Микроскопия структурированного освещения с линейным сканированием

Изобретение относится к технологиям для снижения количества углов, необходимых в ходе формирования изображений при структурированном освещении биологических образцов, за счет применения проточных ячеек со сформированным рисунком. Заявленный способ формирования изображений биологического образца содержит следующие шаги: направляют свет через неподвижную оптическую дифракционную решетку, проецируют рисунок оптической дифракционной решетки, созданный посредством света, направленного через неподвижную оптическую дифракционную решетку, на биологический образец; осуществляют линейное сканирование биологического образца; перемещают биологический образец относительно рисунка оптической дифракционной решетки или перемещают свет, направленный через неподвижную оптическую дифракционную решетку, и реконструируют изображение с высоким разрешением, характерное для биологического образца. Причем по меньшей мере часть биологического образца размещена во множестве наноразмерных лунок, а указанное множество наноразмерных лунок имеет ориентацию, образующую квадратный рисунок. Технический результат - уменьшение количества изображений и размеров, необходимых для разрешения (различения) флуоресцентных образцов с помощью SIM-технологии с применением имеющих особый рисунок проточных ячеек, а также для эффективного использования движения светового пучка относительно флуоресцентных образцов с целью практического осуществления SIM-технологии, которая может быть использована совместно с технологиями линейного сканирования. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 11 ил.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №62/621570, поданной 24 января 2018 г.под названием «Микроскопия структурированного освещения с линейным сканированием», а также заявки на патент Нидерландов №N2020623, поданной 20 марта 2018 г.под названием «Микроскопия структурированного освещения с линейным сканированием». Содержание каждой из упомянутых выше заявок в полном объеме включено в настоящий документ посредством ссылки.

Уровень техники

Многочисленные последние достижения в области биологии опираются на усовершенствованные способы анализа и секвенирования нуклеиновых кислот. Например, проект «Геном человека» позволил определить всю последовательность человеческого генома, что, как можно надеяться, приведет к дальнейшим открытиям в различных областях, начиная от лечения заболеваний до достижений в фундаментальной науке. Недавно стало известно о целом ряде новых технологий секвенирования ДНК, которые основываются на массово-параллельном анализе неамплифицированных, или амплифицированных одиночных молекул, либо в форме плоских массивов, либо на гранулах.

Методы, используемые для анализа последовательности нуклеиновых кислот в таких новых технологиях секвенирования, часто основываются на обнаружении флуоресцентных нуклеотидов или олигонуклеотидов. Микроскопия структурированного освещения (SIM, от англ. Structured Illumination Microscopy) относится к одной из таких технологий секвенирования, в которой пространственно структурированный (то есть со сформированным рисунком) свет может быть использован для формирования изображений образца с целью увеличения латерального разрешения микроскопа в два или более раз. Во время визуализации образца, можно получить изображения образца с различными фазами рисунка (например, 0°, 120° и 240°), причем данную процедуру повторяют, поворачивая и меняя ориентацию рисунка вокруг оптической оси (например, на 60° и 120°). Захваченные изображения (например, девять изображений, одно изображение для каждого угла ориентации в каждой фазе рисунка) могут быть собраны в одно изображение, имеющее расширенную полосу пространственных частот. Указанное единственное изображение можно ретрансформировать в действительное пространство для создания изображения, имеющего более высокое разрешение по сравнению с разрешением, обычно обеспечиваемым традиционным микроскопом.

В типовых SIM-системах, линейно поляризованный световой пучок направляется через оптическую дифракционную решетку, которая приводит к дифракции пучка на два или более отдельных порядка, которые могут проецироваться на отображаемый образец в виде рисунка синусоидальных интерференционных полос. В таких технических решениях, ориентацией спроецированного рисунка оптической дифракционной решетки управляют поворотом оптической дифракционной решетки вокруг оптической оси, при этом фазу рисунка регулируют посредством перемещения оптической дифракционной решетки в боковом направлении поперек оси. В таких системах, оптическая дифракционная решетка устанавливается на столик поступательного перемещения, который, в свою очередь, устанавливается на столик вращения. Дополнительно, в таких системах часто применяется линейный поляризатор для поляризации света, излучаемого источником света, перед его приемом на решетке.

На фиг. 1A показан пример образца 100 и рисунка 102 оптической дифракционной решетки, спроецированного на образец 100. Хотя образец 100 может иметь не разрешаемые (не различимые), более высокие пространственные частоты, наложение рисунка 102 оптической дифракционной решетки, имеющего известную, более низкую пространственную частоту, на образец 100 приводит к появлению муаровых интерференционных полос. В результате, не разрешаемые (не различимые), более высокие пространственные частоты эффективно переходят в более низкие пространственные частоты, разрешаемые (различаемые) микроскопом. Как раскрыто выше, захват изображений образца 100 с разными ориентациями/углами и фазами рисунка 102 оптической дифракционной решетки относительно образца 100, обеспечивает получение изображений, которые можно объединить в одно изображение, ретрансформируемое в действительное пространство для создания изображения, имеющего более высокое разрешение.

Раскрытие сущности изобретения

Примеры раскрытых здесь систем и способов относятся к технологиям для уменьшения количества изображений и размеров, необходимых для разрешения (различения) флуоресцентных образцов с помощью SIM-технологии с применением имеющих особый рисунок проточных ячеек, и для эффективного использования движения светового пучка относительно флуоресцентных образцов с целью практического осуществления SIM-технологии, которая может быть использована совместно с технологиями линейного сканирования.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, способ формирования изображений биологического образца предусматривает направление света через неподвижную оптическую дифракционную решетку, и проецирование рисунка оптической дифракционной решетки, созданного посредством света, направленного через неподвижную оптическую дифракционную решетку, на биологический образец. Способ также может предусматривать линейное сканирование биологического образца, и перемещение биологического образца относительно рисунка оптической дифракционной решетки или перемещение света, направленного через неподвижную оптическую дифракционную решетку. Кроме того, способ также может предусматривать реконструкцию изображения с высоким разрешением, характерным для биологического образца.

В некоторых примерах, свет представляет собой свет с длинами волн в красной и зеленой областях видимого света, исходящий от двух соответствующих лазерных источников. Каждый из двух лазерных источников может выдавать свет в импульсном режиме. В некоторых примерах линейное сканирование биологического образца предусматривает захват изображения некоторого участка биологического образца после возбуждения двумя лазерными источниками, что приводит к освещению биологического образца.

В некоторых вариантах осуществления, перемещение биологического образца относительно рисунка оптической дифракционной решетки или перемещение света относительно рисунка оптической дифракционной решетки создает множество фазовых сдвигов рисунка оптической дифракционной решетки.

В некоторых вариантах осуществления, указанное множество фазовых сдвигов включает в себя по меньшей мере три фазовых сдвига рисунка оптической дифракционной решетки.

В некоторых вариантах осуществления, рисунок оптической дифракционной решетки содержит множество продольных интерференционных полос, ориентированных по меньшей мере по существу перпендикулярно к множеству продолговатых наноразмерных лунок, составляющих проточную ячейку, вмещающую в себя биологический образец. Информация, характерная для биологического образца вдоль первой оси проточной ячейки, может разрешаться (различаться) в соответствии с увеличением разрешения на основании пространственной частоты, создаваемой комбинацией множества продолговатых наноразмерных лунок, составляющих проточную ячейку, и рисунка оптической дифракционной решетки. Информация, характерная для биологического образца вдоль второй оси, которая проходит по меньшей мере по существу перпендикулярно к первой оси, может разрешаться (различаться) в соответствии с не увеличенным разрешением.

В некоторых примерах, рисунок оптической дифракционной решетки содержит множество продольных интерференционных полос, ориентированных по меньшей мере по существу параллельно множеству продолговатых наноразмерных лунок, составляющих проточную ячейку, вмещающую в себя биологический образец. Линейное сканирование может быть осуществлено вдоль направления, выровненного с множеством продолговатых наноразмерных лунок.

В некоторых вариантах осуществления, линейное сканирование биологического образца предусматривает линейное сканирование биологического образца с временной задержкой и накоплением.

В соответствии с другим примером, система может содержать по меньшей мере два лазерных источника, излучающих световые пучки с по меньшей мере двумя длинами волн, соответственно, и неподвижную оптическую дифракционную решетку, выполненную с возможностью создания рисунка оптической дифракционной решетки после прохождения излучаемых световых пучков через неподвижную оптическую дифракционную решетку. Кроме того, система может содержать узел линейного сканирования для: перемещения биологического образца относительно рисунка оптической дифракционной решетки; или перемещения по меньшей мере двух лазерных источников относительно рисунка оптической дифракционной решетки; захвата множество изображений, характерных для участков биологического образца; и реконструкцию изображения с высоким разрешением, характерного для биологического образца, на основании множества изображений.

В некоторых примерах, узел линейного сканирования содержит по меньшей мере две съемочные камеры, причем каждая из них имеет по меньшей мере один датчик изображений, выполненный с возможностью восприятия флуоресцентного биологического образца. Перемещение биологического образца относительно рисунка оптической дифракционной решетки или перемещение по меньшей мере двух лазерных источников может создавать множество фазовых сдвигов рисунка оптической дифракционной решетки. Множество фазовых сдвигов может включать в себя по меньшей мере три фазовых сдвига рисунка оптической дифракционной решетки. Рисунок оптической дифракционной решетки содержит множество продольных интерференционных полос, ориентированных относительно множества продолговатых наноразмерных лунок, составляющих проточную ячейку, вмещающую в себя биологический образец.

В некоторых примерах, узел линейного сканирования захватывает множество изображений, характерных для указанных участков биологического образца вдоль направления, выровненного с множеством продолговатых наноразмерных лунок. В некоторых примерах, каждый из указанных по меньшей мере двух лазерных источников излучает световые пучки в импульсном режиме. В некоторых примерах, узел линейного сканирования захватывает каждое из множества изображений, характерных для указанных участков биологического образца, после возбуждения указанными по меньшей мере двумя лазерными источниками, что приводит к флуоресценции биологического образца.

Следует понимать, что все комбинации приведенных выше концепций и дополнительных концепций, которые будут более подробно описаны ниже (при условии, что такие концепции не являются взаимно несовместимыми), рассматриваются как часть объекта изобретения, раскрытого в настоящем описании. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, встречающиеся в конце данного описания, рассматриваются как часть раскрытого здесь объекта изобретения.

Другие признаки и аспекты раскрытой здесь технологии станут очевидными из нижеследующего подробного описания, в сочетании с прилагаемыми чертежами, на которых проиллюстрированы, в качестве примера, признаки раскрытых здесь вариантов осуществления заявленной технологии. Раскрытие сущности изобретения не подразумевает ограничения объема любого из раскрытых здесь изобретений, которые заданы формулой изобретения и ее эквивалентами.

Краткое описание чертежей

Настоящее изобретение, в соответствии с одним или несколькими вариантами осуществления, подробно раскрыто со ссылкой на прилагаемые чертежи. Чертежи приведены исключительно в иллюстративных целях и просто изображают типовые или примерные варианты осуществления.

На фиг. 1A проиллюстрирован один из примеров структурированного освещения, используемого для уменьшения частотного рисунка образца, что позволяет получить повышенное разрешение.

На фиг. 1B показано, в одном примере, количество углов, необходимых для разрешения (различения) образца с целью формирования изображений.

На фиг. 2 показан один из примеров системы формирования изображений при структурированном освещении.

На фиг. 3A показан пример шестиугольного рисунка проточной ячейки.

На фиг. 3B показан пример рисунка проточной ячейки в виде квадратного массива, применение которого приводит к формированию изображений при структурированном освещении с уменьшенной размерностью.

На фиг. 3C показан пример рисунка проточной ячейки в виде асимметричного массива, применение которого приводит к формированию изображений при структурированном освещении с уменьшенной размерностью.

На фиг. 4 показана блок-схема, иллюстрирующая примерные операции, которые могут быть реализованы для формирования изображений при структурированном освещении с уменьшенной размерностью.

На фиг. 5 показан один из примеров системы формирования изображений с линейным сканированием.

На фиг. 6A-6C показан, в одном примере, фазовый сдвиг рисунка структурированного освещения в одном измерении.

На фиг. 6D показан один из примеров проточной ячейки с асимметричным рисунком, имеющей различные участки, одновременно перекрытые сдвинутыми по фазе рисунками структурированного освещения.

На фиг. 7 показан пример операции линейного сканирования с использованием традиционной проточной ячейки со сформированным рисунком.

На фиг. 8 показан пример операции линейного сканирования с использованием неподвижного рисунка структурированного освещения.

На фиг. 9 показан пример операции линейного сканирования с использованием неподвижного рисунка структурированного освещения, который модулирует световой пучок освещения.

На фиг. 10 показана блок-схема, иллюстрирующая примерные операции, которые могут быть реализованы для формирования изображений при структурированном освещении с уменьшенной размерностью, совместно с формированием изображений при линейном сканировании.

На фиг. 11 показан примерный вычислительный компонент, который может быть использован для реализации различных признаков вариантов осуществления, раскрытых в настоящем описании.

Данные чертежи не являются исчерпывающими и не ограничивают настоящее изобретение точной описанной здесь формой.

Осуществление изобретения

Понятия «порядок» или «порядковый номер», используемые здесь в отношении дифрагированного света, излучаемого дифракционной решеткой, призваны обозначать целое число длин волн, которое отражает разность длин пути света от смежных щелей дифракционной решетки для усиливающей интерференции. Понятие «нулевой порядок» или «максимум нулевого порядка» относятся к центральной светлой интерференционной полосе, излучаемой посредством дифракционной решетки, в которой отсутствует дифракция. Понятие «первый порядок» относится к двум светлым интерференционным полосам, излучаемым на любую из сторон интерференционной полосы нулевого порядка, причем разность длин пути составляет ±1 длина волны.

Понятие «пятно» или «элемент», используемые здесь в отношении образца, призваны обозначать точку или область в рисунке, которая может отличаться от других точек или областей в соответствии с относительным местоположением. Отдельное пятно может содержать одну или несколько молекул конкретного типа. Например, пятно может содержать единственную целевую молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую конкретную последовательность, или пятно может содержать несколько молекул нуклеиновой кислоты, имеющих одинаковую последовательность (и/или их комплементарную последовательность).

Понятие «фрагмент», используемое в настоящем описании, относится к одному или нескольким изображениям одной и той же области образца, причем каждое из указанного одного или нескольких изображений отражает соответствующий цветовой канал. Фрагмент может образовывать подгруппу данных изображения в наборе данных изображения одного цикла формирования изображений.

Понятие «плоскость x-y», используемое в настоящем описании, призвано обозначать двухмерную область, заданную прямыми линиями, относящимися к осям x и y в декартовой системе координат. Если оно используется в отношении детектора и объекта, исследуемого посредством детектора, то область может быть дополнительно определена как проходящая ортогонально к направлению наблюдения между детектором и обнаруженным объектом. Если данное понятие используется в отношении линейного сканнера, то понятие «направление y» относится к направлению сканирования.

Используемое здесь понятие «координата z» призвано обозначать информацию, которая определяет местоположение точки, линии или области вдоль оси, которая проходит ортогонально к плоскости x-y. В конкретных вариантах осуществления, ось z проходит ортогонально к области объекта, исследуемого посредством детектора. Например, направление фокусировки для оптической системы может быть определено вдоль оси z.

Понятие «сканировать линию», используемое в настоящем описании, призвано обозначать обнаружение двумерного поперечного сечения в плоскости x-y объекта, причем указанное поперечное сечение является прямоугольным или продолговатым, и приводит к относительному движению между поперечным сечением и объектом. Например, в случае флуоресцентной визуализации область объекта, имеющая прямоугольную или продолговатую форму, может быть специально возбуждена (за исключением других областей) и/или излучение от указанной области может быть специально получено (за исключением других областей) в заданный момент времени при сканировании.

Раскрытые здесь варианты осуществления относятся к проточным ячейкам, выполненным так, что они имеют квадратные или асимметричные рисунки. Следует напомнить, что SIM-технология основана на использовании пространственно структурированного (то есть со сформированным рисунком) света для получения изображений образца с целью увеличения латерального разрешения микроскопа в два или более раз. Также следует отметить, что традиционно, изображения образца для нескольких фаз рисунка и нескольких ориентаций/углов применяются для обеспечения требуемого увеличения латерального разрешения.

На фиг. 1B, в соответствии с одним из примеров, показана, в целом, исследуемая область обратного пространства, созданного объективом микроскопа (которое является аналогом его дифракционного рисунка), а также проиллюстрировано, как она ограничивается на кромках максимальными пространственными частотами, которые объектив может передавать (2NA / (график 120)). Как показано на чертеже, центральное пятно характеризует компонент нулевого порядка. Компоненты дифракции нулевого и первого порядков, отражающие рисунок параллельных линий, показаны на графике 122. Если промежутки рисунка находятся в одних и тех же пределах разрешения, то пятна первого порядка появляются у края наблюдаемого поля (на границе k₀). В результате смешения частот, наблюдаемые области также содержат, в дополнение к нормальному изображению пространственных частот (центральный круг), два новых смещенных по частоте изображения (график 124), которые центрированы по краю исходного поля. Эти смещенные изображения содержат более высокие пространственные частоты, которые не наблюдаются при использовании традиционных микроскопов. Как показано на графике 126, набор изображений, приготовленный из трех фаз с ориентацией 120°, в итоге, после обработки обеспечивает действительное изображение, имеющее удвоенное пространственное разрешение, которое можно наблюдать при флуоресцентной микроскопии с широким полем обзора.

Однако, за счет конфигурации проточных ячеек, в соответствии с которой они имеют квадратные или асимметричные рисунки (а не шестиугольные рисунки, например), для обеспечения аналогичного увеличения латерального разрешения требуется меньшее количество изображений. То есть проточные ячейки, имеющие квадратные или асимметричные рисунки наноразмерных лунок, обеспечивают, что ось/оси проточной ячейки, имеющей более плотный шаг (то есть расстояние между непосредственно прилегающими друг к другу наноразмерными лунками) и предусматривающие увеличенное разрешение, будут выровнены с осью/осями, разрешение которых необходимо увеличить. В одном из примеров проточной ячейки с квадратным рисунком, увеличенное разрешение требуется в отношении только двух осей. Таким образом, необходимо только шесть изображений (по одному изображению на каждый из двух углов в трех фазах). В случае проточной ячейки с асимметричным рисунком, для обеспечения увеличения разрешения необходимо только три изображения образца (по одному изображению на один угол в трех фазах).

За счет уменьшения количества углов, необходимых для разрешения (различения) образца до желаемого градуса, количество изображений, которое требуется для завершения визуализации образца, сокращается. Например, в контексте химического анализа с красителями 4 видов, системе может потребоваться получение 36 изображений для создания 4 изображений с целью распознавания азотистых оснований (пояснено далее). Объем пространства памяти (например, диск), необходимый для хранения или кэширования захваченных изображений, также может быть уменьшен. Более того, обрабатывающая и/или вычислительная мощность, необходимая для сборки изображений в единственное изображение, и в дальнейшем для ретрансформирования/реконструкции данного единственного изображения в одно, имеющее желаемое разрешение, также может быть уменьшена.

Кроме того, традиционные варианты осуществления SIM-технологии несовместимы с системами секвенирования, в которых используются технологии линейного сканирования для формирования изображений образца. Линейное сканирование может относиться к использованию линии пикселей, которые визуализируют линии проточной ячейки построчно для построения непрерывного изображения (в отличие от съемочной камеры или датчика с двухмерным массивом пикселей, которые захватывают неподвижное изображение всего объекта, например, проточной ячейки). Одним конкретным типом линейного сканирования, который поддается системам секвенирования, является линейное сканирование с временной задержкой и накоплением (TDI, от англ. Time Delay Integration).

В многоугловых SIM-системах, для получения каждой из комбинаций угол/фаза изображения необходимо фиксированное поле зрения. Однако, когда изображения получены относительно только одного угла, как в случае раскрытых здесь вариантов осуществления, в которых в качестве подложки для образца применяется проточная ячейка с асимметричным рисунком, линейное сканирование TDI может быть использовано для захвата изображений образца, которые накладываются на три фазы SIM-рисунка. То есть SIM-рисунок можно перемещать относительно проточной ячейки с асимметричным рисунком для создания трех фаз, необходимых для разрешения (различения) образца в проточной ячейке с увеличенным разрешением вдоль только одной оси.

В некоторых вариантах осуществления, линейное сканирование TDI может быть использовано совместно с SIM-технологиями для формирования изображений образца с помощью съемочной камеры или датчика для линейного сканирования TDI с целью захвата изображения вдоль проточной ячейки (именуемого далее как «полоса обзора»). То есть линейное сканирование TDI может быть осуществлено в отношении проточной ячейки, имеющей SIM-рисунок в первой фазе. SIM-рисунок может быть сдвинут во вторую фазу, после чего линейное сканирование TDI можно повторить. SIM-рисунок может быть сдвинут в третью фазу, и линейное сканирование TDI можно повторить еще раз. Таким образом, происходит захват изображений образца в каждой фазе рисунка.

Альтернативно, различные участки проточной ячейки могут иметь рисунок с различными фазами SIM-рисунка. Например, на первом участке проточной ячейки, SIM-рисунок может быть расположен в первом положении; на втором участке проточной ячейки, SIM-рисунок может быть сдвинут во второе положение; а на третьем участке проточной ячейки, SIM-рисунок может быть сдвинут в третьей положение. Таким образом, когда съемочная камера или датчик захватывает полосу обзора, изображения образца в каждой из трех фаз SIM-рисунка захватываются в единственную линейную развертку TDI.

В еще одном варианте осуществления, вместо сдвига SIM-рисунка относительно образца/проточной ячейки, образец/проточную ячейку перемещают, а SIM-рисунок оставляют неподвижным. Следует понимать, что образец расположен/находится в проточной ячейке, в результате чего образец имеет рисунок в соответствии с наноразмерными лунками, составляющими проточную ячейку. При реализации линейного сканирования TDI, как упомянуто выше, образец/проточная ячейка уже перемещается. Таким образом, такое перемещение образца/проточной ячейки может быть эффективно использовано для исключения необходимости сдвига SIM-рисунка. То есть перемещение образца/проточной ячейки относительно неподвижного SIM-рисунка (при условии его надлежащей ориентации) создает требуемые фазы, необходимые для разрешения (различения) образца.

Перед описанием различных вариантов осуществления систем и способов, рассмотренных подробно в настоящем описании, целесообразно описать примерную среду, с помощью которой возможна реализация раскрытой здесь технологии. Одной из таких примерных сред является система 200 формирования изображений при структурированном освещении, показанная на фиг. 2, которая освещает образец пространственно структурированным светом. Например, система 200 может представлять собой систему флуоресцентной микроскопии со структурированным освещением, в которой используется пространственно структурированный свет возбуждения для формирования изображений биологического образца.

В примере с фиг. 2, излучатель 250 света выполнен с возможностью вывода светового пучка, который коллимируется посредством коллиматорной линзы 251. Коллимированный свет структурирован (со сформированным рисунком) посредством оптического узла 255 структурирования света и направляется посредством дихроичного зеркала 260 через линзу 242 объектива на образец контейнера 210 для образцов, который расположен на столике 270 перемещения. В случае флуоресцирующего образца, образец флуоресцирует под воздействием структурированного света возбуждения, при этом получаемый в результате свет собирается линзой 242 объектива и направляется к датчику изображений системы 240 съемочной камеры для обнаружения флуоресценции.

Оптический узел 255 структурирования света в различных вариантах осуществления, которые будут дополнительно раскрыты ниже, содержит одну или несколько оптических дифракционных решеток для создания синусоидального рисунка дифракционного света (например, интерференционных полос), который проецируется на образцы в контейнере 210 для образцов. Дифракционные решетки могут представлять собой одномерные или двухмерные пропускающие, отражательные или фазовые решетки. Как будет подробно раскрыто ниже со ссылкой на конкретные варианты осуществления, в системе 200 дифракционные решетки необязательно требуют наличия столика вращения. В некоторых вариантах осуществления, дифракционные решетки могут быть зафиксированы (то есть не вращаются или не перемещаются линейно) во время работы системы формирования изображений. Например, в одном конкретном варианте осуществления, который подробно рассмотрен ниже, дифракционные решетки могут содержать две фиксированные одномерные пропускающие дифракционные решетки, ориентированные по существу или точно/абсолютно перпендикулярно друг к другу (например, горизонтальную дифракционную решетку и вертикальную дифракционную решетку).

Во время каждого цикла формирования изображений, в системе 200 используется оптический узел 255 структурирования света с целью получения множества изображений в различных фазах, перемещаемых в боковом направлении вдоль плоскости образца (например, вдоль плоскости x-y), причем данную процедуру повторяют один или несколько раз, поворачивая и меняя ориентацию рисунка вокруг оптической оси (то есть относительно плоскости x-y образца). Далее, захваченные изображения могут быть реконструированы в пространстве для создания изображения с более высоким разрешением (например, изображения, имеющего разрешение, примерно в два раза превышающее латеральное пространственное разрешение отдельно взятых изображений).

В системе 200, излучатель 250 света может представлять собой излучатель некогерентного света (например, он излучает световые пучки, исходящие от одного или нескольких диодов возбуждения), или излучатель когерентного света, такой как излучатель света, исходящего от одного или нескольких лазеров или лазерных диодов. Как показано в примере системы 200, излучатель 250 света содержит оптическое волокно 252 для направления оптического пучка для его вывода. Однако, возможно использование других конфигураций излучателя 250 света. В вариантах осуществления, в которых используется структурированное освещение в многоканальной системе формирования изображений (например, многоканальном флуоресцентном микроскопе, использующем множество длин волн света), оптическое волокно 252 может быть оптически соединено с множеством различных источников света (не показаны), причем каждый источник света излучает свет различной длины волны. Хотя показано, что система 200 имеет единственный излучатель 250 света, в некоторых вариантах осуществления, может быть предусмотрено несколько излучателей 250 света. Например, множество излучателей света может быть предусмотрено в случае применения системы формирования изображений при структурированном освещении, в которой используется несколько плеч, что подробно будет рассмотрено далее. Например, возможно излучение света, соответствующего различным длинам волн, например синей, зеленой, красной или другой области видимого света. В некоторых примерах, может быть использован один излучатель/источник света. В некоторых примерах, может быть использовано два или более излучателей/источников света.

В некоторых вариантах осуществления, система 200 может содержать трубчатую линзу 256, которая может иметь элемент линзы, выполненный с возможностью поворота вдоль оси z для регулирования формы и пути структурированного пучка. Например, некоторый компонент трубчатой линзы может поворачиваться для учета различных значений толщины образца (например, различной толщины покровного стекла) образца в контейнере 210.

В примере системы 200, модуль или устройство 290 подачи текучей среды может направлять поток реагентов (например, флуоресцентно меченых нуклеотидов, буферов, ферментов, реагентов для расщепления, и т.д.) к (или через) контейнеру 210 для образцов и сливному клапану 220. Контейнер 210 для образцов может содержать одну или несколько подложек, на которых располагают образцы. Например, в случае применения системы для анализа большого количество различных последовательностей нуклеиновой кислоты, контейнер 210 для образцов может содержать одну или несколько подложек, на которых связывают, закрепляют или соединяют нуклеиновые кислоты, подлежащие секвенированию. Подложка может представлять собой любую инертную подложку или матрицу, к которой могут быть прикреплены нуклеиновые кислоты, например, это могут быть стеклянные поверхности, пластмассовые поверхности, латекс, декстран, полистирольные поверхности, полипропиленовые поверхности, полиакриламидные гели, золотые поверхности, и кремниевые пластины. В некоторых сферах применения, подложка находится внутри канала или другой области на множестве участков, сформированных в виде матрицы или массива в пределах контейнера 210 для образцов. Система 200 также может содержать исполнительный механизм 230 станции для температурных измерений и нагреватель/охладитель 235, который может опционально регулировать температуру условий текучих сред внутри контейнера 210 для образцов.

В конкретных вариантах осуществления, контейнер 210 для образцов может быть реализован в виде проточной ячейки со сформированным рисунком, содержащей полупрозрачную покровную пластину, подложку, и жидкость, находящуюся между ними, причем биологический образец может быть расположен на внутренней поверхности полупрозрачной покровной пластины или внутренней поверхности подложки. Проточная ячейка может содержать большое количество (например, тысячи, миллионы или миллиарды, или больше) лунок или областей, которые структурированы в заданный массив (например, шестиугольный массив, прямоугольный массив, и т.д.) в подложке. Каждая область может образовывать кластер (например, моноклональный кластер) биологического образца, например ДНК, РНК, или другой геномный материал, который может быть подвержен секвенированию, например, в ходе секвенирования путем синтеза. Проточная ячейка дополнительно может быть разделена на множество отстоящих друг от друга дорожек (например, восемь дорожек), причем каждая из дорожек содержит шестиугольный массив кластеров.

Контейнер 210 для образцов может быть установлен на предметный столик 270 для обеспечения перемещения и выравнивания контейнера 210 для образцов относительно линзы 242 объектива. Предметный столик может иметь один или несколько исполнительных механизмов для обеспечения возможности его перемещения в любом из трех измерений. Например, в контексте системы декартовых координат, исполнительные механизмы могут быть предусмотрены для обеспечения возможности перемещения столика в направлении X, Y и Z относительно линзы объектива. Благодаря этому можно расположить один или несколько участков образца на контейнере 210 для образцов с оптической центровкой относительно линзы 242 объектива. Перемещение предметного столика 270 относительно линзы 242 объектива может быть обеспечено за счет перемещения самого предметного столика, линзы объектива, некоторого другого компонента системы формирования изображений, или любой комбинации перечисленных элементов. Другие варианты осуществления также могут предусматривать перемещение всей системы формирования изображений над неподвижным образцом. Альтернативно, контейнер 210 для образцов может быть зафиксирован во время формирования изображений.

В некоторых вариантах осуществления, может быть предусмотрен компонент 275 фокусировки (ось z) для управления позиционированием оптических компонентов относительно контейнера 210 для образцов в направлении фокусировки (как правило, именуемом «ось z» или «направление z»). Компонент 275 фокусировки может содержать один или несколько исполнительных механизмов, физически соединенных с оптическим столиком или предметным столиком, или с ними обоими, для перемещения контейнера 210 для образцов на предметном столике 270 относительно оптических компонентов (например, линзы 242 объектива) для обеспечения надлежащей фокусировки для операции формирования изображений. Например, исполнительный механизм может быть физически соединен с соответствующим столиком, например, посредством механического, магнитного, гидравлического или другого крепления или может контактировать напрямую или косвенно со столиком. Один или несколько исполнительных механизмов могут быть выполнены с возможностью перемещения столика в z-направлении, с удержанием, при этом, предметного столика в одной и той же плоскости (например, с сохранением ровного или горизонтального положения, по существу или абсолютно перпендикулярного к оптической оси). Следует понимать, что абсолютная перпендикулярность, параллелизм или другая ориентация могут быть не обеспечены в некоторых вариантах осуществления из-за, например, производственных допусков, эксплуатационных пределов, и т.д. Однако, в контексте раскрытых здесь технологий, под выражением «по существу перпендикулярный, параллельный или иным образом ориентированный» следует понимать ориентацию, достаточную для достижения желаемого разрешения или другого релевантного эффекта, раскрытого и/или предполагаемого в настоящем изобретении. Один или несколько исполнительных механизмов также могут быть выполнены с возможностью наклонения столика. Например, это может быть реализовано так, чтобы контейнер 210 для образцов мог быть динамически выровнен для учета любого уклона в его поверхностях.

Испускание структурированного света исследуемым образцом в некотором месте образца, изображение которого получают, может быть направлено через дихроичное зеркало 260 к одному или нескольким детекторам системы 240 съемочной камеры. В некоторых вариантах осуществления, может быть предусмотрен узел 265 переключения фильтра с одним или несколькими эмиссионными фильтрами, причем указанный один или несколько эмиссионных фильтров могут быть использованы для прохождения через них конкретных длин волн излучения и блокировки (или отражения) других длин волн излучения. Например, указанный один или несколько эмиссионных фильтров могут быть использованы для переключения между различными каналами системы формирования изображений. В одном из конкретных вариантов осуществления, эмиссионные фильтры могут быть выполнены в виде дихроичных зеркал, которые направляют излучаемый свет различных длин волн к различным датчикам изображений системы 240 съемочной камеры.

Система 240 съемочной камеры может содержать один или несколько датчиков изображений для контроля и отслеживания процесса получения изображений (например, секвенирования) контейнера 210 для образцов. Система 240 съемочной камеры может быть реализована, например, в виде камеры датчика изображений устройства с зарядовой связью (CCD, от англ. Charge-Coupled Device), но также возможно использование других технологий датчика изображений (например, активно-пиксельный датчик). Выводимые данные (например, изображения) из системы 240 съемочной камеры могут быть переданы в модуль анализа данных в реальном времени (не показан), который может быть реализован в виде программного приложения, которое, как будет подробно раскрыто далее, может реконструировать изображения, захваченные во время каждого цикла формирования изображений, с целью создания изображения, имеющего более высокое пространственное разрешение. Как будет рассмотрено ниже, система 240 съемочной камеры также может быть реализована в виде съемочной камеры TDI CCD для осуществления способа линейного сканирования.

Хотя это и не показано на чертежах, может быть предусмотрен контроллер для управления ориентацией системы 200 формирования изображений при структурированном освещении, в том числе, синхронизации различных оптических компонентов системы 200. Контроллер может быть выполнен с возможностью управления различными аспектами работы системы, например, конфигурацией оптического узла 255 для структурирования света (например, выбором и/или линейным поступательным перемещением дифракционных решеток), перемещением трубчатой линзы 256, фокусировкой, перемещением столика и операциями формирования изображений. В различных вариантах осуществления, контроллер может быть реализован с использованием аппаратного обеспечения, алгоритмов (например, машиноисполняемых инструкций), или комбинации перечисленных средств. Например, в некоторых вариантах осуществления, контроллер может содержать один или несколько ЦП или процессоров с ассоциативной памятью. В другом примере, контроллер может содержать аппаратное обеспечение или другую электрическую схему для управления функционированием, например процессор вычислительной машины и энергонезависимый машиночитаемый носитель данных с машиночитаемыми инструкциями, которые в нем хранятся. Например, такая электрическая схема может содержать одно или несколько из следующих устройств: программируемую пользователем вентильную матрицу (FPGA, от англ. Field Programmable Gate Array), специализированную интегральную микросхему (ASIC, от англ. Application Specific Integrated Circuit), программируемое логическое устройство (PLD, от англ. Programmable Logic Device), сложное программируемое логическое устройство (CPLD, от англ. Complex Programmable Logic Device), программируемую логическую матрицу (PLA, от англ. Programmable Logic Array), программируемую матричную логику (PAL, от англ. Programmable Array Logic) или другое схожее обрабатывающее устройство или электрическую схему. В еще одном примере, контроллер может содержать комбинацию этой электрической схемы с одним или несколькими процессорами.

На фиг. 3A показана примерная конфигурация проточной ячейки 300 со сформированным рисунком, которую можно визуализировать в соответствии с раскрытыми здесь вариантами осуществления. В данном примере, проточная ячейка имеет рисунок с шестиугольным массивом (см. 304) упорядоченных пятен или элементов 302, которые могут быть одновременно визуализированы во время одного сеанса формирования изображений. Для простоты иллюстрирования, проточная ячейка 300 показана как имеющая от нескольких десятков до нескольких сотен пятен 302. Однако специалисту в данной области техники будет понятно, что проточная ячейка 300 может иметь тысячи, миллионы или миллиарды визуализируемых пятен 302. Кроме того, в некоторых примерах, проточная ячейка 300 может представлять собой многоплоскостный образец, содержащий множество плоскостей (по существу или абсолютно перпендикулярных к направлению фокусировки) пятен 302, которые отбираются во время одного сеанса формирования изображений. В одном конкретном варианте осуществления, проточная ячейка 302 может иметь рисунок из миллионов или миллиардов лунок, которые разделены на дорожки. В данном конкретном варианте осуществления, каждая лунка проточной ячейки может содержать биологический материал, подвергаемый секвенированию с использованием технологии секвенирования путем синтеза.

Как упомянуто выше, в некоторых примерах для разрешения (различения) образца с помощью проточной ячейки 300 со сформированным рисунком, для достижения требуемого разрешения необходимо по меньшей мере девять изображений. Это связано с тем, что шестиугольный массив наноразмерных лунок в проточной ячейке 300 со сформированным рисунком представляет собой высокочастотный рисунок, в котором шаг между наноразмерными лунками является плотным, и не разрешаемым (не различимым). В частности, в данном примере, имеется два фактора, определяющих, сколько изображений необходимо для достаточного разрешения (различения) образца.

Первым фактором является количество желаемых копий оптической полосы пропускания. Со ссылкой на фиг. 1B, на графике 122 показана нормальная полоса пропускания без использования SIM-технологии. График 124 иллюстрирует пример, в котором создается одна копия оптической полосы пропускания. Благодаря этому возможно улучшение разрешения в одном измерении, а график 126/график 306 (фиг. 3A) демонстрирует пример, в котором создаются три копии оптической полосы пропускания, что приводит к достаточно равномерному повышению разрешения в двух измерениях.

Вторым фактором является количество изображений, используемых для демодуляции фаз для каждой оптической полосы пропускания. Хотя теоретически необходимо только два изображения (для получения реальных и мнимых частей), обычно используется три изображения для получения более качественного усреднения шума.

Следует понимать, что при поступательном перемещении изображения с пространственной частоты в Фурье-пространство (анализ исходных данных, созданных микроскопом у задней фокальной плоскости объектива, основывается на анализе Фурье), Фурье-преобразование включает в себя 3 компонента или оси. То есть дифракция света у задней фокальной плоскости объектива создает дифракционный барьер, который устанавливает максимальное разрешение приблизительно 200 нм в поперечном (x, y) измерении и 500 нм в осевом (z) измерении, в зависимости от числовой апертуры объектива и средней длины волны освещения. Соответственно, при использовании шестиугольного массива наноразмерных лунок в проточной ячейке 300 со сформированным рисунком изображения получают под тремя углами с использованием SIM-технологии. Как уже было рассмотрено выше, для получения требуемого разрешения, изображения следует делать в трех фазах под каждым из трех углов; при этом для обеспечения того, чтобы были видны все части в области изображения (то есть для покрытия всей длины волны SIM-рисунка), необходимо три фазы, что приводит к созданию девяти изображений. В результате, обеспечивается повышенное разрешение по всем трем осям 308.

Однако, в одном из примеров, с использованием другого типа проточной ячейки со сформированным рисунком, например проточной ячейки 310, в которой наноразмерные лунки 312 нанесены в виде квадратного массива (см. 314), для достижения увеличенного разрешения необходимо только два угла, при этом увеличенное разрешение выровнено вдоль оси квадратного массива. Данный пример проиллюстрирован посредством графика 316, в соответствии с которым только две копии оптической полосы пропускания создаются и требуются для обеспечения необходимого увеличения разрешения. Другими словами, проточная ячейка с квадратным рисунком, такая как проточная ячейка 310, может быть разрешена (различима) за счет выравнивания SIM-рисунка или интерференционных полос с направлениями, в которых необходимо обеспечить увеличение разрешения, в данном случае, вдоль двух осей (x и y) квадратного массива. Следует понимать, что вдоль любой диагональной траектории между соседними наноразмерными лунками 312, будет обеспечиваться некоторое улучшение разрешения так, что соседние в диагональном направлении наноразмерные лунки будут различаться друг от друга. Однако, между наноразмерными лунками 312 вдоль осей x и y, шаг (P_x, P_y) является достаточно узким так, что необходимо усилить разрешение с использованием SIM-технологии, то есть пространственная частота по осям x и y является слишком высокой для разрешения (различения).

За счет использования проточной ячейки с квадратным рисунком, например проточной ячейки 310, требование к размерности традиционных систем секвенирования с использованием SIM-технологии может быть снижено на один размер, причем разрешение увеличивается только по двум осям 318. То есть вместо захвата девяти изображений, которые покрывают три угла по трем фазам каждый, необходимо захватить только шесть изображений, которые покрывают два угла в трех фазах каждый, для надлежащего разрешения (различения) образца, находящегося внутри проточной ячейки 310. Такая компоновка является целесообразной, несмотря на снижение плотности упаковки проточной ячейки 310. Например, в шестиугольном массиве, имеющем такой же шаг, снижение плотности упаковки может составлять только 11%. Однако, реализация SIM-технологии в соответствии с различными примерами, может привести к увеличению плотности упаковки, например, на 365% для квадратного массива с шагом 350 нм, по сравнению с шестиугольным массивом без использования SIM-технологии с шагом 700 нм.

За счет применения другого типа проточной ячейки со сформированным рисунком, в данном примере проточной ячейки с асимметричным рисунком, требование к размерности традиционных систем секвенирования, использующих SIM-технологию, может быть снижено еще на один размер. На фиг. 3C показана проточная ячейка 320 со сформированным рисунком, наноразмерные лунки которой нанесены в виде асимметричного рисунка. В данном варианте осуществления, каждая наноразмерная лунка 322 имеет такую форму или конфигурацию, что она образует продолговатую структуру. Используемое в настоящем описании понятие «продолговатая структура» относится к форме, в которой размер вдоль первой оси больше размеров вдоль второй оси. В данной примере ось х является более узкой по сравнению с длиной или высотой наноразмерной лунки 322 вдоль другой оси (в данном примере, оси y). Следует понимать, что хотя в варианте осуществления, показанном на фиг. 3C, используются эллиптические наноразмерные лунки, также возможно применение других типов продолговатых наноразмерных лунок, например прямоугольников. Возможно применение любой формы наноразмерных лунок, которая обеспечивает получение рисунка, в соответствии с которым образец вдоль только одной оси сопряжен с увеличением разрешения с использованием SIM-технологии. В некоторых вариантах осуществления размер сформированных элементов, то есть ширина интерференционных полос w по меньшей мере по существу равняется или немного превышает диаметр круглого элемента, длину стороны квадратного элемента, длину более длинной или более короткой стороны прямоугольного элемента, диаметр эллиптического элемента вдоль его большой оси или малой оси, или наибольший размер элемента с неправильной формой вдоль одной оси элемента (например, оси x или y). В некоторых вариантах осуществления, наноразмерные лунки могут в качестве альтернативы иметь форму квадратов или кругов, но с асимметричным промежутком между ними.

Таким образом, образец может разрешаться (различаться) вдоль одного направления или оси, то есть оси y, в то время как вдоль другого направления или оси, то есть оси x, используется SIM-технология для увеличения разрешения с целью разрешения (различения) образца. То есть вдоль оси x шаг P_x проточной ячейки 320 с асимметричным рисунком является узким или плотным, что вызывает увеличение разрешения, в то время как вдоль оси y шаг P_y проточной ячейки 320 с асимметричным рисунком, больше. Соответственно, разрешение увеличивается только в одном направлении/вдоль одной оси 318, и только три изображения захватываются для обеспечения надлежащего разрешения (различения) образца, находящегося внутри наноразмерных лунок проточной ячейки 320. Таким образом, как показано на графике 352, только одна копия оптической полосы пропускания создается и требуется для увеличения разрешения.

На фиг. 4 показана блок-схема, иллюстрирующая примерные операции, которые могут быть осуществлены в системе секвенирования, например системе 200 формирования изображений при структурированном освещении с фиг. 2, для секвенирования образца с использованием проточной ячейки с квадратным или асимметричным рисунком. На этапе 400 может быть включен источник света, соответствующий первому рисунку оптической дифракционной решетки, ориентированному в первой фазе. На этапе 410 рисунок оптической дифракционной решетки с первой ориентацией проецируется на образец, и захватывается изображение. То есть, как показано на фиг. 2, излучатель света 250 может выдавать световой пучок, который коллимируется посредством коллиматорной линзы 251. Коллимированный свет структурирован (со сформированным рисунком) посредством оптического узла 255 структурирования света и направляется посредством дихроичного зеркала 260 через линзу 242 объектива на образец контейнера 210 для образцов, который расположен на столике 270. В данном примере осуществления, контейнер 210 для образцов содержит проточную ячейку со сформированным рисунком, имеющую квадратный или асимметричный рисунок, например проточную ячейку 310 или 320, соответственно (фиг. 3B и 3C). В случае флуоресцирующего образца образец, находящийся в проточной ячейке с квадратным или асимметричным рисунком, флуоресцирует под воздействием структурированного света возбуждения, при этом получаемый в результате свет собирается линзой 242 объектива и направляется в датчик изображений системы 240 съемочной камеры для обнаружения флуоресценции.

На этапе 420 можно выполнить проверку для определения того, требуется ли дополнительный фазовый сдвиг. В случае положительного ответа, на этапе 430 оптическую дифракционную решетку сдвигают по фазе, и процесс возвращается на этап 410, где рисунок оптической дифракционной решетки (сдвинутый по фазе) проецируется на образец, и захватывается изображение. Как раскрыто ранее, в целом, осуществляют три фазовых сдвига для захвата всей области изображения, в данном варианте осуществления, всей области проточной ячейки с квадратным рисунком.

Если дополнительный фазовый сдвиг не требуется, то на этапе 440 можно выполнить проверку того, требуется ли дополнительный угол, и на этапе 450 происходит изменение угла оптической дифракционной решетки. Процесс возвращается на этап 410, где рисунок оптической дифракционной решетки (после изменения углов) проецируется на образец, и захватывается изображение. Процесс продолжается и переходит на этап 420, причем, если на этапе 420 определяется, что требуется дополнительный фазовый сдвиг, оптическая дифракционная решетка сдвигается по фазе на этапе 430. И снова, процесс возвращается на этап 410, где рисунок оптической дифракционной решетки (под новым углом и с новой фазой) проецируется на образец, и происходит захват изображения. Также, в данном варианте осуществления, для захвата всей области проточной ячейки с квадратным рисунком требуются изображения в трех фазах. Следует понимать, что упомянутый выше контроллер, используемый для управления аспектами работы системы 200 формирования изображений при структурированном освещении, может иметь инструкции для выполнения описанных выше функций, например проверки того, необходимы или нет дополнительные фазовые сдвиги или ориентации рисунка оптической дифракционной решетки, для визуализации конкретного типа используемой проточной ячейки.

В случае проточной ячейки с квадратным рисунком, например проточной ячейки 310 (фиг. 3), для увеличения разрешения вдоль двух осей проточной ячейки 310 необходимы изображения под двумя углами. Соответственно, после захвата изображений с рисунком оптической дифракционной решетки, спроецированным в двух ориентациях, соответствующих двум углам (с тремя фазовыми сдвигами рисунка оптической дифракционной решетки), на этапе 460 осуществляют реконструкцию изображения с высоким разрешением (путем объединения шести полных изображений и ретрансформирования их в действительное пространство). Такая реконструкция изображения с высоким разрешением может быть выполнена внутри системы, или в некоторых примерах, реконструкция может быть осуществлена с использованием отдельного обрабатывающего модуля.

В одном из вариантов осуществления, в котором проточная ячейка со сформированным рисунком представляет собой асимметричную проточную ячейку, раскрытый выше способ не подразумевает изменение углов. В этом случае также, при использовании асимметричной проточной ячейки, SIM-технология применяется для увеличения разрешения вдоль только одной оси. Соответственно, оптическая дифракционная решетка требует осуществления фазового сдвига только три раза, что обеспечит возможность захвата изображений для трех фазовых сдвигов. Следовательно, поскольку на этапе 420 не требуются другие фазовые сдвиги, способ переходит на этап 460, на котором возможна реконструкция изображения с высоким разрешением с использованием только трех захваченных изображений.

Как было указано ранее, в случае применения проточных ячеек с особыми рисунками, которые позволяют воспользоваться SIM-технологиями со сниженной размерностью, для формирования изображений образцов, находящихся в этих проточных ячейках со сформированным рисунком, могут быть использованы способы линейного сканирования, такие как линейное сканирование TDI. На фиг. 5 показана блок-схема, иллюстрирующая примерную двухканальную систему 500 формирования изображений с линейным сканированием, которая может быть использована для формирований изображений образца в различных вариантах осуществления.

Как и в случае с системой 200 формирований изображений при структурированном освещении с фиг. 2, система 500 формирования изображений с линейным сканированием может быть использована для секвенирования нуклеиновых кислот, при котором нуклеиновые кислоты прикрепляются в фиксированных местах в массиве (то есть в лунках проточной ячейки, такой как проточная ячейка 320), при этом возможно многократное формирование изображений указанного массива. В таких вариантах осуществления, система 500 формирования изображений с линейным сканированием может получать изображения в двух различных цветовых каналах, которые могут позволить отличить конкретный тип основания нуклеотида от других типов. В частности, система 500 формирования изображений с линейным сканированием может реализовать процесс, именуемый как «распознавание азотистых оснований», который в целом относится к процессу определения оснований (например, аденина (А), цитозина (С), гуанина (G) или тимина (Т)) для заданного местоположения точек изображения во время цикла формирования изображений. В ходе двухканального распознавания азотистых оснований, данные изображения, извлеченные из двух изображений, могут быть использованы для определения наличия одного из четырех типов оснований за счет шифрования идентификатора основания в виде комбинации интенсивностей двух изображений. Для заданной точки или местоположения в каждом из двух изображений, идентификатор основания может быть определен в зависимости от того, выглядит ли комбинация идентификаторов сигналов как [вкл., вкл.], [вкл., выкл.], [выкл., вкл.] или [выкл., выкл.].

Снова обратившись к системе 500 формирования изображений с линейным сканированием, можно отметить, что система содержит LGC-модуль 510 линейной генерации с двумя источниками света, 511 и 512, расположенными внутри него. Источники 511 и 512 света могут представлять собой источники когерентного света, например лазерные диоды, которые выдают лазерные пучки. Источник 511 света может испускать свет с первой длиной волны (например, длиной волны красной области видимого света), а источник 512 света может испускать свет со второй длиной волны (например, длиной волны зеленой области видимого света). Световые пучки, выдаваемые лазерными источниками 511 и 512, могут быть направлены через линзу или линзы 513 формирования пучка. В некоторых вариантах осуществления, может быть использована одна линза формирования света для придания формы световым пучкам, выдаваемым обоими источниками света. В других вариантах осуществления, отдельная линза формирования пучка может быть использована для каждого светового пучка. В некоторых примерах, линза формирования света представляет собой линзу Пауэлла, так что световые пучки формируются в линейные рисунки. Линзы формирования пучка LGC-модуля 510 или другие оптические компоненты системы формирования изображений могут быть выполнены так, чтобы придавать свету, излучаемому источниками 511 и 512 света, форму линейных рисунков (например, за счет использования одной или нескольких линз Пауэлла или других линз формирования пучка, дифракционных или рассеивающих компонентов). Например, в некоторых вариантах осуществления, свет, излучаемый источниками 511 и 512 света, может быть отправлен через оптическую дифракционную решетку для создания рисунка оптической дифракционной решетки (SIM-рисунка), который может быть спроецирован на образец.

LGC-модуль 510 может дополнительно содержать зеркало 514 и полуотражательное зеркало 515, предназначенное для направления световых пучков через единственный интерфейсный порт в оптический модуль 530 излучения (ЕОМ, от англ. Emission Optics Module). Световые пучки могут проходить через затворный элемент 516. ЕОМ 530 может содержать объектив 535 и z-столик 536, который перемещает объектив 535 в продольном направлении ближе к или дальше от цели 550. Например, цель (а именно, проточная ячейка со сформированным рисунком) 550 может содержать жидкий слой 552 и полупрозрачную покрывающую пластину 551, причем биологический образец может располагаться на внутренней поверхности полупрозрачной покрывающей пластины, а также внутренней поверхности слоя подложки, находящемся под жидким слоем. При этом z-столик может перемещать объектив для фокусировки световых пучков на любую из внутренних поверхностей проточной ячейки (например, сфокусированных на биологический образец). Биологический образец может представлять собой ДНК, РНК, белки или другие биологические материалы, ответственные за оптическое секвенирование, что является известным из уровня техники.

ЕОМ 530 может содержать полуотражательное зеркало 533 для отражения светового пучка отслеживания фокуса, испускаемого модулем 540 отслеживания фокуса (FTM, от англ. Focus Tracking Module) на цель 550, и далее отражения света, который возвращается от цели 550, обратно в FTM 540. FTM 540 может содержать оптический датчик отслеживания фокуса для обнаружения характеристик возращенного светового пучка отслеживания фокуса и создания сигнала обратной связи для оптимизации фокусировки объектива 535 на цель 550.

ЕОМ 530 может также содержать полуотражательное зеркало 534, которое направляет свет через объектив 535 и одновременно с этим позволяет свету, возвращенному от цели 550, проходить через него. В некоторых вариантах осуществления, ЕОМ 530 может содержать трубчатую линзу 532. Свет, переданный через трубчатую линзу 532, может пройти через фильтрующий элемент 531 и в блок 520 съемочной камеры. Блок 520 съемочной камеры может содержать один или несколько оптических датчиков 521, например TDI-датчики линейного сканирования, для обнаружения света, излучаемого биологическим образцом под воздействием падающих световых пучков (например, флуоресценции под действием красного и зеленого света, принятого от источников 511 и 512 света). В одном из примеров, LGC-модуль (например, раскрытый выше) может проецировать свет через дифракционную решетку для создания рисунка линейных интерференционных полос.

Данные на выходе датчиков узла 520 съемочной камеры могут быть переданы в схему 525 анализа данных в реальном времени. Схема 525 анализа данных в реальном времени, в различных вариантах осуществления, исполняет машиночитаемые инструкции для анализа данных изображения (например, оценивания качества изображения, распознавания азотистых оснований, и т.д.), предоставления информации или отображения характеристик пучка (например, фокуса, формы, интенсивности, мощности, яркости, положения) для графического пользовательского интерфейса (GUI), и т.д. Эти операции могут быть осуществлены в реальном времени во время циклов формирования изображений с целью минимизации времени последующего анализа и обеспечения обратной связи в реальном времени и выявления и устранения неполадок во время одного сеанса формирования изображений. В некоторых вариантах осуществления, схема 525 анализа данных в реальном времени может представлять собой вычислительное устройство (например, вычислительное устройство 1100), которое соединено с возможностью обмена данными с системой 500 формирования изображений и с возможностью управления ею. В некоторых вариантах осуществления, дополнительно раскрытых далее, схема 525 анализа данных в реальном времени может также исполнять машиночитаемые инструкции для корректировки искажения в выводимых данных изображения, принимаемых из узла 520 съемочной камеры.

На фиг. 6A-6C показано примерное представление линейного сканирования TDI проточной ячейки с асимметричным рисунком, причем SIM-технология используется для увеличения разрешения вдоль одной оси проточной ячейки. В частности, на фиг. 6A показана проточная ячейка 620 с асимметричным рисунком (которая может представлять собой вариант осуществления проточной ячейки 320 с асимметричным рисунком (фиг. 3C)), на которую накладывается SIM-рисунок 630. Линейное сканирование TDI может быть осуществлено вдоль оси y, для захвата построчных изображений проточной ячейки 620 с асимметричным рисунком. Изображения, захваченные на фиг. 6A, захватываются с SIM-рисунком 630 в первой фазе.

В качестве примера, система 500 формирования изображений с линейным сканированием может использовать LGC-модуль 510 при взаимодействии с оптикой системы для линейного сканирования образца (покрытого SIM-рисунком, то есть рисунком оптической дифракционной решетки) с помощью света, имеющего длины волн в пределах красной области видимого света, и для линейного сканирования образца с помощью света, имеющего длины волн в пределах зеленой области видимого света. В ответ на линейное сканирование, флуоресцентные красители, находящиеся в различных точках образца, могут флуоресцировать, причем полученный в результате свет может быть собран линзой 535 объектива и направлен в датчик изображений узла 520 съемочной камеры для обнаружения флуоресценции. Например, флуоресценция каждой точки может быть обнаружена посредством нескольких пикселей узла 520 съемочной камеры. Далее, данные изображения на выходе из узла 520 съемочной камеры могут быть переданы в схему 525 анализа данных в реальном времени для обработки, например объединения изображений для формирования полосы обзора.

На фиг. 6B показана проточная ячейка 620 с асимметричным рисунком, перекрытая SIM-рисунком 630. Однако, на фиг. 6B, SIM-рисунок 630 сдвинут по фазе вдоль оси x (с выравниванием относительно оси, требующей увеличения разрешения для разрешения (различения) образца). Как раскрыто выше, система 500 формирования изображений с линейным сканированием может использовать LGC-модуль 510 при взаимодействии с оптикой системы для линейного сканирования образца (перекрытого сдвинутым по фазе SIM-рисунком 630). Изображения могут быть захвачены и выданы из узла 520 съемочной камеры и снова переданы в схему 525 анализа данных в реальном времени для обработки.

На фиг. 6C показана проточная ячейка 620 с асимметричным рисунком, перекрытая SIM-рисунком 630. На фиг. 6C, SIM-рисунок 630 сдвинут по фазе в третью фазу вдоль оси x (с выравниванием относительно оси, требующей увеличения разрешения для разрешения (различения) образца). И снова, система 500 формирования изображений с линейным сканированием может использовать LGC-модуль 510 при взаимодействии с оптикой системы для линейного сканирования образца (перекрытого сдвинутым по фазе SIM-рисунком 630). Изображения могут быть захвачены и выведены из узла 520 съемочной камеры и снова переданы в схему 525 анализа данных в реальном времени для обработки. Изображения, захваченные в соответствии с каждой фазой/фазовым сдвигом, могут быть объединены посредством схемы 525 анализа данных в реальном времени в одно изображение и ретрансформированы в действительное пространство для создания изображения, имеющего более высокое разрешение, в данном примере, вдоль оси x.

В другом варианте осуществления, проиллюстрированном на фиг. 6D, различные участки проточной ячейки 620 могут быть перекрыты SIM-рисунком 630 в его различных фазах. То есть SIM-рисунок в первой фазе 630A перекрывается вдоль более низкого участка проточной ячейки 620, причем тот же самый SIM-рисунок во второй фазе 630B перекрывается вдоль среднего участка проточной ячейки 620, и снова, тот же самый SIM-рисунок в третьей фазе 630C перекрывается вдоль верхнего участка проточной ячейки 620. Соответственно, система 500 формирования изображений с линейным сканированием линейно сканирует проточную ячейку 620, перекрытую различными фазами SIM-рисунка, (630A-630B), так что система 500 формирования изображений с линейным сканированием может визуализировать весь поток, в соответствии с каждой требуемой фазой SIM-рисунка, за один сеанс.В некоторых вариантах осуществления, система 500 формирования изображений с линейным сканированием может быть модифицирована так, что она имеет множество LGC-модулей и множество съемочных камер или датчиков/узлов съемочной камеры, например три, каждая из которых создает и выдает свет через три оптические дифракционные решетки (одинаковые, но ориентированные в различных фазах) для создания трех фаз SIM-рисунка. Таким образом, каждая съемочная камера или датчик/узел съемочной камеры способны захватывать изображение проточной ячейки 620 одновременно с тремя различными фазами SIM-рисунка.

Как упомянуто выше, в других вариантах осуществления, образец/проточная ячейка может перемещаться, в то время как SIM-рисунок остается неподвижным. При реализации линейного сканирования TDI, образец/проточная ячейка уже подвижна. Таким образом, данное перемещение образца/проточной ячейки может быть эффективно использовано для исключения необходимости сдвига SIM-рисунка. То есть перемещение образца/проточной ячейки относительно неподвижного SIM-рисунка создает требуемые фазы, необходимые для разрешения (различения) образца.

На фиг. 7 показана другая примерная проточная ячейка 720 со сформированным рисунком, аналогичная проточной ячейке 300 со сформированным рисунком в виде шестиугольного массива (фиг. 3A). В традиционной системе формирования изображений при структурированном освещении, проточная ячейка 720 может быть линейно отсканирована, например, в направлении оси y. Интенсивность светового пучка на выходе из LGC-модуля, например LGC-модуля 510 (фиг. 5), на образец в проточной ячейке 720, показана в виде широкой и равномерной полосы вдоль оси x (не показана, но по существу или точно перпендикулярна к направлению линейного сканирования). Вдоль оси y, однако, интенсивность светового пучка является узкой. Поскольку лазерный пучок перемещается относительно проточной ячейки 720, флуоресцентные изображения захватываются съемочной камерой или датчиком линейного сканирования, например узлом 520 съемочной камеры (фиг. 5), в соответствующей области, освещенной световым пучком.

Однако, благодаря тому факту, что образец/проточная ячейка 720 уже движется, и поскольку для разрешения (различения) образца в проточной ячейке с асимметричным рисунком, например в проточной ячейке 320 (фиг. 3C), необходима только одномерная SIM-технология, оптическая дифракционная решетка, которая формирует SIM-рисунок, может оставаться неподвижной. То есть для надлежащего разрешения (различения) образца необходимо несколько (например, три) фаз. Соответственно, подвижные столики или другие элементы, обеспечивающие перемещение, например вращение или поступательное перемещение, оптической дифракционной решетки в традиционной системе формирования изображений с линейным сканированием, в данном варианте осуществления не требуются.

На фиг. 8 показана примерная система 800 формирования изображений с линейным сканированием, в которой используется неподвижная оптическая дифракционная решетка. Следует отметить, что, для облегчения понимания, на фиг. 8 представлена упрощенная иллюстрация, в которой показаны не все признаки/элементы. Однако система 800 линейного сканирования может представлять собой один из вариантов осуществления системы 500 формирования изображений с линейным сканированием, в которой используется неподвижная оптическая дифракционная решетка для сохранения неподвижности результирующего рисунка оптической дифракционной решетки/SIM-рисунка.

В примере с фиг. 8, излучатель света, например лазер 802, выполнен с возможностью выдачи светового пучка, который коллимируется посредством коллиматорной линзы 804. В одном варианте осуществления, лазер 802 испускает свет с длиной волны в зеленой области видимого света. Коллимированный свет направляется посредством дихроичного фильтра 806 через неподвижную оптическую дифракционную решетку 812 в линзу 242 объектива посредством другого дихроичного фильтра 828 на образец контейнера 832 для образцов. В данном варианте осуществления, контейнер 830 для образцов представляет собой проточную ячейку с асимметричным рисунком, например проточную ячейку 320 (фиг. 3C).

Второй излучатель света, например лазер 808, испускает свет (с длиной волны в красной области видимого света, например) через неподвижную оптическую дифракционную решетку 812 в линзу 830 объектива, также посредством дихроичного фильтра 828, и на образец контейнера 832 для образцов. Контейнер 832 для образцов располагается на столике 840, который может перемещать контейнер 832 для образцов относительно световых пучков от лазеров 802 и 808. В случае флуоресцентного образца, образец флуоресцирует под воздействием структурированного света возбуждения (лазерных пучков от лазеров 802 и 808), причем получаемый в результате свет собирается линзой 828 объектива и направляется в датчик изображений съемочных камер 814 и 820.

Дихроичный фильтр 806 используется для прохождения через него зеленого светового пучка от лазера 802, который далее проходит через неподвижную оптическую дифракционную решетку 812, с отражением при этом красного светового пучка от лазера 808 к неподвижной оптической дифракционной решетке 812. Дихроичный фильтр 828 функционирует аналогично в том, что он обеспечивает возможность отражения красного и зеленого световых пучков от лазеров 802 и 808 к линзе 830 объектива, при этом позволяя съемочной камере 814 и 820 соответственно захватывать изображения, флуоресцирующие зеленым и красным светом. Дихроичный фильтр 816 направляет излучаемый зеленый свет от флуоресцирующего образца к съемочной камере 814, а дихроичный фильтр 822 направляет излучаемый красный свет от флуоресцирующего образца к съемочной камере 820. Линзы 818 и 824 представляют собой коллиматорные линзы для съемочных камер 814 и 820, соответственно. Дихроичное зеркало 826 направляет излучаемый зеленый и красный свет от флуоресцирующего образца к соответствующим съемочным камерам.

В системе 800 линейного сканирования, оптическая дифракционная решетка 812 является неподвижной. То есть, как было рассмотрено ранее, за счет использования проточных ячеек с асимметричным рисунком совместно с SIM-технологией, требуется только один размер структурированного освещения, при этом множество фаз может быть обеспечено за счет перемещения пучка вдоль проточной ячейки. Другими словами, перемещение лазерного пучка относительно образца/проточной ячейки или перемещение образца/проточной ячейки относительно лазерного пучка, которое приводит к относительному движению между образцом и рисунками возбуждения интерференционных полос, - это все, что необходимо для генерирования различных фаз.

На фиг. 9 показана проточная ячейка 920 со сформированным рисунком, которая может быть линейно отсканирована с помощью системы формирования изображений с линейным сканированием, например системы 800 линейного сканирования. Рисунок оптической дифракционной решетки может быть спроецирован на проточную ячейку 920, при этом проточная ячейка 920 движется в соответствии со способом формирования изображений с линейным сканированием. Перемещение проточной ячейки 920 относительно рисунка неподвижной оптической дифракционной решетки создает необходимые фазовые сдвиги, и изображения, захваченные во время линейного сканирования, после объединения и ретрансформирования в действительное пространство, увеличивают разрешение, как было рассмотрено ранее.

В частности, световой пучок движется в направлении оси у. И снова, интенсивность светового пучка является равномерной вдоль оси x (не показано), при этом интенсивность вдоль оси y подвергается модуляции в результате прохождения через неподвижную оптическую дифракционную решетку, например неподвижную оптическую дифракционную решетку 812 (фиг. 8). При движении светового пучка относительно проточной ячейки 920, рисунок оптической дифракционной решетки сдвигается. Фактически, может быть получено более трех, или даже более десяти фазовых сдвигов. Следовательно, увеличение разрешения вдоль оси линейного сканирования может быть обеспечено за счет перемещения образца/проточной ячейки 920, а не оптической дифракционной решетки. В некоторых вариантах осуществления, как раскрыто ранее, разрешение в данном направлении может быть увеличено по меньшей мере в два раза на поверхностях как с произвольными элементами, так и с периодическими элементами. Следует понимать, что поскольку разрешение может быть увеличено, например, по меньшей мере в два раза, плотность наноразмерных лунок проточной ячейки 920 может быть увеличена в два или более раз.

На фиг. 10 показана блок-схема, иллюстрирующая примерные операции, которые могут быть осуществлены в системе формирования изображений с линейным сканированием, например системе 500 формирования изображений с линейным сканированием (фиг. 5) или системе 800 формирования изображений с линейным сканированием (фиг. 8), для секвенирования образца с использованием проточной ячейки с асимметричным рисунком. На этапе 1000 могут быть включены лазерные источники, например лазерные источники 802 и 808, световые пучки от которых выводятся через неподвижную оптическую дифракционную решетку, например неподвижную оптическую дифракционную решетку 812, в соответствии с первой ориентацией рисунка оптической дифракционной решетки. На этапе 1010 рисунок оптической дифракционной решетки проецируется на образец, а на этапе 1020 образец подвергается линейному сканированию. Линейное сканирование может быть осуществлено так, как раскрыто ранее в отношении системы 800 формирования изображений с линейным сканированием (фиг. 8). На этапе 1030 образец перемещается в соответствии с упомянутым выше способом линейного сканирования, или же для обеспечения относительного движения между образцом и рисунком оптической дифракционной решетки возможно перемещение направленного света, что также раскрыто ранее.

Этапы 1020 и 1030 можно повторять столько раз, сколько необходимо для захвата изображений, характерных для всего образца. И снова, в результате перемещения образца относительно рисунка неподвижной оптической дифракционной решетки, изображения образца и рисунка оптической дифракционной решетки могут быть захвачены с требуемыми фазовыми сдвигами, необходимыми для увеличения разрешения. На этапе 1040 возможна реконструкция изображения с высоким разрешением.

Следует отметить, что для предотвращения размытия вследствие движения между рисунком оптической дифракционной решетки и образцом во время линейного сканирования, лазерные источники могут функционировать в импульсном режиме. То есть лазерные источники, например лазерные источники 802 и 808, могут работать в импульсном режиме так, что при каждом возбуждении, возможен захват изображения линейного сканирования. В некоторых вариантах осуществления, ориентация рисунка оптической дифракционной решетки относительно образца/проточной ячейки может быть сдвинута на 90°. В некоторых вариантах осуществления, как показано на фиг. 6A-6C, если ориентация рисунка оптической дифракционной решетки такова, что образец не движется через светлые и темные области (как в случае, если ориентация рисунка оптической дифракционной решетки сдвинута на 90°), пульсация лазерных источников может не понадобиться, поскольку перемещение образца относительно рисунка оптической дифракционной решетки происходит с той же самой интенсивностью интерференционных полос.

На фиг. 11 показан примерный вычислительный компонент, который может быть использован для реализации различных признаков раскрытой здесь системы и способов, например, упомянутых выше признаков и функциональных возможностей одного или нескольких аспектов способов, проиллюстрированных на фиг. 4 и 10, которые реализованы в системах 200, 500 и/или 800 и раскрыты в настоящем описании. Например, вычислительный компонент может быть выполнен в виде схемы 525 анализа данных в реальном времени.

Используемое в настоящем описании понятие «схема» может описывать заданную единицу функциональности, которая может быть осуществлена в соответствии с одним или несколькими вариантами осуществления настоящего изобретения. Используемое здесь понятие «схема» может быть реализовано с использованием любой формы аппаратного обеспечения или комбинации аппаратного обеспечения и программного обеспечения. Например, для изготовления схемы может быть применен один или несколько процессоров, контроллеров, устройств ASIC, PLA, PAL, CPLD, FPGA, логических компонентов, программных маршрутов или других механизмов. В данном варианте осуществления, различные раскрытые здесь схемы могут быть выполнены в виде дискретных схем или функций, причем описанные здесь признаки могут совместно использоваться частично или полностью одним или несколькими схемами. Другими словами, как будет очевидно специалисту в данной области техники после прочтения данного описания, различные раскрытые здесь признаки и функциональные возможности могут быть реализованы в любой заданной области применения и могут быть воплощены в одной или нескольких отдельных или совместно используемых схемах в различных комбинациях и перестановках. Даже несмотря на то, что различные признаки или элементы функциональных возможностей могут быть индивидуально описаны или заявлены в виде отдельных модулей, специалисту в данной области техники будет понятно, что эти признаки и функциональные возможности могут совместно использоваться одним или несколькими общими элементами программного и аппаратного обеспечения, причем такое описание не требует или подразумевает, что отдельно взятые программные или аппаратные компоненты применяются для осуществления таких признаков или функциональных возможностей.

В случае когда компоненты или схемы в настоящем изобретении реализованы полностью или частично с использованием программного обеспечения, в одном из вариантов осуществления, эти программные элементы могут быть выполнены с возможностью работы с вычислительным или обрабатывающим модулем, способным выполнять функции, раскрытые в их отношении. Один такой примерный вычислительный компонент показан на фиг. 11. Различные варианты осуществления раскрыты в отношении данного примерного вычислительного компонента 1100. После прочтения данного описания, специалисту в данной области техники будет очевидно, как реализовать настоящее изобретение с использованием других вычислительных модулей или архитектур.

Как показано на фиг. 11, вычислительный компонент 1100 может обладать, например, вычислительными или обрабатывающими способностями, имеющимися в настольном компьютере, портативном компьютере, компьютере типа «ноутбук», и планшетном компьютере, переносных вычислительных устройствах (планшетах, персональных цифровых помощниках (PDA, от англ. Personal Digital Assistant), смартфонах, сотовых телефонах, карманных персональных компьютерах, и т.д.); центральных компьютерах, суперкомпьютерах, рабочих станциях или серверах; или любом другом типе специализированных или универсальных вычислительных устройств, которые могут оказаться целесообразными или подходящими для заданной области применения или среды. Вычислительный компонент 1100 может иметь вычислительные возможности, встроенные или иным образом доступные для заданного устройства. Например, вычислительный компонент может быть предусмотрен в других электронных устройствах, таких как, например, цифровые съемочные камеры, навигационные системы, сотовые телефоны, портативные вычислительные устройства, модемы, маршрутизаторы, WAP-устройства, терминалы и другие электронные устройства, которые могут содержать некоторую форму возможности обработки.

Вычислительный компонент 1100 может содержать, например, один или несколько процессоров, контроллеров, модулей управления, или других обрабатывающих устройств, таких как процессор 1104. Процессор 1104 может быть реализован с использованием универсального или специализированного ядра процессора, такого как, например, микропроцессор, контроллер или другая логика управления. В проиллюстрированном примере, процессор 1104 соединен с шиной 1102, хотя любое средство передачи данных может быть использовано для содействия взаимодействию с другими компонентами вычислительного компонента 1100 или обмену данными с внешними устройствами.

Вычислительный компонент 1100 может также содержать один или несколько модулей памяти, часто называемых просто «основная память» 1108. Например, предпочтительно память с произвольным доступом (RAM, от англ. Random Access Memory) или другая динамическая память, может быть использована для хранения информации и инструкций, подлежащих исполнению посредством процессора 1104. Основная память 1108 также может быть использована для хранения временных переменных или другой промежуточной информации во время исполнения инструкций, подлежащих исполнению посредством процессора 1104. Вычислительный компонент 1100 может по аналогии содержать постоянную память (ROM, от англ. Read Only Memory) или другое статическое устройство хранения, соединенное с шиной 1102 для хранения статической информации и инструкций для процессора 1104.

Вычислительный компонент 1100 может также иметь одну или несколько различных форм механизма 1110 хранения информации, который может содержать, например, медиа-накопитель 1112 и интерфейс 1120 блока хранения. Медиа-накопитель 1112 может содержать привод или другой механизм для крепления несъемного или съемного носителя 1114 информации. Например, может быть предусмотрен накопитель на жестком диске, твердотельный накопитель, накопитель на магнитной ленте, накопитель на оптических дисках, привод CD или DVD (R или RW), или другой съемный или несъемный медиа-накопитель. Соответственно, носитель 1114 информации может представлять собой, например, жесткий диск, твердотельный накопитель, магнитную ленту, картридж, оптический диск, CD, DVD или Blu-ray, или другой несъемный или съемный носитель, который может быть считан, записан или к котором может обращаться медиа-накопитель 1112. Как показано в этих примерах, носитель 1114 информации может представлять собой носитель информации, пригодный для использования на компьютере, в котором хранится компьютерное программное обеспечение или данные.

В альтернативных примерах, механизм 1110 хранения информации может содержать другие схожие технические средства для обеспечения возможности загрузки компьютерных программ или других инструкций или данных в вычислительный компонент 1100. Такие технические средства могут включать в себя, например, несъемный или съемный блок 1122 хранения и интерфейс 1120. К примерам таких блоков 1122 хранения и интерфейсов 1120 могут относиться программный картридж и интерфейс картриджа, съемная память (например, флэш-память или другой съемный модуль памяти) и гнездо для модуля памяти, гнездо и карточку PCMCIA, и другие несъемные или съемные блоки 1122 хранения и интерфейсы 1120, которые позволяют передавать программное обеспечение и данные из блока 1122 хранения в вычислительный компонент 1100.

Вычислительный компонент 1100 также может содержать интерфейс 1124 связи. Интерфейс 1124 связи может быть использован для обеспечения возможности передачи программного обеспечения и данных между вычислительным компонентом 1100 и внешними устройствами. К примерам интерфейса 1124 связи может относиться модем или программный модем, интерфейс сети (например, Ethernet, сетевая интерфейсная плата, WiMedia, IEEE 802.XX или другой интерфейс), порт связи (такой как, например, USB-порт, инфракрасный порт, интерфейс Bluetooth® RS232-порта, или другой порт), или другой интерфейс связи. Программное обеспечение и данные, переданные посредством интерфейса 1124 связи, обычно могут переноситься сигналами, которые представляют собой электронные, электромагнитные (в том числе, оптические) или другие сигналы, которыми можно обмениваться посредством заданного интерфейса 1124 связи. Эти сигналы могут быть предоставлены в интерфейс 1124 связи через канал 1128. Этот канал 1128 может переносить сигналы, причем он может быть реализован с использованием проводного или беспроводного средства связи. К некоторым примерам указанного канала можно отнести телефонную линию, сотовую линию, линию радиосвязи, оптическую линию, сетевой интерфейс, локальную или глобальную вычислительную сеть, и другие проводные и беспроводные каналы связи.

В данном документе, понятия «машиночитаемый носитель», «носитель, пригодный для использования на компьютере» и «компьютерный программный носитель» применяются, главным образом, для обозначения долговременного носителя, энергозависимого или энергонезависимого, такого как, например, память 1108, блок 1122 хранения и носитель 1114 информации. Эти и другие различные формы компьютерного программного носителя или носителя, пригодного для использования на компьютере, могут быть задействованы для передачи одной или нескольких последовательностей одной или нескольких инструкций в обрабатывающее устройство для исполнения. Такие инструкции, воплощенные на носителе, именуются, в основном, как «компьютерный программный код» или «компьютерный программный продукт» (который может быть сгруппирован в форме компьютерных программ или других объединений). При исполнении, такие инструкции могут позволить вычислительному модулю 1100 выполнять признаки или функции раскрытого здесь настоящего изобретения.

Следует понимать, что хотя различные признаки, аспекты и функциональные возможности, описанные в одном или нескольких отдельных вариантах осуществления, раскрыты выше в отношении различных примеров и вариантов осуществления, их применимость не ограничивается конкретным вариантом осуществления, в котором они описаны; но вместо этого они могут быть применены, отдельно или в различных комбинациях, в отношении одного или нескольких других вариантов осуществления заявки, независимо от того, описаны или нет такие варианты осуществления, а также независимо от того, представлены или нет такие признаки в качестве части рассмотренного варианта осуществления. Таким образом, объем защиты и сущность настоящей заявки не ограничиваются каким-либо из описанных выше примерных вариантов осуществления.

Следует понимать, что все комбинации приведенных выше концепций (при условии, что такие концепции не являются противоречащими друг другу) рассматриваются как часть раскрытого здесь объекта изобретения. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, фигурирующие в конце данного описания, рассматриваются как часть раскрытого здесь объекта изобретения.

Понятия «по существу» и «примерно», используемые в настоящем описании, в том числе в формуле изобретения, применяются для описания и принятия во внимание небольших отклонений, например, связанных с изменениями в обработке. Например, они могут быть меньше или могут равняться ±5%, например, они могут быть меньше или могут равняться ±2%, например, они могут быть меньше или могут равняться ±1%, например, они могут быть меньше или могут равняться ±0,5%, например, они могут быть меньше или могут равняться ±0,2%, например, они могут быть меньше или могут равняться ±0,1%, например, они могут быть меньше или могут равняться ±0,05%.

В применимой степени, понятия «первый», «второй», «третий», и т.д. используются здесь исключительно для демонстрации соответствующих объектов, описанных этими понятиями в виде отдельных субъектов, причем они не предназначены для обозначения хронологической последовательности, если явным образом не указано иное.

Понятия и фразы, используемые в данном документе, а также их вариации, если явным образом не указано иное, следует толковать как допускающие изменения, нежели ограничивающие. В качестве примера вышесказанного: понятие «включающий в себя» следует толковать как «включающий в себя, без ограничения» и т.д.; понятие «пример» используется для предоставления некоторых примеров рассматриваемого объекта, не исчерпывающий или ограничивающий их перечень; понятия «некоторый» или «какой-либо» следует толковать как «по меньшей мере один», «один или несколько», и т.д., а такие определения как «общепринятый», «традиционный», «нормальный», «стандартный», «известный» и понятия схожего значения не следует рассматривать как ограничивающие описанный объект заданным периодом времени или объектом, существующим в данный момент времени, но вместо этого их следует толковать как охватывающие общепринятые, традиционные, нормальные или стандартные технологии, которые могут существовать или являются известными в данный момент времени или в любой момент времени в будущем. По аналогии, если данный документ ссылается на технологии, которые будут очевидными или известными специалисту в данной области техники, то такие технологии охватывают технологии, очевидные или известные специалисту в данной области техники в данный момент времени или в любой другой момент времени в будущем.

Наличие расширяющих слов и фраз, таких как «один или несколько», «по меньшей мере», «помимо прочего» или других схожих фраз в некоторых примерах не следует толковать как обозначающее, что в случае отсутствия таких расширяющих фраз подразумевается или требуется более «узкий» случай.

Кроме того, различные варианты осуществления, изложенные в настоящем документе, раскрыты на основании примерных блок-схем, структурных схем и других иллюстраций. Как будет очевидно специалисту в данной области техники после прочтения данного документа, проиллюстрированные варианты осуществления и их различные альтернативы можно осуществить, не ограничиваясь проиллюстрированными примерами. Например, блок-схемы и их сопроводительное описание не следует рассматривать как устанавливающее конкретную архитектуру или конфигурацию.

Хотя выше были раскрыты различные варианты осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что они представлены исключительно в качестве примера, и не несут ограничительный характер. По аналогии, различные схемы могут изображать примерную архитектуру или другую конфигурацию для описания, что сделано для облегчения понимания признаков и функциональных возможностей, которые могут быть включены в настоящее изобретение. Настоящее изобретение не ограничивается проиллюстрированными примерными архитектурами или конфигурациями, при этом требуемые признаки могут быть реализованы с использованием разнообразных альтернативных архитектур и конфигураций. В действительно, специалисту в данной области техники будет очевидно, как альтернативные функциональные, логические или физические разделения и конфигурации могут быть осуществлены для реализации требуемых признаков настоящего изобретения. Кроме того, большое количество различных названий составляющих компонентов, отличных от показанных в настоящем документе, могут быть применены в отношении различных разделов. Более того, что касается блок-схем, описаний функционирования и пунктов, относящихся к способу, то порядок, в котором здесь представлены этапы, не устанавливает, что различные варианты осуществления должны быть реализованы для выполнения изложенных функциональных возможностей в том же самом порядке, если из контекста явным образом не следует иное.

1. Способ формирования изображений биологического образца, содержащий шаги:

направляют свет через неподвижную оптическую дифракционную решетку,

проецируют рисунок оптической дифракционной решетки, созданный посредством света, направленного через неподвижную оптическую дифракционную решетку, на биологический образец, причем по меньшей мере часть биологического образца размещена во множестве наноразмерных лунок, а указанное множество наноразмерных лунок имеет ориентацию, образующую квадратный рисунок;

осуществляют линейное сканирование биологического образца;

перемещают биологический образец относительно рисунка оптической дифракционной решетки или перемещают свет, направленный через неподвижную оптическую дифракционную решетку, и

реконструируют изображение с высоким разрешением, характерное для биологического образца.

2. Способ по п. 1, в котором свет представляет собой свет с длинами волн в красной и зеленой областях видимого света, исходящий от двух соответствующих лазерных источников.

3. Способ по п. 2, в котором каждый из двух лазерных источников выдает свет в импульсном режиме.

4. Способ по п. 3, в котором линейное сканирование биологического образца предусматривает захват изображения участка биологического образца после возбуждения двумя лазерными источниками, приводящего к освещению биологического образца.

5. Способ по п. 1, в котором перемещение биологического образца относительно рисунка оптической дифракционной решетки или перемещение света относительно рисунка оптической дифракционной решетки создает множество фазовых сдвигов рисунка оптической дифракционной решетки.

6. Способ по п. 5, в котором указанное множество фазовых сдвигов включает в себя по меньшей мере три фазовых сдвига рисунка оптической дифракционной решетки.

7. Способ по п. 1, в котором рисунок оптической дифракционной решетки содержит множество продольных интерференционных полос, ориентированных по меньшей мере по существу перпендикулярно к множеству продолговатых наноразмерных лунок, составляющих проточную ячейку, вмещающую в себя биологический образец.

8. Способ по. 7, в котором информация, характерная для биологического образца вдоль первой оси проточной ячейки, разрешается в соответствии с увеличением разрешения на основании пространственной частоты, создаваемой комбинацией множества продолговатых наноразмерных лунок, составляющих проточную ячейку, и рисунка оптической дифракционной решетки.

9. Способ по п. 8, в котором информация, характерная для биологического образца вдоль второй оси, которая проходит по меньшей мере по существу перпендикулярно к первой оси, разрешается в соответствии с неувеличенным разрешением.

10. Способ по п. 1, в котором рисунок оптической дифракционной решетки содержит множество продольных интерференционных полос, ориентированных по меньшей мере по существу параллельно множеству продолговатых наноразмерных лунок, составляющих проточную ячейку, вмещающую в себя биологический образец.

11. Способ по п. 10, в котором линейное сканирование осуществляют вдоль направления, выровненного с множеством продолговатых наноразмерных лунок.

12. Способ по п. 1, в котором линейное сканирование биологического образца предусматривает линейное сканирование биологического образца с временной задержкой и накоплением.

13. Система формирования изображений биологического образца, содержащая:

по меньшей мере два лазерных источника, выполненных с возможностью излучения световых пучков по меньшей мере с двумя длинами волн, соответственно;

неподвижную оптическую дифракционную решетку, выполненную с возможностью создания рисунка оптической дифракционной решетки после прохождения излучаемых световых пучков через неподвижную оптическую дифракционную решетку; и

узел линейного сканирования, предназначенный для:

перемещения биологического образца относительно рисунка оптической дифракционной решетки или перемещения по меньшей мере двух лазерных источников относительно рисунка оптической дифракционной решетки, при этом по меньшей мере часть биологического образца размещена во множестве наноразмерных лунок, а указанное множество наноразмерных лунок имеет ориентацию, образующую квадратный рисунок;

захвата множества изображений, характерных для указанных участков биологического образца; и

реконструкции изображения с высоким разрешением, характерного для биологического образца, на основании множества изображений.

14. Система по п. 13, в которой узел линейного сканирования содержит по меньшей мере две съемочные камеры, причем каждая из них имеет по меньшей мере один датчик изображений, выполненный с возможностью восприятия флуоресцентного биологического образца.

15. Система по п. 14, в которой перемещение биологического образца относительно рисунка оптической дифракционной решетки или перемещение по меньшей мере двух лазерных источников создает множество фазовых сдвигов рисунка оптической дифракционной решетки.

16. Система по п. 15, в которой множество фазовых сдвигов включает в себя по меньшей мере три фазовых сдвига рисунка оптической дифракционной решетки.

17. Система по п. 13, в которой рисунок оптической дифракционной решетки содержит множество продольных интерференционных полос, ориентированных относительно множества продолговатых наноразмерных лунок, составляющих проточную ячейку, вмещающую в себя биологический образец.

18. Система по п. 17, в которой узел линейного сканирования выполнен с возможностью захвата множества изображений, характерных для участков биологического образца вдоль направления, выровненного с множеством продолговатых наноразмерных лунок.

19. Система по п. 13, в которой каждый из указанных по меньшей мере двух лазерных источников выполнен с возможностью излучения световых пучков в импульсном режиме.

20. Система по п. 19, в которой узел линейного сканирования выполнен с возможностью захвата каждого из множества изображений, характерных для участков биологического образца, после возбуждения указанными по меньшей мере двумя лазерными источниками, приводящего к флуоресценции биологического образца.