеток цервикального соскоба индивидуума.
[0018] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения рак эндометрия является раком эндометрия типа I, в то время как в других вариантах осуществления рак эндометрия является раком эндометрия типа II.
[0019] Необязательно, стадию определения статуса метилирования гена, как описано в указанных выше вариантах осуществления настоящего изобретения, можно осуществлять посредством метилирование-специфической полимеразной цепной реакции (MSP), количественной метилирование-специфической полимеразной цепной реакции (qMSP), бисульфитного секвенирования (BS), бисульфитного пиросеквенирования, микрочипов, масс-спектрометрии, денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC), пиросеквенирования, иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDIP или mDIP) в комбинации с количественной полимеразной цепной реакцией, секвенирования с иммунопреципитацией метилированной ДНК (MeDIP-seq) или нанопорового секвенирования.
[0020] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу анализа того, имеет ли индивидуум карциному женских репродуктивных органов или карциному толстого кишечника.
[0021] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает следующие стадии:
(a) получения образца из индивидуума;
(b) определения статуса метилирования по меньшей мере одного гена-мишени в образце, где по меньшей мере один ген-мишень выбран из группы, состоящей из ADARB2 (SEQ ID NO: 3), CLVS2 (SEQ ID NO: 6), HOXA9 (SEQ ID NO: 8), MTMR7 (SEQ ID NO: 9) и NTM (SEQ ID NO: 10);
(c) определения того, является ли по меньшей мере один ген-мишень гиперметилированным; и
(d) анализа того, имеет ли индивидуум карциному женских репродуктивных органов или карциному толстого кишечника, с учетом результата, полученного на стадии (c), где гиперметилирование по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум имеет карциному женских репродуктивных органов или карциному толстого кишечника.
[0022] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения образец является образцом, полученным из индивидуума, предпочтительно - человека, или находится в индивидууме, предпочтительно - человеке. Например, образец получают из образцов ткани или клеток эндометрия (например, клеток цервикального соскоба) индивидуума.
[0023] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения карцинома женских репродуктивных органов является карциномой эндометрия типа I, карциномой эндометрия типа II, карциномой яичников, карциномой влагалища, карциномой наружных половых органов, гестационной трофобластической болезнью (GTD) и первичным раком брюшины.
[0024] Необязательно, стадию определения статуса метилирования гена, как описано в указанных выше вариантах осуществления настоящего изобретения, можно осуществлять посредством метилирование-специфической полимеразной цепной реакции (MSP), количественной метилирование-специфической полимеразной цепной реакции (qMSP), бисульфитного секвенирования (BS), бисульфитного пиросеквенирования, микрочипов, масс-спектрометрии, денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC), пиросеквенирования, иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDIP или mDIP) в комбинации с количественной полимеразной цепной реакцией, секвенирования с иммунопреципитацией метилированной ДНК (MeDIP-seq) или нанопорового секвенирования.
[0025] В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению биомаркеров, идентифицированных по настоящему изобретению. В частности, биомаркеры можно применять для получения диагностического набора для оценки того, имеет ли индивидуум карциному, ассоциированную с одним или несколькими из этих биомаркеров.
[0026] Как можно отметить, диагностические наборы, содержащие материалы, подходящие для измерения статуса метилирования указанных биомаркеров, также включены в объем настоящего изобретения.
[0027] Многие из сопутствующих признаков и преимуществ настоящего изобретения будут более понятны с учетом следующего подробного описания и сопутствующих чертежей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0028] Настоящее изобретение будет более понятным из следующего подробного описания с учетом сопутствующих чертежей, где:
[0029] Фигура 1 представляет собой корреляционную матрицу (панель A) и тепловую карту (панель B), на которых показаны сигнатуры метилирования генов-кандидатов в тканях согласно общедоступным данным из MBDcap-Seq и Атласа ракового генома (TCGA) в соответствии с демонстрационным примером из настоящего описания;
[0030] На фигуре 2 представлена точечная диаграмма, на которой представлено распределение статуса метилирования BHLHE22, CDO1, CELF4 и ZNF662 (панель A) и параметры указанных четырех генов (панель B) в соответствии с демонстрационным примером из настоящего описания;
[0031] На фигуре 3 приведен уровень метилирования ДНК 15 генов с использованием ткани эндометрия индивидуума для определения рака эндометрия в соответствии с демонстрационным примером из настоящего описания;
[0032] На фигуре 4 приведен уровень метилирования ДНК 1 генов с использованием цервикальных соскобов индивидуума для определения рака эндометрия в соответствии с демонстрационным примером из настоящего описания;
[0033] На фигуре 5 представлены графики, на которых указаны параметры генов-кандидатов с использованием образца из обучающей выборки (панель A) и тестовой выборки (панель B) в соответствии с демонстрационным примером из настоящего описания; и
[0034] На фигуре 6 приведены результаты перекрестного тестирования шести генов-кандидатов в других карциномах толстого кишечника, шейки матки или яичников в соответствии с демонстрационным примером из настоящего описания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0035] Подробное описание, представленное ниже со ссылкой на сопутствующие чертежи, должно служить описанием примеров настоящего изобретения, а не единственных форм, в которых пример можно осуществлять или использовать. В описании приведены функций примера и последовательности стадий для осуществления и использования примера. Однако те же или эквивалентные функции и последовательности можно осуществлять с помощью разных примеров.
[0036] Для удобства здесь собраны конкретные термины, используемые в описании, примерах и формулы изобретения. Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают значением, общепринято понятным специалисту в области, к которой относится изобретение.
[0037] Если контекст не указывает на иное, следует понимать, что термины в единственном числе должны включать их формы во множественном числе, и термины во множественном числе должны включать формы в единственном числе. В частности, в рамках изобретения формы в единственном числе включают ссылку на множественное число, если контекст четко не указывает на иное. Кроме того, в рамках изобретения термины "по меньшей мере один" и "один или несколько" обладают одинаковым значением и включают один, два, три или более. Кроме того, в рамках изобретения фразы "по меньшей мере один из A, B и C", "по меньшей мере один из A, B или C" и "по меньшей мере один из A, B и/или C" предназначены для включения только A, только B, только C, A и B вместе, B и C вместе, A и C вместе, а также A, B и C вместе.
[0038] Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, приведенные в описании, являются приблизительными, числовые значения, приведенные в конкретных примерах, представлены настолько точно, насколько это возможно. Однако, любое числовое значение, по существу, содержит конкретные ошибки, неизбежно возникающие из стандартного отклонения при соответствующих измерениях. Кроме того, в рамках изобретения термин "приблизительно", как правило, означает в пределах 10%, 5%, 1%, или 0,5% от указанного значения или диапазона. Альтернативно, термин "приблизительно" означает в пределах приемлемой стандартной ошибки среднего при рассмотрении специалистом в этой области. Кроме как в эксплуатационных/демонстрационных примерах, или если четко не указано иное, все числовые диапазоны, количества, значения и процентные доли, такие как количества материалов, длительность периодов времени, температуры, режим работы, соотношения количеств и т.п., представленные в настоящем описании, следует понимать как модифицированные термином "приблизительно" во всех случаях. Таким образом, если не указано иное, числовые параметры, приведенные в настоящем описании, являются приближениями, которые, при желании, можно варьировать. Как минимум, каждый числовой параметр следует, по меньшей мере, истолковывать в свете количества приведенных значимых знаков и с использованием общепринятых способов округления. В настоящем описании диапазоны можно выражать в виде диапазона от одной конечной точки до другой или диапазона между двумя конечными точками. Все диапазоны, представленные в настоящем описании, включают конечные точки, если не указано иное.
[0039] В рамках изобретения термин "диагностика" относится к идентификации патологического состояния или заболевания, такого как неоплазии различных органов женской репродуктивной системы, включая шейку матки, яичник, эндометрий/матку, влагалище, наружные половые органы, матку и перитонеальную выстилку матки. В некоторых случаях термин "диагностика" также относится к различению злокачественных и доброкачественных опухолей. В некоторых других случаях термин "диагностика" относится к различению злокачественной неоплазии и нормальных тканей.
[0040] На всем протяжении настоящего описания термин "неоплазия" относится к новому и аномальному росту клеток или росту аномальных клеток, воспроизводящихся быстрее нормальных. Неоплазия образует неструктурированную массу (опухоль), которая может являться доброкачественной или злокачественной. Термин "доброкачественный" относится к неоплазии или опухоли, являющейся незлокачественной, например, ее клетки не инвазируют окружающие ткани или не метастазируют в отдаленные участки; в то время как термин "злокачественный" относится к неоплазии или опухоли, являющейся метастазирующей, инвазирует смежную ткань или больше не находится под нормальным контролем роста клеток.
[0041] В рамках изобретения термин "злокачественное новообразование" относится ко всем типам злокачественных новообразований или злокачественной неоплазии или опухоли, обнаруживаемым у животных. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения способы направлены на диагностику одной или нескольких карцином гинекологического происхождения. Термин "карцинома" относится к злокачественной опухоли, происходящей из эпителиальных клеток. Неограничивающие примеры карцином женской репродуктивной системы по вариантам осуществления настоящего изобретения включают рак яичников, рак эндометрия, рак влагалища, рак наружных половых органов и первичный рак брюшины.
[0042] В рамках изобретения термин "метилирование" относится к ковалентному присоединению метильной группы в C5-положении цитозина в CpG-динуклеотидах основной промоторной области гена. Термин "статус метилирования" относится к наличию или отсутствию 5-метил-цитозина (5-mCyt) в одном или множестве CpG динуклеотидов в интересующем гене или последовательности нуклеиновой кислоты. В рамках изобретения термин "уровень метилирования" относится к степени метилирования в одной или нескольких копиях интересующего гена или последовательности нуклеиновой кислоты. Уровень метилирования можно вычислять в виде абсолютного значения метилирования в интересующем гене или последовательности нуклеиновой кислоты. Кроме того, "относительный уровень метилирования" можно определять как количество метилированной ДНК относительно общего количества присутствующей ДНК или как количество метилированных копий интересующего гена или последовательности нуклеиновой кислоты относительно общего количества копий гена или последовательность нуклеиновой кислоты. Кроме того, "уровень метилирования" можно определять как процентную долю метилированных участков CpG в интересующем фрагменте ДНК.
[0043] В рамках изобретения термин "профиль метилирования" относится к набору данных, соответствующих уровню метилирования одного или нескольких генов-мишеней в интересующем образце. В некоторых вариантах осуществления профиль метилирования сравнивают с референсным профилем метилирования, полученным из известного типа образца (например, образца злокачественного или незлокачественного новообразования или образцов на разных стадиях злокачественного новообразования).
[0044] В рамках изобретения термин "дифференциальное метилирование" относится к различию уровня метилирования одного или нескольких генов-мишеней в одном образце или группе по сравнению с уровнем метилирования указанного одного или нескольких генов-мишеней в другом образце или группе. Дифференциальное метилирование можно классифицировать как повышенное метилирование ("гиперметилирование") или сниженное метилирование ("гипометилирование"). В рамках изобретения термин "гиперметилирование" гена-мишени в тестируемом образце относится к повышенному уровню метилирования по меньшей мере на 10%, относительно среднего уровня метилирования гена-мишени в референсном образце. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения повышенный уровень метилирования может составлять по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50%.
[0045] Как можно отметить, все гены или полинуклеотидные последовательности, представленные в настоящем описании, соответственно, включают их варианты, имеющие по меньшей мере 75% идентичности нуклеотидной последовательности в отношении указанных генов или полинуклеотидных последовательностей. Кроме того, последовательности генов-мишеней также включают их нуклеотидную последовательность после бисульфитной конверсии. Таким образом, если четко не указано иное, все гены или полинуклеотидные последовательности, представленные в настоящем описании, следует понимать как модифицированные во всех случаях с помощью фразы "и их нуклеотидная последовательность после бисульфитной конверсии и полинуклеотидная последовательность, имеющая по меньшей мере 75% идентичности нуклеотидной последовательности по отношению к указанному гену или указанной нуклеотидной последовательности после бисульфитной конверсии".
[0046] Термин "процент (%) идентичности нуклеотидной последовательности" в отношении гена или нуклеотидной последовательности, определенных в настоящем описании, определяют как процентную долю нуклеотидных остатков в последовательности-кандидате, являющихся идентичными нуклеотидным остаткам в референсной полинуклеотидной последовательности после выравнивания последовательностей и включения пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности последовательности можно осуществлять различными способами, известными специалистам в этой области, например, с использованием общедоступного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в этой области могут определять подходящие параметры выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Процент идентичности указанной полинуклеотидной последовательности A по отношению к референсной полинуклеотидной последовательности B (которую альтернативно можно обозначать как указанную полинуклеотидную последовательность A, имеющую конкретный % идентичности нуклеотидной последовательности по отношению к референсной полинуклеотидной последовательности B) вычисляют по следующей формуле:
где X является количеством нуклеотидных остатков, подсчитанных как идентичные совпадения с помощью программы для выравнивания последовательностей BLAST при выравнивании A и B, и где Y является общим количеством нуклеотидных остатков в A или B, в зависимости от того, что является более коротким.
[0047] Термины "индивидуум" и "пациент" в настоящем описании используют взаимозаменяемо, и они предназначены для обозначения животного, включая человека, которое можно подвергать способам диагностики по настоящему изобретению. Таким образом, термин "индивидуум" или "пациент" включает любое млекопитающее, которое может получить пользу от способа по настоящему изобретению. Термин "млекопитающее" относится ко всем членам класса Млекопитающие, включая людей, приматов, домашних и сельскохозяйственных животных, таких как кролик, свинья, овца и крупный рогатый слой; а также животных, содержащихся в зоопарках, спортивных или домашних животных; и грызунов, таких как мышь и крыса. Термин "не относящееся к человеку млекопитающее" относится ко всем членам класса Млекопитающие, за исключением человека. В одном из примеров варианта осуществления пациент является человеком.
[0048] Термин "образец", используемый в настоящем описании, включает любые образцы, полученные от пациента. В вариантах осуществления настоящего изобретения образец содержит молекулы ДНК и, можно определять их уровень метилирования. Неограничивающие примеры таких образцов включают кровь, мазки, мокроту, мочу, стул, ликвор, желчь, желудочно-кишечные жидкости, лимфу, костный мозг при остеосаркоме, аспираты органов и биоптаты органов или тканей. Эти образцы можно получать из пациента общепринятыми способами, известными специалисту в этой области. Кроме того, специалистам в этой области также известны способы и реагенты для выделения ДНК из образца, например, выделения с использованием фенола/хлороформа или с помощью коммерческих наборов.
[0049] Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично, на обнаружении того, что дифференциальное метилирование (в частности, гиперметилирование) одного или нескольких генов-мишеней, как определено ниже, связано с прогрессированием опухоли или ее отсутствием у индивидуума. Таким образом, эти гены-мишени, в отдельности или в комбинации, можно использовать в качестве биомаркеров для прогнозирования риска или предрасположенности индивидуума к неоплазии, определения злокачественного характера неоплазии. Кроме того, профиль метилирования соответствующих генов пациента можно использовать в качестве руководства для индивидуальной адаптации подходящего режима терапии. Например, в случае пациентов с одним или несколькими гиперметилированными генами-мишенями, указанными в настоящем описании, для лечения неоплазии пациентам можно вводить деметилирующие средства или другие эпигенетические лекарственные средства.
[0050] В свете изложенного выше, настоящее изобретение относится к различным способам диагностики, которые будут отдельно описаны ниже. Например, все способы включают определение статуса метилирования или уровня метилирования по меньшей мере одного гена-мишени. Таким образом, стадии, общие для большинства, если не всех, способов по изобретению, сначала описаны в следующем параграфе.
[0051] В различных аспектах и/или вариантах осуществления настоящего изобретения общие стадии способов по настоящему изобретению включают, по меньшей мере, (a) стадию получения образцов, (b) по меньшей мере одну стадию определения статуса метилирования; и (c) по меньшей мере одну стадию определения гиперметилирования.
[0052] На стадии получения образцов, в случае способов, включающих использование живого индивидуума, по меньшей мере, биологический образец получают из индивидуума. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения образец является образцом, полученным из индивидуума, предпочтительно - человека, или находящимся в индивидууме, предпочтительно - человеке, включая ткань, образец ткани или образец клеток (например, образец, полученный посредством биопсии ткани, например, аспирационной биопсии, браш-биопсии, поверхностной биопсии, пункционной биопсии, щипковой биопсии, эксцизионной биопсии, операционной биопсии, инцизионной биопсии, эндоскопической биопсии, клетки цервикального соскоба, клетки соскоба матки или вагинальный лаваж), опухоль, образец опухоли или биологическую жидкость (например, перитонеальную жидкость, кровь (включая плазму), сыворотку, лимфу, спинномозговую жидкость). В конкретных демонстрационных примерах по настоящему изобретению образец получают из ткани яичника, образцов клеток (например, клетки цервикального соскоба) и физиологической жидкости (например, сыворотки и плазмы) индивидуума. Что касается способов, напрямую осуществляемых с использованием существующих биологических образцов, таких как образцы биоптатов ткани, клетки цервикального соскоба и образцы физиологических жидкостей (например, крови или мочи), указанную выше стадию получения пропускают и получают существующий образец для дальнейшего анализа.
[0053] Что касается стадии (b), статус метилирования определяют с использованием qMSP или бисульфитного пиросеквенирования в соответствии с демонстрационными примерами, представленными ниже. Однако, как можно отметить, способ по настоящему изобретению не ограничен способами, описанными выше; вернее, объем описываемого в заявке изобретения включает использование других эквивалентных способов для количественного определения статуса или уровня метилирования конкретного гена. Как можно отметить, указанные выше способы и их эквиваленты также применимы к вариантам осуществления, представленным в настоящем описании ниже, таким образом, способ, подходящий для определения статуса метилирования или уровня метилирования гена для краткости изложения не повторяют в следующих аспектах/вариантах осуществления.
[0054] На стадии определения гиперметилирования определяют наличие или отсутствие гиперметилирования указанного по меньшей мере одного гена-мишени.
[0055] В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу анализа того, имеет ли индивидуум рак эндометрия (EC), включающему стадию получения образца, стадию определения метилирования; и стадию анализа, как описано выше, и стадию анализа (d), на которой наличие или отсутствие EC у индивидуума определяют с учетом результата, полученного на стадии (c). В частности, гиперметилирование по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум имеет EC. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения отсутствие гиперметилирования по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум не имеет EC. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения отсутствие гиперметилирования по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум не имеет неоплазию эндометрия, или неоплазия эндометрия является доброкачественной; например, миома является распространенной доброкачественной неоплазией эндометрия.
[0056] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один ген-мишень является BHLHE22 или THY1 или и тем, и другим.
[0057] В некоторых вариантах осуществления, в дополнение к BHLHE22 и/или THY1, ген-мишень дополнительно включает по меньшей мере один из ADARB2, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5 и ZNF662.
[0058] В конкретных необязательных вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22 и CDO1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22, CDO1 и TBX5. В некоторых других вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22, THY1, CDO1 и CLVS2. В некоторых других вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22, CDO1 и CELF4. В качестве другого примера, по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22 и CELF4. Альтернативно, по меньшей мере один ген-мишень включает THY1 и CDO1. Альтернативно, по меньшей мере один ген-мишень включает THY1 и CDO1, а также один или оба из CLVS2 и GATA4. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22, CDO1, THY1, CELF4, CLVS2, GATA4, NTM, PRKCDBP и TBX5.
[0059] В вариантах осуществления, в которых определяют статус метилирования нескольких генов-мишеней, анализ можно осуществлять с учетом наличия или отсутствия гиперметилирования указанных генов-мишеней.
[0060] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения образец получают из клеток цервикального соскоба или образца эндометрия индивидуума.
[0061] В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения способ по настоящему изобретению используют для анализа того, имеет ли индивидуум карциному эндометрия на ранней стадии (стадии I или II в соответствии с рекомендациями Международной федерации гинекологии и акушерства). В некоторых необязательных вариантах осуществления образец получают из клеток цервикального соскоба индивидуума, и гиперметилирование BHLHE22 и по меньшей мере одного из CDO1 и CELF4 является показателем того, что индивидуум имеет карциному эндометрия. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения карцинома эндометрия может являться карциномой эндометрия типа I или типа II. По сравнению с общепринятыми способами диагностики, с помощью которых карциному эндометрия которых типа II часто диагностируют на поздней стадии развития злокачественного новообразования (например, стадии 3 или 4), способ по настоящему изобретению обладает существенным преимуществом, заключающимся в получении диагноза до развития злокачественного новообразования в более злокачественную стадию.
[0062] Как можно отметить, биомаркеры, идентифицированные по настоящему изобретению, можно использовать для получения способов диагностики для анализа того, имеет ли индивидуум карциному эндометрия.
[0063] Например, набор может содержать материалы, которые можно использовать для определения уровня метилирования одного или нескольких из указанных выше биомаркеров, таких как, BHLHE22, THY1, ADARB2, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5 и ZNF662.
[0064] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу анализа того, имеет ли индивидуум карциному женских репродуктивных органов или карциному толстого кишечника. Способ также включает общие стадии (a), (b) и (c), как описано выше, и стадию анализа (d), на которой наличие карциномы женских репродуктивных органов или карциномы толстого кишечника у индивидуума определяют с учетом результата, полученного на стадии (c). В частности, гиперметилирование по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум имеет карциному женских репродуктивных органов или карциному толстого кишечника. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения отсутствие гиперметилирования по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум не имеет неоплазию женских репродуктивных органов или неоплазию толстого кишечника, или неоплазия женских репродуктивных органов или неоплазия толстого кишечника является доброкачественной.
[0065] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один ген-мишень выбран из группы, состоящей из ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7 и NTM.
[0066] В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения карцинома женских репродуктивных органов является карциномой эндометрия типа I, карциномой эндометрия типа II, карциномой яичника, карциномой влагалища, карциномой наружных половых органов, гестационной трофобластической болезнью (GTD) и первичным раком брюшины.
[0067] Аналогично, биомаркеры, идентифицированные по настоящему изобретению, можно использовать для получения способов диагностики для анализа того, имеет ли индивидуум карциному женских репродуктивных органов или карциному толстого кишечника.
[0068] Например, набор может содержать материалы, которые можно использовать для определения уровня метилирования одного или нескольких из указанных выше биомаркеров, таких как, ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7 и NTM.
[0069] Следующие примеры представлены для разъяснения конкретных аспектов настоящего изобретения и помощи специалистам в этой области в практическом осуществлении настоящего изобретения. Эти примеры ни в коем случае не следует истолковывать как какое-либо ограничение объема изобретения. Без дальнейших уточнений, полагают, что специалист в этой области с помощью изложенного в настоящем описании может в полной мере использовать настоящее изобретение. Все публикации, процитированные в настоящем описании, включены, таким образом, в него в качестве ссылок в полном объеме.
[0070] Материалы и способы
[0071] 1. Образцы ткани
[0072] Все образцы ткани собирали в период с октября 2014 года по май 2016 года в Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital, New Taipei, Taiwan. Согласно критериям включения, участниками исследования должны быть женщины возрастом 30-80 лет. Возраст, гистологический тип опухоли, стадия согласно критериям Международной федерации гинекологии и акушерства и степень гистологической дифференцировки узнавали из карт пациентов в случае каждого участника. Исследования осуществляли с одобрения Экспертного совета Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital в соответствии с Хельсинкской декларацией 2000 года. От каждого участника исследования получали информированное согласие.
[0073] Образцы эндометрия получали в ходе хирургического вмешательства, сразу замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до проведения анализа. Патологический диагноз для каждого образца подтверждали с помощью гистологического анализа гинекологами-патологами. Нормальную эпителиальную ткань получали из пациентов с миомой.
[0074] Клетки цервикального соскоба получали из пациентов с диагностированной миомой или карциномой эндометрия, и у пациенток не было заболеваний яичников и шейки матки на момент забора образца. Клетки эндоцервикального соскоба получали следующим образом. Новую эндоцервикальную щеточку вставляли в канал шейки матки и осторожно вращали ее 3-5 раз для обеспечения забора образца. Затем щеточку вставляли в центрифужную пробирку (15 мл) содержащую 2 мл RNAlater® (Ambion, Life technologies, USA) и закрывали крышку центрифужной пробирки. Образцы клеток эндоцервикального соскоба хранили при 4°C. После перемешивания на центрифуге типа вортекс в течение 10 секунд образец, содержащий клетки, аликвотировали в три микроцентрифужные пробирки (1 мл на пробирку), которые хранили при -80°C до дальнейшего анализа.
[0075] 2. Анализ и валидация
[0076] В анализируемой когорте для идентификации биомаркеров метилирования использовали общедоступные данные из Атласа ракового генома (TCGA) (включая использование 270 образцов тканей злокачественной опухоли эндометрия и 28 образцов нормальных тканей эндометрия), Em-MethylCap-seq (включая 78 образцов тканей злокачественной опухоли эндометрия и 11 образцов нормальных тканей эндометрия), и данные HCL (включая 10 образцов тканей злокачественной опухоли эндометрия и 10 образцов нормальных тканей эндометрия). Образцы, используемые для верификации биомаркеров метилирования, включали 25 образцов тканей злокачественной опухоли эндометрия, 5 образцов нормальных тканей при миоме, и 15, 10 и 15 цервикальных соскобов, полученных от индивидуумов со злокачественной опухолью эндометрия, миомой и нормальным эндометрием, соответственно.
[0077] Для обучающей выборки, используемой в когорте валидации, использовали образцы цервикальных соскобов, каждый размера 28, полученных от индивидуумов с раком эндометрия, миомой и здоровых индивидуумов. Что касается тестовой выборки для когорты валидации в примере 1, использовали образцы того же размера. Для тестовой выборки, используемой в когорте валидации в примере 2, использовали 50, 40 и 56 образцов клеток цервикального соскоба, соответственно, полученных от индивидуумов со злокачественной опухолью эндометрия, миомой и нормальным эндометрием.
[0078] 3. Полногеномный метиломный анализ ДНК
[0079] 3.1. Анализ метилирования 450K с использованием частиц
[0080] Первый метиломный анализ 298 образцов тканей эндометрия (EC эндометриоидного типа и 28 образцов смежных нормальных тканей) осуществляли с использованием анализа метилирования 450K BeadChip array (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) для идентификации профиля дифференциального метилирования EC. Использовали данные уровня 3 с портала TCGA. Баллы метилирования для каждого CpG представляли в виде β-значения и нормализовали. В образцах карциномы наблюдали≥40% неопластической клеточности. Авторы настоящего изобретения исключали зонды, картированные на половой хромосоме и охватывающие однонуклеотидный полиморфизм (SNP), и фокусировались на остальных 379054 участках CpG, анализируемых в этом исследовании. В этих образцах карциномы наблюдали≥40% неопластической клеточности. Значимо отличающиеся метилированные участки CpG анализировали с использованием критерия Манна-Уитни и P≤0,001. Кроме того, авторы настоящего изобретения фокусировались на участках CpG, локализующихся как можно ближе (±1000 п.н.) к участкам инициации транскрипции (TSS) кодирующих генов. И наконец, авторы настоящего изобретения выбирали гиперметилированных кандидатов с≥5 оставшихся участков CpG в кодирующем гене. Кроме того, выбирали лучшие 5% гиперметилированных отличий от медианных ридов для значений EC минус нормальное значение.
[0081] 3.2. Секвенирование MethylCap
[0082] Метилированную ДНК обогащали с использованием 2 мкг геномной ДНК с помощью набора для обогащения метилированной ДНК MethylMiner methylated DNA Enrichment Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) по инструкциям производителя. В кратком изложении, геномную ДНК обрабатывали ультразвуком до достижения приблизительно 200 п.н., фиксировали с помощью белков MBD и осаждали с использованием 1 M солевого буфера. Обогащенную метилированную ДНК использовали для получения библиотек для секвенирования, следуя стандартным протоколам Illumina (San Diego, CA). Библиотеки MethylCap-seq секвенировали с использованием системы Illumina Genome Analyzer IIx System. Анализ изображений и распознавание оснований осуществляли с использованием стандартной последовательности действий Illumina. Уникальные риды (риды до 36 п.н.) картировали по референсному геному человека (hg18) с помощью алгоритма ELAND с использованием до двух неправильно спаренных пар оснований.
[0083] Уникально картированные риды использовали для дополнительной линейной нормализации и анализа дифференциального метилирования. Уровень метилирования вычисляли посредством сложения количества ридов с использованием следующих уравнений 1 и 2.
(уравнение 1)
N_(рид,i) представляет собой количество нормализованных ридов в i-ом бине; U_(рид,i) представляет собой количество уникально картированных ридов в i-ом бине, и N_U представляет собой количество всех уникально картированных ридов. С помощью "INT" округляют элемент до ближайшего целого числа в сторону минус бесконечности, "^" означает порядковый оператор. Область уровня метилирования представляют в виде среднего значения для нормализованных уникальных ридов. При сравнении групп A и B (G=A или B) средний уровень метилирования (AVGR,G) вычисляли раздельно для двух групп в указанной области R (включающей размер бина m и начинающейся с s-ого бина). Количество образцом представляет собой S_A для группы A и S_B для группы B.
(уравнение 2)
AVGR,G означает средний уровень метилирования в группе G в области R. MR,G является уровнем метилирования в каждом образце в группе G в области R. Статистическую значимость дифференциального метилирования в области R определяли с использованием двухстороннего U критерия Манна-Уитни (P≤0,001). Дифференциально метилированные локусы анализировали посредством сравнения образцов пораженной ткани и контрольных образцов. Анализировали уровень метилирования области размером 2000 п.н., располагающейся на 1000 п.н. выше и ниже TSS кодирующих генов. Авторы настоящего изобретения исключали области TSS на половой хромосоме и в этом исследовании анализировали остальные 23215 областей TSS, среди которых выбирали лучшие 5% гиперметилированных отличий от медианных ридов для значений EC минус нормальное значение.
[0084] В данных с портала TCGA использовали чип для анализа метилирования 450K для анализа образцов ткани, и портал данных содержал наборы данных для 417 образцов тканей эндометрия. Из них для настоящего исследования выбирали 371 случай злокачественного новообразования с≥40% неопластической клеточности. Непараметрический критерий использовали для исследования дифференциального метилирования участков CpG посредством сравнения образцов пораженной ткани и контрольных образцов. Исходно выбирали зонды с P≤0,001 и лучшие 5% высоких β-значений дифференциального метилирования. Затем идентифицировали значимые зонды, локализованные в области, охватывающей участок -1000-+1000 относительно участка инициации транскрипции кодирующих генов. Гиперметилированные гены с по меньшей мере пятью из идентифицированных зондов выбирали в соответствии с критериями выбора авторов настоящего изобретения.
[0085] 3.3. Кластерный анализ профиля метилирования ДНК и выбор кандидатов
[0086] Профили метилирования ДНК получали с использованием способа полного сцепления агломеративной иерархической кластеризации с использованием расстояния городских кварталов в виде функции в MeV4 версии 4.9. В каждой группе выбирали одного-двух кандидатов, реже встречающихся при анализе изменений метилирования при злокачественных новообразованиях и имеющих низкие сигналы при анализе нормального эндометрия у участников исследования без EC.
[0087] 4. Количественная полимеразная цепная реакция для анализа метилирования ДНК
[0088] 4.1. Получение геномной ДНК и бисульфитная конверсия
[0089] Геномную ДНК выделяли из образцов с использованием набора QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). Геномную ДНК (1 мкг) подвергали бисульфитной модификации с использованием набора EZ DNA Methylation Kit (ZYMO RESEARCH, CA, USA) по инструкциям производителя и растворяли в 70 мкл воды, не содержащей нуклеазу. Бисульфитную ДНК использовали в качестве матрицы для анализа метилирования ДНК.
[0090] 4.2. qMSP
[0091] Количественную метилирование-специфичную ПЦР (qMSP) с использованием специфичных зондов и праймеров осуществляли для идентификации относительного уровня метилирования ДНК с использованием в качестве референса неметилированной (COL2A1) тотальной входящей ДНК.
[0092] Продукты ПЦР амплифицировали с использованием LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche, Indianapolis, IN, USA) и LightCycler 480. 20 мкл реакционной смеси содержали 2 мкл бисульфит-конвертированной ДНК, 250 нМ каждого праймера и 10 мкл мастер-микса. Реакции осуществляли с помощью LightCycler 480 с использованием следующих термических профилей: 95°C в течение 5 минут, 50 циклов 95°C в течение 10 секунд, 60°C в течение 30 секунд и 72°C в течение 30 секунд и конечная элонгация при 72°C в течение 5 минут. Для каждого гена во всех образцах осуществляли тестирование в двух повторениях. Уровень метилирования ДНК будут оценивать с помощью ΔCp с использованием формулы: (Cp гена) - (Cp COL2A)]. Результаты теста со значениями Cp COL2A >36 определяли как неудачу определения. Праймеры конструировали с помощью программного обеспечения Oligo 7.0 Primer Analysis.
[0093] 5 Статистический анализ
[0094] Для идентификации различий уровня метилирования между двумя категориями использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, и для идентификации различий уровня метилирования между более чем двумя категориями использовали критерий Крускала-Уоллиса.
[0095] Для независимой когорты строили график частоты истинно положительных результатов (т.е. чувствительности) относительно частоты ложноположительных результатов (т.е. 1-специфичность) для получения графика зависимости чувствительности от частоты ложноположительных результатов (ROC). Для оценки лучшей точности площадь под кривой (AUC) ROC использовали для идентификации оптимального порогового значения для различения двух групп образцов. Оптимальное пороговое значение вычисляли с использованием способа "closest.topleft" и 200 итераций бутстрепа в пакете pROC на языке R. В осуществляемом способе формула представляет собой минимальную сумму [(1-чувствительность)2+(1-специфичность)2]. Для оценки OR и 95% CI для описания риска EC, ассоциированного со статусом метилирования каждого гена-кандидата и комбинации генов, использовали логистическую регрессию. Все значимые различия анализировали с использованием двухстороннего P<0,05. Указанные выше анализы и построение графиков осуществляли с использованием статистического пакета на языке R (версии 3.1.2) и MedCalc (версии 14.12.0). Парный точный апостериорный критерий Фишера и предполагаемую долю ошибок первого рода 0,01 использовали для оценки статистической мощности с помощью G*Power версии 3.1.9.2.
[0096] Пример 1
[0097] Идентификация гиперметилированных генов, ассоциированных с раком эндометрия
[0098] В исследуемой когорте новые гиперметилированные гены при раке эндометрия идентифицировали с использованием данных секвенирования MethyCap и анализа метилирования BeadChip для идентификации DMR, локализующихся на±1 т.п.н. от TSS каждого гена. На первой стадии анализа сравнивали уровни метилирования генов в образцах карциномы эндометрия и нормальных образцах из различных наборов данных, таким образом, идентифицируя 180 генов с использованием консенсусной кластеризации паттернов метилирования. После фильтрации с использованием критериев выбора авторов настоящего изобретения для клинической значимости и функционального обогащения выбирали 23 гена (см. панель A, фигуру 1).
[0099] 23 гена-кандидата, идентифицируемых в анализируемой когорте, подвергали дальнейшей верификации, при которой объединенную ДНК из образцов тканей нормального эндометрия (n=15), эндометрия при миоме (n=10) и злокачественные ткани эндометрия при карциноме (n=15) подвергали qMSP, при котором идентифицировали 14 генов. 14 генов-кандидатов подвергали дальнейшей валидации, при которой объединенную ДНК из цервикальных соскобов пациентов со злокачественной карциномой эндометрия (EC, n=56) или миомой (Myo, n=40) и индивидуумов с нормальным эндометрием (Nor, n=50) подвергали бисульфитному пиросеквенированию. Результаты (фигура 2 и таблица 1) свидетельствуют о том, что с помощью указанных выше девяти генов также можно различать индивидуумов с карциномой эндометрия и нормальной тканью эндометрия или тканью эндометрия при миоме при использовании образцов цервикальных соскобов.
Таблица 1
| Название гена | Количество положительных результатов | |||||
| Пороговое значениеa | Случай | Контроль | Se (%) | Sp (%) | ORb (95%CI) | |
| Все стадии EC | ||||||
| BHLHE22 | 21,9 | 41/49 | 6/95 | 83,7 | 93,7 | 76,0 (24,8-233,3) |
| CDO1 | 67,5 | 41/50 | 6/96 | 82,0 | 93,8 | 68,3 (22,8-204,7) |
| CELF4 | 14,0 | 48/50 | 19/89 | 96,0 | 78,7 | 88,4 (19,7-397,3) |
| ZNF662 | 5034,8 | 46/50 | 19/96 | 92,0 | 80 | 46,6 (14,9-145,5) |
| BHLHE22+CDO1+CELF4 | Любые два положительных значения | 45/49 | 4/88 | 91,8 | 92,5 | 236,3 (56,4-989,6) |
| Ранние стадии EC | ||||||
| BHLHE22+CDO1+CELF4 | Любые два положительных значения | 34/38 | 4/88 | 89,5 | 95,5 | 178,5 (42,2-754,9) |
| Сокращения: Se, чувствительность; Sp, специфичность; OR, отношение рисков. Ранняя стадия включает стадию I и стадию II. aДихотомизация уровней метилирования основана на распределении участников исследования с раком эндометрия и участников исследования без злокачественного новообразования с использованием способа Юдена. bOR вычисляют с использованием одномерной логистической регрессии. Точные значения α ≤0,10 и мощность (1-β)>0,99 вычисляли с использованием парного точного апостериорного критерия Фишера. |
[0100] В частности, на точечной диаграмме на панели A фигуры 2 показано распределение статуса метилирования BHLHE22, CDO1, CELF4 и ZNF662. Используя отдельные цервикальные соскобы, подтверждали, что статус метилирования ДНК был более высоким в образцах EC, чем образцах нормального эндометрия и миомы. Горизонтальной линией на графике представлены пороговые значения, указанные в таблице 1. Значения P вычисляли с помощью критерия Крускала-Уоллиса.
[0101] Кроме того, как показано на панели B фигуры 2, для всех четырех генов наблюдали исключительную площадь под кривой зависимости чувствительности от частоты ложноположительных результатов, при этом их значение AUC близко к 1 (от 0,89 до 0,95), что свидетельствует о получении лучшего кластера.
[0102] Также оценивали характеристики комбинации генов, и результаты, как показано в таблице 1, свидетельствовали о достижении лучшей специфичности с использованием комбинации генов по сравнению с отдельным геном. Более конкретно, при комбинированном тестировании BHLHE22, CELF4 и CDO1 достигали чувствительности 91,8%, специфичности 95,5% и 236,3-кратного повышения риска (95% CI, 56,4-989,6) для любых двух положительных результатов. Эти результаты были схожи с результатами определения EC на более ранних стадиях (чувствительность 89,5%; специфичность 95,5%; OR, 178,5, 95% CI, 42,2-754,9). Статус метилирования генов-кандидатов с использованием цервикальных соскобов некоторых пациентов с раком эндометрия типа II представлен в таблице 2.
Таблица 2
| № участника исследования | Возраст (годы) | Гистология | Стадия | Степень | M-индекс BHLHE22 | M-индекс CELF4 | M-индекс CDO1 | Любые два положительных результатаa |
| GYCA-03-2001 | 57 | Ser | 1A | G3 | 2579,2 | 577,1 | 1533,6 | да |
| GYCA-03-2002 | 59 | En | G3 | 2,0 | 14,8 | 142,3 | да | |
| GYCA-03-2003 | 64 | Ser | G2 | 153,0 | 37,7 | 559,4 | да | |
| GYCA-03-2004 | 54 | En | 1B | G3 | 365,2 | 14,2 | 320,2 | да |
| GYCA-03-2005 | 58 | En | 3A | G3 | 810,5 | 106,0 | 796,6 | да |
| GYCA-03-2006 | 43 | En | 3A | G3 | 13707,8 | 563,3 | 3110,0 | да |
| GYCA-03-2007 | 60 | Mu | 2 | G1 | 9,0 | 340,8 | 1353,7 | да |
| GYCA-03-2008 | 73 | CC | 4B | G3 | 311,4 | 82,3 | 1725,4 | да |
| GYCA-03-2009 | 74 | Ser | 1A | G3 | 37,9 | 6,4 | 1220,0 | да |
| GYCA-03-2010b | 45 | Ser | 1 | 5,9 | 10,4 | 6,4 | нет | |
| GYCA-03-2011 | 68 | Ser | 2 | G3 | 2044,8 | 10,8 | 2102,2 | да |
| GYCA-03-2012 | 56 | Mu | 1B | G1 | 240,1 | 85,8 | 172,8 | да |
| GYCA-03-2013 | 33 | Mu | 1A | G1 | 53,4 | 22,4 | 12,6 | да |
| GYCA-03-2014 | 57 | Mu | 1A | G2 | 375,5 | 172,2 | 217,2 | да |
| Mu, слизистый; CC, светлоклеточный; Ser, серозный; G, степень; M-индекс, индекс метилирования. Стадию определяли по рекомендациям Международной федерации гинекологии и акушерства. aПороговые значения основаны на результатах, вычисленных для эндометриоидного типа. Пороговые значения М-индекса составляли 21,9, 14,0 и 69, 5 для BHLHE22, CELF4 и CDO1, соответственно. bУ пациента диагностировали серозный тип рака эндометрия посредством дилатации и выскабливания в сторонней клинике, но в образцах, полученных посредством гистерэктомии, в клинике, в которой проводили настоящее исследование, обнаруживали только комплексную атипичную гиперплазию. |
[0103] Пример 2
[0104] Идентификация гиперметилированных генов, ассоциированных с карциномой эндометрия
[0105] В исследуемой когорте новые гиперметилированные гены при раке эндометрия идентифицировали с использованием наборов данных, определенных выше. Идентифицировали области дифференциального метилирования (DMR), локализующиеся на±1 т.п.н. от участка инициации транскрипции (TSS) каждого гена. На первой стадии анализа сравнивали уровни метилирования генов в образцах опухоли и нормальных образцах из наборов данных TCGA, таким образом, идентифицируя 46 генов. Кроме того, сравнивали уровни метилирования генов в образцах опухоли и нормальных образцах из наборов данных TCGA для идентификации генов-кандидатов. Идентифицировали всего 15 генов, неизменно проявляющих высокие уровни метилирования (см. панель B, фигуру 1).
[0106] 15 генов-кандидатов, идентифицируемых в анализируемой когорте, подвергали дальнейшей верификации, при которой объединенную ДНК из образцов тканей нормального эндометрия при миоме (EmN_Myo, n=5) и злокачественные ткани рака эндометрия (EC, n=25) подвергали qMSP. Результаты (фигура 3) свидетельствуют о том, что все 15 генов-кандидатов проявляют значимое гиперметилирование в злокачественных тканях рака эндометрия.
[0107] Гены-кандидаты также подвергали дальнейшей верификации, при которой объединенную ДНК из цервикальных соскобов индивидуумов с нормальными тканями эндометрия (N_Em, n=15) или пациентов со злокачественной опухолью эндометрия (EC, n=15) или миомой (Myo, n=10) подвергали qMSP. Результаты (фигура 4) свидетельствуют о том, что с помощью 11 из 15 генов также можно различать индивидуумов со злокачественной опухолью, нормальными тканями или миомой с использованием образцов цервикальных соскобов. Указанными 11 генами являются ADARB2, BHLHE22, CDO1, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5 и THY1. Необходимо отметить, что хотя для FOXI2 наблюдали дифференциальное метилирование, сигнал был относительно слабым, и таким образом, его исключали из дальнейшего исследования.
[0108] Далее исследовали профили метилирования указанных одиннадцати генов-кандидатов, а также ранее идентифицированного гена CELF4. На фигуре 5 показаны характеристики генов-кандидатов для различения образцов EC и не-EC с использованием площади под кривой зависимости чувствительности от частоты ложноположительных результатов в обучающей выборке (панель A) и тестовой выборке (панель B). Значения P для всех анализов составляли <0,001 в случае сравнения площади, равной 0,5. Пороговые значения помечены незаштрихованным кругом и приведены в таблице 3.
Таблица 3
| Название гена | В обучающей выборке | В тестовой выборке | ||||||
| Пороговое значение | Sen | Spe | AUC (95%CI) | Пороговое значение | Sen | Spe | AUC (95%CI) | |
| ADARB2 | 6,37 | 78,57 | 63,64 | 0,75 (0,64-0,85) | ||||
| BHLHE22 | 8,83 | 78,57 | 92,86 | 0,91 (0,84-0,98) | 7,69 | 79,31 | 88,71 | 0,83 (0,90-0,97) |
| CDO1 | 7,47 | 82,14 | 92,86 | 0,93 (0,88-0,99) | 6,97 | 89,66 | 88,71 | 0,89 (0,94-0,99) |
| CELF4 | 8,42 | 78,57 | 85,71 | 0,91 (0,85-0,97) | 7,40 | 85,19 | 82,98 | 0,90 (0,81-0,96) |
| CLVS2 | 6,75 | 67,86 | 67,86 | 0,76 (0,65-0,87) | 6,49 | 88,89 | 92,00 | 0,89 (0,95-1,0) |
| GATA4 | 4,33 | 75,00 | 72,73 | 0,78 (0,67-0,88) | 4,69 | 74,07 | 82,00 | 0,68 (0,79-0,91) |
| HOXA9 | 7,19 | 82,14 | 76,79 | 0,88 (0,81-0,96) | ||||
| MTMR7 | 4,99 | 67,86 | 64,29 | 0,66 (0,54-0,78) | ||||
| NTM | 4,13 | 78,57 | 64,29 | 0,73 (0,62-0,85) | 3,80 | 68,97 | 79,03 | 0,69 (0,80-0,90) |
| PRKCDBP | 7,72 | 89,29 | 58,93 | 0,73 (0,62-0,85) | 5,87 | 68,97 | 69,35 | 0,66 (0,76-0,86) |
| TBX5 | 3,81 | 71,43 | 91,07 | 0,83 (0,72-0,93) | 4,90 | 65,52 | 69,35 | 0,66 (0,77-0,88) |
| THY1 | 2,35 | 75,00 | 83,64 | 0,85 (0,76-0,94) | 3,66 | 92,59 | 90,00 | 0,89 (0,95-0,99) |
| Сокращения: Sen, чувствительность; Spe, специфичность; AUC, площадь под кривой зависимости чувствительности от частоты ложно положительных результатов; CI, доверительный интервал. В случае ADARB2, HOXA9 и MTMR7 точность не улучшалась при анализе комбинаций генов в обучающей выборке, таким образом, их исключали при валидации в тестовой выборке. |
[0109] Данные, представленные в таблице 3 свидетельствует о том, что в случае шести из тестируемых генов (BHLHE22, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4 и THY1) наблюдали значимую точность (по меньшей мере 80%) при различении индивидуумов с нормальным эндометрием и миомой и индивидуумов с карциномой эндометрия. Кроме того, значения AUC для BHLHE22, CDO1, CELF4, CLVS2 и THY1 находились в диапазоне от 0,83 до 0,9, что свидетельствует о получении лучшего кластера. Гены с лучшей точностью выбирали для последующего анализа, касающегося характеристик комбинаций генов, и результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4
| Комбинация генов | Пороговое значение RS | Sen | Spe | AUC (95%CI) |
| BHLHE22+CDO1 | -0,88 | 89,10 | 89,10 | 0,95 (0,90-0,98) |
| CDO1+THY1 | -0,34 | 83,60 | 94,10 | 0,95 (0,90-0,98) |
| BHLHE22+CDO1+TBX5 | -0,54 | 85,50 | 91,10 | 0,95 (0,90-0,98) |
| CDO1+THY1+CLVS2 | -0,07 | 83,64 | 94,10 | 0,95 (0,90-0,98) |
| CDO1+THY1+GATA4 | -1,17 | 90,91 | 85,15 | 0,95 (0,90-0,98) |
| CDO1+THY1+CLVS2+GATA4 | -0,11 | 81,82 | 96,04 | 0,95 (0,90-0,98) |
| BHLHE22+CDO1+THY1+CLVS2 | -0,49 | 87,27 | 92,08 | 0,95 (0,90-0,98) |
| 9 генов: BHLHE22+CDO1+ THY1+CLVS2+GATA4+ NTM+PRKCDBP+TBX5+CELF4 | -0,18 | 85,45 | 96,04 | 0,96 (0,91-0,98) |
| Сокращения: RS, степень риска; Sen, чувствительность; Spe, специфичность; AUC, площадь под кривой зависимости чувствительности от частоты ложно положительных результатов; CI, доверительный интервал. Степень риска вычисляли с использованием всех цервикальных соскобов и модели логистической регрессии. |
[0110] Данные, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что эти комбинации генов имеют лучшую точность, чем любой отдельный ген при использовании всех цервикальных соскобов (таблица 4, 56 образцов EC, 56 образцов миомы и 56 нормальных образцов).
[0111] Пример 3
[0112] ПРЕКРЕСТНОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ ПРИ ДРУГИХ КАРЦИНОМАХ ЖЕНСКИХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ и карциномЕ толстого кишечника
[0113] ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7, NTM и PRKCDBP дополнительно исследовали на их применимость в различении аномальных заболеваний женских репродуктивных органов или карциномы толстого кишечника, и результаты представлены на фигуре 6 (каждый символ соответствует данным для объединенной ДНК 5 человек). В образцах ткани толстого кишечника (Co) наблюдали высокое метилирование ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7 и NTM при раке толстого кишечника (Ca) по сравнению с уровнем метилирования в нормальной ткани толстого кишечника (1N). В случае тканей яичника (Ov), у всех семи генов наблюдали высокий уровень метилирования при раке яичников. Каждый треугольник и кружок соответствуют объединенным 5 равным количествам ДНК образцов.
[0114] Следует понимать, что приведенное выше описание вариантов осуществления представлено исключительно в качестве примера, и что специалисты в этой области могут осуществлять различные модификации. Представленное выше описание, примеры и данные представляют собой полное описание структуры и применения примеров вариантов осуществления изобретения. Хотя различные варианты осуществления изобретения описаны выше с определенной степенью детализации или со ссылкой на один или несколько отдельных вариантов осуществления, специалисты в этой области могут осуществлять многочисленные изменения описанных вариантов осуществления без отклонения от сущности или объема настоящего изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Lai Hung-Cheng
<120> СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ НЕОПЛАЗИЙ ЖЕНСКИХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ
<130> P2947-PCT
<150> US62368182
<151> 2016-07-29
<160> 13
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 3199
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 1
cgtctacgta gtatttctgt ccccggaaga ctggatctca gggaattatt atggaagata 60
ctgctgagcc cctttcatcc tttccaggtg aaaatacaga catttttgtg tcgccctcac 120
ccttccttta tgaaataagg tgcccaactg ttctgatatt accattcaaa aacaggttct 180
gtggcgaacc tcatttgtga atctattaca gagattaata gattatttct cctttttcaa 240
ctaattctca gtggggaaat ttaaccatat ggtaaggaga gaattagaat ttcatcacat 300
tagagcaaaa tgtaatgaaa agagtccaac acctggggcc aactccgaaa gccacaatta 360
aaaggttttt aatgaaacca gagaaaccaa aaattgcata gtcttcagta cttctgccat 420
ataagaaaga gttattggaa ggtgttggga aatattgttt ttacttatgt cataaggatg 480
aaaaccagct gctaaatacc atgtgtaccc agagaccgaa ctcaggagtg agatgaccgc 540
gtgtaccagt gcccatccgg agaggagcac ttgtttttac attctccctt cccgaaccct 600
ccaagaacaa ccgaggctga tccagatgtc cttaaatggc ttccgggtaa ataaatatgc 660
ataaatgcct cacttcgtgt gggagcggat ttgactcctg gtgaagttga ctcttttgaa 720
gcaatcagat tttcatctta aggaaagttt gagaaaccgg tttgtttgtt tgttttcttc 780
ctgtttagga aattgtgtac ttcacaatta ccatcactgt aacagttatt tggagaccac 840
tgcaaaatca ctgccacccc accttaaaaa aaaatgggct gcatgatcac ttgctcttca 900
ttttgctttt ttctttcttt ttttccaatc tgggtaggaa atgggcagtg gcgggtgtgg 960
aaacgaggca gagtgttcgg ggggacgact gctttgctct ctgaccagct gaaaacctag 1020
agtgaatttt gggcaagcca gctgggacac caccttctct cggaaagtcc catccccaaa 1080
tccagaccag tcatcctacg aacaggggtg gagtataatt ctcgcccgga agggtaattt 1140
agcacaagct gagacagcag tggcgaggga agggcagtgg ggggtggggt gcggtgggtg 1200
ggggcgtctg ctttccacag gactcccagg cttcgccgcc gatctacaat ttgctgaagg 1260
agcaaagaac atcctcggct ctaagtaggg cttttagtgt gctcattgat gagtgaaagt 1320
cgccacacat gtcaagctaa aggcagttgt tgggttacta acaggaccca gcgccttgca 1380
aacatatgcg ctaagctgtg tatacagatg gcaggcagaa taatggagca ggcgcctttt 1440
ataaagctct agctgctgcc tgtcttcaga cctgggaaat gaaactattc agacttgcgg 1500
ccagatagcg cctgcgattg tttgttaccg ttttaatcct attaattaaa acgttaacct 1560
gattgggtag aaagcgctgt cccaacaggc gagtcttctt cataataacc tactcagaga 1620
taatgatgta aaagactccc ccgtctgtgg cggcggctgt ttgatgggtc cggaaatctc 1680
ttgaaggtga atccaagcaa gataaacggt gcggagagga ggcgcggggc tgggctcaga 1740
gcggcggcgg cggcggctcc actccctccg cgcccaccct cccaccatgc ggggccgcgg 1800
cccatggtga gccccagcag ccagcaccat cggctggaga cgaagaagaa gaagaagagg 1860
aggcggcgag cgcgggggaa ggcgaaaaag aaaaagaaag aaggggagag ggctcccggc 1920
agcaccagga ccgacgcgcg caccagctcc ggagcccagc tcgcgcgcgt ctgtggggcc 1980
gcctgactcc ggggccgagg cggcggcggc ggcagcgggc gcggcggccc gggctgcgcg 2040
ccggcgcggg accatggagc gcgggatgca cctcggtgca gcggccgccg gcgaggacga 2100
cctcttcctg cacaagagcc tgagcgcctc cacctccaag cgcttggaag cggctttccg 2160
ctccacgccc ccgggcatgg acctgtccct ggcgccgccg cctcgggaac gcccggcgtc 2220
ctcctcctcg tcgcccctgg gctgcttcga gccggctgac cccgaggggg cagggctgct 2280
gttgccgccg cctggaggag gcggcggcgg cagcgcggga agtggcggcg gcggcggcgg 2340
cggggtgggt gtccccgggc tgctagtagg ttcagccggc gttgggggcg accctagcct 2400
aagcagcctg ccggccgggg ccgccctttg cctcaagtac ggcgaaagcg cgagccgggg 2460
ctcggtggcc gagagcagcg gcggcgagca gagccccgac gacgacagcg acggtcgctg 2520
cgagctcgtg ctgcgggccg gagtagccga cccgcgggcc tccccgggag cgggaggtgg 2580
tggcgcgaag gcagccgagg gctgctccaa tgcccacctc cacggcggcg ccagcgtccc 2640
cccggggggc ctgggcggcg gcggcggcgg gggtagcagc agcggtagca gtggcggcgg 2700
tggcggtagc ggtagcggca gcggcggcag cagcagcagc agcagcagca gcagcaagaa 2760
atccaaagag caaaaggcgc tgcggcttaa catcaatgcc cgagagcgcc ggcggatgca 2820
cgacctgaac gacgcgctgg acgagctgcg cgcggtgatc ccctacgcgc acagcccctc 2880
ggtgcgaaag ctctccaaga tcgccacgct gctgctcgcc aagaactaca tcctcatgca 2940
ggcgcaggcc ctggaggaga tgcggcgcct agtcgcctac ctcaaccagg gccaggccat 3000
ctcggctgcc tccctgccca gctcggcggc tgcagcggca gcagctgctg ccctgcaccc 3060
ggcgctcggc gcctacgagc aggcagccgg ctacccgttc agcgccggac tgcccccggc 3120
tgcctcctgc ccggagaagt gcgccctgtt taacagcgtc tcctccagcc tctgcaaaca 3180
gtgcacggag aagccttaa 3199
<210> 2
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 2
ggcctcagcc agcagagccc agatgccttc tgcagttaag atccctggac tcagaatcag 60
aaagctgtta agcaggaagg agtgcgctgc catgaagagg cagacagaag ccagagccag 120
tgtgtctgga atgcatcagg tagatgaatg ggaagatggc tgggatggag ttggagggag 180
gagggaagtc agcagccagg ggccaggaca ttcatggcct taaaaagtat cctacaaaca 240
agaagccagg ttagctcacc tatgaagagg gacagtctta ccagatcatg tgttagagtc 300
cccagatcct ggggagcgtg agaaaagtgc agactcagct ggctctagta ctagattaag 360
gaggtcctag gtgggcaagg ccagctgcat ttttcataaa atgccctaga aacctctgca 420
gtttaccaaa gtgaatagct cctttggact taaccatctg caaggctcat tccagttaga 480
gtgttccatc accctaaatg ctgggaaacc aagcgaatct cctcccactt gcaagcttcc 540
aacagtggct tccaacagtg ccactgcagt atcagaaact gcagggaagg tgccagggct 600
gacttccatg aagaaatagg agaacaggca ggcagacatt ggggaggccc acagaatgtc 660
gtgatcagaa ttcataaaga ggctggcagg atacaaatca atcaaataaa cgttagttca 720
aaaaaattca ctacacctgt gagtgagaga aagtcatcag cactgtctct aaaaatgagc 780
ctagggcttc tggtgacatc caatcggtgg gttatcagga gtgccccagg tgatcaggag 840
ttggcctcga ctcagtcctt tttgtgctgt ctcctcctct ttcccagagt tcctctctct 900
cttctcccac taggcaggga tgagcaagag gaatggctca cccttgagag ctggggtcca 960
tagcccaggt cagttctcca gctctcccac ttaccagcca agacaggagg tgaggattga 1020
gatgggatga acccagcagg cggccatggg ttaaaggtcg ccatgaatgt aatgtgccca 1080
gcacagtgcc tgctaaaagg caacactccc ttcctggtct gaagaccaaa caagcagact 1140
gtactcagga aagccagaag aaccttccag ctgtctggac cagaaggtgc cagcccaggg 1200
gctgaagaag acgtaatgcc cagagcaaaa agcgcctgca gccccctgaa gggctgggtg 1260
ctctggaata gatgaggggg cgaaatgggg ctggggacca gggacggaca gggtgggtcc 1320
agcacctgcc tcgcttccga agggctgctc caacactgaa aaacacccaa ccagcttcct 1380
ttcagaaaga ctggaatatt ccaaaacttc tcactggagg ctccggagga ggtgggctcc 1440
agctgaaaag gaaatgtgga ggcgtgggcg ctcccggcct gcatcctgca cctcttacac 1500
tttggttttc ccacagactc ctgaagaata ggtcagaaga aagggttaaa gccttaaaag 1560
gggaacaacc attgcggggc tcagggagga ggataatgtt ctttgggctg ccgcaccctg 1620
atccccgggg tcccgaaccc tcccgtccct ggccaggcct gccagccaca gggtgagggc 1680
ccccttccgc cgcaacctgc cactctcaca ccaatgcggg accgccttct cttccttccc 1740
caccccccac cccaccctgc cgtcctttct cccccaatct ccgcctctga ttggctgagc 1800
ccccggctcc ccgctccccc tctcctccat ccccggtgaa aactgcgggc tccgagctgg 1860
gtgcagcaac cggaggcggc ggcgcgtctg gaggaggctg cagcagcgga agaccccagt 1920
ccaggtggga actggagccg gtgggacctg gggctcgggg accgccgtca ggcgcccatg 1980
caagacttcc caacactagg cttcgggcca cggtccgagg gcgcccaggg aagaagggcg 2040
cagagcttag ggaggggcct gctttccagg caggggcggg agggggatgc ttctgcaggg 2100
caggggccgc gtggcaccct gatgtctttc ggggaaggcg ctcccgggct ttcgcccgct 2160
gggggactgg tgtctggggc tggggcgctg gagaacaggg aggaagggca ccaaggacag 2220
cctgtgggtc tacattccac ccagacgtcc ccaaacccag ctcgcagagg cggggaggag 2280
gacggatgaa actgcgggga gaggatggag gatggcgagc tagagggaat ctgccgggtg 2340
acctcgcggc gggctgggtg cggggcaccg gaggagaagg aagccgcagt gccgcaggcg 2400
gggactgggt ggaaggcggg cggacggggg aggggagagc tggaaaagga tgagagaggg 2460
ggaaggggga ctcatttggg aaaggagagg attggaatac ggaaatggat taaggatgag 2520
gcccgccggg ggcttgagag ggaggaagag cagaccttct ctgggtctgg agccgcctga 2580
ggacacagac cagaggaaat gaatacagac tgcacctccc cagccgctct ccacccctcc 2640
cctggctctt ctaccctctc cagccccaga cccatttctt ccctttcttg ctctggccat 2700
tgctccccct tcccctccta gatcccaagc ccgcacaaca tctcaaacaa gagtcctcga 2760
ttcaaaagcc agatgccgac cccccttcct cctggatctg gctcagggca gcagctccac 2820
cccgggacag agagagcatt gattgtagct gcagccgccg cgggatccta gcctcacccg 2880
tcaaggggct gagcgccagg gaccctgaac tcgtctagtg gtgcgccctg cgcacccggg 2940
cgcactcaac cgaggcaatg ccctgcgcgc tctcgcgggt gcacgcccct tctgtggcct 3000
ctcctgggcg agcactgctc tgcagatagg ctagactacc ggctccgcgt cgcctcgcca 3060
agggttggtt cagccaaggc tgcaaaaaac aaaaaaagac caggcagaca gcctatccag 3120
ggtggctatt gaaactgggc tggaaaactg cagtcccagg aactccagag agctggacat 3180
tgggaagcat ccttggctca catacaatcg gagatcacta tgtctttctc tcctccagga 3240
acacgattag cttgtgtcct atccagatag gaatagatgc tccctatctg ggagcatcct 3300
tagctatggt gaatggtatc tagccatcca ctggggatgg cgagtgactt agggatttgt 3360
gtctcacgta tatgaagcag tcatcgccag atgttggttg tttttcttaa cccccatcat 3420
aacccggtgg gtatgtaaga ttcagagaga ttcattcatt cattcacaat aaatatcttt 3480
ggagtgtatg ctatatgcca gtaatctgca aacggaaacg gttttgagca ttggggattt 3540
tcttctgaac aggaaatggg aagtccctaa atggggagtc tttgtttaac agatacagag 3600
ttttactttg aaagacaaaa agagttccgg agatgggctg catagcaacg tgaatgtatc 3660
cagcactgct gaatatactg aatttaagta ctgaatttaa atggttaaaa tagtaattat 3720
tatgcttttt gtattttacc acgattaaat ttttttttta aatacgaagc ctcagccctc 3780
ataggtctta tattaccata cactatgtta atgtaagaag aggagaaaga gtggtaaagt 3840
tacttaaagt cacccagcta gtaagtgctc catggccaag cgcagaaaca caccgtgact 3900
gggcttgttc tccctccttc cttgctttcc ctgagcagga aagagccagt ggcagtatca 3960
tgttcagtga gatgcaggga cgagaggggg aatggagaga 4000
<210> 3
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 3
attctaaaag gaaaacgcag aagccctgtc tttctgaggc ttgtctgcaa catacgctca 60
ttccttccaa attatttgct ggaaaaaatt taataaataa tcatagagta attaacatgt 120
tccagttcct gtctatactg gttgatactg attcaacgag tatgaatgaa cttatgaggt 180
gggtgacgtt gttatcccca gtttacagat gaggaaactg aggcacggtt taacttaccc 240
gaggtcatag cagtagagtt aagatttgaa atcaaatgtc ttactctctc tcatcaatga 300
aaactgagct acgatctatc agctcagcac ataacaacac aggatcatcc taattatttc 360
caatgtcccc cagagtgatt cttttttctt atgataaaaa ttatctggaa atttctaggc 420
acataagcag ctgaaaaggt tgcatgtgag gcaatgaata gcagaaatat ttgtgtgcca 480
tttttatatc aacatgttaa tgtgtgctaa tgaattttag agtggatttt tttaaaaaca 540
tgactattgt aattaaaagc ttatgtgatt taaatacaag atgcaatgat gattaccaga 600
ttctattcct ctttatattt tacataagac ttccagggtt ccataagtat aatcttgaaa 660
cataggacat tcctggaaaa aaaaattgct taaaactatt tcagtgtgca atccacctct 720
ttgtaaatgt tactttcttc catccaaata ttacatttgg caacaaaact ctccgctgag 780
agctttctct tccttttgtg tcattgttcc ctaaataaag caacacatga aattcctgac 840
ggcaaaaatc agactcagat cccaaaacct ctgtctttat gcaagattta tcttttgcat 900
tggaaacggc caaggaatat gaagagggga aagaagaggc aaacagacaa gcatgcaggc 960
tctgaggaat aaatgcccct caggacgctg tctcctgggg aattgcaaac ctcagtccgt 1020
ttctgaggaa gtgcggtctc tgcatttctg aaagaggtat ttccccccct tgacacaagg 1080
agcatggtaa tgaattgact agttaaaaac tgttggttgg aaaaacccgt ccctgtgtct 1140
ttctgagcag ggcgagctga gctgtccgcg aggctgcggc aggaggcctc gtcctcccgg 1200
gcagggtccc tcctggaggc tcccccggtc tctcccagac gcacccgcgc cgcgtccttg 1260
ttccccggga gcagcctccc tccagccgcc ggtcctggga gcttcaccgt ccaaacggga 1320
gctgagtttg caagcggcca ggcggcggtg cggctggtgc tgctgctgat gtcagagcca 1380
gaaagcagtt gtgattggat ctaattagac gctgctgcag caaatagaca agctccctgc 1440
gtgattggct tcaaagtggc tggtgccaaa caactagcag aggcgcaaaa gtagcctccc 1500
tgcgctggga gcccagagca ggaggcagag cccgcgggaa gctcggagca ctcaggacgc 1560
cgcgcgccct tccccgccct ccctgaccag ggagcagctc gctccaggcg cccagccgag 1620
gcccccagcc cagtgggagc aagtcataga gaacaattcg agagacagag agacggagcg 1680
cgctttcctg ctcagtcctg aaaagtgagc cgctcccggg tttgcaacct caagcttcgc 1740
agcagcggcg gcggcggctg ccgggaagga ggcaggtgca ggtgcaggag ggaggcggct 1800
ctgggctccg cgcctgggtc tcggccatgg cctcggtcct ggggagcggc agagggtctg 1860
gagggctgag cagtcaactc aaatgcaagt ccaagaggag gaggaggcgg aggtccaagc 1920
ggaaaggtaa ggaccgcgtg gcgcgccggc ccctgccccc cttcaccccc ggcttctcca 1980
ccccggcctc tcatggggtc tccgggcttg tccgttgtga gcagcttcac tttggggtgc 2040
tggcgggatg gctgctccgt gcagggcgct cgggagttca gatcccgtgg aaatgtctgg 2100
ggcctcctct tgcccagagg ggacagtgag cagccacgct gcgacatgtt tgagggaccc 2160
ggacgaagtg gggcgagggc ggcgaggagc tccccgggga ccccgcgcgt ctccgggccc 2220
cgcagtcccc agtggccggc cgggctggca ctgccttcca ccctccggag gccatctcgt 2280
ctcccagtgc caaaggaatt acccaaaaac gggggaacga gccctcgcgc cagctactcc 2340
catccaaact gtcccggagg aagggatagg cgaagccctg cgatcgcctc tccaaattgg 2400
ctggcagttt ttactcaatg tggtgcccgt cgatttgtaa acattgggtc gtaaagagaa 2460
cacagggctc gtccttggag aaataagcag aaatgaatac aggaaaacag aaagaagcat 2520
catattttgt tagtggtaga aaaaaaccgc aaaccaggaa agcaggaaaa gcagccggct 2580
gacagcggcc actgacaaac tcagctgtgc cttgttactg atattcctgg ggctgggccg 2640
cgctgaagtt agtcaatgct acagcaaggg agggctttca cactggggat tttgcaaaat 2700
tagcaatcgc tccaatatga gagcaatgcc cccagtgcca tcgtagcctg tgtgcatgcc 2760
aggaagaatt aaaagattct tctcatgccg acccttctct cctagaggaa cctgtgttat 2820
tgtcagttcc tagtgagcct gcaggagaaa gttcagttct aatcatgatt tgaaatgtgc 2880
tgattttttt taagtgaggt agaagtataa agaacggttg gaaaaacaca gctagaattg 2940
atcagctttg ccagttgttt gaaagcagga ggcaacgtta ggtgtgtttg gggttgtcca 3000
tctttcctga agaattttca tctttgcatt ggcctaagat aagtttctac cagaccgttt 3060
cctgtgtgcc ctcgaaccgt caccaggtcc tttattgcct cttccaataa tagaaattat 3120
ccagacagtc agcaggcata aatgtcaata gcaaacagtc attcattatg accgaacgtc 3180
aggaccactg ggagggattg gcccccacaa cttcctcaaa aggttttgga gcctttggtt 3240
tcagaaggga ggtgatgttg tggttctcat ttacctctca gctgctaagt gtgcgcttgc 3300
gattcacttt gttgtttgaa attatcattt tgaaacagac ctgttagtgt cctccaaaga 3360
taatgccaac acaaagtggc attgatattg agaaagtcac cggattgaat aatgaatatg 3420
acttttaaaa gaggaaaaag gaagcatcat ctttacactt gaaatgttca catttcccaa 3480
tattttttga ttagtctatt taaatattta gagttgaaga atgtggagta atagttcgca 3540
ataatgcatt ttataaatat aaacaggagg aaagtgttgc ctttctccaa attcacttgc 3600
cttgccagga agcgtcagtc atgctagctt agaaagtatt caatttaggg ggaaaaagga 3660
aatctgggga aagacttcat ttgctataaa cttaacttta gcaattcaaa ataaaactcc 3720
tatagcaaat atttccatac cttggttatt ttgaatatgt caagtccctt aattttcata 3780
gccaaaaatt gaagcgggaa agggcattca ggttttgtac actgatttct gttacgaaga 3840
gatttctggc gtgcgggaga atttcccagg gcacctgccg gcagctatct tgataggaaa 3900
gtcaaatcaa acggctaaag attcaatttt tggggaaacg ttaaccatgt agatgtaact 3960
gatcaaatta aaaggtaaag taaccagcta agagacacat 4000
<210> 4
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 4
cgtgaatata ttactttcat aaaaatgtaa aaagaaaaag aggagtcaga gaaagaaaat 60
gaattgtcag aaaaatttag aagttttatc aactgaaatg cagaaaagat aaattgtgct 120
tgcatttcat ttttgttgtt cattccaaac atttatggat tagactagct gaaatgaagt 180
aattaagaga ctcaatagaa aacattgcca agaataaaaa ataatttgag gaaaccatga 240
aaagtttaca ggttactctg tcacaaaata ctttgttaat tcactacccc gcagcaacac 300
acatcaccaa ggctggcttc tggaatgctt tctacttgta gccatttttg aacaataggt 360
gattccgctt ttaacaacac tgttagaata taatgtagcg agttttacca gagatgttta 420
agactacctg gcacaagtaa atttcattgt atacatgtat atacacgagg gagggtgatc 480
atagtctaga aaaaaacagg tcttcagaag tctagaactt taataacctt aaatccaaat 540
tattccctgc gtccatccat aatgagaagg aagaaatcta cacttgcatt tcttccacct 600
ttcacatctt tctcatttaa atcctactgt acttgatttg tgttgttccc aacgtactag 660
gtgctatgca tgacgtagaa acgtgtttcc ttatatgtat gtactagcag gctccttcaa 720
gcacatgcct aaggttgaaa gattcaaata taattatagc ctcttaaatt attgcgtcag 780
agcccgccct atcccctcag aaaaagcccc cttttacacc atcaaatgaa atatcaggtt 840
atttgcactg gatatttttt aaaagaaaat atttgatttt aaaatcaaag agttcttggt 900
tttccatcat ttcactaatt gtcttactag agacccgagt ctcctttgtc aaaatatatt 960
tcagtacgca ttttaaaaaa tatgtgtgtg tgtatactta aatatatata tatataaagt 1020
cttggactta ttttcaccta gcctggggca tatcgtggat agtttcaatc gacaaaacag 1080
gcactctctg gcctaggagt ggaatccatc ctcaattttc gcaggctcct cacaattctc 1140
tatttggaag aagtgtccct ctccttccct tttcttttcc tcctttactc agcgtcagtc 1200
cccgcagcca tctcctccga ccctttttgt ctacgtccca gcgtcgcgaa ccacagcggc 1260
ggaggtggag cggggagagg cgttaggccg ggcggctaaa acgcgccgtt aaagtggggg 1320
agagattgcg cggagcccac gcgatccctg ggacgccgga gacaacgggg ctcttgggaa 1380
ggcgcggagc ccggggaagc cggggatgtg cgcgtgagcc gtgcccgcag ggtctccccg 1440
cctccgccac ctttcttggg tggctctccg cctcgtcctc cctccgaggg ccgttggtac 1500
attcctagtg actccaagcg cttaaaaggg gcccgggagg atgaacccca cagatctgaa 1560
cctgatttgt gtgtgcaccg cgtctccagc gatcccggat ccactgcgct gccaggggcc 1620
tgggggtggg tctcttgctg tctctgcgac gacatcctta cgtttcggca ctctaatgct 1680
gggtttgtgc gtgtgtgtct gcttagcggt ctagcgggct gttaggctcc ctcgccccca 1740
gctccttggc tcgctcagct cctccaccgc agcccagcag tgagacgcgc gcgcagccag 1800
ctccccacga gatggaacag accgaagtgc tgaagccacg gaccctggct gatctgatcc 1860
gcatcctgca ccagctcttt gccggcgatg aggtcaatgt agaggaggtg caggccatca 1920
tggaagccta cgagagcgac cccaccgagt gggcaatgta cgccaagttc gaccagtaca 1980
ggtgagcgcg ctgcagcttc aatgccaggc ggcgcccact cgccccgtct gaggaggaat 2040
ggacgtgggg gacgcagccc aaagtgactg gctcgggaag ctcgggccgc gctgcgtccg 2100
ccgctcgccc cctcgctggc cagccgcggg gctggcacga ctcgcttggg gctccgcggc 2160
cacagcgcag gcggaaggtg gatcctactg gccttgctga cctccggccg ggaacggcgg 2220
acaggcgccg ggaagggagg ccaccgcgcg tctgcgagat tttctgttct cttctctccc 2280
gcaaacccct ctgcttctaa accaccagtc ctcctgcccc tggcctcggg agcaatgccc 2340
acactcccaa gccatcgtta accccgggcg cggagatgcg gagagaccgc actcaggttc 2400
gggccctcct gacaccttaa ggaaccgtct ggccggacta gcagagggtg ctcccagggg 2460
agcactacat cagccatcgg gagaagtgtg tgatgttgaa gaagacaagt cacccgcgtc 2520
agttctccat cactgcgcct tcggtcgcct gcaaccgggc accttatagc aagcattttt 2580
actcatgtaa aatagcgtct tgtggccgtc agctgccact acggaatttc tgctgttccc 2640
tttcccaaac caatttaact aacttccccg actgtgggtt tattcaaatc cactgccaag 2700
tttcgcagat taaatattcg accgtcgttt ttttcagccc ccaaatgatc tgatttatct 2760
tatccttgct tctgacgatc tgtaatgtaa attaaagacc cctacttccc agatgtactt 2820
gagtgaggtg ccctggtaag ctggcttttt tgcagccccg gcttggtgat taagtcgaat 2880
ctctctacca atcctccggg gccagaggta aaatttaatc accccgaagt gtgagaggtt 2940
ctactttttc tgagcagtta gtgcgtcagt ctttgtggtt ttttgggttt agggttagga 3000
gaaaggggta agtgaaagaa aagaataagg aaagaagtaa gtttgttttt cttgggagca 3060
ggttctttta gtcactcttc aacatgtggg atgtttcgta aagttttgtt ggcatgggcg 3120
gtttcaactg tattttagga tttgaaatag aaaaagtgaa gaccactaag gatcccattt 3180
ttcatataca agtgacttga ggaaattcct ttggctccta tcagcttagt tcatggtaga 3240
gcccttctgt agccgtgaaa gctagcagag agtctagctt ttaaattttc ttgcatttgc 3300
tccaggtaat tgaagacttg ttatgggaca ggtactcttc cagacacttg acacatatga 3360
ggaatggcag gcaatgaaga agttgaatga cttgcactag gtcttctatc gatagcggct 3420
ccaggctccc ggggttagca ttgttgttcc agagcctaca ctctaaacca ctgttaaacc 3480
aggacaggtt gtaacagttt ttaatcttta atctttagaa caagtgtatt ttcaaggacc 3540
ttgaactagt ctcgattgac aaactctaaa gcttttgaag tgcaaccagc tgggttgatc 3600
ggtcttttca cagatatctg aggtacagct cattaacata atggatgtag tcccgagggg 3660
gcagttgggg gaagacagga gatgggagag aagtcaattc tacagtattt tttgcattaa 3720
ataggtgcct agcgctgtga aggattctgt tctctgactt tgggagggcc agtgcagaag 3780
aatcaagaca gaatatgctc ccgtgtgggc caggctgtga attctttgaa agaagctgca 3840
gagaagcaac aaagattatc ctaagacttc tggaggaaga attaggatcc ttctgcagga 3900
actcagttta ctgtgaattg aaggttgtgt acacagcttc ttgttaggtc ataaaggcta 3960
caaagtaggg aaaactgagg ctaaaaagca cttactaagt 4000
<210> 5
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 5
gaggctgccc tgaaaaagca aacatgagag aggacggggt gcaggtaaat atcattaacg 60
tgaaaatctg ctaccccagc caagttcacc accagtattc acccctacag gcggggccgc 120
tcggaccctg ctcccggctc cgcgcctgcc actccctttc ccgcgcagcc gagatgccag 180
ccccagtggg cctggcgggg agtccggcgg ggtccggacc gggcggctcg acccccggtc 240
cccacggcag gaacgactca gcctcgcacc tcgggagctg taggtgccga aaacgaaacc 300
cgcgggggca gcgcacgccg cgcgagtctc ggtccggcgg caacccagat agcgattcag 360
gggctttatt cttttgatgg tgattaaaaa aatatattct atttgaaccc gtaaagcaga 420
cgagggcaaa tcaagccatc ccccgcgctg gctcaccggc caccgcgccc agcgccttcc 480
tccccctccg gcgggcgagc gggcaggggc gcccgactcc taccttcctc ccgccagcca 540
ccgggggacc agccgcgctc tccggggcgg gggaggccgc ccgggacggg gacccccacc 600
ttccgccttc ggaagcgggt tggggcgggg gtcggacccc gagtctctac tccccgtccc 660
tctgcccccc ggcgcggccc gacagctccc agccccatcc tggcaggtgg cttgggtggc 720
ggtagatgcc gggcgggagg aagatgtggg gctgctctgg caggttgggg gtgcgaggag 780
gaaaaaaaaa cagagaaaga cacacacaga gagacaggga gagagcgcgc gcgagagagc 840
tcttgtctat agatttatcc acataatata tatttatgta gctttttttc tctcgacact 900
gatgaatgcg cgctcggatc cccgggcgga ctccctccaa gccggctcgc ttttctagtc 960
taaataaata aataaagcca gatggaagaa aaaagcgccc attccacctc cgccgccgcc 1020
ccgcccgcca tccctgcctt tgcttcgccc gcctggcgcc ctaatagagc atagcttggt 1080
ggataaagcc cccctacata cccacacgaa aataaaaatc actattttta aaatacaaaa 1140
agttgcacct gctgctatta caaaaagaac ccccaaaagg caaagagagg aggccggctg 1200
cccggctcct cacggacacc cgctccccgc ggccgccggg cccggaatct cagcgcctcc 1260
cgaagagcca tgcgcctggc gctatttata gccgggggcc gtctcggact gtaccatcgc 1320
cacggcgcgg ggccgccgac gggggaggcg cggtggccgc cgccccacgc cgccctgccc 1380
ccggccgccg cccgccgtgg cgcgggcccc cacagcgcgc ccattcccgg ccccccgcgc 1440
cctcctccgc gcgcgcacac tcgccacccc cacccctggt ctggctggga acttgaaccg 1500
gtccagcctg tttaaacgga aaggacagag atcctgtctg ttcaatgtaa aaaaaaaaaa 1560
aaaaaaaaaa aaaagaaaaa aagaaaaaaa aaatcagatc agaccgagag agagaggaga 1620
gagggagaga gagagggaga gagagaggga gagagagagg agagggaggg agggagagag 1680
agagggggga gagcagagag agagcgcgag cgcgagcgag cgagagaaga ggagaaagag 1740
agagagcaga gagcgagcgg agagcgaggt gtagagaaac cgagggggag agaacccgag 1800
tgtgtgtatg cgtgtgcgtg tgtgagcgcg agcgagcgag agagaggagc gagagagtgt 1860
gagcgagaaa gaataaaagg aaagaagatt ttctctatgt atataaagat ggccacgtta 1920
gcaaacggac aggctgacaa cgcaagcctc agtaccaacg ggctcggcag cagcccgggc 1980
agtgccgggc acatgaacgg attaagccac agcccgggga acccgtcgac cattcccatg 2040
aaggaccacg atgccatcaa gctgttcatt gggcagatcc cccgcaacct ggatgagaag 2100
gacctcaagc ccctcttcga ggagtttggc aaaatctacg agcttacggt tctgaaggac 2160
aggttcacag gcatgcacaa aggtgagtac acctttccct cccaactttg ccggggagca 2220
ggagcgggct ggcgggccga ccggccggcc ggcgactgac gagcggcgga ctaagcgaga 2280
ggaagcctcg ggcgggcgcg gtggagggag gcgctcgggc agcggagacc agagctgggg 2340
tgcgtgggga gctgttcgct ggggcaagac tgggttttgg gcgaggtgct gataggaacg 2400
atgccatgga gagagcagcg ggcgccgatg aagagaaaga gagaggggat cgaggagacg 2460
gggcttggat ttttgggtac agcgacctga aagatgggga tggggaaggc tgcaccggtc 2520
gagcccagga cgctgagcgg acggactcgc gggctcctgg ccggccgagg accgagggtg 2580
ctgtccatcg ccgtggtgct gaaaatacta aaggaggtgg tctcctcatc ctttgctccg 2640
ggctagagta gcaggagcgc agccgtctaa aagggagaga ggtgacaaat tcaaagagaa 2700
atttttattt aaatgtaaca gtaaactctc cctgtcgagc tgtgtgcctc aataatctga 2760
ttgtggtgtg aatggtggtg tgtgttgggg gtgggggggt tggatgtttg aaggaaccag 2820
tgataaaacc taaggcaaga attagcaagg aaccagccat cccctgggtg gagtgggggg 2880
tctggcaagc ctggatagtc cccttcccag gaaagcgggg ctttgggaaa aaaatatgtg 2940
tgtgcgagat ttgcattttg aaaggtgtac cctaatttat cccaaactca ccatgcagag 3000
agctttatag tacattattt ctcccttgaa gcgatcattg ccagtgagtg cttgggggag 3060
ggggagacag aataatcaaa gaattaaaac acagcaactt tttaggaaag tggtcatggg 3120
aattgtccgc agcctgcctg ttttctcctt gttttattat ctttaaagca gagccccaaa 3180
cgtgttcagt tgtagaatgt gtgtgggtgg ctggtgggtg acgaaattag cccagtgctc 3240
cgcttcctaa cagtaatata taggatgtgc agcgggaatg aatcggtgct ggatctatgt 3300
gggcaagtta aatgctttct gagagagatt gatcgccagg cagggaagga gcacggggct 3360
aaggaagttg taggggatgt gtatggatgt tccgttttta ataaacagta gtgtggagag 3420
ccgccgaaga tgctgttaca gctggtggtt ttaaagatga aaacacacgc acacccaccc 3480
ccacatagag agcagcctca tccttggcca caaatgggct atggacacag ctgatcctcc 3540
agcacattag gtgcagagcg cagagctgtc tggctctcta agcagcagcg attttcacta 3600
tcacaaccac cctctttctc cagccctccc ttcgttcgaa tactaaacag agctccaaac 3660
tcttcatagt tggagtccca gagagcagtt tttattggct ttagtatctt ccagcttgcc 3720
tgctgaggag taaatcttaa agttaatggc atgttgagta acacaaaaac acagcagaat 3780
ggaaatatac tgggtttgtt ggggtggggt gagggtgggg gctgtaatgg agagagaagg 3840
caacctttat ccaatatgga gaaaatgtct gtctgttcaa aagagagatt ggaaaggtgg 3900
aacggggagg cagccttcaa aataatattc gaagaaaaaa agaaaacact ttctttttcc 3960
ccccctccct ctcaagtcaa ccatatcttt gtagtttttc 4000
<210> 6
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 6
tcacttaaaa tcctagaagg accttatata tagtgcatat atataacaca catatacaca 60
cacttaagtg gtttattttc tgccttcccc atttaaaaca taaattcctt gacaataatg 120
actgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgta atttattgtc ttattcgggt tcctacatta 180
atttgcatta atttaattaa taaatgctct agctctacca tacaaccctt ttccttcttt 240
ctttttatca acaccatcgc catgagaaga gcaaaaacaa gtgtgcctgt attttgaggg 300
ttctcatagt catcaacatt gaaaatgaca agataagaaa tgtcaagata agaaaatgac 360
aaaatttgct tatcttcaag accacctcct atacacagaa tgcagaaaaa tgccccacac 420
ctcgtggaac tcagtaaata ttagttgcat tgaattaact tcaattcaag accccattct 480
acagtttata aagtcaaaag ttgctcttag taacacgctc agtaatatgt gctgtgtttt 540
gaaaatagaa aatatccctt ttcctcaaat ccatagatag tcatattaag cgcaaggact 600
tctgtttatt tataatgatt ctcatataca gatgcataca actgaaggaa ggatggtatg 660
tgtttccaga aatatttgct ttatgatgag atatgagtga agttcctatt tttttcttcc 720
tttgagaatt atgtttttat tatcatttac cctagtgctc attttcatcc tcttcaacag 780
aaatttagca gggagactgg ttgaaaaact attcatataa gttcctccgg aggcttaatc 840
atcagtacat tgtcttggaa ccactctggt gttttctaaa ttaaatatct ctgtctacaa 900
caaatgcgaa aagtacagaa tgtttccgta ctccttctac atcaaaattg cctcctacag 960
gaacgagaaa atgcgtgtca atgtgaatta ccgtctacaa cagctactct ccaggctgat 1020
ctggggtctt gcacacaaag ggcgaagaga ggggcgtggg gaggctggaa agcatggttg 1080
ccccgcctgg cccggcgacg cccgctcagc agcctgctga ggagtgggga cgaagagcag 1140
cctaaactta gggctcggga tatttcgatg ccacccaaat tgccgtccta ccccaacgag 1200
gcagggaaag gagcggagcg cgcgcgcgag ctgagtgagt gcttacgtcg cagcgagatc 1260
tgtgctggga taattagaga ggagttgggc tgagccgagt cctctttcag cagcagcagc 1320
cggagccgcc gccgcagccc ggtggggcaa ccctgactcg gaccgctcgg gagagcccca 1380
ggagaggcca gcgccgcgca gcagccgccc cgctgcgccc acctccccgg ctgctcccgg 1440
agggctcaca aaggcggtgg ccgcccgagt ggccttctcc atccaggcgt tcgcgtcctc 1500
ctccccacct tctctcccga aggcgaaaat ggcagggcca ggcgagaacc tgggacagcg 1560
gtggccctag ccctgcgatc ctcacccctc ctgctaggag aggctgcggg ctgcccgcgg 1620
acgatgtggc cgcggctgct cccgagcgca tcttcggccc gggtccccgc cgccacccct 1680
cttctctgct ccttccatcc cgcccagagg agttgatgcc gctgtcgccg ccgccgccgc 1740
tgctgaagcc gcggctgatg gatgccaggg agtgccgcat tgcttagcga ccccgcctct 1800
gggtttgctg gtaggagcgg ctgctctttc ttctttcttg ctttggggtt ttatagaaaa 1860
gataaggaca tttttatttt attcttcaca acgtcctccc cttctcttcg tttttgaaat 1920
gtgcattccc agagatatcc ccggtcccct ccctccccct cccccctttt ctccaacccc 1980
gcggcaagtc cgtggaaatg aagggctaga ggaaggcaga agttgggggt ggggttgggg 2040
gagcccacgc tggtaccaac gccaccagaa cccctgctgg tgccttatga gatcacggtg 2100
tatctcagag gggtggtggg aaggtgcgct atctgcagag tcttcaccta attggatcac 2160
aataatctta aataaatcac acaaatttgt cttttaaaaa tagcgtcttt gaataagtac 2220
agggagaaat aatctccttt ctcccccctc tttctctctg tctctttttc tttctggcaa 2280
agatgatctc tctccgccct ggagctcagc gctgaagagc taccttatta ttaatcagaa 2340
tttccatcgc cacccctggc aggcgtatcc ttcagcaggg accgcaggaa cattcacagt 2400
gcaggggctg agatgtgcgt gggggttgtt tttgttacat cttggaagag aagagaagag 2460
gacagtacca agatcagaaa cacccgtgct aggtggaatt aggggtgatt tgttaggaaa 2520
gagaaaggac aagaagagga gtgcggagcc cttcaggggt tcacatctct ttaaaggaaa 2580
ggaaagaggg agccaaagta gggtgttgta ttttaggggg cagaggaaga agtttacacc 2640
ccccggcccc cccagctttg ctgggggaaa gcaggagcaa cagggcactt gattggacac 2700
caagattatt aatttcctgt aggggagagg aagcaggcag caggaggtct gggggctgga 2760
gtctggtggt ggcaaggacc aggtttgctt tgggacagtc aacaaggtct tctgagggaa 2820
agctcagaga taggcagaac aatgactcat ttgcaagccg gtctctcccc tgagaccctg 2880
gagaaagctc gcctggagct caatgaaaac ccagacacgc tgcaccagga catccaggag 2940
gtgagggata tggtcatcac caggccggac attggctttc tgcgcacgga tgatgccttc 3000
atcttacgct tcttgcgggc taggaagttt catcactttg aggccttccg cctcctggcg 3060
cagtactttg agtaccggca gcagaacctg gacatgttca aaagctttaa ggccaccgac 3120
cctggcatca agcaggcact gaaggatggc ttccctgggg gcctggccaa tctggaccac 3180
tatggcagga agattctagt cctttttgct gccaattggg atcagagcag gtaaatccta 3240
aatccaaact tgtattctcc ttttactctc ccattttcca gaatttaccc cgagtagtgt 3300
catggttttg tagatttgat atttttgttt atttggcttg gagaaaagag aaacaaacca 3360
ggagatgagt ttttggtggg caccctggga agggaggagg gcttgtattt ttacttttaa 3420
aacttacttc actaacaccc actttctact gcagctttaa ggtgctacct taaccacgtt 3480
attgcacaga gatctaaatc acttaacttg taaataaagc ttctctgtat gtttcacctt 3540
ctgaaaaagt ttattgggct ggataaacca gtaagaaaat ggggacaact tttcctcctt 3600
cttcctaaaa aaattcttaa actagaccca tcatcattgt catcatcatc atcatcatcc 3660
tctctttggt actgacgttt tatcttttaa gcatagcctg gcgttcgacc aaaagcaagt 3720
agttttgttg cttgggaagt tctctgtttg gtgatgtgta gaagaaggaa taatatgatt 3780
tgtgtccctt cagtgaaagg aagagttgca tcctctgtcg ctgagcatgc ctgctgacac 3840
tgaaaatgta cactgactgg tgtatgtgtc ctacacctgc cactaatcta aagaatctgt 3900
ctcctgtctc atgtgatttt tcatcttttg gaaggaagtg gaaaatattc agatgtgtca 3960
gttggtggac tttttgagct catgtgctac ttaatagaga 4000
<210> 7
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 7
tgtcgccccc agcttccggg atgcaggccc gccggggtct agaggggcgg ctgccgtgcg 60
tccagcctgt gcgcaggcct ttcgccgctc ggcgccccag gcagcctcag tttcctttcc 120
tctgtttgcg ccccagtgaa cctccgcacc tctcattcag ggaagagaat tccccgcgca 180
gccgcgctcg tttcttcctc tgggattttc ctgagaatcc ccaggagttg gccacgatcc 240
catggggggt ttccttctac ccagccccgc gtcctggcct cgtccttaac ccccgggttg 300
ccttcactca ggctgggaat ccacgattga tttcctacta cggaagcggg tggcgttccc 360
agcctgcttt cggagcagca cgggtttcgt gcagggtgtt atcccgaccc cttcccccat 420
ccctctaatc tggcttgaga agcccgtgct ggagagaaaa acgcggcctt aaaaaaaaaa 480
aaaagtttaa ccgaaagcgt gagagccacc cgccggctgt tatctggggc tgaaggctgc 540
ggtaatcgat gggttatttt tacgcggtaa tagggccctg tgattgctct attaaccttt 600
agacctgtct gagggactct ccggctcgca gccccgctgc gctggggcct ccaggctctg 660
acgccgactc ccaactcagg cctgacacat tcccctcccc cataccctgg aagagccccc 720
tccatgaaga agctcccctg gaccgcctgg ctccccagcc cttgccacgt cccttggatt 780
ggtgcagagc cgccgcaggc tgcagaaaaa agggggaaag attagaagag aggaggccac 840
aggagatggg aagtgtcgcc aggaagggat gcagattgca taaatacata aaattgaggc 900
tgaggcctgg gctcccgacc atctccctgg gattttggga aggcaaaagg gaggcttcgg 960
tctctacgct ctgattttag gaggcagtct gggtgtctcc tgaacctcca aggaatccgg 1020
ggctgggagg atccccacta cccctgccca ggaactagca tccagccggg caccccgggt 1080
gacccagtgc cccacacaag atcgagagtt gagcccaaga ggtcaccttc ttctctactg 1140
gccccgcccc tcgcccgccg ctgcgggatg aggaccacag gaaggggggg cggggaggga 1200
gaaagggaac tcattaataa agctgaccct gggcaccaca gcgaacccaa tcgacctccg 1260
gctgggttgc gggtgattcc ccgctccctg gcggtagcac ttgggcattt tccgcggaga 1320
ccccagagcc tggactttgc ctgctggggg agctttccgc acagtcccgc agcctgcgcc 1380
cagcggaggt gtagccgggg ccgcgcaccc ccgccccgcc cttgcacgtg actcccacag 1440
gccagtcagc gccctagggc cgagttgctg ggccggggac ccgagccgcg agctggggac 1500
ttggaggcgg ccggcgcagg ggccgcgaga ggcttcgtcg ccgctgcagc tccgggggct 1560
cccaggggag cgtgcgcgga acctccaggc ccagcaggta gggctttttt cttccctttc 1620
tttgctcctt cccgcggtcc cccaaactcg gagcttctcc gcctttgctt gtctggaggt 1680
agagaggtag ctagtgggag gaaaagagac gtgcgctact cacttcaccg aaattgccca 1740
acccctgctc tgcttttgac tttgccttag caacttcttt aagtcaaagt aagacttggg 1800
ggcaaaacag agaaatattg gaagcgcctt tggattcttt ccgtgtgaac ttgaacgctt 1860
tcaatccctg tccccgtgtg cacattctcc aacccttgtt tgcatatcgc aggccggggc 1920
ctgggtggtg atggtggccg cgtgaagtta ccgggactga cgggcccggg acaggctgca 1980
cggcagctcg cacatggagg gaagtagacg gaggcttgtc gcccaccagc gactccgggg 2040
acgcagggtg gcagtgccag gcagctccgc tgggcctcag gggcccccgg gagccgctct 2100
gaggtgcgga gaggctgctg agtggcggaa ctattcatgc cctttctggc cggcctcctc 2160
gccctcgggg ctggggtcca gggactgaat gctcctctgg aagctcacca ccccacctgc 2220
ccgcgctgct tctacctgaa actggccaag ggcccgagcc cggaccggag ccgtgacttc 2280
cctccgccgg ccacggggct gcccggatcc gccgggttat gtcgcttggc tttgggctca 2340
ggggtcaccg tgggcagagg ggggtgccgg ggtcgcggac tgccaccagg ttgaggaaag 2400
gaggggcctt ttggctgggg aaagagcgtg gtgggggacc cgcggccgat ggaatccctg 2460
gggcagcgcg gcccgcaccg tggaggttgg ggaagcgcct cggggaagtg tttcctgtgt 2520
tcccagaaaa ggaagacaac cgagagcagg tttcaggctt ttaaagaaag cctggggtgt 2580
ggaggtgatg ctccgcacac gtctgtgtct cctcccctgc tgcggccggc ttggttgtgc 2640
cggctagcgt gcgaccgtcc tcctcgctgc aggccgagag cggaggcgta aacccaggcc 2700
agcgaggagt gtcctataaa gggacgggga cttttcggcg cttgcaattc tcccattctg 2760
aaaaatagat cggaagaggg ctattggttg attcttgaaa ggggagcgca tttcctgttg 2820
gcctgcgaat ttggggtgaa ctgggacaag tgatcagaag gagagcaaaa actccccgat 2880
tttggcagcc tcgggagctg ctgggctttc tccgccaact gcaggatcca ggctcaattt 2940
caacaaccag ccagaggcgt tttccaagag cagctaattc cttgtttttc cagaaagtta 3000
tagaggagta ttttctccac cttctgttgt tctagtaatc caactcaggc actatatcag 3060
ccatttgaaa aggcagagaa tgtgataaag acaaatatta gattgatgac attttttgca 3120
tttacctttt aaagtctgca agttactacc tgtgtgtata ctggaagttg gattataaaa 3180
ttctaaatct cctttctttt ccaaagttat gaaagaaaaa aaattacatt atcttgaaga 3240
actgcaggag ttgagtattc cagaaaatgc aatgaaatag gtcagctact tgattttaaa 3300
agtcaaatac tggatctttt attaaggtaa acccataatt ctttaacttt attttcaaag 3360
ggaaaagttg gtgacctcag gtcaattttt aaaaaaatct attctctaac caaacttgct 3420
ggaatgaact atttgccaaa ccaataagtt attgcatatt ttgaaagcaa ataagctttt 3480
aggagttacc atgtgactat ataatacaat acagtactat tccattatta ttactagtga 3540
tgttgcaaaa aatggtgaaa agcattatgt agtgtgtatt aaagattcca tttccagatt 3600
tttacagtaa taaagatgat catttattat agtatataca tttgaggtac tttcttgtat 3660
tatactagaa atctgtagta atagtcaact gttatttaga actttctttt tgcctgttag 3720
gacagtttta taaaaatctg ttataagtgt tttacaaata ttaatttata atcctcactc 3780
ctaagcttca cgatgactct acaaaataag tacctttaat atctgcattt tgcagatgag 3840
gaaactaagg cacagagagg ctaagtaatt tgtctaaagg tgtttattcc gtaagtctca 3900
gagcctggat tcatatatag ttaacattct tgtaaatcta ctattgaaat aaaaaagaaa 3960
actttgtcgg gagtagttgc ctcttcttaa agagagaaat 4000
<210> 8
<211> 3428
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 8
agtttccttc caattaacgg agtggcggcg accttttaat ttacccccaa cgggtgagaa 60
ataaacttcc ccaacgtggc caggcccagg aatgggactg gagtcgatgc ccttttaccc 120
ctccccgttc taatttccag ccctggcctt gagctgtggc tgcctctctt tgggccttgt 180
acctctccgc cgagtctccg ggccccgtag gtaaccaagg cgaggcccgg agtagcagct 240
ggaaagggag gaaggagccc tgaaaggctc acgcggcccc gggacaggcc acatcggtgc 300
gggcctccca ggttccggag ctgcggggtc tcttaggcga ggctgccttt tcccaaaccg 360
aacttgcctt ccattcatgc cacttgtagt tttttcccca gctgggattc acggagcgca 420
accaggcttg cagcgctcat ggttagagcc tctgaggctg gagcacaggg ctgggtcgcc 480
agccgcctgc gcctgggaat cctgattgcc agctgatgag aaaggcgggc tgggcgcgcg 540
tgtgcgtggg gtcgagggcc ggggaccgag cgcgccgcac aaccaaccag gccctcaaaa 600
ccttcgccct ggtggcggct ggccgctccc tcctggccag ctcctccgtg gggtcctcgt 660
agcaaaggcg aatttaaggg ttgcccgggc gcccctcgct ccaggcgggt agctgtgggg 720
acctacaccc gcggtactcc ctgagcggcc ggtccctgcc tggagtgccc tggtagggcc 780
ggcggcggct ccgtttggga cggatcctgc gttgaatttg acttttcgag ggcggccgcg 840
ggtaaactcg cctctcccgg ggaccgcagg gattatttac agggagctcg ccaaccaaac 900
acaacagtct aacctttcca agtcctcgta aatttttaca gctgggagcc acggcgaggc 960
aaacgaatct gttggtcgtt tccgacttcc cgccagcctg tgtggcttct gaaacaataa 1020
ctccttatga aatatcataa atatagattt aaatacagta gagcgacaat gcgatttggc 1080
tgctttttta tggcttcaat tattgtctaa ttttatgtga ggggctccgc tggccgcact 1140
cgcacgcggg acccgcgcct tcttgatggc gtgattaatt gtgatataaa atagtccgct 1200
taagaagtgt gtgtatgggg ggggagacgg gagagtacag agacaaggct agatttgatc 1260
ttttaatcgt cgttggccac aattaaaaca aaccccatcg tagagcggca cgatcccttt 1320
acataaaaac atatggcttt tgctataaaa attatgactg caaaacatcg gaccattaat 1380
agcgtgcgga gtgatttacg cgttattgtt ctgctggacg ggcacgtgac gcgcacggcc 1440
aatgggggcg cgggcgccgg caacttatta ggtgactgta cttccccccc ggtgccacca 1500
agttgttaca tgaaatctgc agtttcataa tttccgtggg tcgggccggg cgggccaggc 1560
gctgggcacg gtgatggcca ccactggggc cctgggcaac tactacgtgg actcgttcct 1620
gctgggcgcc gacgccgcgg atgagctgag cgttggccgc tatgcgccgg ggaccctggg 1680
ccagcctccc cggcaggcgg cgacgctggc cgagcacccc gacttcagcc cgtgcagctt 1740
ccagtccaag gcgacggtgt ttggcgcctc gtggaaccca gtgcacgcgg cgggcgccaa 1800
cgctgtaccc gctgcggtgt accaccacca tcaccaccac ccctacgtgc acccccaggc 1860
gcccgtggcg gcggcggcgc cggacggcag gtacatgcgc tcctggctgg agcccacgcc 1920
cggtgcgctc tccttcgcgg gcttgccctc cagccggcct tatggcatta aacctgaacc 1980
gctgtcggcc agaaggggtg actgtcccac gcttgacact cacactttgt ccctgactga 2040
ctatgcttgt ggttctcctc cagttgatag agaaaaacaa cccagcgaag gcgccttctc 2100
tgaaaacaat gctgagaatg agagcggcgg agacaagccc cccatcgatc ccagtaagtg 2160
tctcctccct tcaaatccgc cgccgcctcc acgccggcct cccggatctg ctggcccgcc 2220
aggtttctct cgagcctgcc ttcgtcctcg ctggaagcct ctcgagttgg ggccaggagc 2280
cagaagttgg tgtttgggac gcctcagata gggccccaag tctggagagc agtgaagagc 2340
ggcccgcagg gctacgggag aggaggcggc tgctgcagcg agagggggcg gggcgggcac 2400
ttcgggacga gccaagactg gccgcccctc tccttggctg cccaggccca ggaccgagat 2460
actttgggcc gttcttcgaa agcagtgcag cccagagagc cttttgtaca actagattgt 2520
ccgtgagcgg cggcagccag ggcagccgga gctgggacgc tgggggagac ggccgattcc 2580
ttccacttct tgccttcggc cagtggcggc gtaaatcctg ccaagatgag gctgcgggcg 2640
acccgggcca caagggtccc catgacagat tattcaaata agccacagac gtgatcagcg 2700
gccttagggc gccctgacgg cttgcccagc tccgaaggcc ttccaggaag gttaaataag 2760
gagtgggggg cgtagaggga caggttggga aagaaagacg aagtcagtga acgggacaga 2820
ggaatcctaa tcttgctaca gaacacaagg cagcatgctt tccctctgcg tggcaaggag 2880
acctgtttcc aaatttcatt ctatacagcg ttttgagagt gggaggaagg agaaggggga 2940
caagaggaca gagtaggaga aaggaaggtc tcggagggga gggcgagcca aagttttact 3000
gcgtgcaatt ttaagtgact gtctgtgcgt ctgtctgcca gggttccatt gtgtccgagg 3060
cctgactgcc tttcctaacc agttcagcag agttctgcac ttcggccaga gaccccatgc 3120
aggaggctca tttgccccag cgggatgtgc gtcttctgct cctaaaccca gtgtttctct 3180
tccccgcaga taacccagca gccaactggc ttcatgcgcg ctccactcgg aaaaagcggt 3240
gcccctatac aaaacaccag accctggaac tggagaaaga gtttctgttc aacatgtacc 3300
tcaccaggga ccgcaggtac gaggtggctc gactgctcaa cctcaccgag aggcaggtca 3360
agatctggtt ccagaaccgc aggatgaaaa tgaagaaaat caacaaagac cgagcaaaag 3420
acgagtga 3428
<210> 9
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 9
taattacgct gaataggatc gtattgagtt tgtaataatt agcaatacca tccctaagga 60
aacagggttt ggtctcactg ccaaatcaga agtttgcctt gcctcaagag aaatataagt 120
attctggaaa aagtcttgca agtgtttttg ataagaattc aaatctcctc aggccattga 180
atatcacagg attttgggaa aatgcccagt taaaatcaag gttgtatttt aaaattctgt 240
tagcaaaagt atttgcaact gaattatcta tgtgataaaa gttgcataag aagaattctc 300
tagaagacgt ttggtaactt gcaatcaagt agtttaggtc ttgcttatgg ttaggtgtcc 360
ctagagatct ttaaaggcat taccaactcc ctctttaaaa aaatcacaaa cacaaaggta 420
gagacagtgc attattttga ctctcaaatt ccctttccac ttcaacatag tataggctag 480
gctcaattca gcgttaaagt tcagtggctt tatgtgacaa caacaacgaa agtgttcttt 540
tcacttccaa aagaatcagc tgtggctttc cagagtagtt cttctaataa tgtaaactaa 600
tggtaaactt gttctaattg cctcccaaag cagtaggagg atgaaatggt agaagacctg 660
tgaaagaggg atctggaatt ttaaaaataa attcaacacc gtattaatta tttgctggaa 720
ggctgcaatg tgtccaggta ttagataaaa aaacggtaag cagagtctct acggaaaaaa 780
aaaaaaaatc acaatccagc ctgaaagatg agtaagagcg aggaaaaaat tgaacagaac 840
tatgtagaat tctataaaat ttcacttatg gtggagcatt gtactcttag ggctgcaaga 900
aaaaaaaaat ggagggcgtt cttcctctct ttggcttttc ccaagaggcc taacgctaac 960
aatggcacca actactgtta ataccatcaa tagggaaatg gtaccgcata atggatgctt 1020
tgtatctcta tctctcagtt cagttggagc taaataaaga gggcaaatga gcacccaaca 1080
ctgtgccagg ggaaaagtgt cgcctgcaac agtgaagtcg caggtggatg tgagatgcct 1140
gacttaggag cgcgcttacc aaggcgctaa cactgctgct attatttcca cccgcacccc 1200
gagcgctatg ccggccgcgc ctgggatgaa acacacacat tgagcctaca agaccgtcct 1260
gggtctagag tgtctgtggc agccttcttt tctgccccac cctgaaatcc tagctatccc 1320
aggacgccct agaaggaagc ccagggacgg tgtggagcag cctgtactcc ccatctctct 1380
tccaggaggc cacacccaaa acaaggccct ctttgtgtct cggagaacag tggccgtata 1440
gtgctccgcc ggctgcccct gttaagagag agcgagcagc cctcgccccg gcaaccccag 1500
gcagaggcgc gtcgcggcgg cggcgcaggt gggcgcaggc gcggaggtgg gctctctagg 1560
gccgcgcggg agccccgggt ccgcacgccg cgcgcggaac acctgggggc ggagccaaga 1620
ccgcgtcccg cccactcccg ggcgcgaagc cccctccccg cgcccctccc atcgcgccgc 1680
agaggcgcgc aggtgcgtga ggccgcgccc gcccgggacc ctgcagacgt gggccagcca 1740
tggagcacat ccgtacgccc aaggttggtg acaccagcgc gggcggagga gggacgggag 1800
gagatggggg aggaggagga gggatgctga gcgcgcggga ggccgactgc tttgaggggc 1860
accggcggag cctggaccgc gggcgaggga ggagcaggca ttgcctgagc atcccggggt 1920
gcctgcgagc ccggtcgttc tcttgctgcc tcccaggcct agccttagct gctgctgggt 1980
ctgacctctt ggttttgggg gagcgcagtg gacacaaggg tgaacgggag ggaacctcag 2040
ttgtctgcta gtaactgggt gtagatcaac ccttctttct cctggcacga ggctttctct 2100
tttagctgtt ggccgctcag agtagttgaa agggaaataa gcctttcggt gacaggtgca 2160
aggaaaacga gctaaatgca gagggactcc tgcgcttgga agcttgttaa atctagggtg 2220
tcaggcccac ccggctcggc cttcccagtc agcatcctca tcctgagcgt agcagctgca 2280
aggggcctta cacagaacgg ataatcaata ttcattgtag gttgaatgat ggtgtgttct 2340
tgccttttcc agtccgtttt gttcgttaga gaaaaggatg cagcttacgg attcgtcacg 2400
cactgttgtg ttttaacaac accagctttt gctaattaac aaaagcaaat ggtccctgat 2460
cactccagta aattaacatt ggaaacgttg atcgctgtac caaatcttcc tcctcagttg 2520
tactgataat ctaatttaga atgaaaatga tgatcgacgt tactgcatga taaaaaccct 2580
aaacgagtga aagaatatgc ttaaaaaccc tattggctgt ctgttgttac taccaccaca 2640
gctccttgcg tttttgcagg atgaacttcc attcaaaatg taggcccctg acaggtcaaa 2700
gctaggtcag agtggccata gctcaggtgg ttccagggat cccacacatt taagaggggt 2760
gggggcaatt gctttatggc cagcaagaat tgattcctaa attttggaat agttcctgag 2820
tacctttttg taaaagcaga ttaaaatgat ctcatgtcat tggaagaaga aatcttttag 2880
tttgctggag aatgtcagtt ccgacagtaa atttaaattg tattgatttt gcactaggga 2940
attaagttgt cgcttcacaa tcatgaaatt gtaaacttag aagacaatgc tacaaaccac 3000
agaataggtg gctcaaagct ttcagagttt aagtggtact aaataattta ttccagaagg 3060
gtgaatttaa ctcatggact ctgcccttgc caagggcatt cttcctcctt ccatgatgaa 3120
gggagccgtt tgtaaaagtg atagctgttg tggatattga tagcaagaat gatacagtga 3180
catggcagtg gatgccactt tgttagagaa tatgaatttg ggggagtcaa ggccttttct 3240
gttctatata caaagccacc tggtacaaag tcacgtgtga acctgagttg caagcagtgt 3300
tcttactctt aaaattggtg tttatggata ccctctaagc agtgcagtac ttgaagtcag 3360
aaatccttat ttatctggaa atggaaacaa attgggggaa aatggaaaat tgtctgaagt 3420
gttactgaat tgggtgagtc attaacattt gggataaagc tggtgaaaaa aataagaaat 3480
tacagaggtt ggatggatcg gattcattta ttcatttatt ttattctaca agcatttaga 3540
acctttcatg tgccaggctc tgtgttaagt gctggaagcg tccaggaact cacaatctct 3600
aaggggaggc agttgtaaat atgtcagtgt atgatagaga catgtgcaag gtgcagtggg 3660
tagagaggga gactgaagag aggatcagct ctgccctcaa ggtcaaggga agccttctta 3720
gaagagccgt cttaacatgg aaggacttaa ggaggactag gagcattttc aacagtggtc 3780
atgtacttgt ataaatatat attgtaataa ataattacaa ccctaaagaa actgaaaaca 3840
ataacaatgg tcaaagataa atgattcctt gaggttaaat aacatcctcc ttttgtttta 3900
catttttaag ggcaaaatta attttcacag tctaaatgaa aaagagaaca acattactta 3960
cagagcttgc agagttaaat atataattgt tactggtcat 4000
<210> 10
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 10
agtgattggt actgctcgaa ggttgccaga atgagtattg taccgaagcc cttatggtta 60
tatgactcag ttataatggt tcagtctctt tgataccgga tggctttttg gaagaccatt 120
tttctgttat ttaacagttg ttaacaacaa caacaacaaa aagcttcctg gttgtgtttg 180
atagagtcta ggggaaaaac aaagccactg ttgcctcctc tccatcccca aggagaatgt 240
gggtcagggc tggaggccgg ctctgggaat ccctgagaag ggagcattat taatgtcacc 300
accactgtgc ctgctgagct gctctgtgct tcccccttgc acaagaacca ggcccagcca 360
gggaaaggaa acgcaggcca ttccctcaga gccgaagtta agggagaaat aataatacag 420
gcacaggagg accagcagca gccagagagg agaagtgaca gggaccgagg caaatccagt 480
ctctccccgg gtttcaagaa tttgagaaac acacctctta aagatgaaat cagctgtgcg 540
agagtgtgag gcccaggaaa cctgggagtc tgctgtataa atacagcaag tggctcacac 600
tcatccaccc aagtgagcac ttttgcaggc ccagcatctt ttaatggcga caaaacaaga 660
ataaagaatg taagtgggtg tctgaacttg accaacattt tgatgatgcg atttttccag 720
tttcgcacac taagaggctt ctgtgatttt ggatttgttt tatatatggc agatctctag 780
aatggtagtg ttgagtctct ggggttttga gcagctttgt ggggggctgc tgggcgggtg 840
ctgtactact gaataactat gaggttcttc taaaacatcc tccgaacact ctgagtttac 900
tctgaatgct aatgggatta atctgatcat tttaaaggtg catgtatgca tgctgcaggg 960
tgttcctttc ccagttaatt agtttgtgac ccttattaag atgtctcaag tctgaggctg 1020
attaaggctg catggtaact ttgtcttttt tcctaatttg gaagcgcgta aatggttaaa 1080
ctcctggcct gggctgggct ggtgcacagc ctgggcccgg cgcggcgggg gttaaggtgg 1140
gcgcccgcgc cccgcgcccc gcgccctccc gccgggatga gagcgcagtc cgcgccgcca 1200
gcccgcccgc tcgctccgag gcggcaccgg gagaaagtgg cggtcaggga tggagctgct 1260
gccatgacaa ccccggcggt cggggcccgc gcgcgtcggg gctgctcccg ggaggaaggc 1320
ggcgcggagg ccgggggcgg ccgctgagct tggcgtccgc gcggctccgg tgcgggctgc 1380
gccgcgcctt ccccagcgag ctaccgagct tggggccgcc gcggtccgct cccgccgccc 1440
ggcctctccc tcctcggcca ccgccgcagc ccctgccccg ccgagccccg ccggacagcg 1500
gcggccgcag cgcgcatttg ggctccgagg aagttgaccg aggcggctgc cgcaggatcc 1560
cgggcccgga tcgcacgaag cccgcgcggc cgtctcctcc gcgcgccacc cctgcgcctc 1620
ccgcgagctc cacttcccat ctgctattgt ttccgattgt tttccggtgg cgagcccggc 1680
tccgaaactt acaaagtgtt ggatgtcccc cgttcgaact gagggactgc agaccgcctc 1740
tgggtagctg gatgaagccc accccgtccc cttctggtac caaagtgctt actcctctcc 1800
aaagtgccgt gtctgaactg ccgctgggaa gaagcggctc ctgagacgcg cccacacctt 1860
tcacctgccg cgcgcttccc cctcctcggc caccttcccg gcggaagcag cgaggaggga 1920
gccccctttg gccgtcctcc gtggaaccgg ttttccgagg ctggcaaaag ccgaggctgg 1980
atttggggga ggaatattag actcggagga gtctgcgcgc ttttctcctc cccgcgcctc 2040
ccggtcgccg cgggttcacc gctcagtccc cgcgctcgct ccgcacccca cccacttcct 2100
gtgctcgccc ggggggcgtg tgccgtgcgg ctgccggagt tcggggaagt tgtggctgtc 2160
gagaatgggg gtctgtgggt acctgttcct gccctggaag tgcctcgtgg tcgtgtctct 2220
caggctgctg ttccttgtac ccacaggagt gcccgtgcgc agcggagatg ccaccttccc 2280
caaagctatg gacaacgtga cggtccggca gggggagagc gccaccctca ggtagggagc 2340
tgacattgtt ctgcgaactg atggtttgta tggggtcggg gtaaggggca ggggtgcagg 2400
tgtgtgcact gaggcgtgcc tgggttggcg gagaggtcgc tggttccctg ggctgcacaa 2460
tttatggctg cgctgggggc tctgcccggg aatgtggcag tcgtagggaa aggctcagag 2520
gttctggcgg tgagcttttt cccaaaaact ggcctctgcg gctcaggcac ttgttaaagg 2580
tgaggggtgg ctggaccagg tggtcgccga gattgaggga cttgtgcctg gcactgtctg 2640
tgcctgagcc tggtggccgt ggtgacaggg ggcttggagg ggctccccgc gagcagtctt 2700
ctctgaagtt aatgagcccc aaaggagggg tctggcttgg agtgaatgcc cccactcgcc 2760
catgccatag ggctttgcca gccctggctc ctgcactctg ggagagccgc tgctttgtcc 2820
tgggcctgac tgtgcccggg ctttcctggg gtgccttcat gccgtgagct ggtgggcaga 2880
cagagatgct ttctcctgtc tgaacgtggc tttctgaggc ccaagtcatg gagtctgatt 2940
tgtccgtgga aaatggcatt tactgtagtg aactgtgttc tgttcctgct ctccaccaaa 3000
acggtacatg caaaactcgt ctactgaaga gaaactaggt ttcagtgttg ggttgggtcc 3060
tgattggctt ctggggttaa ggcttacagg cactggggga ggagaagaag aagaatcttg 3120
gttatgcttt gtgtaaggta gaatgattct atctccctga ttaccttgcc tgcagaaacg 3180
ctaactgaat ttccagtgtt gataaaccac acctctcata tgcgggcaaa acacttaatg 3240
attgcgatgg gaaattttat tctctgggat tttataagag aataagcatg aggtggacgt 3300
taagaaggtt catgggaacg atttccctgc ctctccttgg tttagtctgc cctcctaaat 3360
aaagttttcc aaactaagcg acagaactaa ccacaaggca acatggcaat attcctgtcc 3420
tttgcacatg aagatttctg gaaagataac cctggtgctg gtgtctactg ttttgcccct 3480
ctgatgactt cttctaggat tgggttgttt tggactgtat acttaaggca atatctatag 3540
gatagaaaat ggtgaagagg aggcaatgtc aatacagagc tgagttatca ggacattgcc 3600
aaaggaagtg tgtaatttag ggacccgtgc agggctacaa gcatccagtg atcctttgtc 3660
taggcaaagc ttaacctcat ggctctggtg aactcctagt tatttgttgg ctcacgagac 3720
ccacctcttc cactcttctg agcaaaaata aagcaacttc cttcccccac tcagaaatga 3780
ttgtgtatct gctttaaaaa tggatttcag gggagttaca aatatgcagt gatttcagac 3840
tacttaaata aaaaaccaaa aataaatgtc tagagcagta ataatcaagg aaattttctt 3900
gttcaagaaa tgcttgttct ctggatgccc tctttgtccc tagtccttgg ctgcaaggag 3960
ggcctcccag ggacagagac attctgaatg gggaacattt 4000
<210> 11
<211> 2848
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 11
tttctggcat tagctgccca cgtctgtggc acttcaggcc catgtaacta tttccagagt 60
gacacaagtt tcttccacag ttgtcaacaa gtggccctca caggttcagt gagaagagga 120
agagggagag agatcatcag gattaatgga ttacttgcat ttgtgagacg gtttgccaag 180
tattgctaca aacaaggcac gggattttct tttttctttt cttttttttt tgagatggag 240
tcttgctctg tcctccaggc tgtagtgcag tggagcaatc ttggtttact gcattctctg 300
cctcccaggt tcaaacgatt cttctgcctc agccctcccg agtagctggg attacaggcg 360
tgtgtcacaa cgccctgcta atttttgtat ttttagtaga gacggggttt tgccatgttg 420
cccaggctgg tctggaactc cctgcctcac gtgatcctcc cccctcggcc tcccaaagtg 480
gtgggattac aagcatgagc caccgcgccc ggctaaggca tgggatgttt cgaactgctg 540
acattagaaa ttcacaatcc acatcattaa ctggatcctc catgcccact ctctccctct 600
ctgcagcagc aatttcaaat ctttactctc cgcagttcca cagaacacaa gaaacaaaca 660
aacaagcaaa aaaagtcagg caggagccca agtaacctct atcaaagcaa agaccagtgc 720
ctagtctaac gcttttaagg attttaaaag aggtgaaggt gtcctgctta tcctccaagc 780
ttgggtgctg gggccggggc ggctgagatt taccagtgaa acccaaagaa agagagggca 840
gaaaactaga gaaaagaaac cagataatgc tacccaagag gacgaaataa agaagcagga 900
aacgaagcct gaggctaaac cctggagatg actattagga aaacaccaga ggatgccccg 960
cccgccagcc cacaatgagc agcctgtcca agtcacaaag cggggcctcg ggccttgaca 1020
gttcgcgatc tgtaagcaga atgttccagg gcctccctgt cgcctgcatc cagcctgggg 1080
gcaatcttca ctggtgtggg aggccgaaag tggacggcga cggaggcccc tctggttatc 1140
tctttgccgt gccaacacag tctctgcgcc cactaagatg catgaaataa aaatttccgt 1200
gactcgccct ttgcagtgga gaactgaaac aggcacacca gggaattgga gcggaggagg 1260
gtaactcaaa ctcagagtga gagggtttgc agggggccga tttggggcca acaggcttcc 1320
cagcaggccc ccggcgcggg acagcggaag gcgaaacgct ttcaagagac cccgctgcca 1380
acatccccac gccctcgcgc cctcccgccg ccccagaagg ccaactccgc ctgcctgagt 1440
cacagctgga gctggggagg agccagggaa aggaggcccc tgaccgtagt gcggccagca 1500
gttgcaggca gacggagcag agcggtcagg gatcatgagg gagagtgcgt tggagcgggg 1560
gcctgtgccc gaggcgccgg cggggggtcc cgtgcacgcc gtgacggtgg tgaccctgct 1620
ggagaagctg gcctccatgc tggagactct gcgggagcgg cagggaggcc tggctcgaag 1680
gcagggaggc ctggcagggt ccgtgcgccg catccagagc ggcctgggcg ctctgagtcg 1740
cagccacgac accaccagca acaccttggc gcagctgctg gccaaggcgg agcgcgtgag 1800
ctcgcacgcc aacgccgccc aagagcgcgc ggtgcgccgc gcagcccagg tgcagcggct 1860
ggaggccaac cacgggctgc tggtggcgcg cgggaagctc cacgttctgc tcttcaaggt 1920
cagtgacctc aaacggtccc caatccgagg cctttgccgg cctgtgggcc accagctggg 1980
ggctccccgc ttccatccac ctaccacacc cacattcctg acccctcccg ccgtctgttg 2040
ctgtggaaca gactcacaga gccgcaccca cttcccaaga cccagcccca tccctccctc 2100
tcacgcctga gccccgcctg gccaatccaa gcccgcccag ctctagctca ggccacgtcc 2160
gcagaatttg gtctgagtcc cagccaatcc ctaaaataac ggtggttgaa agggcattcc 2220
gtgactgcgg gcactatcct cttctcgccc ctcaccaggc ctcacctact ttacagcgtt 2280
ttgcagttcg cacgcagctt tccctcccct taccttccca cgcctgcctt tccccccaga 2340
ctctggctgc ggaggtaaaa ggtttccctt gtgtaattaa ggagtgagtt tcgggctgct 2400
gggggtaagg agctgccagg atcagtgctg tgtccgtcac atgcaggagg agggtgaagt 2460
cccagccagc gctttccaga aggcaccaga gcccttgggc ccggcggacc agtccgagct 2520
gggcccagag cagctggagg ccgaagttgg agagagctcg gacgaggagc cggtggagtc 2580
cagggcccag cggctgcggc gcaccggatt gcagaaggta cagagcctcc gaagggccct 2640
ttcgggccgg aaaggccctg cagcgccacc gcccaccccg gtcaagccgc ctcgccttgg 2700
gcctggccgg agcgctgaag cccagccgga agcccagcct gcgctggagc ccacgctgga 2760
gccagagcct ccgcaggaca ccgaggaaga tcccgggaga cctggggctg ccgaagaagc 2820
tctgctccaa atggagagtg tagcctga 2848
<210> 12
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 12
cctggcaaga atggattctc tcgaaaggtt tgaaaatccc tattttgctt ggtggcccag 60
accatctgtg ctcaatgagc taagcaaatc tggctgggct attacctggg agagtccaga 120
tttttcctct ctggaggggc ctgaagatta tttatgggaa ttaattttat ccccaaatct 180
ctgagaactt aaagggattg ggaaggtctt tctggatttc cctttccctc tactggagat 240
gtagcggttc agccttcttc cgatgccatg tttgtttttc gtgtcttcgg cctagggtcg 300
ccttgccagc aagcctaaag gcctccaagc tgacttggag ggtgagggtg ttttcacaaa 360
taaatacatc gcctgggcaa agggaaaata tctgtttgca aacaaacctg gaaggtggag 420
tgagcaccat agcaaaggag ggctggcttt ctccccggtt gccccacatt cagggttgga 480
gattctccac tttggcattt tgcagcaatg gcctggcctg ggattttagc agagcagtca 540
cagagggtta cacagctgct gacctcgggg catttctcct ccctccatcc ctttctccag 600
accttgactt gcaggcccaa gtctcttatc agaaccctag aaaaatcagt atgatggggg 660
tacaggaggt aaggatggga aacagaacag gactcctgac atttactcca agcaccaata 720
ttcggtgtcc caatctgggt ctgctcagac tgagacctac tgactgtgtt tgtgctttta 780
ttgacctctt caactcaccc taaaaaaaaa aaatacatct cagagaggga aagggcaagg 840
agaggagacc agtggagatg aaaaccctag ccagtcccca gtgactgttt gattatttta 900
ataaaactgg gcactgcctt gtgtacacct ggagcagggg acgtctggtg gccccactgg 960
gtggggggtg agggcccgca gcgatttctt agcatctttg atctcggccc ccatcccaat 1020
gcaccttcac cctgccttca ccccagagtc gttgagagta ggggtgatga gtagggggtg 1080
gaggggagat gtcaggaagg cgagcgccgg ccaggcgggg tcaggcagct ctccttctcg 1140
aggtcagcgt tggagagaat gtctgcaagg ctgcggaggc ccgcggtgtg tttgtgtgtg 1200
tgcgtccaga ctcggttctc tgcaccgcca gcgtcactga gattacttcc cgattagaag 1260
ccgaccgcgt ttgaaatgat ttgtgcagga gtttttgcag ccaccgcttg ctcagagaag 1320
cagagatgga tggaggttgg gaaaggggta gagaggaggg agttattgca ggtctgtgtt 1380
gagagtcgta ttgtgatttg agtgttcggg aaatctagtg gaaatttggg gtggggggaa 1440
gggaggacgg gagggtggga gggagagaga agggggaggg cgacagagtg cagtgggagc 1500
tagttggata ggcgatttca gtactttgtg agcatcgagg caacccaacg tcactgtgct 1560
cagctgagtt ggcttgtatt tcagagagag agagagaggg agagagagtg agagagactg 1620
actcttacct cgaatccggg aactttaatc ctgaaagctg cgctcagaaa ggacttcgac 1680
cattcactgg gcttccaact ttccctccct gggggtgtaa aggaggagcg gggcactgag 1740
attatatggt tgccggtgct cttggaggct attttgtgtt ctttggcgct tgccaactgg 1800
gaagtattta gggagagcaa gcgcacagca gaggaggtgt gtgttggagg tgggcagtcg 1860
ccgcggaggc tccagcggta ggtgcgccct agtaggcagc agtagccgct attctgggta 1920
agcagtaaac cccgcataaa ccccggagcc accatgcctg ctcccccgcc tcaccgccgg 1980
cttccctgct aggagcagca gaggatgtgg tgaatgcacc ggcttcaccg aacgaggtaa 2040
ccgtcccggc agatggcccg ggaggctcag gagggagctc gtcggccgag tcggctgggg 2100
cggcgggaat ggcggattcc agcccggctt tgcattctgc agagcacagc ttgcagagat 2160
tttgcgcggc tcggagctcc ccggcaaatg gagtctggga ggccgccgcg gctggcggag 2220
cggcattgag gtttgcagaa gcacggcctg gttctgtcaa accgcatctt gttcgcctcc 2280
gccagcccag agctccccgg gaccctggcg agggcgcggg gtaggattct ccccgcggcc 2340
ggcagtgaat gggagcgcgt gtaggggcgc cagccctgct ttcttttgtt gtgagtaggc 2400
agcggggctc cagtcgccgc ctccctgaag ccccgagaac gaggcgaaga aagctgcttg 2460
caagtcaggc ctcagaagct gtccttctcc tcggccccat ttctagatct ctggccacag 2520
caggtcaggg tgggatctgg ccgcttgctt aagcagctgc tgaggttttg ggggaccatc 2580
gcttgtgccc gcttcccaaa gtcttcccgt tctaggggga attcctactt gcgtatagaa 2640
gagattggaa ggagatcaga gagcaggaga caggctcatc gggcttgaac agctctgcgg 2700
cagttatttt gtgtgttcta agctcatacg cctgcaaacc cgggccgttc tatgcattgc 2760
ggggacccgg gctgcagatt caatgtctcc agcctaggac ttatccgaga atgattttgt 2820
cctcgccaat cctgagcctg agcctgcagt tttagcaggc caggcctggc tgaagttcag 2880
agaaacccct ttcggcctgg tcactccaca aaatgcccgc catcccccgc ccggcatcag 2940
agcgctggtg gcgggcaccc agtgacgagc cttcctcgga acggctgcac ggtgactttc 3000
ttcatctagt cttctgtttg gctacttttt atcttttaac gaatcttact taaggttggg 3060
ataaagaaaa ggatgtttaa ttttaaagga cttttaatgt taaggcctgt aactggtaaa 3120
aggtgtatat gaattctctt ttgaacctag tctcaatctg cacaaccttc cccttctgtg 3180
tttttctttt tgcaagaggc gggttatttc acacatttct gcctgctgca gaaaactatt 3240
cctcttgtga ggtttaataa aaagagtttc gacggcatct tgtaatttgg cgaagaaaga 3300
aattctctaa aggacactgg gtttttgttt tgttttgttt ttggttccta cccagtggct 3360
tccaaaaata cccacgcctt atctttattg gctcttccag aagtccagac aaatttgacg 3420
ggcagcttgc ttatcacgga gagcctgcgc aggggagatg cgggcctcac cttctccggg 3480
tctgacgcgg gtcttttgca agaagttgtg cctgcttata aagtaatagt aatactacta 3540
ggaatactag taacagtaat aattctaggg ccttctgcag tcaccttcgg ctgggaacgg 3600
aggtgctggt agctggaaac tgggggccaa actgctccct cctgtcacta gaattgtgct 3660
ctccaacctt tctctcgttc tctctctgtc ctccccaccc ccatctcccc ctgcttcttg 3720
tcctcagagc agaaccttgc gcgggcacag ggccctgggc gcaccatggc cgacgcagac 3780
gagggctttg gcctggcgca cacgcctctg gagcctgacg caaaagacct gccctgcgat 3840
tcgaaacccg agagcgcgct cggggccccc agcaagtccc cgtcgtcccc gcaggccgcc 3900
ttcacccagc aggtaaggag acctcgcgct tcgggtccct ttgcagagat caaagtcaga 3960
gtctggcttt cctgctcggc ttctcttgcg gggacagaac 4000
<210> 13
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 13
gagaaagcca aaaatttccc cctaccaatt acataagatt ccctgcttct agttagcccg 60
cctgtagttt ccccatgcca gcaacttcca ataagggaat acctgaagcc attccttttt 120
tccactgtga agctttcccc actcttctgc ctgactttca gtctgctgaa tgcaagtgat 180
gagggctgac tctcttgtca tatatagcaa gctctgaata atagtctttg ttctcatttg 240
aataatcttt attttcacac ttcttaaaaa atttaatttc ctggcatgtt gcataatgtt 300
aggtaagcca ttttctctct ttgggcctta ctttcttcaa ctgaaaaact ggttcaacat 360
ttattcattc ttttattccg taagccaaaa ataaaattca aagccctctg accatatgaa 420
tggatctctc ctcttggcta agggcattcc aaagttaacg tgaaaaactg gttcaggcca 480
taatgggaag gaggagttgg acatggctca ttatgctccc ctaccttttg aaattcagga 540
ccagctgacc agcattaaca tcaacacaga ccttaagact gatagaacag cctctttaag 600
tctcacagac tatccggtag tgtgataatg atgagaaaca tttgcagtct attctctgaa 660
gcctgctaca ggctccatct gcatgataaa actttggtct ccacaagccc ttatcttaac 720
tgagacatcc ctttctattg attctaagtc tttatacaat aacttaactc tttcaaccaa 780
ttgccactca gaaaatcttt gaatccacct atgtcctgaa agcctcctct tccagttgtc 840
ccacctttcc ataccgaacc aacgtacatc ttacatgtat taattgatgt cttatgtctt 900
cctaaaatgt gtaaaaccaa gttgtagccc gaccacgttg ggcacatgtt ctcaggatct 960
cctggggctg tggcacgggc catggtcact catatttggc tcaggataaa tcccttcaaa 1020
tattttacag tttgactttt cgtggacaat tctacaaata ttccttggca gttaaagaaa 1080
taactcccca ggaggtgcta gacatcgggc gcatgttaga ggcacaaaga tgagaatgtt 1140
aaaagacata aaatacaggt ctgctctggg aatgcaaaaa ctggtaaaag gagagataaa 1200
agagcaggtg cagtctagtg aagtacccgc tacctcctat cagcaaatat ctgtccacct 1260
agggtgcagc gagctggaga ggaaggggtg gcctagagcg caggggaagg attcctcccc 1320
agccgcctgc acccctaccc cggtagcggt ccctgggatc gtccgtgtct ccaggagaac 1380
cggaccgctc tcccctccct ccccgagcga gaaaggagga ccacagagat gcggcgccct 1440
ccgccgtcct agagcaaccg gagcggcccg agccccggcc tcccggatgc tggggcctgg 1500
cgggtgtgga gcacggggag tcgggcgtgg ggcgggcagg gagtggagtc ggggtcttac 1560
tccggtggct gcagggcgca gggtagccgt gtcaggcctg cccaggtgca gagcgctctt 1620
ccgcgacccc aacagcctct ggtccggtct ggcgcgccct cgctttccca gagggcgacc 1680
tgggctatgg cggccgtggc gctggcgagc gggacacgcc tcggccttgt cctcgagctg 1740
ctcccgggac agcccgcgct gccccgggcg cgccgggtga gtgcggggcc ggagcctgga 1800
agcagtcttg gccctgccct gggttctagg cccggagacg gggtggtgcg gcggctggga 1860
aatgggggta caacccagag tgaggggcct cgagggacag gcagcacagc ggagtcgaca 1920
cccctggacc tgagcctcaa ggagagcaga cgtgcagcgg cacggggttg agccgactgc 1980
tggggcagag cgcacagagt gctgtcgggg gcgatgaatg gccagaattt cagagctgcc 2040
tttacagagc tggttatgtt tgagctgggt attaggttga aaaggaattt gcaatgcagg 2100
agcaggaagg aagaactgga tattcaggca agagtagccg caggtgcaag gacacagaac 2160
agggtgagga aagagtttgg tttcccaatg caatggtgag aggatcggag atgagagtgg 2220
tggtggctga tgatcctggc caggaaagct gggtctgtga gtagtgaatg gaattgtctg 2280
tagtgcagag gaatgtggac tctattaggc agacaaagtt gagccagcca aagccttgga 2340
gccctggagt gctggataaa tagctgtgga gactttctag tgcgcaagga ctgaagtgca 2400
gtggaccaga atgggctcct ccacagtgtg gagactgaga ccctgaagga ggcagtggct 2460
gagaattacg ggaagtccca acggctggag gtcagcagta tttgtttctt aagaggatga 2520
gagaaagaag gtgcaggagc tgagactcct agagatatag aaaatgggga catggagatt 2580
gggacgtggg taagcaagtg aggtgggatc tttgtgagag tgttgcgggt ggtgggggtg 2640
cagggagtaa agtcacaacg aggatctgcc ctgttgagta cagtgttcag agcaacctga 2700
atgttctgag gagccctagc tgcctctgtg gctggtggca gtgactgggg aggacaaagg 2760
aggaagagtc ctatacaggg gcagcaggga tggcaggaat ggggacggaa ggcagtgtgg 2820
cataacaggc aagagccaga gtcaaacagg cctgggttct gtctcagttc tggaactttg 2880
ggggaagtta atccctccga gtctcagttt cctcttctaa aaaacggatc tgatagtagg 2940
ctatgagaca taacaaagaa tatatgtcaa gtgcttggca caggcttaat aaatgatagt 3000
tgttatcaag ggtgggtgac ctctgaagga ggacacattg tggagagagg atgggaccta 3060
gagcacagat gtggtttggg gtataaggat gaaacaagaa aacttttgca gactcatgaa 3120
aaagaggaga aaatgtttgc tgaaataaag atgaagagac atgagaaaat tgatggctga 3180
tgccttgtct ctttgtacat aggaggcaaa aatcttctgc tgatagagtt cctgtagaca 3240
ttcagaatcc agaatcccca caggcacccc cacagtacct tttgatgccc tgtctcccct 3300
tcctcttggc ctggtcctgg ggttgtccta gggcatttaa acacatgttg tttcaggagt 3360
cagtgacctt cgaggatgtg gccgtctact tctctgagaa cgaatggatc ggcctgggcc 3420
ctgctcagag agccctgtac agggatgtga tgctggagaa ttatggggct gtggcttccc 3480
tgggtaaggg tctctccctt tgggccctgc ctccaccctt gagagtttgc tggctccttt 3540
tttctcaaag gctcaggagt tgttgataac cctcagctca atggcagctt caggctcttg 3600
gatttttaat gacctaacct cagcagccgt tggaaagtag gaagtcctgg tatcagtttg 3660
ggccttatac aggacttcct tgctccagag tgagaggtgc caaaccccta cccttgtgtt 3720
gtgggtatag tgagaagaga gcaaattcat ggtgctccac tgagccttca gttccctccc 3780
ctctcggttt gcaagatcca gcctaattcc aagcatcctc atgaggatgt ctgaacttga 3840
gagctctaag agggagagga caggtaagaa ttgaggactc aattcctcaa tgagtgaaat 3900
catccatttg ctgactcaaa cagttactga gtcgtctgtc aacttcctga cctttgtaag 3960
tctcctggcc cctctcttgt cctttcccct ggaattcctt 4000
<---
1. Способ анализа того, имеет ли индивидуум карциному эндометрия, включающий стадии
(a) получения образца цервикального соскоба от индивидуума;
(b) определения статуса метилирования по меньшей мере одного гена-мишени в образце цервикального соскоба, где по меньшей мере один ген-мишень включает по меньшей мере один из BHLHE22, CELF4, CLVS2 и THY1;
(c) определения того, является ли по меньшей мере один ген-мишень гиперметилированным; и
(d) анализа того, имеет ли индивидуум карциному эндометрия, с учетом результата, полученного на стадии (c), где гиперметилирование по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум имеет карциному эндометрия.
2. Способ по п. 1, где по меньшей мере один ген-мишень дополнительно включает CDO1, и стадия (b) включает определение статуса метилирования CDO1.
3. Способ по п. 1, где по меньшей мере один ген-мишень дополнительно включает по меньшей мере один из ADARB2, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5 и ZNF662, и стадия (b) включает определение статуса метилирования по меньшей мере одного из ADARB2, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5 и ZNF662.
4. Способ по п. 1, где по меньшей мере один ген-мишень дополнительно включает BHLHE22, CDO1, THY1, CELF4, CLVS2, GATA4, NTM, PRKCDBP и TBX5.
5. Способ по п. 1, где по меньшей мере один ген-мишень дополнительно включает BHLHE22 и по меньшей мере один из CDO1 и CELF4, и стадия (b) включает определение статуса метилирования BHLHE22 и по меньшей мере одного из CDO1 и CELF4.
6. Способ по п. 1, где карцинома эндометрия является карциномой эндометрия типа I или типа II.
7. Способ анализа того, имеет ли индивидуум карциному яичников, включающий стадии
(a) получения образца из индивидуума;
(b) определения статуса метилирования по меньшей мере одного гена-мишени в образце, где по меньшей мере один ген-мишень содержит CLVS2;
(c) определения того, является ли по меньшей мере один ген-мишень гиперметилированным; и
(d) анализа того, имеет ли индивидуум карциному яичников, с учетом результата, полученного на стадии (c), где гиперметилирование по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум имеет карциному яичников.
8. Способ по п. 7, где по меньшей мере один ген-мишень дополнительно включает по меньшей мере один из THY1, ADARB2, CDO1, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5 и ZNF662, а стадия (b) включает определения статуса метилирования по меньшей мере одного из THY1, ADARB2, CDO1, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5 и ZNF662.
9. Способ по п. 7, где по меньшей мере один ген-мишень дополнительно включает по меньшей мере один из ADARB2, HOXA9, MTMR7, NTM и PRKCDBP, а стадия (b) включает определения статуса метилирования по меньшей мере одного из ADARB2, HOXA9, MTMR7, NTM и PRKCDBP.
10. Способ анализа того, имеет ли индивидуум карциному толстого кишечника, включающий стадии
(a) получения образца из индивидуума;
(b) определения статуса метилирования по меньшей мере одного гена-мишени в образце, где по меньшей мере один ген-мишень содержит CLVS2;
(c) определения того, является ли по меньшей мере один ген-мишень гиперметилированным; и
(d) анализа того, имеет ли индивидуум карциному толстого кишечника, с учетом результата, полученного на стадии (c), где гиперметилирование по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум имеет карциному толстого кишечника.
11. Способ по п. 10, где по меньшей мере один ген-мишень дополнительно включает по меньшей мере один из THY1, ADARB2, CDO1, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5 и ZNF662, а стадия (b) включает определения статуса метилирования по меньшей мере одного из THY1, ADARB2, CDO1, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5 и ZNF662.
12. Способ по п. 10, где по меньшей мере один ген-мишень дополнительно включает по меньшей мере один из ADARB2, HOXA9, MTMR7, NTM и PRKCDBP, а стадия (b) включает определения статуса метилирования по меньшей мере одного из ADARB2, HOXA9, MTMR7, NTM и PRKCDBP.
