Способ оценки селекционных образцов озимой пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили
Владельцы патента RU 2726066:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность способа оценки селекционных образцов озимой пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили заключается в следующем. Проводят селективный отбор каллусов, выращенных на среде Мурасиге-Скуга в культуре зрелых зародышей, на фоне культурального фильтрата Fusarium oxysporum Schlecht.:Fr., при этом в качестве культурального фильтрата Fusarium oxysporum Schlecht.:Fr. используют 8-суточный культуральный фильтрат в концентрации 20%, содержащий 2 мл культурального фильтрата и 8 мл стерильной дистиллированной воды, в который помещают предварительно выращенные в культуре зрелых зародышей каллусы и выдерживают в течение 47-48 ч в темноте при температуре 26-27°С, затем образовавшуюся в результате диспергирования рыхлой каллусной ткани клеточную суспензию высевают на свежую питательную среду Мурасиге-Скуга, при этом частоту каллусообразования определяют на 30 сутки культивирования в темноте при температуре 26-27°С и 70%-ной влажности воздуха. Изобретение позволяет сократить трудоемкость и временные затраты и увеличить выборки анализируемых сортообразцов в течение всего календарного года независимо от сроков вегетационного периода культуры. 1 табл., 4 пр.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к сельскому хозяйству, фитопатологии, биотехнологии, в частности, к способу оценки селекционных образцов озимой пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили и может быть использовано для отбора сортообразцов озимой пшеницы, устойчивых к микотоксинам Fusarium oxysporum Schlecht.: Fr. - возбудителя фузариозной корневой гнили, на стадии каллуса для сокращения продолжительности селекционного процесса.
Уровень техники
Известен лабораторный способ определения устойчивости растений к обыкновенной корневой гнили при выращивании предварительно инфицированных проростков в рулонной культуре с дальнейшей балловой оценкой интенсивности развития и распространенности болезни (см. Бенкен А.А., Хрустовская В.Н. Лабораторная оценка болезнеустойчивости растений и паразитических свойств возбудителей обыкновенной корневой гнили злаков // Труды ВНИИЗР. Л., 1977. Вып. 56. С. 9-13).
Недостатком данного способа является трудоемкость и длительность определения устойчивости растений к обыкновенной корневой гнили.
Известен метод оценки токсиноустойчивости сортов, когда, используя эмпирически подобранные концентрации культурального фильтрата возбудителя корневой гнили злаков, отбирают более выносливые к действию токсинов образцы. Критерием устойчивости сортов служит степень ингибирования ростовых процессов (см. Гешеле Э.Э. Методическое руководство по фитопатологической оценке зерновых культур. Одесса, 1971. 180 с.).
Недостатком данного метода является длительность и субъективность оценки токсиноустойчивости сортов.
Известен способ оценки устойчивости пшеницы к различным патогенам, при этом растения выращивают в искусственных условиях, проводят их заражение смешанным инокулюмом патогена и оценивают устойчивость, при этом при массовом определении устойчивости заражение ведут на ранних стадиях развития растений, начиная с фазы проростков, а при индивидуальном определении растения заражают в фазы развития, определяемые по патогену с наибольшим влиянием на жизнеспособность и семенную продуктивность (см. пат. SU №1777726, МПК А01Н 1/04, A01G 7/00; опубл. 30.11.1992 г.)
Недостатком данного способа является значительная трудоемкость, длительность и субъективность оценки.
Известен способ определения относительной устойчивости сортов мягкой яровой пшеницы к возбудителю обыкновенной корневой гнили злаков Bipolaris sorokiniana Shoem. путем обработки растительных образцов культуральными фильтратами возбудителя, содержащими токсины гриба, отличающийся тем, что в качестве растительных образцов используют проростки, выращенные в рулонной культуре на водопроводной воде до фазы 2-3 листьев, опытные образцы проростков выдерживают в культуральном фильтрате возбудителя болезни в разведении 1:1 в течение 24 часов, контрольные образцы - в дистиллированной воде то же время, готовят нарезки из средней части вторых листьев проростков контрольных и опытных образцов, помещают их в дистиллированную воду в соотношении 1:4 на 1,5 часа в условия освещения, фильтруют вытяжки, определяют их электропроводность при переменном напряжении на частоте 1 кГц и оценивают относительную устойчивость сорта по отношению
К=(Go-Gк)/Gк×100%
где Gк - электропроводность водных вытяжек листьев контрольных образцов;
Go - электропроводность водных вытяжек листьев опытных образцов,
чем меньше вычисленное отношение, тем устойчивее сорт среди группы оцениваемых сортов мягкой яровой пшеницы (см. пат. RU №2625027, МПК C12N 1/14, А01Н 5/12, опубл. 11.07.2017 г.).
Основным недостатком способа является его высокая трудоемкость, существенные временные затраты, в том числе на кондуктометрические исследования.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ оценки устойчивости сортов яровой пшеницы по ингибированию ростовых процессов и биомассы, заключающийся в том, что предварительно отобранные и простерилизованные этиловым спиртом семена испытуемых сортов раскладывают в чашки Петри по 25 штук на фильтровальную бумагу, увлажненную 5 мл дистиллированной воды (контроль) и 5 мл культурального фильтрата гриба, полученного в процессе выращивания его на жидкой питательной среде Чапека, в соответствующем разведении. Культивируют в термостате при температуре 20-22°С в течение 7 суток. Через 7 суток у проростков отделяют корни от ростков и сушат при температуре 105°С до постоянного веса. Критерием устойчивости сорта служит показатель корнеобеспеченности, численно равный сухой биомассе корней, деленной на сухую биомассу ростков (см. Рогинская В.А. Влияние условий культивирования на токсинообразование у возбудителя корневой гнили пшеницы гриба Helmintosporium sativum Pam, King et Bakke // Микробные ассоциации и их функционирование в почвах Западной Сибири. Новосибирск: Наука, 1979. С. 243-250).
Основным недостатком ближайшего аналога является его высокая трудоемкость и существенные временные затраты. Он включает такие трудоемкие и длительные операции, как подготовка лабораторной посуды, раскладывание семян по чашкам Петри, проращивание их в течение недели, разборка проростков, отделение ростков от корней, высушивание и взвешивание каждого образца, поэтому данный способ недостаточно эффективен при массовых оценках сортообразцов озимой пшеницы на устойчивость к корневой гнили.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа оценки селекционных образцов озимой пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили, обладающего сокращением трудоемкости и временных затрат, а также более высокой эффективностью за счет определения устойчивости растений при выращивании их in vitro, что позволяет получить увеличение выборки анализируемых сортообразцов в течение всего календарного года независимо от сроков вегетационного периода культуры.
Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, сводится к сокращению трудоемкости и временных затрат, высокой эффективности, и увеличению выборки анализируемых сортообразцов в течение всего календарного года независимо от сроков вегетационного периода культуры.
Технический результат достигается с помощью способа оценки селекционных образцов озимой пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили, включающего селективный отбор каллусов, выращенных на среде Мурасиге-Скуга в культуре зрелых зародышей, на фоне культурального фильтрата Fusarium oxysporum Schlecht.:Fr., при этом в качестве культурального фильтрата Fusarium oxysporum Schlecht.:Fr., используют 8-суточный культуральный фильтрат в концентрации 20%, содержащий 2 мл культурального фильтрата и 8 мл стерильной дистиллированной воды, в который помещают предварительно выращенные в культуре зрелых зародышей каллусы и выдерживают в течение 47-48 часов в темноте при температуре 26-27°С, затем образовавшуюся в результате диспергирования рыхлой каллусной ткани клеточную суспензию высевают на свежую питательную среду Мурасиге-Скуга, при этом частоту каллусообразования определяют на 30 сутки культивирования в темноте при температуре 26-27°С и 70%-ной влажности воздуха.
Таким образом, технический результат, который достигается с помощью предлагаемого изобретения, сводится к отбору для дальнейшей селекционной работы сортообразцов озимой пшеницы, у которых каллусообразование из культуры клеток, полученной из каллусов, выращенных в течение 30 суток в культуре зрелых зародышей на питательной среде Мурасиге-Скуга, и подвергшихся в дальнейшем 47-48-часовому воздействию 20%-ного 8-суточного культурального фильтрата возбудителя болезни Fusarium oxysporum, составляет 50% и более (ЛД50).
Способ осуществляют внесением микотоксинов возбудителя фузариозной корневой гнили в составе культурального фильтрата в зону роста растений при выращивании культуры клеток озимой пшеницы, которую получают из каллусов, полученных в культуре зрелых зародышей на среде Мурасиге-Скуга, in vitro. При этом каллусы помещаются в 20%-ный 8-суточный культуральный фильтрат возбудителя болезни Fusarium oxysporum, выдерживают 47-48 часов, а затем полученную клеточную суспензию высевают на свежую питательную среду Мурасиге-Скуга. Анализ проводят на 30 сутки культивирования в темноте при 26-27°С и относительной влажности воздуха 70%.
Таким образом, технический результат достигается тем, что в жестких селективных условиях имеет место скрининг клеток с повышенной устойчивостью к селективному фактору (фитотоксичные метаболиты Fusarium oxysporum, содержащиеся в культуральном фильтрате, полученном путем выращивания гриба в течение 8 суток на жидкой картофельно-глюкозной среде (200 г картофеля и 20 г глюкозы) с добавлением тиамина и аспарагина, соответственно, 100 мг и 2 г, на 1 л среды).
Сущность способа оценки селекционных образцов озимой пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили, заключается в следующем. Проводят селективный отбор каллусов, выращенных на среде Мурасиге-Скуга в культуре зрелых зародышей, на фоне культурального фильтрата Fusarium oxysporum Schlecht.:Fr., при этом в качестве культурального фильтрата Fusarium oxysporum Schlecht.:Fr., используют 8-суточный культуральный фильтрат в концентрации 20%, содержащий 2 мл культурального фильтрата и 8 мл стерильной дистиллированной воды, в который помещают предварительно выращенные в культуре зрелых зародышей каллусы и выдерживают в течение 47-48 часов с темноте при температуре 26-27°С, затем образовавшуюся в результате диспергирования рыхлой каллусной ткани клеточную суспензию высевают на свежую питательную среду Мурасиге-Скуга, при этом частоту каллусообразования определяют на 30 сутки культивирования в темноте при температуре 26-27°С и 70%-ной влажности воздуха.
Краткое описание чертежей и иных материалов
На фиг. дан способ оценки селекционных образцов озимой пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили. Влияние различной концентрации 8-суточного культурального фильтрата Fusarium oxysporum на рост каллусной ткани озимой пшеницы, количество и размер (см) каллусов озимой пшеницы в зависимости от особенностей сортообразца, таблица.
Осуществление изобретения
Примеры конкретного выполнения способа оценки селекционных образцов озимой пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили.
Пример 1. В качестве источника получения каллуса используют экспланты тканей зрелых зародышей сортов озимой пшеницы Таня, Сила и сортообразцов 2/3-17, 12/42-17, №3 селекции Ставропольского ГАУ.
Для получения каллуса семена озимой пшеницы стерилизуют 70%-ным раствором этанола, затем 7%-ным - хлорамина, трижды промывают стерильной дистиллированной водой и замачивают в стерильной воде на 1 сутки. Затем в асептических условиях зародыши изолируют из набухших семян и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга (см. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, Т.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев. Москва: Агропромиздат, 1990. 383 с.) с добавлением мезоинозита - 100 мг/л, никотиновой кислоты и пиридоксина - 0,5 мг/л, тиамина - 0,1 мг/л, глицина - 2,0 мг/л, 2,4-Д и кинетина, соответственно - 2,0 и 0,5 мг/л, 3% сахарозы и 0,7% агар-агара при рН=5,8.
Культивирование проводят в кондиционированной комнате при температуре 26-27°С и относительной влажности воздуха 70% в темноте. Повторность для эксплантов всех сортообразцов - по 30 в варианте.
Для получения токсических метаболитов, применяемых в качестве селектирующего агента, используют мицелиальный изолят Fusarium oxysporum, полученный методом фрагментации корней и основания стеблей пораженных фузариозной корневой гнилью растений пшеницы (см. Кольнобрицкий Н.И., Бондарь В.П. Метод диагностики возбудителя офиоболезной корневой гнили озимой пшеницы и изучение штаммов патогена // Защита растений. К.: Ураджай, 1989. Вып. 36. С. 21-25.)
Гриб выращивают в течение 8 суток глубинно на жидкой картофельно-глюкозной среде из расчета на 1000 г готового раствора в следующем соотношении компонентов, г:
картофель - 200
глюкоза - 20
тиамин - 0,1
аспарагин - 2
вода - остальное,
приготовленной следующим образом: 200 граммов нарезанного картофеля, приготовленного из поверхностно обеззараженных, промытых и очищенных клубней, кипятят в 1 л воды на водяной бане в течение 1 часа. После фильтрования добавляют 20 г глюкозы и доводят объем до 1000 мл. Стерилизуют в течение 15 минут при 0,5 атм. В стерильную среду добавляют 0,1 г тиамина и 2 г аспарагина (см. Кирай З., Клемент З., Шоймоши Ф., Вереш Й. Методы фитопатологии. М.: Колос, 1974. 343 с.; Кольнобрицкий Н.И., Бондарь В.П. Метод диагностики возбудителя офиоболезной корневой гнили озимой пшеницы и изучение штаммов патогена // Защита растений. К.: Ураджай, 1989. Вып. 36. С. 21-25.)
Полученную культуру гриба Fusarium oxysporum фильтруют для отделения мицелия и получения культурального фильтрата, содержащего весь набор токсических веществ, участвующих в патогенезе.
Выращенные в культуре зрелых зародышей на питательной среде Мурасиге-Скуга каллусы озимой пшеницы различных сортов и сортообразцов (10 штук) помещают в пробирки со стерильной дистиллированной водой (10 мл), не содержащей культурный фильтрат возбудителя Fusarium oxysporum и, соответственно, его токсины, и выдерживают 47-48 часов с темноте при 26-27°С. Образовавшуюся в результате диспергирования рыхлой каллусной ткани клеточную суспензию высевают на свежую питательную среду Мурасиге-Скуга. Частоту каллусообразования определяют на 30 сутки культивирования (в темноте при 26-27°С и 70-ной влажности воздуха).
Повторность для всех сортов и сортообразцов - по 30 в варианте.
Результат:
В отсутствии селектирующего фактора каллусообразование у сортов и сортообразцов составило 63,3-96,7%, что свидетельствует о различном морфогенном потенциале сортообразцов в зависимости от генетических особенностей (см. фиг.).
Пример 2.
Проводят аналогично примера 1, но выращенные в культуре зрелых зародышей на питательной среде Мурасиге-Скуга каллусы озимой пшеницы различных сортов и сортообразцов (10 штук) помещают в пробирки, содержащие 10 мл 8-суточного культурального фильтрата в концентрации 10% (из расчета 1 мл культурального фильтрата и 9 мл стерильной дистиллированной воды), и выдерживают 48 часов с темноте при 26°С. Образовавшуюся в результате диспергирования рыхлой каллусной ткани клеточную суспензию высевают на свежую питательную среду Мурасиге-Скуга. Частоту каллусообразования определяют на 30 сутки культивирования (в темноте при 26°С и 70-ной влажности воздуха).
Повторность для всех сортов и сортообразцов - по 30 в варианте.
Результат:
В присутствии селектирующего фактора в виде 10%-ого 8-суточного культурального фильтрата отмечено значительное снижение (от 70 до 80%) морфогенного потенциала сортообразцов, что свидетельствует о летальном токсическом воздействии метаболитов возбудителя Fusarium oxysporum на неорганизованно растущие клетки озимой пшеницы в культуре каллусов независимо от генетических особенностей (см. фиг.).
Пример 3.
Проводят аналогично пример 1, но выращенные в культуре зрелых зародышей на питательной среде Мурасиге-Скуга каллусы озимой пшеницы изучаемых сортов и сортообразцов (10 штук) помещают в пробирки, содержащие 10 мл 8-суточного культурального фильтрата в концентрации 20% (из расчета 2 мл культурального фильтрата и 8 мл стерильной дистиллированной воды), и выдерживают 47-48 часов с темноте при 26-27°С.Образовавшуюся в результате диспергирования рыхлой каллусной ткани клеточную суспензию высевают на свежую питательную среду Мурасиге-Скуга. Частоту каллусообразования определяют на 30 сутки культивирования (в темноте при 26-27°С и 70%-ной влажности воздуха).
Повторность для всех сортов и сортообразцов - по 30 в варианте.
Результат:
В присутствии селектирующего фактора в виде 20%-ого 8-суточного культурального фильтрата отмечено снижение морфогенного потенциала сортообразцов на уровне ЛД50 (см. фиг.).
В качестве меры токсичности ЛД50 выбрана с тем расчетом, что именно при данной мере токсичности результаты могут значительно отличаться в связи с такими факторами, как генетические различия сортоообразцов.
Таким образом, установлено, что в жестких селективных условиях два из изучаемых сортоообразцов (2/3-17 и сорт Сила) проявили выносливость к метаболитам возбудителя болезни Fusarium oxysporum (частота каллусогенеза составила 50,0-53,3%) и могут быть использованы в дальнейшей селекционной работе на устойчивость к фузариозной корневой гнили озимой пшеницы.
Пример 4.
Проводят аналогично примера 1, но выращенные в культуре зрелых зародышей на питательной среде Мурасиге-Скуга каллусы озимой пшеницы различных сортов и сортообразцов (10 штук) помещают в пробирки, содержащие 10 мл 8-суточного культурального фильтрата в концентрации 30%о (из расчета 3 мл культурального фильтрата и 7 мл стерильной дистиллированной воды), и выдерживают 47-48 часов с темноте при 26-27°С.Образовавшуюся в результате диспергирования рыхлой каллусной ткани клеточную суспензию высевают на свежую питательную среду Мурасиге-Скуга. Частоту каллусообразования определяют на 30 сутки культивирования (в темноте при 26-27°С и 70%-ной влажности воздуха).
Повторность для всех сортов и сортообразцов - по 30 в варианте.
Результат:
В присутствии селектирующего фактора в виде 30%-ого 8-суточного культурального фильтрата отмечено значительное снижение (83,3-93,3%) морфогенного потенциала сортообразцов, что свидетельствует о летальном токсическом воздействии метаболитов возбудителя Fusarium oxysporum на неорганизованно растущие клетки озимой пшеницы в культуре каллусов не зависимо от генетических особенностей (см. фиг.).
Пример 5.
Проводят аналогично примера 1, но выращенные в культуре зрелых зародышей на питательной среде Мурасиге-Скуга каллусу озимой пшеницы различных сортов и сортообразцов (10 штук) помешают в пробирки, содержащие 10 мл 8-суточного культурального фильтрата в концентрации 50% (из расчета 5 мл культурального фильтрата и 5 мл стерильной дистиллированной воды), и выдерживают 47-48 часов с темноте при 26-27°С. Образовавшуюся в результате диспергирования рыхлой каллусной ткани клеточную суспензию высевают на свежую питательную среду Мурасиге-Скуга. Частоту каллусообразования определяют на 30 сутки культивирования (в темноте при 26-27°С и 70%-ной влажности воздуха).
Повторность для всех сортов и сортообразцов - по 30 в варианте.
Результат:
В присутствии селектирующего фактора в виде 50%-ого 8-суточного культурального фильтрата отмечено значительное снижение (от 70 до 86,6%) морфогенного потенциала сортообразцов, что свидетельствует о летальном токсическом воздействии метаболитов возбудителя Fusarium oxysporum на неорганизованно растущие клетки озимой пшеницы в культуре каллусов не зависимо от генетических особенностей (см. фиг.).
Таким образом, наиболее оптимальным является пример 3, так как в жестких селективных условиях два из изучаемых сортоообразцов (2/3-17 и сорт Сила) проявили выносливость к метаболитам возбудителя болезни Fusarium oxysporum (частота каллусогенеза составила 50,0-53,3%) и могут быть использованы в дальнейшей селекционной работе на устойчивость к фузариозной корневой гнили озимой пшеницы.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими техническими решениями имеет следующие преимущества:
сокращение трудоемкости и временных затрат;
высокая эффективность, выполнения способа оценки селекционных образцов озимой пшеницы;
увеличение выборки анализируемых сортообразцов в течение всего календарного года независимо от сроков вегетационного периода культуры;
а также тот факт, что отбор селекционных образцов озимой пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили на фоне культурального фильтрата возбудителя болезни осуществляют на клеточном, а не организменном уровне, что является более достоверным.
Литература:
1. Бенкен А.А., Хрустовская В.Н. Лабораторная оценка болезнеустойчивости растений и паразитических свойств возбудителей обыкновенной корневой гнили злаков // Труды ВНИИЗР. Л., 1977. Вып. 56. С. 9-13.
2. Гешеле Э.Э. Методическое руководство по фитопатологической оценке зерновых культур. Одесса, 1971. 180 с.
3. Кольнобрицкий Н.И., Бондарь В.П. Метод диагностики возбудителя офиоболезной корневой гнили озимой пшеницы и изучение штаммов патогена // Защита растений. К.: Ураджай, 1989. Вып. 36. С. 21-25.
4. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, Т.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев. Москва: Агропромиздат, 1990. 383 с.
5. Патент SU №1777726 «Способ определения устойчивости пшеницы к патогенам», МПК А01Н 1/04, A01G 7/00; опубл. 30.11.1992 г.
6. Патент RU №2625027 «Способ определения относительной устойчивости сортов мягкой яровой пшеницы к возбудителю обыкновенной корневой гнили злаков», МПК C12N 1/14, А01Н 5/12, опубл. 11.07.2017 г.
7. Рогинская В.А. Влияние условий культивирования на токсинообразование у возбудителя корневой гнили пшеницы гриба Helmintosporium sativum Pam, King et Bakke // Микробные ассоциации и их функционирование в почвах Западной Сибири. Новосибирск: Наука, 1979. С. 243-250.
Способ оценки селекционных образцов озимой пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили, включающий селективный отбор каллусов, выращенных на среде Мурасиге-Скуга в культуре зрелых зародышей, на фоне культурального фильтрата Fusarium oxysporum Schlecht.:Fr., отличающийся тем, что в качестве культурального фильтрата Fusarium oxysporum Schlecht.:Fr. используют 8-суточный культуральный фильтрат в концентрации 20%, содержащий 2 мл культурального фильтрата и 8 мл стерильной дистиллированной воды, в который помещают предварительно выращенные в культуре зрелых зародышей каллусы и выдерживают в течение 47-48 ч в темноте при температуре 26-27°C, затем образовавшуюся в результате диспергирования рыхлой каллусной ткани клеточную суспензию высевают на свежую питательную среду Мурасиге-Скуга, частоту каллусообразования определяют на 30 сутки культивирования в темноте при 26°C и 70%-ной влажности воздуха, а устойчивость к фузариозной корневой гнили озимой пшеницы в жестких селективных условиях определяют при частоте каллусообразования при 50,0-53,3%.
