Гуманизированные антитела к cd19 человека и способы их применения

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу, которое специфично связывается с CD19 человека, а также к фармацевтической композиции, его содержащей. Также раскрыто применение вышеуказанного антитела в изготовлении лекарственного средства для связывания CD19. Изобретение также относится к способу истощения популяции В-клеток, предусматривающему использование вышеуказанного антитела. Изобретение позволяет эффективно осуществлять лечение пациента, страдающего от заболевания, ассоциированного с патологическим увеличением числа В-клеток. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 8 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам против CD19 человека (антитело к CD19 человека), способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим данные антитела, и к их применениям.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

CD19 человека представляет собой 95 кДа трансмембранный белок (корецептор В-клеток), экспрессируемый исключительно на В-клетках и на фолликулярных дендритных клетках. CD19 находится в ассоциации с CD21 и CD81. CD19 и CD21 требуются для нормальной дифференциации В-клеток (Carter, R.H., et al., Immunol. Res. 26 (2002) 45-54). Антитела против CD19 использовали в нескольких клинических испытаниях (см., например, Hekman, A., et al., Cancer Immunol. Immunother. 32 (191) 364-372; Vlasfeld, L.T., et al., Cancer Immunol. Immunother. 40 (1995) 37-47; Conry, R.M., et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 18 (1995) 231-241; Manzke, O., et al., Int. J. Cancer 91 (2001) 516-522).

Антитела против CD19 упоминаются, например, в WO 2004/106381, WO 2005/012493, WO 2006/089133, WO 2007/002223, WO 2006/133450, WO 2006/121852, WO 2003/048209, US 7109304, US 2006/0233791, US 2006/0280738, US 2006/0263357, US 2006/0257398, EP 1648512, EP 1629012, US 2008/0138336, WO 2008/022152 и в Bruenke, J., et al., Br. J. Hematol. 130 (2005) 218-228; Vallera, D.A., et al., Cancer Biother. Radiopharm. 19 (2004) 11-23; Ghetie, M.A., et al., Blood 104 (2004) 178-183; Lang, P., et al., Blood 103 (2004) 3982-3985; Loeffler, A., et al., Blood 95 (2000) 2098-2103; Le Gall, F., et al., FEBS Lett. 453 (1999) 164-168; Li, Q., et al., Cancer Immunol. Immunother. 47 (1998) 121-130; Eberl, G., et al., Clin. Exp. Immunol. 114 (1998) 173-178; Pietersz, G.A., et al., Cancer Immunol. Immunother. 41 (1995) 53-60; Myers, D.E., et al., Leuk. Lymphoma. 18 (1995) 93-102; Bejcek, B.E., et al., Cancer Res. 55 (1995) 2346-2351; Hagen, I.A., et al, Blood 85 (1995) 3208-3212; Vlasfeld, L.T., et al., Cancer Immunol. Immunother. 40 (1995) 37-47; Rhodes, E.G. et al., Bone Marrow Transplant. 10 (1992) 485-489; Zola, H., et al., Immunol. Cell Biol. 69 (1991) 411-422; Watanabe, M., et al., Cancer Res. 50 (1990) 3245-3248; Uckun, F.M., et al., Blood 71 (1988) 13-29; Pezzutto, A., et al.; J Immunol. 138 (1987) 2793-2799. Моноклональное антитело SJ25-C1 имеется в продаже (продукт № 4737, Sigma-Aldrich Co. США, SEQ ID NO: 21-24). Антитела с повышенной аффинностью к FcγRIIIA упоминаются в WO 2008/022152.

Антитело против CD19 может иметь ингибирующие или стимулирующие эффекты на активацию В-клеток. Связывание антител к CD19 с митогенстимулированными В-клетками ингибирует последующее увеличение Са²⁺ и происходящую в результате этого активацию и пролиферацию данных клеток, и пролиферация и дифференциация В-клеток может либо ингибироваться, либо усиливаться антителом к CD19, в зависимости от использованного митогенного стимула и степени поперечного связывания данным антителом.

В WO 2004/106381 описываются фармацевтические композиции, содержащие биспецифичные конструкции антитела к CD3, к CD19 для лечения расстройств, связанных с В-клетками. Антитела к CD19 описываются в WO 2005/012493. В WO 2006/089133 описываются антитела к CD19 и их применения в онкологии. Антитела к CD19 и их применения описываются в WO 2007/002223. B WO 2006/133450 описывается терапия антителом к CD19 для трансплантации.

В WO 2011/147834 описываются антитела против CD19 и их применения.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе предложены антитела против CD19 (человека), которые являются полезными в качестве терапевтического агента для лечения аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, волчанки, псориаза или заболевания кости, или для лечения опухолей.

Данное изобретение отчасти основано на открытии того, что для удаления многочисленных горячих точек дезамидирования в гуманизированном антителе к CD19 человека достаточной является одна мутация.

Антитела, описанные в данном документе, имеют свойства, приносящие пользу пациенту, страдающему от заболевания, ассоциированного с патологическим увеличением числа В-клеток.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело, которое специфично связывается с CD19 человека, где данное антитело содержит

(а) HVR-H1 (гипервариабельная область 1 тяжелой цепи), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03,

(б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11,

(в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05,

(г) HVR-L1 (гипервариабельная область 1 легкой цепи), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 или 28,

(д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и

(е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08.

В одном воплощении данное антитело представляет собой моноклональное антитело.

В одном воплощении антитело представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

В одном воплощении антитело представляет собой фрагмент антитела, который специфично связывается с CD19 человека.

В одном воплощении антитело содержит:

(а) последовательность VH (вариабельный домен тяжелой цепи), имеющую по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 09, и последовательность VL (вариабельный домен легкой цепи), имеющую по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 19, или

(б) последовательность VH, имеющую по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 09, и последовательность VL, имеющую по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 27, или

(в) последовательность VH и последовательность VL, такую же, как в (а) или (б).

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифичное антитело, которое специфично связывается с CD19 человека и вторым отличным антигеном.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является фармацевтический препарат, содержащий антитело, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело, как описано в данном документе, для лечения злокачественных заболеваний В-клеток. В одном воплощении злокачественное заболевание В-клеток выбрано из группы, состоящей из CLL (хронический лимфоцитарный лейкоз), NHL (неходжкинская лимфома) и DLBCL (диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома).

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело, как описано в данном документе, для применения в качестве лекарственного средства.

В одном воплощении данное лекарственное средство предназначено для лечения В-клеточного рака, воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, волчанки, псориаза или заболевания кости. В одном воплощении данное лекарственное средство предназначено для истощения популяции В-клеток.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело, как описано в данном документе, для применения в лечении В-клеточного рака, воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, волчанки, псориаза или заболевания кости.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является антитело, как описано в данном документе, для применения в истощении популяции В-клеток.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является применение антитела, как описано в данном документе, в изготовлении лекарственного средства. В одном воплощении данное лекарственное средство предназначено для лечения В-клеточного рака, воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, волчанки, псориаза или заболевания кости. В одном воплощении данное лекарственное средство предназначено для истощения популяции В-клеток.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является способ лечения индивида, имеющего В-клеточный рак, включающий введение данному индивиду эффективного количества антитела, как описано в данном документе.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является способ истощения популяции В-клеток у индивида, включающий введение данному индивиду эффективного количества антитела, как описано в данном документе.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является способ изготовления лекарственного средства для лечения заболевания, включающего антитело, как описано в данном документе. В одном воплощении данное заболевание представляет собой В-клеточный рак, воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание, ревматоидный артрит, волчанку, псориаз или заболевание кости.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, как описано в данном документе.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту, как описано в данном документе.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является способ продуцирования антитела, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, таким образом, что продуцируется антитело, выделение антитела из клетки или среды культивирования и очистку антитела.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является иммуноконъюгат, содержащий антитело, как описано в данном документе, и цитотоксический агент.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин «акцепторная человеческая каркасная область» для целей данного документа представляет собой каркасную область, содержащую аминокислотную последовательность каркасной области вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасной области вариабельного домена тяжелой цепи (VН), происходящую из каркасной области человеческого иммуноглобулина или человеческой консенсусной каркасной области, как определено ниже. Акцепторная человеческая каркасная область, «происходящая из» каркасной области человеческого иммуноглобулина или человеческой консенсусной каркасной области, может содержать такую же аминокислотную последовательность, как и они, или она может содержать изменения аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях число изменений аминокислот составляет 10 или меньше, 9 или меньше, 8 или меньше, 7 или меньше, 6 или меньше, 5 или меньше, 4 или меньше, 3 или меньше, или 2 или меньше. В некоторых воплощениях акцепторная человеческая каркасная область VL является идентичной по последовательности последовательности каркасной области VL человеческого иммуноглобулина или последовательности человеческой консенсусной каркасной области VL.

Термин «аффинность» относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером связывания (например, антигеном). Если не указано иное, термин «аффинность связывания» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к собственной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы Х в отношении ее партнера Y обычно может быть представлена константой диссоциации (k_d). Аффинность может быть измерена обычными способами, известными в данной области, включающими способы, описанные в данном документе.

Термин антитело «с созревшей аффинностью» относится к антителу с одним или более чем одним изменением в одной или более чем одной гипервариабельной области (HVR) по сравнению с родительским антителом, которое не обладает такими изменениями, причем такие изменения приводят к улучшению аффинности антитела в отношении антигена.

Термины «антитело к CD19 человека» и «антитело, которое специфично связывается с CD19 человека» относятся к антителу, которое способно связываться с CD19 человека с достаточной аффинностью таким образом, что данное антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического агента в нацеливании на CD19 человека. В одном воплощении степень связывания антитела к CD19 человека с неродственным белком, не являющимся CD19 белком, составляет меньше, чем примерно 10% связывания данного антитела с CD19 человека при измерении поверхностным плазмонным резонансом. В некоторых воплощениях антитело, которое специфично связывается с CD19 человека имеет константу диссоциации (KD) 10^-8 M или меньше.

Термин «антитело» используется в данном документе в самом широком смысле и охватывает разные структуры антител, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, но не ограничиваясь ими, при условии, что они демонстрируют желательную активность связывания антигена.

Термин «антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC)» относится к функции, опосредованной связыванием с рецептором Fc, и относится к лизису клеток-мишеней антителом, как описано в данном документе, в присутствии эффекторных клеток. В одном воплощении ADCC измеряется посредством обработки препарата эритроидных клеток, экспрессирующих CD19 (например, клеток K562, экспрессирующих рекомбинантный CD19 человека), антителом, как описано в данном документе, в присутствии эффекторных клеток, таких как свежевыделенные РВМС (одноядерные клетки периферической крови) или очищенные эффекторные клетки из лейкоцитарных пленок, подобные моноцитам или NK клеткам (натуральный киллер). Клетки-мишени метятся ⁵¹Cr и затем инкубируются с антителом. Меченые клетки инкубируются с эффекторными клетками, и супернатант анализируется на высвобожденный ⁵¹Cr. Контроли включают инкубирование эндотелиальных клеток-мишеней с эффекторными клетками, но без антитела. Способность антитела индуцировать исходные стадии, опосредованные ADCC, исследуется посредством измерения их связывания с клетками, экспрессирующими рецепторы Fcγ, такими как клетки, рекомбинантно экспрессирующие FcγRI и/или FcγRIIA, или NK клетки (экспрессирующие в основном FcγRIIIA). В одном предпочтительном воплощении измеряется связывание с FcγR на NK клетках.

Термин «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител (например, scFv) и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.

Термин «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из конкретного источника или вида, тогда как остальная тяжелая и/или легкая цепь происходит из другого источника или вида.

«Класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, которым обладает его тяжелая цепь. Существуют пять главных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и несколько из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ соответственно.

Термин «цитотоксический агент» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает клеточную функцию и/или вызывает гибель или разрушение клетки. Цитотоксические агенты включают радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты, ингибирующие рост; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты; и разные противоопухолевые или противораковые агенты, раскрытые ниже, но не ограничиваются ими.

Термин «комплементзависимая цитотоксичность (CDC)» относится к лизису клеток, индуцированному антителом, как описано в данном документе, в присутствии комплемента. В одном воплощении CDC измеряется посредством обработки человеческих эндотелиальных клеток, экспрессирующих CD19, антителом, как описано в данном документе, в присутствии комплемента. В одном воплощении данные клетки метятся кальцеином. CDC обнаруживается, если антитело индуцирует лизис 20% или более клеток-мишеней в концентрации 30 мкг/мл. Связывание с фактором C1q комплемента может быть измерено в ELISA (твердофазный иммуноферментый анализ). В таком анализе, в общем, планшет ELISA покрывают концентрационными интервалами антитела, к которому добавляют очищенный C1q человека или человеческую сыворотку. Связывание C1q выявляется антителом, направленным против C1q, с последующим выявлением конъюгатом, меченным пероксидазой. Выявление связывания (максимальное связывание B_max) измеряется как оптическая плотность при 405 нм (ОП405) для пероксидазного субстрата ABTS® (2,2'-азино-ди-[3-этилбензтиазолин-6-сульфонат (6)]).

Термин «эффекторные функции» относится к тем биологическим активностям, приписываемым области Fc антитела, которые варьируют в зависмости от класса антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание с C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов поверхности клетки (например, рецептора В-клеток) и активацию В-клеток.

Эффекторные функции, зависимые от связывания с рецептором Fc, могут быть опосредованы взаимодействием области Fc антитела с рецепторами Fc (FcR), которые представляют собой специализированные рецепторы поверхности клетки на гематопоэтических клетках. Рецепторы Fc принадлежат к надсемейству иммуноглобулинов, и было показано то, что они опосредуют и удаление покрытых антителами патогенов фагоцитозом иммунных комплексов, и лизис эритроцитов и разных других клеточных мишеней (например, опухолевых клеток), покрытых соответствующим антителом, посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (см., например, Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). FcR определяются по их специфичности в отношении изотипов иммуноглобулинов: рецепторы Fc в отношении антител IgG называются FcγR. Связывание с рецептором Fc описывается, например, в Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341 и Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248.

Поперечное связывание рецепторов в отношении области Fc антител IgG (FcγR) запускает широкий спектр эффекторных функций, включающих фагоцитоз, антителозависимую клеточную цитотоксичность и высвобождение воспалительных медиаторов, а также клиренс иммунных комплексов и реуляцию продукции антител. У человека было охарактеризовано три класса FcγR, которыми являются следующие:

- FcγRI (CD64) связывается с мономерным IgG с высокой аффинностью и экспрессируется на макрофагах, моноцитах, нейтрофилах и эозинофилах. Модификация в области Fc IgG по меньшей мере одного аминокислотного остатка E233-G236, P238, D265, N297, A327 и P329 (нумерация согласно индексу EU (Европейский Союз) по Kabat) уменьшает связывание с FcγRI. Замена в IgG1 и IgG4 на остатки IgG2 в положениях 233-236 уменьшала связывание с FcγRI в 10³ раза и устраняла ответ человеческих моноцитов на сенсибилизированные антителами эритроциты (Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).

- FcγRII (CD32) связывается с комплексированным IgG с аффинностью от средней до низкой и экспрессируется в широком спектре клеток. Данный рецептор может быть разделен на два подтипа: FcγRIIА и FcγRIIВ. FcγRIIА находится на многих клетках, участвующих в умерщвлении (например, макрофаги, моноциты, нейтрофилы), и, по-видимому, способен активировать процесс умерщвления. FcγRIIВ, по-видимому, играет роль в ингибирующих процессах и находится на В-клетках, макрофагах и на тучных клетках и эозинофилах. На В-клетках он, по-видимому, функционирует, подавляя дальнейшую продукцию иммуноглобулина и переключение изотипа, например, до класса IgE. На макрофагах FcγRIIВ действует, ингибируя фагоцитоз, опосредованный FcγRIIА. На эозинофилах и тучных клетках В-форма может помогать подавлять активацию данных клеток через связывание IgE с его отдельным рецептором. Пониженное связывание с FcγRIIА обнаруживается, например, для антител, содержащих область Fc IgG с мутациями по меньшей мере одного из аминокислотных остатков E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 и K414 (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

- FcγRIII (CD16) связывается с IgG с аффинностью от средней до низкой и существует в виде двух типов. FcγRIIIА находится на NK клетках, макрофагах, эозинофилах и некоторых моноцитах, и Т-клетках и опосредует ADCC. FcγRIIIВ сильно экспрессируется на нейтрофилах. Пониженное связывание с FcγRIIIА обнаруживается, например, для антител, содержащих область Fc IgG с мутацией по меньшей мере одного аминокислотного остатка E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 и D376 (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

Картирование сайтов связывания на человеческом IgG1 в отношении рецепторов Fc, вышеупомянутые сайты мутаций и способы измерения связывания с FcγRI и FcγRIIА описываются в Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604.

«Эффективное количество» агента, например, фармацевтического препарата, относится к эффективному количеству в необходимых дозировках и в течение необходимых периодов времени для достижения желательного терапевтического или профилактического результата.

Термин «рецептор Fc» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к активирующим рецепторам, характеризуемым присутствием цитоплазматической последовательности ITAM, ассоциированной с данным рецептором (см., например, Ravetch, J.V. and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290). Такими рецепторами являются FcγRI, FcγRIIA и FcγRIIIA. Термин «отсутствие связывания с FcγR» обозначает то, что при концентрации антитела 10 мкг/мл связывание антитела, как описано в данном документе, с клетками NK составляет 10% или меньше относительно связывания, обнаруженного для антитела LC.001 против OX40L, как описано в WO 2006/029879.

В то время как IgG4 демонстрирует пониженное связывание с FcR, антитела других подклассов IgG демонстрируют сильное связывание. Однако Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (потеря углевода Fc), Pro329 и 234, 235, 236 и 237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435 являются остатками, которые, при изменении, также уменьшают связывание с FcR (Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324 и EP 0 307 434). В одном воплощении антитело, как описано в данном документе, принадлежит к подклассу IgG1 или IgG2 и содержит мутацию PVA236, GLPSS331 и/или L234A/L235A. В одном воплощении антитело, как описано в данном документе, принадлежит к подклассу IgG4 и содержит мутацию L235E. В одном воплощении антитело дополнительно содержит мутацию S228P.

Термин «область Fc» используется в данном документе для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Данный термин включает области Fc с природной последовательностью и варианты области Fc. В одном воплощении область Fc тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) области Fc может присутствовать или может отсутствовать. Если в данном документе не определено иначе, нумерация аминокислотных остатков в области Fc или в константной области осуществляется согласно системе нумерации EU, также именуемой индекс EU, как описано в Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

Антитела, как описано в данном документе, в одном воплощении содержат в качестве области Fc область Fc человеческого происхождения. В одном воплощении область Fc содержит все части человеческой константной области. Область Fc антитела непосредственно участвует в активации комплемента, в связывании C1q, активации С3 и в связывании с рецептором Fc. В то время как влияние антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с C1q вызвано определенными сайтами связывания в области Fc. Такие сайты связывания известны в современном уровне техники и описываются, например, Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J. J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324 и EP 0 307 434. Такими сайтами связывания являются, например, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 и P329 (нумерация согласно индексу EU по Kabat; если в данном документе не определено иначе, нумерация аминокислотных остатков в области Fc или в константной области осуществляется согласно системе нумерации EU, также именуемой индекс EU, как описано в Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). Антитела подкласса IgG1, IgG2 и IgG3 обычно демонстрируют активацию комплемента, связывание с C1q и активацию С3, тогда как IgG4 не активируют систему комплемента, не связываются с C1q и не активируют С3. «Область Fc антитела» представляет собой термин, хорошо известный квалифицированному специалисту, и она определяется на основе расщепления антител папаином. В одном воплощении область Fc представляет собой человеческую область Fc. В одном воплощении область Fc принадлежит к человеческому подклассу IgG4 и содержит мутации S228P и/или L235E (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном воплощении область Fc принадлежит к человеческому подклассу IgG1 и содержит мутации L234A и L235A (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

«Каркасная область» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех FR доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно появляются в VH (или VL) в следующей последовательности: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «полное антитело» используются в данном документе взаимозаменяемо для названия антитела, имеющего по существу аналогичную структуру структуре природного антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат область Fc, как определено в данном документе.

Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформантов» и «трансформированные клетки», которые включают первичные трансформированные клетки и потомство, полученное от них, независимо от числа пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновых кислот, но может содержать мутации. Сюда включено мутантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, на которую осуществляется скрининг или отбор у исходно трансформированной клетки.

«Человеческая консенсусная каркасная область» представляет собой каркасную область, которая представляет собой чаще всего встречающиеся аминокислотные остатки в наборе последовательностей каркасных областей VL или VH человеческого иммуноглобулина. В общем, набор последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина происходит из подгруппы последовательностей вариабельного домена. Обычно данная подгруппа последовательностей представляет собой такую же подгруппу, что и в Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. В одном воплощении для VL данной подгруппой является подгруппа каппа I, такая же, как и в Kabat et al., выше. В одном воплощении для VН данной подгруппой является подгруппа III, такая же, как и в Kabat et al., выше.

Термин «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из HVR, не являющихся человеческими, и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из HVR (например, CDR (область, определяющая комплементарность)) соответствуют HVR антитела, не являющегося человеческим, и все или по существу все FR соответствуют FR человеческого антитела. Гуманизированное антитело возможно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из человеческого антитела. Термин «гуманизированная форма» антитела, например, антитела, не являющегося человеческим, относится к антителу, которое подверглось гуманизации.

Термин «гипервариабельная область» или «HVR» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, содержащей отрезки аминокислотных остатков, которые являются гипервариабельными по последовательности («области, определяющие комплементарность» или «CDR») и/или образуют структурно определенные петли («гипервариабельные петли»), и/или содержат остатки, контактирующие с антигеном («контакты с антигеном»). В общем, антитела содержат шесть HVR: три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3).

HVR включают:

(а) гипервариабельные петли, находящиеся в аминокислотных остатках 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);

(б) CDR, находящиеся в аминокислотных остатках 24-34 ( L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);

(в) контакты с антигеном, находящиеся в аминокислотных остатках 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) и 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));

(г) комбинации (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) и 94-102 (H3).

Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) нумеруются в данном документе согласно Kabat et al., выше.

«Иммуноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более чем одной гетерологичной молекулой, включающей цитотоксический агент, но не ограничивающейся им.

«Индивид» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают домашних животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, человека и приматов, не являющихся человеком, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс), но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях индивид или субъект представляет собой человека.

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было отделено от компонента его природного окружения. В некоторых воплощениях антитело очищают до чистоты, большей, чем 95% или 99% при определении, например, электрофоретическими (например, SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), изоэлектрофокусировка (IEF), капиллярный электрофорез) или хроматографическими (например, ионообменная ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) или ВЭЖХ с обращенной фазой) способами. Относительно обзора способов оценки чистоты антител, см., например, Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87.

Термин «выделенная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонента ее природного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат данную молекулу нуклеиновой кислоты, но данная молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или в участке хромосомы, который отличается от ее природного хромосомного участка.

Фраза «выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к CD19 человека» относится к одной или более чем одной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую и легкую цепи антитела (или их фрагменты), включая такую(кие) молекулу(лы) нуклеиновой кислоты в одном векторе или в отдельных векторах, и такую(кие) молекулу(лы) нуклеиновой кислоты, присутствующую(щие) в одном или более чем одном участке в клетке-хозяине.

Термин «моноклональное антитело» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связываются с тем же самым эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих встречающиеся в природе мутации или возникающих во время получения препарата моноклонального антитела, причем такие варианты обычно присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые типично включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, модификатор «моноклональный» указывает на характер антитела как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующий продукции антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, подлежащие применению согласно настоящему изобретению, можно получать целым рядом методик, включающих способ гибридомы, способы генной инженерии, способы фагового дисплея и способы с использованием трансгенных животных, содержащих все локусы человеческого иммуноглобулина или их часть, но не ограничивающихся ими, причем такие способы и другие типичные способы для получения моноклональных антител описываются в данном документе.

Термин «голое антитело» относится к антителу, которое не конъюгировано с гетерологичной группировкой (например, с цитотоксической группировкой) или с радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтическом препарате.

Термин «природные антитела» относится к встречающимся в природе молекулам иммуноглобулинов с варьирующими структурами. Например, природные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые связаны дисульфидными связями. От N- до С-конца каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также именуемую вариабельный тяжелый домен или вариабельный домен тяжелой цепи, с последующими тремя константными доменами (СН1, СН2 и СН3), при этом между первым и вторым константным доменом располагается шарнирная область. Аналогичным образом, от N- до С-конца каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также именуемую вариабельный легкий домен или вариабельный домен легкой цепи, с последующим константным легким доменом (CL). Легкая цепь антитела может быть приписана к одному из двух типов, именуемых каппа (κ) и лямбда (λ), но основе аминокислотной последовательности ее константного домена.

Термин «листок-вкладыш в упаковке» используется для названия инструкций, традиционно включаемых в имеющиеся в продаже упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» по отношению к контрольной последовательности полипептида определяется как процентная доля аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными аминокислотным остаткам в контрольной последовательности полипептида, после выравнивания данных последовательностей и, если необходимо, введения пробелов для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не рассматривая любые консервативные замены как часть идентичности последовательности. Выравнивание для целей определения процента идентичности аминокислотной последовательности может достигаться разными способами, которые находятся в пределах квалификации в данной области, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Для целей данного документа, однако, значения % идентичности аминокислотной последовательности получаются с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Авторство компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2 принадлежит Genentech, Inc., и исходный код с пользовательской документацией был подан в Бюро регистрации авторских прав США, Washington D.C., 20559, где он зарегестрирован под регистрационным № авторского права США TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной от Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, или может быть составлена из исходного кода. Программу ALIGN-2 следует составлять для применения в операционной системе UNIX, включая цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательности излагаются программой ALIGN-2 и не варьируют.

В ситуациях, когда ALIGN-2 применяется для сравнений аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности А с или относительно данной аминокислотной последовательности Б (что может быть альтернативно сформулировано как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности с или относительно данной аминокислотной последовательности Б) рассчитывается следующим образом:

100 умножить на долю X/Y

где Х представляет собой число аминокислотных остатков, подсчитанных как идентичные совпадения, посредством программы выравнивания последовательностей ALIGN-2 в выравнивании А и Б данной программой, и где Y представляет собой общее число аминокислотных остатков в Б. Будет понятно то, что когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности Б, % идентичности аминокислотной последовательности А с Б не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности Б с А. Если конкретно не утверждается иное, все значения % идентичности аминокислотной последовательности, используемые в данном документе, как описано в непосредственно предшествующем абзаце, получены с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

Термин «фармацевтический препарат» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечивать эффективную биологическую активность содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому вводился бы препарат.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтическом препарате, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.

Термин «CD19» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антигену CD19 человеческих В-лимфоцитов (альтернативным(ными) названием(ями) являются: антиген дифференциации CD19, антиген поверхности В-лимфоцитов В4, антиген поверхности Т-клеток Leu-12; UniProtKB P15391-1 (изоформа 1; SEQ ID NO: 33) и P15391-2 (изоформа 2; SEQ ID NO: 34)). Данный термин охватывает «полноразмерный», не подвергавшийся процессингу человеческий CD19, а также любую форму человеческого CD19, которая возникает в результате процессинга в клетке, при условии, что антитело, как описано в данном документе, связывается с ней.

Термин «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «осуществление лечения») в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к клиническому вмешательству в попытке изменить природный ход заболевания индивида, которого лечат, и оно может осуществляться либо для профилактики, либо по ходу клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают предупреждение появления или рецидива заболевания, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или опосредованных патологических последствий заболевания, предупреждение метастазов, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или улучшенный прогноз, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях антитела, как описано в данном документе, используются для задержки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) природного антитела обычно имеют аналогичные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR). (См., например, Kindt, T.J., et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), страница 91). Один домен VH или VL может быть достаточным для придания специфичности связывания с антигеном. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, могут быть выделены с использованием домена VH или VL из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH соответственно. См., например, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

Термин «вектор» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной размножать другую нуклеиновую кислоту, с которой он связан. Данный термин включает вектор в качестве структуры самореплицирующейся нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Определенные векторы способны уравлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми они связаны функциональным образом. Такие векторы называются в данном документе «экспрессионными векторами».

II. КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ

В одном аспекте данное изобретение отчасти основывается на данных о том, что для удаления многочисленных горячих точек дезамидирования в гуманизированном антителе к CD19 человека достаточно одной мутации. В некоторых воплощениях предложены антитела, которые связываются с CD19 человека. Антитела, как описано в данном документе, являются полезными, например, для диагностики или лечения.

А. Типичные антитела к CD19 человека

Обнаружили то, что гуманизированное антитело дикого типа к CD19 человека имеет три горячие точки дезамидирования в HVR-L1: NSNGNT (SEQ ID NO: 36). Дополнительно обнаружили то, что в HVR-H2 присутствует дополнительная горячая точка дезамидирования: KFNG (SEQ ID NO: 37).

В одном аспекте в данном документе предложено выделенное гуманизированное антитело, которое специфично связывается с CD19 человека и имеет улучшенную стабильность, особенно стабильность в отношении дезамидирования в HVR тяжелой и легкой цепи: HVR-H2 и HVR-L1 по сравнению с другими гуманизированными вариантами. В данном улучшенном гуманизированном антителе к CD19 человека сохраняется перекрестная реактивность родительского мышиного антитела в отношении антигенов человека/яванского макака.

Для направления на горячую точку дезамидирования в HVR-H2 была введена точечная мутация от N (Asn) до Q (Gln) в положении 64 (нумерация согласно Kabat). Таким образом, антитело, как описано в данном документе, имеет HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность TEKFQG (SEQ ID NO: 38). В одном предпочтительном воплощении гуманизированное антитело к CD19 человека содержит HVR-H2, которая имеет аминокислотную последовательность YINPYNDGSK YTEKFQG (SEQ ID NO: 11).

Для направления на горячие точки дезамидирования в легкой цепи и для получения гуманизированного антитела к CD19 человека с улучшенной стабильностью в отношении дезамидирования были введены индивидуальные мутации в положения 27d, 27e, 28 и 29 по Kabat и двойная мутация в положения 27е и 28 (нумерация согласно Kabat). Всего генерировали 9 вариантов (вар. 1-вар. 9; SEQ ID NO: 60-68 и 70) гуманизированного антитела дикого типа (вар. 0; SEQ ID NO: 59 и 69).

вариант → ↓параметр	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9
KD (BIAcore) [нM]	5	250	136	2	1	6	54	4	16	45
t1/2 [мин]	-	0,1	1,1	105,2	191,5	43,6	4,4	51,5	17,6	4
связывание с CD19 человека после инкубации при pH 7,4 [%]	46	0	75	84	85	95	91	72	83	83
связывание с CD19 человека после инкубации при pH 6,0 [%]	90	0	95	95	97	99	97	86	91	87
главный пик гель-фильтрации после инкубации [%]	> 95	> 95	> 95	> 95	> 95	> 95	> 95	> 95	> 95	-

Обнаружили то, что при одной мутации в положении 27е согласно Kabat - от S (серин) до Р (пролин) - могут быть затронуты все горячие точки дезамидироания в HVR-L1. Это не мутация склонного к дезамидированию остатка N (аспарагина), а соседнего остатка.

Таким образом, антитело, как описано в данном документе, имеет HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность LENPNGNT (SEQ ID NO: 39). В одном воплощении гуманизированное антитело к CD19 человека содержит HVR-L1, которая имеет аминокислотную последовательность LENPSGNT (SEQ ID NO: 40). В одном предпочтительном воплощении гуманизированное антитело к CD19 человека содержит HVR-L1, которая имеет аминокислотную последовательность RSSQSLENPN GNTYLN (SEQ ID NO: 20). В одном предпочтительном воплощении гуманизированное антитело к CD19 человека содержит HVR-L1, которая имеет аминокислотную последовательность RSSQSLENPS GNTYLN (SEQ ID NO: 28).

Дополнительно у данных антител поддерживается перекрестная реактивность с CD19 яванского макака, как показано в следующей Таблице.

EC50 [мкг/мл]	вар. 0	вар. 5	вар. 9
ECD (внеклеточный домен) huCD19	0,087	0,084	0,089
ECD cyCD19	0,313	0,255	0,435

Таким образом, в одном воплощении антитело к CD19 человека специфично связывается с CD19 человека и CD19 яванского макака.

Гуманизированное антитело дикого типа к CD19 человека (вар. 0) демонстрирует после очистки приблизительно 7,5%-ное дезамидирование. После хранения в течение двух недель при рН 7,4 количество дезамидированного антитела увеличивается до приблизительно 18,5%. Вариант антитела с мутацией S27eP (вар. 5) демонстрирует приблизительно 2%-ное дезамидирование и 2%-ное образование сукцинимида после очистки. На протяжении хранения при рН 7,4 в течение двух недель присутствует только приблизительно 7,5% дезамидированного антитела.

В одном аспекте в данном документе предложено выделенное гуманизированное антитело, которое специфично связывается с CD19 человека и CD19 яванского макака, содержащее HVR-H2 SEQ ID NO: 11 и HVR-L1 SEQ ID NO: 20 или 28.

В одном аспекте в данном документе предложено антитело к CD19 человека, содержащее по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (а) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05, (г) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, (д) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и (е) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08.

В одном аспекте в данном документе предложено антитело к CD19 человека, содержащее по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (а) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05, (г) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, (д) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и (е) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08.

В одном аспекте в данном документе предложено антитело к CD19 человека, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (а) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05. В одном воплощении данное антитело содержит HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05. В другом воплощении данное антитело содержит HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05, и HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08. В другом воплощении данное антитело содержит HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05, HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08, и HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В другом воплощении данное антитело содержит (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05.

В другом аспекте в данном документе предложено антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (а) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, (б) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и (в) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08. В одном воплощении данное антитело содержит (а) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, (б) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и (в) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08.

В другом аспекте в данном документе предложено антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (а) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, (б) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и (в) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08. В одном воплощении данное антитело содержит (а) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, (б) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и (в) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08.

В другом аспекте антитело, как описано в данном документе, содержит (а) домен VH, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, (ii) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (iii) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 05, и (б) домен VL, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (i) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и (iii) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08.

В другом аспекте антитело, как описано в данном документе, содержит (а) домен VH, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, (ii) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (iii) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 05, и (б) домен VL, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (i) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и (в) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08.

В другом аспекте в данном документе предложено антитело, содержащее (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 08.

В другом аспекте в данном документе предложено антитело, содержащее (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 08.

Антитело к CD19 человека, как описано в данном документе, представляет собой гуманизированное антитело. В одном воплощении гуманизированное антитело к CD19 человека содержит такие же HVR, как и в любом из приведенных выше воплощений, и дополнительно содержит акцепторную человеческую каркасную область, например, каркасную область человеческого иммуноглобулина (зародышевой линии) или человеческую консенсусную каркасную область.

В другом аспекте антитело к CD19 человека содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 09. В некоторых воплощениях последовательность VH, имеющая по меньшей мере 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к CD19 человека, содержащее данную последовательность, сохраняет способность к связыванию с CD19 человека. В некоторых воплощениях в SEQ ID NO: 09 всего от 1 до 10 аминокислот было заменено, вставлено и/или подвергнуто делеции. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции происходят в областях вне HVR (т.е. в FR). Возможно антитело к CD19 человека содержит последовательность VH SEQ ID NO: 09, включающую посттрансляционные модификации данной последовательности. В конкретном воплощении VH содержит одну, две или три HVR, выбранные из: (а) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05.

В другом аспекте предложено антитело к CD19 человека, где данное антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий по меньшей мере 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 27 (SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 27 отличаются в одном положении аминокислоты). В некоторых воплощениях последовательность VL, имеющая по меньшей мере 90%-ную, 91%-ную, 92%-ную, 93%-ную, 94%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к CD19 человека, содержащее данную последовательность, сохраняет способность к связыванию с CD19 человека. В некоторых воплощениях в SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 27 всего от 1 до 10 аминокислот было заменено, вставлено и/или подвергнуто делеции. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции происходят в областях вне HVR (т.е. в FR). Возможно антитело к CD19 человека содержит последовательность VL в SEQ ID NO: 19, включающую посттрансляционные модификации данной последовательности. Возможно антитело к CD19 человека содержит последовательность VL в SEQ ID NO: 27, включающую посттрансляционные модификации данной последовательности. В конкретном воплощении VL содержит одну, две или три HVR, выбранные из: (а) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, (б) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и (в) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08. В конкретном воплощении VL содержит одну, две или три HVR, выбранные из: (а) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, (б) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, и (в) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08.

В другом аспекте предложено антитело к CD19 человека, где данное антитело содержит такую же VH, как и в любом из воплощений, приведенных выше, и такую же VL, как и в любом из воплощений, приведенных выше. В одном воплощении антитело содержит последовательности VH и VL в SEQ ID NO: 09 и SEQ ID NO: 19 или 27 соответственно, включая посттрансляционные модификации данных последовательностей.

В другом аспекте в данном документе предложено антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело к CD19 человека, как описано в данном документе. Например, в некоторых воплощениях предложено антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело к CD19 человека, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 09 и последовательность VL SEQ ID NO: 19.

В одном воплощении антитело к CD19 человека по любому из приведенных выше воплощений представляет собой моноклональное антитело. В одном воплощении антитело к CD19 человека представляет собой фрагмент антитела, например, Fv, Fab, Fab', scFv, диатело или фрагмент F(ab')₂. В другом воплощении антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное антитело IgG1 или IgG4, или антитело другого класса или изотипа, как определено в данном документе.

В одном воплощении всех аспектов антитело содержит (все положения согласно индексу EU по Kabat):

i) гомодимерную область Fc человеческого подкласса IgG1, возможно с мутациями P329G, L234A и L235A, или

ii) гомодимерную область Fc человеческого подкласса IgG4, возможно с мутациями P329G, S228P и L235E, или

iii) гомодимерную область Fc человеческого подкласса IgG1 с мутациями (P329G, L234A и L235A) I253A, H310A и H435A или с мутациями (P329G, L234A, L235A) H310A, H433A и Y436A, или

iv) гетеродимерную область Fc, в которой

а) один полипептид области Fc содержит мутацию T366W, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A и Y407V, или

б) один полипептид области Fc содержит мутации T366W и Y349C, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A, Y407V и S354C, или

в) один полипептид области Fc содержит мутации T366W и S354C, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A, Y407V и Y349C,

или

v) гетеродимерную область Fc человеческого подкласса IgG1, в которой оба полипептида области Fc содержат мутации P329G, L234A и L235A, и

а) один полипептид области Fc содержит мутацию T366W, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A и Y407V, или

б) один полипептид области Fc содержит мутации T366W и Y349C, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A, Y407V и S354C, или

в) один полипептид области Fc содержит мутации T366W и S354C, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A, Y407V и Y349C,

или

vi) гетеродимерную область Fc человеческого подкласса IgG4, в которой оба полипептида области Fc содержат мутации P329G, S228P и L235E, и

а) один полипептид области Fc содержит мутацию T366W, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A и Y407V, или

б) один полипептид области Fc содержит мутации T366W и Y349C, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A, Y407V и S354C, или

в) один полипептид области Fc содержит мутации T366W и S354C, и другой полипептид области Fc содержит мутации T366S, L368A, Y407V и Y349C,

или

vii) комбинацию одной из iii) c одной из iv), v) и vi).

Одним аспектом, как описано в данном документе, является двухвалентное биспецифичное антитело, содержащее:

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь антитела, специфично связывающегося с первым антигеном, и

б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела, специфично связывающегося со вторым антигеном, где вариабельные домены VL и VH второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменяют друг друга,

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

Антитело согласно а) не содержит модификацию, как описано согласно б), и тяжелая цепь, и легкая цепь согласно а) представляют собой выделенные цепи.

В антителе согласно б)

в пределах легкой цепи

вариабельный домен легкой цепи VL заменяется вариабельным доменом тяжелой цепи VН указанного атитела,

и

в пределах тяжелой цепи

вариабельный домен тяжелой цепи VН заменяется вариабельным доменом легкой цепи VL указанного атитела.

В одном воплощении

i) в константном домене CL первой легкой цепи согласно а) аминокислота в положении 124 (нумерация согласно Kabat) заменена на положительно заряженную аминокислоту, и где в константном домене CН1 первой тяжелой цепи согласно а) аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 (нумерация согласно индексу EU по Kabat) заменена на отрицательно заряженную аминокислоту,

или

ii) в константном домене CL второй легкой цепи согласно б) аминокислота в положении 124 (нумерация согласно Kabat) заменена на положительно заряженную аминокислоту, и где в константном домене CН1 второй тяжелой цепи согласно б) аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 (нумерация согласно индексу EU по Kabat) заменена на отрицательно заряженную аминокислоту.

В одном предпочтительном воплощении

i) в константном домене CL первой легкой цепи согласно а) аминокислота в положении 124 независимо заменена на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (Н) (нумерация согласно Kabat) (в одном предпочтительном воплощении - независимо на лизин (K) или аргинин (R)), и где в константном домене СН1 первой тяжелой цепи согласно а) аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 независимо заменена на глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно индексу EU по Kabat),

или

ii) в константном домене CL второй легкой цепи согласно б) аминокислота в положении 124 независимо заменена на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (Н) (нумерация согласно Kabat) (в одном предпочтительном воплощении - независимо на лизин (K) или аргинин (R)), и где в константном домене СН1 второй тяжелой цепи согласно б) аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 независимо заменена на глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении в константном домене CL второй тяжелой цепи аминокислоты в положении 124 и 123 заменены на K (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении в константном домене СН1 второй легкой цепи аминокислоты в положении 147 и 213 заменены на Е (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном предпочтительном воплощении в константном домене CL первой легкой цепи аминокислоты в положении 124 и 123 заменены на R и K соответственно, и в константном домене СН1 первой тяжелой цепи аминокислоты в положении 147 и 213 заменены на Е (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении в константном домене CL второй тяжелой цепи аминокислоты в положении 124 и 123 заменены на K, и где в константном домене СН1 второй легкой цепи аминокислоты в положении 147 и 213 заменены на Е, и в вариабельном домене VL первой легкой цепи аминокислота в положении 38 заменена на K, в вариабельном домене VH первой тяжелой цепи аминокислота в положении 39 заменена на Е, в вариабельном домене VL второй тяжелой цепи аминокислота в положении 38 заменена на K, и в вариабельном домене VH второй легкой цепи аминокислота в положении 39 заменена на Е (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

Одним аспектом, как описано в данном документе, является двухвалентное биспецифичное антитело, содержащее:

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь антитела, специфично связывающегося с первым антигеном, и

б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела, специфично связывающегося со вторым антигеном, где вариабельные домены VL и VH второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменены друг на друга, и где константные домены CL и СН1 второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменены друг на друга,

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

Антитело согласно а) не содержит модификацию, как описано согласно б), и тяжелая цепь и легкая цепь согласно а) представляют собой выделенные цепи.

В антителе согласно б)

в пределах легкой цепи

вариабельный домен легкой цепи VL заменен вариабельным доменом тяжелой цепи VН указанного антитела, и константный домен легкой цепи CL заменен константным доменом тяжелой цепи СН1 указанного антитела;

и

в пределах тяжелой цепи

вариабельный домен тяжелой цепи VН заменен вариабельным доменом легкой цепи VL указанного антитела, и константный домен тяжелой цепи СН1 заменен константным доменом легкой цепи СL указанного антитела.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является двухвалентное биспецифичное антитело, содержащее:

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь антитела, специфично связывающегося с первым антигеном, и

б) вторую легкую цепь и вторую тяжелую цепь антитела, специфично связывающегося со вторым антигеном, где константные домены СL и СН1 второй легкой цепи и второй тяжелой цепи заменены друг на друга,

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

Антитело согласно а) не содержит модификацию, как описано согласно б), и тяжелая цепь, и легкая цепь согласно а) представляют собой выделенные цепи.

В антителе согласно б)

в пределах легкой цепи

константный домен легкой цепи СL заменен константным доменом тяжелой цепи СН1 указанного антитела;

и в пределах тяжелой цепи

константный домен тяжелой цепи СН1 заменен константным доменом легкой цепи СL указанного антитела.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является мультиспецифичное антитело, содержащее:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) один, два, три или четыре одноцепочечных фрагмента Fab, специфично связывающихся с одним-четырьмя дополнительными антигенами (т.е. вторым и/или третьим, и/или четвертым, и/или пятым антигеном, предпочтительно специфично связывающихся с одним дополнительным антигеном, т.е. со вторым антигеном),

в котором указанные одноцепочечные фрагменты Fab согласно б) слиты с указанным полноразмерным антителом согласно а) через пептидный линкер на С- или N-конце тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела,

где первый антиген или один из дополнительных антигенов представляет собой CD19 человека.

В одном воплощении один или два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, слиты с полноразмерным антителом через пептидный линкер на С-конце тяжелой или легкой цепей указанного полноразмерного антитела.

В одном воплощении один или два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, слиты с полноразмерным антителом через пептидный линкер на С-конце тяжелых цепей указанного полноразмерного антитела.

В одном воплощении один или два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, слиты с полноразмерным антителом через пептидный линкер на С-конце легких цепей указанного полноразмерного антитела.

В одном воплощении два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, слиты с полноразмерным антителом через пептидный линкер на С-конце каждой тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела.

В одном воплощении два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, слиты с полноразмерным антителом через пептидный линкер на С-конце каждой тяжелой цепи указанного полноразмерного антитела.

В одном воплощении два идентичных одноцепочечных фрагмента Fab, связывающихся со вторым антигеном, слиты с полноразмерным антителом через пептидный линкер на С-конце каждой легкой цепи указанного полноразмерного антитела.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является трехвалентное биспецифичное антитело, содержащее:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела,

б) первый полипептид, состоящий из:

ба) вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела,

или

бб) вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела и константного домена 1 (СН1) антитела,

где указанный первый полипептид слит N-концом его домена VH через пептидный линкер с С-концом одной из двух тяжелых цепей указанного полноразмерного антитела,

в) второй полипептид, состоящий из:

ва) вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела,

или

вб) вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела и константного домена легкой цепи (СL) антитела,

где указанный второй полипептид слит N-концом домена VL через пептидный линкер с С-концом других двух тяжелых цепей указанного полноразмерного антитела,

и

где вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела первого полипептида и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела второго полипептида образуют вместе антигенсвязывающий сайт, специфично связывающийся со вторым антигеном,

и

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

В одном воплощении вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела полипептида согласно б) и вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела полипептида согласно в) связаны и стабилизируются посредством межцепочечного дисульфидного мостика посредством введения дисульфидной связи между следующими положениями:

i) положением 44 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 100 вариабельного домена легкой цепи или

ii) положением 105 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 43 вариабельного домена легкой цепи, или

iii) положением 101 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 100 вариабельного домена легкой цепи (нумерация всегда осуществляется согласно индексу EU по Kabat).

Методики для введения неприродных дисульфидных мостиков для стабилизации описываются, например, в WO 94/029350, Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59; Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393 или Schmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721. В одном воплощении возможная дисульфидная связь между вариабельными доменами полипептидов согласно б) и в) образуется между положением 44 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 100 вариабельного домена легкой цепи. В одном воплощении возможная дисульфидная связь между вариабельными доменами полипептидов согласно б) и в) образуется между положением 105 вариабельного домена тяжелой цепи и положением 43 вариабельного домена легкой цепи (нумерация всегда осуществляется согласно индексу EU по Kabat). В одном воплощении предпочтительным является трехвалентное биспецифичное антитело без указанной возможной дисульфидной стабилизации между вариабельными доменами VH и VL одноцепочечных фрагментов Fab.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является триспецифичное или тетраспецифичное антитело, содержащее:

а) первую легкую цепь и первую тяжелую цепь полноразмерного антитела, которое специфично связывается с первым антигеном, и

б) вторую (модифицированную) легкую цепь и вторую (модифицированную) тяжелую цепь полноразмерного антитела, которое специфично связывается со вторым антигеном, где вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, и/или где константные домены CL и СН1 заменяют друг друга, и

в) где от одного до четырех антигенсвязывающих пептидов, которые специфично связываются с одним или двумя дополнительными антигенами (т.е. с третьим и/или четвертым антигеном), слиты через пептидный линкер с С- или N-концом легких цепей или тяжелых цепей а) и/или б),

где первый антиген или второй антиген, или один из дополнительных антигенов представляет собой CD19 человека.

Антитело согласно а) не содержит модификацию, как описано согласно б), и тяжелая цепь и легкая цепь согласно а) представляют собой выделенные цепи.

В одном воплощении триспецифичное или тетраспецифичное антитело содержит согласно в) один или два антигенсвязывающих пептида, которые специфично связываются с одним или двумя дополнительными антигенами.

В одном воплощении антигенсвязывающие пептиды выбраны из группы фрагмента scFv и фрагмента scFab.

В одном воплощении антигенсвязывающие пептиды представляют собой фрагменты scFv.

В одном воплощении антигенсвязывающие пептиды представляют собой фрагменты scFab.

В одном воплощении антигенсвязывающие пептиды слиты с С-концом тяжелых цепей а) и/или б).

В одном воплощении триспецифичное или тетраспецифичное антитело содержит согласно в) один или два антигенсвязывающих пептида, которые специфично связываются с одним дополнительным антигеном.

В одном воплощении триспецифичное или тетраспецифичное антитело содержит согласно в) два идентичных антигенсвязывающих пептида, которые специфично связываются с третьим антигеном. В одном предпочтительном воплощении такие два идентичных антигенсвязывающих пептида слиты оба через одинаковый пептидный линкер с С-концом тяжелых цепей а) и б). В одном предпочтительном воплощении два идентичных антигенсвязывающих пептида представляют собой либо фрагмент scFv, либо фрагмент scFab.

В одном воплощении триспецифичное или тетраспецифичное антитело содержит согласно в) два антигенсвязывающих пептида, которые специфично связываются с третьим и с четвертым антигеном. В одном воплощении указанные два антигенсвязывающих пептида оба слиты через одинаковый пептидный соединитель с С-концом тяжелых цепей а) и б). В одном предпочтительном воплощении указанные два антигенсвязывающих пептида представляют собой либо фрагмент scFv, либо фрагмент scFab.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное четырехвалентное антитело, содержащее:

а) две легкие цепи и две тяжелые цепи антитела, которые специфично связываются с первым антигеном (и содержат два фрагмента Fab),

б) два дополнительных фрагмента Fab антитела, которые специфично связываются со вторым антигеном, где указанные дополнительные фрагменты Fab оба слиты через пептидный линкер либо с С-, либо с N-концами тяжелых цепей а),

и

где во фрагментах Fab были осуществлены следующие модификации:

i) в обоих фрагментах Fab a) или в обоих фрагментах Fab б) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, и/или константные домены CL и CH1 заменяют друг друга,

или

ii) в обоих фрагментах Fab a) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, и константные домены CL и CH1 заменяют друг друга,

и

в обоих фрагментах Fab б) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, или константные домены CL и CH1 заменяют друг друга,

или

iii) в обоих фрагментах Fab a) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, или константные домены CL и CH1 заменяют друг друга,

и

в обоих фрагментах Fab б) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, и константные домены CL и CH1 заменяют друг друга,

или

iv) в обоих фрагментах Fab a) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга, и в обоих фрагментах Fab б) константные домены CL и CH1 заменяют друг друга,

или

v) в обоих фрагментах Fab a) константные домены CL и CH1 заменяют друг друга, и в обоих фрагментах Fab б) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга,

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

В одном воплощении указанные дополнительные фрагменты Fab оба слиты через пептидный линкер либо с С-концами тяжелых цепей а), либо с N-концами тяжелых цепей а).

В одном воплощении указанные дополнительные фрагменты Fab оба слиты через пептидный линкер с С-концами тяжелых цепей а).

В одном воплощении указанные дополнительные фрагменты Fab оба слиты через пептидный соединитель с N-концами тяжелых цепей а).

В одном воплощении во фрагментах Fab осуществляются следующие модификации:

i) в обоих фрагментах Fab a) или в обоих фрагментах Fab б) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга,

и/или

константные домены CL и СН1 заменяют друг друга.

В одном воплощении во фрагментах Fab осуществляются следующие модификации:

i) в обоих фрагментах Fab a) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга,

и/или

константные домены CL и СН1 заменяют друг друга.

В одном воплощении во фрагментах Fab осуществляются следующие модификации:

i) в обоих фрагментах Fab a) константные домены СL и СН1 заменяют друг друга.

В одном воплощении во фрагментах Fab осуществляются следующие модификации:

i) в обоих фрагментах Fab б) вариабельные домены VL и VH заменяют друг друга,

и/или

константные домены CL и СН1 заменяют друг друга.

В одном воплощении во фрагментах Fab осуществляются следующие модификации:

i) в обоих фрагментах Fab б) константные домены CL и СН1 заменяют друг друга.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное четырехвалентное антитело, содержащее:

а) (модифицированную) тяжелую цепь первого антитела, которое специфично связывается с первым антигеном и содержит первую пару доменов VH-CH1, где С-конец указанной тяжелой цепи и N-конец второй пары доменов VH-CH1 указанного первого антитела слиты через пептидный линкер,

б) две легкие цепи указанного первого антитела а),

в) (модифицированную) тяжелую цепь второго антитела, которое специфично связывается со вторым антигеном и содержит первую пару доменов VH-CL, где С-конец указанной тяжелой цепи и N-конец второй пары доменов VH-CL указанного второго антитела слиты через пептидный линкер, и

г) две (модифицированные) легкие цепи указанного второго антитела в), причем каждая содержит пару доменов CL-CH1,

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное антитело, содержащее:

а) тяжелую цепь и легкую цепь первого полноразмерного антитела, которое специфично связывается с первым антигеном, и

б) тяжелую цепь и легкую цепь второго полноразмерного антитела, которое специфично связывается со вторым антигеном, где N-конец тяжелой цепи соединяется с С-концом легкой цепи через пептидный линкер,

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

Антитело согласно а) не содержит модификацию, как описано согласно б), и тяжелая цепь и легкая цепь представляют собой выделенные цепи.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное антитело, содержащее:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) фрагмент Fv, специфично связывающийся со вторым антигеном, содержащий домен VH² и домен VL², где оба домена соединяются друг с другом через дисульфидный мостик,

где только либо домен VH², либо домен VL² слиты через пептидный линкер с тяжелой или легкой цепью полноразмерного антитела, специфично связывающегося с первым антигеном,

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

В данном биспецифичном антителе тяжелые цепи и легкие цепи согласно а) представляют собой выделенные цепи.

В одном воплощении другие домен VH² или домен VL² не слиты через пептидный линкер с тяжелой или легкой цепью полноразмерного антитела, специфично связывающегося с первым антигеном.

Во всех аспектах, как описано в данном документе, первая легкая цепь содержит домен VL и домен CL, и первая тяжелая цепь содержит домен VH, домен СН1, шарнирную область, домен СН2 и домен СН3.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное трехвалентное антитело, содержащее:

а) два фрагмента Fab, которые специфично связываются с первым антигеном,

б) один фрагмент CrossFab, который специфично связывается со вторым антигеном, в котором домены СН1 и CL обмениваются друг с другом,

в) одну область Fc, содержащую первую тяжелую цепь области Fc и вторую тяжелую цепь области Fc,

где С-конец доменов СН1 двух фрагментов Fab соединен с N-концом полипептидов тяжелой цепи области Fc, и

где С-конец домена CL фрагмента CrossFab соединен с N-концом домена VH одного из фрагментов Fab,

и

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное трехвалентное антитело, содержащее:

а) первый и второй фрагмент Fab, который каждый специфично связывается с первым антигеном,

б) один фрагмент CrossFab, который специфично связывается со вторым антигеном, в котором домены СН1 и CL обмениваются друг с другом,

в) одну область Fc, содержащую первую тяжелую цепь области Fc и вторую тяжелую цепь области Fc,

где С-конец домена СН1 первого фрагмента Fab соединен с N-концом одного из полипептидов тяжелой цепи области Fc, и С-конец домена CL фрагмента CrossFab соединен с N-концом полипептида другой тяжелой цепи области Fc, и

где С-конец домена СН1 второго фрагмента Fab соединен с N-концом домена VH первого фрагмента Fab или с N-концом домена VH фрагмента CrossFab, и

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное трехвалентное антитело, содержащее:

а) первый и второй фрагмент Fab, который каждый специфично связывается с первым антигеном,

б) один фрагмент CrossFab, который специфично связывается со вторым антигеном, в котором домены VH и VL обмениваются друг с другом,

в) одну область Fc, содержащую первую тяжелую цепь области Fc и вторую тяжелую цепь области Fc,

где С-конец домена СН1 первого фрагмента Fab соединен с N-концом одного из полипептидов тяжелой цепи области Fc, и С-конец домена СН1 фрагмента CrossFab соединен с N-концом другого полипептида тяжелой цепи области Fc, и

где С-конец домена СН1 второго фрагмента Fab соединен с N-концом домена VH первого фрагмента Fab или с N-концом домена VL фрагмента CrossFab, и

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное антитело, содержащее:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) фрагмент Fab, специфично связывающийся со вторым антигеном, содержащий домен VH² и домен VL², содержащие фрагмент тяжелой цепи и фрагмент легкой цепи, где

в пределах фрагмента легкой цепи

вариабельный домен легкой цепи VL² заменен вариабельным доменом тяжелой цепи VH² указанного антитела,

и

в пределах фрагмента тяжелой цепи

вариабельный домен тяжелой цепи VH² заменен вариабельным доменом легкой цепи VL² указанного антитела,

где фрагмент Fab тяжелой цепи вставлен между доменом СН1 одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела и соответствующей областью Fc полноразмерного антитела, и N-конец легкой цепи фрагмента Fab конъюгирован с С-концом легкой цепи полноразмерного антитела, которая образует пару с тяжелой цепью полноразмерного антитела, в которую была вставлена тяжелая цепь фрагмента Fab, и

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

Одним аспектом, как описано в данном документе, является биспецифичное антитело, содержащее:

а) полноразмерное антитело, специфично связывающееся с первым антигеном и состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, и

б) фрагмент Fab, специфично связывающийся со вторым антигеном, содержащий домен VH² и домен VL², содержащие фрагмент тяжелой цепи и фрагмент легкой цепи, где

в пределах фрагмента легкой цепи

вариабельный домен легкой цепи VL² заменен вариабельным доменом тяжелой цепи VH² указанного антитела,

и

в пределах фрагмента тяжелой цепи

вариабельный домен тяжелой цепи VH² заменен вариабельным доменом легкой цепи VL² указанного антитела,

где С-конец фрагмента тяжелой цепи фрагмента Fab конъюгирован с N-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, и С-конец фрагмента легкой цепи фрагмента Fab конъюгирован с N-концом легкой цепи полноразмерного антитела, которая образует пару с тяжелой цепью полноразмерного антитела, с которой конъюгирован фрагмент тяжелой цепи фрагмента Fab, и

где первый антиген или второй антиген представляет собой CD19 человека.

В одном воплощении всех аспектов антитело, как описано в данном документе, представляет собой мультиспецифичное антитело, которое требует гетеродимеризации по меньшей мере двух полипептидов тяжелой цепи, и где данное антитело специфично связывается с человеческим рецептором трансферрина и со вторым антигеном рецептора трансферрина, не являющегося человеческим.

Было описано несколько подходов для модификаций СН3 для того, чтобы поддерживать гетеродимеризацию, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291, которые включены в данный документ посредством ссылки. Типично в подходах, известных в данной области, и домен СН3 первой тяжелой цепи, и домен СН3 второй тяжелой цепи генетически модифицированы комплементарным образом таким образом, что тяжелая цепь, содержащая один генетически модифицированный домен СН3, больше не может гомодимеризоваться с другой тяжелой цепью той же самой структуры (например, первая тяжелая цепь с генетически модифицированным СН3 больше не может гомодимеризоваться с другой первой тяжелой цепью с генетически модифицированным СН3; и вторая тяжелая цепь с генетически модифицированным СН3 больше не может гомодимеризоваться с другой второй тяжелой цепью с генетически модифицированным СН3). Посредством этого тяжелая цепь, содержащая один генетически модифицированный домен СН3, принуждается к гетеродимеризации с другой тяжелой цепью, содержащей домен СН3, которая генетически модифицирована комплементарным образом. Для этого воплощения домен СН3 первой тяжелой цепи и домен СН3 второй тяжелой цепи генетически модифицируются комплементарным образом посредством аминокислотных замен таким образом, что первая тяжелая цепь и вторая тяжелая цепь принуждаются к гетеродимеризации, тогда как первая тяжелая цепь и вторая тяжелая цепь больше не могут гомодимеризоваться (например, по стерическим причинам).

В данной области известны разные подходы для поддержки гетеродимеризации тяжелых цепей, которые были процитированы и включены выше, и они рассматриваются как другие альтернативы, используемые в предоставлении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, которое содержит «неспаренную область Fab», полученную из первого антитела, которая специфично связывается с первым антигеном, и «спаренную область Fab», полученную из второго антитела, которая специфично связывается со вторым антигеном, в комбинации с конкретными аминокислотными заменами, описанными выше.

Домены СН3 мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, могут быть изменены посредством технологии «выступ во впадину», которая подробно описана с несколькими примерами, например, в WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621 и Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681. В данном способе взаимодействующие поверхности двух доменов СН3 изменяют для увеличения гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих данные два домена СН3. Каждый из двух доменов СН3 (двух тяжелых цепей) может быть «выступом», тогда как другой - «впадиной». Введение дисульфидного мостика дополнительно стабилизирует гетеродимеры (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) и увеличивает выход.

В одном предпочтительном воплощении мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутацию T366W в домене СН3 «цепи выступа» и мутации T366S, L368A, Y407V в домене СН3 «цепи впадины» (нумерация согласно индексу EU по Kabat). Также может быть использован дополнительный межцепоченый дисульфидный мостик между доменами СН3 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), например, посредством введения мутации Y349C в домен СН3 «цепи выступа» и мутации Е356С или мутации S354C в домен СН3 «цепи впадины». Таким образом, в другом предпочтительном воплощении мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутации Y349C и T366W в одном из двух доменов СН3 и мутации Е356С, T366S, L368A и Y407V в другом из двух доменов СН3, или мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутации Y349C и T366W в одном из двух доменов СН3 и мутации S354С, T366S, L368A и Y407V в другом из двух доменов СН3 (дополнительная мутация Y349C в одном домене СН3 и дополнительная мутация Е356С или S354C в другом домене СН3 образует межцепочечный дисульфидный мостик) (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

Но также альтернативно или дополнительно можно использовать другие технологии «выступа во впадину», как описано ЕР 1870459А1. В одном воплощении мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутации R409D и K370E в домене СН3 «цепи выступа» и мутации D399K и E357K в домене СН3 «цепи впадины» (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутацию T366W в домене СН3 «цепи выступа» и мутации T366S, L368A и Y407V в домене СН3 «цепи впадины», и дополнительно мутации R409D и K370E в домене СН3 «цепи выступа» и мутации D399K и E357K в домене СН3 «цепи впадины» (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутации Y349C и T366W в одном из двух доменов СН3 и мутации S354C, T366S, L368A и Y407V в других двух доменах СН3, или мультиспецифичное антитело, как описано в данном документе, содержит мутации Y349C и T366W в одном из двух доменов СН3 и мутации S354C, T366S, L368A и Y407V в других двух доменах СН3 и дополнительно мутации R409D и K370E в домене СН3 «цепи выступа» и мутации D399K и E357K в домене СН3 «цепи впадины» (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

Помимо «технологии выступ во впадину» в данной области известны другие методики для модификации доменов СН3 тяжелых цепей мультиспецифичного антитела для усиления гетеродимеризации. Данные технологии, особенно технологии, описанные в WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 и WO 2013/096291, рассматриваются здесь в качестве альтернатив «технологии выступ во впадину» в сочетании с мультиспецифичным антителом, как описано в данном документе.

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в ЕР 1870459. Данный подход основывается на введении заряженных аминокислот с противоположными зарядами в конкретные положения аминокислот на поверхности контакта домена СН3/СН3 между обоими - первой и второй тяжелыми цепями.

Соответственно, данное воплощение относится к мультиспецифичному антителу, как описано в данном документе, где в третичной структуре антитела домен СН3 первой тяжелой цепи и домен СН3 второй тяжелой цепи образуют поверхность контакта, которая расположена между соответствующими доменами СН3 антитела, где каждая из соответствующих аминокислотных последовательностей домена СН3 первой тяжелой цепи и домена СН3 второй тяжелой цепи содержит набор аминокислот, которые расположены в пределах указанной поверхности контакта в третичной структуре антитела, где из набора аминокислот, которые расположены на поверхности контакта в домене СН3 одной тяжелой цепи первая аминокислота заменена на положительно заряженную аминокислоту, и из набора аминокислот, которые расположены на поверхности контакта в домене СН3 другой тяжелой цепи вторая аминокислота заменена на отрицательно заряженную аминокислоту. Мультиспецифичное антитело согласно данному воплощению в данном документе также называется «СН3(+/-)-генетически модифицированное мультиспецифичное антитело» (где сокращение «+/-» обозначает противоположно заряженные аминокислоты, которые были введены в соответствущие домены СН3).

В одном воплощении указанного СН3(+/-)-генетически модифицированного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, положительно заряженная аминокислота выбрана из K, R и Н, и отрицательно заряженная аминокислота выбрана из E или D.

В одном воплощении указанного СН3(+/-)-генетически модифицированного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, положительно заряженная аминокислота выбрана из K и R, и отрицательно заряженная аминокислота выбрана из E или D.

В одном воплощении указанного СН3(+/-)-генетически модифицированного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, положительно заряженная аминокислота представляет собой K, и отрицательно заряженная аминокислота представляет собой E.

В одном воплощении указанного СН3(+/-)-генетически модифицированного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота R в положении 409 заменена на D, и аминокислота K в положении заменена на Е, и в домене СН3 другой тяжелой цепи аминокислота D в положении 399 заменена на K, и аминокислота Е в положении 357 заменена на K (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2013/157953. В одном воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на K, и в домене СН3 другой тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на D (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В другом воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на K, и аминокислота L в положении 351 заменена на K, и в домене СН3 другой тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на D (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В другом воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на K, и аминокислота L в положении 351 заменена на K, и в домене СН3 другой тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на D (нумерация согласно индексу EU по Kabat). Дополнительно в домене СН3 другой тяжелой цепи содержится по меньшей мере одна из следующих замен: аминокислота Y в положении 349 заменена на Е, аминокислота Y в положении 349 заменена на D, и аминокислота L в положении 368 заменена на Е (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном воплощении аминокислота L в положении 368 заменена на Е (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2012/058768. В одном воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на Y, и аминокислота Y в положении 407 заменена на А, и в домене СН3 другой тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на А, и аминокислота K в положении 409 заменена на F (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В другом воплощении в домене СН3 другой тяжелой цепи, помимо вышеупомянутых замен, заменена по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 411 (исходно Т), 399 (исходно D), 400 (исходно S), 405 (исходно F), 390 (исходно N) и 392 (исходно K) (нумерация согласно индексу EU по Kabat). Предпочтительными заменами являются следующие:

- замена аминокислоты Т в положении 411 аминокислотой, выбранной из N, R, Q, K, D, E и W (нумерация согласно индексу EU по Kabat),

- замена аминокислоты D в положении 399 аминокислотой, выбранной из R, W, Y и K (нумерация согласно индексу EU по Kabat),

- замена аминокислоты S в положении 400 аминокислотой, выбранной из E, D, R и K (нумерация согласно индексу EU по Kabat),

- замена аминокислоты F в положении 405 аминокислотой, выбранной из I, M, T, S, V и W (нумерация согласно индексу EU по Kabat),

- замена аминокислоты N в положении 390 аминокислотой, выбранной из R, K и D (нумерация согласно индексу EU по Kabat) и

- замена аминокислоты K в положении 392 аминокислотой, выбранной из V, M, R, L, F и E (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В другом воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе (генетически модифицированное согласно WO 2012/058768), в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота L в положении 351 заменена на Y, и аминокислота Y в положении 407 заменена на А, и в домене СН3 другой тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на V, и аминокислота K в положении 409 заменена на F (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В другом воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота Y в положении 407 заменена на A, и в домене СН3 другой тяжелой цепи аминокислота Т в положении 366 заменена на A, и аминокислота K в положении 409 заменена на F (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В указанном последнем вышеупомянутом воплощении в домене СН3 указанной другой тяжелой цепи аминокислота K в положении 392 заменена на E, аминокислота T в положении 411 заменена на E, аминокислота D в положении 399 заменена на R, и аминокислота S в положении 400 заменена на R (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2011/143545. В одном воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домены СН3 обеих тяжелых цепей вводятся модификации аминокислот в положениях 368 и/или 409 (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2011/090762. WO 2011/090762 относится к модификациям аминокислот согласно технологии «выступ во впадину». В одном воплощении указанного СН3(KiH)-генетически модифицированного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота T в положении 366 заменена на W, и в домене СН3 другой тяжелой цепи аминокислота Y в положении 407 заменена на А (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В другом воплощении указанного СН3(KiH)-генетически модифицированного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота T в положении 366 заменена на Y, и в домене СН3 другой тяжелой цепи аминокислота Y в положении 407 заменена на T (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, которое принадлежит к изотипу IgG2, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2011/090762.

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2009/089004. В одном воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота K или N в положении 392 заменена на отрицательно заряженную кислоту (в одном предпочтительном воплощении - на E или D, в одном предпочтительном воплощении - на D), и в домене СН3 другой тяжелой цепи аминокислота D в положении 399, аминокислота Е или D в положении 356, или аминокислота Е в положении 357 заменена на положительно заряженную аминокислоту (в одном предпочтительном воплощении - на K или R, в одном предпочтительном воплощении - на K, в одном предпочтительном воплощении аминокислоты в положениях 399 или 356 заменены на K) (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном дополнительном воплощении, помимо вышеупомянутых замен, в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота K или R в положении 409 заменена на отрицательно заряженную аминокислоту (в одном предпочтительном воплощении - на E или D, в одном предпочтительном воплощении - на D) (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В еще одном другом воплощении, помимо или в качестве альтернативы вышеупомянутым заменам, в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота K в положении 439 и/или аминокислота K в положении 370 независимо друг от друга заменены на отрицательно заряженную аминокислоту (в одном предпочтительном воплощении - на E или D, в одном предпочтительном воплощении - на D) (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2007/147901. В одном воплощении указанного мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, в домене СН3 одной тяжелой цепи аминокислота K в положении 253 заменена на Е, аминокислота D в положении 282 заменена на K, и аминокислота K в положении 322 заменена на D, и в домене СН3 другой тяжелой цепи аминокислота D в положении 239 заменена на K, аминокислота E в положении 240 заменена на K, и аминокислота K в положении 292 заменена на D (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении мультиспецифичного антитела, как описано в данном документе, для поддержки гетеродимеризации первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи мультиспецифичного антитела используется подход, описанный в WO 2007/110205.

В одном воплощении всех аспектов и воплощений, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело представляет собой биспецифичное антитело или триспецифичное антитело. В одном предпочтительном воплощении мультиспецифичное антитело представляет собой биспецифичное антитело.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, антитело представляет собой двухвалентное или трехвалентное антитело. В одном воплощении данное антитело представляет собой двухвалентное антитело.

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело имеет структуру константного домена антитела типа IgG. В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG1 или к человеческому подклассу IgG1 с мутациями L234A и L235A. В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG2. В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG3. В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG4 или к человеческому подклассу IgG4 с дополнительной мутацией S228P. В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG1 или к человеческому подклассу IgG4. В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG1 с мутациями L234A и L235A (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG4 с мутациями S228P и L235Е (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном другом воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, мультиспецифичное антитело характеризуется тем, что указанное мультиспецифичное антитело принадлежит к человеческому подклассу IgG4 с мутациями S228P, L235Е и P329G (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую домен СН3, как определено в данном документе, содержит дополнительный С-концевой глицин-лизиновый дипептид (G446 и K447, нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном воплощении всех аспектов, как описано в данном документе, антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую домен СН3, как определено в данном документе, содержит дополнительный С-концевой остаток глицина (G446, нумерация согласно индексу EU по Kabat).

Антитело, как описано в данном документе, в одном воплощении характеризуется принадлежностью к человеческому подклассу IgG1 с мутациями PVA236, L234A/L235A и/или GLPSS331 (нумерация согласно индексу EU по Kabat) или к подклассу IgG4. В другом воплощении антитело характеризуется принадлежностью к любому подклассу IgG, в одном воплощении - к IgG1 или IgG4, содержащему по меньшей мере одну мутацию в E233, L234, L235, G236, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 и/или P329 (нумерация согласно индексу EU по Kabat). В одном воплощении антитело подкласса IgG4 дополнительно содержит мутацию S228P или мутации S228P и L235E (Angal, S., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108) (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

С-конец тяжелой цепи антитела, как описано в данном документе, может представлять собой полный C-конец, заканчивающийся аминокислотными остатками PGK. С-конец тяжелой цепи может представлять собой укороченный С-конец, в котором были удалены один или два С-концевых аминокислотных остатка. В одном предпочтительном воплощении С-конец тяжелой цепи представляет собой укороченный С-конец, оканчивающийся PG.

В некоторых воплощениях предложенное здесь антитело может быть дополнительно модифицировано так, чтобы оно содержало один или более чем один челночный модуль гематоэнцефалического барьера, который известен в данной области и легко доступен.

Челночный модуль гематоэнцефалического барьера характеризуется наличием специфичности связывания в отношении рецептора гематоэнцефалического барьера. Эта специфичность связывания может быть получена либо слиянием челночного модуля гематоэнцефалического барьера с антителом к CD19 человека, как описано в данном документе, или она может быть получена введением специфичности связывания к рецептору гематоэнцефалического барьера в качестве одной из специфичностей связывания мультиспецифичного антитела, которое специфично связывается с CD19 человека и, таким образом, имеет специфичность связывания антитела к CD19 человека, как описано в данном документе, и специфичность связывания к рецептору гематоэнцефалического барьера.

Один или более чем один челночный модуль гематоэнцефалического барьера может быть слит с любым концом легкой или тяжелой цепи антитела к CD19 человека, как описано в данном документе. В одном предпочтительном воплощении челночный модуль гематоэнцефалического барьера слит с С-концом тяжелой цепи.

Один или более чем один челночный модуль гематоэнцефалического барьера может быть слит с соответствующей цепью антитела либо непосредственно, либо через линкерный пептид. В одном предпочтительном воплощении линкерный пептид имеет аминокислотную последовательность GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41).

Челночный модуль гематоэнцефалического барьера может представлять собой фрагмент scFv антитела. В одном воплощении челночный модуль гематоэнцефалического барьера представляет собой scFv, содержащий в порядке от N- к С-концу вариабельный домен легкой цепи - константный домен легкой цепи - линкерный пептид - вариабельный домен тяжелой цепи - константный домен 1 тяжелой цепи.

В одном предпочтительном воплощении челночный модуль гематоэнцефалического барьера представляет собой фрагмент scFv антитела 8D3 к рецептору трасферрина с (G4S)₆ линкерным пептидом или его гуманизированный вариант.

Термин «его гуманизированный вариант» обозначает молекулу, которая была получена пересадкой CDR мышиного антитела 8D3 на человеческий каркас с возможным введением, независимо друг от друга, одной-трех мутаций в каждую из каркасных областей (FR) и/или гипервариабельных областей (HVR).

В одном аспекте в данном документе предложен слитый полипептид антитела к CD19 человека, содержащий антитело к CD19 человека, два пептидных линкера и два одновалентных связывающих элемента, которые связываются с рецептором гематоэнцефалического барьера, где данный линкер связывает антитело к CD19 человека с одновалентными связывающими элементами, которые связываются с рецептором гематоэнцефалического барьера.

В одном аспекте в данном документе предложен слитый полипептид антитела к CD19 человека, содержащий антитело к CD19 человека, пептидный линкер и один одновалентный связывающий элемент, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера, где данный линкер связывает антитело к CD19 человека с одновалентным связывающим элементом, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера.

В одном воплощении одновалентный связывающий элемент, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера, выбран из группы, состоящей из белков, полипептидов и пептидов.

В одном воплощении одновалентный связывающий элемент, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера, содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из лиганда рецептора гематоэнцефалического барьера, scFv, Fv, scFab, VHH, в одном предпочтительном воплощении - scFv или scFab.

В одном воплощении рецептор гематоэнцефалического барьера выбран из группы, состоящей из рецептора трансферрина, рецептора инсулина, рецептора инсулиноподобного фактора роста, белка 8, родственного рецептору липопротеина низкой плотности, белка 1, родственного рецептору липопротеина низкой плотности, и гепаринсвязывающего фактора роста, подобного эпидермальному фактору роста. В одном предпочтительном воплощении рецептор гематоэнцефалического барьера представляет собой рецептор трансферрина.

В одном воплощении одновалентный связывающий элемент, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера, содержит один scFab или один scFv, направленный на рецептор трансферрина, более конкретно scFab или scFv, распознающий эпитоп в рецепторе трансферрина, содержащийся в пределах аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, 43 и 44.

В одном воплощении одновалентный связывающий элемент, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера, связан с С-концевым концом тяжелой цепи антитела к CD19 человека посредством линкера.

В одном воплощении пептидный линкер представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую длину по меньшей мере 15 аминокислот, более предпочтительно - длину от 18 до 25 аминокислот.

В одном воплощении антитело к CD19 человека представляет собой полноразмерное антитело, в одном предпочтительном воплощении - полноразмерный IgG. Термин «полноразмерное антитело» обозначает антитело, состоящее из двух полипептидов легкой цепи антитела и двух полипептидов тяжелой цепи антитела, где в двух полипептидах тяжелой цепи антитела С-концевой остаток лизина (K) может присутствовать или нет.

В одном предпочтительном воплощении слитый полипептид антитела к CD19 человека содержит полноразмерное антитело IgG к CD19 человека в качестве мозгового эффекторного элемента, линкер последовательности GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41) и один scFab в качестве одновалентного связывающего элемента, который связывается с человеческим рецептором трансферрина в качестве рецептора гематоэнцефалического барьера, где scFab связан посредством линкера с С-концевым концом (части Fc) одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела к CD19 человека, и где scFab распознает эпитоп в человеческом рецепторе трансферрина, содержащийся в пределах аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52, 53 и 54.

В одном предпочтительном воплощении слитый полипептид антитела к CD19 человека содержит полноразмерное антитело IgG к CD19 человека в качестве мозгового эффекторного элемента, линкер последовательности GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41) и один scFv в качестве одновалентного связывающего элемента, который связывается с человеческим рецептором трансферрина в качестве рецептора гематоэнцефалического барьера, где scFab связан посредством линкера с С-концевым концом (части Fc) одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела к CD19 человека, и где scFab распознает эпитоп в человеческом рецепторе трансферрина, содержащийся в пределах аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, 43 и 44.

В одном воплощении первая тяжелая цепь антитела к CD19 человека содержит первый модуль димеризации, и вторая тяжелая цепь антитела содержит второй модуль димеризации, обеспечивающий гетеродимеризацию двух тяжелых цепей.

В одном воплощении первый модуль димеризации первой тяжелой цепи антитела к CD19 человека представляет собой тяжелую цепь выступа, и модуль димеризации второй тяжелой цепи антитела к CD19 человека представляет собой тяжелую цепь впадины (согласно стратегии выступ во впадину).

Слитый полипептид антитела к CD19 человека, как описано в данном документе, можно использовать для транспортировки антитела к CD19 человека через гематоэнцефалический барьер.

В одном воплощении тяжелая цепь антитела к CD19 человека, которая связана на ее С-концевом конце области Fc c scFab в качестве одноваленого связывающего элемента, который связывается с человеческим рецептором трансферрина, имеет следующую структуру в направлении от N- до С-конца:

• тяжелая цепь IgG,

• пептидный линкер, связывающий С-концевой конец области Fc тяжелой цепи IgG с N-концевым концом домена VL scFab, в одном предпочтительном воплощении данный пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41),

• вариабельный домен легкой цепи (VL) и домен С-каппа легкой цепи scFab,

• пептидный линкер, связывающий С-концевой конец домена С-каппа легкой цепи scFab с N-концевым концом домена VН scFab, в одном предпочтительном воплощении данный пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность (G₄S)₆GG (SEQ ID NO: 45),

• вариабельный домен тяжелой цепи (VН) антитела scFab и домен СН1 тяжелой цепи IgG.

В одном воплощении тяжелая цепь антитела к CD19 человека, которая связана на ее С-концевом конце области Fc c scFv в качестве одноваленого связывающего элемента, который связывается с человеческим рецептором трансферрина, имеет следующую структуру в направлении от N- до С-конца:

• тяжелая цепь IgG,

• пептидный линкер, связывающий С-концевой конец Fc-части тяжелой цепи IgG с N-концевым концом домена VL фрагмента антитела scFv, в одном предпочтительном воплощении данный пептидный линкер представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41),

• вариабельный домен легкой цепи (VL),

• пептидный линкер, связывающий С-концевой конец вариабельного домена легкой цепи с N-концевым концом домена VН scFv, в одном предпочтительном воплощении данный пептидный линкер представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью (G₄S)₆GG (SEQ ID NO: 45),

• вариабельный домен тяжелой цепи (VН) фрагмента антитела scFv.

В одном воплощении челночный модуль гематоэнцефалического барьера/scFab или scFv, направленный на рецептор гематоэнцефалического барьера, происходит из гуманизированного антитела 8D3 к рецептору трансферрина (см., например, Boado, R.J., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258). Вариабельный домен мышиной тяжелой цепи имеет следующую аминокислотную последовательность:

EVQLVESGGG LVQPGNSLTL SCVASGFTFS NYGMHWIRQA PKKGLEWIAM IYYDSSKMNY ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LEMNSLRSED TAMYYCAVPT SHYVVDVWGQ GVSVTVSS

(SEQ ID NO: 46).

Вариабельный домен мышиной легкой цепи (вариант 1) имеет следующую аминокислотную последовательность:

DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKLELK

(SEQ ID NO: 47), и

вариабельный домен мышиной легкой цепи (вариант 2) имеет следующую аминокислотную последовательность:

DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKVEIK

(SEQ ID NO: 48).

В одном воплощении антитело к рецептору трансферрина или специфичность связывания против рецептора трансферрина содержит (а) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51; (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, 54 или 55; (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.

В одном воплощении антитело к рецептору трансферрина содержит по меньшей мере одну пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 49 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 50, образующую сайт связывания в отношении рецептора трансферрина.

Один челночный модуль гематоэнцефалического барьера

В одном аспекте антитело к CD19 человека или слитый полипептид антитела к CD19 человека имеет точно одну специфичность связывания или челночный модуль для гематоэнцефалического барьера, таким образом, является по меньшей мере биспецифичным, где специфичность связывания или челночный модуль для гематоэнцефалического барьера содержит гуманизированные вариабельные домены антитела 8D3 к рецептору трансферрина человека или пару вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 49 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 50, при этом специфичность связывания или челночный модуль для гематоэнцефалического барьера транспортирует антитело к CD19 человека через гематоэнцефалический барьер.

Один или два челночных модуля гематоэнцефалического барьера

В одном аспекте антитело к CD19 человека или слитый полипептид антитела к CD19 человека имеет одну или две специфичности связывания или челночных модуля для гематоэнцефалического барьера, таким образом, является по меньшей мере биспецифичным, где сайт связывания или челночный модуль для гематоэнцефалического барьера происходит(дят) из антитела, которое связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера (BBB-R, специфичность связывания в отношении BBB-R) с низкой аффинностью, при этом специфичность связывания или челночный модуль для гематоэнцефалического барьера, происходящий из антитела, которое связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера с низкой аффинностью, транспортирует антитело к CD19 человека через гематоэнцефалический барьер.

В одном воплощении BBB-R выбран из группы, состоящей из рецептора трансферрина (TfR), рецептора инсулина, рецептора инсулиноподобного фактора роста (рецептор IGF), белка 8, родственного рецептору липопротеина низкой плотности (LRP8), белка 1, родственного рецептору липопротеина низкой плотности (LRP1), и гепаринсвязывающего фактора роста, подобного эпидермальному фактору роста (HB-EGF). В другом таком аспекте BBB-R представляет собой человеческий BBB-R. В одном таком аспекте BBB-R представляет собой TfR. В другом таком аспекте BBB-R представляет собой TfR, и антитело не ингибирует активность TfR. В другом таком аспекте BBB-R представляет собой TfR, и антитело не ингибирует связывание TfR с трансферрином.

В одном воплощении антитело не ухудшает связывание BBB-R с одним или более чем одним из его природных лигандов. В одном таком воплощении антитело специфично связывается с человеческим рецептором трансферрина (hTfR) таким образом, что оно не ингибирует связывание hTfR с человеческим трансферрином.

В одном воплощении специфичность связывания в отношении BBB-R имеет IC₅₀ (полумаксимальная ингибирующая концентрация) в отношении BBB-R от примерно 1 нМ до примерно 100 мкМ. В одном воплощении IC₅₀ составляет от примерно 5 нМ до примерно 100 мкМ. В одном воплощении IC₅₀ составляет от примерно 50 нМ до примерно 100 мкМ. В одном воплощении IC₅₀ составляет от примерно 100 нМ до примерно 100 мкМ. В одном воплощении специфичность связывания в отношении BBB-R имеет аффинность в отношении BBB-R от примерно 5 нМ до примерно 10 мкМ. В одном воплощении специфичность связывания в отношении BBB-R, при конъюгировании с или нахождении в антителе к CD19 человека, имеет аффинность в отношении BBB-R от примерно 30 нМ до примерно 1 мкМ. В одном воплощении специфичность связывания в отношении BBB-R, при конъюгировании с или нахождении в антителе к CD19 человека, имеет аффинность в отношении BBB-R от примерно 50 нМ до примерно 1 мкМ. В одном воплощении аффинность специфичности связывания в отношении BBB-R или слитого полипептида антитела к CD19 человека в отношении BBB-R измеряется с использованием анализа Скэтчарда. В одном воплощении аффинность специфичности связывания в отношении BBB-R или слитого полипептида антитела к CD19 человека в отношении BBB-R измеряется с использованием анализа BIACORE. В одном воплощении аффинность специфичности связывания в отношении BBB-R или слитого полипептида антитела к CD19 человека в отношении BBB-R измеряется с использованием конкурентного ELISA (твердофазный иммунноферментый анализ).

Применение слитых полипептидов антитела, содержащих челнок гематоэнцефалического барьера

В другом воплощении в данном документе предложен способ увеличения воздействия на ЦНС антитела к CD19 человека, где антитело к CD19 человека связано с антителом или фрагментом антитела, который с низкой аффинностью связывается с BBB-R, увеличивая, посредством этого, воздействие на ЦНС антитела к CD19 человека. Термин «связанный» включает случаи, в которых антитело со специфичностью связывания к BBB-R вводится в качестве второй специфичности связывания в по меньшей мере биспецифичное антитело к CD19 человека/BBB-R. В одном воплощении увеличения воздействия на ЦНС антитела к CD19 человека измеряется относительно воздействия на ЦНС антитела к CD19 человека, связанного с типичным антителом, не имеющим пониженную аффинность в отношении BBB-R. В одном воплощении увеличения воздействия на ЦНС антитела к CD19 человека измеряется как отношение количества антитела к CD19 человека, находящегося в ЦНС, относительно количества, находящегося в сыворотке после введения. В одном воплощении увеличения воздействия на ЦНС приводит к отношению больше, чем 0,1%. В одном воплощении увеличение воздействия на ЦНС антитела к CD19 человека измеряется относительно воздействия на ЦНС антитела к CD19 человека в отсутствие связанного антитела к BBB-R. В одном воплощении увеличение воздействия на ЦНС антитела к CD19 человека измеряется посредством визуализации. В одном воплощении увеличение воздействия на ЦНС антитела к CD19 человека измеряется посредством непрямых данных, таких как модификация одного или более чем одного физиологического симптома.

Предложен способ увеличения удерживания в ЦНС антитела к CD19 человека, введенного субъекту, при котором антитело к CD19 человека связано с антителом или фрагментом антитела, которое связывается с BBB-R с низкой аффинностью, таким образом, что увеличивается удерживания в ЦНС антитела к CD19 человека.

В другом воплощении в данном документе предложен способ оптимизации для того, чтобы фармакокинетика и/или фармакодинамика антитела к CD19 человека была эффективной в ЦНС субъекта, где антитело к CD19 человека связано с антителом или фрагментом антитела, который связывается с BBB-R с низкой аффинностью, при этом антитело или фрагмент антитела выбран таким образом, что его аффинность в отношении BBB-R после связывания с антителом к CD19 человека приводит уровню транспорта антитела или фрагмента антитела, конъюгированного с антителом к CD19 человека через ВВВ, который оптимизирует фармакокинетику и/или фармакодинамику антитела к CD19 человека в ЦНС.

В другом воплощении в данном документе предложен способ лечения неврологического расстройства у млекопитающего, включающий лечение млекопитающего антителом или фрагментом антитела, который связывается с BBB-R, и который связан с антителом к CD19 человека, где данное антитело было выбрано так, чтобы иметь низкую аффинность в отношении BBB-R, и, посредством этого, улучшает поглощение в ЦНС антитела и связанного антитела к CD19 человека. В одном воплощении лечение приводит к уменьшению или устранению симптомов расстройства. В другом аспекте лечение приводит к уменьшению интенсивности неврологического расстройства.

В одном воплощении всех предыдущих аспектов антитело к BBB-R имеет IC₅₀ в отношении BBB-R от примерно 1 нМ до примерно 100 мкМ. В другом таком воплощении IC₅₀ составляет от примерно 5 нМ до примерно 100 мкМ. В другом таком воплощении IC₅₀ составляет от примерно 50 нМ до примерно 100 мкМ. В другом таком воплощении IC₅₀ составляет от примерно 100 нМ до примерно 100 мкМ. В другом воплощении антитело имеет аффинность в отношении BBB-R от примерно 5 нМ до примерно 10 мкМ. В другом воплощении, при связывании с антителом к CD19 человека, антитело имеет аффинность в отношении BBB-R от примерно 30 нМ до примерно 1 мкМ. В другом воплощении, при связывании с антителом к CD19 человека, антитело имеет аффинность в отношении BBB-R от примерно 50 нМ до примерно 1 мкМ. В одном воплощении аффинность антитела к BBB-R или слитого полипептида антитела к CD19 человека в отношении BBB-R измеряется с использованием анализа Скэтчарда. В другом воплощении аффинность антитела к BBB-R или слитого полипептида антитела к CD19 человека в отношении BBB-R измеряется с использованием анализа BIACORE. В другом воплощении аффинность антитела к BBB-R или слитого полипептида антитела к CD19 человека в отношении BBB-R измеряется с использованием конкурентного ELISA.

В другом воплощении слитый полипептид антитела к CD19 человека является меченым. В другом воплощении антитело к BBB-R или фрагмент не ухудшают связывания BBB-R с одним или более чем одним из его природных лигандов. В другом воплощении антитело к BBB-R специфично связывается с hTfR таким образом, что оно не ингибирует связывания hTfR с человеческим трансферрином. В другом воплощении слитый полипептид антитела к CD19 человека вводится млекопитающему. В другом воплощении млекопитающее представляет собой человека. В другом воплощении млекопитающее имеет неврологическое расстройство. В другом воплощении неврологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из болезни Альцгеймера (AD), инсульта, деменции, мышечной дистрофии (MD), рассеянного склероза (MS), бокового амиотрофического склероза (ALS), муковисцидоза, синдрома Эйнджелмена, синдрома Лиддла, болезни Паркинсона, болезни Пика, болезни Пэджета, рака и травматического поражения мозга.

Нековалентные комплексы в качестве челноков гематоэнцефалического барьера

Одной частью нековалентного комплекса является челночный модуль гематоэнцефалического барьера (челночный модуль ВВВ), который представляет собой биспецифичное антитело с первой специфичностью связывания в отношении гаптена и второй специфичностью связывания в отношении рецептора гематоэнцефалического барьера (BBBR). Такой челночный модуль ВВВ распознает способную подвергаться трансцитозу мишень поверхности клетки на гематоэнцефалическом барьере (такую как TfR, LRP или другие мишени - BBB-R) и одновременно связывает гаптенилированное антитело к CD19 человека.

Более подробно, антитело, которое специфично связывается с CD19 человека, конъюгируется с гаптеном и комплексируется посредством гаптенсвязывающего сайта челнока гематоэнцефалического барьера. Данный комплекс является определенным и стабильным, и специфично доставляет гаптенилированное антитело, которое специфично связывается с CD19 человека, через гематоэнцефалический барьер. Поскольку гаптенилированное антитело, которое специфично связывается с CD19 человека, является нековалентно комплексированным челноком гематоэнцефалического барьера, данное гаптенилированное антитело, которое специфично связывается с CD19 человека, с одной стороны, связывается с его носителем для доставки (соответствует челноку гематоэнцефалического барьера, соответствует биспецифичному антителу) на протяжении его времени нахождения в кровотоке, но, с другой стороны, также может эффективно высвобождаться после трансцитоза. Конъюгирование с гаптеном может осуществляться без препятствования активности антитела, которое специфично связывается с CD19 человека. Челнок гематоэнцефалического барьера не содержит необычного ковалентного присоединения и, следовательно, избавлен от какого-либо риска иммуногенности. Комплексы гаптенилированного антитела, которое специфично связывается с CD19 человека, с биспецифичным антителом, содержащим гаптенспецифичные сайты связывания, придают благоприятные биофизические характеристики антителу, которое специфично связывается с CD19 человека. Кроме того, такие комплексы способны адресовать груз в клетки или ткани, которые демонстрируют антиген, который распознается второй специфичностью связывания биспецифичного антитела.

Антитело, которое специфично связывается с CD19 человека, сохраняет его функциональность, несмотря на гаптенилирование, а также при комплексировании челноком гематоэнцефалического барьера (биспецифичным антителом). Кроме того, сайт связывания биспецифичного антитела с рецептором гематоэнцефалического барьера сохраняет его специфичность связывания и аффинность в присутствии комплексированного гаптенилированного антитела, которое специфично связывается с CD19 человека. Комплексы гаптенилированного антитела, которое специфично связывается с CD19 человека, с биспецифичным антителом, как описано в данном документе, можно использовать для направленной доставки антитела, которое специфично связывается с CD19 человека, специфично в клетки, которые экспрессируют рецептор гематоэнцефалического барьера. Поскольку гаптенилированное антитело, которое специфично связывается с CD19 человека, нековалентно связано с биспецифичным антителом, антитело, которое специфично связывается с CD19 человека, может высвобождаться после интернализации или трансцитоза.

В другом аспекте антитело к CD19 человека согласно любому из приведенных выше воплощений может включать любые из характеристик, одиночно или в комбинации, как описано в Разделах 1-5 ниже.

1. Аффинность антитела

В некоторых воплощениях антитело, предложенное в данном документе, имеет значение K_D, меньшее или равное 1 мкМ, меньшее или равное 100 нМ, или меньшее или равное 10 нМ (например, 10^-8 М или меньше, например, от 10^-7 М до 10^-8 М).

Например, K_D можно измерять с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса BIACORE^®. Анализ с использованием BIACORE^®-2000 или BIACORE^®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) проводится при 25°С с чипами СМ5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU). Биосенсорные чипы на основе карбоксиметилированного декстрана (СМ5, BIACORE, Inc.) активируются N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разводится 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией при скорости тока 5 мкл/минуту для достижения приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После инъекции антигена инъецируется 1 М этаноламин для блокирования непрореагировавших групп. Для измерений кинетики инъецируются двухкратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) с 0,05% поверхностно-активного вещества полисорбат 20 (TWEEN-20^TM) (PBST) при 25°С при скорости тока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) рассчитываются с использованием простой модели связывания один к одному Лангмюра (BIACORE ^® Evaluation Software, версия 3.2) посредством одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесная константа диссоциации (K_D) рассчитывается как отношение k_off/k_on (см., например, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881).

2. Фрагменты антител

В некоторых воплощениях антитело, предложенное в данном документе, представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антитела включают фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv и scFv, и другие фрагменты, описанные ниже, но не ограничиваются ими. Для обзора определенных фрагментов антитела, см. Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Для обзора фрагментов scFv см., например, Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315; см. также WO 93/16185; US 5571894 и US 5587458. Для обсуждения фрагментов Fab и F(ab')₂, содержащих остатки эпитопа, связываемого рецептором утилизации и имеющих повышенные периоды полувыведения in vivo, см. US 5869046.

Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифичными. См., например, EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; и Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Триатела и тетратела также описываются в Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134).

Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи антитела или его часть, или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В некоторых воплощениях однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (Domantis, Inc., Waltham, MA; см., например, US 6248516).

Фрагменты антитела могут быть получены разными методиками, включающими протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продукцию рекомбинантными клетками-хозяевами (например, E. coli или фагом), но не ограничивающимися ими, как описано в данном документе.

3. Химерные и гуманизированные антитела

Антитело, предложенное в данном документе, представляет собой химерное антитело. Определенные химерные антитела описываются, например, в US 4816567; и Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). В одном примере химерное антитело содержит вариабельную область, не являющуюся человеческой (например, вариабельную область, происходящую от мыши, крысы, хомяка, кролика или примата, не являющегося человеком, такого как обезьяна), и человеческую константную область. В другом воплощении химерное антитело представляет собой антитело «с переключением класса», у котрого класс или подкласс был изменен от класса или подкласса родительского антитела. Химерные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.

Гуманизированное антитело представляет собой химерное антитело. Типично антитело, не являющееся человеческим, гуманизируют для уменьшения иммуногенности у человека, при сохранении специфичности и аффинности родительского антитела, не являющегося человеческим. В общем, гуманизированное антитело содержит один или более чем один вариабельный домен, в котором HVR, например, CDR (или их части) происходят из антитела, не являющегося человеческим, и FR (или их части) происходят из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело возможно также будет содержать по меньшей мере часть человеческой константной области. В некоторых воплощениях некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками из антитела, не являющегося человеческим (например, антитела, из которого происходят остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

Обзор гуманизированных антител и способов их получения делается, например, в Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 и дополнительно описывается, например, в Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5821337, US 7527791, US 6982321 и US 7087409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (описывающей пересадку области, определяющей специфичность (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (описывающей «изменение поверхности (вариабельного домена)»); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (описывающей «перетасовку FR»); и Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 и Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (описывающей подход «направленного отбора» для перетасовки FR).

Человеческие каркасные области, которые можно использовать для гуманизации, включают каркасные области, отобранные с использованием способа «наилучшей аппроксимации» (см., например, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; каркасные области, происходящие из консенсусной последовательности вариабельных областей легкой или тяжелой цепи конкретной подгруппы человеческих антител (см., например, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; и Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); человеческие зрелые (соматически мутировавшие) каркасные области или человеческие каркасные области зародышевой линии (см., например, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); и каркасные области, полученные в результате скрининга библиотек FR (см., например, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 и Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618), но не ограничиваются ими.

4. Мультиспецифичные антитела

В некоторых воплощениях антитело, предложенное в данном документе, представляет собой мультиспецифичное антитело, например, биспецифичное антитело. Мультиспецифичные антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности связывания в отношении по меньшей мере двух разных сайтов. В некоторых воплощениях одна из специфичностей связывания направлена в отношении CD19 человека, и другая - в отношении любого другого антигена. В некоторых воплощениях биспецифичные антитела могут связываться с двумя разными эпитопами CD19 человека. Биспецифичные антитела также могут использоваться для локализации цитотоксических агентов в клетках, которые экспрессируют CD19 человека. Биспецифичные антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

Методики получения мультиспецифичных антител включают рекомбинантную соэкспрессию двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, имеющих разные специфичности (см. Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829 и Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), и генетическую инженерию «выступ во впадину» (см., например, US 5731168). Мультиспецифичные антитела также можно получать инженерией эффектов электростатического наведения для получения Fc-гетеродимерных молекул антитела (WO 2009/089004); поперечным связыванием двух или более чем двух антител или фрагментов (см., например, US 4676980 и Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); применением лейциновых молний для получения биспецифичных антител (см., например, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; применением технологии «диатела» для получения биспецифичных фрагментов антител (см., например, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); применением димеров одноцепочечных Fv (sFv) (см., например, Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); и получением триспецифичных антител, как описано, например, в Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).

В данный документ также включены генетически модифицированные антитела с тремя или более чем тремя функциональными антигенсвязывающими сайтами, включающие «антитела-осьминоги» (см., например, US 2006/0025576).

Антитело или фрагмент в данном документе также включает «Fab двойного действия» или «DAF», содержащий антигенсвязывающий сайт, который связывается с CD19 человека, а также с другим, отличным антигеном (см., например, US 2008/0069820).

Антитело или фрагмент в данном документе также включает мультиспецифичные антитела, описанные в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2010/145793.

5. Варианты антител

В некоторых воплощениях рассматриваются предложенные в данном документе варианты аминокислотной последовательности антител. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела могут быть получены введением подходящих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или посредством пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции из и/или вставки в, и/или замены остатков в пределах аминокислотных последовательностей антитела. Можно сделать любую комбинацию делеции, вставки и замены для получения конечной конструкции, при условии, что данная конечная конструкция обладает желательными характеристиками, например, связывания антигена.

а) Варианты с заменой, вставкой и делецией

В некоторых воплощениях предложены варианты антитела, имеющие одну или более чем одну аминокислотную замену. Интересующие сайты для мутагенеза, приводящего к заменам, включают HVR и FR. Консервативные замены показаны в Таблице ниже под заголовком «предпочтительные замены». В Таблице 1 предложены более существенные замены под заголовком «типичные замены», и, как описано далее ниже по отношению к классам боковых цепей аминокислот. В интересующее антитело могут быть введены аминокислотные замены, и продукты подвергаются скринингу в отношении желательной активности, например, сохраненного/улучшенного связывания антигена, пониженной иммуногенности или улучшенной ADCC или CDC.

Исходный остаток	Типичные замены	Предпочти-тельные замены
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин	Leu
Leu (L)	норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин	Leu

Аминокислоты могут быть сгруппированы согласно общим свойствам боковой цепи:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислотные: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены будут влечь за собой замену члена одного из данных классов на другой класс.

Один тип варианта с заменами включает замену одного или более чем одного остатка гипервариабельной области родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). В общем, полученный(ные) в результате вариант(ты), отобранный(ные) для дальнейшего исследования, будет(дут) иметь модификации (например, улучшения) некоторых биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) относительно родительского антитела и/или будет(дут) иметь по существу сохраняющиеся определенные биологические свойства родительского антитела. Типичным вариантом с заменами является антитело с созревшей аффинностью, которое может быть с удобством получено, например, с использованием методик созревания аффинности на основе дисплея, таких как методики, описанные в данном документе. Вкратце, один или более чем один остаток HVR мутируется, варианты антитела подвергаются дисплею на фаге и подвергаются скринингу на определенную биологическую активность (например, аффинность связывания).

Изменения (например, замены) могут быть сделаны в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения могут быть сделаны в «горячих точках» HVR, т.е. остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации во время процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), и/или остатках, которые контактируют с антигеном, причем полученные в результате варианты VH или VL тестируются на аффинность связывания. Созревание аффинности посредством конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек было описано, например, в Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. В некоторых воплощениях созревания аффинности в выбранные для созревания вариабельные гены вводится разнообразие посредством любого из целого ряда способов (например, ПЦР (полимеразная цепная реакция), склонная к ошибкам, перетасовка цепи или мутагенез, управляемый олигонуклеотидом). Затем создается вторичная библиотека. Данная библиотека затем подвергается скринингу для идентификации любых вариантов антитела с желательной аффинностью. Другой способ введения разнообразия включает подходы, направленные на HVR, в которых рандомизируются несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков за раз). Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, могут быть специфично идентифицированы, например, с использованием мутагенеза на основе аланинового сканирования или моделирования. В частности, часто в качестве мишени используются CDR-H3 и CDR-L3.

В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции могут происходить в пределах одной или более чем одной HVR, при условии, что такие изменения по существу не уменьшают способность антитела к связыванию антигена. Например, в HVR могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, как предложено в данном документе), которые по существу не уменьшают аффинность связывания. Такие изменения, например, могут быть вне остатков, контактирующих с антигеном в HVR. В некоторых воплощениях вариантов последовательностей VH и VL, предложенных выше, каждая HVR либо является неизменной, либо содержит не больше, чем одну, две или три аминокислотные замены.

Полезный способ идентификации остатков или областей антитела, которые могут служить в качестве мишени для мутагенеза, называется «мутагенезом на основе аланинового сканирования», как описано Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. В данном способе остаток или группа остатков-мишеней (например, заряженных остатков, таких как Аrg, Аsp, Нis, Lys и Glu) идентифицируется и заменяется нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином) для определения того, подвергается ли влиянию взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замены могут быть введены в положениях аминокислот, демонстрирующих функциональную чувствительность к исходным заменам. В качестве альтернативы или дополнительно, может быть определена кристаллическая структура комплекса антиген-антитело для идентификации контактных точек между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут служить в качестве мишени или устраняться в качестве кандидатов для замены. Варианты могут быть подвергнуты скринингу для определения того, имеют ли они желательные свойства.

Вставки в аминокислотную последовательность включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более чем сто остатков, а также вставки внутри последовательности одиночных или многих аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело в N-концевым метионильным остатком. Другие вставочные варианты молекулы антитела включают слияние с N- или С-концом антитела фермента (например, для ADEPT (антителоопосредованная терапия с использованием ферментов и пролекарств)) или полипептида, который увеличивает период полувыведения антитела в сыворотке.

б) Варианты по гликозилированию

В некоторых воплощениях предложенное в данном документе антитело изменяют для увеличения или уменьшения степени, в которой гликозилируется антитело. Добавление или делеция сайтов гликозилирования в антителе могут с удобством осуществляться посредством изменения аминокислотной последовательности таким образом, что создается или удаляется один или более чем один сайт гликозилирования.

Когда антитело содержит область Fc, может быть изменен углевод, присоединенный к нему. Природные антитела, продуцированные клетками млекопитающих, типично содержат разветвленный двухантенный олигосахарид, который обычно присоединен N-связью к Asn297 домена СН2 области Fc. См., например, Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32. Данный олигосахарид может включать разные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стволе» структуры двухантенного олигосахарида. В некоторых воплощениях могут быть сделаны модификации олигосахарида в антителе, как описано в данном документе, для того, чтобы создать варианты антитела с некоторыми улучшенными свойствами.

В одном воплощении предложены варианты антитела, имеющие структуру углевода, в которой отсутствует фукоза, присоединенная (прямо или опосредованно) к области Fc. Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяется посредством расчета среднего количества фукозы в пределах цепи сахара на Asn297 относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn297 (например, сложных, гибридных и высокоманнозных структур), при измерении масс-спектрометрией MALDI-TOF (времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы), как описано, например, в WO 2008/077546. Asn297 относится к остатку аспарагина, расположеному примерно в положении 297 в области Fc (EU нумерация остатков области Fc согласно Kabat); однако, Asn297 также может быть расположен примерно в плюс/минус 3 аминокислотах выше или ниже положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, из-за минорных вариаций последовательности в антителах. Такие фукозилированные варианты могут иметь улучшенную функцию ADCC. См., например, US 2003/0157108; US 2004/0093621. Примеры публикаций, относящихся к «дефукозилированным» или «дефицитным по фукозе» вариантам антител включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Примеры линий клеток, способных продуцировать дефукозилированные антитела, включают клетки СНО (яичники китайского хомяка) Lec13, дефицитные по фукозилированию белка (Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108 и WO 2004/056312, особенно в Примере 11), и нокаутные линии клеток, такие как нокаутные клетки СНО по гену альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688 и WO 2003/085107).

Кроме того, предложены варианты антител с разделенными надвое олигосахаридами, например, в которых двухантенный олигасахарид, присоединенный к области Fc антитела, разделен надвое GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь пониженное фукозилирование и/или улучшенную функцию ADCC. Примеры таких вариантов антител описываются, например, в WO 2003/011878; US 6602684 и US 2005/0123546. Также предложены варианты антител с по меньшей мере одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к области Fc. Такие варианты антител могут иметь улучшенную функцию CDC. Такие варианты антител описываются, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964 и WO 1999/22764.

в) Варианты области Fc

В некоторых воплощениях в область Fc антитела, предложенного в данном документе, могут быть введены одна или более чем одна аминокислотная модификация, генерируя, посредством этого, вариант области Fc. Данный вариант области Fc может содержать последовательность человеческой области Fc (например, области Fc человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или более чем одном положении аминокислоты.

В некоторых воплощениях в данном документе предложен вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, которые делают его желательным кандидатом для применений, в которых важным является период полувыведения антитела in vivo, тем не менее, определенные эффекторные функции (такие как комплемент и ADCC) не являются необходимыми или являются вредными. Могут проводиться анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo для подтверждения уменьшения/устранения активностей CDC и/или ADCC. Например, анализы связывания с рецептором Fc (FcR) могут проводиться для обеспечения того, что у антитела отсутствует связывание с FcγR (следовательно, вероятно отсутствует активность ADCC), но сохраняется способность к связыванию с FcRn. У первичных клеток для опосредования ADCC - клеток NK - экспрессируется только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках обобщена в Таблице 3 на странице 464 Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Неограничивающие примеры анализов in vitro для оценки активности ADCC интересующей молекулы описываются в US 5500362 (см., например, Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063 и Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); US 5821337 (см. Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). В качестве альтернативы, можно использовать способы нерадиоактивного анализа (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96^® (Promega, Madison, WI). Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают одноядерные клетки периферической крови (РВМС) и клетки-природные киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно, активность ADCC интересующей молекулы можно оценивать in vivo, например, в такой животной модели, как модель, раскрытая в Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Также можно проводить анализы связывания C1q для подтверждения того, что антитело не способно связываться с C1q и, следовательно, не имеет активности CDC. См., например, ELISA связывания C1q и C3c в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052 и Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). Связывание с FcRn и определения клиренса/периода полувыведения in vivo также можно проводить с использованием способов, известных в данной области (см., например, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769).

Антитела с пониженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или более чем одного остатка области Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (US 6737056). Такие мутанты Fc включают мутантов Fc с заменами в двух или более чем двух положениях аминокислот 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант Fc «DANA» с заменой остатков 265 и 297 на аланин (US 7332581).

Описаны некоторые варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcR. (См., например, US 6737056; WO 2004/056312 и Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

В некоторых воплощениях вариант антитела содержит область Fc с одной или более чем одной аминокислотной заменой, которая улучшает ADCC, например, с заменами в положениях 298, 333 и/или 334 области Fc (EU нумерация остатков).

В некоторых воплощениях в области Fc делаются изменения, которые приводят к измененным (т.е. либо улучшенным, либо уменьшенным) связыванию с C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в US 6194551, WO 99/51642 и Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.

Антитела с увеличенными периодами полувыведения и улучшенным связыванием с неонатальным рецептором Fc (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG в плод (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593 и Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), описываются в US 2005/0014934. Данные антитела содержат область Fc c одной или более чем одной заменой в ней, которая улучшается связывание области Fc с FcRn. Такие варианты Fc включают варианты с заменами в одном или более чем одном остатке Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, с заменой остатка 434 области Fc (US 7371826).

См. также Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5648260; US 5624821 и WO 94/29351 относительно других примеров вариантов области Fc.

г) Варианты антител, модифицированные по цистеину

В некоторых воплощениях может быть желательным создание антител, модифицированных по цистеину, например, «тиоМАб», в которых один или более чем один остаток антитела заменен остатками цистеина. В конкретных воплощениях замененные остатки встречаются в доступных сайтах антитела. Посредством замены данных остатков на цистеин реакционноспособные тиольные группы располагаются в доступных сайтах антитела и могут быть использованы для конъюгирования антитела с другими группировками, такими как группировки лекарственных средств или группировки линкер-лекарственное средство, с созданием иммуноконъюгата, как описано в данном документе далее. В некоторых воплощениях любой один или более чем один из следующих остатков может быть заменен на цистеин: V205 (нумерация по Kabat) легкой цепи; А118 (нумерация EU) тяжелой цепи и S400 (нумерация EU) тяжелой цепи области Fc. Антитела, модифицированные по цистеину, могут быть получены, как описано, например, в US 7521541.

д) Производные антител

В некоторых воплощениях предложенное в данном документе антитело может быть дополнительно модифицировано так, чтобы оно содержало дополнительные небелковые группировки, которые известны в данной области и являются легко доступными. Группировки, подходящие для дериватизации антитела, включают водорастворимые полимеры, но не ограничиваются ими. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1, 3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси, но не ограничиваются ими. Полиэтиленгликольпропиональдегид может иметь преимущества в производстве из-за его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и, при присоединении более чем одного полимера, они могут быть одинаковыми или разными молекулами. В общем, число и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, могут определяться на основе соображений, включающих конкретные свойства или функции антитела, подлежащие улучшению, но не ограничивающиеся ими, независимо от того, будет ли производное антитела использоваться в терапии при определенных условиях, и т.д.

В другом воплощении предложены конъюгаты антитела и небелковой группировки, которая может быть селективно нагрета под воздействием радиации. В одном воплощении небелковая группировка представляет собой углеродную нанотрубку (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Радиация может иметь любую длину волны и включает длины волн, которые не причиняют вреда обычным клетках, но которые нагревают небелковую группировку до температуры, при которой умерщвляются клетки, приближенные к небелковой группировке антитела, но не ограничивается ими.

Б. Способы и композиции генной инженерии

Антитела могут быть получены с использованием способов и композиций генной инженерии, например, как описано в US 4816567. В одном воплощении предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к CD19 человека, описанное в данном документе. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VН антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). В другом воплощении предложен один или более чем один вектор (например, экспрессионный вектор), содержащий такую нуклеиновую кислоту. В другом воплощении предложена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном таком воплощении клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована): (1) вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VН антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VН антитела. В одном воплощении клетка-хозяин является эукариотической, например, клеткой яичника китайского хомяка (СНО) или лимфоидной клеткой (например, клеткой Y0, NS0, Sp20). В одном воплощении предложен способ получения антитела к CD19 человека, где данный способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, как предложено выше, при подходящих условиях для экспрессии антитела и, возможно, выделение антитела из клетки-хозяина (или культуральной среды клеток-хозяев).

Для рекомбинантной продукции антитела к CD19 человека нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, как описано выше, выделяют и вставляют в один или более чем один вектор для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такую нуклеиновую кислоту можно легко выделять и секвенировать с использованием традиционных методик (например, посредством применения олигонуклеотидных зондов, которые способны к специфичному связыванию с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).

Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают прокариотические или эукариотические клетки, описанные в данном документе. Например, антитела могут быть продуцированы в бактериях, в частности, когда не требуются гликозилирование и эффекторная функция Fc. Относительно экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях, см., например, US 5648237, US 5789199 и US 5840523. (См. также Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, описывающую экспрессию фрагментов антитела в E. coli.). После экспрессии антитело может быть выделено из пасты бактериальных клеток в растворимой фракции и может быть дополнительно очищено.

Помимо прокариотов, подходящими хозяевами клонирования или экспрессии для векторов, кодирующих антитело, являются эукариотические микробы, такие как нитчатые грибки или дрожжи, включающие штаммы грибков и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», приводя к продукции антитела с частично или полностью человеческой картиной гликозилирования. См. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414 и Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела также происходят из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток безпозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, которые можно использовать в сочетании с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

Культуры клеток растений также можно использовать в качестве хозяев. См., например, US 5959177, US 6040498, US 6420548, US 7125978 и US 6417429 (описывающие технологию PLANTIBODIES^TM для продуцирования антител в трансгенных растениях).

В качестве хозяев также можно использовать клетки позвоночных. Например, могут быть полезными линии клеток млекопитающих, которые адаптированы для роста в суспензии. Другими примерами полезных линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7); линия эмбриональной почки человека (293 или клетки 293, как описано, например, в Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); клетки эмбриональной почки хомяка (BHK); мышиные клетки сертоли (клетки ТМ4, как описано, например, в Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени серой крысы (BRL 3A); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, как описано, например, в Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие полезные линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), включающие клетки СНО DHFR^- (негативные по дегидрофолатредуктазе) (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220), и миеломные линии клеток, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Относительно обзора определенных линий клеток-хозяев млекопитающих, подходящих для продукции антител, см., например, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.

В. Анализы

Предложенные в данном документе антитела к CD19 человека могут быть идентифицированы, подвергнуты скринингу или охарактеризованы на их физические/химические свойства и/или биологические активности посредством разных анализов, известных в данной области.

1. Анализы связывания и другие анализы

В одном аспекте антитело, как описано в данном документе, тестируется на его активность связывания антигена, например, известными способами, такими как ELISA, вестерн-блоттинг и т.д.

2. Анализы активности

В одном аспекте предложены анализы для идентификации антител к CD19 человека, имеющих биологическую активность. Биологическая активность может включать, например, ингибирование пролиферации В-клеток или умерщвление В-клеток. Также предложены антитела, имеющие такую биологическую активность in vivo и/или in vitro.

В некоторых воплощениях антитело, как описано в данном документе, тестируется на такую биологическую активность.

Г. Иммуноконъюгаты

В данном документе также предложены иммуноконъюгаты, содержащие антитело к CD19 человека, как описано в данном документе, конъюгированное с одним или более чем одним цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтические агенты или лекарственные средства, агенты, ингибирующие рост, токсины (например, белковые токсины, ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.

В одном воплощении иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), в котором антитело конъюгировано с одним или более чем одним лекарственным средством, включающим майтансиноид (см. US 5208020, US 5416064 и EP 0 425 235 B1); ауристатин, такой как монометильные лекарственные группировки ауристатина DE и DF (MMAE и MMAF) (см. US 5635483, US 5780588 и US 7498298); доластатин; калихеамицин или его производное (см. US 5712374, US 5714586, US 5739116, US 5767285, US 5770701, US 5770710, US 5773001 и US 5877296; Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342 и Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); антрациклин, такой как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343 и US 6630579); метотрексат; виндезин; таксан, такой как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел; трихотецен и СС1065, но не ограничивающимся ими.

В другом воплощении иммуноконъюгат содержит антитело, как описано в данном документе, конъюгированное с ферментативно активным токсином или его фрагментом, включающим цепь А дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модексина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca аmericana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Saponaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены, но не ограничивающимся ими.

В другом воплощении иммуноконъюгат содержит антитело, как описано в данном документе, конъюгированное с радиоактивным атомом, с образованием радиоконъюгата. Для получения радиоконъюгатов доступен целый ряд радиоактивных изотопов. Примеры включают At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu. При использовании радиоконъюгата для выявления, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, TC^99m или I¹²³, или спиновую метку для визуализации посредством ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известного как магнитно-резонансная томография), такую как опять-таки йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.

Конъюгаты антитела и цитотоксического агента можно получать с использованием целого ряда бифункциональных агентов связывания с белком, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол 2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин может быть получен, как описано в Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104. Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой типичный хелатирующий агент для конъюгирования радионуклеида с антителом. См. WO 94/11026. Линкер может представлять собой «расщепляемый линкер», облегчащий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно использовать кислотолабиьный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фотолабильный линкер, диметильный линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; US 5208020).

Среди иммуноконъюгатов или ADC в данном документе прямо рассматриваются конъюгаты, полученые с использованием поперечносвязывающих реактивов, но не ограничивающиеся ими, включающие BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), но не ограничивающиеся ими, которые имеются в продаже (например, у Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., США).

Д. Способы и композиции для диагностики и выявления

В некоторых воплощениях любое из предложенных в данном документе антител к CD19 человека является полезным для выявления присутствия клеток, презентирующих CD19 человека, в биологическом образце. Термин «выявление» в том виде, в котором он используется в данном документе, охватывает количественное или качественное выявление. В некоторых воплощениях биологический образец содержит клетку или ткань, такую как, например, кровь, сыворотку крови или плазму крови.

В одном воплощении предложено антитело к CD19 человека для применения в способе диагностики или выявления. В другом аспекте предложен способ выявления присутствия клеток, презентирующих CD19 человека, в биологическом образце. В некоторых воплощениях данный способ включает приведение биологического образца в контакт с антителом к CD19 человека, как описано в данном документе, при пермиссивных условиях для связывания антитела к CD19 человека с CD19 человека и выявление того, образуется ли комплекс между антителом к CD19 человека и CD19 человека. Такой способ может представлять собой способ in vitro или in vivo. В одном воплощении антитело к CD19 человека используется для отбора субъектов, подходящих для терапии антителом к CD19 человека, например, где CD19 человека представляет собой биомаркер для отбора пациентов.

Типичные расстройства, которые можно диагностировать с использованием антитела, как описано в данном документе, включают В-клеточные раковые заболевания, такие как B-клеточная лимфома и B-клеточные лейкозы, за исключением множественной миеломы, например, неходжкинскую лимфому и острый лимфобластный лейкоз. В некоторых воплощениях предложены меченые антитела к CD19 человека. Метки включают метки или группировки, которые выявляются непосредственно (такие как флуоресцентные, хромофорные, элекронноплотные, хемилюминисцентные и радиоативные метки), а также группировки, такие как ферменты или лиганды, которые выявляются опосредованно, наример, через ферментативную реакцию или молекулярное взаимодействие, но не ограничиваются ими. Типичные метки включают радиоизотопы ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H и ¹³¹I, флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и их производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люциферазу светляка и бактериальную люциферазу (US 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, гетероциклические оксидазы, такие как уриказу и ксантиноксидазу, связанные с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника красителя, таким как HRP (пероксидаза хрена), лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы и тому подобное, но не ограничиваются ими.

Е. Фармацевтические препараты

Фармацевтические препараты антитела к CD19 человека, как описано в данном документе, получают смешиванием такого антитела, имеющего желательную степень чистоты, с одним или более чем одним возможным фармацевтически приемлемым носителем (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th edition, Osol, A. (ed.) (1980)), в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Фармацевтически премлемые носители обычно являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях и включают: буферы, такие как фосфатный, цитратный и на основе других органических кислот; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензэтония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (меньше, чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поли(винилпирролидон); аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; хелаторы, такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG), но не ограничиваются ими. Типичные фармацевтически приемлемые носители в данном документе дополнительно включают агенты для диспергирования лекарственного средства в кишечнике, такие как растворимые нейтрально-активные гиалуронидазные гликопротеины (sHASEGP), например, человеческие растворимые гиалуронидазные гликопротеины РН-20, такие как rhuPH20 (HYLENEX^®, Baxter International, Inc.). Некоторые типичные sHASEGP и способы применения, включая rhuPH20, описываются в US 2005/0260186 и US 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP объединяется с одной или более чем одной дополнительной гликозаминогликаназой, такой как хондроитиназа.

Типичные лиофилизированные препараты антител описываются в US 6267958. Водные препараты антител включают препараты, описанные в US 6171586 и WO 2006/044908, причем последние препараты включают гистидин-ацетатный буфер.

Описанный в данном документе препарат также может содержать более, чем один активный ингредиент, необходимый для конкретного показания, которое лечат, предпочтительно ингредиенты с взаимодополняющими активностями, которые не оказывают вредного влияния друг на друга. Такие активные ингредиенты, подходящим образом, присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для намеченной цели.

Активные ингредиенты могут быть захвачены в микрокапсулы, полученные, например, методиками коацервации или посредством полимеризации на границе раздела фаз, например, в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и в поли-(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственного средства (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th edition, Osol, A. (ed.) (1980).

Могут быть получены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, которые находятся в виде формованных предметов, например, пленок или микрокапсул.

Препараты, подлежащие применению для введения in vivo, обычно являются стерильными. Стерильность может легко достигаться, например, посредством фильтрования через мембраны для стерилизующего фильтрования.

Ж. Терапевтические способы и композиции

Любое из предложенных в данном документе антител к CD19 человека можно использовать в терапевтических способах либо одно, либо в комбинации, либо в виде моноспецифичного антитела, либо в виде мультиспецифичного антитела.

CD19 экспрессируется на большинстве В-клеток (пан-В-клеточный маркер), за исключением стволовых клеток и плазматических клеток, и часто экспрессируется при большинстве человеческих В-клеточных злокачественных заболеваниях (антиген, ассоциированный с опухолью), таких как лимфома и лейкозы, за исключением множественной миеломы, например, при неходжкинской лимфоме и остром лимфобластном лейкозе.

Биспецифичные антитела, распознающие два белка поверхности клетки на разных популяциях клеток, имеют потенциал перенаправления цитотоксических иммунных клеток для разрушения патогенных клеток-мишеней.

В одном аспекте предложено антитело к CD19 человека для применения в качестве лекарственного средства. В других аспектах предложено антитело к CD19 человека для применения в лечении В-клеточного рака. В некоторых воплощениях предложено антитело к CD19 человека для применения в способе лечения. В некоторых воплощениях в данном документе предложено антитело к CD19 человека для применения в способе лечения индивида, имеющего В-клеточный рак, включающем введение данному индивиду эффективного количества антитела к CD19 человека. В одном таком воплощении данный способ дополнительно включает введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. В других воплощениях в данном документе предложено антитело к CD19 человека для применения в истощении популяций В-клеток. В некоторых воплощениях в данном документе предложено антитело к CD19 человека для применения в способе истощения популяций В-клеток у индивида, включающем введение данному индивиду эффективного количества антитела к CD19 человека для истощения популяций В-клеток. «Индивид» согласно любому из приведенных выше воплощений предпочтительно представляет собой человека. В-клеточный рак в одном воплощении представляет собой В-клеточную лимфому или В-клеточный лейкоз. В одном воплощении В-клеточный рак представляет собой неходжкинскую лимфому или острый лимфобластный лейкоз.

В других аспектах предложено антитело к CD19 человека для применения в иммунотерапии рака. В некоторых воплощениях предложено антитело к CD19 человека для применения в способе иммунотерапии рака. «Индивид» согласно любому из приведенных выше воплощений предпочтительно представляет собой человека.

В другом аспекте в данном документе предложено применение антитела к CD19 человека в изготовлении или получении лекарственного средства. В одном воплощении данное лекарственное средство предназначено для лечения В-клеточного рака. В другом воплощении лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения В-клеточного рака, включающем введение индивиду, имеющему В-клеточный рак, эффективного количества лекарственного средства. В одном таком воплощении данный способ дополнительно включает введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, как описано ниже. В другом воплощении лекарственное средство предназначено для истощения популяции В-клеток. В другом воплощении лекарственное средство служит для применения в способе истощения популяции В-клеток у индивида, включающем введение индивиду эффективного количества лекарственного средства для истощения популяции В-клеток. «Индивид» согласно любому из приведенных выше воплощений может представлять собой человека. В-клеточный рак в одном воплощении представляет собой В-клеточную лимфому или В-клеточный лейкоз. В одном воплощении В-клеточный рак представляет собой неходжкинскую лимфому или острый лимфобластный лейкоз.

В другом аспекте в данном документе предложен способ лечения В-клеточного рака. В одном воплощении данный способ включает введение индивиду, имеющему такой В-клеточный рак, эффективного количества антитела к CD19 человека. В одном таком воплощении данный способ дополнительно включает введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, как описано ниже. «Индивид» согласно любому из приведенных выше воплощений может представлять собой человека. В-клеточный рак в одном воплощении представляет собой В-клеточную лимфому или В-клеточный лейкоз. В одном воплощении В-клеточный рак представляет собой неходжкинскую лимфому или острый лимфобластный лейкоз.

В другом аспекте в данном документе предложен способ истощения популяции В-клеток у индивида. В одном воплощении данный способ включает введение индивиду эффективного количества антитела к CD19 человека для истощения популяции В-клеток. В одном воплощении «индивид» представляет собой человека. В-клеточный рак в одном воплощении представляет собой В-клеточную лимфому или В-клеточный лейкоз. В одном воплощении В-клеточный рак представляет собой неходжкинскую лимфому или острый лимфобластный лейкоз.

В другом аспекте в данном документе предложены фармацевтические препараты, содержащие любое из антител к CD19 человека, как описано в данном документе, например, для применения в любом из вышеупомянутых терапевтических способов. В одном воплощении фармацевтический препарат содержит любое из антител к CD19 человека, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом воплощении фармацевтический препарат содержит любое из антител к CD19 человека, как описано в данном документе, и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент.

Антитела, как описано в данном документе, можно использовать в терапии либо одни, либо в комбинации с другими агентами. Например, антитело, как описано в данном документе, можно вводить совместно с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом.

Такие комбинированные терапии, отмеченные выше, охватывают комбинированное введение (где два или более чем два терапевтических агента включаются в тот же самый или в отдельные препараты) и раздельное введение, причем в данном случае введение антитела, как описано в данном документе, может происходить до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента или агентов. В одном воплощении введение антитела к CD19 человека и введение дополнительного терапевтического агента происходит в пределах примерно одного месяца или в пределах примерно одной, двух или трех недель, или в пределах примерно одних, двух, трех, четырех, пяти или шести суток друг от друга.

Антитело, как описано в данном документе (и любой дополнительный терапевтический агент), можно вводить любым подходящим способом, включающим парентеральное, внутрилегочное и интраназальное введение, и, если это желательно для местного лечения, введение в область поражения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование может осуществляться любым подходящим путем, например, посредством инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, отчасти в зависимости от того, является ли введение краткосрочным или хроническим. В данном документе рассматриваются разные схемы дозирования, включающие однократные или многократные введения на протяжении разных моментов времени, болюсное введение и импульсную инфузию, но не ограничивающиеся ими.

Антитела, как описано в данном документе, были бы приготовлены, дозированы и введены способом, согласующимся с надлежащей медицинской практикой. В данном контексте факторы для рассмотрения включают конкретное расстройство, которое лечат, конкретное млекопитающее, которое лечат, клиническое состояние индивидуального пациента, причину расстройства, место доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело не обязательно должно, но возможно приготовлено с одним или более чем одним агентом, используемым в настоящее время для предупреждения или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в препарате, типа расстройства или лечения и других факторов, обсуждавшихся выше. Они обычно используются в таких же дозировках и с использованием таких же путей введения, которые описаны в данном документе, или примерно от 1 до 99% от дозировок, описанных в данном документе, или в любой дозировке и посредством любого пути, который эмпирически/клинически определен как подходящий.

Для предупреждения или лечения заболевания подходящая дозировка антитела, как описано в данном документе (при применении его одного или в комбинации с одним или более чем одним другим дополнительным терапевтическим агентом), будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и хода заболевания, того, вводится ли антитело для предупредительных или терапевтических целей, предыдущей терапии, клинической истории и ответа на антитело пациента, и решения лечащего врача. Антитело подходящим образом вводится пациенту за один раз или на протяжении серии обработок. В зависимости от типа и тяжести заболевания, исходной дозировкой-кандидатом для введения пациенту может быть примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,5 мг/кг - 10 мг/кг) антитела, независимо от того, осуществляется ли она одним или более чем одним раздельным введением или посредством непрерывной инфузии. Одна типичная суточная дозировка может варьировать от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Для повторных введений на протяжении нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение обычно поддерживалось бы до желательного появления подавления симптомов заболевания. Одна типичная дозировка антитела находилась бы в интервале от примерно 0,05 мг/кг до примерно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту могла бы вводиться одна или более чем одна доза примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любая их комбинация). Такие дозы могут вводиться периодически, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, что пациент получает от примерно двух до примерно двадцати, например, примерно шесть доз антитела). Может вводиться исходная более высокая загрузочная доза, с последующими одной или более чем одной меньшими дозами. Однако могут быть полезными другие схемы дозировки. Прогресс данной терапии легко отслеживается традиционными методиками и анализами.

В данном документе дополнительно предложены способы лечения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, волчанки, псориаза и заболевания кости, включающие введение пациенту, диагностированному как имеющий такое заболевание (и, следовательно, нуждающемуся в такой терапии), антитела, специфично связывающегося с CD19 человека, как описано в данном документе. Данное антитело может вводиться одно, в фармацевтической композиции или, в качестве альтернативы, в комбинации с другими лекарственными средствами для лечения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, волчанки, псориаза или заболевания кости. Антитело вводится в фармацевтически эффективном количестве.

В данном документе дополнительно предложено применение антитела, как описано в данном документе, для лечения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, волчанки, псориаза или заболевания кости и для изготовления фармацевтической композиции, содержащей антитело, как описано в данном документе. Кроме того, в данном документе предложен способ изготовления фармацевтической композиции, содержащей антитело, как описано в данном документе.

В данном документе дополнительно предложено антитело, как описано в данном документе, для лечения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, волчанки, псориаза или заболевания кости.

Кроме того, в данном документе предложено применение антитела, как описано в данном документе, для изготовления фармацевтической композиции для лечения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, волчанки, псориаза или заболевания кости. Данное антитело используется в фармацевтически эффективном количестве.

Кроме того, в данном документе предложено применение антитела, как описано в данном документе, для изготовления фармацевтической композиции для лечения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, волчанки, псориаза или заболевания кости. Данное антитело используется в фармацевтически эффективном количестве.

Понятно, что любые из приведенных выше препаратов или терапевтических способов могут проводиться с использованием иммуноконъюгата, как описано в данном документе, вместо или помимо антитела к CD19 человека.

III. Изделия

В другом аспекте предложено изделие, содержащее вещества, полезные для лечения, предупреждения и/или диагностики описанных выше расстройств. Изделие содержит контейнер и этикетку или листок-вкладыш в упаковке на или в ассоциации с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы, мешки с в.в. (внутривенный) раствором и т.д. Контейнеры могут быть сделаны из целого ряда материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама или в комбинации с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностики состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой мешок для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, проницаемую подкожной инъекционной иглой). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой антитело, как описано в данном документе. На этикетке или листке-вкладыше в упаковке указано то, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, где данная композиция содержит антитело, как описано в данном документе; и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, где данная композиция содержит дополнительный цитотоксический или иной терапевтический агент. Изделие в данном воплощении может дополнительно содержать листок-вкладыш в упаковке, на котором указано то, что композиции могут быть использованы для лечения конкретного состояния. Альтернативно или дополнительно, изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекции (BWFI), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой или пользовательской точки зрения, включающие другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Понятно, что любое из приведенных выше изделий может включать иммуноконъюгат, как описано в данном документе, вместо или помимо антитела к CD19 человека.

IV. Описание перечня последовательностей

SEQ ID NO: 1	вариабельный домен тяжелой цепи мышиного антитела 8B8 к CD19 человека
SEQ ID NO: 2	вариабельный домен легкой цепи мышиного антитела 8B8 к CD19 человека
SEQ ID NO: 3	HVR-H1 мышиного антитела 8B8 к CD19 человека
SEQ ID NO: 4	HVR-H2 мышиного антитела 8B8 к CD19 человека
SEQ ID NO: 5	HVR-H3 мышиного антитела 8B8 к CD19 человека
SEQ ID NO: 6	HVR-L1 мышиного антитела 8B8 к CD19 человека
SEQ ID NO: 7	HVR-L2 мышиного антитела 8B8 к CD19 человека
SEQ ID NO: 8	HVR-L3 мышиного антитела 8B8 к CD19 человека
SEQ ID NO: 9	вариабельный домен гуманизированной тяжелой цепи
SEQ ID NO: 10-28	чередующиеся последовательности гуманизированного вариабельного домена легкой цепи и гуманизированного варианта HVR-L1

V. Номенклатура антител

	номер последовательности
антитело или вариабельная область антитела	вариабельный домен тяжелой цепи (VH)	вариабельный домен легкой цепи (VL)	HVR-H1	HVR-H2	HVR-H3	HVR-L1	HVR-L2	HVR-L3
0:wt	1	2	3	4	5	6	7	8
1:N27dH	9	10	3	11	5	12	7	8
2:N27dQ	9	13	3	11	5	14	7	8
3:S27eA	9	15	3	11	5	16	7	8
4:S27eV	9	17	3	11	5	18	7	8
5:S27eP	9	19	3	11	5	20	7	8
6:N28Q	9	21	3	11	5	22	7	8
7:G29A	9	23	3	11	5	24	7	8
8:G29V	9	25	3	11	5	26	7	8
9:S27ePN28S	9	27	3	11	5	28	7	8

VI. ПРИМЕРЫ

Следующее представляет собой примеры способов и композиций по изобретению. Понятно, что можно воплощать на практике разные другие воплощения, принимая во внимание общее описание, приведенное выше.

Хотя вышеизложенное изобретение и было описано в некоторых подробностях посредством иллюстрации и примера для целей ясности понимания, данные описания и примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения. Раскрытия всей патентной и научной литературы, процитированной в данном документе, прямо включены во всей их полноте посредством ссылки.

Пример 1

Иммунизация и получение мышиных антител к CD19 человека (гибридом)

Мышей Balb/c шесть раз иммунизировали и подвергали бустерной иммунизации клетками HEK293, трансфицированными CD19 (средняя плотность рецептора 35000 на клетку). Иммунный ответ отслеживали посредством тестирования образцов сыворотки с использованием ELISA на клетки с CD19 на клетках NIH-3T3, трансфицированных CD19. Клетки селезенки от мышей с достаточными титрами антитела к CD19 человека использовали для создания бессмертных клеток посредством слияния с мышиной миеломной линией клеток P3X63 Ag8.653. Осуществляли три слияния, и супернатанты гибридомы подвергали скринингу посредством ELISA на клетки на клетках NIH-3T3, трансфицированных CD19 человека, и анализа связывания FACS (флуоресцентная сортировка клеток) на антитела, специфичные в отношении CD19 человека, с использованием клеток Дауди (CD19⁺) и клеток CD19^-.

Пример 2

Скрининг гибридом и клеточная биологическая функциональная оценка антитела к CD19

Клеточный ELISA для скрининга антител против hCD19

Для скрининга гибридом и для идентификации тех гибридом, которые секретируют антитела против CD19 человека, применяли клеточный ELISA. В качестве позитивных клеток использовали клетки NIH3T3, трансфицированные CD19 человека; нетрансфицированные клетки NIH3T3 использовали в качестве клеток негативного контроля. Для оценки позитивных гибридом количественно определяли отношение ОП (оптическая плотность) между трансфицированными и нетрансфицированными клетками NIH3T3.

- Культуральная среда: DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) с высоким содержанием глюкозы (4,5 мг/мл), 10% FCS (фетальная телячья сыворотка), Na-пируват, NEAA (заменимые аминокислоты), глутамин.

- Позитивный контроль антител: моноклональное антитело к CD19 (IgG1) Кат. № 555409 с от Pharmingen - 1 мг/мл.

- Выявляющее антитело: конъюгат с HRP антитела козы против IgG мыши (H+L), Кат. № 170-06516 от Bio-Rad.

- Разведение 1:2000 в 1× блокирующем реактиве для ELISA.

- Другие реактивы: фибронектин, Кат. № 838039 с от Roche, 1 мг/мл.

- Глутаральдегид: 25%-ный маточный раствор // высокоочищенный агар для научных целей - №R102, конечная концентрация 0,05% в PBS.

- Блокирующий реактив для ELISA: 10× маточный раствор // Кат. № 1112589 от Roche.

- Субстрат ТМВ (тетраметилбензидин): Кат. № 11432559 от Roche.

- Останавливающий раствор: 1 М H₂SO₄.

- Кат. № 170-6516 Bio-Rad - разведение 1:2000 в 1× блокирующем реактиве для ELISA.

Сутки 1:

- Покрытие фибронектином: 5 мкг/см² в PBS; 96-луночный планшет - 32 см²; 160 мкг/планшет в 6 мл.

- PBS, 50 мкл/лунку.

- Инкубировать 45 мин при RT (комнатная температура), отсосать покрывающий раствор.

- Высеять 1,25 × 10⁴ клеток/лунку в 50 мкл культуральной среды в 96-луночном планшете.

- Инкубировать 40 часов при 37°С.

- Добавить в верхнюю половину планшета: клетки NIH3T3, экспрессирующие CD19.

- Добавить в нижнюю половину планшета: нетрансфицированные клетки NIH3T3.

Сутки 3:

- Добавление антитела позитивного контроля или образцов (супернатант или мышиная сыворотка) в 50 мкл культуральной среды.

- Инкубировать в течение 2 ч при 4°С.

- Удалить среду, зафиксировать клетки 100 мкл глутаральдегида (0,05% в PBS).

- Промыть два раза 200 мкл PBS.

- Добавление выявляющего антитела 1:2000, 50 мкл/лунку.

- Инкубировать 2 ч при RT.

- Промыть три раза 200 мкл PBS.

- Добавить 50 мкл ТМВ, инкубировать в течение 30 мин при RT.

- Остановить добавлением 25 мкл 1 М H₂SO₄; считать экстинкцию при 450 нм/620 нм.

- Расчет результатов: отношение ОП NIH3T3 CD19 : ОП нетрансфицированных NIH3T3.

Пример 3

Гуманизация антитела к CD19

Специфичность связывания мышиного антитела к CD19 переносили на человеческий акцепторный каркас для устранения потенциальных проблем иммуногенности, возникающих из-за отрезков последовательности, которые человеческий организм будет распознавать как чужеродные. Это осуществляли пересадкой полных областей, определяющих комплементарность (CDR), мышиного (донорного) антитела на каркас человеческого (акцепторного) антитела, и данный процесс называется пересадкой CDR или гуманизацией антитела.

Мышиную аминокислотную последовательность выравнивали с набором V генов антитела человеческой зародышевой линии и сортировали согласно идентичности и гомологии последовательности. Перед выбором одной конкретной акцепторной последовательности должна быть определена так называемая каноническая структура петель донорного антитела (Morea, V., et al., Methods, Vol 20, Issue 3 (2000) 267-279). Эти канонические структуры петель определяются типом остатков, присутствующих в так называемых канонических положениях. Данные положения находятся (частично) вне областей CDR и должны поддерживаться в конечной конструкции функционально эквивалентными для того, чтобы сохранять конформацию CDR родительского (донорного) антитела. В качестве акцептора для тяжелой цепи была выбрана человеческая последовательность зародышевой линии VBASE_VH1_1, и для легкой цепи была выбрана последовательность VBASE_VK2_5. Это привело к гуманизированному антителу дикого типа.

Пример 4

Экспрессия антител, связывающихся с CD19

Последовательности, кодирующие вариабельный домен антитела, получали посредством синтезов генов.

Для введения соответствующих точечных мутаций была проведена реакция быстрой замены на основе 33-мерного праймера. Все последовательности подтверждали секвенированием (SequiServe, Vaterstetten, Германия). Все последовательности клонировали в векторы, которые обеспечивают селекцию и размножение в E. coli (репликатор из вектора pUC18, бета-лактамаза для устойчивости к ампициллину). Данные векторы дополнительно содержат кассеты, которые обеспечивают экспрессию в клетках млекопитающих (репликатор oriP вируса Эпштейна-Барр (EBV), немедленный ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса (HCMV) и последовательность полиаденилирования).

Всем сегментам гена, которые кодируют легкую и тяжелую цепи антитела, предшествовала последовательность ДНК, кодирующая сигнальный пептид (MGWSCIILFLVATATGVHS; SEQ ID NO: 29). Данные белки экспрессировали посредством временной трансфекции клеток человеческой эмбриональной почки HEK293 в суспензии. Данные клетки культивировали при 37°С и 8% СО₂. В сутки трансфекции клетки высевали в свежую среду в плотности 1-2×10⁶ жизнеспособных клеток/мл. Сотрансфицировали эквимолярные количества плазмидных ДНК и тяжелой, и легкой цепи. Супернатанты культуры клеток отбирали через 7 суток после трансфекции, центрифугировали (14000 g в течение 45 мин при 4°С) и затем фильтровали через 0,22 мкм фильтр. Данные супернатанты могли быть заморожены и сохранены при -20°С до очистки.

Пример 5

Очистка антител, связывающихся с CD19

Бесклеточный супернатант ферментации (HEK 293F) загружается на предварительно уравновешенную (фосфатно-солевой буферный раствор, PBS) аффинную колонку на основе белка А (MabSelect^TMSuRe, GE Healthcare, 8×100 мм) с контактным временем 5 минут. После промывки (PBS, 5 объемов колонки) антитело элюируется 25 мМ лимонной кислотой/NaOH (pH 3,0). Элюат доводится до рН 5,5 1 М Tris и инкубируется в течение ночи при 4°С. Затем осуществляется конечное фильтрование (0,45 мкм).

Очистка варианта 5 антитела к CD19 человека (S27eP):

Бесклеточный супернатант ферментации (244 мл, HEK 293F) загружали на предварительно уравновешенную (фосфатно-солевой буферный раствор, PBS) аффинную колонку на основе белка А (MabSelect^TMSuRe, GE Healthcare, 8×100 мм) с контактным временем 5 минут. После промывки (PBS, 5 объемов колонки) антитело элюировали 25 мМ лимонной кислотой/NaOH (pH 3,0). Элюат доводили до рН 5,5 1 М Tris и инкубировали в течение ночи при 4°С. Конечное фильтрование (0,45 мкм) давало 31,1 мг (5,7 мл, 5,45 мг/мл) продукта 99,0%-ной чистоты (SEC - гель-фильтрация).

Очистка варианта 9 антитела к CD19 человека (S27eP/N28S):

Бесклеточный супернатант ферментации (260 мл, HEK 293F) загружали на предварительно уравновешенную (PBS) аффинную колонку на основе белка А (MabSelect^TMSuRe, GE Healthcare, 8×100 мм) с контактным временем 5 минут. После промывки (PBS, 5 объемов колонки) целевой белок элюировали 25 мМ лимонной кислотой/NaOH (pH 3,0). Элюат доводили до рН 5,5 1 М Tris (рН 9,0) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Конечное фильтрование (0,2 мкм) давало 9,1 мг (5,2 мл, 1,75 мг/мл) продукта 98,0%-ной чистоты (SEC).

Пример 6

Предоставление клеток, экспрессирующих ECD CD19, и связывание с ними антител

Клетки HEK293 трансфицировали 1 мкг плазмидной ДНК на 1,5×10⁶ клеток с использованием LipofectAmine 2000 и затем инкубировали в течение 48 часов при 37°С. Данные плазмиды кодировали внеклеточный домен (ECD) либо CD19 человека (PEEPLVVKVE EGDNAVLQCL KGTSDGPTQQ LTWSRESPLK PFLKLSLGLP GLGIHMRPLA IWLFIFNVSQ QMGGFYLCQP GPPSEKAWQP GWTVNVEGSG ELFRWNVSDL GGLGCGLKNR SSEGPSSPSG KLMSPKLYVW AKDRPEIWEG EPPCLPPRDS LNQSLSQDLT MAPGSTLWLS CGVPPDSVSR GPLSWTHVHP KGPKSLLSLE LKDDRPARDM WVMETGLLLP RATAQDAGKY YCHRGNLTMS FHLEITARPV LWHWLLRTGG WK; SEQ ID NO: 30), либо CD19 яванского макака (PQEPLVVKVE EGDNAVLQCL EGTSDGPTQQ LVWCRDSPFE PFLNLSLGLP GMGIRMGPLG IWLLIFNVSN QTGGFYLCQP GLPSEKAWQP GWTVSVEGSG ELFRWNVSDL GGLGCGLKNR SSEGPSSPSG KLNSSQLYVW AKDRPEMWEG EPVCGPPRDS LNQSLSQDLT MAPGSTLWLS CGVPPDSVSR GPLSWTHVRP KGPKSSLLSL ELKDDRPDRD MWVVDTGLLL TRATAQDAGK YYCHRGNWTK SFYLEITARP ALWHWLLRIG GWKV; SEQ ID NO: 31), слитые с последовательностью GPI (гликозилированный фосфатидилинозитольный) якоря человеческого PSCA (антиген стволовой клетки простаты) для внеклеточной презентации. Соответствующие трансфицированные клетки дважды промывали в буфере FACS (PBS, содержащий 5% фетальной тялячей сыворотки (FCS)) и ресуспендировали в буфере FACS до конечной концентрации 2*10⁶ клеток/мл, соответствующей 5,0*10⁴ клеток/25 мкл/лунку. Была установлена исходная концентрация антител 60 мкг/мл (2× конечная концентрация), и затем осуществлялось разведение 1:3 (об./об.) в сериях титрования. Первичное антитело инкубировали на клетках в течение одного часа при комнатной температуре, с последующими двумя стадиями промывки. Для вторичного выявления использовали антитело к huIgG (H+L), конъюгированное с Alexa488, в концентрации 30 мкг/мл. Вторичное антитело инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Затем клетки дважды промывали и ресуспендировали в 70 мкл/лунку буфера FACS и анализировали с использованием BD FACS Canto.

Соответствующие значения ЕС₅₀ (полумаксимальная эффективная концентрация) для гуманизированного антитела дикого типа и вариантов 5 (S27eP) и 9 (S27eP/M28S) показаны в следующей Таблице.

	wt [мкг/мл]	вариант 5 [мкг/мл]	вариант 9 [мкг/мл]
ECD CD19 человека	0,087	0,084	0,089
ECD CD19 яванского макака	0,313	0,255	0,435

Пример 7

Масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС)

Вещество антитела (приблизительно 80 мкг) денатурировали в 200 мМ гистидин-HCl буфере (рН 6,0), содержащем приблизительно 7 М гуанидиний-HCl, восстанавливали с использованием 10 мМ ТСЕР (трис-2-карбоксиэтилфосфин), и заменяли буфер на 200 мМ гистидин-HCl (рН 6,0) с использованием колонок Zeba Spin c MWCO (порог отсечения молекулярной массы) 7 КДа (Thermo Scientific). Наконец, вещество расщепляли 2,5 мкг трипсина или термолизина (Promega) в течение 16 часов при 37°С. Сбор данных осуществляли с использованием градиента RP-UPLC (сверхэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой) на С18 колонке ACQUITY BEH300 (Waters), используя систему UPLC NanoAcquity (Waters), с последующей МС/МС (тандемная масс-спектрометрия) на основе CID на масс-спектрометре Orbitrap Fusion Tribrid (Thermo Scientific) с TriVersa NanoMate (Advion) в качестве источника наноэлектрораспылительной ионизации. Данные оценивали с использованием поисков ионов МС/МС Mascot (Matrix Science) и пептидного анализатора (Roche Diagnostics GmbH), программы для оценки данных МС собственной разработки. Количественное измерение осуществляли посредством интегрирования извлеченных хроматограмм ионного тока соответствующих пептидов.

Результаты:

В следующей таблице показан уровень дезамидирования и образования сукцинимида гуманизированного антитела к CD19 дикого типа (вариант 0: wt) при инкубировании при 37°С в течение 2 недель при рН 7,4 в буфере PBS (использованный фрагмент: SSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYR; SEQ ID NO: 35).

образец	дезамидированная форма [%]	образование сукцинимида [%]
контроль	~8	0
инкубированное при 37°C в течение 2 недель при pH 7,4 в буфере PBS	26-32	0

В следующей таблице показан уровень дезамидирования и образования сукцинимида при инкубировании варианта 5 гуманизированного антитела к CD19 (S27eP) (использованный фрагмент: SSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYR; SEQ ID NO: 35).

образец	дезамидированная форма [%]	образование сукцинимида [%]
контроль	2	2
инкубированное при 37°C в течение 2 недель при pH 7,4 в буфере PBS	7	0
инкубированное при 40°C в течение 2 недель при pH 6,0 в буфере гистидин/NaCl	4	2

В следующей таблице показан уровень дезамидирования и образования сукцинимида при инкубировании варианта 3 гуманизированного антитела к CD19 (S27eА) (использованный фрагмент: SSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYR; SEQ ID NO: 35).

образец	дезамидированная форма [%]	образование сукцинимида [%]
контроль	7	2
инкубированное при 37°C в течение 2 недель при pH 7,4 в буфере PBS	23	1
инкубированное при 40°C в течение 2 недель при pH 6,0 в буфере гистидин/NaCl	13	1

В следующей таблице показан уровень дезамидирования и образования сукцинимида при инкубировании варианта 7 гуманизированного антитела к CD19 (G29A) (использованный фрагмент: SSQSLENSNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYR; SEQ ID NO: 35).

образец	дезамидированная форма [%]	образование сукцинимида [%]
контроль	8	0
инкубированное при 37°C в течение 2 недель при pH 7,4 в буфере PBS	45	0,5
инкубированное при 40°C в течение 2 недель при pH 6,0 в буфере гистидин/NaCl	13	0

Пример 8

Определение аффинности к CD19

Для определения кинетических параметров связывания между антителами к CD19 человека и внеклеточным доменом рекомбинантного рецептора CD19 человека использовали анализ на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Протокол 1:

Для захвата антитела к CD19 человека использовали фрагмент антитела F(ab)'2 против антитела человека в качестве захватывающего антитела (Jackson Immuno Research; код заказа: 109-006-006). 20 мкг/мл захватывающего антитела иммобилизовали на чипе CM5 (GE Healthcare; BR-1005-30) при pH 4,5 посредством применения набора для аминного связывания согласно инструкциям изготовителя (GE Healthcare). Буфером для образца и подвижным буфером были HBS-EP+ (GE Healthcare; BR-1006-69). В проточной ячейке была установлена температура 25°С. В блоке для образцов была установлена температура 12°С. Оба были первично обработаны подвижным буфером. Антитело к CD19 человека захватывали посредством инъецирования 35 нМ раствора в течение 60 с при скорости тока 20 мкл/мин. Ассоциацию измеряли посредством инъецирования рекомбинантного человеческого ECD CD19 в разных концентрациях в растворе в течение 120 с при скорости тока 50 мкл/мин, начиная с 900 нМ с разведениями 1:3 и используя всего пять концентраций. Фазу диссоциации отслеживали в течение вплоть до 600 с, и запускали ее переключением от раствора для образца до подвижного буфера. Поверхность регенерировали два раза посредством 60 с и 30 с промывки 10 мМ раствором глицина (рН 1,5) при скорости тока 30 мкл/мин. Общие различия показателя преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного от поверхности с F(ab)'2 козы против человеческого антитела. Также вычитали пустые инъекции (двойной контроль). Для расчета кажущейся KD и других кинетических параметров использовали модель Лангмюра 1:1.

Протокол 2:

Для захвата антитела к CD19 человека использовали захватывающее антитело против Fab человека. Сначала иммобилизовали 30 мкг/мл антитела козы против Fab человека (код заказа: 28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB) на чипе СМ5 (GE Healthcare; BR-1005-30) при рН 5,0 посредством применения набора для аминного связывания (GE Healthcare) согласно инструкциям изготовителя. Буфер для образца и подвижный буфер представляли собой HBS-EP+ (GE Healthcare; BR-1006-69). В проточной ячейке была установлена температура 25°С. В блоке для образцов была установлена температура 12°С. Оба были первично обработаны подвижным буфером. Антитело к CD19 человека захватывали посредством инъецирования 10 нМ раствора в течение 60 с при скорости тока 10 мкл/мин. Ассоциацию измеряли посредством инъецирования рекомбинантного человеческого ECD CD19 в течение 90 с при скорости тока 10 мкл/мин в концентрации 250 нМ. Фазу диссоциации отслеживали в течение вплоть до 60 с, и запускали ее переключением от раствора для образца до подвижного буфера. Поверхность регенерировали посредством 60 с промывки 10 мМ раствором глицина (рН 2,1) при скорости тока 10 мкл/мин. Общие различия показателя преломления корректировали путем вычитания ответа от пустой поверхности.

Расчет:

Относительное связывание образца представляет собой отношение, рассчитанное из уровня захвата и уровня связывания (RU связывания, разделенные на RU захвата):

Относительная активная концентрация образца представляет собой отношение образца по сравнению с контрольным образцом:

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

<120> ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА К CD19 ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> P33094

<150> EP15187820.4

<151> 2015-10-01

<160> 70

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ala Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Lys Gln Lys Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 2

Asp Ala Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Leu

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 3

Asp Tyr Ile Met His

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 4

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Asn

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 5

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 6

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 7

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 7

Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 8

Leu Gln Leu Thr His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 9

<211> 121

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированный VH

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL N27dH

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированная HVR-H2

<400> 11

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HVR-L1 N27dH

<400> 12

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 13

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL N27dQ

<400> 13

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Gln Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HVR-L1 N27dQ

<400> 14

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Gln Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 15

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH S27eA

<400> 15

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ala

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 16

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HVR-L1 S27eA

<400> 16

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 17

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL S27eV

<400> 17

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Val

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 18

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HVR-L1 S27eV

<400> 18

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Val Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 19

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL S27eP

<400> 19

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 20

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HVR-L1 S27eP

<400> 20

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 21

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL N28Q

<400> 21

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HVR-L1 N28Q

<400> 22

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 23

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL G29A

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 24

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> G29A HVR-L1

<400> 24

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 25

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL G29V

<400> 25

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Val Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 26

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HVR-L1 G29V

<400> 26

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Val Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 27

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH S27eP/N28S

<400> 27

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro

20 25 30

Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 28

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HVR-L1 S27eP/N28S

<400> 28

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 29

<211> 19

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сигнальный пептид

<400> 29

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 30

<211> 272

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 30

Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val

1 5 10 15

Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr

20 25 30

Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe

50 55 60

Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro

65 70 75 80

Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val

85 90 95

Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly

100 105 110

Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro

115 120 125

Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg

130 135 140

Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr

165 170 175

Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro

180 185 190

Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser

195 200 205

Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu

210 215 220

Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr

245 250 255

Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys

260 265 270

<210> 31

<211> 274

<212> ПРТ

<213> Macaca fascicularis

<400> 31

Pro Gln Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val

1 5 10 15

Leu Gln Cys Leu Glu Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Val

20 25 30

Trp Cys Arg Asp Ser Pro Phe Glu Pro Phe Leu Asn Leu Ser Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Gly Met Gly Ile Arg Met Gly Pro Leu Gly Ile Trp Leu Leu

50 55 60

Ile Phe Asn Val Ser Asn Gln Thr Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro

65 70 75 80

Gly Leu Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Ser Val

85 90 95

Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly

100 105 110

Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro

115 120 125

Ser Gly Lys Leu Asn Ser Ser Gln Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg

130 135 140

Pro Glu Met Trp Glu Gly Glu Pro Val Cys Gly Pro Pro Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr

165 170 175

Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro

180 185 190

Leu Ser Trp Thr His Val Arg Pro Lys Gly Pro Lys Ser Ser Leu Leu

195 200 205

Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Asp Arg Asp Met Trp Val Val

210 215 220

Asp Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Trp Thr Lys Ser Phe Tyr Leu Glu Ile

245 250 255

Thr Ala Arg Pro Ala Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Ile Gly Gly Trp

260 265 270

Lys Val

<210> 32

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 32

Asp Thr Asp Leu Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gln Pro Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly

20 25 30

Pro Gly Gln Leu

35

<210> 33

<211> 537

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 33

Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val

1 5 10 15

Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr

20 25 30

Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe

50 55 60

Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro

65 70 75 80

Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val

85 90 95

Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly

100 105 110

Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro

115 120 125

Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg

130 135 140

Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr

165 170 175

Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro

180 185 190

Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser

195 200 205

Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu

210 215 220

Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr

245 250 255

Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys

260 265 270

Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu

275 280 285

Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg

290 295 300

Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val Thr Pro Pro

305 310 315 320

Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu Ser Leu Pro

325 330 335

Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala Ala Gly Leu

340 345 350

Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp Val Gln Ala

355 360 365

Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly Pro Glu Glu

370 375 380

Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu Asp Ser Glu

385 390 395 400

Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu Ser Gln Asp

405 410 415

Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly Pro Glu Asp

420 425 430

Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu Asp Glu Glu

435 440 445

Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser Pro His Gly

450 455 460

Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly Ser Gln Ser

465 470 475 480

Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Arg Ser

485 490 495

Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala Asp Ser Tyr

500 505 510

Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp Gly Gly Gly

515 520 525

Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg

530 535

<210> 34

<211> 538

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 34

Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val

1 5 10 15

Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr

20 25 30

Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe

50 55 60

Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro

65 70 75 80

Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val

85 90 95

Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly

100 105 110

Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro

115 120 125

Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg

130 135 140

Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr

165 170 175

Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro

180 185 190

Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser

195 200 205

Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu

210 215 220

Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr

245 250 255

Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys

260 265 270

Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu

275 280 285

Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg

290 295 300

Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val Thr Pro Pro

305 310 315 320

Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu Ser Leu Pro

325 330 335

Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala Ala Gly Leu

340 345 350

Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp Val Gln Ala

355 360 365

Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly Pro Glu Glu

370 375 380

Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu Asp Ser Glu

385 390 395 400

Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu Ser Gln Asp

405 410 415

Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly Pro Glu Asp

420 425 430

Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu Asp Glu Glu

435 440 445

Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser Pro His Gly

450 455 460

Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Ala Gly Ser Gln

465 470 475 480

Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Arg

485 490 495

Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala Asp Ser

500 505 510

Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp Gly Gly

515 520 525

Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg

530 535

<210> 35

<211> 31

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент антитела для анализа МС

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X = S, P, A

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> X = G or A

<400> 35

Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Xaa Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu Asn Trp

1 5 10 15

Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg

20 25 30

<210> 36

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 36

Asn Ser Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 37

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 37

Lys Phe Asn Gly

1

<210> 38

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированный фрагмент HVR-H2 с мутацией N64Q

<400> 38

Thr Glu Lys Phe Gln Gly

1 5

<210> 39

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированный фрагмент HVR-L2 с мутацией S27eP

<400> 39

Leu Glu Asn Pro Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 40

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированный фрагмент HVR-L2 с мутацией S27eP/N28S

<400> 40

Leu Glu Asn Pro Ser Gly Asn Thr

1 5

<210> 41

<211> 18

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер

<400> 41

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 42

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент человеческого рецептора трансферрина

<400> 42

Ile Gly Gln Asn Met Val Thr Ile Val Gln Ser Asn Gly Asn Leu

1 5 10 15

<210> 43

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент человеческого рецептора трансферрина

<400> 43

Asn Met Val Thr Ile Val Gln Ser Asn Gly Asn Leu Asp Pro Val

1 5 10 15

<210> 44

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент человеческого рецептора трансферрина

<400> 44

Gln Ser Asn Gly Asn Leu Asp Pro Val Glu Ser Pro Glu Gly Tyr

1 5 10 15

<210> 45

<211> 32

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептидный линкер

<400> 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

<210> 46

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Met Asn Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Pro Thr Ser His Tyr Val Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Val

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu

1 5 10 15

Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Arg Val Gln Val

65 70 75 80

Glu Asp Ile Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Tyr Asn Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 48

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант L104V и L106I SEQ ID NO: 57

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu

1 5 10 15

Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Arg Val Gln Val

65 70 75 80

Glu Asp Ile Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Tyr Asn Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 49

<211> 122

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гуманизированный вариант_DASG VH 299-023

<400> 49

Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser

50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser

65 70 75 80

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr

85 90 95

Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 110

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант гуманизации_NYA VL 299-009

<400> 50

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn

85 90 95

Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 51

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Oryctolagus cuniculus

<400> 51

Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

1 5

<210> 52

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Oryctolagus cuniculus

<400> 52

Trp Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 53

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Oryctolagus cuniculus

<400> 53

Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Asn Gly Phe Asp

1 5 10 15

Pro

<210> 54

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HVR-H3 DASG 299-000

<400> 54

Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp

1 5 10 15

Pro

<210> 55

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HVR-H3 DAQG 299-000

<400> 55

Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Gln Gly Phe Asp

1 5 10 15

Pro

<210> 56

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HVR-L1 RAA 299-000

<400> 56

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 57

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Oryctolagus cuniculus

<400> 57

Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 58

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HVR-L3 NYA 299-000

<400> 58

Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn Val Asp Asn Thr

1 5 10

<210> 59

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант последовательности LC

<400> 59

Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 60

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант последовательности LC 1

<400> 60

Gln Ser Leu Glu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 61

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант последовательности LC 2

<400> 61

Gln Ser Leu Glu Gln Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 62

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант последовательности LC 3

<400> 62

Gln Ser Leu Glu Asn Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 63

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант последовательности LC 4

<400> 63

Gln Ser Leu Glu Asn Val Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 64

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант последовательности LC 5

<400> 64

Gln Ser Leu Glu Asn Pro Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 65

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант последовательности LC 6

<400> 65

Gln Ser Leu Glu Asn Ser Gln Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 66

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант последовательности LC 7

<400> 66

Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 67

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант последовательности LC 8

<400> 67

Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Val Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 68

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант последовательности LC 9

<400> 68

Gln Ser Leu Glu Asn Pro Ser Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5 10

<210> 69

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант последовательности HC 0

<400> 69

Thr Glu Lys Phe Asn Gly Lys Ala Thr Leu

1 5 10

<210> 70

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант последовательности HC 1

<400> 70

Thr Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met

1 5 10

<---

1. Антитело, которое специфично связывается с CD19 человека, где данное антитело содержит:

(а) HVR-H1 (гипервариабельная область тяжелой цепи 1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03,

(б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11,

(в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05,

(г) HVR-L1 (гипервариабельная область легкой цепи 1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 или 28,

(д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07,

и

(е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08.

2. Антитело по п. 1, где данное антитело представляет собой моноклональное антитело.

3. Антитело по любому из пп. 1, 2, где данное антитело представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

4. Антитело по любому из пп. 1-3, где данное антитело представляет собой фрагмент антитела, который специфично связывается с CD19 человека.

5. Антитело по любому из пп. 1-4, где данное антитело содержит:

(а) последовательность VH (вариабельный домен тяжелой цепи), имеющую по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 09, и последовательность VL (вариабельный домен легкой цепи), имеющую по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 19, или

(б) последовательность VH, имеющую по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 09, и последовательность VL, имеющую по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 27, или

(в) последовательность VH и последовательность VL, такую же, как в (а) или (б).

6. Фармацевтическая композиция для связывания CD19, содержащая антитело по любому из пп. 1-5 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Антитело по любому из пп. 1-5 для применения в качестве лекарственного средства.

8. Антитело по любому из пп. 1-5 для лечения В-клеточного рака.

9. Антитело по любому из пп. 1-5 для применения в истощении популяции В-клеток.

10. Применение антитела по любому из пп. 1-5 в изготовлении лекарственного средства для связывания CD19.

11. Применение по п. 10, в котором лекарственное средство предназначено для лечения В-клеточного рака.

12. Применение по п. 10, в котором лекарственное средство предназначено для истощения популяции В-клеток.

13. Способ истощения популяции В-клеток, включающий введение эффективного количества антитела по любому из пп. 1-5 для истощения популяции В-клеток.