Антитела с двойной специфичностью

Настоящая группа изобретений относится к иммунологии. Предложен способ создания антитела с двойной специфичностью или его антигенсвязывающего фрагмента, а также антитела и антигенсвязывающие фрагменты, полученные таким способом и способные связывать интерлейкин-4 (ИЛ4) и интерлейкин-5 (ИЛ5) или ИЛ4 и интерлейкин-13 (ИЛ13). Антитела с двойной специфичностью создают идентификацией моноспецифического антитела, обладающего остатками вариабельного участка V_L легкой цепи, которые являются электростатическими или гидрофобными, и изменением последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей один или более доступных растворителю остатков в V_H данного антитела. Также представлены фармацевтические композиции, содержащие такие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, и способы лечения астмы с их использованием. Кроме того, предложены: полинуклеотид, вектор экспрессии, клетка-хозяин и основанный на ее использовании способ получения указанных антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Данная группа изобретений может найти применение в производстве лекарственных средств. 11 н. и 34 з.п. ф-лы, 8 ил., 3 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к антителам с двойной специфичностью и способам создания и использования таких антител.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Антитела представляют собой специфические иммуноглобулиновые полипептиды, продуцируемые иммунной системой позвоночных в ответ на стимуляцию чужеродными белками, гликопротеинами, клетками или другими антигенными чужеродными веществами. Важная роль этого процесса заключается в образовании антител, которые специфически связываются с конкретным чужеродным веществом. Специфичность связывания таких полипептидов с конкретным антигеном является высокоточной, а множество видов специфичности способных создаваться отдельным организмом позвоночного, необыкновенно по своей сложности и вариабельности. Тысячи антигенов способны вызывать ответные реакции, каждая почти исключительно направлена на конкретный антиген, который их вызывает.

Специфическое распознавание антигенов имеет принципиальное значение для функционирования антител при адаптивном иммунном ответе. При образовании репертуара антител комбинаторное связывание тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC) консервативно у всех позвоночных. В то же время существует асимметрия разнообразия двух цепей. Вариабельный домен НС (V_H) содержит значительно большее разнообразие последовательностей и обеспечивает детерминантами антигенного распознавания больше, чем вариабельный домен LC (V_L). Однако, данная вариабельность, с помощью которой антитела распознают и связываются с конкретным чужеродным веществом, некоторых антител в отношении антигенсвязывающей энергии в значительной степени зависит от V_L.

Специфичность антител и фрагментов антител к конкретному антигену или антигенам делает антитела востребованными лекарственными средствами. Антитела и фрагменты антител могут использоваться для таргетирования конкретных антигенов с плейотропным биологическим действием (например, цитокины). По этой причине, существует текущая и постоянная потребность в идентификации и определении характеристик лекарственных средств на основе антител, особенно антител, фрагментов и их производных, пригодных для лечения различных заболеваний и нарушений, таких как аллергические заболевания, воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания и пролиферативные заболевания.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предлагаются способы создания антител с двойной специфичностью и фрагментов антител. В изобретении также предложены специфические антитела, идентифицированные с использованием этих способов, а также их применение.

В общем, способы по данному изобретению включают диверсификацию V_H антитела для образования вариантов антител с двойной специфичностью, которые могут стабильно экспрессироваться в библиотеке. В одном варианте реализации изобретения антитело, перед диверсификацией, характеризуется как имеющее V_H и V_L, которые соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, специфически связывающегося с первым эпитопом, но не вторым эпитопом. Антитело дополнительно характеризуется как имеющее электростатический или гидрофобный остаток в любой одной, двух или трех аминокислотах, находящихся в положениях 32, 50 или 91 (система нумерации Кабата) V_L. Такое антитело, имеющее электростатический или гидрофобный остаток в одном или более таких положений, потом изменяется по одному или более аминокислотных остатков (например, подверженные воздействию растворителя остатки) в V_H. Потом V_H и V_L могут быть экспрессированы (например, в виде библиотеки) и диверсифицированы антитела с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающие фрагменты, которые способны специфически связываться с первым и вторым эпитопами, отобранными из экспрессированных V_H и V_L.

В одном аспекте изобретение отличается способом создания антитела с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L), в котором V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, специфически связывающегося с первым эпитопом и вторым эпитопом, указанный способ включает стадии: (а) предоставление антитела, которое содержит V_H и V_L, причем V_H и V_L соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который связывается с первым эпитопом, но не вторым эпитопом, и при этом указанное антитело содержит по меньшей мере одну аминокислоту в положении 32, 50 или 91 V_L, которая является электростатической или гидрофобной; (b) изменение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей V_H антитела из стадии (а), причем изменяется одна или более доступных растворителю аминокислот; (с) экспрессирование V_L и измененного V_H из стадии (b); и (d) отбор антитела с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего V_L и измененный V_H из стадии (с), при этом V_H и V_L соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, специфически связывающегося с первым эпитопом и вторым эпитопом.

В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере две из аминокислот в положении 32, 50 или 91 являются электростатическими или гидрофобными. В некоторых вариантах реализации изобретения все три аминокислоты в положении 32, 50 и 91 являются электростатическими или гидрофобными. В некоторых вариантах реализации изобретения электростатический остаток представляет собой тирозин. В некоторых вариантах реализации изобретения электростатический остаток представляет собой триптофан. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая V_H, изменяется на основе разнообразия множества встречающихся в природе аминокислотных последовательностей тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения подверженное воздействию растворителя положение остатка является положением аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из положений 33, 34, 50-58 и 95-97 V_H. В некоторых вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает изменение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей V_L антитела из стадии (а), в которой изменяется один или больше доступных растворителю аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации изобретения подверженное воздействию растворителя положение остатка представляется собой положение аминокислотного остатка, выбранное из аминокислот 93-96 V_L. В некоторых вариантах реализации изобретения измененный V_H отображается на фаге с V_L во время отбора на стадии (d). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело из стадии (а) содержит определяющий комплементарность участок CDRL1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9), CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10), и CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTSPWTF (SEQ ID NO.: 11). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело из стадии (а) содержит определяющий комплементарность участок CDRH1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность DYSMH (SEQ ID NO.: 13), CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность VWINTETGEPTYADDFK (SEQ ID NO.: 17), и CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20). В некоторых вариантах реализации изобретения антигенсвязывающий сайт антитела с двойной специфичностью из стадии (d) связывает исключительно совместно первый эпитоп и второй эпитоп. В других вариантах реализации изобретения антигенсвязывающий сайт антитела с двойной специфичностью из стадии (d) связывает одновременно первый эпитоп и второй эпитоп. В некоторых вариантах реализации изобретения первый эпитоп походит из одной биологической молекулы и второй эпитоп походит из такой же биологической молекулы. В других вариантах реализации изобретения первый эпитоп походит из первой биологической молекулы, а второй эпитоп походит из второй биологической молекулы. В некоторых вариантах реализации изобретения первую биологическую молекулу и вторую биологическую молекулу выбирают из группы, состоящей из ИЛ4/ИЛ5 и ИЛ4/ИЛ13. В некоторых вариантах реализации изобретения первая биологическая молекула и вторая биологическая молекула являются цитокинами. В некоторых вариантах реализации изобретения первая или вторая биологическая молекула представляет собой молекулу, которая, при связывании с данным антителом, может увеличить период полувыведения антитела с двойной специфичностью in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения первая или вторая биологическая молекула представляет собой сывороточный альбумин или неонатальный Fc-рецептор (FcRn). В некоторых вариантах реализации изобретения первая или вторая биологическая молекула представляет собой молекулу, которая, при связывании с данным антителом, может увеличить эффекторную функцию антитела с двойной специфичностью in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения первая или вторая биологическая молекула связывается с белком клеточной поверхности на естественных клетках-киллерах или макрофагах. В некоторых вариантах реализации изобретения белок клеточной поверхности представляет собой Fc-рецептор или C1q. В некоторых вариантах реализации изобретения V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом или вторым эпитопом с K_D 10^-6 или ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом или вторым эпитопом с K_D 10^-9 или ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом или вторым эпитопом с K_D 10^-12 или ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом с K_D 10^-6 или ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом с K_D 10^-9 или ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом с K_D 10^-12 или ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения первая биологическая молекула и вторая биологическая молекула не являются структурно сходными. В некоторых вариантах реализации изобретения отбор на стадии (d) включает глубокое секвенирование, ультраглубокое секвенирование и/или секвенирование следующего поколения.

Типичные антитела, продуцированные с использованием способов по данному изобретению, включают антитела, которые связывают как интерлейкин 4 (ИЛ4), так и интерлейкин 5 (ИЛ5), а также антитела, которые связывают как ИЛ4, так и интерлейкин 13 (ИЛ13), как описано ниже. Успешная продукция этих антител демонстрирует, что изменение последовательности вариабельного домена тяжелой цепи антитела может служить в качестве общего подхода инженерии для создания антител с двойной специфичностью и действием. Антитела с двойной специфичностью, включающие, но не ограниченные ИЛ4/ИЛ5- и ИЛ4/ИЛ13-антителами, описанными в данном документе, обладают потенциалом одновременного таргетирования двух механизмов (с повышенным и не повышенным уровнем) и пригодны для лечения различных заболеваний и нарушений, включая, но не ограничиваясь, иммунными нарушениями, воспалительными нарушениями и пролиферативными нарушениями.

Соответственно, в другом аспекте изобретение отличается выделенным антителом с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающим фрагментом, созданным способом по данному изобретению, описанным выше. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело с двойной специфичностью представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент представляет собой Fab или scFv. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело с двойной специфичностью представляет собой IgG.

В другом аспекте изобретение отличается выделенным антителом с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающим фрагментом, которое содержит аминокислотную последовательность любого из антител на фиг. 4А, 4В, 4С, 7А, 7С или 7D.

В другом аспекте изобретение отличается выделенным антителом с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим следующие шесть CDR: (i) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9); (ii) CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10); (iii) CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTSPWTF (SEQ ID NO.: 11); (iv) CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYDIH (SEQ ID NO.: 14); (v) CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность VWINTETGEPTYADDFK (SEQ ID NO.: 17), и (vi) CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность EILFYGMDY (SEQ ID NO.: 21).

В другом аспекте изобретение отличается выделенным антителом с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим следующие шесть CDR: (i) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9); (ii) CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10); (iii) CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTSPWTF (SEQ ID NO.: 11); (iv) CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYFIH (SEQ ID NO.: 15); (v) CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность AGIVYDATGFTTYADDFK (SEQ ID NO.: 18), и (vi) CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20).

В другом аспекте изобретение отличается выделенным антителом с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим следующие шесть CDR: (i) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9); (ii) CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10); (iii) CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTPFPLTF (SEQ ID NO.: 12); (iv) CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYLMH (SEQ ID NO.: 16); (v) CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность AVIVSITGRTYYADDFK (SEQ ID NO.: 19), и (vi) CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20).

В другом аспекте изобретение отличается выделенным антителом с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим следующие шесть CDR: (i) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9); (ii) CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10); (iii) CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTSPWTF (SEQ ID NO.: 11); (iv) CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYSMH (SEQ ID NO.: 13); (v) CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность GVIFQSGATYYADDFK (SEQ ID NO.: 22), и (vi) CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20).

В другом аспекте изобретение отличается выделенным антителом с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим следующие шесть CDR: (i) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9); (ii) CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10); (iii) CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTSPWTF (SEQ ID NO.: 11); (iv) CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYSMH (SEQ ID NO.: 13); (v) CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность GIIFYTGHTYYADDFK (SEQ ID NO.: 23), и (vi) CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20).

В другом аспекте изобретение отличается выделенным антителом с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим следующие шесть CDR: (i) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9); (ii) CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10); (iii) CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYX₁X₂PWTF (SEQ ID NO.: 24), где X₁ представляет собой Thr, Ile, Leu или Lys, a X₂ представляет собой Ser или His; (iv) CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYFIH (SEQ ID NO.: 15); (v) CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность X₁GIVYDATGFTX₂YAX₃X₄FK (SEQ ID NO.: 25), где X₁ представляет собой Ala или Gly, X₂ представляет собой Thr, Ile, Val или Ala, X₃ представляет собой Asp, Val или Glu и X₄ представляет собой Asp, Glu, Asn, Ser, Ile, Leu, Thr, Ala или Phe, и (vi) CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит следующие шесть CDR: (i) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9); (ii) CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10); (iii) CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTHPWTF (SEQ ID NO.: 27); (iv) CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYFIH (SEQ ID NO: 15); (v) CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность GGIVYDATGFTTYAEEFK (SEQ ID NO.: 28), и (vi) CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит следующие шесть CDR: (i) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9); (ii) CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10); (iii) CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYKHPWTF (SEQ ID NO.: 31); (iv) CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYFIH (SEQ ID NO.: 15); (v) CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность AGIVYDATGFTVYADDFK (SEQ ID NO.: 32), и (vi) CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, дополнительно содержит каркасный участок 3 (FR3), содержащий аминокислотную последовательность GRX₁TITX₂DX₃STSTX₄ (SEQ ID NO.: 26), где X₁ представляет собой Val или Phe, Х₂ представляет собой Arg или Ile, Х₃ представляет собой Thr, Phe, Met или Pro и Х₄ представляет собой Ala или Val.

В другом аспекте изобретение отличается выделенным антителом с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим вариабельный участок легкой цепи, выбранный из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO.: 1, 5, 29 или 33, и вариабельный участок тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID NO.: 2, 3,4, 6, 7, 8, 30 или 34. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает ИЛ4 с Kd 500 нМ или ниже и ИЛ5 с Kd около 900 нМ или ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает ИЛ4 с Kd 100 нМ или ниже и ИЛ5 с Kd около 100 нМ или ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает ИЛ4 с Kd 10 нМ или ниже и ИЛ5 с Kd около 50 нМ или ниже. В других вариантах реализации изобретения выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает ИЛ4 с Kd 500 нМ или ниже и ИЛ13 с Kd около 900 нМ или ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает ИЛ4 с Kd 100 нМ или ниже и ИЛИ с Kd около 100 нМ или ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, ингибирует или блокирует связывание ИЛ4, ИЛ5 или ИЛ13 со своими рецепторами. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой антитело IgG. В некоторых вариантах реализации изобретения антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab-фрагмент или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере часть каркасной последовательности представляет собой консенсусную каркасную последовательность человека. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой химерное, гуманизированное или целое антитело человека.

Предложена также фармацевтическая композиция, содержащая любое из предыдущих антител с двойной специфичностью или их антигенсвязывающих фрагментов. В другом аспекте изобретение отличается выделенной нуклеиновой кислотой, которая кодирует любое из описанных в данном документе антител с двойной специфичностью, содержащая вектор (например, экспрессионный вектор) для экспрессирования этого антитела.

В другом аспекте изобретение отличается клетками-хозяевами, содержащими предыдущие нуклеиновые кислоты и/или векторы. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего (например, клетку яичника китайского хомяка (СНО). В других вариантах реализации изобретения клетка-хозяина представляет собой прокариотическую клетку (например, клетку Е.coli). Предложен также способ продуцирования любого из предыдущих антител с двойной специфичностью, причем способ включает культивирование клетки-хозяина, которая продуцирует антитело с двойной специфичностью, и выделение антитела с двойной специфичностью из клетки-хозяина или культуральной среды.

В другом аспекте изобретение отличается способом лечения у субъекта астмы, причем способ включает введение субъекту любого из описанных в данном документе антител с двойной специфичностью, при этом введение проводится в течение времени и в количестве, достаточном для лечения или предупреждения развития у субъекта астмы. В некоторых вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного средства для лечения астмы, выбранного из группы, состоящей из антагониста IgE, антигистаминного средства, теофилина, сальбутамола, беклометазона дипропионата, натрия кромогликата, стероидного средства и противовоспалительных средств. В некоторых вариантах реализации изобретения астма представляет собой аллергическую астму.

В еще одном аспекте изобретение отличается способом лечения у субъекта пролиферативного нарушения, причем способ включает введение субъекту любого из описанных в данном документе антител с двойной специфичностью, при этом введение проводится в течение времени и в количестве, достаточном для лечения у субъекта пролиферативного нарушения. В некоторых вариантах реализации изобретения пролиферативное нарушение представляет собой рак. В некоторых вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает введение субъекту дополнительного антипролиферативного средства, выбранного из группы, состоящей из химиотерапевтического средства, цитотоксического средства и антиангиогенного средства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1А и 1В представлены графики, показывающие результаты картирования мутагенеза CDR антитела hu19C11. Для измерения относительной аффинности связывания антигенов Fab-вариантов hu19C11, выявляли связывание серийно разбавленного фага, отображавшего методом дисплея анти-ИЛ4 антитело hu19C11 дикого типа (дт) или аланиновые мутанты по CDR LC с анти-gD антителом (А) или ИЛ4 (В), нанесенными на лунки для ИФА, соответственно, путем экспрессии Fab и использования конъюгата анти-М13 фагового антитела с пероксидазой хрена (HRP) для количественного определения связывания антигенов. gD представляет собой экспрессионный пептидный маркер, гибридизированный с С-концом легкой цепи. Анти-gD антитело непосредственно наносили на лунки для ИФА, тогда как ИЛ4 захватывался неблокирующим анти-ИЛ4 антителом, нанесенным на лунки для ИФА.

На фиг. 1С представлен график, показывающий, что влияние аланиновых мутаций в отдельных сайтах CDR исследовали сравнением относительной аффинности связывания ИЛ4 фага, отображавшего Fab-варианты, проведением анализов как для фиг. 1А и 1В. Использованы однобуквенные коды аминокислот. Значения относительной силы связывания ИЛ4 определяли подбором данных с использованием модели линейной регрессии и последующим делением коэффициента наклона прямой связывания ИЛ4 (по отношению к концентрации фага) на коэффициент наклона прямой экспрессии Fab. Низкие значения (ниже пунктирной линии) считались низкой аффинностью связывания ИЛ4 относительно hu1911 дт, что указывает на наличие деструктивных мутаций.

На фиг. 2А представлена структурная диаграмма, показывающая критические остатки для связывания ИЛ4 антителом hu19C11, картированные в иерархическом представлении структуры Fab трастузумаба (PDB: 1FDV). Структурную модель hu19C11 создали программой МОЕ с использованием, соответственно, для тяжелой и легкой цепи в качестве шаблонов 3SQO и 3BEI данных из РОВ. Остатки, важные для связывания ИЛ4, являются остатками LC 31, 32, 50, 53, 91, 92 и остатками НС 31, 32, 96, 98 и 99 (по нумерации Кабата). Остатки на модельной структуре в иерархическом представлении антигенсвязывающего сайта обозначены красным цветом. Библиотеки Fab-вариантов hu19C11, отображенные методом дисплея на фаге, созданы путем сайт-направленной мутации. Остатки НС, для которых допускали использование всех 20 аминокислот с предпочтением остатков дикого типа, отмечены жирным шрифтом, тогда как для других остатков НС и LC, как отмечено, допускали ограниченные мутации для имитации природного разнообразия.

На фиг. 2В представлена таблица, показывающая структуру комбинаторных библиотек для рекрутирования у hu19C11 вторичной антигенной специфичности. Показаны последовательности CDR отобранных клонов, включающие анти-ИЛ5 специфические (5А), анти-ИЛ4/5 специфические (Е7, В1) и анти-ИЛ4/13 специфические (F1, F2) клоны антител с мутациями из исходного hu19C11 дикого типа. Остатки, рандомизированные в библиотеках, и мутации в выделенных клонах затемнены в соответствии с их свойствами: Y, W, F - аминокислоты с ароматической боковой цепью; гидрофобные - L, I, V, А, М; основные - K, R, Н; кислотные - D, Е; полярные - S, Т, N, Q; и Р, G. Показана относительная аффинность связывания антигенов, как измерено по IC50 при проведении конкурентных анализов с фагами. Сначала Fab-отображающий фаг инкубировали с серийными разведениями соответствующих антигенов в растворе в течение 2 ч, потом несвязанный фаг на некоторое время захватывался антигеном, покрывавшем лунки для ИФА, и выявлялся конъюгатом анти-М13 HRP. Концентрацию 50% антигенного ингибирования при связывания фага с лункой, покрытой антигеном, рассчитывали как IC50. «СН» отмечено отсутствие выявляемого связывания клона фагов непосредственно с лунками, покрытыми антигенами.

На фиг. 3 представлен график, показывающий результаты титрования десяти созданных библиотек фаговых дисплеев (от 2144-1 до 2144-10) для определения ИЛ4-связывающей способности.

На фиг. 4А показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельного домена легкой цепи вариантов анти-ИЛ4/ИЛ5 антител hu19C11 с двойной специфичностью (Е7 (SEQ ID NO.: 1) и B1 (SEQ ID NO.: 5)), а также анти-ИЛ5 специфического антитела 5A (SEQ ID NO.: 1), выровненных с анти-ИЛ4 специфическим hu19C11 (SEQ ID NO.: 1).

На фиг. 4В показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи вариантов анти-ИЛ4/ИЛ5 антител hu19C11 с двойной специфичностью (Е7 (SEQ ID NO.: 4) и B1 (SEQ ID NO.: 6)), а также анти-ИЛ5 специфического антитела 5A (SEQ ID NO.: 3), выровненных с анти-ИЛ4 специфическим hu19C11 (SEQ ID NO.: 2).

На фиг. 4С показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи вариантов анти-ИЛ4/ИЛ13 антител hu19C11 с двойной специфичностью (F1 (SEQ ID NO.: 7) и F2 (SEQ ID NO.: 8)), выровненных с анти-ИЛ4 специфическим hu19C11 (SEQ ID NO.: 2).

На фиг. 5 представлено график, показывающий двойную специфичность отобранных вариантов hu19C11 в виде IgG. Антигенсвязывающая специфичность отобранных вариантов hu19C11 оценивали как связывание этих вариантов в форме IgG1 человека при 250 нМ с антигеном(ами)-мишенью(ями) или несколькими нерелевантными белками, нанесенными на лунки для ИФА, с выявлением конъюгатами анти-Fc антитело HRP.

На фиг. 6 представлено график, показывающий определение характеристик специфичности связывания вариантов hu19C11 с двойной специфичностью (анти-ИЛ4 специфического антитела дикого типа: 19С11; анти-ИЛ5 специфического: 5А и анти-ИЛ4/5 специфических: Е7 и В1) в указанных концентрациях антител при блокировании взаимодействия ИЛ5 со своим рецептором. Уровни биотинилированного ИЛ5-рецептора а, связанного с ИЛ5 и иимобилизированного на лунках для ИФА, в присутствии увеличивающихся концентраций гуманизированного 19С11 или вариантов в виде IgG выявляли конъюгатом стрептавидина-HRP.

На фиг. 7А представлена таблица, показывающая аминокислотную последовательность вариантов с созревшей аффинностью ИЛ4/ИЛ5-специфических антител Е7 и их относительная аффинность для антигенов-мишеней, как измерено конкурентными анализами с фагами. Для повышения аффинности, фаговые библиотеки, отображающие варианты Е7, конструировали с выбранными остатками, мутированными по принципам рандомизации «гомолог» (жирный шрифт), «ограниченная мутация» (курсив) и «мягкая мутация» (серый цвет), которые, соответственно, допускали наличие аминокислот дикого типа и гомологичных аминокислот, и ограниченное разнообразие на основе природных антител или приблизительно 50% дикого типа и 50% всех остальных аминокислот. Первоначально CDR Н2 подвергали гомологичной мутации для оптимизации растворимости новорекрутированной функции по связыванию с ИЛ5. Для других CDR, авторами таргетировались те сайты, которые не критичны для связывания ИЛ4. Последовательности отобранных клонов выравнивали с Е7 и показаны мутации. Относительную аффинность каждого клона оценивали по фаговой IC50, как описано выше.

На фиг. 7В представлена таблица, показывающая значения аффинности антитела Е7 и его вариантов с созревшей аффинностью, 1С36 и 1С60, очищенных в виде Fab, как измерено методом Biacore с использованием сенсорного чипа СМ5, иммобилизированного с ИЛ5 человека (R&D Systems) или ИЛ4 при 25°С.

На фиг. 7С показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельного домена легкой цепи вариантов анти-ИЛ4/ИЛ5 антител Е7, 1С36 с двойной специфичностью с повышенной аффинностью (SEQ ID NO.: 29) и 1С60 (SEQ ID NO: 33), выровненные с аминокислотной последовательностью вариабельного домена легкой цепи антитела Е7 (SEQ ID NO.: 1).

На фиг. 7D показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи вариантов анти-ИЛ4/ИЛ5 антител Е7, 1С36 с двойной специфичностью с повышенной аффинностью (SEQ ID NO.: 30) и 1С60 (SEQ ID NO.: 34), выровненные с аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи антитела Е7 (SEQ ID NO.: 4).

На фиг. 8А и 8В представлены графики, показывающие определение характеристик специфичности связывания Е7 и вариантов Е7 с созревшей аффинностью (1С36 и 1С60). Прямое связывание Е7 и варианты Е7 с повышенной аффинностью в виде IgG (100 нМ) с иммобилизованным антигеном и нерелевантными белками на планшете для ИФА выявляли анти-IgG-HRP (А). Связывание биотинилированного ИЛ5 с ИЛ5-рецептором, нанесенным на лунки для ИФА в присутствии буферного раствора (PBS) или 50 нМ Е7, 1С36 или 1С60, выявляли конъюгатом стрептавидина-HRP (В).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Многие пути развития заболеваний возникают посредством воздействия более одного белка или белка, обладающего более чем одной функцией. К примеру, аллергические, воспалительные или аутоиммунные нарушения (например, астма) часто вовлекают множество цитокинов. Антитела с двойной специфичностью пригодны как для терапевтических, так и диагностических применений, в которых требуется таргетинг более одного антигена. Авторы открыли новый способ создания антител с двойной специфичностью. Если V_L антитела содержит остатки, которые критичны для взаимодействия антитело-антиген, то такие антитела потом могут быть диверсифицированы изменением остатков V_H только этого домена или в комбинации с дополнительными остатками V_L и каркаса.

В общем, способы по данному изобретению включают диверсификацию V_H антитела для создания вариантов, которые могут стабильно экспрессироваться в библиотеке. В общем, антитело, которое специфически связывается с первым эпитопом, но не вторым эпитопом, и которое характеризуется как имеющее электростатический или гидрофобный остаток в любой одной, двух или трех аминокислотах, находящихся в положениях 32, 50 или 91 (по нумерации Кабата) V_L, изменяется по одному или более аминокислотным остаткам (например, подверженным влиянию растворителя аминокислотным остаткам) в V_H. Потом V_H и V_L экспрессируют и диверсифицируют антитела с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающие фрагменты, которые способны специфически связываться с первым и вторым эпитопами, потом отбираемые из экспрессированных V_H и V_L.

Типичные антитела, продуцированные с использованием способов по данному изобретению, включают антитела, которые связывают как интерлейкин 4 (ИЛ4), так и интерлейкин 5 (ИЛ5), а также антитела, которые связывают как ИЛ4, так и интерлейкин 13 (ИЛИ), как описано ниже. Эти антитела демонстрируют, что мутации в вариабельном домене тяжелой цепи (например, CDR) ИЛ4-антитела придают свойства двойного связывания дополнительных нерелевантных белков, а также ИЛ4, и предоставляют подтверждение концепции по общей стратегии изменения остатков в V_H для придания двойной специфичности. Антитела с двойной специфичностью, включая, но не ограничиваясь ИЛ4/ИЛ5- и ИЛ4/ИЛ13-антителами, описанными в данном документе, обладают потенциалом одновременного таргетирования множества антигенов, к примеру, механизмов действия цитокинов с повышенным и не повышенным уровнем, что делает их полезными для лечения различных заболеваний и нарушений, включая цитокин-опосредованные заболевания (например, астму).

I. Определения

Термин «мультиспецифическое антитело» используется в самом широком смысле и конкретно охватывает антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L), причем единица V_HV_L обладает полиэпитопной специфичностью (т.е. способна связываться с двумя разными эпитопами на одной биологической молекуле или каждым эпитопом на разных биологических молекулах). Такие мультиспецифические антитела включают, но не ограничиваются, полноразмерными антителами, антителами, обладающими двумя или более доменов V_L и V_H, фрагментами антител, такими как Fab, Fv, dsFv, scFv, диателами, биспецифическими диателами и триателами, фрагментами антител, которые ковалентно или нековалентно связаны. «Полиэпитопная специфичность» предполагает способность специфически связываться с двумя или более разными эпитопами на одной и той же или отличающейся мишени(ях). «Двойная специфичность» или «биспецифичность» относится к способности специфически связываться с двумя разными эпитопами на одной и той же или отличающейся мишени(ях). Однако, в отличие от биспецифических антител, антитела с двойной специфичностью представляют собой природные антитела IgG в форме, в которой две антигенсвязывающие руки идентичны по аминокислотной последовательности и каждая Fab-рука способна к распознаванию двух антигенов. Двойная специфичность дает возможность антителам взаимодействовать с высокой аффинностью с двумя разными антигенами как одна молекула Fab или IgG. В соответствии с одним вариантом реализации изобретения мультиспецифическое антитело в форме IgG1 связывается с каждым эпитопом с аффинностью от 5 мкМ до 0,001 пМ, от 3 мкМ до 0,001 пМ, от 1 мкМ до 0,001 пМ, от 0,5 мкМ до 0,001 пМ или от 0,1 мкМ до 0,001 пМ. Термин «моноспецифический» относится к способности связывать только один эпитоп.

В общем, антитело содержит основную 4-цепочечную единицу антитела, которая представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей (антитело IgM состоит из 5 основных гетеротетрамерных единиц вместе с дополнительным полипептидом, называемым J-цепь, и поэтому содержит 10 антигенсвязывающих сайтов, тогда как секретируемые антитела IgA могут полимеризоваться с образованием поливалентных агрегатов, включающих 2-5 основных 4-цепочечных единиц вместе с J-цепью). В случае IgG 4-цепочечная единица обычно имеет массу 150000 Дальтон. Каждая L-цепь связана с Н-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как две Н-цепи связаны друг с другом одной или более дисульфидными связями в зависимости от изотипа Н-цепи. Каждая Н- и L-цепь также имеет расположенные с равными интервалами межцепочечные дисульфидные мостики. На N-конце каждая Н-цепь имеет вариабельный домен (V_H), за которым следуют три константных домена (C_H) для каждой α- и γ-цепей и четыре СН-домена для μ- и ε-изотипов. На N-конце каждая L-цепь имеет вариабельный домен (V_L), за которым следует константный домен (C_L) на ее другом конце. V_L выравнивается с V_H, a C_L выравнивается с первым константным доменом тяжелой цепи (C_H1). Предполагается, что конкретные аминокислотные остатки должны образовывать область разделения между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Соединение V_H и V_L попарно вместе образует антигенсвязывающий сайт. В отношении структуры и свойств разных классов антител, см., например, Basic and Clinical Immunology. 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6. L-цепь из любого вида позвоночных может быть отнесена к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа и лямбда, на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена своих тяжелых цепей (C_H), иммуноглобулины могут быть отнесены к разным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющие тяжелые цепи, обозначенные соответственно α, δ, γ, ε и μ. Классы γ и α дополнительно разделяются на подклассы на основе относительно незначительных различий в последовательности C_H и функционирования, например, организм людей экспрессирует следующие подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.

Термин «вариабельный» относится к тому факту, что среди антител некоторые сегменты вариабельных доменов сильно различаются по последовательностям. Вариабельный или «V»-домен медиирует антигенное связывание и определяет специфичность конкретного антитела к своему конкретному антигену. В то же время вариабельность не является равномерно распределенной на промежутке из 110 аминокислот вариабельных доменов. Вместо этого, V-участки состоят из относительно инвариантных промежутков, называемых каркасные участки (FR), из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками с чрезвычайной вариабельностью, называемыми «гипервариабельными участками», которые составляют в длину 9-12 аминокислот каждый. Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, преимущественно принимающих конфигурацию бета-листа, соединенных тремя гипервариабельными участками, которые образуют петли, соединяющие структуру бета-листа, а в некоторых случаях - образующие часть структуры бета-листа. Гипервариабельные участки каждой цепи объединены друг с другом в непосредственной близости с помощью FR и, вместе с гипервариабельными участками другой цепи, участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, однако проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности (АЗКЦ).

Термин «гипервариабельный участок», если используется в данном документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывания антигена. Гипервариабельный участок обычно содержит аминокислотные остатки из «определяющего комплементарность участка» или «CDR» (например, примерно около 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) остатков в V_L и примерно около 26-35 (H1), 49-65 (Н2) и 95-102 (Н3) остатков в V_H (в одном варианте реализации изобретения, HI состоит из примерно около 31-35 остатков); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или этих остатков из «гипервариабельной петли» (например, 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) остатки в V_L, и 26-32 (H1), 53-55 (Н2), и 96-101 (Н3) - в V_H; Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).

Термин «моноклональное антитело», как используется в настоящем документе, относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. отдельных антител, составляющих популяцию, являющихся практически сходными и связывающих один и тот же эпитоп(ы), за исключением возможных вариантов, которые могут появляться в процессе продуцирования моноклонального антитела, такие варианты обычно присутствуют в незначительных количествах. Такое моноклональное антитело, как правило, содержит антитело, содержащее вариабельный участок, который связывает мишень, причем антитело получают процессом, включающим отбор антитела из множества антител. К примеру, процесс отбора может представлять собой отбор уникального клона из множества клонов, например, пула гибридомных клонов, фаговых клонов или клонов рекомбинантных ДНК. Следует понимать, что выбранное антитело может быть дополнительно изменено, например, с целью повышения аффинности к мишени, гуманизации антитела, повышения его продукции в культуре клеток, снижения его иммуногенности in vivo, создания мультиспецифического антитела и т.д., и что антитело, содержащее измененную последовательность вариабельного участка, также является моноклональным антителом по этому изобретению. Кроме своей специфичности, преимущество препаратов моноклональных антител заключается в том, что они как правило не контаминированы другими иммуноглобулинами. Модификатор «моноклональное» указывает на свойство антитела, как на полученное из практически гомогенной популяции антител, и его не следует интерпретировать как требование продуцирования антитела посредством какого-либо конкретного способа. К примеру, моноклональные антитела, которые предполагается применять в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены различными способами, включая гибридомную технологию (например, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981), методами с использованием рекомбинантных ДНК (см. например, пат. США №4816567), технологии фаговых дисплеев (см. например, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004) и Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004) и технологии продуцирования антител человека или аналогов антител человека в организмах животных, которые содержат частичные или целые локусы или гены иммуноглобулинов человека, кодирующие последовательности иммуноглобулинов человека (см., например, WO 98/24893, WO/9634096, WO/9633735 и WO/91 10741, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); патенты США №5545806, 5569825, 5591669 (все - компании GenPharm); 5545807; WO 97/17852, патенты США №5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5661016, и Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996) и Lonberg и Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).

Моноклональные антитела в данном документе специально включают химерные, гуманизированные, целые антитела и антитела с созревшей аффинностью. Химерные антитела представляют собой антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из конкретных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, тогда как оставшаяся часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагментов таких антител, поскольку они проявляют требуемую биологическую активность (пат. США №4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Представляющие интерес химерные антитела в данном документе включают «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельных доменов, происходящих из организмов приматов кроме человека (например узконосая обезьяна, человекообразная обезьяна и т.д.) и последовательности константных участков человека.

«Гуманизированные» формы нечеловеческих антител (например, грызуна) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческого антитела. В большинстве случаев, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки гипервариабельного участка реципиента заменены остатками гипервариабельного участка нечеловеческого вида (донорское антитело), такого как мышь, крыса, кролик или примат кроме человека, имеющего требуемую специфичность, аффинность и характеристику антитела. В некоторых случаях остатки каркасных участков (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не встречающиеся в реципиентном антителе или донорском антителе. Эти модификации проведены для дополнительного усовершенствования характеристик антител. В общем, гуманизированное антитело будет содержать практически все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют таким участкам иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, а все или практически все FR соответствуют таким участкам последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также не обязательно будет содержать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно происходящий из иммуноглобулина человека. Более подробно см. Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

«Антитело человека» представляет собой антитело, обладающее аминокислотной последовательностью, которая соответствует последовательности антитела, продуцированного организмом человека и/или полученной с использованием любой методики создания антител человека. Из этого определения антитела человека, в частности, исключено гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки нечеловеческого происхождения.

Антитело «с созревшей аффинностью» представляет собой антитело, содержащее одно или более изменений в одном или более CDR, которые приводят к повышению аффинности антитела к антигену по сравнению с исходным антителом, не содержащим такого изменения(ий). Предпочтительные антитела с созревшей аффинностью будут иметь наномолярные или даже пикомолярные значения аффинности к антигену-мишени. Антитела с созревшей аффинностью продуцируют методиками, известными в данной области техники. Marks et al. Bio/Technology 10: 779-83 (1992) описывает созревание аффинности методом перетасовки доменов V_H и V_L. Случайный мутагенез CDR и/или каркасных остатков описан в источниках: Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-13 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-55 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-19 (1995) и Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-96 (1992).

«Интактное антитело» представляет собой антитело, которое содержит антигенсвязывающий сайт, а также C_L, и по меньшей мере константные домены тяжелой цепи C_H1, C_H2 и C_H3. Константные домены могут быть константными доменами нативных последовательностей (например, константные домены нативных последовательностей человека) или их вариант аминокислотных последовательностей. Предпочтительно, интактное антитело обладает одной или более эффекторных функций.

«Фрагменты антитела» содержат часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv-фрагменты; диатела; линейные антитела (см. патенты США №5641870, пример 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Экспрессия «линейных антител» обычно относится к антителам, описанным в Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995). Вкратце, эти антитела составляют пару тандемных Fd-сегментов (V_H-C_H1-V_H-C_H1), которые вместе с комплементарными полипептидами легких цепей образуют пару антигенсвязывающих участков. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.

При расщеплении антител папаином образуются два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемые «Fab»-фрагментами, и остаточный «Few-фрагмент, название которого отражает его способность к легкой кристаллизации. Fab-фрагмент состоит из целой L-цепи вместе с доменом вариабельного участка Н-цепи (V_H), и первым константным доменом из одной тяжелой цепи (C_H1). Обработка антитела пепсином дает один большой F(ab')₂-фрагмент, который условно соответствует двум дисульфидносвязанным Fab-фрагментам, имеющим дивалентную антигенсвязывающую активность и еще способным к перекрестному связыванию антигена. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что имеют несколько дополнительных остатков на карбоксильном конце C_H1-домена, включая один или более цистеинов из шарнирного участка антитела. В данном документе Fab'-SH представляет собой обозначение Fab', в котором цистеиновый остаток(и) константных доменов несет свободную тиольную группу. F(ab')₂-фрагменты антител первоначально получали в виде пар Fab'-фрагментов, между которыми находятся шарнирные остатки цистеина. Известны также другие варианты химического связывания фрагментов антител.

Fc-фрагмент содержит карбокситерминальные части обоих Н-цепей, удерживаемых вместе дисульфидными связями. Эффекторные функции антител определяются по последовательностям в Fc-участке; этот участок также является частью, распознаваемой Fc-рецепторами (FcR), обнаруженными на определенных видах клеток.

«Fv» состоит из димера одного домена вариабельного участка тяжелой цепи и одного вариабельного участка домена легкой цепи, соединенных жесткой нековалентной связью. При фолдинге этих двух доменов выделяется шесть гипервариабельных петель (по 3 петли на каждой Н- и L-цепи), которые дают аминокислотные остатки для связывания антигенов и придают антителу антигенсвязывающую специфичность. В то же время даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфические для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя часто с более низкой аффинностью, чем целый сайт связывания.

«Одноцепочечные Fv», также имеющие аббревиатуру «sFv» или «scFv», представляют собой фрагменты антител, которые содержат домены антител V_H и V_L, связанные в одну полипептидную цепь. Предпочтительно, чтобы scFv-полипептид дополнительно содержал полипептидный линкер между V_H- и V_L-доменами, которые дают возможность scFv образовывать требуемую структуру для связывания антигенов. Для обзора sFv, см. публикацию Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995.

Термин «диатела» относится к малым фрагментам антител, полученным конструированием sFv-фрагментов (см. предыдущий параграф) с такими короткими линкерами (около 5-10 остатков) между V_H- и V_L-доменами, чтобы достигалось спаривание V-доменов между цепями, но не внутри цепей, приводящее к получению бивалентного фрагмента, т.е фрагмента, имеющего два антигенсвязывающих сайта. Биспецифические антитела представляют собой гетеродимеры двух «кроссоверных» sFv-фрагментов, в которых V_H- и V_L-домены двух антител представлены на разных полипептидных цепях. Диатела подробнее описаны, к примеру, в ЕР 404097; WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Термином «электростатический» обозначают обладание зарядом. В целом, электростатические аминокислоты имеют полярные или заряженные боковые цепи. Примеры аминокислот с полярными боковыми цепями включают серии, треонин, тирозин, цистеин, аспарагин и глутамин. Примеры аминокислот с отрицательно заряженными боковыми цепями включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Примеры аминокислот с положительно заряженными боковыми цепями включают лизин, аргинин и гистидин.

Термином «гидрофобный» обозначают несовместимость с водой или отсутствие растворимости, абсорбирования или легкого смешивания с водой. В целом, гидрофобные аминокислоты имеют неполярные боковые цепи и их примеры включают аланин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, триптофан и валин.

Термин «цитокин» представляет собой общий термин для белков, высвобождаемых одной популяцией клеток, которые действуют на другую клетку как межклеточные медиаторы. Примеры цитокинов включают лимфокины, монокины и традиционные полипептидные гормоны. Среди цитокинов учитываются гормоны роста, такие как гормон роста человека, N-метионильный гормон роста человека и гормон роста крупного рогатого скота; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин и проинсулин; релаксин и прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликул стимулирующий гормон (ФСГ), тиреостимулирующий гормон (ТСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ); фактор роста клеток печени; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухолей-α и -β; ингибирующее вещество Мюллера; гонадотропин-ассоциированный гормон мыши; ингибин; актин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (ТПО); факторы роста нервной ткани, такие как ФРН-β; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (ТФР), такие как ТФР-α и ТФР-β; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (ЭПО); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-α, -β и -γ; колониестимулирующие факторы (КСФ), такие как КСФ макрофагов (М-КСФ); КСФ гранулоцитов-макрофагов (ГМ-КСФ) и КСФ гранулоцитов (Г-КСФ); интерлейкины (ИЛ), такие как ИЛ1, ИЛ1α, ИЛ2, ИЛ3, ИЛ4, ИЛ5, ИЛ6, ИЛ7, ИЛ8, ИЛ11, ИЛ12 и ИЛ13; фактор некроза опухолей, такой как ФНО-α или ФНО-β, и другие полипептидные факторы, включающие ЛИФ и кит-лиганд (КЛ). Как используется в данном документе, термин цитокин включает белки, полученные из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток, и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативными последовательностями.

Как используется в данном документе, «кодонный набор» относится к набору разных последовательностей нуклеотидных триплетов, используемых для кодирования требуемых вариантных аминокислот. Набор олигонуклеотидов может синтезироваться, к примеру, методом твердофазного синтеза, включая последовательности, которые представляют все возможные комбинации нуклеотидных триплетов, обеспеченных кодонным набором, и которые будут кодировать требуемую группу аминокислот. Стандартная форма обозначения кодонов соответствует коду, установленному МБС, который известен в данной области и описан в данном документе. Как правило, кодонный набор представлен 3 заглавными буквами курсивом, например, NNK, NNS, XYZ, DVK, и тому подобное (например, NNK кодон предполагает N=A/T/G/C в положениях в кодоне 1 и 2 и K=G/T в эквимолярном соотношении в положении 3 для кодирования всех 20 природных аминокислот). «Неслучайный кодонный набор», как используется в данном документе, таким образом, относится к кодонному набору, который кодирует выбранные аминокислоты, удовлетворяющие частично, предпочтительно полностью, критерии для отбора аминокислот, как описано в данном документе. Синтез олигонуклеотидов с выбранной нуклеотидной «вырожденностью» в определенных положениях хорошо известен в данной области техники, к примеру, при использовании подхода TRIM (Knappek et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 1999); Garrard и Henner, Gene 128:103, 1993). Такие наборы олигонуклеотидов, имеющие определенные кодонные наборы, могут синтезироваться с использованием коммерческих синтезаторов нуклеиновых кислот (доступных, к примеру, в компании Applied Biosystems, г. Фостер Сити, Калифорния) или могут быть получены коммерческим заказом (к примеру, из компании Life Technologies, г. Роквилл, Мэриленд). Поэтому, набор олигонуклеотидов, синтезированный с конкретным кодонным набором, как правило, будет содержать множество олигонуклеотидов с разными последовательностями, причем отличия определяются кодонным набором в пределах всей последовательности. Олигонуклеотиды, как используется в соответствии с данным изобретением, имеют последовательности, которые допускают гибридизацию с нуклеиновокислотной матрицей вариабельного домена и также могут, но не обязательно, содержать сайты для ферментов рестрикции, к примеру, в целях проведения клонирования.

Антитело по этому изобретению, «которое связывает» представляющий интерес антиген, представляет собой антитело, которое связывает антиген с достаточной аффинностью такой, чтобы антитело стало пригодным в качестве диагностического и/или терапевтического средства при таргетинге белка или клетки или ткани, экспрессирующей данный антиген, и в значительной степени перекрестно не реагировало с другими белками. В таких вариантах реализации изобретения степень связывания антитела с «нецелевым» белком будет меньше чем около 10% от связывания данного антитела со своим конкретным белком-мишенью, как определено анализом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) или радиоиммунопреципитацией (РИА) или ИФА. Применительно к связыванию антитела с молекулой-мишенью, термин «специфическое связывание» или «специфически связываться с» или является «специфическим к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретной полипептидной мишени означает связывание, которое измеряемо отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может быть измерено, к примеру, определением связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы. К примеру, специфическое связывание может определяться конкуренцией с контрольной молекулой, которая сходна с мишенью, к примеру, при избытке немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание показывает, может ли связывание меченой мишени с зондом полностью ингибироваться избытком немеченой мишени. Термин «специфическое связывание» или «специфически связывается с» или является «специфическим к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретной полипептидной мишени, как используется в данном документе, может быть проиллюстрирован, к примеру, молекулой, обладающей K_D для мишени 10^-4 М или ниже, альтернативно 10^-5 М или ниже, альтернативно 10^-6 М или ниже, альтернативно 10^-7 М или ниже, альтернативно 10^-8 М или ниже, альтернативно 10^-9 М или ниже, альтернативно 10^-10 М или ниже, альтернативно 10^-11 М или ниже, альтернативно 10^-12 М или ниже или K_D в диапазоне от 10^-4 М до 10^-12 М или от 10^-6 М до 10^-10 М или от 10^-7 М до 10^-9 М. Как будет понятно специалисту в данной области, значения аффинности и K_D связаны обратной зависимостью. Высокая аффинность для антигена измеряется низким значением K_D. В одном варианте реализации изобретения термин «специфическое связывание» относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде без значительного связывания с любым другим полипептидом или полипептидным эпитопом.

«Биологически активный», «биологическая активность» и «биологические свойства» применительно к полипептиду по этому изобретению означают способность к связыванию с биологической молекулой, кроме случаев, когда указано иное.

«Биологическая молекула» относится к нуклеиновой кислоте, белку, углеводу, липиду и их комбинациям. В одном варианте реализации изобретения биологическая молекула существует в природе.

«Выделенный», когда используется для описания различных антител, описанных в данном документе, обозначает антитело, которое идентифицировано и отделено и/или выделено из клетки или культуры клеток, в которой оно экспрессировано. Контаминирующие компоненты природного окружения представляют собой вещества, которые, как правило, могут мешать диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах реализации изобретения антитело будет очищено (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков на N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности путем использования секвенатора с вращающейся чашкой или (2) до гомогенности, полученной методом ДСН-ПААГ электрофореза в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях, используя Кумасси синий или, предпочтительно, окрашивание серебром. Выделенное антитело включает антитела, полученные in situ внутри рекомбинантных клеток, поскольку по меньшей мере один компонент из полипептидного природного окружения будет отсутствовать. В то же время, выделенный полипептид обычно будет получен с использованием по меньшей мере одной стадии очистки.

Термин «контрольные последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Контрольные последовательности, которые пригодны для введения в прокариоты, к примеру, включают промотор, не обязательно операторную последовательность и сайт связывания рибосом. Известно, что в эукариотических клетках используются промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда она помещена в функциональную зависимость от другой последовательности нуклеиновой кислоты. К примеру, ДНК предпоследовательности или секреторного лидера является функционально связанной с ДНК полипептида, если она экспрессируется как пребелок, принимающий участие в секреции этого полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию этой последовательности, или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы облегчать прохождение трансляции. В целом, «функционально связанный» означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются непрерывными и, в случае наличия секреторного лидера, непрерывными и в фазе считывания. Тем не менее, энхансеры не должны быть непрерывными. Связывание сопровождается лигированием по подходящим сайтам рестрикции. Если таких сайтов нет, то в соответствии с подходящей методикой используются синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» применительно к полипептидным последовательностям, идентифицируемым в данном документе, определяется как процентное содержание аминокислотных остатков в потенциальной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в подлежащем сравнению полипептиде, если необходимо, после выравнивания этих последовательностей и введения гэпов для достижения максимального процента идентичности последовательностей и, не учитывая любые консервативные замены, как части идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может достигаться различными способами, которые находятся в пределах компетенции в данной области, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как BLAST, BLAST-2, ALIGN или программное обеспечение Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения степени выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания на полной длине подлежащих сравнению последовательностей. В то же время, для целей данного документа, значения % идентичности аминокислотных последовательностей формируются с использованием компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 разработана компанией Genentech Inc., а исходный код представлен в документации пользователя в Бюро по охране авторских прав, г. Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где он зарегистрирован под № регистрации авторского права TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной в компании Genentech Inc., г. Южный Сан Франциско, Калифорния. Программу ALIGN-2 необходимо компилировать для применения на операционной системе UNIX, предпочтительно digital UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей заданы программой ALIGN-2 и не изменяются.

Аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, являются непрерывными аминокислотными последовательностями, если не указано иное.

«Структурно несходные» биологические молекулы в соответствии с этим изобретением относятся к биологическим молекулам, которые не принадлежат к тому же классу (белок, нуклеиновая кислота, липид, углеводы и т.д.) или, к примеру, когда они относятся к белкам, обладающим менее 60% идентичности аминокислот, менее 50% идентичности аминокислот, менее 40% идентичности аминокислот, менее 30% идентичности аминокислот, менее 20% идентичности аминокислот или менее 10% идентичности аминокислот при сравнении друг с другом.

«Жесткость условий» реакций гибридизации легко определяется средним специалистом в данной области и обычно представляет собой эмпирический расчет в зависимости от длины зондов, температуры промывания и концентрации солей. В общем, более длинные зонды требуют более высоких температур для правильного отжига, тогда как более короткие зонды требуют более низких температур. Обычно гибридизация зависит от способности денатурированной ДНК к отжигу, когда комплементарные цепи представлены в окружении с температурой ниже их температур плавления. Чем выше степень требуемой гомологии между зондом и способной к гибридизации последовательности, тем выше относительная температура, которая может быть использована. В результате, из этого следует, что более высокие относительные температуры могут способствовать созданию более жестких условий реакции, тогда как более низкие температуры менее способствуют этому. В отношении дополнительных подробностей и объяснения жесткости условий реакций гибридизации, см. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

«Жесткие условия» или «очень жесткие условия», как определено в данном документе, могут быть установлены по таким параметрам: (1) применение низкой ионной силы и высокой температуры для промывания, к примеру, 0,015 М хлорид натрия/0,0015 М цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50С; (2) применение во время гибридизации денатурирующего агента, такого как формамид, к примеру, 50% (об./об.) формамид с 0,1% бычьего сывороточного альбумина/0,1% фиколла/0,1% поливинилпирролидона/50 мМ буферного раствора фосфата натрия при рН 6,5 с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42°С, или (3) гибридизация в течение ночи в растворе, в котором использован 50% формамид, 5 × SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 × раствор Денхардта, обработанная ультразвуком ДНК из молок лососевых (50 мкг/мл), 0,1% ДСН и 10% декстрана сульфат при 42°С, с промыванием 10 минут при 42°С в 0,2 × SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) с последующим промыванием в очень жестких условиях 10 минут, включающем раствор 0,1 × SSC, содержащий ЭДТА при 55°С.

«Умеренно жесткие условия» могут быть определены, как описано авторами Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, и включать применение раствора для промывания и условия гибридизации (например, температуру, ионную силу и % ДСН) менее жесткие, чем описанные выше. Примером умеренно жестких условий является инкубация в течение ночи при 37°С в растворе, содержащем: 20% формамид, 5 × SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ цитрат тринатрия), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5 × раствор Денхардта, 10% декстрана сульфат и 20 мг/мл денатурированной разрезанной ДНК из молок лососевых с последующим промыванием фильтров в 1 × SSC при около 37-50°С. Специалист в данной области должен знать, как подобрать температуру, ионную силу и т.п., как необходимые для соответствия факторам, таким как длина зондов и тому подобное.

«Эффекторные функции» антител относятся к биологическим видам активности, присущим Fc-участку (Fc-участок с нативной последовательностью или вариант аминокислотной последовательности Fc-участка) антитела и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; снижение экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток) и активацию В-клеток.

«Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность» или «АЗКЦ» относится к образованию цитотоксичности, при которой секретированный Ig связывается на Fc-рецепторах (FcR), презентированных на определенных цитотоксических клетках (например, естественных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), давая возможность этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с несущей антиген клеткой-мишенью и впоследствии убивать эту клетку-мишень цитотоксинами. Антитела являются «оружием» цитотоксических клеток и абсолютно необходимы для обеспечения такой гибели. Первичные клетки для медиирования АЗКЦ, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные по экспрессии FcR на гемопоэтических клетках собраны в табл. 3 на странице 464 статьи Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Для оценки активности АЗКЦ представляющей интерес молекулы может проводиться анализ АЗКЦ in vitro, такой как описанный в патенте США №5500362 или 5821337. Пригодные для таких анализов эффекторные клетки включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и естественные клетки-киллеры (NK). В альтернативном варианте, или дополнительно, активность АЗКЦ представляющей интерес молекулы может оцениваться in vivo, например, на модели на животном, такой как описано в Clynes et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 95: 652-656 (1998).

Термин «Fc-рецептор» или «FcR» описывает рецептор, который связывается с Fc-участком антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Более того, предпочтительный FcR представляет собой рецептор, который связывает антитело IgG (гамма рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые обладают сходными аминокислотными последовательностями, которые главным образом отличаются своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит в своем цитоплазматическом домене иммунорецепторный активирующий мотив на основе тирозина (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит в своем цитоплазматическом домене иммунорецепторный ингибирующий мотив на основе тирозина (ITIM) (см. обзор М. in , Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcR рассмотрены в статье Ravetch и Kinet, (Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)); Capel et al., (Immunomethods 4: 25-34 (1994)) и de Haas et al., (J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)). Другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, в данном документе охвачены термином «FcR». Этот термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).

«Эффекторные клетки человека» представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или более FcR и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют эффекторную функцию АЗКЦ. Примеры лейкоцитов человека, которые медиируют АЗКЦ, включают мононуклеарные клетки периферийной крови (МКПК), естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; предпочтительными являются МКПК и NK-клетки. Эффекторные клетки могут быть выделены из нативного источника, например, из крови.

«Комплементзависимая цитотоксичность» или «КЗЦ» относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны с распознаваемым ними антигеном. Для оценки активации комплемента, может быть выполнен анализ КЗЦ, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антитела или фрагмента антитела для лечения у субъекта заболевания или нарушения. В случае аллергического, воспалительного или аутоиммунного заболевания (например, астма, артрит и т.д.), терапевтически эффективное количество антитела или фрагмента антитела (например, антитела с двойной специфичностью или мультиспецифического антитела или фрагмента антитела к ИЛ4 и ИЛ5 или ИЛ4 и ИЛ13) может облегчать или лечить заболевание, или предупреждать, уменьшать, облегчать или лечить симптомы, связанные с этим заболеванием. В случае пролиферативного заболевания (например, злокачественной опухоли) терапевтически эффективное количество антитела или фрагмента антитела может уменьшать количество раковых клеток; уменьшать размер первичной опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и предпочтительно останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; до определенной степени ингибировать рост опухоли и/или до некоторой степени облегчать один или более симптомов, связанных с этим нарушением. В тех случаях, когда антитело или фрагмент антитела может предупреждать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. При лечении рака эффективность in vivo может быть измерена, например, оценкой продолжительности выживаемости, времени до прогрессирования заболевания (ТТР), продолжительности безрецидивной выживаемости (DFS), продолжительности выживаемости без прогрессирования (PFS), частот положительного ответа (RR), продолжительности ответа и/или качества жизни.

Под «уменьшением или ингибированием» понимают способность вызывать общее снижение предпочтительно на 20% или больше, предпочтительнее на 50% ли больше и предпочтительнее всего на 75%, 85%, 90%, 95% или больше. Уменьшение или ингибирование может относиться к симптомам подлежащего лечению нарушения, наличию или размеру метастазов, размеру первичной опухоли или размеру или количеству кровеносных сосудов при ангиогенных нарушениях.

«Воспалительное заболевание», как используется в данном документе, относится к патологическим состояниям, приводящим к воспалению, как правило, вызванному хемотаксисом нейтрофилов.

«Аутоиммунное заболевание», как используется в данном документе, представляет собой заболевание или нарушение, возникающее из и направленное против собственных тканей индивидуума, или его совместное выявление или проявление, или обусловленное им состояние.

Примеры заболеваний или нарушений, которые являются воспалительными, аутоиммунными, или ими обоими, включают, но не ограничиваются, астмой, такой как астма бронхиале, бронхиальная астма и аутоиммунная астма, артритом (ревматоидный артрит, такой как острый артрит, хронический ревматоидный артрит, подагрический артрит, острый подагрический артрит, хронический воспалительный артрит, дегенеративный артрит, инфекционный артрит, артрит Лайма, пролиферативный артрит, псориатический артрит, спинной артрит и юношеский ревматоидный артрит, остеоартрит, хронический прогрессирующий артрит, деформирующий артрит, первичный хронический артрит, реактивный артрит и анкилозирующий спондилит), воспалительными гиперпролиферативными болезнями кожи, псориазом, таким как бляшечный псориаз, чешуйчатый псориаз, пустулезный псориаз и псориаз ногтей, дерматитом, включающий контактный дерматит, хронический контактный дерматит, аллергический дерматит, аллергический контактный дерматит, герпетиформный дерматит и атопический дерматит, Х-сцепленным гипер IgM-синдромом, крапивницей, такой как хроническая аллергическая крапивница и хроническая идиопатическая крапивница, включая хроническую аутоиммунную крапивницу, полимиозитом/дерматомиозитом, юношеским дерматомиозитом, токсическим эпидермальным некролизом, склеродермой (включающую системную склеродерму), склерозом, таким как системный склероз, рассеянный склероз (PC), такой как спинооптический PC, первичнопрогрессирующий PC (ППРС) и рецидивирующе-ремиттирующий PC (РРРС), прогрессирующий системный склероз, атеросклерозом, артериосклерозом, диссеминированным склерозом и атаксическим склерозом, воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК) (к примеру, болезнь Крона, аутоиммуноопосредованными заболеваниями пищеварительного тракта, колит, такой как ульцеративный колит, язвенный колит, микроскопический колит, коллагенозный колит, полипозный колит, некротизирующий энтероколит и трансмуральный колит и аутоиммуное воспалительное заболевание пищеварительного тракта), гангренозной приодермией, узелковой эритемой, первичным склерозирующим холангитом, эписклеритом, синдромом дыхательной недостаточности, включающем синдром зрелого возраста или синдром острой дыхательной недостаточности (СОДН), менингитом, воспалением всей или части сосудистой оболочки глаза, радужной оболочки глаза, хороидитом, аутоиммуным нарушением со стороны кроветворной системы, ревматоидным спондилитом, синдромом внезапной потери слуха, IgE-опосредованными заболевания, такими как анафилаксия, аллергический и атопический ринит, гипер IgE-опосредованным синдромом, энцефалитом, таким как энцефалит Рассмусена и лимбический энцефалит и/или энцефалит ствола головного мозга, увеитом, таким как передний увеит, острый передний увеит, грануломатозный увеит, негрануломатозный увеит, факоантигенный увеит, задний увеит или аутоиммуный увеит, гломерулонефритом (ГН) с и без нефротического синдрома, таким как хронический или острый гломерулонефрит, таким как первичный ГН, иммунноопосредованный ГН, мембранный ГН (мембранная нефропатия), идиопатический мембранный ГН или идиопатическая мембранная нефропатия, мембранно- или мембранный пролиферативный ГН (МПГН), включающий I тип и II тип, и быстро прогрессирующий ГН, аллергическими состояниями, аллергической реакцией, экземой, включающей аллергическую или атопическую экзему, склеродермой, болезнью Уиппла, гипертрофическим рубцеванием, преэклампсией, спайками брюшной полости, состояниями с вовлечением инфильтрации Т-клеток и хроническими воспалительными реакциями, хроническим пульмональным воспалительным заболеванием, аутоиммунным миокардитом, нарушением адгезии лейкоцитов, системной красной волчанкой (СКВ) или системной эритематозной волчанкой, такой как кожная СКВ, подострая кожная красная волчанка, синдром неонатальной волчанки (СНВ), диссеминированная красная волчанка, волчанкой (включающей нефрит, церебрит, детскую, непочечную, внепочечную, дисковидную, алопецию), юношеским (I типа) сахарным диабетом, включающим инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) у детей, сахарный диабет зрелого возраста (диабет II типа), аутоиммунный диабет, идиопатический несахарный диабет, иммунными реакциями, связанными с острой и замедленной гиперчувствительностью, опосредованными цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулезом, саркоидозом, гранулематозом, включающим лимфоматоидный гранулематоз, гранулематоз Вегенера, агранулоцитоз, васкулитами, включающими васкулит (включая васкулит крупных сосудов (включая ревматическую полимиалгия и гигантоклеточный артрит (Такаясу)), артрит средних сосудов (включая болезнь Кавасаки и узелковый полиартериит), микроскопическим полиартритом, васкулитом ЦНС, некротизирующим, кожным или гиперчувствительным васкулитом, системным некротизирующим васкулитом и АНЦА-ассоциированным васкулитом, таким как васкулит или синдром Чарга-Строса (СЧС)), височным артритом, апластической анемией, аутоиммунной апластической анемией, анемией с положительным тестом Кумбса, анемией Даймонда-Блэкфана, гемолитической анемией или иммунной гемолитической анемией, включающей аутоиммунную гемолитическую анемию (АИГА), злокачественную анемию (пернициозная анемия), болезнью Аддисона, врожденной апластической анемией или аплазией (ВАА), недостаточностью фактора VIII, гемофилией А, аутоиммунной нейтропенией, панцитопенией, лейкопенией, заболеванием с вовлечением диапедеза лейкоцитов, воспалительными нарушениями ЦНС, синдром с множественным поражением органов, таким как вторичные поражения при септицемии, травме или кровопотере, опосредованными комплексами антиген-антитело заболевания, заболеванием легочного гемосидероза с гломерулонефритом, синдромом с антифосфолипидными антителами, аллергическим невритом, синдромом Бехчета или болезнью Бехчета, синдромом Кастлемана, синдромом Гудпасчера, синдромом Рейно, синдромом Шегрена, синдромом Стивенса-Джонсона, пемфигоидом, таким как буллезный пемфигоид и кожный пемфигоид, пузырчаткой (включающей обыкновенную пузырчаку, листовидную пузырчатку, пузырчатый слизисто-мембранный пемфигоид и эритематозную пузырчатку), аутоиммунными полиэндокринопатиями, болезнью или синдромом Рейтера, нефритом от иммунных комплексов, антителоопосредованным нефритом, оптиконевромиелитом, полинейропатиями, хронической нейропатией, такой как IgM-полинейропатии или IgM-опосредованная нейропатия, тромбоцитопенией (как развивающаяся, к примеру, у пациентов с инфарктом миокарда), включающей тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТП) и аутоиммунную или иммунноопосредованную тромбоцитопению, такую как идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), включающая хроническую или острую ИТП, аутоиммунной болезнью яичек и яичников, включающей аутоиммуный орхит и оофорит, первичным гипотироидизмом, гипопаратироидизмом, аутоиммунными эндокринными заболеваниями, включающими тироидит, такой как аутоиммунный тироидит, болезнь Хашимото, хронический тироидит (тироидит Хашимото) или подострый тироидит, аутоиммунным заболеванием щитовидной железы, идиопатическим гипотироидизмом, болезнью Грэйвса, полигландулярными синдромами, такими как аутоиммунные полигландулярные синдромы (или полигландулярные эндокринопатические синдромы), паранеопластическими синдромами, включающими нейрологические паранеопластические синдромы, такие как миастенический синдром Ламберта-Итона или синдром Ламберта-Итона, синдром скованного человека или мышечной скованности, энцефаломиелитом, таким как аллергический энцефаломиелит или энцефаломиелит аллергика и экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ), тяжелой миастенией, такой как ассоциированная с тимомой тяжелая миастения, мозжечковой дегенерацией, нейромиотонией, опсоклонусом или синдромом опсоклонус-миоклонус (СОМ) и сенсорной невропатией, мультифокальной двигательной нейропатией, синдромом Шихена, аутоиммунным гепатитом, хроническим гепатитом, волчаночным гепатитом, гигантоклеточным гепатитом, хроническим острым гепатитом или аутоиммунным хроническим активным гепатитом, лимфатическим интерстициальным пневмонитом, облитерирующим бронхиолитом (нетрансплатационным) в отличии от НСИП, синдромом Гийена-Барре, болезнью Бергера (IgA-зависимая нефропатия), идиопатической IgA-зависимой нефропатией, линеарным IgA-зависимым дерматозом, первичным биллиарным циррозом, пневмоциррозом, аутоиммунным энтеропатическим синдромом, целиакией, целиакией-спру (глютеновая энтеропатия), рефракторной целиакией, идиопатической целиакией, криоглобулинемией, боковым амниотрофическим склерозом (БЛС; болезнью Лу-Герига), ишемической болезнью сердца, аутоиммунным заболеванием уха, таким как аутоиммунное заболевание внутреннего уха (АЗВУ), аутоиммунной потерей слуха, синдромом опсоклонус-миоклонус (СОМ), полихондритом, таким как рефракторный или рецедивирующий полихондрит, легочно-альвеолярным протеинозом, амилоидозом, склеритом, доброкачественным лимфоцитозом, первичным лимфоцитозом, который включает моноклональный лимфоцитоз В-клеток (например, доброкачественная моноклональная гаммопатия и моноклональная гаммапатия неустановленной этиологии, МГНЭ), периферической нейропатией, паранеопластическим синдромом, каналопатиями, такими как эпилепсия, мигрень, аритмия, нервно-мышечные нарушения, глухота, слепота, периодический паралич и каналопатии ЦНС, аутизмом, воспалительной миопатией, фокально-сегментарным гломерулосклерозом (ФСГС), эндокринной офтальмопатией, увеоретинитом, хориоретинитом, аутоиммунным заболеванием печени, фибромиалгией, множественной эндокринной недостаточностью, синдромом Шмидта, адреналитом, желудочной атрофией, пресенильной деменцией, демиелинизирующими заболеваниями, такими как аутоиммунные демиелинизирующие заболевания, диабетической нефропатией, синдромом Дресслера, гнездной алопецией, КРЕСТ-синдромом (кальциноз, феномен Рейно, пищеводная дискинезия, склеродактилия и телеангиэктазия), аутоиммунным бесплодием у мужчин и женщин, смешанным поражением соединительной ткани, болезнью Шагаса, ревматической лихорадкой, привычным выкидышем, легким фермера, мультиформной эритемой, посткардиотомным синдромом, синдромом Кушинга, легким птицеводов, аллергическим гранулематозным ангиитом, доброкачественным лимфоцитарным ангиитом, синдромом Альпорта, альвеолитом, таким как аллергический альвеолит и фиброзирующий альвеолит, интерстициальным заболеванием легких, трансфузионной реакцией, проказой, малярией, лейшманиозом, трипаносомозом, шистосоматозом, аскаридозом, аспергиллезом, синдромом Сэмптера, синдромом Каплана, лихорадкой денге, эндокардитом, эндомиокардиальным фиброзом, диффузным интерстициальным фиброзом легких, интерстициальным фиброзом легких, идиопатическим легочным фиброзом, муковисцидозом, эндофтальмитом, стойкой возвышающейся эритемой, эритробластозом плода, эозинофильным фасциитом, синдромом Шульмана, синдромом Фелти, флариазом, циклитом, таким как хронический циклит, гетерохронический циклит, иридоциклит или циклит Фукса, пурпурой Шенлейна-Геноха, инфекцией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), эховирусной инфекцией, кардиомиопатией, болезнью Альцгеймера, парвовирусной инфекцией, инфекцией вируса краснухи, поствакцинальными синдромами, врожденной инфекцией краснухи, инфекцией вируса Эпштейна-Барр, паротитом, синдромом Эванса, аутоиммунной гонадной дисфункцией, хореей Сиденгама, постстрептококковым нефритом, облитерирующим тромбоангиитом, тиреотоксикозом, сухоткой спинного мозга, хориоидитом, гигантоклеточной полимиалгией, эндокринной офтамопатией, хроническим гиперчувствительным пневмонитом, сухим кератоконъюнктивитом, эпидемическим кератоконъюнктивитом, идиопатическим нефритическим синдромом, нефропатией минимальных изменений, доброкачественным наследственным и ишемически-реперфузионным повреждением, ретинальной аутоиммунной реакцией, воспалением суставов, бронхитом, хроническим обструктивным заболеванием легких, силикозом, высыпаниями на слизистой оболочке, афтозным стоматитом, артериосклеротическими нарушениями, аспермиогенезом, аутоиммунным гемолизом, болезнью Бека, криоглобулинемией, контрактурой Дюпюитрена, факоанафинактической эндофтальмией, аллергическим энтеритом, узловатой лепрозной эритемой, идиопатическим паралич лицевого нерва, синдром хронической усталости, ревматической лихорадкой, болезнью Хаммена-Рича, сенсонейральной потерей слуха, пароксизмальной гемоглобинурией, гипогонадизмом, регионарным илеитом, лекопенией, инфекционным мононуклеозом, поперечным миелитом, первичной идиопатической микседемой, нефрозом, симпатической офтальмией, гранулематозным орхитом, панкреатитом, острым полирадикуитом, гангренозной пиодермией, тиреоидитом де Кервена, приобретенной атрофией селезенки, бесплодием из-за антител против сперматозоидов, незлокачественной тимомой, витилиго, ТКИД и ассоциированными с вирусом Эпштейна-Барр заболеваниями, приобретенным синдромом иммунодефицита (СПИД), паразитарными заболевания, такие как лейшмания, синдромом токсического шока, пищевым отравлением, состояниями с вовлечением инфильтрации Т-клеток, нарушением адгезии лейкоцитов, иммунными реакциями, связанными с острой и замедленной гиперчувствительностью, вызванными цитокинами и Т-лимфоцитами, заболеваниями с вовлечением диапедеза лейкоцитов, синдромом множественного поражения органов, опосредованными комплексами антиген-антитело заболеваниями, заболеванием антигломерулярной базальной мембраны, аллергическим нейритом, аутоиммунными полиэндокринопатиями, оофоритом, первичной микседемой, аутоиммунным атрофическим гастритом, симпатической офтальмией, ревматическими заболеваниями, смешанным поражением соединительной ткани, нефротическим синдромом, инсулитом, полиэндокринной недостаточность, периферической нейропатией, аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа, идиопатическим гипопаратиреоидизмом зрелого возраста (ИГЗВ), тотальной алопецией, дилатационной кардиомиопатией, приобретенным буллезным эпидермолизом (ПБЭ), гемохроматозом, миокардитом, нефротическим синдромом, первичным склерозирующим холангитом, гнойным или негнойным синуситом, острым или хроническим синуситом, этмоидальным, фронтальным, максиллярным или сфеноидальным синуситом, аутоиммунной пузырчаткой, нарушением, связанным с эозинофилами, таким как эозинофилия, идиопатический гиперэозинофильный синдром, эозинофильный инфильтрат легкого, синдром эозинофилии-миалгии, синдром Леффлера, хроническая эозинофильная пневмония, тропическая легочная эозинофилия, бронхопневмонийным аспергиллезом, аспергилломой или гранулемой, содержащей эозинофилы, анафилаксией, серонегативным спондилоартритом, аутоиммунным полиэндокринным заболеванием, склерозирующим холангитом, склерой, эписклерой, хроническим кожно-слизистым кандидозом, синдром Брутона, транзиторной гипогаммаглобулинемией новорожденных, синдромом Вискотта-Олдрича, атаксией-телеангиэктазией, аутоиммунными нарушениями, ассоциированными с коллагеновой болезнью, ревматизмом, неврологическим заболеванием, ишемическим нарушением, связанным с реперфузией, реакцией снижения кровяного давления, сосудистой дисфункцией, ангиэктазией, поражением тканей, кардиоваскулярной ишемией, гипералгезией, церебральной ишемией и заболеванием, сопровождающимся васкуляризацией, аллергическими гиперчувствительными нарушениями, гломерилонефритом, реперфузионным повреждением, реперфузионным повреждением миокардиальной или других тканей, дерматозами с компонентами острого воспаления, острым гнойным менингитом или другими воспалительными нарушениями центральной нервной системы, офтальмологическими и глазничными воспалительными нарушениями, гранулоцитарными трансфузионноассоциированными синдромами, цитокининдуцированной токсичностью, острым тяжелым воспалением, хроническим неустранимым воспалением, пиелитом, пневмоциррозом, диабетической ретинопатией, диабетическим поражением крупных артерий, внутриартериальной гиперплазией, пептической язвой, вальвулитом и эндометриозом.

«Аллергическое заболевание» в данном документе представляет собой заболевание или нарушение, при котором индивид является гиперсенсибилированным и проявляет иммунологическую реакцию по отношению к веществу, которое в обычных условиях является неиммуногенным. Аллергическое заболевание обычно характеризуется активизацией тучных клеток с помощью IgE, порождая воспалительную реакцию, которая может приводить к таким умеренным симптомам как насморк до представляющего угрозу жизни анафилактического шока и смерти. Примеры аллергического заболевания включают, но не ограничиваются, астмой (например, аллергическая астма), аллергическим ринитом (например, сенная лихорадка), аллергическим дерматитом (например, экзема), контактным дерматитом, пищевой аллергией и крапивницей.

Вышеприведенный список не является всеобъемлющим и специалисту в данной области должно быть понятно, что любое заболевание или нарушение может попадать в различные категории. К примеру, астма является как аллергическим, так и воспалительным нарушением и считается некоторыми практикующими врачами аутоиммунным нарушением.

Термины «рак» и «раковый» относятся к или описывают физиологическое состояние млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Данное определение включает доброкачественные и злокачественные раковые заболевания.

Термин «предраковый» относится к состоянию или новообразованию, которое, как правило, предшествует или развивается в раковое заболевание.

Термин «пролиферативное заболевание», как используется в данном документе, представляет собой заболевание или нарушение, которое ассоциируется с некоторой степенью пролиферации аномальных клеток. В одном варианте реализации изобретения пролиферативное клеточное нарушение представляет собой рак. В некоторых вариантах реализации изобретения раковое заболевание, выбрано из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, немелкоклеточного рака легких, неходжкинской лимфомы (НХЛ), В-клеточной лимфомы, В-клеточной лейкемии, множественной миеломы, рака почек, рака простаты, рака печени, рака головы и шеи, меланомы, рака яичников, мезотелиомы и глиобластомы.

Термин «опухоль», как используется в данном документе, относится к росту и пролиферации всех неопластических клеток, как злокачественных, так и доброкачественных, а также предраковых и раковых клеток и тканей.

Термином «неметастатический» обозначает рак, который является доброкачественным, или который остается в первичной локализации и не проникает в лимфатическую или кровеносную сосудистую систему или в ткани, отличающиеся от тканей первичной локализации. В целом, неметастатический рак представляет собой любой рак, являющийся раком 0, I или II стадии, и в редких случаях рак III стадии.

«Субъект» является позвоночным, предпочтительно млекопитающим, предпочтительнее человеком. Млекопитающие включают, но не ограничиваются, сельскохозяйственными животными (такие как коровы), животными для спорта, домашними животными (такие как кошки, собаки и кони), приматами, мышами и крысами.

II. Создание антител с двойной специфичностью.

Вариабельный домен (V_H) тяжелой цепи содержит значительно большее разнообразие последовательностей и предоставляет детерминанты антигенного распознавания чаще, чем вариабельный домен (V_L) легкой цепи. Предыдущие результаты авторов изобретения впервые продемонстрировали, что вариабельный домен легкой цепи может быть изменен с целью продукции одного антитела с двойной специфичностью (см. опубликованную патентную заявку США №20080069820 и статью Bostrom et al., Science 232: 1610-1614 (2009), полное описание которых включено в данный документ посредством ссылки). Авторами обнаружено, что антитела с двойной специфичностью могут быть созданы из антител, которые имеют остатки V_L, являющиеся критичными для антигенного распознавания, путем изменения аминокислотных остатков в V_H, включая отсутствие введения мутации в V_L. Эти новые и оригинальные способы подробно описаны ниже.

Авторами обнаружено, что в V_L могут быть идентифицированы специфические остатки, которые являясь электростатическими или гидрофобными, дают возможность считать, что такой V_L является критическим для антигенного распознавания. В таких случаях, изменение V_H антитела применяется для создания антитела с двойной специфичностью, которое связывает как первый эпитоп, так и второй эпитоп. Конкретно, если любой один, два или три аминокислотные остатки в положениях 32, 50 или 91 (по нумерации Кабата) антитела являются электростатическими (например, тирозин) или гидрофобными (например, триптофан), тогда последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая V_H этого антитела, изменяется по одному или более кодонам V_H, которые кодируют один или более доступных для растворителя аминокислотных остатков.

В различных вариантах реализации изобретения остатки в V_H, которые могут быть изменены, включают любую одну или более аминокислот 33, 34, 50-58 или 95-97. Не обязательно, в дополнение к остаткам тяжелой цепи могут быть изменены аминокислотные остатки 93-96 легкой цепи. Доступность для растворителя или важность для антигенного распознавания для тяжелой цепи может быть определена с использованием стандартных методик, известных в данной области, включающих, но не ограниченных, структурным картированием и аланин-сканирующим мутагенезом.

Потом экспрессируются V_L и измененный V_H (например, в виде библиотеки) и отбирается антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает V_L и измененный V_H, специфически связывающееся с первым эпитопом и вторым эпитопом. В дополнение к V_H может изменяться или может не изменяться V_L исходного антитела. В дополнение к V_H могут изменяться или могут не изменяться аминокислотные остатки в каркасном участке исходного антитела.

Антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое идентифицируют посредством указанных выше способов отбора, может быть дополнительно модифицировано для увеличения аффинности к одному или обоим антигенам-мишеням, к примеру, способом созревания аффинности или другими известными в данной области способами. Процесс отбора при созревании аффинности может включать применение подхода масштабного параллельного секвенирования (например, глубокое секвенирование, ультраглубокое секвенирование или секвенирование следующего поколения) для идентификации остатка(ов) (например, остатки подверженные действию растворителя или не подверженные действию растворителя), которые способствуют связыванию одного или обоих антигенов-мишеней (например, способствуют увеличению аффинности к антигену-мишени). См., к примеру, Fowler et al. Nat. Methods. 7(9): 741-746, 2010. Антитело с двойной специфичностью также может быть модифицировано для увеличения стабильности или времени полувыведения, или для уменьшения иммуногенности. Такие модификации известны специалистам в данной области.

III. Терапевтическое применение

Антитела с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе в данном документе, которые связывают как ИЛ4, так и ИЛ5 (например, B1, Е7 и варианты Е7 с созревшей аффинностью) или ИЛ4 и ИЛ13 (например, F1 и F2) могут применяться для лечения, супрессирования или предупреждения заболевания, такого как аллергические, воспалительные и аутоиммунные заболевания (например, астма); ИЛ4-опосредованного заболевания; ИЛ5-опосредованного заболевания; ИЛ13-опосредованного заболевания; ИЛ4/ИЛ5-опосредованного заболевания; ИЛ4/ИЛ13-опосредованного заболевания и/или пролиферативных нарушений (например, рака).

Примеры воспалительных и аутоиммунных заболеваний или нарушений, которые могут излечиваться антителами с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающими фрагментами, описаны выше. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание или нарушение включает, но не ограничивается, астмой, такой как астма бронхиале, бронхиальная астма и аутоиммунная астма.

Астму описывают как хроническое легочное заболевание, которое охватывает воспаление дыхательных путей, гиперреактивность и обструкцию. Физиологически, гиперреактивность дыхательных путей подтверждается пониженной бронхиальной проходимостью дыхательных путей после бронхопровокации метахолином или гистамином. Другие инициирующие факторы, которые вызывают обструкцию дыхательных путей, включают холодный воздух, физическую нагрузку, вирусную инфекцию верхних дыхательных путей, сигаретный дым и респираторные аллергены. Бронхиальная провокация аллергенами индуцирует у многих пациентов быстрое опосредованное иммуноглобулином Е (IgE) уменьшение бронхиальной проходимости дыхательных путей ранней фазы, сопровождающееся опосредованной IgE реакцией поздней фазы с уменьшением бронхиальной проходимости дыхательных путей на 4-8 часов. Ранний ответ обусловлен резким высвобождением воспалительных веществ, таких как гистамин, ПГД₂, лейкотриен, триптаза и фактор активации тромбоцитов (ФАТ), в то время как поздний ответ обусловлен синтезированными de novo провоспалительными цитокинами (например ФНОα, ИЛ4, ИЛ13) и хемокинами (например МСР-1 и MIP-1α) (Busse et al. In: Allergy: Principles and Practice, Ed. Middleston, 1173 (1998)). У хронических астматических пациентов стойкие легочные симптомы медиируются повышенным откликом Th2-клеток. Считается, что Th2-цитокины играют важную роль для развития заболевания (Larche et al., J. Allergy Clin. Immunol., III: 450 (2003)), а именно, ИЛ13 и ИЛ4, продуцированные Th2-клетками с NK-фенотипом (NKT) в дыхательных путях, как показано на модели астмы на грызунах (Akbari et al., Nature Med., 9: 582 (2003)). Макропатология астматических дыхательных путей отображает гипервентиляцию легких, гипертрофию гладкой мускулатуры, утолщение ретикулярной пластинки, отек слизистой, шелушение эпителиальных клеток, разрушение реснитчатых клеток и гиперсекрецию слизистой железы. Микроскопически, астма характеризуется наличием в бронхиальных тканях увеличенных количеств эозинофилов, нейтрофилов, лимфоцитов и плазмоцитов, бронхиальных выделений и слизи. Сначала, происходит рекрутирование лейкоцитов из кровотока в дыхательные пути при участии активированных CD4+ Т-лимфоцитов. Активированные Т-лимфоциты также непосредственно высвобождают воспалительные медиаторы из эозинофилов, тучных клеток и лимфоцитов. В дополнение к этому, Th2-клетки продуцируют ИЛ4, ИЛ5, ИЛ9 и ИЛ13. ИЛ4, в сочетании с ИЛ13, передает сигнал, который переключает синтез антител IgM на IgE.

Перекрестное связывание мембраносвязанных молекул IgE аллергеном приводит к дегрануляции тучных клеток, высвобождению гистамина, лейкотриенов и других медиаторов, которые закрепляют воспаление дыхательных путей. ИЛ5 активирует рекрутирование и активацию эозинофилов. Активированные тучные клетки и эозинофилы также синтезируют свои цитокины, которые помогают закрепить воспаление. Эти повторяющиеся циклы воспаления в легких с повреждением тканей легких с последующим восстановлением могут вызывать продолжительные структурные изменения («ремоделирование») дыхательных путей.

Умеренная астма в настоящее время лечится ежедневными ингаляциями противовоспалительных кортикостероидов или ингибитора активности тучных клеток, такого как кромолин натрия или недокромил, плюс, при необходимости, ингаляцией бета2-агониста (3-4 раза в сутки) для облегчения симптомов обострения или индуцированной аллергенами или физической нагрузкой астмы. Кромолин натрия и недокромил блокируют бронхоспазм и воспаление, но обычно эффективны только в отношении астмы, которая ассоциирована с аллергенами или физической нагрузкой и, как правило, только для астматиков юношеского возраста. Введенные ингаляцией кортикостероиды снижают воспаление, гиперреактивность и обструкцию дыхательных путей, и уменьшают количество острых приступов болезни. Однако, для того, чтобы воздействие лечения стало явным, требуется по меньшей мере месяц и до года - для того, чтобы произошло отчетливое улучшение. Наиболее частыми побочными эффектами являются хриплость голоса и грибковая инфекция ротовой полости, т.е. кандидоз. Сообщалось о более серьезных побочных эффектах, например, частичной адренальной супрессии, ингибировании роста и уменьшенном костеобразовании, но только при применении повышенных доз. Беклометазон, триамцинолон и флунизолид вероятно обладают сходной активностью; тогда как будезонид и флутиказон являются более активными и, по сообщениям, дают меньше системных побочных эффектов.

Даже у пациентов с умеренным заболеванием проявляется воспаление дыхательных путей, включающее инфильтрацию слизистой оболочки и эпителия активированными Т-клетками, тучными клетками и эозинофилами. Т-клетки и тучные клетки высвобождают цитокины, которые способствуют росту и созреванию эозинофилов и продукции антител IgE, и эти факторы, в свою очередь, увеличивают микрососудистую проницаемость, разрушают эпителий и стимулируют нервные рефлексы и слизисто-секретирующие железы. Результатом является гиперреактивность дыхательных путей, бронхостеноз и гиперсекреция, проявляемые сопением, кашлем и одышкой.

Традиционно, астму лечили пероральными и ингаляционными бронхорасширяющими средствами. Эти средства помогают подавить симптомы астмы, но никоим образом не лежащее в основе воспаление. Признание в последние 10 лет важности воспаления в этиологии астмы привело к увеличению применения кортикостероидов, но многие пациенты продолжают страдать от неконтролируемой астмы.

Антитела с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающие фрагменты, со специфичностью к ИЛ4, ИЛ5, и/или ИЛ13 должны таргетировать множественное механизмы патологического процесса и могут применяться для лечения астмы как терапевтическое средство, сами по себе или в комбинации с дополнительными видами терапии (например, известными в данной области или описанными выше).

В дополнительных вариантах реализации изобретения антитела с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающие фрагменты, могут использоваться для лечения рака. Термин рак охватывает набор пролиферативных нарушений, включающие, но не ограниченные, предраковыми новообразованиями, доброкачественными опухолями и злокачественными опухолями. Доброкачественными опухоли остаются локализированными в месте возникновения и не обладают способностью к инфильтрации, прорастанию или метастазированию в удаленные места. Злокачественные опухоли будут прорастать и повреждать вокруг них другие ткани. Они также могут получить способность оторваться от места, где начали расти, и распространиться в другие части тела (метастазировать), обычно через кровоток или через лимфатическую систему, в которой расположены лимфатические узлы. Первичные опухоли классифицируют по типу ткани, из которой они возникли; метастатические опухоли классифицируют по типу ткани, из которой происходят раковые клетки. С течение времени, клетки злокачественной опухоли становятся более аномальными и оказываются менее похожими на нормальные клетки. Это изменение во внешнем виде раковых клеток называется степенью злокачественности опухоли, а раковые клетки описывают как хорошо дифференцированные, умеренно дифференцированные, слабо дифференцированные или недифференцированные. Хорошо дифференцированные клетки имеют достаточно нормальный внешний вид и напоминают нормальные клетки, из которых они происходят. Недифференцированные клетки представляют собой клетки, которые стали настолько аномальными, что больше невозможно определить происхождение клеток.

IV. Дозировки и лекарственные формы.

Композиции с антителом или фрагментом антитела следует составлять, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы, которые следует учитывать в данном контексте, включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подвергаемое лечению, клиническое состояние отдельно взятого пациента, причину нарушения, область доставки средства, способ введения, график введения и другие факторы, известные медицинским работникам. «Терапевтически эффективное количество» антитела или фрагмента антитела, требующего введения, будет регулироваться такими соображениями и составлять минимальное количество необходимое для предупреждения, облегчения или лечения аллергического, воспалительного, аутоиммунного или пролиферативного заболевания или нарушения или его симптомов. Дозировка и временные интервалы введения антитела или фрагмента антитела по данному изобретению будет зависеть от различных клинических факторов, включающих общее состояние здоровья субъекта и тяжесть симптомов, к примеру, аллергического нарушения. Данное изобретение включает применение антител или фрагментов антител для лечения, предупреждения или уменьшения аллергических нарушений, или вызванных ими симптомов, или риска развития у субъекта аллергических нарушений. Антитело или фрагмент антитела может вводиться в любое время, к примеру, после диагностирования или выявления аллергического нарушения или состояния, связанного с аллергическим нарушением, или для предупреждения аллергического нарушения у субъектов, у которых еще не диагностировали аллергическое нарушение, но существует риск развития такого нарушения (например, субъекты, страдающие от или подлежащие лечению в отношении нарушенной иммунной системы), после определения риска развития аллергического нарушения.

Антитела с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающие фрагменты, по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде лекарственной формы и введены различными способами, например, путями, известными для особых показаний, включая, но не ограничиваясь, введением ингаляцией, местно, перорально, подкожно, бронхиальной инъекцией, внутривенно, интрацеребрально, интраназально, трансдермально, внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрилегочно, вагинально, ректально, внутриартериально, интрацереброспинально, интраартикулярно, внутрисуставно, внутриочагово, парентерально, интравентикулярно в головной мозг или интраокулярно. К примеру, антитела, или фрагменты антител, могут быть приготовлены в форме пилюли, таблетки, капсулы, жидкости или таблетки с замедленным высвобождением для перорального введения; или жидкости для внутривенного, подкожного введения; полимера или другого носителя для замедленного высвобождения для местного введения; мази, крема, геля, жидкости или пластыря для местного введения.

Местное введение может быть особенно востребованным в случае, если побочные эффекты или токсичность связана с антагонизмом с ИЛ4, ИЛ5 или ИЛ13. Для терапевтического применения также может использоваться стратегия ex vivo. Стратегии ех vivo включают трансфецирование или трансдуцирование клеток, полученных у субъекта, полинуклеотидом, кодирующим антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент. Трансфецированные или трансдуцированные клетки потом обратно вводят субъекту. Клетки могут быть любыми из большого диапазона типов, включающих, без ограничения, гемопоэтические клетки (например, клетки костного мозга, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, Т-клетки или В-клетки), фибробласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты или мышечные клетки.

К примеру, для лечения или предупреждения развития нарушения может использоваться непрерывная системная инфузия или периодическое инъецирование антител с двойной специфичностью. Лечение может продолжаться в течение периода времени в диапазоне от 1 суток до длительности времени жизни субъекта, предпочтительнее от 1 до 100 суток и предпочтительнее всего от 1 до 20 суток, а предпочтительнее всего до тех пор, пока симптомы аллергического, воспалительного, аутоиммунного или пролиферативного заболевания или нарушения, или их симптомы, не уменьшатся или исчезнут. Дозировки варьируют в зависимости от соединения и тяжести состояния. Антитела с двойной специфичностью или их антигенсвязывающие фрагменты, могут вводиться непрерывно путем инфузии, используя имплантируемый насос с постоянной или программируемой подачей, или путем периодических инъекций. Могут также использоваться системы с замедленным высвобождением. При определенных обстоятельствах устройства с полупроницаемыми имплантируемыми мембранами также пригодны как средства доставки антител с двойной специфичностью или их антигенсвязывающих фрагментов. В другом варианте реализации изобретения антитела с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающие фрагменты, вводятся местно, например, путем ингаляции, и введение может повторяться периодически. Может также использоваться ингаляционное введение, например, путем использования ингалятора или распылителя и лекарственной формы с аэрозольным агентом. Антитело также может вводиться в легкие пациента в форме композиции сухого порошка (см., например, пат. США №6514496).

Дозировка антител с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающих фрагментов, будет зависеть от других критических факторов, таких как масса и состояние субъекта и пути введения этого соединения. Для лечения субъектов может вводиться приблизительно между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг массы тела антител с двойной специфичностью или их антигенсвязывающих фрагментов. Более предпочтительный диапазон составляет от 1 мг/кг до 50 мг/кг массы тела с самым предпочтительным диапазоном от 1 мг/кг до 25 мг/кг массы тела. В зависимости от времени полувыведения антител или фрагментов антител у конкретного субъекта, антитела или фрагменты антител могут вводиться от нескольких раз в сутки до одного раза в неделю. Способы по настоящему изобретению, представленные для одного, а также для многократных введений, выполняются одновременно или в течение длительного периода времени.

Предпочтительно, чтобы антитела с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающие фрагменты, вводили парентерально или внутривенно путем непрерывной инфузии или местно путем ингаляции. Доза и режим дозирования зависит от тяжести заболевания и общего состояния здоровья субъекта. Для парентерального введения антитела с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающие фрагменты, готовят в виде инъекционной стандартной лекарственной формы (раствор, суспензия, эмульсия) в сочетании с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем. Такие носители являются заведомо нетоксичными и не оказывающими лечебного действия. Примерами таких носителей являются вода, солевой раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и 5% раствор сывороточного альбумина человека. Могут также использоваться неводные носители, такие как нелетучие масла и этилолеат. В качестве носителей могут использоваться липосомы. Носитель может содержать незначительные количества добавок, таких как вещества, которые улучшают изотоничность и химическую стабильность, например, буферные вещества и консерванты. Антитела с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающие фрагменты, как правило, готовят в виде лекарственной формы с такими носителями в концентрациях от около 1 мг/мл до 10 мг/мл. Для введения путем ингаляции антитела с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающие фрагменты, вводятся в состав любым подходящим способом с образованием аэрозольной формы по настоящему изобретению. Композицию, содержащую антитела с двойной специфичностью, или их антигенсвязывающие фрагменты, испаряют или распыляют с, или без, фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества для получения пара, который может конденсироваться и вдыхаться непосредственно в легкие, к примеру, используя ингалятор. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества могут быть летучими, и классы таких вспомогательных веществ известны в данной области, и включают, без ограничения, газообразные, жидкие и твердые растворители и растворители в состоянии сверхкритической жидкости. Типичные носители в пределах этих классов включают, без ограничения, воду, стерильный солевой раствор, физиологические буферные растворы, подобные фосфатно-солевому буферному раствору, терпены, спирты, пропиленгликоль, глицерин и другие сходные спирты, сухой лед, диметилформамид, диметилацетамид, диоксид углерода в состоянии сверхкритической жидкости и их смеси.

Требуемая дозировка зависит от выбора пути введения; природы лекарственной формы; природы болезни субъекта; размера, массы, площади поверхности тела, возраста и пола субъекта; других вводимых лекарственных веществ и усмотрения лечащего врача. Принимая во внимание разнообразие доступных полипептидов и фрагментов и различающуюся эффективность различных путей введения следует предполагать широкие вариации требуемой дозировки. К примеру, следует ожидать, что пероральное введение потребует более высоких дозировок, чем введение путем внутривенной инъекции. Вариации этих уровней дозирования могут регулироваться с использованием стандартных эмпирических путей оптимизации, как широко распространено в данной области. Введение может быть однократным или многократным (например, 2-, 3-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150-раз или более). Инкапсулирование полипептида в подходящем носителе для доставки (например, полимерные микрочастицы или имплантируемые устройства) может увеличивать эффективность доставки, особенно пероральной доставки.

В одном варианте реализации изобретения по лечению астмы антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, не обязательно должно быть, но в некоторых случаях входит в лекарственную форму или вводится в комбинации (одновременно или последовательно) с одним или несколькими средствами, в настоящее время используемыми для предупреждения или лечения астмы, или риска развития астмы. Антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, может быть введено в лекарственную форму, к примеру, с антагонистом IgE, бронхорасширяющими лекарственными веществами (например, агонистами бета2-адренорецепторов, ксантинами, антагонистами холинорецепторов), противовоспалительными средствами (например, динатрия кромогликатом (DSCG), недокромилом натрия, антигистаминами, такими как кетотифен, кортикостероидами, такими как преднизолон), теофиллином, сальбутамолом, беклометазоном дипропионатом или другим лечащим астму средством, известным в данной области. Эффективное количество таких других средств зависит от количества антитела с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающего фрагмента, присутствующего в лекарственной форме, типа нарушения или лечения и других факторов, отмеченных выше.

Терапевтические лекарственные формы готовят с использованием стандартных способов, известных в данной области, смешиванием действующего вещества, имеющего требуемую степень чистоты, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences (20^th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Приемлемые носители включают солевой раствор или буферные растворы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные (менее чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахароспирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий, и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или ПЭГ.

Не обязательно, но предпочтительно, чтобы лекарственная форма содержала фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно хлорид натрия, и предпочтительно в приблизительно физиологических концентрациях. Не обязательно лекарственные формы по данному изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый консервант. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация консерванта находится в диапазоне от 0,1 до 2,0%, обычно об./об. Подходящие консерванты включают консерванты, известные в фармацевтической области. Типичными консервантами являются бензиловый спирт, фенол, м-крезол, метилпарабен и пропилпарабен. Не обязательно лекарственные формы по данному изобретению могут включать фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество в концентрации от 0,005 до 0,02%.

Лекарственная форма, описанная в данном документе, также может содержать более одного активного соединения, требуемого при конкретном показании подлежащем лечению, предпочтительно с дополняющими видами активности, которые не оказывают негативного влияния друг на друга. Такие молекулы присутствуют в надлежащей комбинации в количествах, которые эффективны для использования по назначению.

Действующие вещества могут также заключаться в микрокапсулы, полученные, например, методиками коацервации или межфазной полимеризации, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и полиметилметакрилатные микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны в издании Remington's Pharmaceutical Sciences, выше.

Могут быть приготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем матрицы представлены в форме, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (к примеру, поли-2-гидроксиэтилметакрилат или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США №3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразрушаемый этилвинилацетат, разрушаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как полимеры, такие как этиленвинилацетат и молочная кислота-гликолевая кислота, обеспечивают возможность высвобождать молекулы дольше 100 суток, определенные гидрогели высвобождают белки в течении более коротких периодов времени. Если инкапсулированные антитела остаются в организме в течение длительного времени, то они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°С, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям иммуногенности. Для стабилизации могут быть разработаны рациональные стратегии, зависящие от участвующего механизма. К примеру, если обнаружено, что механизм агрегации вызывает образование межмолекуляной связи S-S посредством тиодисульфидного обмена, то стабилизация может быть достигнута модификацией сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислых растворов, регулированием содержания влаги, использованием подходящих добавок и разработкой специальных композиций с полимерными матрицами.

В одном примере антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, вводится местно, например, если при данном нарушении допустимо, прямыми инъекциями и инъекции могут повторяться периодически, или ингаляцией. Антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, может также доставляться субъекту системно или непосредственно в пораженную область.

В данном изобретении предложена также композиция, содержащая антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, и фармацевтически приемлемый носитель или растворитель. Эта композиция для терапевтического применения является стерильной и может быть лиофилизирована. Подразумевается также применение антитела с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающего фрагмента, по этому изобретению в производстве лекарственного средства для лечения описанных в данном документе показаний. Композиция может дополнительно содержать второе лекарственное средство, такое как противоастматические средство, противовоспалительное средство или антипролиферативное средство (например, химиотерапевтическое средство, цитотоксическое средство или антиангиогенное средство).

V. Промышленные препараты и наборы.

В другом варианте реализации изобретения предложен промышленный препарат, содержащий вещества пригодные для лечения заболеваний или нарушений (например, аллергических заболеваний или нарушений или астмы). В еще одном варианте реализации изобретения предложен промышленный препарат, содержащий вещества пригодные для лечения воспалительных, аутоиммунных и пролиферативных заболеваний или нарушений. Промышленный препарат включает контейнер и этикетку или листок-вкладыш в упаковке, нанесенный на или связанный с контейнером. Подходящие контейнеры включают, к примеру, бутыли, флаконы, шприцы и т.п. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, эффективно лечащую указанное состояние, и может иметь стерильный порт для доступа (к примеру, контейнер может представлять собой мешок с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело с двойной специфичностью или антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению. На этикетке или листке-вкладыше в упаковке, указано, что композицию используют для лечения конкретного состояния. Этикетка или листок-вкладыш в упаковке должны дополнительно содержать инструкции по введению композиции антитела пациенту. Подразумеваются также промышленные препараты и наборы, включающие комбинаторные терапевтические средства, описанные в данном документе.

В листке-вкладыше в упаковке приводятся инструкции, в обычном порядке включаемые в коммерческие упаковки терапевтических средств, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предостережения, касающиеся использования таких терапевтических средств. В одном варианте реализации изобретения в листке-вкладыше указано, что композиция применяется для лечения астмы.

В дополнение к этому, промышленный препарат может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буферный раствор, такой как бактериостатическая вода для инъекций (БВДИ), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно также может содержать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

В данном изобретении также предложены наборы, которые пригодны для различных целей, например, для очистки или иммунопреципитации ИЛ4, ИЛ5 или ИЛ13 из клеток. Для выделения и очистки ИЛ4, ИЛ5 или ИЛ13, набор может содержать ИЛ4/ИЛ5- или ИЛ4/ИЛ13-антитела, связанные с гранулами (например, гранулами сефарозы). Могут быть предложены наборы, которые содержат антитела для выявления и количественного определения ИЛ4, ИЛ5 или ИЛ13 in vitro, например, при анализе ИФА или вестерн-блот. Как и в случае промышленного препарата, набор включает контейнер и этикетку или листок-вкладыш в упаковке, нанесенный на или связанный с контейнером. Контейнер содержит композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело с двойной специфичностью или мультиспецифическое антитело или фрагмент антитела по данному изобретению. Могут быть включены дополнительные контейнеры, содержащие, например, растворители и буферные растворы или контрольные антитела. На этикетке или листке-вкладыше к упаковке может приводится описание композиции, а также инструкции для предполагаемого применения in vitro или при диагностике.

Следующие примеры представлены только с иллюстративными целями и никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. В действительности, различные модификации данного изобретения, в дополнение к показанным и раскрытым в данном документе, станут очевидными специалистам в данной области из вышеизложенного описания и входят в сферу прилагаемой формулы изобретения.

ПРИМЕРЫ

Серийно выпускаемые реактивы, приведенные ниже в примерах, использованы в соответствии с инструкциями производителей, если не указано иное. Источник клеток, обозначенных номерами доступа АТСС и рассмотренных в следующих примерах и во всем описании, представляет собой Американскую коллекцию типовых культур, г.Манассас, Вирджиния. Если не установлено иное, то в настоящем изобретении используются стандартные процедуры технологии рекомбинантных ДНК, такие как описаны в данном документе выше и в следующих учебниках: Sambrook et al., supra; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.

Пример 1. Разработка и конструирование библиотек.

Введением мутации в определяющие комплементарность участки (CDR) легкой цепи (LC) моноспецифическое антитело может рекрутировать вторую специфичность связывания к новому антигену, в то же время сохраняя свою первичную антигенную специфичность. Дополнительно, двойное связывание может быть аффинносозревшим до значения Ко в наномолярном диапазоне. Это направление инженерии создания двойной специфичности хорошо подходит для антител, которые главным образом для связывания своих первичных антигенов используют CDR тяжелых цепей (НС). Здесь авторами описывается анти-интерлейкин 4 антитело, полученное из гибридомы мыши, которое по энергии связывания в значительной степени зависит от CDR LC, и обретение этим антителом двойной специфичностью лишь с помощью мутации в CDR НС или с дополнительной мутацией в CDR LC. Один такой вариант с двойной специфичностью как к интерлейкину 4 (ИЛ4), так и интерлейкину 5 (ИЛ5) прошел созревание до получения высокой двойной аффинности со значением K_D в наномолярном диапазоне. Эти результаты дополнительно подчеркивают способность антитела обрести двойную специфичность и демонстрируют общеприменимое направление инженерии для создания двойной специфичности в любом антителе, используя стратегию сканирования мутаций для выявления участков антигенсвязывающего сайта, который может переносить мутацию и допускать возможность создания вторичной специфичности связывания.

Авторами поставлена задачу рекрутировать вторую антигенную специфичность в гуманизированное антитело 19С11 (hu19C11, гуманизированное в скелете исходной линии VH1 и каппа I), которое связывает ИЛ4 и блокирует его захватывание ИЛ4-рецепторомсс. Авторы впервые клонировали его Fab в конструкции «фагмиды» (pV0115) для совместной экспрессии LC и, бицистронно, вариабельного домена и константного домена 1 (СН1) НС гибридизированного С-терминально с минорным белком р3 оболочки М13, как описано (Lee et al., J. Mol. Biol. 340: 1073-93, 2004). Часть шарнирного участка IgG с аминокислотной последовательностью KTHTC включили между СН1 и р3 М13 для того, чтобы обеспечить дисплейное отображение бивалентного Fab (Lee et al., J. Mol. Biol. 340: 1073-93, 2004) для увеличения эффективности связывания антигенов, иммобилизированных на плотной поверхности-подложке. Авторами впервые подтверждено, что Fab-отображающий фаг, хорошо связывался с высокой аффинностью с антителом против экспрессионного маркера (gD) гибридизированного С-терминально с LC и с ИЛ4 (фаговая ЕС₅₀=1 нМ), что сходно с измеренной аффинностью антитела в виде IgG.

Для определения стратегии инженерии по рекрутированию вторичной специфичности связывания с hu19C11, авторами впервые исследовано важность этих трех CDR LC для связывания ИЛ4 путем мутации двух или трех остатков в каждом CDR LC с заменой на аланин. Эти положения CDR LC были отобраны, поскольку они идентифицированы раннее как ключевые положения для проведения комбинаторного мутагенеза в подходе с использованием библиотеки LC для отбора клонов с двойной специфичностью из антител, полагаясь в значительной степени на CDR НС с их первичным антигенным связыванием (Bostrom et al. PLoS One. 6:el7887, 2011). Фаги, отображающие hu19C11 дикого типа, аланиновые мутанты L1 (I30A/N31A/D32A), L2 (Y50A/H53A/R54A) или L3 (D91A/Y92A), иммобилизировали с анти-gD антителом (фиг. 1А) или ИЛ4 (фиг. 1В) и проанализировали на связывание с использованием ИФА. Авторы обнаружили, что CDR LC оказались важными по энергетическим параметрам. Для фагов, отображавших Fab, с аланиновыми мутациями в любом из трех CDR LC не выявлено выявляемого связывания с ИЛ4, но не связывания с анти-gD антителом, что указывает, что эти мутанты действительно отображались на фаге, пусть даже и на меньшем уровне, чем Fab дикого типа, но их связывание с ИЛ4 было существенно нарушено (фиг. 1А и 1В). Поэтому, в подходе по созданию рандомизированных библиотек CDR LC вероятно не будут продуцироваться антитела с двойной специфичностью, поскольку количество аминокислотных остатков, доступных для создания вторичного антигенного связывания, крайне ограниченное. Далее авторы провели мутацию отдельных ключевых остатков CDR LC, а также поверхностно-доступных CDR НС, как ранее описано (Sidhu et al. J Mol Biol. 338: 299-310, 2004; Lee et al. J Mol Biol. 340: 1073-1093, 2004) и оценили их роль при связывании ИЛ4 путем определения относительной аффинности связывания этих аланиновых мутантов по сравнению с hu19C11 дикого типа. Эти результаты подтвердили важность таких ключевых остатков CDR LC для связывания ИЛ4. Тем не менее, все проверенные положения CDR Н2 и половина из CDR H1 и Н3 оказались устойчивыми к мутации (фиг. 1С).

Картированием остатков, которые критически важны для связывания ИЛ4 (LC-остатки 30, 31, 32, 50, 53, 54, 91, 92; НС-остатки 31, 32, 98, 99 (по нумерации Кабата)) на структуре Fab трастузумаба (PDB: 1FDV) в качестве модели, авторами определена область с центром в CDR Н2, которая устойчива к мутации и может подходить для создания вторичной специфичности (фиг. 2А). Потом авторы отбирали набор остатков в CDR H1 (33, 34), Н2 (50-58), Н3 (95-97) и L3 (93-96), которые устойчивы к аланиновой мутации, для рандомизации в центре на CDR Н2 схемы мутаций и использования одного набора синтетических олигонуклеотидов, направленного на рандомизацию этих отобранных остатков на каждом из четырех CDR в соответствии со способом проведения мутагенеза по Kunkel et al. (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-82, 1987). В схеме рандомизации руководствовались разнообразием в природных антителах в отношении аминокислотной композиции и вариабельности по длине CDR Н2 и CDR L3 (фиг. 2В). Шаблон мутагенеза содержал стоп-кодон только в CDR Н2, который обеспечивал мутацию в этом CDR в Fab-отображающих библиотеках. Авторы создали библиотеки фаговых дисплеев, каждую с размером в диапазоне 10⁸-10⁹. Фаговыми титрованиями hu19C11 и десяти библиотек НС (с 2144-1 до 2144-10) оценивали связывание с иммобилизированным ИЛ4 (PeproTech), захваченным неблокирующим анти-ИЛ4 антителом, каждая библиотека, в виде пула, показала несколько пониженный уровень связывания с ИЛ4, который обычно более снижен по сравнению с шаблонным антителом hu19C11, что указывает в среднем на разные уровни нарушения связывания ИЛ4 (фиг. 3).

Авторы выбрали ИЛ5 и ИЛ13 в качестве вторичных антигенов. Поскольку эти два интерлейкина, подобно ИЛ4, принадлежат к семейству 4-спиральных связанных цитокинов, они являются крайне дивергентны на уровне аминокислотной последовательности и структурной организации (LaPorte et al. Cell. 132: 259-272, 2008; Patino et al. Structure. 19: 1864-1875, 2011; Finkelman et al. J Immunol. 184: 1663-1674, 2010). Идентичность последовательностей между ИЛ4 и ИЛ13 составляет 12%, в то время как между ИЛ4 и ИЛ5 - составляет 11%. Структурно, ИЛ5 образует уникальный переплетенный гомодимер с одной α-спиралью из одной цепи, образующей 4-спиральную связку с тремя α-спиралями из другой цепи (Milburn et al. Nature. 363: 172-176, 1993; Patino et al. Structure. 19: 1864-1875, 2011); ИЛ4 и ИЛ13 оба являются мономерами. Тем не менее, эти три цитокина родственны по их биологической функции и антитела с двойной специфичностью, которые связывают и блокируют двоих из этих цитокинов, могут обладать потенциальной пользой как средства для лечения аллергических заболеваний, таких как астма 9 (Finkelman et al. J Immunol. 184: 1663-1674, 2010; Haldar et al. N Engl J Med. 360: 973-984, 2009).

Авторами выполнено несколько циклов пэннинга и обогащения ИЛ5- или ИЛ13-связывающих клонов, которые сохраняют связывание ИЛ4 из сконструированных библиотек фаговых дисплеев, как ранее описано (Bostrom et al. Science. 323: 1610-1614, 2009). Скринингом приблизительно по 100 клонов за раз, авторы обнаружили от 3 до 8 клонов, которые проявляли двойное связывание с ИЛ5/ИЛ4 или ИЛ13/ИЛ4, соответственно. И по результатам секвенирования идентифицировали два уникальных ИЛ4/ИЛ5-связующих клона (B1, Е7) и два уникальных ИЛ4/ИЛ13- (FI, F2) связывающих клона (фиг. 2В). Авторы также выделили клоны, которые связывались исключительно с ИЛ5 (например, клон 5А). За исключением клона В1, все клоны содержали мутации только в CDR НС по сравнению с их моноспецифическим исходным шаблоном (фиг. 4А-4С). Этот факт продемонстрировал, что мутация CDR НС моноспецифического антитела может придавать двойную специфичность. Авторы использовали конкурентные анализы по связыванию фагов для оценки аффинности клонов, выраженной в концентрации интерлейкинов, необходимой для ингибирования 50% Fab-отображающего фага от связывания с иммобилизированными интерлейкинами (IC₅₀). Авторами обнаружено, что связывание с вторичными антигенами было слабым с IC₅₀ в микромолярном диапазоне, тогда как связывание ИЛ4 обеспечивалось в наномолярном диапазоне.

Пример 2. Оценка характеристик библиотек.

Для подтверждения специфичности двойного связывания, клоны B1, Е7, F2 и 5А экспрессировались как IgG, и подтверждалось связывание результирующих IgG с предполагаемыми антигенами, но не с некоторыми другими белками (фиг. 5). Авторы дополнительно исследовали специфичность связывания путем демонстрации минимального связывания IgG с клетками эпителиальной клеточной линии 293 почки человека методом проточной цитометрии, которые не экспрессируют ИЛ4, ИЛ5, и ИЛ13, а также с частицами бакуловируса (БВ), образовавшимися из клеток насекомых, методом ИФА (Hotzel et al. MAbs. 4: 753-760, 2012). Кроме того, показано, что ИЛ4/ИЛ5-антитела с двойной специфичностью В1 и Е7 вместе с моноспецифическим ИЛ5-связывающим антителом блокировали связывание ИЛ5 с ИЛ5-рецептором а, что предполагает, что связывающие эпитопы на ИЛ5 перекрываются с такими эпитопами на ИЛ5-рецепторе (фиг. 6). Измерениями методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) определено, что ИЛ4/ИЛ5-клон Е7 с двойной специфичностью обладал низкой аффинностью к ИЛ5 (K_D=905 нМ), но сохранял высокую аффинность связывания ИЛ4 (K_D=3,4 нМ) своего исходного антитела hu19C11, что измерено методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (фиг. 7А и 7В).

Пример 3. Созревание аффинности антигенсвязывающего фрагмента с двойной специфичностью.

Для повышения двойной аффинности Е7, авторы рандомизировали CDR Е7 посредством сайт-направленного мутагенеза и для проведения отбора по связыванию отобразили варианты на фаге. Создавали три библиотеки, таргетирующие остатки CDR Н2 и CDR L3 (библиотека H2/L3), остатки CDR H1, Н2 и Н3 (библиотека Н1/Н2/Н3) или остатки CDR Н2 и выбирали сайты на каркасном участке 3 (FR3) НС (библиотека H2/FR3) для рандомизации, как описано (Lee et al. J Mol Biol. 340: 1073-1093, 2004; Bostrom et al. Methods Mol Biol. 525: 1-24, 2009; Lee et al. Blood. 108: 3103-3111, 2006) (фиг. 7A). Так как клон Е7 сохранял высокую аффинность связывания ИЛ4, авторы сфокусировали усилия по повышению связывания ИЛ5 на отборе библиотек. В библиотеке Н1/Н2/Н3, авторы обнаружили много клонов с повышенной аффинностью к ИЛ5, но со значительно уменьшенной аффинностью к ИЛ4, тогда как клоны из библиотеки H2/L3 и библиотеки H2/FR3 показали повышенное связывание ИЛ5 без потери аффинности ИЛ4-связывания (фиг. 4А). Отобранные клоны очищали как IgG и сравнивали с Е7. Многие варианты из библиотеки H2/L3 проявляли повышенное двойное связывание как IgG без увеличения связывания с набором нецелевых белков (фиг. 8А). Авторами также подтверждено низкое нецелевое связывание, используя связывание BV и анализ FACS клеток 293, как указано выше, и что усовершенствованные клоны продолжают блокировать связывание ИЛ5 со своим рецептором (фиг. 8В). Значения аффинности моновалентного связывания двух усовершенствованных вариантов, 1С36 и 1С60 (фиг. 7С и 7D), определяли методом ППР как связывание Fab с иммобилизированным ИЛ4 или ИЛ5. Оба варианта сохраняли высокую аффинность к ИЛ4 (K_D=3-4 нМ) и повышенную аффинность к ИЛ5 большую, соответственно, в 37-раз и 20-раз (K_D=24,1 нМ для 1С36 и 44,4 нМ для 1С60) (фиг. 7В).

В итоге, авторами изобретения показано, что мутация в CDR НС моноспецифического антитела может рекрутировать вторичную специфичность связывания, и авторы усовершенствовали одно из выделенных антител с двойной специфичностью до получения аффинности в диапазоне низких значений нМ к обоим антигенам. Раннее, авторы продемонстрировали, что Fab трастузумаба обретает двойную специфичность посредством мутации в CDR LC; с тех пор с использованием такого же подхода изменения LC были созданы другие антитела с двойной специфичностью. Вместе с данными настоящего исследования, авторы подчеркивают возможности создания специфичности связывания антител. Авторы обнаружили, что при ограниченной мутации в CDR не только на стороне легкой цепи, но также и на тяжелой, антителу может быть добавлена другая специфичность связывания. В природе антитела постоянно находятся под влиянием ремоделирования из-за генной перетасовки и соматических мутаций. Было показано, что антитела могут «использоваться повторно» превращением в антитела с разными свойствами связывания, вследствие разного функционирования из-за соматических мутаций. Для создания специфичности связывания путем ограниченной мутации антитела могут обладать одной из идеальных форм фолдинга и структурами, которые должны играть роль в очень большой емкости естественного иммунного ответа для распознавания практически бесконечных разновидностей чужеродных антигенов. Кроме того, в этой работе впервые показано общее направление инженерии для создания антитела с двойной специфичностью из моноспецифического антитела, обобщенное следующим образом. Посредством анализа мутагенеза (например, сканированием аланином) каждый может сначала идентифицировать участок антигенсвязывающего сайта, который устойчивый к мутации без существенного нарушения связывания своего первичного антигена.

Другие варианты реализации изобретения.

Все патенты, патентные заявки, публикации патентных заявок и другие публикации, цитируемые или упоминаемые в этом описании, включены в данный документ посредством ссылки в том же объеме, как если бы каждый независимый патент, патентная заявка, публикация патентной заявки или публикация были бы специально и конкретно указаны для включения посредством ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Genentech, Inc.

F. Hoffmann-La Roche AG

<120> АНТИТЕЛА С ДВОЙНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ

<130> 50474-029WO3

<150> US 61/946547

<151> 2014-02-28

<150> US 61/919552

<151> 2013-12-20

<160> 34

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp

20 25 30

Ala Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 2

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Val Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ile Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Val Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ile Leu Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Thr Tyr Ala Asp Asp

50 55 60

Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Gly Ile Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp

20 25 30

Ala Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Pro Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 6

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Val Ile Val Ser Ile Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ile Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Phe Gln Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Ile Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Phe Tyr Thr Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Ile Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 9

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp Ala Ala

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 10

Tyr Thr Ser His Arg Tyr Thr

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 11

Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp Thr Phe

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 12

Gln Gln Asp Tyr Thr Pro Phe Pro Leu Thr Phe

1 5 10

<210> 13

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 13

Asp Tyr Ser Met His

1 5

<210> 14

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 14

Asp Tyr Asp Ile His

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 15

Asp Tyr Phe Ile His

1 5

<210> 16

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 16

Asp Tyr Leu Met His

1 5

<210> 17

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 17

Val Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

1 5 10 15

Lys

<210> 18

<211> 18

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 18

Ala Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Thr Tyr Ala Asp Asp

1 5 10 15

Phe Lys

<210> 19

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 19

Ala Val Ile Val Ser Ile Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe

1 5 10 15

Lys

<210> 20

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 20

Gly Gly Ile Phe Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 21

Glu Ile Leu Phe Tyr Gly Met Asp Tyr

1 5

<210> 22

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 22

Gly Val Ile Phe Gln Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

<210> 23

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 23

Gly Ile Ile Phe Tyr Thr Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

<210> 24

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa представляет собой Thr, Ile, Lys или Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa представляет собой Ser или His

<400> 24

Gln Gln Asp Tyr Xaa Xaa Pro Trp Thr Phe

1 5 10

<210> 25

<211> 18

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa представляет собой Ala или Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa представляет собой Thr, Ile, Val или Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> Xaa представляет собой Asp, Val или Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa представляет собой Asp, Glu, Asn, Ser, Ile, Leu, Thr, Ala или Phe

<400> 25

Xaa Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Xaa Tyr Ala Xaa Xaa

1 5 10 15

Phe Lys

<210> 26

<211> 14

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa представляет собой Val или Phe

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa представляет собой Arg или Ile

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa представляет собой Thr, Phe, Met или Pro

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> Xaa представляет собой Ala или Val.

<400> 26

Gly Arg Xaa Thr Ile Thr Xaa Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Xaa

1 5 10

<210> 27

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 27

Gln Gln Asp Tyr Thr His Pro Trp Thr Phe

1 5 10

<210> 28

<211> 18

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 28

Gly Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Thr Tyr Ala Glu Glu

1 5 10 15

Phe Lys

<210> 29

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp

20 25 30

Ala Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Thr His Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 30

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Thr Tyr Ala Glu Glu

50 55 60

Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Gly Ile Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 31

Gln Gln Asp Tyr Lys His Pro Trp Thr Phe

1 5 10

<210> 32

<211> 18

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 32

Ala Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Val Tyr Ala Asp Asp

1 5 10 15

Phe Lys

<210> 33

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Asp

20 25 30

Ala Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Lys His Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 34

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Phe Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Gly Ile Val Tyr Asp Ala Thr Gly Phe Thr Val Tyr Ala Asp Asp

50 55 60

Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Gly Ile Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<---

1. Способ создания антитела с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L), причем V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом, при этом способ включает следующие стадии:

(a) предоставление антитела, которое содержит V_H и V_L, причем V_H и V_L соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который связывается с первым эпитопом, но не вторым эпитопом, и при этом антитело содержит по меньшей мере одну аминокислоту в положениях 32, 50 или 91 V_L (нумерация Кабата), которая является электростатической или гидрофобной;

(b) сохранение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей V_L антитела из стадии (а), неизменной и изменение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей V_H антитела из стадии (а), причем изменяется один или более аминокислотных остатков в положениях 33, 34, 50-58 и 95-97 V_H;

(c) экспрессия V_L и измененного V_H из стадии (b); и

(d) отбор антитела с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего V_L и измененный V_H из стадии (с), причем V_H и V_L соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая V_H, изменяется на основе разнообразия множества встречающихся в природе аминокислотных последовательностей тяжелой цепи.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что измененный V_H отображается на фаге с V_L во время отбора на стадии (d).

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что антитело из стадии (а) содержит определяющий комплементарность участок CDRL1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO: 9), CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO: 10), и CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTSPWTF (SEQ ID NO: 11).

5. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что антитело из стадии (а) содержит определяющий комплементарность участок CDRH1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность DYSMH (SEQ ID NO: 13), CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность VWINTETGEPTYADDFK (SEQ ID NO: 17), и CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO: 20).

6. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что первый эпитоп происходит из одной биологической молекулы и второй эпитоп происходит из такой же биологической молекулы.

7. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что первый эпитоп происходит из первой биологической молекулы, а второй эпитоп происходит из второй биологической молекулы.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что первая биологическая молекула представляет собой ИЛ4 и вторая биологическая молекула представляет собой ИЛ5.

9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что первая биологическая молекула представляет собой ИЛ4 и вторая биологическая молекула представляет собой ИЛ13.

10. Способ по п. 7, отличающийся тем, что первая биологическая молекула и вторая биологическая молекула представляют собой цитокины.

11. Способ по п. 7, отличающийся тем, что первая или вторая биологическая молекула представляет собой молекулу, которая может увеличить период полувыведения антитела с двойной специфичностью при связывании с антителом in vivo.

12. Способ по п. 7, отличающийся тем, что первая или вторая биологическая молекула представляет собой сывороточный альбумин или неонатальный Fc-рецептор (FcRn).

13. Способ по п. 7, отличающийся тем, что первая или вторая биологическая молекула представляет собой молекулу, которая может увеличить эффекторную функцию антитела с двойной специфичностью при связывании с антителом in vivo.

14. Способ по п. 7, отличающийся тем, что первая или вторая биологическая молекула связывается с белком клеточной поверхности на естественных клетках-киллерах или макрофагах.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что белок клеточной поверхности представляет собой Fc-рецептор или C1q.

16. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом или вторым эпитопом с K_D 10^-6 или ниже.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом или вторым эпитопом с K_D 10^-9 или ниже.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом или вторым эпитопом с K_D 10^-12 или ниже.

19. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом с K_D 10^-6 или ниже.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом с K_D 10^-9 или ниже.

21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что V_H и V_L антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом с K_D 10^-12 или ниже.

22. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что первая биологическая молекула и вторая биологическая молекула не являются структурно сходными.

23. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что отбор на стадии (d) включает глубокое секвенирование.

24. Выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, для лечения ИЛ4-опосредованного заболевания или ИЛ5-опосредованного заболевания, где выделенное антитело с двойной специфичностью создано способом по п. 8, где антитело с двойной специфичностью содержит:

(i) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 9); CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 10); CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 11); CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 15); CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 18), и CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 20);

(ii) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 9); CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 10); CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 12); CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 16); CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 19), и CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 20);

(iii) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 9); CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 10); CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 24); CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 15); CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 25), и CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 20);

(iv) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 9); CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 10); CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 27); CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 15); CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 28), и CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 20); или

(v) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 9); CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 10); CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 31); CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 15); CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 32), и CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 20).

25. Выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, по п. 24, отличающееся тем, что антитело с двойной специфичностью представляет собой моноклональное антитело.

26. Выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, по п. 24, отличающееся тем, что фрагмент представляет собой Fab или scFv.

27. Выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, по п. 24, отличающееся тем, что антитело с двойной специфичностью представляет собой IgG.

28. Выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, по п. 24, отличающееся тем, что ИЛ4-опосредованное заболевание или ИЛ5-опосредованное заболевание представляет собой аллергическое заболевание.

29. Выделенное антитело с двойной специфичностью по п. 24, отличающееся тем, что аллергическое заболевание представляет собой астму.

30. Способ лечения у субъекта астмы, причем способ включает введение субъекту выделенного антитела с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающего фрагмента, по п. 29, отличающийся тем, что указанное введение проводится в течение времени и в количестве, достаточных для лечения или предупреждения развития у субъекта астмы.

31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного средства для лечения астмы, выбранного из группы, состоящей из антагониста IgE, антигистаминного средства, теофилина, сальбутамола, беклометазона дипропионата, натрия кромогликата, стероидного средства и противовоспалительного средства.

32. Фармацевтическая композиция для лечения ИЛ4-опосредованного заболевания или ИЛ5-опосредованного заболевания, содержащая терапевтически эффективное количество выделенного антитела с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающего фрагмента, по любому из пп. 24-29.

33. Выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, для лечения ИЛ4-опосредованного заболевания или ИЛ13-опосредованного заболевания, где выделенное антитело с двойной специфичностью создано способом по п. 9, где антитело с двойной специфичностью содержит:

(i) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 9); CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 10); CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 11); CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 13); CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 23), и CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 20); или

(ii) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 9); CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 10); CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 11); CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 13); CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 23) и CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 20).

34. Выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, по п. 33, отличающееся тем, что антитело с двойной специфичностью представляет собой моноклональное антитело.

35. Выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, по п. 33, отличающееся тем, что фрагмент представляет собой Fab или scFv.

36. Выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, по п. 33, отличающееся тем, что антитело с двойной специфичностью представляет собой IgG.

37. Выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, по п. 33, отличающееся тем, что ИЛ4-опосредованное заболевание или ИЛ13-опосредованное заболевание представляет собой аллергическое заболевание.

38. Выделенное антитело с двойной специфичностью по п. 32, отличающееся тем, что аллергическое заболевание представляет собой астму.

39. Способ лечения у субъекта астмы, причем способ включает введение субъекту выделенного антитела с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающего фрагмента, по п. 38, отличающийся тем, что указанное введение проводится в течение времени и в количестве, достаточных для лечения или предупреждения развития у субъекта астмы.

40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного средства для лечения астмы, выбранного из группы, состоящей из антагониста IgE, антигистаминного средства, теофилина, сальбутамола, беклометазона дипропионата, натрия кромогликата, стероидного средства и противовоспалительного средства.

41. Фармацевтическая композиция для лечения ИЛ4-опосредованного заболевания или ИЛ13-опосредованного заболевания, содержащая терапевтически эффективное количество выделенного антитела с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмента, по любому из пп. 33-38.

42. Полинуклеотид, кодирующий выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из пп. 24-29 и 33-38.

43. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 42.

44. Клетка-хозяин для экспрессии полинуклеотида по п. 42, где клетка-хозяин содержит вектор экспрессии по п. 43.

45. Способ продуцирования выделенного антитела с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающего фрагмента, по любому из пп. 24-29 и 33-38, причем способ включает культивирование клетки-хозяина, которая содержит вектор экспрессии по п. 43, и выделение выделенного антитела с двойной специфичностью.