Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого cyslt1 рецептора
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению человеческого лейкотриенового рецептора типа 1 (human cysteinyl leikotriene receptor 1, CysLTR1), и может быть использовано для экспрессии CysLT1 рецептора. Предложена генетическая конструкция с нуклеотидной последовательностью, которая оптимизирована для экспрессии CysLTR1 в клетках насекомых. Изобретение обеспечивает рекомбинантную экспрессию в эукариотической системе на клеточной поверхности за счет комбинации N-концевых пептидных фрагментов и положения партнерного белка b562RIL в третьей внутриклеточной петле, что также стабилизирует белок и помогает образованию кристаллических контактов. Также проводят дополнительное транкирование неупорядоченного С-конца CysLT1 рецептора, препятствующего формированию кристаллов. 3 ил.
Изобретение относится к молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологиям и касается новых генетических конструкций и продуцентов, обеспечивающих экспрессию рекомбинантного человеческого цистеинил-лейкотриенового рецептора 1 класса GPCR, пригодного к дальнейшим структурно-функциональным исследованиям.
Известна конструкция дикого типа CysLT1, депонированная в базе данных BLAST Align
Retrieve/ID mapping UniProtKB - Q9Y271 (CLTR1_HUMAN, https://www.uniprot.org/uniprot/Q9Y271).
Существуют патенты на препараты лейкотриеновых рецепторов, гены, конструкции и клеточные линии для получения рецептора в целях фармакологического скрининга и получения антител (https://patents.google.com/patent/US6465212?oq=cyslt1).
Существует большое количество патентов, касающихся создания прототипов лекарственных препаратов, лигандов, антагонистов, имеющих своими мишенями CysLT1 и методов их использования
https://patents.google.com/patent/W02013013490A1/en?oq=cyslt1
www.google.ru/patents/WO2017088725A1?cl=en
www.google.ru/patents/US8980917
Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам неизвестно, чтобы существовала конструкция CysLT1 рецептора, обеспечивающая кристаллизацию белка методом in meso.
Отличительным признаком изобретения являются: комбинация N-концевых пептидных фрагментов, обеспечивающих рекомбинантную экспрессию в эукариотической системе на клеточной поверхности, а также очистку рецептора; положение партнерного белка в третьей внутриклеточной петле, способствующего повышению выхода белка на цитоплазматическую мембрану при экспрессии, стабилизирующего белок и помогающего образованию кристаллических контактов; транкирование неупорядоченного С-конца CysLT1 рецептора, препятствующего формированию кристаллов.
Техническим результатом изобретения является возможность получения дифрагирующих кристаллов указанной конструкции, полученных методом кристаллизации в липидной кубической фазе, а также проведения функциональных тестов: анализа связывания лигандов, анализа стабилизирующего эффекта различных буферных растворов.
Описание способа получения генетической конструкции заявляемого изобретения.
Способ поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность модифицированного CysLT1 рецептора. Мелким регистром показан ген рецептора, курсивом - ген партнера b562RIL. Крупным прямым шрифтом показаны гены N-концевых пептидов и линкеров.
На фиг. 2 представлена схема кристаллизационной конструкции CysLT1R, цветом показаны N-концевые пептидные фрагменты, место вставки BRIL, обрезка С-конца. Схема построена при помощи Интернет базы данных GPCRdb.org.
На фиг. 3 представлен анализ степени агрегации (А) и стабильности (Б) CysLT1R после оптимизации протокола очистки. Микрофотографии в видимом свете характерных кристаллов комплексов с зафирлукастом (В) и пранлукастом (Г).
Ген дикого типа был приобретен в компании cdna.org (США), плазмида, ген белка-партнера был синтезирован компанией GenScript (США). Используемый плазмидный вектор pFastBac1 (Invitrogen, США), модифицировался методом безлигазного клонирования с использованием праймеров, синтезированных в компании Евроген (Россия). Применялась ПЦР-смесь Accuprime-Pfx (Invitrogen, США), для избавления от исходной плазмиды использовалась Dpnl рестриктаза (NEB, США), согласно рекомендациям фирмы-производителя. Для амплификации вектора использовался бактериальный копийный штамм E.coli, ТОР10. Аминокислотная и ДНК-последовательности представлены на фиг 1-2.
Оценка эффективности заявляемой генетической конструкции для реализации указанного назначения проводилась следующим образом. Плазмидой трансформировались бактериальные клетки E.coli штамма DH10Bac, в котором методом сайт-специфичной транспозиции ген интереса встраивался в челночный вектор бакмиду, содержащую геном бакуловируса AcNPV. Клетки Sf9 трансфецировались бакмидой, и формировался вирус, в геноме которого содержался ген CysLT1 рецептора. В результате чего получалась клеточная культура, экспрессирующая белок на клеточной мембране, что проверялось методом проточной цитометрии. После наработки биомассы проводилось выделение мембранной фракции путем лизиса клеток в гипотоническом буфере и отделения цитозольной фракции в гипертоническом буфере, затем солюбилизация белка мягким детергентом и очистка при помощи металл-аффинной хроматографии, белок при этом стабилизировался добавлением лиганда, начиная с шага солюбилизации. Чистота белкового препарата проверялась электрофоретическим методом. Затем исследовалась степень агрегации рецептора методом аналитической гель-фильтрационной ВЭЖХ и стабильность методом анализа кривой плавления с СРМ красителем (С1484, Sigma, США). Чистота препарата составляла более 90%, степень мономерности - более 90%, температура плавления составляла более 70 градусов с лигандом и более 60 градусов для Апо формы. Проводилась кристаллизация в липидной кубической фазе, и были получены белковые кристаллы с антагонистами, зафирлукастом (Z4152, Sigma, США) и пранлукастом (Р0080, Sigma, США), продифрагировавшие до 2,5 и 2,7 ангстрем, соответственно (фиг 3).
Использование заявляемой генетической конструкции позволяет проводить рентгеноструктурный анализ кристаллов CysLT1 рецептора и изучать белок при помощи различных биофизических методов исследования.
--->
SEQUENCE LISTING
<110> федеральное государственное автономное образовательное
учреждение высшего образования "Московский физико-технический
институт (национальный исследовательский университет)"
<120> Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной
экспрессии и кристаллизации человеческого CysLT1 рецептора.
<130> RU
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atgaagacga tcatcgccct gagctacatc ttctgcctgg tattcgccga ctacaaggac 60
gatgatgacg ccaaactgca gaccatgcat catcatcatc atcatcatca tcatcatgaa 120
aacctgtatt ttcagggcgg taccatggat gaaacaggaa atctgacagt atcttctgcc 180
acatgccatg acactattga tgacttccgc aatcaagtgt attccacctt gtactctatg 240
atctctgttg taggcttctt tggcaatggc tttgtgctct atgtcctcat aaaaacctat 300
cacaagaagt cagccttcca agtatacatg attaatttag cagtagcaga tctactttgt 360
gtgtgcacac tgcctctccg tgtggtctat tatgttcaca aaggcatttg gctctttggt 420
gacttcttgt gccgcctcag cacctatgct ttgtatgtca acctctattg tagcatcttc 480
tttatgacag ccatgagctt tttccggtgc attgcaattg tttttccagt ccagaacatt 540
aatttggtta cacagaaaaa agccaggttt gtgtgtgtag gtatttggat ttttgtgatt 600
ttgaccagtt ctccatttct aatggccaaa ccacaaaaag atgagaaaaa taataccaag 660
tgctttgagc ccccacaaga caatcaaact aaaaatcatg ttttggtctt gcattatgtg 720
tcattgtttg ttggctttat catccctttt gttattataa ttgtctgtta cacaatgatc 780
attttgacct tactaaaaaa atcaatgaaa tcggctgatc tggaagacaa ttgggaaact 840
ctgaacgaca atctcaaggt gatcgagaag gctgacaatg ctgcacaagt caaagacgct 900
ctgaccaaga tgagggcagc agccctggac gctcagaagg ccactccacc taagctcgag 960
gacaagagcc cagatagccc tgaaatgaaa gactttcggc atggattcga cattctggtg 1020
ggacagattg atgatgcact caagctggcc aatgaaggga aagtcaagga agcacaagca 1080
gccgctgagc agctgaagac cacccggaat gcatacattc agaagtacct gtcgggcaaa 1140
aatctgtcaa gtcataaaaa ggctatagga atgatcatgg tcgtgaccgc tgccttttta 1200
gtcagtttca tgccatatca tattcaacgt accattcacc ttcatttttt acacaatgaa 1260
actaaaccct gtgattctgt ccttagaatg cagaagtccg tggtcataac cttgtctctg 1320
gctgcatcca attgttgctt tgaccctctc ctatatttct tttctggggg taactttagg 1380
aaaaggctgt ctacattcag aaagtaataa 1410
<---
Генетическая конструкция с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, кодирующая человеческий лейкотриеновый рецептор типа 1 (human cysteinyl leikotriene receptor 1, CysLTR1).
