Способы отбора t-клеточной линии и ее донора для адоптивной клеточной терапии

Данное изобретение относится к иммунологии. Предложен способ отбора аллогенной Т-клеточной линии, предусматривающий отбор Т-клеточной линии с применением репрезентации, которая идентифицирует множество HLA аллелей и описывает признаки относительных активностей Т-клеточных линий, каждая из которых распознает эпитоп антигена злокачественной опухоли и ограничена различными вариантами HLA аллелей или комбинациями HLA аллелей, причем в репрезентации каждый идентифицированный HLA аллель или комбинация HLA аллелей связаны с соответствующим признаком относительной активности Т-клеточной линии, ограниченной HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей. Настоящий способ может найти применение в адоптивной терапии рака. 21 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл., 1 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки No. 62/075856, поданной 5 ноября 2014 года, которая полностью включена в настоящий документ в качестве ссылки.

ЗАЯВЛЕНИЕ О ГОСУДАРСТВЕННЫХ ПРАВАХ

[0002] Данное изобретение было создано при поддержке государства в рамках NCI Ca 23766, SR21 CA 162002, SP30-Ca08748-40, P01 Ca 106450, P01 Ca 52477-13; P01 Ca54350, выделенных Национальным институтом здравоохранения. Правительство имеет определенные права на изобретение.

1.ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] В настоящем документе описаны способы отбора аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на них. Кроме того, описаны способы отбора донора, от которого получают аллогенную Т клеточную линию для терапевтического введения пациенту, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на них.

2.ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Противовирусные CD8+ T-клетки отвечают на незначительное количество потенциальных пептидных детерминант, кодируемых вирусными геномами. Цитотоксические T-клетки распознают инфицированные клетки посредством взаимодействия T-клеточного рецептора (TCR) с 8-11-аминокислотными антиегенными пептидами, образующими комплекс с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) I класса. Эти комплексы MHC-пептид возникают вследствие внутриклеточного процессинга эндогенно синтезированных вирусных белков (Saveanu, L., et al., Immunol Rev, 2005. 207: 42-59; Strehl, B., et al., Immunol Rev, 2005. 207: 19-30).

[0005] Пептидные детерминанты соответствуют теоретически рассчитанным мотивам связывания внутри специфических HLA молекул. Хотя можно получить большое количество пептидных эпитопов, Т-клеточные ответы сфокусированы на выбранном количестве эпитопов, явление, известное как иммунодоминирование (Sercarz, E.E., et al., Annu Rev Immunol, 1993. 11: 729-66; Yewdell, J.W. and J.R. Bennink, Annu Rev Immunol, 1999. 17: 51-88). Высоко специализированная природа CD8-Т-клеточных ответов на патогены указывает, что индивидуальные эпитопы различаются по своей способности индуцировать Т-клеточные ответы (Yewdell, J.W. and J.R. Bennink, Annu Rev Immunol, 1999. 17: 51-88).

[0006] Пептидные эпитопы, которые индуцируют наиболее выраженные Т-клеточные ответы у любого индивидуума, могут быть дополнительно классифицированы на основе соизмеримого вклада эпитопа в общий T-клеточный ответ на любой конкретный вирусный пептид. ''Иммунодоминантные'' эпитопы распознаются наиболее распространенными когнатными T-клеточными популяциями, тогда как ''субдоминантные'' эпитопы распознаются менее распространенными T-клеточными популяциями. Таким образом, в зависимости от их относительного вклада в общий T-клеточный ответ индивидуальные эпитопы могут быть классифицированы как доминантные, содоминантные или субдоминантные, таким образом, устанавливая иерархию иммунодоминирования.

[0007] В случае инфекции вируса гриппа у мышей CD8 Т-клеточные ответы, как правило, направлены лишь на небольшое количество специфических эпитопов (La Gruta, N.L., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2006. 103: 994-999). И в конкретном ярком примере, полный CD8 T-клеточный ответ на вирус парагриппа мыши (вирус Сендай) направлен на единичный эпитоп (Cole, G.A. et al., Int Immunol, 1994. 6: 1767-1775; Kast, W.M., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1991. 88: 2283-2287).

[0008] Т-клеточные ответы у человека были охарактеризованы для нескольких вирусных инфекций. Исследования Т-клеточных ответов на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) привели к идентификации нескольких эпитопов в различных белках этого вируса, и эти исследования также продемонстрировали, что иммунодоминантные эпитопы могут быть представлены преобладающими аллелями лейкоцитарного антигена человека (HLA), такими как HLA A0301, B0702 или A0201 у индивидуумов, наследующих эти HLA аллели совместно (Day, C.L., et al., J Virol, 2001. 75: 6279-6291). Кроме того, множественные эпитопы могут быть представлены посредством этих же HLA аллелей во время различных фаз инфекции (Yu, X.G., et al., J Virol, 2002. 76: 8690-8701). Оценка Т-клеточных ответов на цитомегаловирус человека (CMV) привела к идентификации нескольких иммунодоминантных эпитопов внутри наиболее иммуногенных белков этого вируса, а именно CMVpp65 и IE1, и представляющих их HLA аллелей. Это затем привело к выявлению того, что среди индивидуумов, наследующих специфические HLA аллели, такие как HLA B0702 и HLA A0201, эпитопы, представленные этими аллелями, составляют иммунодоминантные эпитопы. Когда эти аллели являются наследуемыми совместно, эпитопы, представленные посредством HLA B0702, составляют иммунодоминантный T-клеточный ответ, в то время как эпитопы, представленные HLA A0201, являются субдоминантными (Lacey, S.F., et al., Hum Immunol, 2003. 64: 440-452).

[0009] Иммунодоминантность отражает конечный продукт множества положительных и отрицательных факторов, которые управляют процессингом антигена и презентацией, а также активацией T-клеток и авидностью T-клеток (Yewdell, J.W. и J.R. Bennink, Annu Rev Immunol, 1999. 17: 51-88). Среди них основные факторы до настоящего времени, оцениваемые в большинстве исследований, включали генетический фон HLA I класса у инфицированных индивидуумов, последовательность вирусных белков и кинетику вирусных инфекций, а также аффинности связывания пептидных эпитопов в бороздках HLA, а также аффинность TCR к комплексу пептид-MHC.

[0010] Адоптивная иммунотерапия с применением полученных от донора вирусоспецифических T-клеток может быть эффективной для устранения вирусных инфекций, таких как вирус Эпштейна-Барр (EBV) и CMV, после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (HSCT). Недостаточность своевременной доступности полученных от донора вирус-специфических T-клеток была главным ограничением для успешного применения данного терапевтического подхода. Кроме того, такие клетки не могут быть от серонегативных доноров и доноров пуповинной крови. В таких случаях, предверательно полученные от стороннего донора вирус-специфические T-клетки могут быть легкодоступными для лечения серьезных вирусных инфекций у таких пациентов. Несколько групп продемонстрировали безопасность и потенциальную эффективность полученных от стороннего донора линий вирус-специфических цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) для лечения EBV, CMV и аденовирусных (ADV) инфекций, с применением CTL линий, инфузии которых проводили исходя из эмперического опыта на основе совпадения 2 или более HLA аллелей (Haque, T, et al., Lancet, 2002. 360: 436-442; Barker, J. N., et al., Blood, 2010. 116: 5045-5049; Doubrovina, E., et al., Blood, 2012. 119: 2644-2656; Uhlin, M., et al., Clinical Infectious diseases, 2012. 55: 1064-1073; Leen, A. M., et al., Blood, 2013. 121:5113-5123). Существует необходимость в способе отбора CTL линий для обеспечения высокой и устойчивой эффективности CTL лечения.

[0011] Цитирование ссылки в настоящем документе не должно рассматриваться как признание того, что таким является известный уровень для настоящего изобретения.

3.СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] Настоящее изобретение относится к способам отбора аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, и способам отбора донора аллогенных T-клеток, от которого получают такую аллогенную T клеточную линию.

[0013] В различных аспектах, способы отбора аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержат: отбор для пациента аллогенной T клеточной линии, которая распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, с применением репрезентации (далее в настоящем документе «репрезентация активности»), которая (i) идентифицирует множество HLA аллелей и необязательно комбинации HLA аллелей, и (ii) описывает признаки относительной активности T клеточных линий, каждая из которых распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, и ограничена различными вариантами HLA аллелей или комбинаций HLA аллелей в их множественности; где в репрезентации каждый идентифицированный HLA аллель или комбинация HLA аллелей связаны с соответствующим признаком относительной активности T клеточной линии, ограниченной HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, относительных активностей, являющихся относительными мерами известной активности против патогена или против злокачественной опухоли, демонстрируемой T клеточными линиями; где (A) отобранная T клеточная линия имеет общее с HLA аллелью или комбинацией HLA аллелей пациента или пораженных клеток (например, злокачественной опухоли или связанными с присутствием патогена) у пациента, идентифицированных посредством репрезентации, до которой ограничено распознавание Т клеточной линии; и (B) HLA аллель или комбинация HLA аллелей, до которых отобранная T клеточная линия ограничена, связана в репрезентации с признаком самой высокой относительной активности среди HLA аллелей и комбинаций HLA аллелей в репрезентации, которая, как известно, имеет общее с пациентом или пораженными клетками у пациента (на основе распределения HLA пациента или пораженных клеток у пациента), и если не признаны непригодными.

[0014] В определенных вариантах осуществления способы отбора аллогенной T клеточной линии дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап создания репрезентации активности. В определенных вариантах осуществления способы отбора аллогенной T клеточной линии дополнительно содержат предшествующий этапу создания этап измерения относительных активностей. В определенных вариантах осуществления способы отбора аллогенной T клеточной линии дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA пациента или пораженных клеток у пациента. В специфических вариантах осуществления этап установления содержит типирование, по меньшей мере, 4 HLA локусов.

[0015] В различных аспектах, способы отбора донора аллогенных T-клеток, от которого получают аллогенную Т клеточную линию для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержат: отбор донора Т-клеток, аллогенного пациенту, с применением репрезентации активности, которая (i) идентифицирует множество HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, и (ii) описывает признаки относительных активностей T клеточных линий, каждая из которых распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, и ограниченных различными вариантами HLA аллелей или комбинаций HLA аллелей в множественности; где в репрезентации каждый идентифицированный HLA аллель или комбинация HLA аллелей связаны с соответствующим признаком относительной активности T клеточной линии, ограниченной HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, относительными активностями, являющимися относительными мерами известных активностей против патогена или против злокачественной опухоли, демонстрируемыми T клеточными линиями; где (A) отобранный донор Т-клеток имеет, по меньшей мере, один HLA аллель или комбинацию HLA аллелей общий с пациентом или пораженными клетками (например, злокачественной опухоли или связанными с присутствием патогена) у пациента; и (B) один из, по меньшей мере, одного HLA аллеля или комбинации HLA аллелей общий с пациентом или пораженными клетками у пациента связан в репрезентации с признаком самой высокой относительной активности среди HLA аллелей и комбинаций HLA аллелей в репрезентации активности которые, как известно, должны быть общими с пациентом или пораженными клетками у пациента, и если не признаны непригодными.

[0016] В определенных вариантах осуществления способы отбора донора аллогенных T-клеток дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап создания репрезентации активности. В определенных вариантах осуществления способы отбора донора аллогенных T-клеток дополнительно содержат предшествующий этапу создания этап измерения относительных активностей. В определенных вариантах осуществления способы отбора донора аллогенных T-клеток дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA у пациента или пораженных клеток у пациента. В определенных вариантах осуществления способы отбора донора аллогенных T-клеток дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA донора T-клеток. В определенных вариантах осуществления способы отбора донора аллогенных T-клеток дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA для пациента или пораженных клеток у пациента и распределение HLA для донора T-клеток. В специфических вариантах осуществления этап установления содержит типирование, по меньшей мере, 4 HLA локусов.

[0017] В некоторых вариантах осуществления репрезентация активности является списком множественности HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, ранжированных по относительным активностям. В некоторых вариантах осуществления репрезентация активности является базой данных, содержащей списки множественностей HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, каждая из которых связана с балом, указывающим на относительную активность. В некоторых вариантах осуществления репрезентация активности является диаграммой рассеяния. В конкретном аспекте таких вариантов осуществления, первая ось диаграммы рассеяния представляет различные варианты HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей в множественности, и вторая ось диаграммы рассеяния представляет процент интерферон-γ-секретирующих CD3+ клеток, полученных из каждой T клеточной линии, для которой признак относительной активности описан в репрезентации, при стимуляции антигенпредставляющими клетками, которые являются аутологичными соответствующей Т клеточной линии и загружены одним или несколькими пептидами, демонстрирующими антигенность патогена или злокачественной опухоли, в качестве признака указанной относительной активности. В предпочтительных вариантах осуществления относительные активности являются клиническими эффективностями Т клеточных линий in vivo при лечении пациентов, имеющих патоген или злокачественную опухоль. В некоторых вариантах осуществления репрезентацию активности хранят в базе данных.

[0018] В различных аспектах, способы отбора донора аллогенных T-клеток, от которого получают аллогенную Т клеточную линию для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержат: отбор донора Т-клеток, аллогенного пациенту, который имеет общую одну или несколько HLA аллелей с пациентом или пораженными клетками (например, злокачественной опухоли или связанными с присутствием патогена) у пациента, с применением репрезентации (далее в настоящем документе «репрезентации частоты»), которая (i) идентифицирует множество HLA аллелей, и (ii) описывает признаки относительных частот образования T клеточных линий, каждая из которых распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, и ограничены различными аллелями из указанных HLA аллелей в множественности; где в репрезентации каждый идентифицированный HLA аллель связан с соответствующим признаком относительной частоты образования указанных T клеточных линий, ограниченных HLA аллелем, где: отобранный донор Т-клеток имеет, по меньшей мере, один HLA аллель общий с пациентом или пораженными клетками у пациента, который связан в репрезентации с признаком более высокой частоты образования чем HLA аллели донора, которые не являются общими с пациентом или пораженными клетками у пациента.

[0019] В определенных вариантах осуществления способы отбора донора аллогенных T-клеток дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап создания репрезентации частоты. В определенных вариантах осуществления способы отбора донора аллогенных T-клеток дополнительно содержат предшествующий этапу создания этап измерения относительных частот. В определенных вариантах осуществления способы отбора донора аллогенных T-клеток дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA для пациента или пораженных клеток у пациента. В определенных вариантах осуществления способы отбора донора аллогенных T-клеток дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA донора T-клеток. В определенных вариантах осуществления способы отбора донора аллогенных T-клеток дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA для пациента или пораженных клеток у пациента и распределение HLA для донора T-клеток. В специфических вариантах осуществления этап установления содержит типирование, по меньшей мере, 4 HLA локусов.

[0020] В некоторых вариантах осуществления репрезентация частоты является списком множественности HLA аллелей, ранжированных по относительным частотам. В некоторых вариантах осуществления репрезентация частоты является базой данных, содержащей списки множественностей HLA аллелей, каждый из которых связан с балом, указывающим на относительную частоту. В некоторых вариантах осуществления репрезентацию частоты хранят в базе данных.

[0021] Кроме того, в настоящем документе представлены способы лечения пациента-человека, имеющего патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержащие: (a) отбор аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту в соответствии со способом, описанном в данном документе; и (b) введение популяции T-клеток, полученной из отобранной аллогенной T клеточной линии, пациенту.

[0022] Кроме того, в настоящем документе описаны способы получения аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержащие: (a) отбор донора Т-клеток в соответствии со способом отбора донора аллогенных Т-клеток, как описано в данном документе, ; и (b) получение аллогенной T клеточной линии из отобранного донора аллогенных Т-клеток, где аллогенная T клеточная линия распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена или патогена или злокачественной опухоли.

[0023] В различных аспектах, пациент имеет патоген или имеет подозрение на его наличие, где T клеточные линии распознают, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена. В различных вариантах осуществления патогеном является вирус, бактерия, гриб, гельминт или простейшее. В определенных вариантах осуществления патогеном является вирус.

[0024] В некоторых вариантах осуществления вирусом является цитомегаловирус (CMV). В специфических вариантах осуществления, пациент имеет CMV инфекцию или имеет подозрение на наличие CMV инфекции после того, как пациент прошел HSCT. В специфических вариантах осуществления, антигеном является CMV pp65. В специфических вариантах осуществления, антигеном является CMV IE1.

[0025] В некоторых вариантах осуществления вирусом является вирус Эпштейна-Барр (EBV). В специфических вариантах осуществления, антигеном является EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C, LMP1 или LMP2.

[0026] В некоторых вариантах осуществления вирусом является BKV, JCV, вирус герпеса, аденовирус, вирус иммунодефицита человека, вирус гриппа, вирус Эбола, поксвирус, рабдовирус или парамиксовирус.

[0027] В некоторых вариантах осуществления вирусом является вирус герпеса-6 человека (HHV-6) или вирус герпеса-8 человека (HHV-8).

[0028] В различных аспектах, пациент имеет злокачественную опухоль или имеет подозрение на ее наличие, где T клеточная линия распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления злокачественной опухолью является злокачественная опухоль молочной железы, легкого, яичника, желудка, поджелудочной железы, гортани, пищевода, семенников, печени, околоушных желез, желчных путей, кишечника, прямой кишки, шейки матки, матки, эндометрия, почки, мочевого пузыря, предстательной железы, щитовидной железы, головного мозга или кожи. В некоторых вариантах осуществления злокачественной опухолью является злокачественная опухоль крови. В специфических вариантах осуществления, злокачественной опухолью является лимфопролиферативное нарушение.

[0029] В некоторых вариантах осуществления злокачественной опухолью является WT1-положительная злокачественная опухоль. В некоторых вариантах осуществления антигеном является WT1.

[0030] В некоторых вариантах осуществления злокачественной опухолью является EBV-положительное посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (EBV-PTLD). В специфических вариантах осуществления, антигеном является EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B или EBNA3C. В специфических вариантах осуществления, антигеном является LMP1 или LMP2.

[0031] В некоторых вариантах осуществления злокачественной опухолью является EBV-положительная назофарингеальная карцинома. В специфических вариантах осуществления, антигеном является EBNA1, LMP1 или LMP2.

[0032] В различных вариантах осуществления способ отбора аллогенной T клеточной линии, как описано в данном документе, является компьютеризованным. В различных вариантах осуществления способ отбора донора аллогенных Т-клеток, как описано в данном документе, является компьютеризованным.

[0033] Кроме того, в настоящем документе представлена компьютерная система для отбора аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержащая: центральный процессор; память, соединенная с центральным процессором, инструкции запоминающего устройства для проведения этапов по любому способу отбора аллогенной T клеточной линии или любому способу отбора донора аллогенных Т-клеток, как описано в данном документе.

[0034] Кроме того, в настоящем документе представлен машиночитаемый носитель, имеющий выполняемые компьютером инструкции для проведения этапов по любому способу отбора аллогенной T клеточной линии или любому способу отбора донора аллогенных Т-клеток, как описано в данном документе.

[0035] В различных вариантах осуществления пациент был реципиентом при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT). В специфических вариантах осуществления, HSCT является трансплантатом костного мозга, трансплантатом стволовых клеток периферической крови или трансплантатом пуповинной крови. В различных вариантах осуществления пациент был реципиентом трансплантата солидного органа (SOT).

[0036] Пациент, описываемый в этом документе, является пациентом-человеком.

4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[0037] На фигуре 1 представлена репрезентация, которая показывает процент интерферон-γ-секретирующих CD3+ клеток для каждой T клеточной линии в банке 119 CMV-специфических CTL линий, которые ограничены HLA аллелями или комбинациями HLA аллелей, презентирующими иммунодоминантные эпитопы, сгруппированные посредством их соответствующих HLA аллелей или комбинаций HLA аллелей, как описано в примере, раздел 6.2.3.

5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0038] Настоящее изобретение относится к способам отбора аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, и способы отбора донора аллогенных T-клеток, от которого получают такую аллогенную T клеточную линию. По изобретению, существует иерархия HLA аллелей, презентирующих иммунодоминантные эпитопы, которая ведет к предпочтительной экспансии эпитоп-специфических T-клеток, ограниченных специфическими HLA аллелями над другими наследуемыми и экспрессируемыми аллелями. В настоящем изобретении применяют репрезентацию, отражающую эту иерархию экспансии (отражаемую активностью против патогена или против злокачественной опухоли), чтобы отобрать аллогенные T клеточные линии для терапии и отбора доноров, из которых можно получать аллогенные T клеточные линии.

[0039] Кроме того, существует иерархия HLA аллелей, презентирующих иммунодоминантные эпитопы, которая ведет к предпочтительному образованию эпитоп-специфических T-клеток, ограниченных специфическими HLA аллелями над другими наследуемыми и экспрессируемыми аллелями. В настоящем изобретении применяют репрезентацию, отражающую эту иерархию образования (отраженную частотой образования), чтобы отобрать доноров, из которых получать T клеточные линии.

5.1. Отбор T клеточной линии для адоптивной клеточной терапии

[0040] В настоящем документе представлены способы отбора аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие.

[0041] В различных аспектах, способы отбора аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержат: отбор T клеточной линии, аллогенной пациенту, которая распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, с применением репрезентации (далее в настоящем документе «репрезентация активности»), которая (i) идентифицирует множество HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, и (ii) описывает признаки относительных активностей T клеточных линий, каждая из которых распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, и ограничена различными вариантами HLA аллелей или комбинациями HLA аллелей в множественности; где в репрезентации каждый идентифицированный HLA аллель или комбинация HLA аллелей связаны с соответствующим признаком относительной активности T клеточной линии, ограниченной HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, относительными активностями, являющимися относительными мерами известных активностей против патогена или против злокачественной опухоли, демонстрируемыми T клеточными линиями; где (A) выбранная T клеточная линия имеет общий с пациентом или пораженными клетками (например, злокачественной опухоли или связанными с присутствием патогена) у пациента HLA аллель или комбинацию HLA аллелей, идентифицированных посредством репрезентации, до которой ограничено распознавание Т клеточной линии; и (B) HLA аллель или комбинация HLA аллелей, до которых выбранная Т клеточная линия ограничена, связаны в репрезентации с признаком самой высокой относительной активности среди HLA аллелей и комбинаций HLA аллелей в репрезентации, которые, как известно, должны быть общими с пациентом или пораженными клетками у пациента (на основе распределения HLA пациента или пораженных клеток у пациента), и если не признаны непригодными. HLA аллель или комбинацию HLA аллелей считают «признанными непригодными», если известно, что T клеточная линия, ограниченная этим HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, является неподходящей для терапевтического введения по какой-либо причине. Например, если наблюдают, что предварительно выбранная T клеточная линия не имеет или имеет слишком мало жизнеспособных клеток в образце клеточной линии, HLA аллель или комбинацию HLA аллелей (до которых ограничена T клеточная линия) можно рассматривать как непригодную. В качестве другого примера, если относительные активности в репрезентации активности основаны на in vitro или ex vivo анализах активности, и известно, что относительная in vivo активность T клеточной линии, ограниченной конкретным HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, не коррелирует с относительным in vitro или ex vivo анализом, применяемым для создания репрезентации активности, таким образом, что относительная активность в репрезентации активности не является высшей относительно in vivo активности, конкретный HLA аллель или комбинацию HLA аллелей (до которых ограничена такая T клеточная линия) можно считать непригодными. Например, было замечено, что in vivo активность против CMV инфекции у пациентов-людей для T клеточных линий, ограниченных HLA-B35, является клинически неэффективной (таким образом, незначительной относительно in vivo активности), хотя процент интерферон-γ-секретирующих CD3+ T-клеток, полученных из T клеточных линий, ограниченных HLA-B35, указывает на более высокую относительную активность; таким образом, в отношении лечения CMV инфекций, если T клеточная линия, ограниченная HLA-B35, является предварительной выбранной, предпочтительно HLA-B35 будет «признана непригодной». По способу, заявленному в формуле изобретения, выбранная T клеточная линия является специфической для эпитопа патогена или злокачественной опухоли, презентируемого посредством HLA аллеля или комбинации HLA аллелей, общих с пациентом, который связан с наивысшей активностью среди HLA аллелей или комбинаций HLA аллелей у пациента. В связанном специфическом варианте осуществления, HLA аллель или комбинацию HLA аллелей считают непригодной, если известно, что T клеточная(ые) линия(и), ограниченная(ые) HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, является клинически неэффективной при лечении пациентов, имеющих патоген или злокачественную опухоль.

[0042] В другом варианте осуществления предоставленным по изобретению способом является способ отбора потенциальной аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержащий: отбор T клеточной линии, аллогенной пациенту, которая распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, с применением репрезентации активности, которая (i) идентифицирует множество HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, и (ii) описывает признаки относительных активностей T клеточных линий, каждая из которых распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, и ограничена различными вариантами HLA аллелей или комбинациями HLA аллелей в множественности; где в репрезентации каждый идентифицированный HLA аллель или комбинация HLA аллелей связаны с соответствующим признаком относительной активности T клеточной линии, ограниченной HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, относительными активностями, являющимися относительными мерами известных активностей против патогена или против злокачественной опухоли, демонстрируемыми T клеточными линиями; где (A) выбранная T клеточная линия имеет общий с пациентом или пораженными клетками (например, злокачественной опухоли или связанными с присутствием патогена) у пациента HLA аллель или комбинацию HLA аллелей, идентифицированных посредством репрезентации, до которой ограничено распознавание Т клеточной линии; и (B) HLA аллель или комбинация HLA аллелей, до которых выбранная Т клеточная линия ограничена, связаны в репрезентации с признаком самой высокой относительной активности среди HLA аллелей и комбинаций HLA аллелей в репрезентации, которые, как известно, должны быть общими с пациентом или пораженными клетками у пациента (на основе распределения HLA пациента или пораженных клеток у пациента).

[0043] В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап создания репрезентации активности. Способы, которые можно использовать для создания репрезентации активности, описаны ниже. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу создания этап измерения относительных активностей. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA для пациента или пораженных клеток у пациента.

[0044] В специфических вариантах осуществления, выбранная T клеточная линия распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, указанный, по меньшей мере, один эпитоп, презентируемый посредством HLA аллеля или комбинации HLA аллелей, который является общим с пациентом или пораженными клетками у пациента, где HLA аллель или комбинация HLA аллелей связана с признаком наивысшей относительной активности среди HLA аллелей и комбинаций HLA аллелей у пациента или пораженных клеток у пациента (и если не признаны непригодными, как описано выше). В предпочтительном аспекте таких вариантов осуществления, относительные активности являются клиническими эффективностями Т клеточных линий in vivo при лечении пациентов, имеющих патоген или злокачественную опухоль.

[0045] В специфических вариантах осуществления способов, описываемых в настоящем документе, по меньшей мере, один эпитоп является, по меньшей мере, одним иммунодоминантным эпитопом.

[0046] В определенных вариантах осуществления способов по изобретению, выбранная T клеточная линия имеет общий с пациентом или пораженными клетками (например, злокачественной опухоли или связанными с присутствием патогена) у пациента HLA аллель или комбинацию HLA аллелей, идентифицированных посредством репрезентации активности, до которой ограничено распознавание Т клеточной линии. В некоторых вариантах осуществления пациентом является реципиент трансплантата. В конкретном варианте осуществления, где пациентом является реципиент трансплантата, HLA аллель(и) или комбинация(ии) HLA аллелей, которые являются общими с пациентом или пораженными клетками (например, раковыми или инфицирвоанными патогеном) у пациента, относятся к HLA аллелю(ям) или комбинации(ям) HLA аллелей, которые являются общими с пациентом до и/или после трансплантации. В некоторых вариантах осуществления пораженные клетки у пациента происходят из трансплантата, пересаженного пациенту, и таким образом экспрессируют HLA аллели трансплантата; в таких вариантах осуществления, определение HLA распределения пораженных клеток у пациента может быть произведено посредством типирования HLA аллелей в трансплантате, пересаженном пациенту. В других вариантах осуществления пораженные клетки у пациента не получены из трансплантата, пересаженного пациенту, и таким образом имеют HLA распределение пациента до трансплантации. В специфических вариантах осуществления, трансплантатом является HSCT или трансплантат солидного органа.

5.1.1. Создание T клеточных линий

[0047] T клеточные линии для отбора для терапевтического введения и/или для применения для получения информации для создания репрезентации, могут быть получены, как описано в настоящем документе. T клеточные линии, которые распознают, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, можно получать посредством любого известного в данной области способа или, как описано в настоящем документе. Неограничивающие примерные способы создания T клеточных линий, которые распознают, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, можно найти в Trivedi, D., et al., Blood, 2005. 105: 2793-2801; Koehne, G., et al., Blood, 2000. 96: 109-117; Koehne, G., et al., Blood, 2002. 99: 1730-1740; Doubrovina, E., et al., Blood, 2012. 119: 2644-2656; Barker, J. N., et al., Blood, 2010. 116: 5045-5049; O'Reilly, R. J., et al., Immunol Res, 2007. 38: 237-250; и O' Reilly, R. J., et al., Best Practice & Research Clinical Haematology, 2011. 24: 381-391.

[0048] В определенных вариантах осуществления T клеточную линию получают посредством стимулирования T-клеток от сероположительного донора с применением антигенпредставляющих клеток, презентирующих один или несколько пептидов антигена(ов), демонстрируя антигенность патогена или злокачественной опухоли (пациента). Предпочтительно, антигенпредставляющие клетки являются аутологичными с T-клетками (и таким образом являются полученнными из донора T-клеток). В специфических вариантах осуществления, T-клетки стимулируют с применением дендритных клеток, загруженных совокупностью пептидов одного или нескольких антигенов патогена или злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления дендритные клетки получают из Т-клеток донора. В специфических вариантах осуществления, T-клетки стимулируют с применением цитокин-активированных моноцитов (CAMS), загруженных совокупностью пептидов одного или нескольких антигенов патогена или злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления CAMS получают из Т-клеток донора. В специфических вариантах осуществления, T-клетки стимулируют с применением мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs), загруженных совокупностью пептидов одного или нескольких антигенов патогена или злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления PBMCs получают из Т-клеток донора. В определенных вариантах осуществления T клеточные линии получают посредством стимулирования T-клеток с применением B лимфоцитарных клеточных линий (BLCLs), загруженных совокупностью пептидов одного или нескольких антигенов патогена или злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления BLCLs получают из Т-клеток донора. В специфических вариантах осуществления, BLCLs являются EBV-трансформированными BLCLs, полученными из Т-клеток донора. В определенных вариантах осуществления T клеточные линии получают посредством стимулирования T-клеток с применением искусственных антиген-презентирующих клеток (AAPCs), загруженных совокупностью пептидов одного или нескольких антигенов патогена или злокачественной опухоли.

[0049] В различных вариантах осуществления совокупностью пептидов является совокупность перекрывающихся пептидов, охватывающих антиген патогена или злокачественной опухоли. В различных вариантах осуществления совокупностью пептидов является совокупность перекрывающихся пептидов, охватывающих более, чем один антиген патогена или злокачественной опухоли. В конкретном варианте осуществления совокупностью перекрывающихся пептидов является совокупность перекрывающихся пентадекапептидов.

[0050] В определенных вариантах осуществления T клеточные линии получают посредством стимулирования T-клеток с применением AAPCs, генентически спроектированных для экспрессии, по меньшей мере, одного иммуногенного пептида или белка патогена. В определенных вариантах осуществления T клеточные линии получают посредством стимулирования T-клеток с применением BLCLs, которые являются трансформированными с применением вируса, где вирусом является патоген.

[0051] В некоторых вариантах осуществления T-клетки стимулируют в течение 28-40 суток в культуре. В конкретных вариантах осуществления T-клетки стимулируют в присутствии IL-2. В различных вариантах осуществления после стимулирования T клеточные линии криоконсервируют для хранения. В конкретном варианте осуществления, где T клеточная линия выбрана в соответствии с заявленным способом, который связан с криоконсервацией, T клеточную линию размораживают до терапевтического введения. В дополнительном специфическом варианте осуществления, размороженную T клеточную линию необязательно размножают в культуре до терапевтического введения.

[0052] В различных вариантах осуществления T-клетки, которые применяют для создания T клеточных линий, очищают посредством известных в данной области способов. В определенных вариантах осуществления T-клетки обгощают лимфоцитами периферической крови, отделенными от PBMCs. В некоторых вариантах осуществления T-клетки обогощают лимфоцитами периферической крови, отделенными от PBMCs посредством элиминации прикрепившихся моноцитов с последующей элиминацией естественных киллеров.

[0053] Дендритные клетки, которые можно использовать для стимулирования T-клеток для образования T клеточных линий, распознающих, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, могут быть получены из цитокин-активированных моноцитов (CAMS). В некоторых вариантах осуществления CAMS получают посредством инкубирования PBMCs с цитокинами, такими как GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-1β, IL-6, и/или простагландин-E2.

[0054] BLCLs, которые можно использовать для стимулирования T-клеток для создания T клеточных линий, распознающих, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, можно получать из PBMCs с применением любого известного в данной области способ,а например, как описано в Koehne, G., et al., Blood, 2000. 96: 109-117 или Koehne, G., et al., Blood, 2002. 99: 1730-1740.

[0055] HLA аллель или комбинация HLA аллелей, до которых ограничена каждая из созданных T клеточных линий, которые распознают, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, можно определять любого известного в данной области способа, например, как описано в Trivedi, D., et al., Blood, 2005. 105: 2793-2801; Barker, J. N., et al., Blood, 2010. 116: 5045-5049; Hasan, A.N., et al., J Immunol, 2009. 183: 2837-2850; или Doubrovina, E., et al., Blood, 2012. 120: 1633-1646.

5.1.2. Установление HLA распределения

[0056] Этап установления HLA распределения (т.е., типирование HLA локусов) можно проводить посредством любого известного в данной области способа. Неограничивающие примерные способы для установления HLA распределения можно найти в Lange, V., et al., BMC Genomics, 2014. 15: 63; Erlich, H., Tissue Antigens, 2012. 80:1-11; Bontadini, A., Methods, 2012. 56:471-476; Dunn, P.P., Int J Immunogenet, 2011 38:463-473; and Hurley, C.K., ʺDNA-based typing of HLA for transplantation.ʺ in Leffell, M.S., et al., eds., Handbook of Human Immunology, 1997. Boca Raton: CRC Press. В некоторых вариантах осуществления этап установления HLA распределения содержит типирование, по меньшей мере, 4 HLA локусов, предпочтительно HLA-A, HLA-B, HLA-C и HLA-DRB1. В некоторых вариантах осуществления этап установления HLA распределения содержит типирование 4 HLA локусов, предпочтительно HLA-A, HLA-B, HLA-C и HLA-DRB1. В некоторых вариантах осуществления этап установления HLA распределения содержит типирование по меньшей мере 6 HLA локусов. В некоторых вариантах осуществления этап установления HLA распределение содержит типирование 6 HLA локусов. В некоторых вариантах осуществления этап установления HLA распределения содержит типирование по меньшей мере 8 HLA локусов. В некоторых вариантах осуществления этап установления HLA распределения содержит типирование 8 HLA локусов. В некоторых вариантах осуществления этап установления HLA распределения содержит типирование всех из известных HLA локусов. В некоторых вариантах осуществления этап установления HLA распределения содержит типирование менее чем всех из известных HLA локусов.

[0057] В основном, типирование большего количества HLA локусов является предпочтительным для практического применения изобретения, поскольку чем больше HLA локусов, которые являются типированными, тем более вероятно аллогенная выбранная T клеточная линия будет обладать самой высокой активностью относительн других аллогенных T клеточных линий, которые имеют HLA аллели или комбинации HLA аллелей, общие с пациентом или пораженными клетками у пациента.

5.1.3. Создание репрезентации активности для отбора T клеточных линий

[0058] Репрезентация активности идентифицирует множество HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, и описывает признаки относительных активностей T клеточных линий (i) каждая из которых распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли (пациента), и (ii) ограничена различными вариантами HLA аллелей или комбинациями HLA аллелей в множественности. В репрезентации активности каждый идентифицированный HLA аллель или комбинация HLA аллелей связаны с соответствующим признаком относительной активности T клеточной линии, ограниченной HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, относительными активностями, являющимися относительными мерами известных активностей против патогена или против злокачественной опухоли, демонстрируемыми T клеточными линиями.

[0059] Относительные активности Т клеточных линий можно получать посредством любого in vitro, ex vivo или in vivo способа, известного в данной области.

[0060] В предпочтительных вариантах осуществления относительные активности измеряют как in vivo клинические эффективности Т клеточных линий при лечении пациентов, имеющих патоген или злокачественную опухоль. В специфических аспектах таких вариантов осуществления, относительные активности можно измерять как процент пациентов, имеющих патоген или злокачественную опухоль или имеющих подозрение на их наличие, которые достигают полной ремиссии (CR) после лечения с применением T клеточных линий. В специфических вариантах осуществления, относительные активности измеряют как процент пациентов, имеющих патоген или злокачественную опухоль или имеющих подозрение на их наличие, которые достигают CR или частичную ремиссию (PR) после лечения с применением T клеточных линий.

[0061] В некоторых вариантах осуществления относительные активности измеряют как процент интерферон-γ-продуцирующих CD3+ клеток, полученных из каждой из Т клеточных линий при стимуляции антигенпредставляющими клетками, презентирующими один или несколько пептидов, демонстрирующих антигенность патогена или злокачественной опухоли. В специфических вариантах осуществления, где антигеном является CMV или EBV, относительные активности измеряют посредством способов, модифицированных на основе или как описано в Koehne, G., et al., Blood, 2002. 99: 1730-1740 или Waldrop, S.L., et al., J Clin Invest, 1997. 99: 1739-1750.

[0062] В некоторых вариантах осуществления относительные активности измеряют как процент клеток, экспрессирующих антиген патогена или злокачественной опухоли, которые лизируются при воздействии каждой Т клеточной линии в анализе цитотоксичности, производимом в соответствии с известными в данной области способами.

[0063] По настоящему изобретению, относительные активности не измеряют как аффинности связывания эпитопа, распознаваемого посредством соответствующей T клеточной линии, с HLA аллелем, который презентирует эпитоп.

[0064] В некоторых аспектах, репрезентация активности является списком множественности HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, ранжированных по относительным активностям. В некоторых вариантах осуществления этап отбора аллогенной T клеточной линии проводят посредством движения по списку множественности HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, ранжированных посредством относительных активностей, с наиболее высоким рангом в списке, являющимся признаком наиболее высокой относительной активности, и определения HLA аллеля или комбинации HLA аллелей с самым высоким рангом, которые, как известно, являются общими с пациентом или пораженными клетками у пациента, и выбора аллогенной T клеточной линии, ограниченной этим HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей. В качестве примера, в конкретном варианте осуществления репрезентация активности списком, как представлено в таблице 6.

[0065] В некоторых аспектах, репрезентация активности является базой данных (например, таблицей) с перечислением множества HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, каждый из которых связан с балом, указывающим на относительную активность. В некоторых вариантах осуществления этап отбора аллогенной T клеточной линии проводят посредством проработки базы данных с перечислением множества HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, каждый из которых связан с балом, указывающим на относительную активность, с наивысшим балом в базе данных, являющимся признаком самой высокой относительной активности, и определения HLA аллеля или комбинации HLA аллелей с наиболее высоким балом, который, как известно, является общим с пациентом или пораженными клетками у пациента, и выбор аллогенной T клеточной линии, ограниченной этим HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей. В конкретном варианте осуществления этап отбора аллогенной T клеточной линии с применением репрезентации активности, которая является такой базой данных, можно проводить посредством первого отфильтровывания (исключения) всех HLA аллелей и комбинаций HLA аллелей в базе данных, которые не являются общими с пациентом или пораженными клетками у пациента, а затем определения среди оставшихся, HLA аллеля или комбинации HLA аллелей, связанного с признаком самой высокой относительной активности, а затем выбора аллогенной T клеточной линии, ограниченной этим HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей.

[0066] В некоторых аспектах, репрезентация активности является диаграммой рассеяния. В определенных вариантах осуществления первая ось диаграммы рассеяния представляет различные варианты HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей в множественности HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей. В определенных вариантах осуществления вторая ось диаграммы рассеяния представляет относительные активности. В конкретном варианте осуществления вторая ось диаграммы рассеяния представляет процент интерферон-γ-секретирующих CD3+ клеток, полученных из каждой T клеточной линии, для которой признак относительной активности описан в репрезентации активности, при стимуляции антигенпредставляющими клетками, презентирующими один или несколько пептидов одного или нескольких антигенов, демонстрирующих антигенность патогена или злокачественной опухоли. В конкретном варианте осуществления стимулирование осуществляют с применением антигенпредставляющих клеток, которые являются аутологичными соответствующей Т клеточной линии и загружены одним или несколькими пептидами, демонстрирующими антигенность патогена или злокачественной опухоли, в качестве признака указанной относительной активности. В качестве примера, в конкретном варианте осуществления репрезентация активности является диаграммой рассеяния, как представлено на фигуре 1.

[0067] В некоторых вариантах осуществления репрезентацию активности хранят в базе данных.

[0068] В различных вариантах осуществления способ отбора аллогенной T клеточной линии является компьютеризованным. В некоторых вариантах осуществления способ отбора аллогенной T клеточной линии является компьютеризованным с использованием компьютерной системы, как описано в разделе 5.6. В некоторых вариантах осуществления способы отбора аллогенной T клеточной линии являются компьютеризованными с использованием машиночитаемого носителя, как описано в разделе 5.6.

[0069] Дополнительные данные можно использовать для обновления репрезентации активности, как только становятся доступны дополнительные данные.

5.2. Терапевтическое применение отобранных T клеточных линий

[0070] Кроме того, в настоящем документе представлены способы лечения пациента-человека, имеющего патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержащие: (a) отбор аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту в соответствии с любым способом отбора аллогенной T клеточной линии, как описано в разделе 5.1; и (b) введение популяции T-клеток, полученной из отобранной аллогенной T клеточной линии пациенту. Таким образом, у пациента, имеющего злокачественную опухоль, изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли; у пациента, имеющего патоген, изобретение относится к способу лечения заболевания, нарушению или состоянию, связанному с присутствием патогена.

[0071] В определенных вариантах осуществления введение производят посредством инфузии популяции Т-клеток, полученных из отобранной аллогенной T клеточной линии. В некоторых вариантах осуществления введение производят посредством болюсной внутривенной инфузии популяции Т-клеток, полученных из отобранной аллогенной T клеточной линии. Количество, предназначенное для введения, можно определять на основе состояния пациента и знаний лечащего врача. В определенных вариантах осуществления введение содержит введение, по меньшей мере, приблизительно 1 × 105 T-клетки/кг/доза/неделя пациенту, где популяцию Т-клеток получают из отобранной аллогенной T клеточной линии. В некоторых вариантах осуществления введение содержит введение приблизительно от 1 × 106 до 2 × 106 T-клетки/кг/доза/неделя пациенту, где популяцию Т-клеток получают из отобранной аллогенной T клеточной линии. В некоторых вариантах осуществления введение содержит введение приблизительно 1 × 106 клетки/кг/доза/неделя пациенту, где популяцию Т-клеток получают из отобранной аллогенной T клеточной линии. В некоторых вариантах осуществления введение содержит введение приблизительно 2 × 106 T-клетки/кг/доза/неделя пациенту, где популяцию Т-клеток получают из отобранной аллогенной T клеточной линии. В определенных вариантах осуществления вышеописанные режимы дозирования реализуют в течение, по меньшей мере, 3 недель, таким образом, что вводят, по меньшей мере, 3 дозы. В некоторых вариантах осуществления вышеописанные режимы дозирования реализуют в течение 3 недель, таким образом, что вводят 3 дозы. В некоторых вариантах осуществления вышеописанные режимы дозирования реализуют в течение 6 недель, таким образом, что вводят 6 доз. В определенных вариантах осуществления вышеописанные режимы дозирования реализуют в течение 3 недель, таким образом, что вводят 3 дозы, с последующим введением популяции T-клеток, полученных из отобранной аллогенной T клеточной линии посредством другого режима дозирования в течение, по меньшей мере, одной недели, где второй режим дозирования составляет приблизительно 1 × 107 T-клетки/кг/доза/неделя. В определенных вариантах осуществления вышеописанные режимы дозирования реализуют в течение 3 недель, таким образом, что вводят 3 дозы, с последующим введением популяции T-клеток, полученных из отобранной аллогенной T клеточной линии посредством другого режима дозирования в течение трех недель, где второй режим дозирования составляет приблизительно 1 × 107 T-клетки/кг/доза/неделя. В определенных вариантах осуществления где пациент имеет злокачественную опухоль, вводят 5 повторных инфузий доз приблизительно от 1 × 108 до 1 × 109 T-клетки/кг/доза/неделя.

5.3. Отбор донора Т-клеток для адоптивной клеточной терапии

[0072] Кроме того, в настоящем документе представлены способы отбора донора аллогенных T-клеток, от которого получают аллогенную Т клеточную линию для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие.

5.3.1. Отбор донора Т-клеток на основе репрезентации активности

[0073] В различных аспектах, способы отбора аллогенного донора T-клеток, от которого получают аллогенную Т клеточную линию для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержат: отбор донора Т-клеток, аллогенного пациенту, с применением репрезентации активности, которая (i) идентифицирует множество HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, и (ii) описывает признаки относительных активностей T клеточных линий, каждая из которых распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, и ограничена различными вариантами HLA аллелей или комбинациями HLA аллелей в множественности; где в репрезентации каждый идентифицированный HLA аллель или комбинация HLA аллелей связаны с соответствующим признаком относительной активности T клеточной линии, ограниченной HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, относительными активностями, являющимися относительными мерами известных активностей против патогена или против злокачественной опухоли, демонстрируемыми T клеточными линиями; где (A) отобранный донор Т-клеток имеет, по меньшей мере, один HLA аллель или комбинацию HLA аллелей, общих с пациентом или пораженными клетками (например, злокачественной опухоли или связанными с присутствием патогена) у пациента; и (B) один из, по меньшей мере, одного HLA аллеля или комбинации HLA аллелей, общих с пациентом или пораженными клетками у пациента, связан в репрезентации с признаком самой высокой относительной активности среди HLA аллелей и комбинаций HLA аллелей в репрезентации активности, которые, как известно, должны быть общими с пациентом или пораженными клетками у пациента, и если не признаны непригодными. HLA аллель или комбинацию HLA аллелей считают «признанными непригодными», если известно, что T клеточная линия, ограниченная этим HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, является неподходящей для терапевтического введения по какой-либо причине. Например, если относительные активности в репрезентации активности основаны на in vitro или ex vivo анализах активности, и известно, что относительная in vivo активность T клеточной линии, ограниченной конкретным HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, не коррелирует с относительным in vitro или ex vivo анализом, применяемым для создания репрезентации активности, таким образом, что самая высокая относительная активность в репрезентации активности не является высшей относительно in vivo активности, конкретный HLA аллель или комбинацию HLA аллелей (до которых ограничена такая T клеточная линия) можно считать непригодными. Например, было замечено, что in vivo активность против CMV инфекции у пациентов-людей для T клеточных линий, ограниченных HLA-B35, является клинически неэффективной (таким образом, незначительной относительно in vivo активности), хотя процент интерферон-γ-секретирующих CD3+ T-клеток, полученных из T клеточных линий, ограниченных HLA-B35, указывает на более высокую относительную активность; таким образом, в отношении лечения CMV инфекций, если предварительно отобран донор T-клеток, имеющий HLA-B35, предпочтительно HLA-B35 будет «признанным непригодным». В связанном специфическом варианте осуществления, HLA аллель или комбинацию HLA аллелей будут считать непригодной, если известно, что T клеточная линия(и), ограниченная(ые) HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, являются клинически неэффективными при лечении пациентов, имеющих патоген или злокачественную опухоль.

[0074] В другом варианте осуществления способ, предоставленный по изобретению, является способом отбора потенциального аллогенного донора T-клеток, от которого получают аллогенную Т клеточную линию для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержащим: отбор донора Т-клеток, аллогенного пациенту, с применением репрезентации активности, которая (i) идентифицирует множество HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, и (ii) описывает признаки относительных активностей T клеточных линий, каждая из которых распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, и ограничена различными вариантами HLA аллелей или комбинациями HLA аллелей в множественности; где в репрезентации каждый идентифицированный HLA аллель или комбинация HLA аллелей связаны с соответствующим признаком относительной активности T клеточной линии, ограниченной HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, относительными активностями, являющимися относительными мерами известных активностей против патогена или против злокачественной опухоли, демонстрируемыми T клеточными линиями; где (A) отобранный донор Т-клеток имеет, по меньшей мере, один HLA аллель или комбинацию HLA аллелей, общих с пациентом или пораженными клетками (например, злокачественной опухоли или связанными с присутствием патогена) у пациента; и (B) один из, по меньшей мере, одного HLA аллеля или комбинации HLA аллелей, общих с пациентом или пораженными клетками у пациента, связан в репрезентации с признаком самой высокой относительной активности среди HLA аллелей и комбинаций HLA аллелей в репрезентации активности, которые, как известно, должны быть общими с пациентом или пораженными клетками у пациента.

[0075] В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап создания репрезентации активности. Способы, которые можно использовать для создания репрезентации активности, описаны в разделе 5.1.3. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу создания этап измерения относительных активностей. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA у пациента или пораженных клеток у пациента. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA донора T-клеток. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA у пациента или пораженных клеток у пациента и распределение HLA для донора T-клеток.

[0076] В специфических вариантах осуществления отобранный донор Т-клеток имеет, по меньшей мере, один HLA аллель или комбинацию HLA аллелей, которые являются общими с пациентом или пораженными клетками у пациента, где один из, по меньшей мере, одного HLA аллеля или комбинации HLA аллелей, связан с признаком самой высокой относительной активности среди HLA аллелей и комбинаций HLA аллелей у пациента (и если не признаны непригодными, как описано выше). В предпочтительном аспекте таких вариантов осуществления, относительные активности являются клиническими эффективностями Т клеточных линий in vivo при лечении пациентов, имеющих патоген или злокачественную опухоль.

[0077] В специфических вариантах осуществления способов, описываемых в настоящем документе, по меньшей мере, один эпитоп является, по меньшей мере, одним иммунодоминантным эпитопом.

[0078] В определенных вариантах осуществления способов по изобретению, отобранный донор Т-клеток имеет, по меньшей мере, один HLA аллель или комбинацию HLA аллелей, общих с пациентом или пораженными клетками (например, злокачественной опухоли или связанными с присутствием патогена) у пациента. В некоторых вариантах осуществления пациент является реципиентом трансплантата. В конкретном варианте осуществления, где пациент является реципиентом трансплантата, HLA аллель(и) или комбинация(и) HLA аллелей, которые являются общими с пациентом или пораженными клетками (например, раковыми или инфицированными патогеном) у пациента, относятся к HLA аллелю(ям) или комбинации(ям) HLA аллелей, которые являются общими с пациентом до и/или после трансплантации. В некоторых вариантах осуществления пораженные клетки у пациента получают из трансплантата, пересаженного пациенту и, таким образом, экспрессируют HLA аллели трансплантата; в таких вариантах осуществления, определение HLA распределения пораженных клеток у пациента может быть произведено посредством типирования HLA аллелей в трансплантате, пересаженном пациенту. В других вариантах осуществления пораженные клетки у пациента не получены из трансплантата, пересаженного пациенту, и таким образом имеют HLA распределение пациента до трансплантации. В специфических вариантах осуществления, трансплантатом является HSCT или трансплантат солидного органа.

[0079] T клеточные линии для создания репрезентации активности могут быть сделаны, как описано в разделе 5.1.1.

[0080] Этап установления HLA распределения можно проводить, как описано в разделе 5.1.2. В основном, типирование большего количества HLA локусов является предпочтительным для применения изобретения на практике, поскольку чем большее количество HLA локусов являются типированными, тем более вероятно отобранный донор Т-клеток станет источником аллогенной T клеточной линии, имеющей самую высокую активность относительно других аллогенных T клеточных линий, полученных из другого донора T-клеток, которые имеют, по меньшей мере, один HLA аллель или комбинацию HLA аллелей, общих с пациентом или пораженными клетками у пациента.

5.3.1.1. Создание репрезентация активности для отбора доноров

[0081] Репрезентация активности может быть такой же, как обсуждалось в разделе 5.1.3, и сделана, как описано там.

[0082] В некоторых аспектах, репрезентация активности является списком множественности HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, ранжированных по относительным активностям. В некоторых вариантах осуществления этап отбора аллогенного донора T-клеток проводят посредством продвижения по списку множества HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, ранжированных посредством относительных активностей, с самым высоким рангом в списке, являющимся признаком самой высокой относительной активности, и определения наиболее высоко ранжированной HLA аллели или комбинации HLA аллелей, которые, как известно, являются общими с пациентом или пораженными клетками у пациента, и выбор аллогенного донора T-клеток, который имеет эту HLA аллель или комбинацию HLA аллелей. В качестве примера, в конкретном варианте осуществления репрезентация активности является списком, представленным в таблице 6.

[0083] В некоторых аспектах, репрезентация активности является базой данных (например, таблицей) с перечислением множества HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, каждая из которых связана с балом, указывающим на относительную активность. В некоторых вариантах осуществления этап отбора донора аллогенных Т-клеток проводят посредством продвижения по базе данных с перечислением множества HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, каждая из которых связана с балом, указывающим на относительную активность, с самым высоким балом в базе данных, являющимся признаком самой высокой относительной активности, и определение наиболее высоко оцененной HLA аллели или комбинации HLA аллелей, которые, как известно, являются общими с пациентом или пораженными клетками у пациента, и выбор аллогенного донора T-клеток, который имеет эту HLA аллель или комбинацию HLA аллелей. В конкретном варианте осуществления этап отбора донора аллогенных Т-клеток с применением репрезентации активности, которая является такой базой данных, можно проводить посредством первого отфильтровывания (исключения) всех HLA аллелей и комбинаций HLA аллелей в базе данных, которые не являются общими с пациентом или пораженными клетками у пациента, а затем определение среди оставшихся HLA аллеля или комбинации HLA аллелей, связанных с признаком самой высокой относительной активности, а затем выбор аллогенного донора T-клеток, который имеет эту HLA аллель или комбинацию HLA аллелей.

[0084] В некоторых аспектах, репрезентация активности является диаграммой рассеяния. В определенных вариантах осуществления первая ось диаграммы рассеяния представляет различные варианты HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей в множественности HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей. В определенных вариантах осуществления вторая ось диаграммы рассеяния представляет относительные активности. В конкретном варианте осуществления вторая ось диаграммы рассеяния представляет процент интерферон-γ-секретирующих CD3+ клеток, полученных из каждой T клеточной линии, для которой признак относительной активности описан в репрезентации активности, при стимуляции антигенпредставляющими клетками, презентирующими один или несколько пептидов одного или нескольких антигенов, демонстрирующих антигенность патогена или злокачественной опухоли. В конкретном варианте осуществления стимулирование осуществляют с применением антигенпредставляющих клеток, которые являются аутологичными соответствующей Т клеточной линии и загружены одним или несколькими пептидами, демонстрирующими антигенность патогена или злокачественной опухоли, в качестве признака указанной относительной активности. В качестве примера, в специфических вариантах осуществления, репрезентация активности является диаграммой рассеяния, как представлено на фигуре 1.

[0085] В некоторых вариантах осуществления репрезентацию активности хранят в базе данных.

[0086] В различных вариантах осуществления способ отбора донора аллогенных Т-клеток, как описано в настоящем документе, является компьютеризованным. В некоторых вариантах осуществления способ отбора донора аллогенных Т-клеток, как описано в настоящем документе, является компьютеризованным с использованием компьютерной системы, как описано в разделе 5.6. В некоторых вариантах осуществления способы отбора донора аллогенных T-клеток, как описано в разделе 5.3.1 являются компьютеризованными с использованием машиночитаемого носителя, как описано в разделе 5.6.

[0087] Дополнительные данные можно использовать для создания репрезентации активности, как только дополнительные данные становятся доступными.

5.3.2. Отбор донора Т-клеток на основе репрезентации частоты

[0088] В различных аспектах, способы отбора донора аллогенных T-клеток, от которого получают аллогенную Т клеточную линию для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержат: отбор донора Т-клеток, аллогенного пациенту, который имеет общие один или несколько HLA аллелей с пациентом или пораженными клетками (например, злокачественной опухоли или связанными с присутствием патогена) у пациента, с применением репрезентации (далее в настоящем документе «репрезентации частоты»), которая (i) идентифицирует множество HLA аллелей, и (ii) описывает признаки относительных частот образования T клеточных линий, каждая из которых распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, и ограничены различными аллелями из указанных HLA аллелей в множественности; где в репрезентации каждый идентифицированный HLA аллель связан с соответствующим признаком относительной частоты образования указанных T клеточных линий, ограниченных HLA аллелем, где: выбранный донор T-клеток имеет, по меньшей мере, один HLA аллель, общий с пациентом или пораженными клетками у пациента, который связан в репрезентации с признаком более высокой частоты образования, чем HLA аллели донора, которые не являются общими с пациентом или пораженными клетками у пациента.

[0089] В другом варианте осуществления способ, предоставленный по изобретению, является способом отбора потенциального аллогенного донора T-клеток, от которого получают аллогенную Т клеточную линию для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержащим: отбор донора Т-клеток, аллогенного пациенту, который имеет общие одну или несколько HLA аллелей с пациентом или пораженными клетками (например, злокачественной опухоли или связанными с присутствием патогена) у пациента, с использованием репрезентации частоты, которая (i) идентифицирует множество HLA аллелей, и (ii) описывает признаки относительных частот образования T клеточных линий, каждая из которых распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли, и ограничена различными аллелями из указанных HLA аллелей в множественности; где в репрезентации каждый идентифицированный HLA аллель связан с соответствующим признаком относительной частоты образования указанных T клеточных линий, ограниченных HLA аллелем, где: выбранный донор Т клеток имеет, по меньшей мере, один HLA аллель, общий с пациентом или пораженными клетками у пациента, который связан в репрезентации с признаком более высокой частоты образования, чем HLA аллели донора, которые не являются общими с пациентом или пораженными клетками у пациента.

[0090] В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап создания репрезентации частоты. Способы, которые можно использовать для создания репрезентации частоты описаны ниже. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу создания этап измерения относительных частот. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA для пациента или пораженных клеток у пациента. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA донора T-клеток. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно содержат предшествующий этапу отбора этап установления распределения HLA для пациента или пораженных клеток у пациента и распределение HLA для донора T-клеток.

[0091] В специфических вариантах осуществления способов, описываемых в настоящем документе, по меньшей мере, один эпитоп является, по меньшей мере, одним иммунодоминантным эпитопом.

[0092] В определенных вариантах осуществления способов по изобретению, отобранный донор Т-клеток имеет, по меньшей мере, один HLA аллель общий с пациентом или пораженными клетками (например, злокачественной опухоли или связанными с присутствием патогена) у пациента, который связан в репрезентации частоты с признаком более высокой частоты образования, чем HLA аллели донора, которые не являются общими с пациентом или пораженными клетками у пациента. В некоторых вариантах осуществления пациент является реципиентом трансплантата. В конкретном варианте осуществления, где пациент является реципиентом трансплантата, HLA аллель(и), которые являются общими с пациентом или пораженными клетками (например, раковыми или инфицированными патогеном) у пациента, относятся к HLA аллелю(ям), которые являются общими с пациентом до и/или после трансплантации. В некоторых вариантах осуществления пораженные клетки у пациента получают из трансплантата, пересаженного пациенту и, таким образом, экспрессируют HLA аллели трансплантата; в таких вариантах осуществления определение HLA распределения пораженных клеток у пациента может быть произведено посредством типирования HLA аллелей в трансплантате, пересаженном пациенту. В других вариантах осуществления пораженные клетки у пациента не получены из трансплантата, пересаженного пациенту, и таким образом имеют HLA распределение пациента до трансплантации. В специфических вариантах осуществления, трансплантатом является HSCT или трансплантат солидного органа.

[0093] T клеточные линии для создания репрезентации частоты могут быть созданы, как описано в разделе 5.1.1.

[0094] Этап установления HLA распределения можно проводить, как описано в разделе 5.1.2. В основном, типирование большего числа HLA локусов является предпочтительным для применения изобретения на практике.

[0095] Этап установления HLA распределения можно проводить, как описано в разделе 5.1.2.

5.3.2.1. Создание репрезентации частоты для отбора доноров

[0096] Репрезентация частоты идентифицирует множество HLA аллелей и описывает признаки относительных частот образования T клеточных линий, (i) каждая из которых распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена патогена или злокачественной опухоли (пациента), и (ii) ограничена различными вариантами HLA аллелей. В репрезентации частоты каждый идентифицированный HLA аллель связан с соответствующим признаком относительной частоты образования Т клеточных линий, ограниченных HLA аллелями.

[0097] В некоторых аспектах, репрезентация частоты является списком множественности HLA аллелей, ранжированных по относительным частотам. В некоторых вариантах осуществления этап отбора донора аллогенных Т-клеток проводят посредством продвижения по списку множественности HLA аллелей, ранжированных посредством относительных частот, с самым высоким рангом в списке, являющимся признаком самой высокой относительной частоты, и выбора аллогенного донора T-клеток, который имеет, по меньшей мере, один HLA аллель, общий с пациентом или пораженными клетками у пациента, который связан в списке с более высоким рангом, чем HLA аллели донора, которые не являются общими с пациентом или пораженными клетками у пациента.

[0098] В некоторых аспектах, репрезентация частоты является базой данных (например, таблицей) с перечислением множества HLA аллелей, каждый из которых связан с балом, указывающим на относительную частоту. В некоторых вариантах осуществления этап отбора донора аллогенных Т-клеток проводят посредством прожвижения по базе данных с перечислением HLA аллелей, каждый из которых связан с балом, указывающим на относительную частоту, с самым высоким балом в базе данных, являющимся признаком самой высокой относительной частоты, и выбора аллогенного донора T-клеток, который имеет, по меньшей мере, один HLA аллель, общий с пациентом или пораженными клетками у пациента, который связан в базе данных с более высоким балом, чем HLA аллели донора, которые не являются общими с пациентом или пораженными клетками у пациента.

[0099] В некоторых вариантах осуществления репрезентацию частоты хранят в базе данных.

[00100] В различных вариантах осуществления способ отбора донора аллогенных Т-клеток, как описано в данном документе, является компьютеризованным. В некоторых вариантах осуществления способ отбора донора аллогенных Т-клеток, как описано в данном документе, является компьютеризованным с использованием компьютерной системы, как описано в разделе 5.6. В некоторых вариантах осуществления способы отбора донора аллогенных T-клеток, как описано в данном документе, являются компьютеризованными с использованием машиночитаемого носителя, как описано в разделе 5.6.

[00101] Дополнительные данные можно использовать для обновления репрезентации частоты, как только дополнительные данные становятся доступными.

5.4. Получение T клеточной линии

[00102] Кроме того, в настоящем документе описаны способы получения аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие, содержащие: (a) отбор донора Т-клеток в соответствии со способом, как описано в разделе 5,3; и (b) получение аллогенной T клеточной линии из отобранного донора аллогенных Т-клеток, аллогенная T клеточная линия которого распознает, по меньшей мере, один эпитоп антигена или патогена или злокачественной опухоли.

5.5. Пациенты

[00103] Пациентом, указанным в данном описании изобретения является пациент-человек.

[00104] В различных вариантах осуществления пациент был реципиентом трансплантата. В конкретном варианте осуществления трансплантатом является HSCT. В определенных вариантах осуществления HSCT является трансплантатом костного мозга (BMT). В определенных вариантах осуществления HSCT является трансплантатом стволовых клеток периферической крови (PBSCT). В определенных вариантах осуществления HSCT является трансплантатом пуповинной крови (CBT). В конкретном варианте осуществления трансплантат является трансплантатом солидного органа.

[00105] В различных вариантах осуществления пациент не являлся реципиентом трансплантата. В конкретном варианте осуществления пациент не являлся реципиентом HSCT. В конкретном варианте осуществления пациент не являлся реципиентом трансплантата солидного органа.

[00106] В различных аспектах, пациент имеет патоген или имеет подозрение на его наличие. В конкретном варианте осуществления пациент имеет патоген. В конкретном варианте осуществления пациент является сероположительным по патогену, и имеет симптомы инфицирования патогеном. Патогеном может быть вирус, бактерия, гриб, гельминт или простейшее. В определенных вариантах осуществления патогеном является вирус.

[00107] В некоторых вариантах осуществления вирусом является цитомегаловирус (CMV). В специфических вариантах осуществления, пациент имеет CMV инфекцию или имеет подозрение на наличие CMV инфекции после того, как пациент прошел HSCT. В конкретных вариантах осуществления антигеном CMV является CMV pp65. В конкретных вариантах осуществления антигеном CMV является CMV IE1.

[00108] В некоторых вариантах осуществления вирусом является вирус Эпштейна-Барр (EBV). В конкретных вариантах осуществления антигеном EBV является EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C, LMP1 или LMP2.

[00109] В некоторых вариантах осуществления вирусом является вирус полиомы BK (BKV), вирус Джона Каннингема (JCV), вирус герпеса, аденовирус (ADV), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус гриппа, вирус Эбола, поксвирус, рабдовирус или парамиксовирус. В конкретных вариантах осуществления вирусом является BKV. В конкретных вариантах осуществления вирусом является JCV. В конкретных вариантах осуществления вирусом является ADV. В конкретных вариантах осуществления вирусом является вирус герпеса-6 человека (HHV-6) или вирус герпеса-8 человека (HHV-8).

[00110] В одном из вариантов осуществления пациент имеет вирусную инфекцию, которая не отвечает на терапию противовирусными лекарственными средствами (низкомолекулярное соединение).

[00111] В различных аспектах, пациент имеет злокачественную опухоль или имеет подозрение на ее наличие. В конкретном варианте осуществления пациент имеет злокачественную опухоль. Злокачественная опухоль может включать злокачественную опухоль крови, молочной железы, легкого, яичника, желудка, поджелудочной железы, гортани, пищевода, семенников, печени, околоушных желез, желчных путей, кишечника, прямой кишки, шейки матки, матки, эндометрия, почки, мочевого пузыря, предстательной железы, щитовидной железы, головного мозга или кожи. В некоторых вариантах осуществления злокачественной опухолью является злокачественная опухоль крови. В специфических вариантах осуществления, злокачественной опухолью является лимфопролиферативное нарушение. В других вариантах осуществления злокачественной опухолью является злокачественная опухоль головного мозга.

[00112] В некоторых вариантах осуществления злокачественной опухолью является WT1-положительная злокачественная опухоль. В специфических вариантах осуществления, антигеном злокачественной опухоли является WT1.

[00113] В некоторых вариантах осуществления злокачественной опухолью является EBV-положительное посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (EBV-PTLD). В специфических вариантах осуществления, антигеном EBV-PTLD является EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B или EBNA3C. В дополнительных специфических вариантах осуществления антигеном является LMP1 или LMP2.

[00114] В некоторых вариантах осуществления злокачественной опухолью является EBV-положительная назофарингеальная карцинома. В специфических вариантах осуществления, антигеном EBV-положительной назофарингеальной карциномы является EBNA1, LMP1 или LMP2.

[00115] Антиген злокачественной опухоли, как описано в настоящем документе, может быть специфическим для рака или связанным с раком антигеном, и, таким образом, может быть пептидом или белком, чья экспрессия в раковой ткани или в раковых клетках выше, чем в нераковой ткани или нераковых клетках, или пептидом или белком, которые экспрессируются исключительно в раковой ткани или раковых клетках относительно нераковой ткани или нераковых клеток.

5.6. Компьютерные системы и машиночитаемые носители

[00116] В различных вариантах осуществления компьютерная система или машиночитаемый носитель сконфигурирован для осуществления любых способов отбора аллогенной T клеточной линии, и любых способов отбора донора аллогенных T-клеток, как описано в данном документе.

[00117] Кроме того, в настоящем документе представлены компьютерные системы для отбора аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему патоген или злокачественную опухоль или с подозрением на их наличие. В конкретном варианте осуществления такая компьютерная система содержит: центральный процессор; память, объединенную с центральным процессором, инструкции запоминающего устройства для произведения этапа(ов) любого из способов отбора аллогенной T клеточной линии или любого из способов отбора донора аллогенных T-клеток, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления компьютерная система дополнительно содержит средство отображения информации в рабочей связи с центральным процессором.

[00118] Кроме того, в настоящем документе представлен машиночитаемый носитель, имеющий выполняемые компьютером инструкции для произведения этапа(ов) любого из способов отбора аллогенной T клеточной линии или любого из способов отбора донора аллогенных T-клеток, как описано в данном документе.

[00119] В некоторых вариантах осуществления в компьютерную систему или машиночитаемый носитель загружены компоненты программного обеспечения, которые являются стандартными в данной области. Компоненты программного обеспечения в совокупности приводят к функционированию компьютерной системы в соответствии со способом отбора аллогенных T клеточных линий или способами отбора донора аллогенных T-клеток, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в компьютерную систему или машиночитаемый носитель загружены компоненты программного обеспечения, которые являются стандартными в данной области, и один или несколько компьютерных программных продукта, которые являются специфическими для данного изобретения. В специфических вариантах осуществления, один или несколько компьютерных программных продуктов приводит к функционированию компьютерной системы в соответствии со способом отбора аллогенных T клеточных линий или способов отбора донора аллогенных T-клеток, как описано в данном документе. В специфических вариантах осуществления, один или несколько компьютерных программных продуктов, которые являются специфичными для данного изобретения и компоненты программного обеспечения, которые являются стандартными в данной области, в совокупности приводят к функционированию компьютерной системы в соответствии со способом отбора аллогенных T клеточных линий или способов отбора донора аллогенных T-клеток, как описано в настоящем документе.

[00120] В определенных вариантах осуществления компьютерная система или машиночитаемый носитель сконфигурирован для отбора аллогенной T клеточной линии для терапевтического введения пациенту для высокой и постоянной эффективности. В определенных вариантах осуществления компьютерная система или машиночитаемый носитель сконфигурирован для отбора аллогенного донора T-клеток, от которого получают аллогенную Т клеточную линию для терапевтического введения пациенту для высокой и постоянной эффективности.

6. ПРИМЕР

[00121] Некоторые варианты осуществления в настоящем документе проиллюстрированы посредством следующего неограничивающего примера, который демонстрирует технологию, допускающую оптимизированный отбор терапевтически активных CMVpp65-специфических T-клеток из хранящихся в банке T-клеточных линий с HLA частично совпадающим со сторонним донором для лечения CMV инфекций на основе иерархии HLA аллелей, совпадающих у донора и реципиента, которые презентируют иммунодоминантные вирусные пептиды.

6.1. Способы:

6.1.1. Создание банка CMV CTL:

[00122] Все клеточные продукты производили в GMP лаборатории в мемориальном онкологическом центре Слоана Кеттеринга (MSKCC) в соответствии со стандартными процедурами эксплуатации (SOPs) и протоколами соответствия FDA.

6.1.1.1. Получение аутологичных цитокин-активированных моноцитов (CAMS):

[00123] Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли из крови сероположительных доноров посредством центрифугирования в градиенте плотности с применением фиколла-гипака.

[00124] PBMC в концентрации 107/мл, суспендированные в RPMI-1640 c 1% аутологичной сыворотки оставляли для адгезии в 6-луночных планшетах для культивирования тканей при 37°C в течение 2 часов, после которых неприкрепившиеся мононуклеарные клетки аккуратно удаляли. Прикрепившиеся моноциты, культивированные с 2 мл IMDM без сыворотки на лунку и с добавлением GM-CSF 2000 IU(50 мкл) и IL-4 1000 U (25 мкл) IL-4 через сутки вплоть до 5 суток. На 5 сутки фактор некроза опухоли-α (SIGMA, St. Louis) добавляли для достижения конечной концентрации 10 нг/мл, интерлейкин-1β до 400 IU/мл, интерлейкин-6 (R&D systems, Inc, Minneapolis, MN USA) до 1000 IU/мл и простагландин-E2 (Calbiochem, La Jolla, CA USA) до 25 мм/мл, чтобы индуцировать конечное созревание CAMS. На 7 сутки зрелые CAMS собирали, характеризовали в отношении экспрессии HLA Class II, CD14 и костимулирующих молекул посредством FACS, подсчитывали, разделяли на аликвоты и использовали для сенсибилизации T-клеточных линий, как подробно описано ниже.

6.1.1.2. Создание аутологичных трансформированных B лимфоцитарных клеточных линий (BLCL):

[00125] EBV-BLCLs от каждого донора получали посредством инфицирования PBMC с применением EBV штамма B95.8, как описано ранее (Koehne, G., et al., Blood, 2000. 96: 109-117; Koehne, G., et al., Blood, 2002. 99: 1730-1740). Клетки культивировали в RPMI 1640 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA USA) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и ацикловира.

6.1.1.3. Создание CMVpp65 специфических T-клеток:

[00126] T-клетки получали посредством обогащения из лимфоцитов периферической крови, отделенных от PBMCs посредством удаления прикрепившихся моноцитов с последующим удалением естественных киллеров посредством иммуномагнитной сепарации CD56+ клеток с применением предварительно покрытых CD56 иммуномагнитных микрочастиц (Miltenyi Biotech Inc.). Очищенные T-клетки затем сокультивировали с облученными аутологичными CAMS, загруженными совокупностью перекрывающихся пентадекапептидов (PL CAMs) степени чистоты GMP, как описано ранее (Trivedi, D., et al., Blood, 2005. 105: 2793-2801). T-клетки культивировали в течение 28-40 суток в присутствии IL-2 (5-40U/мл), и повторно стимулировали каждую неделю с применением облученных загруженных аутологичным пептидом CAMS, при соотношении эффектора и стимулятора 20:1, как описано ранее (Trivedi, D., et al., Blood, 2005. 105: 2793-2801).

6.1.2. Характеризация CMVpp65 специфических T-клеток:

6.1.2.1. Анализ тетрамеров:

[00127] Долю CMVpp65 эпитоп специфических T-клеток количественно определяли с использованием тетрамеров HLA-пептид с использованием коммерчески доступных тетрамеров CMVpp65 MHC-пептид для HLA A0201, A2402 и B0702, несущих пептидные последовательности NLVPMVATV, QYDPVAALF и TPRVTGGGAM, соответственно (Beckman Coulter, Inc Fullerton, CA). T-клетки инкубировали с тетрамерным комплексом, конъюгированным с CD3 FITC, CD8 PE, CD4 PerCP (BD Bioscience, San Jose, CA) и APC в течение 20 минут на льду, отмывали и затем анализировали посредством FACS (BD LSR II). Данные анализировали с использованием программного обеспечения Flowjo (Tree Star Inc, Ashland, OR). Долю CD4 и CD8+ T-клеток внутри культур, а также долю CD3+ и CD8+ T-клеток, связывающихся с тетрамерами HLA-пептидов определяли.

6.1.2.2. Репертуар TCR Vβ

[00128] Тетрамер CMV пептид-HLA+T-клетки анализировали на предмет репертура TCRVβ посредством проточной цитометрии с использованием коммерчески доступного набора, содержащего антитела к 24 подсемействам Vβ области TCR человека (IO Test® Бета Mark, Beckman Coulter, Inc, France) в соответствии с инструкциями производителя (Wei, S., et al., Immunogenetics, 1994. 40: 27-36).

6.1.2.3. Количественная оценка CMV-специфических и аллореактивных IFN-γ-продуцирующих T-клеток

[00129] В начале и в нескольких точках развития каждой CMV-специфической T-клеточной линии, T-лимфоциты донора в концентрации 1 × 106/мл смешивали с аутологичными CAMS, которые были загружены совокупностью CMVpp65 пептидов (20 мкг/мл) при соотношении эффектор-стимулятор 5:1. Контрольные пробирки, содержащие эффекторные клетки и PBMCs, не загруженные каким-либо пептидом, поставили в параллели. Брефелдин добавляли к нестимулированным и стимулированным пептидом образцам в концентрации 10 мкг/мл клеток. Пробирки инкубировали в течение ночи в течение 16 часов в инкубаторе с увлажненным воздухом, 5% CO2 при 37°C.

[00130] Аликвоты смешанных нестимулированных и стимулированных культур переносили в пробирки для окрашивания моноклональными антителами. Клетки окрашивали с применением 5 мкл моноклональных анти-CD3 меченных аллофикоцианином (APC) и 10 мкл анти-CD8 меченных перидинин хорофилл протеином (PerCP) или анти-CD4 меченных PerCP (BD Biosciences, San Jose, CA) и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте. Клетки отмывали с применением 2 мл фосфатно-солевой буфер (PBS)- бычий сывороточный альбумин (BSA)- азид (AZ) (PBS+0,5% BSA+0,1% AZ). Клетки центрифугировали, супернатант выбрасывали и 100 мкл реагента (Fix & Perm Cell Permeabilization Reagents & B; Caltag Laboratories, Burlingame, CA) добавляли в каждую пробирку, чтобы зафиксировать клетки. Эти клетки затем инкубировали в течение 15 минут. Клетки отмывали с применением PBS+BSA+AZ, и 100 мкл реагента B (Caltag Laboratories) добавляли для пермеабилизации. Внутриклеточное окрашивание проводили посредством добавления 10 мкл изотипического контроля IgG1 мыши флуоресцеинизотиоцианат (FITC) или моноклональных антител к IFN-γ FITC (BD PharMingen, San Diego, CA). Клетки инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, в темноте, дважды отмывали и дополнительно фиксировали в 1% формалине.

[00131] Окрашенные и зафиксированные клетки затем исследовали с использованием проточного цитометра LSR II с тремя лазерами с 10-цветовой возможностью воспроизведения (BD Biosciences), и анализировали с использованием программного обеспечения flowjo. Клетки в первую очередь идентифицировали по прямому и боковому светорассеянию, а затем посредством установки гейтов CD3+ клеток в CD3 APC против точечной диаграммы бокового светорассеяния. От двадцати до пятидесяти тысяч событий было включено в комбинированный гейт. Для дополнительной идентификации клеток проводили гейтирование CD3+CD8+ или CD3+CD4+клеток. Квадранты были установлены на основе анализа пробирок с нестимулированным контролем и изотипическим контролем.

6.1.3. Установление иерархии: количественный анализ противовирусных CD8+ Т-клеточных ответов на различные CMVpp65 эпитопы

6.1.3.1. Картирование эпитопов с использованием библиотеки перекрывающихся 15 aa пептидов

[00132] Т-клеточные ответы на специфические пептиды внутри CMV pp65 идентифицировали и количественно оценивали посредством измерения количества IFNγ положительных T-клеток, образованных посредством вторичного стимулирования аутологичными APCs, загруженными пептидами или совокупностью пептидов (PL), представляющими интерес, в соответствии с методом Waldrop et al (Waldrop, S.L., et al., J Clin Invest, 1997. 99: 1739-1750) с изменениями, внесенными Koehne et al (Koehne, G., et al., Blood, 2002. 99: 1730-1740). Сетка совокупности перекрывающихся пептидов делала возможной идентификацию специфических эпитопов, индуцирующих Т-клеточные ответы. Загруженные пептидами PBMCs, которые были аутологичными T-клеткам донора, CAMS, которые были аутологичны T-клеткам донора, или BLCL, которые были аутологичны T-клеткам донора, применяли в качестве APC для стимулирования отвечающих T-клеток для картирования эпитопа.

6.1.3.2. Цитотоксическая активность in vitro

[00133] Все T-клеточные линии оценивали на предмет их способности лизировать мишени, загруженные CMVpp65, с использованием стандартного анализа высвобождения 51хрома, как описано ранее (Koehne, G., et al., Blood, 2002. 99: 1730-1740; Trivedi, D., et al., Blood, 2005. 105: 2793-2801). Мишени, использованные во всех экспериментах, состояли из панели EBV-BLCL, каждая из которых имела общий с T-клетками данного донора единичный HLA аллель. Эти клетки были загружены, как указано для данного эксперимента, полной совокупностью CMVpp65 пептидов или их специфическими субсовокупностями, единичными пентадекапептидами или CMV pp65 нонамером, которые как известно, презентируются этим аллелем (например, NLVPMVATV для HLA A0201, QYDPVAALF для HLA A2402 и TPRVTGGGAM и RPHERNGFTV для HLA B0702) (Trivedi, D., et al., Blood, 2005. 105: 2793-2801; Hasan, A.N., et al., J Immunol, 2009. 183: 2837-2850). Мишени, загруженные пептидами, не презентируемыми общим HLA аллелем, применяли в качестве контроля. Рестрикцию HLA идентифицировали посредством реактивности против мишеней, активированных идентифицированным пептидным эпитопом, презентируемым на специфическом общем HLA аллеле, и отсутствия реактивности против пептида, загруженного или в EBV BLCL, содержащих другие общие аллели, или в полностью несочетающие EBV BLCL.

6.2. Данные:

6.2.1. Банк CMV CTL степени чистоты GMP из генотипически гетерогенных популяций донора, наследующих разнотипный массив HLA аллелей

[00134] В общей сложности 119 CMVpp65 специфических CTL линий были созданы за срок в 7 лет с начала клинического испытания с применением полученных от донора CMVpp65 специфических T-клеток для лечения вирусемии CMV у реципиентов аллогенных HSCT.

[00135] Совокупность доноров, использованных для создания CTL линий, наследовала 180 различных HLA аллелей, которые представляли общие HLA аллели, преобладающие в мультиэтнической популяции Нью-Йорка. Распределение HLA аллелей в совокупности CTL доноров также близко коррелировало с частотами HLA аллелей, представленными в каждой этнической популяции, включая европеоидов, азиатов и черных, за исключением HLA A0201 и B0702, которые были чрезмерно представлены; 33% против 25% и 21% против 8,7%, соответственно (Таблица 1). Порядок частот наследуемых аллелей HLA класса I среди 119 доноров был следующим: A0201 (n=39), A0301 (n= 28), B0702 (n=25), B 44 (n=24), HLA B 0801 (n=22), B 3501-11 (n=19), A1101 (n=16), A2402 (n=14), B 1501-17 (n=14), B 1801-07 (n=12), 3201-03 (n =11), A3301-04 (n=10), B 4001-06 (n=9), и A2601 (n=9), B 5701 (n=9). Другие аллели HLA класса I были представлены с низкой частотой, такой как HLA B 5201 (n=8), B 3801 (n=6), A6801-09 (n=5), B 5801 (n=5). Для аллелей HLA класса II было 6 аллелей HLA DRB1, которые были часто представлены, как и ожидалось на основе их высокой частоты в общей популяции (таблица 1). По порядку частот они включали DRB1 1501-08, 0401-32, 0301-13, 0701-04, 1101-20, 1301-34.

[00136] Таблица 1. Частоты HLA аллелей в основной популяции и характеризация 119 CMVpp65 специфических CTL линий.

HLA аллель Частота HLA аллелей в основной популяции CTL линии=119

HLA аллель	Частота HLA аллелей в основной популяции	CTL линии=119
	Cauc.	черные	азиаты	CTL линии, наследующие аллель	HLA аллель, ограничивающая цитотоксический ответ T-клеток
N	% CTL линий
A0101	14,07	4,85	3,66	23	3	12
A0201	25,01	15,75	3,22	39	32	82
A0301	11,9	6,48	3,23	29	0	0
A1101	6,87	1,45	16,33	16	1	6,2
A2301-05	2,5	11,77	0,8	4	0	0
A2402-07	10,3	3,14	23,97	16	3	18,7
A2501	2,12	0,45	0,46	2	0	0
A2601	4,22	3,33	3,85	9	4	44,4
A2901-02	3,01	3,94	0,86	8	2	25
A3001-10	3,39	14,48	2,1	6	1	16,7
A3101-10	2,52	1,88	4,62	7	0	0
A3201-10	3,92	2,03	0,62	10	0	0
A3301- 10	2,72	5,72	5,13	9	0	0
A6801-02	3,99	9,68	1,29	6	2	33
A6901	3,99	9,68	1,29	1	0	0
A7401-09		2	0	0
B0702	8,67	7,71	3,37	25	25	100
B0801	7,41	4,83	1,4	22	1	4,5
B1301-09	3,12	1,05	7,45	3	0	0
B1401-09	3,29	3,45	0,68	7	0	0
B1501-09	4,06	0,92	8,43	13	0	0
B1801-09	6,31	4,62	0,92	11	1	9
B2701-05	3,71	1,46	3,62	5	2	40
B3501-3511	10,33	5,53	5,03	19	9	47,4
B3801	2,41	0,35	2,1	5	0	0
B4001-4006	3,12	0,45	9,03	11	2	18,2
B4201-02	0,14	5,06	0,06	3	3	100
B4401-03	11,19	5,75	3,59	22	4	18,2
DRB1 0301	11,1	13,99	5,02	27	5	18,5
DRB1 0401-04	12,82	10,51	12,99	23	4	17,4
DRB1 0701	13,17	9,23	5,77	28	3	10,7
DRB1 1101-04	13,36	15,74	7,74	26	8	30,8
DRB1 1501-02	10,73	9,91	14,35	31	5	16

6.2.2. CMVpp65 специфические Т-клеточные ответы, в которых преобладают эпитопы, представленные ограниченным количеством аллелей HLA класса I и класса II

[00137] В 103 из 119 (87%) CTL линий иммунодоминантные Т-клеточные ответы были ограничены посредством аллелей HLA класса I, и в 16 CTL линиях посредством аллелей HLA класса II. В 54% CTL линий иммунодоминантные Т-клеточные ответы были ограничены посредством 3 аллелей HLA класса I; A0201 (25%), B 0702 (21%) и B3501-11 (8%). Другие аллели, презентирующие иммунодоминантные эпитопы включали HLA 2402, B 4001, B 4006, B 4202, B 4204, B 4402, B 4403, DRB1 0401 и 0404, DRB1 1101, DRB1 1202. Таким образом, несмотря на широкий спектр аллелей HLA класса I и класса II, представленных в этом банке, только 19 из этих аллелей презентировали эпитопы, вызывающие иммунодоминантные Т-клеточные ответы. Кроме того, Т-клеточные ответы любого детектируемого уровня были специфическими для эпитопов, презентируемых посредством только 49 из 180 HLA аллелей, наследуемых донорами в банке.

6.2.3. HLA аллели, презентирующие иммунодоминантные эпитопы, присутствуют в иерархическом порядке внутри индивидуумов, наследующих совместно специфические гаплотипы

[00138] Оценка T-клеточных линий в банке также продемонстрировала, что эпитопы, презентируемые специфическими HLA аллелями, были стабильно доминантными, как было измерено посредством количественного анализа эпитоп специфических IFNγ+ T-клеток и установления их HLA-рестрикции. Предшествующие исследования предоставили доказательство того, что эпитопы CMVpp65, презентируемые HLA B0702, являются доминантными у пациентов, наследующих совместно HLA A0201 и B0702 (Lacey, S.F., et al., Hum Immunol, 2003. 64: 440-452). В серии этого примера, HLA B0702 были стабильно аллель ограничивающими иммунодоминантными Т-клеточными ответами в случае всех 25 доноров в банке, наследующих эту аллель (100%), включая 9 совместно наследуемых с HLA A0201. Таким образом, ответы, ограниченные HLA B0702, были доминантными независимо от других наследуемых аллелей HLA класса I и класса II.

[00139] С другой стороны, у 30 из 39 доноров (77%), наследующиих HLA A0201, иммунодоминантный T-клеточный ответ был ограничен HLA A0201. Оставшимися 9 донорами были те, кто совместно наследовали HLA A0201 и B0702, и у каждого из этих 9 доноров иммунодоминантный T-клеточный ответ был ограничен посредством HLA B0702. Таким образом, HLA A0201 был аллелем, ограничивающим иммунодоминантный T-клеточный ответ при совместном наследовании с любыми другими аллелями HLA класса I или класса II, за исключением того, когда он совместно наследовался с HLA B0702. Например, среди 22 доноров, наследующих HLA B44 аллели, только 4 вызывали доминантные ответы, ограниченные этим аллелем. Когда эти аллели (B4401, B4402, B4403) совместно наследовали с HLA A0201, у 11 из 12 таких доноров (91,6%) иммунодоминантные ответы CTL были ограничены HLA A0201; другой донор также совместно наследовал HLA B0702 и вызывал HLA B0702 ограниченный ответ.

[00140] Другой поразительной чертой Т-клеточных ответов у доноров, наследующих HLA B 0702 или A0201, был тот факт, что наблюдаемые ответы были направлены исключительно против эпитопов, представленных этими аллелями. В противоположность этому, в T клеточных линиях, в которых ответы на иммунодоминантные эпитопы были ограничены посредством других HLA аллелей, субдоминантные популяции Т-клеток, специфических для других эпитопов и ограниченных посредством других HLA аллелей, наблюдали в большинстве случаев. Этот анализ сделал возможным распознавание иерархической кластеризации HLA аллелей, презентирующих иммунодоминантные эпитопы, как представлено на фигуре 1.

[00141] Иерархия HLA аллелей, презентирующих иммунодоминантные эпитопы, была основана исключительно на их уровне функциональной активности в ответ на стимулирование пептидом. Не было корреляции между аффинностью пептида для HLA связывания и его способностью вызывать иммунодоминантные Т-клеточные ответы (Таблица 2).

[00142] Таблица 2. Характеризация HLA аллелей, презентирующих иммунодоминантные эпитопы.

No	Эпитоп	Презентирующий HLA аллель	Количество CTL линий, демонстрирующих ответ	Количество эпитоп иммунодоминантных CTL линий	Предсказанный балл связывания (SYFPEITHI)
HLA класс I
1	NLVPMVATV	A0201	31	30	30
2	TPRVTGGGAM	B0702	16	13	19
3	RPHERNGFTV	B0702	12	7	17
4	HERNGFTVL	B4001 & 4006, B4201 & 4202, B4403, A2601, A0101	11	10	23 23 23 8 4
5	EVQAIRETVE	B3501, B3502, B3503, B3508, B3511	7	5	2
6	QYDPVAALF	A2402, 2407	5	5	24
7	INVHHYPSAA	A2601 A0101	3 1	3 1	6 0
8	YSEHPTFTS	B0801 A0101	4	3	0 13
9	QMWQARLTV	B5201 B3502	3 1	2 1	не обнаружен 1
10	VYALPLKMLN	A2402 A6801 B3501	1 1 1	3	14 5 11
11	FVFPTKDVAL	A2402 B3501	2 2	2 2	21 13
HLA класс II
11	EHPTFTSQYRIQGKL	DRB1 1101, DRB1 1104, DRB1 1501	8	7	3 3 4
12	KYQEFFWDAND	DRB1 1101, DQB1 0501	6	5	1 18
13	QPFMRHERNGF	DRB1 0301 DRB1 1501	3	2	не обнаружен не обнаружен
HLA класс I и класс II (общие)
1	KYQEFFWDANDIYRI	B1801, DRB1 1101, DQB1 0501	1 6 1	1 5 0	не обнаружен 1 18
2	QIFLEVQAIRETVE	B3501-3511, DRB1 1501	7 1	5 0	2 14
3	QPFMRHERNGF	A0101, B0801 DRB1 0301 DRB1 1501	1 1 2 1	1 1 2 0	1 не обнаружен не обнаружен не обнаружен
4	AGILARNLVPMVATV	A0201 DRB1 0401, DRB1 0402, DRB1 0404 DQB1 0301	31 2 1 1 1	30 1 1 0 1	30 14 14 14 не обнаружен
5	PQYSEHPTFTSQYRI	A0101, B0801 DRB1 0301	2 2 2	2 2 2	13 0 0

6.2.4. Репертуар эпитопов и HLA аллелей, составляющих CMV CTL банк, можно использовать для лечения различных популяций пациентов

[00143] Очень ограниченный репертуар иммунодоминантных CMVpp65 эпитопов, вызывающих Т-клеточные ответы, был обнаружен внутри 119 CTL линий, составляющих GMP банк, которые презентировались ограниченных количеством HLA аллелей. Учитывая, что Т-клеточные ответы определяются такой узкой специфичностью; для антиген специфических T-клеток, предназначенных быть клинически эффективными при стороннем использовании, выбранные T-клетки должны отвечать на эпитопы, презентируемые посредством HLA аллеля, общего с пациентом. С учетом этих параметров, анализировали долю этнически отличающихся пациентов, которых потенциально можно было бы лечить с применением CTLs из этого банка.

[00144] Серия последовательных трансплантатов с удаленными T-клетками, полученных в Мемориальном онкологическом центре Слоуна-Кеттеринга за последние 3-5 лет от доноров, которые были или HLA совпадающими или HLA несочетающими, родственными или неродственными, а также донорами пуповинной крови, была проверена. В серии 239 HLA совпадающих родственных или неродственных трансплантатов в центре, в 86% таких случаев было возможным идентифицировать CTL линию с CMV T-клеточным ответом, ограниченным посредством HLA аллеля, общего с пациентом и с совпадающими 1-2 дополнительными HLA аллелями. Сходным образом, в серии 137 HLA несочетающихся трансплантатов и 70 трансплантатов пуповинной крови, соответствующим образом было возможным идентифицировать ограниченную CTL линию в 93% и 81% случаев, соответственно. Таким образом, несмотря на широкую репрезентацию HLA аллелей в этом CTL банке, T-клетки, ограниченные посредством ограниченного репертуара HLA аллелей, могли быть идентифицированы и использованы для лечения большинства пациентов в данной этнически неоднородной группе.

6.2.5. Клиническая активность CMV CTLs, выбранных для лечения от донора трансплантатов или стороннего донора с использованием переопределенных эпитопов и критериев HLA рестрикции

[00145] В общей сложности 54 подлежащих оценке пациентов получали CMV CTLs в качестве лечения клинической инфекции или стойкой вирусемии, которая не отвечает на противовирусные лекарственные средства. Из них 19 получили CMVpp65-специфические T-клетки от их HCT донора (NCTO1646645) и 35 из T-клеток от стороннего донора с >2 сочетающимися HLA аллелями. Результаты обобщены в таблице 3 и таблице 4. В этом анализе CR определяют как клиренс клинической инфекции и/или клиренс детектируемого CMV из крови. PR определяют как снижение CMV в крови >2 log10. SD определяют как пациентов со стабильным клиническим статусом и снижением CMV <2 log10. POD определяют как непрерывную прогрессию вирусемии и клинического заболевания.

[00146] Таблица 3. Ответы посредством HLA рестрикции введенных CMVpp65-специфических T-клеток.

РЕСТРИКЦИЯ HLA Т-КЛЕТОК (ЭПИТОП)	N ПОЛУЧИВШИХ ЛЕЧЕНИЕ И ПОДДАЮЩИХСЯ ОЦЕНКЕ	ОТВЕТЫ
CR	PR	SD	POD
HLA-A0201 (NLVPMVATV)	19	12	2	3	2
HLA-B0702 (TPRVTGGGAM или RPHERNGFTV)	8	8	0	0	0
HLA-B0801 (DVEEDLTMT)	3	3	0	0	0
HLA B4401-3/B4001 (HERNGFTVL)	5	2	1	1	0
HLA-B3501 (N=3) (IPSINVHHY)	7	0	0	0	7
HLA-B3502 (N=3) (QMQARLTVS)
HLA-B3508 (N=1) (EVQAIRETVE)
HLA-A2601 (INVHHYPSAA)	3	0	0	0	3

[00147] Таблица 4. Иммунодоминантные HLA аллели, детектируемые в других введенных CMVpp65 специфических T-клетках

Рестрикция HLA аллелей (Эпитоп)	N поддающихся оценке	Ответ
CR	PR	SD	POD
A2407 (QYDPVAALF)	1	0	0	0	1
A2902 (VCSMENTRAT)	1	1	0	0	0
A3001 (RVSQPSLIL)	1	0	1	0	0
B0705 (GVMTRGRLKA)	1	1	0	0	0
B1801 (KYQEFFWDAN)	1	0	1	0	0
B2704 (VSVNVHNPT)	1	1	0	0	0
DRB1 0301 (QPFMRPHERNG)	1	0	0	0	1
DRB1 0701 (SGKLFMHVTLG)	1	0	0	0	1
DRB1 1101 (FTSQYRIQGKL)	1	0	1	0	0

[00148] Как можно видеть, из 19 пациентов, получавших T-клетки, специфические для CMVpp65 эпитопа, презентируемого HLA A201, 14 достигали CR или PR. Из 9 получавших лечение T-клетками, специфическими для иммунодоминантного эпитопа, презентируемого HLA B0702, 8 достигали CR. Сходным образом, иммунодоминантные T-клетки, ограниченные посредством HLA A2402 (N=2) и B0801 (N=3), индуцировали CRs в каждом из 5 случаев лечения.

[00149] В противоположность этому, 7/7 реципиентов CMVpp65-специфических T-клеток, специфических для иммунодоминантного эпитопа, презентируемого аллельным вариантом HLA B35, не продемонстрировали ответ. Сходным образом, иммунодоминантные T-клетки, специфические для эпитопов A2601 (N=3), A2407 (N=1) и B5001 (N=1), не смогли элиминировать инфекцию или снизить вирусемию.

[00150] Эти проспективные результаты обеспечивают доказательство того, что иммунодоминантные эпитопы, презентируемые специфическими HLA аллелями индуцируют T-клетки, которые обладали лучшей терапевтической активностью in vivo.

[00151] Пациентов, которые получали трансплантаты от доноров, которые также давали согласие иметь их CMVpp65-специфические T-клетки, включали в банк для применения у индивидуумов, отличных от тех, которым они предоставляли HLA совместимые HCT, также ретроспективно изучали. Причиной было то, что трансплантаты, лишенные T-клеток, от таких доноров, которые, как правило, содержат 2-8×103 T-клетки/кг массы реципиента, также предоставят небольшое количество иммунодоминантных CMV-специфических T-клеток, поскольку частота IFNγ+ CMV специфических T-клеток в крови у сероположительных доноров находилась в диапазоне 0,1-1% от циркулирующих T-клеток. Результаты этого первоначального анализа представлены в таблице 5.

[00152] Таблица 5. Анализ CMV реактивации, заболевания и конечного ответа на терапию, направленную на CMV, у пациентов, которые получали трансплантаты от HLA совместимых доноров, которые также вносили клетки в банк в качестве сторонних доноров.

HLA аллель	N	Нет	Низкий (2-13/предметное стекло < 1000)	Высокий (>100/предметное стекло >предметное стекло)	CMV заболевание	Rx T-клетки	Тип заболевания	Ult. Нет ответа
B0702	25	9	7	9	0	6	-	0
A0201	36	14	12	10	1	7	BAL+L.P.	0
Нет B0702	29	11	12	6	1	-	BAL+L.P.
B0801
Нет B0702	16	8	4	4	1	-	другое	0
B35	13	2	3	8	7	-	1 менингиома	6
Нет A02 или B07							1 гепатит
							3 пневмония
							2 другое
A1101	13	4	2	7	2	-	1 пневмония	2
Нет A02 или B7							1 колит
A2601	9	3	3	3	3	-	2 другое	1
							1 пневмония
A0101	16	9	3	4	3	-	1 менингиома	2
Нет A2 или B7							1 другое
							1 пневмония
A2402	13	5	3	5	2	-	1 пневмония	1
Нет A2 или B7
A0301	8	3	2	3	1	-	1 CSF+	0
Нет A2 или B7

[00153] Снова, как видно у пациентов, получавших лечение CMVpp65-специфическими T-клетками, реципиенты трансплантатов от доноров, имеющих общие HLA B0702 и A0201 аллели, имели низкий риск развития CMV заболевания, и вирусемия стабильно отвечала на лечение, в то время как те, кто получал импланты от доноров, не имеющих эти аллели, демонстрировали значительное присутствие манифестной инфекции. Это снова конкретно наблюдали у пациентов, несущих варианты HLA B35, у которых отсутствовал или HLA B0702, или A0201.

[00154] Клинические данные позволили нам определить иерархию определенных HLA аллелей, презентирующих иммунодоминантные эпитопы CMVpp65, вызывающих пептид-специфические Т-клеточные ответы (см. таблицу 6), пример репрезентации активности.

[00155] Таблица 6. Иерархия HLA аллелей, презентирующих иммунодоминантные эпитопы CMVpp65, вызывающих пептид-специфические Т-клеточные ответы.

РЕСТРИКЦИЯ HLA T КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ	РАНГa
HLA-B0702	1
HLA-A0201	2
HLA-B0801	3
HLA-B4401	4

a более высокий ранг соответствует более значимой клинической эффективности T клеточной линии, ограниченной посредством HLA аллеля, при лечении пациентов, имеющих CMV инфекцию или непрекращающуюся вирусемию, которые продемонстрировали отсутствие ответа на противовирусные лекарственные средства

[00156] Наши данные указали на то, что HLA-B35 варианты не следует использовать (и таким образом они должны быть признаны «непригодными» среди HLA аллелей в репрезентации).

6.3. Данные позволяют предположить, что:

[00157] 1. Ограниченный репертуар CMVpp65 эпитопов вызывает функциональные CMV специфические цитотоксические Т-клеточные ответы и в общей сложности 49 HLA аллелей из 181 аллелей, представленных внутри этого CTL банка, презентируют эти иммунодоминантные CMVpp65 эпитопы.

[00158] 2. Идентифицированные пептидные эпитопы могут быть использованы для разработки эффективной полипептидной вакцины или использованы в качестве ограниченной совокупности пептидов для создания высоко функциональных CMV CTLs в будущем для адоптивной иммунотерапии.

[00159] 3. Включение анализа иерархии HLA в отбор CTL линий для лечения должен содействовать более высокой и более стабильной эффективности CTL лечения сторонних лиц.

6.4. Сущность клинических и экспериментальных результатов

[00160] Адоптивно пересаженные вирус-специфические T-клетки, чтобы быть эффективными, должны быть специфическими для вирусного пептидного эпитопа, который как экспрессируется клетками-хозяевами, инфицированными вирусом, так и презентируется HLA аллелем, экспрессируемым инфицированными клетками-хозяевами и T-клетками донора, посредством которых HLA-ограниченные T-клетки донора распознают вирусный эпитоп.

[00161] Вслед за разрешением первичной инфекции CMV первоначально широкий репертуар отвечающих T-клеток уменьшается, таким образом, что остаются T-клетки, специфические только для ограниченного количества иммунодоминантных эпитопов. Как результат, CMVpp65-специфические T-клеточные линии, полученные размножением латентно инфицированных, CMV сероположительных нормальных доноров, как правило, являются специфическими только для 1-2 иммунодоминантных CMVpp65 пептидов, презентируемых только 1-2 HLA аллелями, экспрессируемыми донором.

[00162] Авторы обнаружили, что существует иерархия HLA аллелей, презентирующих иммунодоминантные эпитопы CMVpp65, вызывающие пептид-специфические Т-клеточные ответы, что ведет к преимущественному распространению CMVpp65-специфических T-клеток, презентируемых специфическими HLA аллелями по сравнению со всеми другими наследуемыми и экспрессируемыми. Эта иерархия не основана на аффинности связывания пептида с презентирующим аллелем. Как результат этой иерархии HLA рестрикции:

[00163] 1. Иммунодоминантные эпитопы, вызывающие CMVpp65-специфические T-клетки, детектируемые в размноженных in vitro T-клеточных линиях презентируются только ограниченным количеством HLA аллелей.

[00164] 2. Кроме того, среди индивидуумов наследующи два или более HLA аллелей из этого ограниченного репертуара HLA аллелей, которые презентируют иммунодоминантные пептидные эпитопы, определенные HLA аллели (например, HLA B0702 или HLA A0201) стабильно презентируют эпитопы, которые вызывают ответы на исключение других.

[00165] Ранние результаты фазы II испытаний дополнительно указывают на то, что пациенты с CMV инфекцией или стабильной вирусемией, которые не продемонстрировали ответ на противовирусную лекарственную терапию, которых затем лечили с применением полученных от сторонних доноров CMVpp65-специфических T-клеток, которые являются ограниченными посредством HLA аллеля, экспрессируемого инфицированными клетками у хозяина, тех пациентов, получающих CMVpp65-специфические T-клетки, которые ограничены посредством тех же HLA аллелей в вершине иерархии (например, HLA B0702 или HLA A0201), стабильно отвечают, в то время как лечение с применением CMVpp65-специфических T-клеток, ограниченных посредством HLA аллелей, находящихся ниже в иерархии, может элиминировать инфекцию, ответы являются менее стабильными.

7. Включение посредством ссылки

[00166] В настоящем документе цитируются различные публикации, раскрытие информации о которых, таким образом, полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки.

1. Способ отбора аллогенной Т-клеточной линии для терапевтического введения пациенту-человеку, имеющему злокачественную опухоль или с подозрением на ее наличие, содержащий:

отбор Т-клеточной линии, аллогенной пациенту, которая распознает по меньшей мере один эпитоп антигена злокачественной опухоли, с применением репрезентации, которая (i) идентифицирует множество HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, и (ii) описывает признаки относительных активностей Т-клеточных линий, каждая из которых распознает по меньшей мере один эпитоп антигена злокачественной опухоли, и ограничена различными вариантами HLA аллелей или комбинациями HLA аллелей в множественности; где в репрезентации каждый идентифицированный HLA аллель или комбинация HLA аллелей связаны с соответствующим признаком относительной активности Т-клеточной линии, ограниченной HLA аллелем или комбинацией HLA аллелей, где относительными активностями являются относительные меры известных активностей против злокачественной опухоли, демонстрируемой Т-клеточными линиями; где

(A) выбранная Т-клеточная линия имеет общий с пациентом или пораженными клетками у пациента HLA аллель или комбинацию HLA аллелей, идентифицированных посредством репрезентации, до которой ограничено распознавание Т-клеточной линии; и

(B) HLA аллель или комбинация HLA аллелей, до которых выбранная Т-клеточная линия ограничена, связаны в репрезентации с признаком самой высокой относительной активности среди HLA аллелей и комбинаций HLA аллелей в репрезентации, которые, как известно, должны быть общими с пациентом или пораженными клетками у пациента, и если не признаны непригодными; и

где способ дополнительно содержит (i) до стадии отбора стадию создания репрезентации и (ii) до стадии создания стадию измерения относительных активностей.

2. Способ по п. 1, который дополнительно содержит предшествующий этапу отбора этап установления HLA распределения пациента или пораженных клеток у пациента.

3. Способ по п. 2, где этап установления содержит типирование по меньшей мере 4 HLA локусов.

4. Способ по п. 1, где репрезентация является списком множественности HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, ранжированных по относительным активностям.

5. Способ по п. 1, где репрезентация является базой данных, содержащей списки множественностей HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей, каждая из которых связана с баллом, указывающим на относительную активность.

6. Способ по п. 1, где репрезентация является диаграммой рассеяния.

7. Способ по п. 6, где первая ось диаграммы рассеяния представляет различные варианты HLA аллелей и необязательно комбинаций HLA аллелей в множественности; и где вторая ось диаграммы рассеяния представляет процент интерферон-γ-секретирующих CD3+ клеток, полученных из каждой Т-клеточной линии, для которой признак относительной активности описан в репрезентации, при стимуляции антигенпредставляющими клетками, которые являются аутологичными соответствующей Т-клеточной линии и загружены одним или несколькими пептидами, демонстрирующими антигенность злокачественной опухоли, в качестве признака указанной относительной активности.

8. Способ по п. 1, где относительные активности являются клиническими эффективностями Т-клеточных линий in vivo при лечении пациентов, имеющих злокачественную опухоль.

9. Способ по п. 1, где репрезентацию хранят в базе данных.

10. Способ по п. 5, где относительными активностями являются in vivo клинические эффективности Т-клеточных линий при лечении пациентов, имеющих злокачественную опухоль.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где злокачественной опухолью является рак крови.

12. Способ по любому из пп. 1-10, где злокачественной опухолью является злокачественная опухоль молочной железы, легкого, яичника, желудка, поджелудочной железы, гортани, пищевода, семенников, печени, околоушных желез, желчных путей, кишечника, прямой кишки, шейки матки, матки, эндометрия, почки, мочевого пузыря, предстательной железы, щитовидной железы, головного мозга или кожи.

13. Способ по любому из пп. 1-10, где антигеном является WT1.

14. Способ по любому из пп. 1-10, где злокачественной опухолью является лимфопролиферативное нарушение.

15. Способ по п. 14, где злокачественной опухолью является EBV-положительное посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение.

16. Способ по п. 15, где антигеном является EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B или EBNA3C.

17. Способ по п. 15, где антигеном является LMP1 или LMP2.

18. Способ по любому из пп. 1-10, где злокачественной опухолью является EBV-положительная назофарингеальная карцинома.

19. Способ по п. 18, где антигеном является EBNA1, LMP1 или LMP2.

20. Способ по любому из пп. 1-10, где пациент был реципиентом HSCT.

21. Способ по п. 20, где HSCT является трансплантатом костного мозга, трансплантатом стволовых клеток периферической крови или трансплантатом пуповинной крови.

22. Способ по любому из пп. 1-10, где пациент был реципиентом трансплантата солидного органа.