Инъецируемая композиция для уменьшения локализованного жира без болевого синдрома, отёка и побочных эффектов и способ ее получения

Группа изобретений относится к уменьшению локализованного жира у субъекта. Композиция для уменьшения локализованного жира содержит активные ингредиенты, состоящие из (i) фосфатидилхолина и (ii) по меньшей мере одного вещества, выбранного из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0. Также раскрыты препарат для удаления локализованного отложения жира у субъекта, наборы для уменьшения или удаления локализованного отложения жира, способ получения инъецируемой композиции для уменьшения локализованного жира, способ получения фармацевтической композиции для нехирургического удаления локализованного отложения жира, способ удаления локализованного отложения жира у субъекта и способ нехирургического удаления локализованного отложения жира у субъекта. Группа изобретений обеспечивает уменьшение локализованного жира без болевого синдрома, отека и побочного эффекта. 8 н. и 31 з.п. ф-лы, 77 ил., 29 табл., 21 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к композиции для нехирургического уменьшения жира без боли, отека и побочного эффекта у субъекта, имеющего локализованное отложение жира, с применением фармацевтически активного фосфатидилхолина, и к способу ее получения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композиции и препарату для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочных эффектов (а именно некроз мышечных клеток, фибробластов и сосудистых эндотелиальных клеток, отличных от адипоцитов; отек; потеря чувствительности мест введения; обширная отечность; эритема; уплотнение; парестезия; узелковое утолщение; зуд; ощущение жжения; повреждение нерва или дисфагия), где композиция содержит: (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0, к набору, содержащему ее, к способу ее получения и к способу нехирургического удаления локализованного отложения жира с пониженными болевыми и побочными эффектами с применением композиции или препарата.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с патентной заявкой Кореи № 10-2017-0051868, поданной 21 апреля 2017 г., и патентной заявкой Кореи № 10-2017-0146264, поданной 3 ноября 2017 г., содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Локально отложенный жир является предметом особого беспокойства у многих людей. Люди, имеющие нежелательные выпуклые или округлые отложения жира на лице или частях тела, могут выглядеть менее привлекательными и могут выглядеть старше. Это может быть вызвано старением, образом жизни или генетической предрасположенностью. Для преодоления такого состояния, мы применяем упражнения и диеты, но эффект уменьшения жира ограничен.

Типичные хирургические косметические пластические процедуры для уменьшения локализованного отложения жира включают липосакцию, липопластику и липоскульптурное удаление жира, которые представляют собой косметические пластические операции по удалению большого количества жира. Косметические минимально инвазивные (нехирургические) процедуры представляют собой процедуры с применением медицинских устройств, мезотерапию или инъекции не по утвержденным показаниям. Тем не менее, при хирургическом вмешательстве, лечение занимает несколько недель или месяцев, а некоторые люди, такие как курильщики и диабетики, могут испытывать значительные задержки в лечении и имеют потенциальные осложнения и риски, такие как смертельные побочные эффекты, вызывающие 20 смертей на 100000 человек, риск общей потери чувствительности, чрезмерное кровотечение, повреждение внутренних органов, бактериальные инфекции, рубцы, кровоподтеки, отек и боль. В случае альтернативных нехирургических способов, существует потенциальный риск, поскольку не обеспечиваются безопасность и эффективность из-за отсутствия широкомасштабных клинических испытаний, проводимых с разрешения и под надзором органов здравоохранения. Существует необходимость в разработке клинически пригодных новых лекарственных средств, которые не имеют рисков хирургического и нехирургического вмешательств.

Инъецируемые лекарственные средства для локализованного уменьшения жира представляют собой инъекции лекарственного средства в подкожный жировой слой для того, чтобы вызвать потерю жировых клеток. Типичным примером является инъекция PPC (полиенфосфатидилхолин). Инъекция PPC является аббревиатурой от полиенфосфатидилхолина, и существует Essentiale® N i.v. разработанный немецкой компанией A. Nattermann GmbH в 1950-х годах для лечения заболеваний печени и Lipostabil® N iv. разработанный для профилактики и лечения жировой эмболии, а также Lipobean®, который был одобрен в качестве вспомогательного средства при печеночной коме вследствие цирроза печени в Республике Корея.

При назначении инъекций PPC для профилактики и лечения заболеваний печени или жировой эмболии, в 1988 году доктор Sergio Maggiori, итальянский врач из Общества мезотерапии в Париже, Франция, по результатам испытания впервые сообщил о том, что ксантелазму, заболевание при котором желтый жир откладывается на веках, вылечили инъекцией PPC, в 1999 году доктор Patricia G.Rittes, бразильский дерматолог из Бразильского общества дерматологов, объявила результаты испытания уменьшения жировых отложений нижних век с помощью инъекции PPC, подтверждая возможность уменьшения жира с помощью инъекции PPC. С тех пор были опубликованы результаты испытаний относительно малой безопасности и безопасности инъекций PPC в отложения жира на животе, боку, бедре, под подбородком, спине, руке, ноге и липоме.

Инъекция PPC представляет собой композицию, в которой смешивают основной компонент полиенфосфатидилхолин и солюбилизирующий агент дезоксихолевую кислоту (DCA). PPC является незаменимым фосфолипидом и основным компонентом биологической мембраны и состоит из гидрофобных хвостов, в которой пять жирных кислот связаны с гидрофильной головкой фосфора и холина в глицериновой углеродной цепи. Он составляет 55 % клеточной мембраны и митохондриальной сети организма человека. Поскольку он практически не синтезируется в организме человека, то является важным компонентом, который должен поступать извне. В большом количестве он содержится в соевых бобах, яйцах и т.п. А также он может быть извлечен физическим или химическим способом с применением нуклеиновой кислоты и очищен до высокой степени чистоты.

Дезоксихолевая кислота (DCA) представляет собой одну из вторичных желчных солей, побочный продукт метаболизма энтеробактерий, и ее смешивают в качестве солюбилизирующего агента, чтобы превратить плохо растворимый PPC в стабильно инъецируемую композицию. PPC, солюбилизированный DCA, стабильно диспергируется в виде системы смешанных мицелл размером менее 10 нм. Если инъекцию осуществлять без солюбилизации PPC, то он не будет растворяться в одной молекуле, и желаемая концентрация в крови не будет обеспечена. Кроме того, кровеносные сосуды могут забиться и может возникнуть тромбоз, поэтому несолюбилизированный PPC не применяют для инъекций. Если лекарственное средство не растворяется во время внутривенной инъекции и образует взвешенный осадок, крупные частицы блокируют кровеносные сосуды, влияют на кровоток окружающих тканей вблизи заблокированных кровеносных сосудов или повреждают, или стимулируют ткани, что приводит к зуду, боли, судорогам, и т.п. В тяжелых случаях может произойти развитие эмболии.

PPC рассматривали в качестве активного ингредиента для уменьшения жира на основании того факта, что Lipostabil® N iv, композицию, содержащую PPC в качестве основного компонента и DCA в качестве солюбилизирующего агента, назначают для лечения жировой эмболии, при которой жировая ткань проникает в вену, вызывая эмболию. Но было подтверждено, что DCA, смешанная в качестве солюбилизирующего агента в инъекциях PPC, вызывает некроз из-за детергентного влияния, что приводит к снижению количества адипоцитов. Таким образом, было обнаружено, что гиполипидемическим активным ингредиентом инъекций PPC является DCA (непатентный документ 1). Исходя из этого, в 2015 году Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) одобрило инъекцию DCA, которая не содержит PPC, разработанную Kythera Biopharmaceuticals INC, частной компанией, расположенной в США, в качестве цитолитического агента для улучшения внешности за счет уменьшения жировой прослойки под подбородком.

Однако, поскольку инъекции, содержащие отдельно DCA, или инъекции PPC, солюбилизированного DCA, лизируют не только адипоциты (адипоциты 3T3L1), но и нормальные фибробласты, эндотелиальные клетки и клетки скелетных мышц, то это инъекции клеточного лизиса, а не инъекции уменьшения жировых отложений (непатентный документ 2).

Клинически, как сообщается, композиция, в которой смешаны PPC и DCA приводит к появлению болевого синдрома (78,4 %), гематомы (83,8 %), эритемы (100 %), ощущения жжения (100 %), отека (100 %) и уплотнения (66,7 %) и композиция, содержащая только DCA, как сообщается, приводит к появлению болевого синдрома (100 %), гематомы (91,9 %), эритемы (100 %), ощущения жжения (100 %), отека (100 %) и уплотнения (89,2 %) (непатентный документ 3). Кроме того, результаты крупномасштабного клинического испытания показали, что применение композиции, содержащей только DCA, приводит к появлению болевого синдрома (73,6 %), гематомы (72,9 %), отека (67,8 %), потере чувствительности (65,5 %), эритемы (35,3 %), отека (29,1 %), уплотнения (28,3 %), зуда (16,3 %) и узелковых утолщений (14,3 %) (непатентный документ 4). Такие опасные случаи вызваны механизмом действия, при котором подкожно вводимый DCA блокирует подачу кислорода к клеткам, вызывая немедленное расширение клеток, образование пузырей и повреждение клеточной мембраны, что приводит к некрозу клеток вследствие быстрой воспалительной реакции (непатентный Документ 5).

Когда клетки погибают in vivo, отмечаются различия в некрозе и апоптозе. Апоптоз относится к активной гибели, при которой экспрессия и активность различных генов и белков регулируются сигналом, запрограммированным внутри клеток, и апоптосомы, образуемые в результате этого процесса, удаляются окружающими клетками или макрофагами путем фагоцитоза и т.п., так что воспаление не возникает. С другой стороны, некроз представляет собой пассивную гибель, которая возникает внезапно из-за изменений во внешней среде, что приводит к беспорядочному клампингу хромосом и разбуханию цитоплазмы. Наконец, клеточный дебрис образуется в результате деградации клеток, и известно, что он вызывает воспаление (Earnshaw, WC, Curr. Opin. Cell Biol., 7, pp. 337-343, 1995).

Таким образом, когда инъекция по уменьшению локализованного жира действует как фактор некроза клеток, воспаление воздействует на окружающую область, не относящуюся к целевому участку, в который вводят лекарственное средство, так что инъекция также влияет на нормально функционирующие клетки и, таким образом, они погибают. Суммируя указанные факты, важно избирательно и высокоэффективно индуцировать липолиз и апоптоз адипоцитов без побочных эффектов, вызываемых уже одобренными инъекциями для коррекции внешности, таких как болевой синдром, отек, потеря чувствительности, обширная отечность, эритема, уплотнение, парестезия, узелковое утолщение, зуд, ощущение жжения и некроз мышечных клеток, фибробластов и эндотелиальных клеток сосудов, отличных от адипоцитов. Однако до настоящего времени не существует исследований и составов, разработанных с этой точки зрения (непатентный документ 6).

До настоящего времени было проведено лечение не по утвержденным показаниям с применением Lipostabil® N i.v., Essentiale® N i.v., инъецируемым составом композиции, в котором смешаны PPC и DCA, для уменьшения локализованного жира, и с применением Kybella (композиции, содержащей только DCA), проведено много исследований по расщеплению жира, и Kybella также является первой в мире, получившей одобрение FDA в качестве цитолитического препарата для улучшения внешности. Но предшествующий уровень техники и композиции имеют определенные ограничения. Те, кто хочет уменьшить количество жира с помощью нехирургического лечения, жалуются на дискомфорт и беспокойство из-за побочных эффектов, вызванных композицией PPC плюс DCA или композицией, содержащей только DCA, таких как болевой синдром, отек, потеря чувствительности, обширная отечность, эритема, уплотнение, парестезия, узелковое утолщение, зуд, ощущение жжения и некроз мышечных клеток, фибробластов и эндотелиальных сосудистых клеток, отличных от адипоцитов. По этим причинам, хотя клиническая эффективность была подтверждена в настоящее время, соблюдение режима терапии является низким. Следовательно, по сравнению с доступными в настоящее время цитолитическими инъекциями, необходимо разработать инъекции, которые не вызывают болевой синдром и отек вследствие воспаления и которые расщепляют жир без побочных эффектов, избирательно индуцируя апоптоз и деградацию адипоцитов. Настоящее изобретение соответствует указанным требованиям.

Основываясь на вышеизложенных фактах, авторы настоящего изобретения исследовали влияние PPC на уменьшение количества жира и результаты исследования показали, что композиция, содержащая только PPC, без DCA уменьшала только количество адипоцитов путем апоптоза, а не некроза, без воздействия на фибробласты (непатентный документ 7). С тех пор авторы настоящего изобретения завершили настоящее изобретение, изучая композицию для избирательного уменьшения количества жировых клеток на основе PPC в качестве активного ингредиента без возникновения боли, отека и побочных эффектов.

(Непатентный документ 1) Rotunda AM, Suzuki H, Moy RL, Kolodney M., Detergent effects of sodium deoxycholate are a major feature of an injectable phosphatidylcholine formulation used for localized fat dissolution. Dermatol Surg 30(7):1001-8(2004);

(Непатентный документ 2) A.Gupta, Action and comparative efficacy of phosphatidylcholine formulation and isolated sodium deoxycholate for different cell type, Aest Plast Sur, 33:346-352, 2009;

(Непатентный документ 3) Giovanni Salti, Phosphatidylcholine and sodum deoxycholate in the treatment of localized fat: A doube-blind, randomized study, Dermatol Surg 34:60-66, 2007

(Непатентный документ 4) Humphrey et al, ATX-101 for reduction of submental fat: A Phase III randomized controlled trial, J AM ACAD DERMATOL Vol75, No.4, 788-797, 2016;

(Непатентный документ 5) Duncan, Injectable therapies for localized fat loss: state of the art, Clin Plastic Surg, 1-13, 2011;

(Непатентный документ 6) Duncan, Refinement of Technique in injection lipolysis based on scientific studies and clinical evaluation, Clin Plastic Surg 36 195-209 (2009);

(Непатентный документ 7) Dong-Seok Kim, Phosphatidylcholine induces apoptosis of 3T3-L1 adipocytes, Journal of biomedical science, 18:91,1-7, 2011.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Для решения проблемы побочных эффектов обычных инъекций, содержащих только DCA, или инъекций PPC, солюбилизированного DCA, таких как болевой синдром, отек и различные побочные эффекты, вызванные неселективным лизисом клеток, особенно серьезные клинические побочные эффекты, вызванные некрозом мышечных клеток, фибробластов и сосудистых эндотелиальных клеток, отличных от адипоцитов, авторы настоящего изобретения провели исследование по получению безопасной и стабильной инъецируемой композиции для уменьшения локализованного жира, которая уменьшает жир без болевого синдрома и отека по механизму индукции апоптоза и липолиза в адипоцитах, и избирательно уменьшает адипоциты без повреждения фибробластов, клеток эндотелия сосудов и клеток скелетных мышц. В результате автором изобретения было завершено настоящее изобретение после подтверждения того факта, что композиция по настоящему изобретению, полученная добавлением таурохолевой кислоты (ТСА), в частности гликохолевой кислоты (GCA), к фосфатидилхолину (PPC) в определенном соотношении, является безопасной и имеет отличную стабильность состава и не вызывает некроз клеток, но индуцирует апоптоз и избирательную деградацию только адипоцитов.

Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения обеспечена композиция для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта (отек; потеря чувствительности в месте введения; обширная отечность; эритема; уплотнение; парестезия; узелковое утолщение; зуд; ощущение жжения; повреждение нерва; дисфагия и некроз мышечных клеток, фибробластов и сосудистых эндотелиальных клеток, отличных от адипоцитов), где композиция содержит: (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен препарат для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, где препарат содержит: (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где молярное отношение (ii) к (i) в препарате составляет от 0,7 до 3,0.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен набор, содержащий: (I) первый контейнер, содержащий композицию или препарат для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где композиция или препарат содержит: (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где молярное отношение (ii) к (i) в композиции или препарате составляет от 0,7 до 3,0; и (II) устройство для доставки композиции или препарата к месту отложения жира.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен набор, содержащий: (I) первый контейнер, содержащий композицию или препарат для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где композиция или препарат содержит: (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли имеет ту же массу, что и фосфатидилхолин или менее; и (II) устройство для доставки композиции или препарата к месту отложения жира.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен способ получения инъецируемой композиции для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта (отек; потеря чувствительности в месте введения; обширная отечность; эритема; уплотнение; парестезия; узелковое уплотнение; зуд; ощущение жжения; повреждение нерва; дисфагия и некроз мышечных клеток, фибробластов и сосудистых эндотелиальных клеток, отличных от адипоцитов), где способ включает стадии: (а) добавление по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (ТСА) и их соли к воде для инъекций с последующим растворением при перемешивании для получения прозрачной смеси; (b) добавление консерванта с последующим перемешиванием; (c) добавление фосфатидилхолина с последующим перемешиванием при комнатной температуре; и (d) доведение общего объема композиции водой с последующим перемешиванием, где молярное отношение по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, к фосфатидилхолину составляет от 0,7 до 3,0.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен способ получения фармацевтической композиции для нехирургического удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где способ включает добавление фосфатидилхолина и по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли,

где по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, имеет ту же массу, что и фосфатидилхолин, или менее.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен способ удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где способ включает введение эффективного количества фосфатидилхолина, и по меньшей мере одного солюбилизирующего фосфатидилхолин агента, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, субъекту, имеющему локализованное отложение жира.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен способ нехирургического удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, имеющего локализованное отложение жира, где способ включает введение препарата, содержащего (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечен способ нехирургического удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, где способ включает введение препарата, содержащего (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, субъекту, имеющему локализованное отложение жира, где молярное отношение (ii) к (i) в препарате составляет 0,7 до 3,0.

В одном варианте осуществления препарат содержит фосфатидилхолин в концентрации от 1,0 до приблизительно 15,0 %, при которой лизируется жир.

В одном варианте осуществления препарат представляет собой инъецируемый препарат. В другом варианте осуществления препарат представляет собой инъецируемый препарат для уменьшения адипоцитов.

Настоящее изобретение также относится к способу нехирургического уменьшения локализованного отложения жира у субъекта, имеющего локализованное отложение жира.

В одном варианте осуществления способ включает введение препарата, содержащего по меньшей мере одну композицию фосфатидилхолина, солюбилизированного гликохолевой кислотой или таурохолевой кислотой, в фармацевтически приемлемом препарате, имеющем значение рН от 6,0 до 9,0.

В одном варианте осуществления способ введения включает подкожную инъекцию.

В одном варианте осуществления локализованное отложение жира выбрано из группы, состоящей из грыжи жировой клетчатки нижнего века, липом, липодистрофии и отложений жира, связанных с целлюлитом.

В одном варианте осуществления отложение жира локализовано под глазами, субментально (под подбородком), под руками, на ягодицах, икрах, спине, бедрах, лодыжках или животе субъекта.

Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему письменное описание по применению препарата, содержащего по меньшей мере одну композицию фосфатидилхолина, солюбилизированного гликохолевой кислотой или таурохолевой кислотой, для нехирургического удаления локализованного отложения жира у субъекта.

Техническое решение

В соответствии с аспектом настоящего изобретения обеспечена композиция для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта (отек; потеря чувствительности в месте введения; обширная отечность; эритема; уплотнение; парестезия; узелковое утолщение; зуд; ощущение жжения; повреждение нерва; дисфагия и некроз мышечных клеток, фибробластов и сосудистых эндотелиальных клеток, отличных от адипоцитов), где композиция содержит: (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечен препарат для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, где препарат содержит: (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где молярное отношение (ii) к (i) в препарате составляет от 0,7 до 3,0.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечен набор, содержащий: (I) первый контейнер, содержащий композицию или препарат для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где композиция или препарат содержит: (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где молярное отношение (ii) к (i) в композиции или препарате составляет от 0,7 до 3,0; и (II) устройство для доставки композиции или препарата к месту отложения жира.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечен набор, содержащий: (I) первый контейнер, содержащий композицию или препарат для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где композиция или препарат содержит: (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, имеет ту же массу, что и фосфатидилхолин или менее; и (II) устройство для доставки композиции или препарата к месту отложения жира.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечен способ получения инъецируемой композиции для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта (отек; потеря чувствительности в месте введения; обширная отечность; эритема; уплотнение; парестезия; узелковое утолщение; зуд; ощущение жжения; повреждение нерва; дисфагия и некроз мышечных клеток, фибробластов и эндотелиальных клеток сосудов, отличных от адипоцитов), где способ включает стадии: (а) добавление по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, к воде для инъекций с последующим растворением при перемешивании для получения прозрачной смеси; (b) добавление консерванта с последующим перемешиванием; (с) добавление фосфатидилхолина с последующим перемешиванием при комнатной температуре; и (d) доведение общего объема композиции водой с последующим перемешиванием, где молярное отношение по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, к фосфатидилхолину составляет от 0,7 до 3,0.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечен способ получения фармацевтической композиции для нехирургического удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, включающий добавление фосфатидилхолина и по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы состоящий из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, где по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, имеет ту же массу, что и фосфатидилхолин, или менее.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечен способ удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, включающий введение эффективного количества фосфатидилхолина и по меньшей мере одного солюбилизирующего фосфатидилхолин агента, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, субъекту, имеющему локализованное отложение жира.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечен способ нехирургического удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, имеющего локализованное отложение жира, где способ включает введение препарата, содержащего (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечен способ нехирургического удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, где способ включает введение препарата, содержащего (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, субъекту, имеющему локализованное отложение жира, где молярное отношение (ii) к (i) в препарате составляет от 0,7 до 3,0.

Определения

Термин "фосфатидилхолин" в настоящем изобретении относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием 1,2-диацил-sn-глицеро-3-фосфохолин в качестве фосфолипида и в настоящем описании обозначен как PPC.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем описании, могут быть использованы при практическом применении или испытании настоящего изобретения, в данном документе описаны предпочтительные способы и материалы.

В контексте настоящего документа, каждый из следующих терминов имеет значение, связанное с ним в этом разделе.

Форма единственного числа применяется в данном документе для обозначения одного или более (т.е. по меньшей мере одного) грамматического объекта. В качестве примера, "элемент" относится к одному элементу или более.

При ссылке на измеряемые величины, такие как количество, продолжительность времени и т.д., термин "приблизительно" означает охват вариантов ±20 %, ±10 %, ±5 %, ±1 % или ±0,1 % от указанного значения, так как такая вариация подходит для осуществления указанного способа.

Заболевание или расстройство "облегчено", если тяжесть симптомов заболевания или расстройства, частота таких симптомов, испытываемых пациентом, или и то и другое снижаются.

В контексте настоящего документа термин "желчная кислота" включает стероидные кислоты (и/или их карбоксикислотные анионы) и их соли, встречающиеся в желчи животного (например, человека). "Дезоксихолевая кислота" представляет собой разновидность желчной соли и относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием (4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-дигидрокси-10,13-диметил-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил]пентановая кислота и в настоящем описании обозначено как DCA.

"Гликохолевая кислота" представляет собой разновидность желчной соли и относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием 2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-тригидрокси-10,13-диметил-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил]пентаноил]амино]уксусная кислота и в настоящем описании обозначено как GCA.

"Таурохолевая кислота" представляет собой разновидность желчной соли и относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием 2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-тригидрокси-10,13-диметил-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил]пентаноил]амино]этансульфоновая кислота и в настоящем описании обозначено как ТСА.

"Холиевая кислота" представляет собой разновидность желчной соли и относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием (4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-тригидрокси-10,13-диметил-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил]пентановая кислота и в настоящем описании обозначено как CA.

"Хенодезоксихолевая кислота" представляет собой разновидность желчной соли и относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием ((4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-дигидрокси-10,13-диметил-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил]пентановая кислота и в настоящем описании обозначено как CDCA.

"Урсодезоксихолевая кислота" представляет собой разновидность желчной соли и относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием (4R)-4-[(3R,5S,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-дигидрокси-10,13-диметил-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил]пентановая кислота и в настоящем описании обозначено как UDCA.

"Гликодезоксихолевая кислота" представляет собой разновидность желчной соли и относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием 2-[[(4R)-4-[(3R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-дигидрокси-10,13-диметил-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил]пентаноил]амино]уксусная кислота и в настоящем описании обозначено как GDCA.

"Тауродезоксихолевая кислота" представляет собой разновидность желчной соли и относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием 2-[[(4R)-4-[(3R,5R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-дигидрокси-10,13-диметил-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил]пентаноил]амино]этансульфоновая кислота и в настоящем описании обозначено как TDCA.

"Гиодезоксихолевая кислота" представляет собой разновидность желчной соли и относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием (4R)-4-[(3R,5R,6S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-3,6-дигидрокси-10,13-диметил-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил]пентановая кислота и в настоящем описании обозначено как HDCA.

"Литохолевая кислота" представляет собой разновидность желчной соли и относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием ((4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3-гидрокси-10,13-диметил-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил]пентановая кислота и в настоящем описании обозначено как LCA.

"Тауроурсодеоксихолевая кислота" представляет собой разновидность желчной соли и относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием 2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-дигидрокси-10,13-диметил-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил]пентаноил]амино]этансульфоновая кислота и в настоящем описании обозначено как TUDCA.

"Дегидрохолевая кислота" представляет собой разновидность желчной соли и относится по номенклатуре ИЮПАК к соединению под названием (4R)-4-[(5S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-диметил-3,7,12-триоксо-1,2,4,5,6,8,9,11,14,15,16,17-додекагидроциклопента[а]фенантрен-17-ил]пентановая кислота и в настоящем описании обозначено как DHCA.

Термины "пациент", "субъект", "индивидуум" и т.п. используются в контексте настоящего документа взаимозаменяемо и относятся к любому животному или его клетке (например, in vitro или in situ), которые доступны в способах, описанных в настоящем документе. В определенных неограничивающих вариантах осуществления пациентом, субъектом или индивидуумом является человек.

Термин "композиция" или "фармацевтическая композиция", используемый в контексте настоящего документа, может относиться к смеси по меньшей мере одного соединения или композиции по настоящему изобретению с другими химическими компонентами, такими как любые дополнительные носители, стабилизаторы, суспендирующие вещества, диспергирующие вещества, суспендирующие вещества, загустители и/или наполнители и т.п. Фармацевтическая композиция способствует введению соединения в организм.

Используемые в контексте настоящего документа термины "эффективное количество", "фармацевтически эффективное количество" и "терапевтически эффективное количество" относятся к нетоксичному и достаточному количеству вещества для обеспечения желаемых биологических результатов. Результатом может быть уменьшение и/или облегчение признака, симптома или причины заболевания, или любое другое желаемое изменение биологической системы. Подходящее терапевтическое количество в любом отдельном случае может быть определено специалистом в данной области техники с применением рутинного экспериментирования.

Используемый в контексте настоящего документа термин "эффективность" может относиться к максимальному эффекту (Emax), достигнутому в рамках исследования.

Используемый в контексте настоящего документа "учебный материал" включает публикацию, запись, диаграмму или любое другое средство представления, которое можно применять для сообщения пользы соединения, композиции, вектора или системы доставки в наборе по настоящему изобретению для облегчения различных заболеваний или расстройств, упомянутых в контексте настоящего документа. Выборочно или альтернативно, учебный материал может описывать по меньшей мере один способ облегчения заболевания или расстройства в клетке или ткани млекопитающего. Учебный материал набора по настоящему изобретению может быть прикреплен, например, к контейнеру, содержащему идентифицированное соединение, композицию, вектор или систему доставки по настоящему изобретению, или может поставляться вместе с контейнером, содержащим соединение, композицию, вектор или систему доставки.

Альтернативно, учебный материал может быть отправлен отдельно от контейнера с намерением, чтобы вещество и соединение (композицию) получатель применял совместно.

Термин "локальное введение" относится к введению пациенту несистемным путем фармацевтического ингредиента в мышцу или подкожное пространство, или поблизости. Таким образом, локальное введение исключает системные пути введения, такие как внутривенное или пероральное введение.

Термин "фармацевтически приемлемый" относится к тем свойствам и/или веществам, которые являются приемлемыми для пациента с фармакологической/токсикологической точки зрения, и фармацевта химика-технолога с физической/химической точки зрения в отношении композиции, состава, стабильности, переносимости пациентом и биодоступности. "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к среде, которая не препятствует эффективности биологической активности активного(ых) ингредиента(ов) и не является токсичной для хозяина, которому его вводят.

"Терапевтическое" лечение представляет собой лечение, назначаемое субъекту, который проявляет признаки или симптомы патологии, с целью уменьшения или устранения этих признаков или симптомов.

Используемый в контексте настоящего документа термин "лечение" или "обеспечение лечения" определяется как применение или введение терапевтического агента, то есть соединения по настоящему изобретению (отдельно или в комбинации с другим фармацевтическим агентом), пациенту или применение или введение терапевтического агента в выделенную ткань или клеточную линию от пациента (например, для диагностики или применения ex vivo), который характеризуется рассматриваемым в настоящем документе состоянием, симптомом рассматриваемого в настоящем документе состояния или потенциалом для развития рассматриваемого в настоящем документе состояния, с целью вылечить, исцелить, облегчить, ослабить, обратить, устранить, улучшить, усовершенствовать или повлиять на рассматриваемое в настоящем документе состояние, симптомы рассматриваемого в настоящем документе состояния или потенциал для развития рассматриваемого в настоящем документе состояния. Такие способы лечения могут быть специально адаптированы или модифицированы на основе знаний, полученных в области фармакологии.

Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения по настоящему изобретению, которое при введении пациенту сглаживает симптом заболевания. Количество соединения по настоящему изобретению, которое составляет "терапевтически эффективное количество", будет варьироваться в зависимости от соединения, состояния заболевания и его тяжести, возраста пациента, подлежащего лечению, и т.п. Терапевтически эффективное количество может быть определено специалистом в данной области техники рутинным способом с учетом его собственных знаний и данного раскрытия.

Диапазоны: в настоящем документе, различные аспекты изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона предназначено только лишь для удобства и краткости и не должно рассматриваться как негибкое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как имеющее конкретно раскрытые все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в данном диапазоне. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, следует рассматривать как имеющее специфические раскрытые поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т. д., а также отдельные числа в данном диапазоне, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.

Термин "%", используемый в настоящем изобретении для выражения содержания композиции, означает содержание мас./об.%, если не указано иное, и означает значение мас./об.% от общей массы композиции, если не указано иное.

В настоящем изобретении символ "/" в выражении "по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты или таурохолевой кислоты и их соли/фосфатидилхолина", представляет собой дробное представление обычно используемой формы.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.

Применение Kybella (DCA 1,0 %), одобренного FDA цитолитического агента для улучшения внешности, и инъецируемой композиции PPC не по утвержденным показаниям (например, Lipostabil, Essential, Lipobean), солюбилизированного DCA, сопровождается болью и отеком вследствие воспалительной реакции, при их введении с целью уменьшения локализованного жира. Кроме того, они представляют собой неселективный цитолитический агент, вызывающий некроз фибробластов, клеток скелетных мышц, сосудистых эндотелиальных клеток, а также адипоцитов, и побочные эффекты со смертельным исходом, такие как некроз в месте введения, язвы и паралич нижней челюсти, а также повреждение нерва. По этой причине было рекомендовано не вводить лекарственные средства в слюнные железы, лимфатические узлы, мышцы или области, очень близко к ним расположенные, чтобы предотвратить возможное повреждение тканей, кроме жировой. Кроме того, субъекты, которые в настоящее время получают препарат Kybella, продолжают сообщать о побочных эффектах, таких как боль, отек, паралич лица и некроз кожи.

В связи с этим авторами настоящего изобретения было обнаружено, что композиция, содержащая только PPC (5,0 %) без солюбилизирующего агента, имела in vitro эффект по уменьшению адипоцитов, эквивалентный Kybella (DCA 1,0 %), но PPC избирательно индуцировал уменьшение адипоцитов по механизму апоптоза и деградации, а также была подтверждена возможность получения композиции для уменьшения жира без боли, отеков и побочных эффектов. Тем не менее, PPC имеет ограничение в получении композиции, которая является физически или химически стабильной и безопасной для инъекций, вследствие его плохой растворимости. Исходя из этого, автор настоящего изобретения изучал композицию для уменьшения адипоцитов, содержащую PPC в качестве основного компонента, начиная с 2010 года. В результате PPC, диспергированный в гомогенизаторе высокого давления, продемонстрировал влияние на уменьшение адипоцитов в зависимости от времени и концентрации, но существовало ограничение в промышленном применении из-за его низкой стабильности.

По этой причине авторы настоящего изобретения провели физические и химические испытания состава, чтобы получить композиции, в составе которых можно безопасно и стабильно подкожно вводить плохо растворимый PPC (фиг. 1-3). Данное исследование основано на предположении, что токсичность может быть выражена, в частности, поверхностной активностью желчной кислоты (соли). Поскольку свойство поверхностной активности ингибирует присущий PPC эффект апоптоза и деградации адипоцитов, и индуцирует лизис клеток посредством некроза, это приводит к локализованному расщеплению жира, сопровождающемуся болью, отеком и побочными эффектами. Таким образом, конкретные типы поверхностно-активных веществ и потенциал их применения (соотношение) вызывают значительные технические трудности для специалистов в данной области техники.

Результаты, представленные ниже в различных сравнительных примерах, примерах и экспериментальных примерах, демонстрируют неожиданные специфические воздействия композиций по настоящему изобретению. Кратко, авторы настоящего изобретения выбрали комбинацию желчной кислоты (соли), которая, как было обнаружено, не имеет побочных реакций in situ или имеет слабые побочные реакции in vivo при оценке выраженности отека, поражения и воспаления среди выбранных композиций, которые являются промышленно применимыми и безопасными, как было подтверждено в результате испытания препарата. Среди отобранных желчных кислот (солей), GCA и TCA выбирали для селективности адипоцитов при оценке жизнеспособности адипоцитов, фибробластов, эндотелиальных клеток и клеток скелетных мышц in vitro, а затем проверяли влияние композиций PPC, солюбилизированного GCA или TCA, на апоптоз адипоцитов и деградацию. Кроме того, было подтверждено, что комплексная композиция PPC, солюбилизированного GCA, по настоящему изобретению, не проявляет ни системную, ни локальную токсичность. Результаты клинических испытаний настоящего изобретения демонстрируют неожиданное открытие, что эффективность композиции по уменьшению жира не уступает препарату Kybella, и что применение композиции не сопровождается болью, отеками и побочными эффектами или эти проявления снижаются на 80 % или более. Далее это будет описано более подробно.

В результате испытаний желчных солей (холевая кислота (CA), дезоксихолевая кислота (DCA), гликохолевая кислота (GCA), таурохолевая кислота (TCA), хенодезоксихолевая кислота (CDCA), урсодезоксихолевая кислота (UDCA), гликодезоксихолевая кислота (GDCA), тауродезоксихолевая кислота (TDCA), гиодезоксихолевая кислота (HDCA), тауроурсодеоксихолевая кислота (TUDCA), литохолевая кислота (LCA) и дегидрохолевая кислота (DHCA), выбранных в качестве солюбилизирующего агента для PPC, было подтверждено, что LCA и DHCA не способны солюбилизировать PPC (фиг. 3A и 3B) и что CA, DCA, GCA, TCA, CDCA, UDCA, GDCA, TDCA, HDCA и TUDCA стабильно солюбилизируют PPC при определенном молярном отношении или более (фиг. 2A-2J).

Испытания in vivo на появление воспаления, отека и поражения проводили с применением CA, DCA, GCA, TCA, CDCA, UDCA, GDCA, TDCA, HDCA и TUDCA, которые представляют собой желчную кислоту, выбранную при испытании препарата. Среди желчных кислот, DCA представляет собой наиболее сильнодействующее поверхностно-активное вещество и, как сообщается, вызывает воспаление, отек и клинические побочные эффекты, вызванные неселективным лизисом клеток. Следовательно, авторам настоящего изобретения было известно, что добавки, проявляющие вредное побочное действие, например, DCA среди желчных кислот, не являются подходящими солюбилизирующими агентами, поскольку они ингибируют исходную активность PPC в отношении избирательного апоптоза и деградации адипоцитов. Затем, во-первых, осуществляли in vivo инъекции желчных кислот в различных концентрациях для изучения отеков, поражений кожи и воспалений, которые являются типичными примерами вредного побочного действия.

В результате испытания in vivo желчных кислот на появление отека (фиг. 4A-4G) через 2 часа после введения были выявлены следующие оценки:

"Нет" - комплексная композиция PPC (от 2,50 до 5,0 %), солюбилизированного GCA (от 1,25 до 2,5 %) или TCA (от 1,25 до 2,5 %),

"Легкий" - композиции, содержащие только PPC (от 1,25 до 10,0 %), GCA (1,0 %), TCA (1,0 %) и TUCA (1,0 %, 2,5 %), и комплексные композиции PPC (7,5 %, 10,0 %) плюс GCA (3,75 %, 5,0 %) и PPC (7,5 %, 10,0 %) плюс TCA (3,75 %, 5,0 %),

"Умеренный" - композиции, содержащие только PPC (12,5 %, 15,0 %), UDCA (1,0 %), GDCA (1,0 %), CDCA (1,0 %), CA (1,0 %), GCA (2,5 %, 5,0 %), TCA (2,5 %, 5,0 %) и TUDCA (5,0 %, 7,5 %), и комплексные композиции PPC (5,0 %) плюс CA (2,5 %), PPC (15,0 %) плюс GCA (7,5 %) и PPC (15,0 %) плюс ТС (7,5 %),

"Тяжелый" и "Крайне тяжелый" - другие односоставные композиции и комплексные композиции.

Авторами изобретения было неожиданно обнаружено, что комплексная композиция PPC (от 2,5 до 15,0 %) плюс GCA (от 1,25 до 7,5 %) (фиг. 4N) и комплексная композиция PPC (5,0 %) плюс GCA (от 2,5 до 7,5 %) (фиг. 4P) по настоящему изобретению при применении не приводят к появлению отека, в сравнении с PPC (5,0 %), солюбилизированным DCA (2,2 %), демонстрирующим появление крайне тяжелого отека. Авторами изобретения было неожиданно обнаружено, что степень отека, наблюдаемого при введении только GCA или TCA, резко снижается при введении комплексных композиций PPC плюс GCA и PPC плюс TCA. Тем не менее, композиция, содержащая только DCA, или композиция PPC 5,0 %, солюбилизированного DCA 2,2 %, продемонстрировала появление крайне тяжелого отека после введения, что свидетельствует о том, что DCA обладает эффектом индукции клеточного некроза и прерывания присущего для PPC избирательного апоптоза и деградации адипоцитов (фиг. 4M).

В результате испытания in vivo на появление поражения кожи (фиг. 5А-5F) через 2 часа после введения были выявлены следующие оценки:

"Нет" - композиции, содержащие только PPC (от 1,25 до 15,0 %), GCA (1,0 %), TCA (1,0 %) и TUDCA (от 1,0 до 7,5 %), а также комплексные композиции PPC (от 2,5 до 10,0 %) плюс GCA (от 1,25 до 5,0 %) и PPC (5,0 %) плюс GCA (от 2,5 до 5,0 %),

"Легкий" - композиции, содержащие только HDCA (1,0 %), CA (1,0 %), GCA (2,5 %, 5,0%) и TCA (2,5 %, 5,0 %) и комплексная композиция PPC (15,0 %) плюс GCA (7,5 %),

"Умеренный" - композиции, содержащие только DCA (1,0 %), UDCA (1,0 %), TDCA (1,0 %), GDCA (1,0 %), CDCA (1,0 %), CA (2,5 %), GCA (7,5 %) и TCA (7,5 %),

"Тяжелый" и "Крайне тяжелый" - другие односоставные композиции и комплексные композиции.

Полученные результаты соответствовали результатам испытания на появление отека, и было подтверждено, что подкожная инъекция комплексной композиции PPC плюс GCA или PPC плюс TCA ослабляла симптомы поражения по сравнению с композицией, содержащей только GCA или TCA.

В результате окрашивания гематоксилин-эозином (H&E) in vivo на появление воспаления (фиг. 6A-6F) были выявлены следующие оценки:

"Нет" - композиции, содержащие только PPC (от 2,5 до 7,5 %), TUDCA (от 1,0 до 5,0 %) и комплексные композиции PPC (от 2,5 до 7,5 %) плюс GCA (от 1,25 до 3,75 %), PPC (5,0 %) плюс GCA (от 2,5 до 7,5 %), PPC (5,0 %) плюс TCA (2,5 %) и PPC (5,0 %) плюс TUDCA (4,0 %),

"Легкий" - композиции, содержащие только PPC (10,0 %, 12,5 %), GCA (1,0 %), TCA (1,0 %) и TUDCA (7,5 %) и комплексные композиции PPC (10,0 %) плюс GCA (5,0 %), PPC (5,0 %) плюс GCA (10,0 %),

"Умеренный" - композиции, содержащие только PPC (15,0 %), TDCA (1,0 %), GDCA (1,0 %), CDCA (1,0 %), CA (1,0 %) и GCA (2,5 % и более) и TCA (2,5 % и более), а также комплексные композиции PPC (15,0 %) плюс GCA (7,5 %) и PPC (5,0 %) плюс CA (2,5 %),

"Тяжелый" и "Крайне тяжелый" - другие односоставные композиции и комплексные композиции.

Эти результаты согласуются с результатами испытаний на появление отека и поражения, доказывающими, что токсичность инъекции, содержащей только GCA или TCA, отсутствует и облегчается добавлением PPC, но при этом DCA или эквивалентные желчные кислоты вызывают появление боли, отека и побочных эффектов, вызываемых некрозом, который прерывает присущий PPC избирательный апоптоз и деградацию адипоцитов.

В результате испытания in vitro на жизнеспособность адипоцитов на композициях, содержащих PPC, солюбилизированный с помощью солюбилизирующих агентов TUDCA, TCA и GCA, выбранных на основе вышеуказанного испытания препарата, а также результатов испытаний in vivo желчных кислот в отношении появления отека, воспаления и поражения кожи, группа композиции, содержащей только PPC, группа PPC, солюбилизированного GCA или TCA, показали снижение жизнеспособности адипоцитов в зависимости от времени и концентрации (фиг. 7A-7D). Авторами изобретения было неожиданно обнаружено, что TUDCA ингибирует апоптоз и деградацию адипоцитов. В связи с этим были опубликованы результаты исследования по ингибированию апоптоза клеток с помощью TUDCA (Andrew L.Rivard, Administration of Tauroursodeoxycholic acid reduced apoptosis following myocardial infarction in rat, The American Journal of Chinese Medicine, Vol. 35, No. 2, 279-295, 2007), предполагающие, что PPC действует по-разному на некроз клеток и апоптоз.

Отдельно PPC 5,0 %, PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 % и PPC 15,0 % плюс TCA 7,5 % показали сходные с DCA 1,0 % активности в отношении уменьшения адипоцитов в течение 96 часов. Таким образом, группа только PPC 5,0 % и PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 % показали ту же жизнеспособность адипоцитов, что и препарат Kybella (DCA 1,0 %), который представляет собой цитолитический агент, одобренный FDA, для улучшения внешности, и не выявлено статистически достоверных различий в воздействии на уменьшение адипоцитов в этих экспериментальных группах (фиг. 7Е). По общим результатам, важно выбрать солюбилизирующий агент, который выбран для получения PPC в качестве инъецируемой композиции для локализованного уменьшения жира, из желчных кислот с низкой токсичностью, таких которые не прерывают присущий для PPC избирательный апоптоз и деградацию адипоцитов вследствие некроза (или такая токсичность может быть нейтрализована с помощью PPC) и могут обеспечить безопасность и стабильность композиции. Таким образом авторами было неожиданно обнаружено, что следует выбирать солюбилизирующий агент без отрицательной трансформации (PPC плюс DCA) или ингибирующей (PPC плюс TUDCA) активности, такой как некроз, в отношении присущего для PPC эффекта уменьшения содержания жира.

В результате теста in vitro на жизнеспособность адипоцитов на композиции, содержащей только GCA, при молярном отношении, смешанном для солюбилизации PPC, GCA показал снижение жизнеспособности адипоцитов в зависимости от времени и концентрации. Не выявлено статистически достоверных различий в жизнеспособности адипоцитов между композицией, содержащей только PPC, и композицией, содержащей PPC, солюбилизированный GCA (фиг. 7F-7H). То есть воздействие на апоптоз адипоцитов композиции, содержащей только PPC, и композиции, содержащей PPC, солюбилизированный GCA, было одинаковым. Для того, чтобы исследовать влияние GCA на уменьшение адипоцитов в композиции по настоящему изобретению, наблюдали влияние PPC с увеличением ввода GCA на уменьшение адипоцитов. В результате испытания на жизнеспособность адипоцитов через 96 часов воздействия комплексной композиции PPC (5,0 %), солюбилизированного GCA (от 2,5 до 8,75 %), и композиции, содержащей только PPC (5,0 %), не было выявлено статистически достоверного влияния комплексной композиции, содержащей PPC (5,0 %), солюбилизированный GCA (от 2,5 до 7,5 %), по сравнению с композицией, содержащей только PPC (5,0 %). То есть группы были равны по влиянию на апоптоз адипоцитов. Однако группа, обработанная PPC (5,0 %), солюбилизированным GCA (8,75 %), продемонстрировала статистически достоверное различие относительно влияния на апоптоз адипоцитов (фиг. 7I). Эти результаты предполагают, что положительная эффективность PPC может быть нарушена, когда молярное отношение GCA/PPC составляет 3,04 моль/моль (PPC 5,0 % плюс GCA 8,75 %) или более.

Согласно ранее полученным результатам, DCA или композиция, содержащая PPC, солюбилизированный DCA, вызывает клинически несовместимые с жизнью побочные эффекты, лизируя не только адипоциты, но также фибробласты, клетки скелетных мышц и сосудистые эндотелиальные клетки. В результате исследования жизнеспособности клеток при воздействии композиции, содержащей только PPC, и комплексной композиции, содержащей PPC, солюбилизированный GCA, авторами было неожиданно обнаружено, что PPC плюс GCA избирательно уменьшает адипоциты, в отличие от PPC плюс DCA (фиг. 8A-8D). Композиция по настоящему изобретению представляет собой композицию для избирательного уменьшения адипоцитов, вызывающую безопасное уменьшение жира без таких несовместимых с жизнью побочных эффектов, как кожный некроз, паралич нижнечелюстного нерва, дисфагия, вызванных коммерчески доступным цитолитическим агентом Lipostabil® N, iv (PPC плюс DCA) и Kybella iv (DCA).

Чтобы оценить, было ли уменьшение адипоцитов вызвано некрозом или апоптозом и деградацией, наблюдали влияние на апоптоз адипоцитов через активность каспазы 3 и влияние на липолиз адипоцитов через высвобождение глицерина.

Композиция, содержащая только PPC, и комплексная композиция, содержащая PPC плюс GCA, продемонстрировали влияние на индукцию активности каспазы-3 в зависимости от времени до значительного уровня. Однако, комплексная композиция, содержащая PPC плюс DCA, ингибировала активность капазы-3 по сравнению с PPC или PPC плюс GCA. Интересно, что DCA 1,0 % показала некоторое повышение активности каспазы-3 до 24 часов, но через 48 часов активность каспазы-3 возвращалась к уровням, определяемым до обработки. Считается, что это явление связано с тем фактом, что действие против клеточного апоптоза частично наблюдается до 24 часов сразу после обработки композицией, содержащей только DCA, а затем наступает некроз клетки вследствие воспалительной реакции (фиг. 10A и 10B).

Через 24 часа после обработки испытуемые материалы, за исключением DCA 1,0 % и PPC 5,0 % плюс GCA 5,0 %, индуцировали секрецию глицерина аналогичным образом. Через 48 часов после обработки группы только PPC, PPC плюс DCA, только DCA и только GCA продемонстрировали немного более высокую цитолитическую активность, чем через 24 часа. В частности, группа PPC плюс GCA продемонстрировала гораздо более высокий апоптотический эффект на клетки, чем композиция, содержащая только PPC (фиг. 10C и 10D).

В результате, композиция, содержащая только PPC, и комплексная композиция, содержащая PPC плюс GCA, способствовали специфическому эффекту уменьшения адипоцитов вследствие апоптоза и липолиза, что отличается от некроза, вызываемого композицией, содержащей PPC плюс DCA. При таком механизме было обнаружено, что, когда композицию по настоящему изобретению вводят в подкожный жировой слой, жир расщепляется без появления боли, отека и побочных эффектов.

Основываясь на эффекте уменьшения адипоцитов in vitro, гистопатологические исследования гематоксилин-эозином (H&E) in vivo осуществляли с применением композиции, содержащей только PPC (2,5 %, 5,0 %, 10,0 % и 15,0 %), PBS (отрицательный контроль) и Isuprel (положительный контроль), DCA 1,0 %, GCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс DCA 2,2 %, PPC 5,0 % плюс HDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс UDCA 3,0 %, PPC 5,0 % плюс TDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс GDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс CDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс CA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс TUDCA 4,0 %, PPC 5,0 % плюс TCA 2,5 % и PPC (от 2,5 до 10,0 %) плюс GCA (от 1,25 до 5,0 %). В результате, в жировой ткани, в которую инъецировали композицию, содержащую только DCA, или комплексную композицию PPC плюс DCA, было выявлено сильное воспаление в области введения, клетки растворялись в результате некроза и начиналось значительное разрушение. Композиция, содержащая только DCA, показала сильный уровень воспаления, даже несмотря на низкую концентрацию DCA, равную 1 %, и индукция воспаления была выше, чем для композиции, содержащей только GCA. Для комплексной композиции PPC плюс GCA выявлено, что жировые клетки стали меньше, четко наблюдались апоптотические клетки, и адипоциты превратились в адипоциты, образованные слиянием разрушенных адипоцитов, степень индукции воспаления была низкой при всех концентрациях обработки, и было обнаружено, что морфологическим повреждениям подвержена только мембрана адипоцитов (фиг. 11A-11D).

Взятые вместе результаты испытания состава, результаты испытаний in vivo на появление отека, воспаления и поражения кожи, результаты испытаний in vitro на жировых клетках, мышечных клетках, фибробластах, результаты испытаний жизнеспособности эндотелиальных клеток и результаты гистопатологического исследования H&E in vivo скопления жировой ткани, подтверждают, что комплексная композиция PPC, солюбилизированного GCA, по настоящему изобретению имеет заметно более низкую местную токсичность по сравнению с комплексной композицией PPC, солюбилизированного зарегистрированным препаратом DCA, и композицией, содержащей только GCA. Чтобы проверить эти результаты в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики (НЛП), было проведено исследование токсического действия композиции при однократном введении на собаках породы бигль путем расчета терапевтической дозы. В результате было подтверждено, что комплексная композиция по настоящему изобретению не имела токсического действия (фиг. 12A-12C).

Для оценки выраженности болевого синдрома in vivo, после введения каждой экспериментальной композиции измеряли расстояние и скорость движения мышей. За исключением показателей для композиции, содержащей только PPC, и композиций GCA плюс PPC, расстояние и скорость движения были значительно уменьшены во всех экспериментальных группах по сравнению с показателями до введения. И результаты показали, что расстояние и скорость движения не изменились или незначительно увеличились в группе, получавшей композицию, содержащую только PPC 5,0 %, композиции PPC 5,0 % плюс TUDCA 4,0 %, PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 % или PPC 5,0 % плюс TCA 2,5 %. С другой стороны, расстояние и скорость движения снижались на 20 % в группе мышей, получавших PPC 5,0 % плюс DCA 2,2 %, PPC 5,0 % плюс HDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс UDCA 3,0 %, PPC 5,0 % плюс TDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс GDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс CDCA 2,5 % или PPC 5,0 % плюс CA 2,5 %, и было установлено, что активность снизилась из-за болевого синдрома (фиг. 13A и 13B).

На основании результатов испытаний состава, результатов испытаний in vivo на появление отека, воспаления и поражения кожи, результатов испытаний in vitro на жировых клетках, мышечных клетках, фибробластах, результатов испытаний жизнеспособности эндотелиальных клеток и результатов гистопатологического исследования H&E in vivo скоплений жировой ткани, результатов испытания токсического действия композиции при однократном введении и результатов оценки боли, безопасность и эффективность оценивали до и после введения человеку для клинической валидации. Результаты клинических исследований показали, что через 12 недель после инъекции в жировой слой под подбородком, 0,2 см³, интервал 1 см, глубина от 6 до 8 мм, всего 50 точек, доза 10 мл, 6 раз с интервалом 4 недели, было визуально подтверждено уменьшение жирового слоя под подбородком (фиг. 14A). Уровень удовлетворенности результатом субъекта составил 4 из 5, а улучшение после сравнения с фотографиями до введения дозы было оценено как 1,5 балла (фиг. 14A). Кроме того, по данным компьютерной томографии содержание жирового слоя под подбородком уменьшилось на 30,36 %, с 5,6 мм до введения до 3,9 мм через 12 недель после последнего введения (фиг. 14B).

Для шести пациентов мужского и женского пола, которые получали инъецируемую композицию PPC, солюбилизированного DCA (продукты, ранее выпущенные на рынок), проводили клиническую оценку боли, отека и побочных эффектов после введения инъецируемой композиции PPC, солюбилизированного GCA, по настоящему изобретению. После местной анестезии с применением 9,6 % лидокаиновой мази в течение 30 минут или более субъектам, имеющим опыт инъецирования композиции (PPC 2,5 % плюс DCNa 1,2 %), включающей физиологический раствор и Lipobean® (инъекция PPC 5,0 %, солюбилизированного DCNa 2,4 %), смешанный в соотношении 1:1 в область живота и боков (интервал 1,5 см, глубина от 10 до 12 мм, 0,5 см³ на точку, от 50 мл до 100 мл на введение) с помощью шприца, снабженного иглой 13 мм, или в жировой слой под подбородком (интервал 1,0 см, глубина от 6 до 8 мм, 0,2 см³ на точку, 10 мл на введение), вводили композицию по настоящему изобретению (инъекция PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA 2,8 %, или инъекция PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA 4,0 %) субъектам тем же способом введения. В результате испытания субъекты, получившие инъекцию композиции PPC, солюбилизированного DCNa, жаловались на боль и отек, особенно во время введения и через 10 дней после введения, а также на поражения кожи, такие как эритема, гематома, синяки и местные повреждения, такие как уплотнения, узелковые утолщения, зуд и жжение. Неожиданным было то, что субъекты, получившие инъекции PPC, солюбилизированного GCA по настоящему изобретению, ощущали слабовыраженные и по существу отсутствующие болевой синдром (фиг. 15A) и отек (фиг. 15B). Таким образом безопасность была улучшена на 80 % или более по сравнению с группой, которая получала инъекцию PPC, солюбилизированного DCA, и о серьезных побочных реакциях среди субъектов не сообщалось (фиг. 15A-15C). В частности, не выявлено никаких побочных эффектов, таких как отек, гематома, кровоподтеки, эритема, парестезия, уплотнение, узелковые утолщения и зуд, или выявлено на достоверно низком уровне.

В дополнение, не выявлено визуальных повреждений кожи при введении PPC, солюбилизированного GCA, в живот и по бокам при 0,5 см³, с интервалом 1,5 см, глубиной 12 мм, всего 200 точек, доза 100 мл (фиг. 16). Как показано на фиг. 16, эритема была уменьшена до нулевой или легкой степени, за исключением синяка, вызванного самой инъекционной иглой, или повреждения кровеносных сосудов, вызванного повреждением сосудов во время инъекции. Не выявлено парестезии, широкого отека, уплотнения, парестезии, узелковых утолщений, зуда, ощущения жжения, дисфагии и т.п. (фиг. 15C).

Таким образом, композиция по настоящему изобретению представляет собой инновационное изобретение, которое избирательно уменьшает адипоцит путем апоптоза и деградации, уменьшает беспокойство и дискомфорт пациента, улучшает соблюдение пациентом режима терапии и обладает стабильностью состава. И композиция по настоящему изобретению не вызывает болевого синдрома и отека, которые являются следствием воспаления после введения обычной инъецируемой композиции DCA или PPC, солюбилизированного DCA, и обширной отечности, эритемы, дискомфорта, такого как синяк и потеря чувствительности, уплотнения, парестезии, узелковых утолщений, зуда, ощущения жжения, повреждения нерва и дисфагии, вызванных неселективной цитолитической активностью.

Таким образом, обеспечена композиция для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где композиция содержит:

(i) фосфатидилхолин; и

(ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли,

где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0.

Кроме того, обеспечена композиция для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где композиция по существу состоит из:

(i) фосфатидилхолина; и

(ii) по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли,

где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0.

В частности, обеспечена композиция для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где композиция содержит:

(i) фосфатидилхолин;

(ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли; и

(iii) воду (или воду для инъекций),

где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0.

Кроме того, обеспечена композиция для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где композиция по существу состоит из:

(i) фосфатидилхолина;

(ii) по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли; и

(iii) воды (или воды для инъекций),

где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0.

Инъецируемую композицию, уменьшающую жир, по настоящему изобретению можно наносить на локализованную область и предпочтительно наносить на жировое отложение, липому, расположенную, но не ограниченную ими, на животе, под подбородком, предплечье, бедре, талии, боковой поверхности бедра, под глазом, линии бюстгальтера и т.п. и можно применять для коррекции морщин на шее.

Композицию по настоящему изобретению предпочтительно применяют для нехирургического удаления локализованного отложения жира у субъекта. Термин "нехирургический" относится к медицинской процедуре, которая не требует разреза.

Состав композиции по настоящему изобретению конкретно не ограничен при условии, что ее применяют с целью уменьшения жира (в частности, уменьшения локализованного жира), и включает, например, инъекцию, такую как пластырь, депо и т.д. и предпочтительно представляет собой инъецируемую композицию. То есть настоящее изобретение относится к композиции или препарату, которые можно инъецировать непосредственно в место лечения пациента, нуждающегося в удалении жира, без хирургического вмешательства.

Инъецируемая композиция для уменьшения локализованного жира по настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию для лечения гиперплазии жировой ткани или гиперпролиферативного расстройства (заболевания), причем расстройство конкретно не ограничено, если в данной области техники известно, что оно является гиперпролиферативным или гипераккумулятивным патологическим заболеванием жировой ткани, например, но не ограничиваясь ими, ожирение (абдоминальное ожирение), опущение нижнего века, липома, болезнь Деркума, диффузная липома шеи, жировой отек, множественные жировые узелковые утолщения, ксантоз, жировая дистрофия, накопление жира, связанное с целлюлитом, и т.п.

Способы введения инъецируемой композиции по настоящему изобретению не ограничены, но могут быть введены способом, подходящим для пациента, с учетом тяжести заболевания, возраста, пола и других состояний пациента. Такой способ введения конкретно не ограничен, но предпочтительно введение осуществляют непосредственно в подкожный жировой слой (ткань), например, с помощью многократных, подкожных или внутрикожных инъекций с интервалами от 0,5 до 2,0 см в виде решетки.

В настоящем изобретении термин "побочный эффект" относится к побочным эффектам препаратов PPC, которые содержат определенные соли желчных кислот, которые известны или коммерчески доступны, в частности обычные инъекции PPC, солюбилизированного DCA (например, Lipostabil, Essential, Lipobean) или препарат, содержащий только DCA (например, Kybella), известные как инъекции для уменьшения локализованного жира. И это относится к вредному действию на организм человека, которое отличается от основного действия, ожидаемого в качестве терапевтического эффекта лекарственного средства (в настоящем изобретении эффект уменьшения жира). В частности, побочным эффектом является по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из отека, потери чувствительности (особенно потери чувствительности в местах введения), обширной отечности, эритемы, гематомы, синяков, уплотнения, сенсорных отклонений, узелковых утолщений, зуда, ощущения жжения, дисфагии и некроза клеток, отличных от адипоцитов (мышечные клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки сосудов и т.д.) и т.п., за исключением, но не ограничиваясь ими, гематомы и синяка, вызванных применением самой инъекционной иглы. Инъецируемая композиция для уменьшения локализованного жира по настоящему изобретению отличается тем, что местные побочные реакции смягчаются до такой степени, что побочные эффекты по существу отсутствуют.

Используемый здесь термин "облегчение боли и побочных эффектов" означает, что боль и побочные эффекты понижаются, устраняются, присутствуют на низком уровне (частично удалены), по существу отсутствуют (по существу удалены) и полностью отсутствуют (полностью удалены).

В настоящем изобретении болевой синдром и отек включают болевой синдром во время инъекции и болевой синдром и отек после введения. Настоящее изобретение характеризуется значительным понижением болевого синдрома и отека (по существу без боли и отека) в отличие от обычных коммерчески доступных композиций, содержащих только DCA, или инъекций PPC, солюбилизированного DCA, которые приводят к появлению боли и отека. Такие инъекции PPC, не приводящие к появлению болевого синдрома и отеков, впервые раскрыты в настоящем изобретении, и, в частности, они отличаются тем, что при их применении отсутствуют вторичная боль и отек, длящиеся более 10 дней вследствие воспаления, а также первичная боль во время инъекции и сразу после введения. В настоящем изобретении значение боли отличается от симптомов, вызванных проникновением иглы (например, болезненность, синяк от иглы, гематома от иглы, отечность от иглы), но относится к понятию боли или отека (воспаления), которые вызваны особенностью инъецируемой композиции, содержащей только DCA, или инъецируемой композиции DCA плюс PPC. В одном варианте осуществления настоящего изобретения во время инъекции комплексной композиции PPC плюс GCA по настоящему изобретению, субъекты практически не испытывали боли по сравнению с коммерчески доступной "инъекцией PPC, солюбилизированного DCA", применяемой в качестве контрольной группы (фиг. 15А). Принимая во внимание, что комплексный препарат по настоящему изобретению аналогичен существующим коммерчески доступным препаратам (типичный пример инъекции PPC, солюбилизированного DCNa) по характеристикам частиц (мицелла, размер частиц и т.д.) и тем, что все инъекции вводят при значении pH, соответствующем организму человека, воздействие композиции по настоящему изобретению трудно предсказать исходя из ранее известных способов.

Кроме того, композиция по настоящему изобретению отличается тем, что вызывает апоптоз и липолиз непосредственно в адипоцитах. В одном варианте осуществления настоящего изобретения комплексный препарат PPC плюс GCA по настоящему изобретению существенно не влияет на другие клетки, кроме адипоцитов, таких как фибробласты, клетки скелетных мышц и эндотелиальные клетки сосудов, и было подтверждено, что индукция апоптоза и липолиза была непосредственно эффективна только в адипоцитах (см. фиг. 8A-8D). Этот эффект сопоставим с препаратами PPC, солюбилизированного другими желчными кислотами (например, коммерчески доступные препараты PPC плюс DCA), которые вызывают некроз в других клетках, отличных от адипоцитов. Впервые раскрыто в настоящем изобретении, что при определенных соотношениях GCA и PPC, препарат обладает специфическим к адипоцитам (избирательным) воздействием.

Инъецируемые препараты получают путем растворения основных лекарственных средств (в настоящем изобретении PPC, солюбилизированного GCA) и, при необходимости, других добавок в воде для инъекций, фильтрации раствора с помощью бактериального фильтра, стерилизации раствора, наполнения раствором флакона, ампулы или свободной области шприца с последующей герметизацией. Таким образом при получении инъекций можно применять воду для инъекций, а также воду можно применять для заполнения оставшегося количества. Вода для инъекций не имеет особых ограничений, если она представляет собой дистиллированную воду для инъекций или буферный раствор для инъекций, предназначенный для разбавления твердых инъекций или водорастворимых инъецируемых растворов. Например, можно применять фосфатно-буферный раствор или дигидрофосфат натрия (NaH₂PO₄) при значении рН от 3,5 до 7,5, буферный раствор лимонной кислоты или т.п. Фосфат, в контексте данного документа, может быть в форме натриевой соли или калиевой соли, или может быть в форме ангидрида или гидрата и может быть в форме лимонной кислоты или ангидрида, или гидрата. Примеры воды для инъекций включают, но не ограничиваются ими, инъекцию глюкозы, инъекцию ксилита, инъекцию D-маннита, инъекцию фруктозы, физиологический раствор, инъекцию декстрана 40, инъекцию декстрана 70, инъекцию аминокислоты, раствор Рингера и раствор Рингера с молочной кислотой.

В настоящем изобретении фосфатидилхолин (PPC) представляет собой фосфолипид, широко распространенный у животных, растений, дрожжей и грибов. Он также называется лецитин, полиенофосфатидилхолин и 3-sn-фосфатидилхолин и имеет основную структуру формулы 1. Он представляет собой мембранный фосфолипид млекопитающих, главным образом в мозге, нервах, клетках крови, яичном желтке и тому подобное. В растениях он содержится в соевых бобах, семечках, зародышах пшеницы и редко встречается в бактериях. Как правило, насыщенные жирные кислоты связаны с положением 1 глицерина, ненасыщенные жирные кислоты связаны с положением 2, и большинство ацильных групп представляют собой от С12 до С22 (от 12 до 22 атомов углерода).

Формула 1

Фосфатидилхолин по настоящему изобретению имеет структуру, представленную формулой 1, где R1 представляет собой насыщенную или ненасыщенную жирную кислоту, имеющую от 12 до 22 атомов углерода, и R2 представляет собой насыщенную или ненасыщенную жирную кислоту, имеющую от 12 до 22 атомов углерода. Насыщенная или ненасыщенная жирная кислота может быть в форме прямой или разветвленной цепи, а ненасыщенная жирная кислота может включать мононенасыщенную или полиненасыщенную (например, двойная, тройная или четверная). Фосфатидилхолин по настоящему изобретению может представлять собой отдельное соединение или может представлять собой смесь различных соединений, имеющих различное число углеродных атомов ацильных групп R1 и R2. Предпочтительно фосфатидилхолин по настоящему изобретению может иметь молекулярную массу от 700 г/моль до 1000 г/моль, и более предпочтительно молекулярную массу от 750 г/моль до 800 г/моль.

Фосфатидилхолин по настоящему изобретению может быть экстрагирован из любого, выбранного из группы, состоящей из различных животных или растений, например, соевых бобов, семечек, зародышей пшеницы и яичного желтка. Альтернативно, коммерчески доступный фосфатидилхолин по настоящему изобретению может быть приобретен и применен или может быть применен продукт, полученный способом химического синтеза, известным в данной области техники.

Фосфатидилхолин по настоящему изобретению предпочтительно может быть выделен из соевых бобов или яичного желтка. Как правило, типичная структура фосфатидилхолина, выделенного из соевых бобов, соответствует формуле 2. И, как правило, типичная структура фосфатидилхолина, полученного из яичного желтка, представлена формулой 3. Фосфатидилхолин, применяемый в настоящем изобретении, может представлять собой одиночное соединение, состоящее только из соединения, соответствующего формуле 2 или 3, или смесь, в которую дополнительно включены несколько соединений, имеющих различное число углеродных атомов в ацильных группах R1 и R2, в соответствии с формулой 1. Смесь может содержать по существу 50 мас.% или более, более предпочтительно 70 мас.% или более и наиболее предпочтительно 90 мас.% или более соединения формулы 2 или 3.

Формула 2

Формула 3

Наиболее предпочтительно, фосфатидилхолин по настоящему изобретению может быть экстрагирован из соевых бобов и может представлять собой смесь, содержащую соединение, соответствующее формуле 2, в соотношении 93,0 мас.% или более.

В инъецируемой композиции для уменьшения локализованного жира по настоящему изобретению концентрация фосфатидилхолина составляет от 0,625 до 15,0 мас./об. % от общей массы композиции, предпочтительно от 1,25 до 12,5 мас./об.% и более предпочтительно от 2,5 до 10,0 мас./об.% от общей массы композиции. Наиболее предпочтительно, концентрация фосфатидилхолина составляет от 2,5 до 7,5 мас./об.% от общей массы композиции. Когда концентрация фосфатидилхолина составляет менее 0,625 мас./об.%, эффект липолиза отсутствует (см. фиг. 7A-7D). Когда концентрация фосфатидилхолина составляет более 15 мас./об.%, вследствие его высокой вязкости неудобно вводить многократные дозы в подкожно-жировой слой, и поскольку требуется большое количество солюбилизирующего агента, то возникает умеренная воспалительная реакция, могут проявиться серьезные побочные эффекты, такие как боль, отек и воспаление.

Композиция для уменьшения локализованного жира по настоящему изобретению отличается тем, что молярное отношение по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли (здесь и далее сокращенное обозначение (ii)), к фосфатидилхолину (PPC, здесь и далее сокращенное обозначение (i)) составляет от 0,7 до 3,0. Другими словами, молярное отношение (ii) к (i) может составлять от 0,7 до 3,0, более предпочтительно молярное отношение (ii) к (i) может составлять от 0,7 до 2,60, и наиболее предпочтительно молярное отношение (ii) к (i) может составлять от 0,7 до 1,73. Когда молярное отношение (моль/моль) составляет менее 0,7, трудно сформировать стабильные мицеллы, что приводит к плохой стабильности состава. Следовательно, нижнее предельное значение молярного отношения предпочтительно составляет 0,70 или более, а более предпочтительно 0,76. Когда верхнее предельное значение молярного отношения составляет 3,04 или более, боль, отек и побочные эффекты заметно проявляются при умеренном или более выраженном воспалении, умеренном или более выраженном отеке и тяжелом или более поражении кожи, соответственно, и ограничивает функцию PPC вследствие некроза клеток вместо положительного влияния на апоптоз и липолиз адипоцитов. При молярном отношении 3,0 или менее эти побочные эффекты и боль были заметно уменьшены. В частности, при молярном отношении 2,60 или менее, отек, поражение и воспаление не выявлены или выявлены легкие симптомы. Клинически может наблюдаться небольшой отек, но, по существу без боли и побочных эффектов, и, таким образом, этот уровень принят в качестве более предпочтительного диапазона в настоящем изобретении. Наиболее предпочтительно, когда молярное отношение составляет 1,73 или менее, тогда отек и поражение, а также клиническая боль и отек, вызванные воспалением, не появляются.

В настоящем изобретении диапазон молярных отношений (ii) к (i) включает диапазон, в котором минимальное или максимальное граничное значение выбрано из группы, состоящей из значения 0,70, 0,71, 0,72, 0,73, 0,74, 0,75, 0,76, 0,77, 0,78, 0,79, 0,80, 0,81, 0,82, 0,83, 1,09, 1,05, 1,06, 1,07, 1,08, 1,09, 1,10, 1,09, 1,08, 1,09, 1,11, 1,12, 1,13, 1,14, 1,15, 1,16, 1,17, 1,18, 1,19, 1,20, 1,21, 1,22, 1,23, 1,24, 1,25, 1,26, 1,27, 1,28, 1,29, 1,30, 1,31, 1,32, 1,33, 1,34, 1,35, 1,53, 1,54, 1,55, 1,56, 1,57, 1,58, 1,59, 1,60, 1,50, 1,54, 1,50, 1,61, 1,62, 1,63, 1,64, 1,65, 1,66, 1,67, 1,68, 1,69, 1,70, 1,71, 1,72, 1,73, 1,74, 1,75, 1,76, 1,77, 1,78, 1,79, 1,80, 1,81, 1,82, 1,83, 1,84, 1,85, 1,86, 1,87, 1,88, 1,89, 1,90, 1,91, 1,92, 1,93, 1,94, 1,95, 1,96, 1,97, 1,98, 1,99, 2,00, 2,01, 2,02, 2,03, 2,04, 2,05, 2,06, 2,07, 2,08, 2,09, 2,10, 2,11, 2,12, 2,13, 2,14, 2,15, 2,16, 2,17, 2,18, 2,19, 2,20, 2,21, 2,22, 2,23, 2,2 2,42, 2,43, 2,44, 2,45, 2,46, 2,47, 2,48, 2,32, 2,33, 2,34, 2,62, 2,63, 2,64, 2,65, 2,66, 2,67, 2,68, 2,69, 2,70, 2,71, 2,72, 2,73, 2,50, 2,52, 2,53, 2,54, 2,55, 2,56, 2,57, 2,58, 2,59, 2,74, 2,75, 2,76, 2,77, 2,78, 2,79, 2,80, 2,81, 2,82, 2,83, 2,84, 2,85, 2,86, 2,87, 2,88, 2,89, 2,90, 2,91, 2,92, 2,93, 2,94, 2,95, 2,96, 2,99 и 3,00. В качестве наиболее предпочтительного примера настоящего изобретения граничные значения 0,76 и 1,39 могут быть выбраны из вышеописанных значений по настоящему изобретению. Таким образом, для специалиста в данной области техники очевидно, что диапазон молярных отношений от 0,76 до 1,39, то есть все значения в диапазоне от 0,76 или более до 1,39 или менее, могут быть применены к настоящему изобретению.

В частности, композиция для уменьшения локализованного жира по настоящему изобретению отличается тем, что композиция содержит "гликохолевую кислоту или ее соль" в определенном соотношении компонентов смеси. Гликохолевая кислота представляет собой желчную соль, которая имеет молекулярную массу приблизительно 465,63 г/моль и далее обозначена как GCA или GC. Гликохолевая кислота может быть применена в форме фармацевтически приемлемой соли. Термин "фармацевтически приемлемый", в контексте настоящего документа, означает физиологически приемлемый и обычно не вызывает аллергических реакций или подобных реакций при введении людям и включает, но не ограничивается ими, натриевую соль, калиевую соль или соль аммония. Предпочтительно соль гликохолевой кислоты по настоящему изобретению может представлять собой гликохолат натрия (GCNa).

Гликохолевая кислота или ее соль могут быть экстрагированы из кишечника животного в соответствии со способом, известным в данной области техники, и могут быть приобретены на коммерческой основе или может быть применен способ химического синтеза, известный в данной области техники.

Более конкретно, минимальное молярное отношение GCA к PPC (GCA/PPC) для получения прозрачного раствора, пригодного для микрофильтрации, и смешанной системы мицелл диаметром 10 нм или менее, которую можно безопасно и стабильно вводить подкожно, составляет 0,76 (PPC 5,0 % плюс GCA 2,2 %). При молярном отношении меньшем, чем минимальное молярное отношение, стабильность препарата становится низкой вследствие осаждения. Следовательно, содержание гликохолевой кислоты или ее соли предпочтительно такое, что молярное отношение GCA к PPC (GCA/PPC) составляет от 0,76 до 3,0 (GCA от 2,2 до 8,65 мас./об.% в расчете на PPC 5 %), а конкретный диапазон относится к вышеупомянутому молярному отношению. Когда гликохолевую кислоту применяют в форме ее соли, молярное отношение предпочтительно может быть рассчитано на основе только фрагмента гликохолевой кислоты в соли гликохолевой кислоты.

Композиция для уменьшения локализованного жира по настоящему изобретению отличается тем, что композиция содержит "таурохолевую кислоту или ее соль" в определенном соотношении компонентов смеси. Таурохолевая кислота представляет собой желчную соль, которая имеет молекулярную массу приблизительно 515,71 г/моль и далее обозначена как ТСА. Таурохолевая кислота может быть применена в форме фармацевтически приемлемой соли. Термин "фармацевтически приемлемый", в контексте настоящего документа, означает физиологически приемлемый и обычно не вызывает аллергических реакций или подобных реакций при введении людям и включает, но не ограничивается ими, натриевую соль, калиевую соль или соль аммония. Предпочтительно соль гликохолевой кислоты по настоящему изобретению может представлять собой гликохолат натрия (TCNa).

Таурохолевая кислота или ее соль могут быть экстрагированы из кишечника животного в соответствии со способом, известным в данной области техники, и могут быть приобретены на коммерческой основе или может быть применен способ химического синтеза, известный в данной области техники.

Более конкретно, минимальное молярное отношение TCA к PPC (TCA/PPC) для получения прозрачного раствора, пригодного для микрофильтрации, и смешанной системы мицелл диаметром 10 нм или менее, которую можно безопасно и стабильно вводить подкожно, составляет 0,78 (PPC 5,0 % плюс ТСА 2,5 %). При молярном отношении, меньшем, чем минимальное молярное отношение, стабильность препарата становится низкой вследствие осаждения. Следовательно, содержание гликохолевой кислоты или ее соли предпочтительно такое, что молярное отношение TCA к PPC (TCA/PPC) составляет от 0,78 до 3,0 (TCA от 2,5 до 9,57 % (мас./об.) в расчете на PPC 5 %), а конкретный диапазон относится к вышеупомянутому молярному отношению. Когда таурохолевую кислоту применяют в форме ее соли, молярное отношение предпочтительно может быть рассчитано на основе только фрагмента таурохолевой кислоты в соли таурохолевой кислоты.

На данной стадии, по меньшей мере одно (вещество), выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, предпочтительно имеет ту же массу (или процентное отношение массы к объему (т.е. мас./об.%)), что и фосфатидилхолин или менее. Например, массовое отношение в расчете на PPC может составлять от 1: 0,1 до 1. В частности, массовое отношение в расчете на PPC может составлять 1: 0,1, 1: 0,2, 1: 0,3, 1: 0,4, 1: 0,5, 1: 0,6, 1: 0,7, 1: 0,8, 1: 0,9 или 1. Когда такой стандарт массы применяют на основе молярного отношения (молярного отношения GCA/PPC или молярного отношения TCA/PPC), молярное отношение предпочтительно может составлять от 0,7 до 1,73, более предпочтительно от 0,76 до 1,73.

Предпочтительно, содержание по меньшей мере одного (вещества), выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, менее, чем масса (или процентное отношение массы к объему (т.е. мас./об.%)) фосфатидилхолина. Например, массовое отношение в расчете на PPC может составлять от 1:0,1 до 0,999. В частности, массовое отношение в расчете на PPC может составлять 1: 0,1, 1: 0,2, 1: 0,3, 1: 0,4, 1: 0,5, 1: 0,6, 1: 0,7, 1: 0,8 или 1:0,9. Когда такой стандарт массы применяют на основе молярного отношения (молярного отношения GCA/PPC или молярного отношения TCA/PPC), молярное отношение предпочтительно может составлять от 0,7 или более до менее 1,73, более предпочтительно 0,76 или более до менее 1,73.

Когда гликохолевую кислоту или таурохолевую кислоту применяют в форме их соли, массовое отношение предпочтительно может быть рассчитано на основе только соотношения фрагмента гликохолевой кислоты в соли гликохолевой кислоты или соотношения фрагмента таурохолевой кислоты в таурохолевой кислоте.

По меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их солей, можно применять следующим образом:

(A) только отдельное вещество (гликохолевая кислота, одна из солей гликохолевой кислоты, таурохолевая кислота, одна из солей таурохолевой кислоты) можно объединять в комплекс с PPC, или

(B) смесь GCA или ее солей; и TCA или ее соли (здесь и далее смесь GCA-TCA) можно объединять в комплекс с PPC.

Как описано выше, композиция по настоящему изобретению, где GCA, TCA или их соль содержится в определенном соотношении компонентов смеси с фосфатидилхолином (PPC), отличается тем, что представляет собой нелипосомный мицеллярный препарат. Таким образом, композиция по настоящему изобретению отличается присутствием в композиции фосфатидилхолина в форме мицелл, чем отличается от обычных композиций PPC с применением липосомной системы.

GCA, TCA или их соли содержатся в инъецируемых композициях для уменьшения жира по настоящему изобретению в определенной дозе (или соотношении компонентов смеси, молярном отношении), как описано выше, так что они не только превосходны в стабильности состава, но также, в отличие от обычных солюбилизирующих агентов (особенно дезоксихолата и его соли), содержащихся в инъецируемой композиции PPC, которые вызывают побочные эффекты, такие как некроз клеток, сопровождающийся болью и отеком тела, гематомами, потерей чувствительности, эритемой, отеком, уплотнением, зудом, узелковыми утолщениями, и т.п., индуцирует высокоэффективные липолиз и апоптоз адипоцитов вместе с PPC, так что болевой синдром и побочные эффекты в значительной степени устраняются, и показывает превосходный эффект в уменьшении жира (боль и отек уменьшены на 80 % или более, эритема, гематома, уплотнение, зуд и узелковые утолщения уменьшены более чем на 80 %). Таким образом, отдельный противовоспалительный агент и/или анальгетический компонент для лечения болевого синдрома необязательно включен или входит в состав композиции, что также является отличительным признаком настоящего изобретения.

Между тем, композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать, по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из консерванта; изотонического агента; и регулятора pH.

Конкретно, композиция для уменьшения локализованного жира по настоящему изобретению предпочтительно может дополнительно содержать по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из консерванта от 0,1 до 5 мас./об.%, изотонического агента от 0,1 до 10 мас./об.% и регулятора рН от 0,01 до 2 мас./об.% от общей массы композиции.

Консервант может быть выбран из группы, состоящей из бензилового спирта, лидокаина, прокаина и хлорбутанола, но не ограничивается ими. Более предпочтительно бензиловый спирт. Бензиловый спирт является одним из ароматических спиртов и представляет собой бесцветную прозрачную жидкость. Концентрация бензилового спирта, содержащегося в инъецируемой композиции по настоящему изобретению, может предпочтительно составлять от 0,1 до 2 мас./об.%.

Изотонический агент служит для надлежащего поддержания (контроля) осмотического давления, когда композиция по настоящему изобретению, содержащая фосфатидилхолин, вводится в организм, а также обладает вспомогательным эффектом дальнейшей стабилизации фосфатидилхолина в растворе. Изотонический агент может представлять собой фармацевтически приемлемый сахар, соль или любую их комбинацию или смесь. Примеры включают глюкозу в виде сахара и хлорид натрия, хлорид кальция, сульфат натрия, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль с молекулярной массой 1000 или менее и т.п. в виде водорастворимой неорганической соли. И более предпочтительно может представлять собой хлорид натрия. Их можно использовать отдельно или в комбинации из двух или более веществ. Концентрация изотонического агента предпочтительно составляет от 0,1 до 5 мас./об.% и может быть доведена до подходящего количества таким образом, чтобы состав раствора, содержащий каждую из соответствующих смесей, стал изотоническим раствором в зависимости от типа, количества и т.п. компонентов, содержащихся в композиции по настоящему изобретению.

Регулятор рН по настоящему изобретению осуществляет контроль значения рН инъецируемого препарата и включает как кислотные, так и основные вещества. Кислотное вещество включает, но не ограничивается ими, соляную кислоту, уксусную кислоту, адипиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, аскорбат натрия, этоксид натрия, яблочную кислоту, янтарную кислоту, винную кислоту, фумаровую кислоту и лимонную кислоту. Основное вещество включает, но не ограничивается ими, неорганическое основание (например, гидроксид натрия, гидроксид калия, карбонат натрия, гидрокарбонат натрия, карбонат магния, карбонат кальция, оксид магния, аммиак, синтетический гидроталькит), органическое основание (например, основную аминокислоту, такую как лизин, аргинин и т.д., меглюмин и т.д.) и т.п. В настоящем изобретении регулятор рН может включать кислотное вещество и основное вещество, соответственно, только в составе композиции, или два или более веществ можно применять в комбинации. Более предпочтительно регулятор рН по настоящему изобретению может представлять собой гидроксид натрия и/или соляную кислоту. Количество добавляемого регулятора pH может варьироваться в зависимости от типа и количества компонентов композиции по настоящему изобретению и предпочтительно составляет от 0,01 мас./об.% до 1,32 мас./об.%, более предпочтительно 0,01 мас./об.% до 1 мас./об.%. Значение рН композиции по настоящему изобретению предпочтительно может составлять от 7,0 до 7,8, а тип и количество регулятора рН могут быть изменены специалистом в данной области техники в соответствии с конкретной композицией.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления, настоящим изобретением обеспечена композиция для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где композиция состоит из:

(i) фосфатидилхолина,

(ii) по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA) или таурохолевой кислоты (TCA) и их солей,

(iii) консерванта,

(iv) изотонического агента,

(v) регулятора pH, и

(vi) оставшейся воды,

где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0. Характеристики отдельных компонентов, содержание, комбинации и т.п. композиции могут быть поняты из вышеприведенного описания.

Настоящее изобретение также относится к препарату для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, где препарат содержит:

(i) фосфатидилхолин; и

(ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли,

где молярное отношение (ii) к (i) в препарате составляет от 0,7 до 3,0.

Настоящее изобретение также относится к препарату для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, где препарат состоит из:

(i) фосфатидилхолина; и

(ii) по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли,

где молярное отношение (ii) к (i) в препарате составляет от 0,7 до 3,0.

Настоящее изобретение также относится к препарату для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, где препарат по существу состоит из:

(i) фосфатидилхолина,

(ii) по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, и

(iii) воды (или воды для инъекций),

где молярное отношение (ii) к (i) в препарате составляет от 0,7 до 3,0.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления, настоящим изобретением обеспечен препарат для удаления локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где препарат состоит из:

(i) фосфатидилхолина,

(ii) по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA) или таурохолевой кислоты (TCA) и их солей,

(iii) консерванта,

(iv) изотонического агента,

(v) регулятора pH, и

(vi) оставшейся воды,

где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0. Состав, содержание и характеристики конкретных веществ, составляющих препарат, такие же, как и для композиции для уменьшения локализованного жира.

Композиция для уменьшения локализованного жира по настоящему изобретению и препарат по настоящему изобретению могут отличаться тем, что имеют значение рН от 6,8 до 7,8.

Однократная доза (единичная лекарственная форма) композиции или препарата по настоящему изобретению может представлять собой общее количество, например, но не ограничиваясь ими, 500 мл, 400 мл, 300 мл, 200 мл, 100 мл, 90 мл, 80 мл, 70 мл, 60 мл, 50 мл, 40 мл, 30 мл, 20 мл, 10 мл, 9 мл, 8 мл, 7 мл, 6, мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2 мл, 1 мл, 0,9 мл, 0,8 мл, 0,7 мл, 0,6 мл, 0,5 мл, 0,4 мл, 0,3 мл, 0,2 мл, 0,1 мл, 0,09 мл, 0,08 мл, 0,07 мл, 0,06 мл, 0,05 мл, 0,04 мл, 0,03 мл, 0,02 мл, 0,01 мл, 0,009 мл, 0,008 мл, 0,007 мл, 0,006 мл, 0,005 мл, 0,004 мл, 0,003 мл, 0,002 мл, 0,001 мл, 0,0009 мл, 0,0008 мл, 0,0007 мл, 0,0006 мл, 0,0005 мл, 0,0004 мл, 0,0003 мл, 0,0002 мл или 0,0001 мл на область воздействия млекопитающих. Однократная доза будет зависеть отчасти от области воздействия, количества жира и желаемого результата.

Конкретно, однократную дозу (единичную лекарственную форму) композиции или препарата по настоящему изобретению можно вводить в диапазоне от 0,1 мл до 500 мл, предпочтительно от 1 мл до 200 мл, более предпочтительно от 1 мл до 100 мл от общего количества в область воздействия.

Композицию или препарат по настоящему изобретению можно вводить путем введения во множество целевых участков (точек) через равные интервалы в область воздействия за один прием, и общее количество может относиться к общему количеству дозы, вводимой через указанное множество целевых участков за один прием. Количество целевых участков может составлять от 1 до 50, предпочтительно от 2 до 30, более предпочтительно от 3 до 15 и т.д., для одной области воздействия. Кроме того, композиция или препарат по настоящему изобретению включает введение в один целевой участок в одной области воздействия за один прием, и в этом случае специалисту в данной области техники должно быть понятно, что общее количество рассчитывается из расчета количества на один целевой участок.

Кроме того, композицию или препарат по настоящему изобретению можно вводить в дозировке, но не ограничиваясь ими, от 0,01 до 20 мл на целевой участок, предпочтительно от 0,1 до 10 мл, более предпочтительно от 0,02 до 5 мл, наиболее предпочтительно от 0,1 до 1 мл.

Композицию или препарат по настоящему изобретению можно вводить однократно или многократно в целевой участок. В определенных вариантах осуществления композицию по изобретению вводят в целевой участок по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз. Одно или более введение можно выполнить в течение одного часа, дня, недели, месяца или года. Предпочтительно многократные введения в один целевой участок выполняют 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 или менее раз в год, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 или менее раз в месяц, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 или менее раз в неделю, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 или менее раз в день, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 или менее раз в час. В определенных вариантах осуществления выполняют от 1 до 100, от 2 до 50, от 3 до 30, от 4 до 20 или от 5 до 10 введений субъекту в целевой участок. Такие введения можно выполнять в течение 1 года, 6 месяцев, 5 месяцев, 4 месяцев, 3 месяцев, 2 месяцев, 1 месяца, 3 недель, 2 недель или 1 недели, или менее.

Композицию или препарат по настоящему изобретению можно вводить на различные уровни (глубину) под кожу, включая, но не ограничиваясь, например, от 0,1 до 4 дюймов (от 0,25 до 10,2 см), от 0,5 до 3 дюймов (от 1,27 до 7,62 см), от 1 до 2 дюймов (от 2,54 до 5,08 см) в кожу.

Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему:

(I) первый контейнер, содержащий композицию или препарат для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где композиция или препарат содержит: (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где молярное отношение (ii) к (i) в композиции или препарате составляет от 0,7 до 3,0, и

(II) устройство для доставки композиции или препарата к месту отложения жира.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к набору, содержащему:

(I) первый контейнер, содержащий композицию или препарат для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, причем композиция или препарат содержит: (i) фосфатидилхолин, и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, имеет ту же массу, что и фосфатидилхолин или менее; и

(II) устройство для доставки композиции или препарата к месту отложения жира.

В наборе по настоящему изобретению (I) композиция или препарат, содержащиеся в первом контейнере, соответствуют вышеприведенному описанию композиции и препарата для уменьшения локализованного жира по настоящему изобретению. Первый контейнер имеет объем, достаточный для размещения однократной дозы (единичной лекарственной формы) композиции или препарата по настоящему изобретению. Например, первый контейнер может подходить для размещения растворов 500 мл, 100 мл, 20 мл, 10 мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2 мл или 1 мл. В некоторых вариантах осуществления первый контейнер может иметь объем от 0,01 мл до приблизительно 100 мл, от приблизительно 0,1 мл до приблизительно 90 мл, от приблизительно 0,5 мл до приблизительно 80 мл, от приблизительно 1 мл до приблизительно 70 мл, от приблизительно 2 мл до приблизительно 60 мл, от приблизительно 3 мл до приблизительно 50 мл, от приблизительно 4 мл до приблизительно 40 мл, от приблизительно 5 мл до приблизительно 30 мл, от приблизительно 6 мл до приблизительно 20 мл и от приблизительно 7 мл до приблизительно 10 мл. В более предпочтительном варианте осуществления первый контейнер представляет собой флакон или ампулу, имеющую объемную емкость приблизительно от 1 до 10 мл.

Набор по настоящему изобретению содержит (II) устройство для доставки композиции в первом контейнере к месту отложения жира. Конкретный тип устройства для доставки конкретно не ограничен, но может предпочтительно представлять собой шприц и/или может дополнительно включать другое подходящее устройство для доставки (например, пластырь).

Устройство для доставки может быть предварительно заполнено однократной дозой композиции или препарата по настоящему изобретению.

Набор по настоящему изобретению может дополнительно содержать множество контейнеров. Например, набор может дополнительно содержать соответствующее количество разбавителя для разбавления композиции или препарата, содержащихся в первом контейнере, и/или во второй контейнер, содержащий любое другое второе вещество. Любое другое второе вещество может быть выбрано специалистом в данной области техники в качестве составляющего компонента в соответствии с целью набора, причем тип такого вещества конкретно не ограничен, а его примеры включают противомикробные агенты, сосудосуживающие средства, противотромбозные агенты, антикоагулянты, диспергирующие вещества, антидисперсанты, средства, улучшающие проникновение, стероиды, транквилизаторы, миорелаксанты и противодиарейные средства.

Набор может включать письменное описание по применению композиции или препарата для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта. Соответственно, композиция или препарат, содержащиеся в первом контейнере (I), можно вводить в соответствии с письменным описанием. Письменное описание может содержать инструкции по взятию, которые могут зависеть, например, от целевого участка, млекопитающего, подлежащего лечению, желаемого результата, местоположения целевого участка, концентрации раствора и количества отложения жира. Предпочтительно письменные описания относятся к лечению млекопитающих, таких как люди, собаки, кошки или лошади. Письменное описание может также включать информацию о лечении других домашних и/или сельскохозяйственных животных.

Письменное описание может включать информацию о применении композиций по настоящему изобретению для лечения определенных желаемых областей млекопитающего, таких как под глазами, под подбородком, под рукой, на бедрах, икрах, спине, боковой поверхности бедра, лодыжках или на животе. В определенных вариантах осуществления в письменном описании указаны инструкции по применению композиций по настоящему изобретению для лечения отложения жира, связанного с опущением нижнего века, липомами, липодистрофией, бычьим горбом при липодистрофии или целлюлитом.

Письменное описание может включать информацию о количестве разбавления, если необходимо, компонентов первого контейнера и/или разбавителя второго контейнера. Письменное описание может включать информацию относительно правильного введения композиции или препарата по настоящему изобретению, такую как частота или доза введения.

Термин "содержащий" используется как синоним термина "включающий" или "отличающийся" и не исключает дополнительных ингредиентов или стадий, которые не упомянуты в композициях и способах. Термин "состоящий из" исключает дополнительные элементы, стадии или ингредиенты, которые не описаны отдельно. Термин "по существу состоящий из" означает, что в объем композиций или способов термин включает описанные материалы или стадии, а также любой материал или стадию, которые существенно не влияют на основные характеристики композиций или способов.

Настоящее изобретение относится к способу получения инъецируемой композиции для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где способ включает стадии:

(а) добавление по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, к воде для инъекций с последующим растворением при перемешивании с получением прозрачной смеси,

(b) добавление консерванта с последующим перемешиванием;

(с) добавление фосфатидилхолина с последующим перемешиванием при комнатной температуре, и

(d) доведение общего объема композиции водой с последующим перемешиванием,

где молярное отношение по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли к фосфатидилхолину, составляет от 0,7 до 3,0.

Далее способ получения инъецируемой композиции для уменьшения локализованного жира по настоящему изобретению будет описан подробно.

На стадии (а) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, добавляют к воде для инъекций с последующим растворением при перемешивании с получением по существу прозрачной смеси.

На данной стадии, по меньшей мере одно (вещество), выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их солей, и их комбинации и соотношения компонентов смеси являются такими, как в вышеприведенном описании композиции. На стадии (а) может быть предварительно добавлен регулятор pH.

Стадия (b) представляет собой стадию введения консерванта. На стадии (b) любой из изотонического агента и регулятора рН или оба из них могут быть дополнительно добавлены и перемешаны. Компоненты и концентрации консервантов, изотонических агентов и регуляторов рН такие же, как в вышеприведенном описании композиции.

В настоящем изобретении перемешивание или смешивание может быть выполнено известными средствами перемешивания (в смесителе), и специалист в данной области техники может в целях повышения эффективности варьировать такие условия, как температура, давление, время или скорость вращения, в зависимости от вида или характеристик материала.

На стадии (с) к смеси, перемешиваемой на стадии (b), добавляют фосфатидилхолин, и смесь перемешивают до растворения смеси в условиях затенения и воздухонепроницаемости. Перемешивание может осуществляться средством перемешивания (в смесителе), известным в данной области техники, предпочтительно в течение от 2 до 24 часов, более предпочтительно в течение от 5 до 15 часов. Скорость вращения составляет от 100 до 1000 об/мин, но не ограничивается этими значениями. Посредством вышеуказанного способа фосфатидилхолин может быть получен в виде гомогенных частиц, имеющих небольшой размер (диаметр частиц от 2 до 10 нм, предпочтительно диаметр частиц от 2 до 6 нм) в композиции. Если перемешивание выполняют в течение менее 2 часов, желаемый размер частиц и однородность не могут быть получены, а если перемешивание выполняют более 24 часов, это неэкономично для способа получения. Специалисты в данной области техники также смогут установить различные условия осуществления способа для увеличения растворимости компонента, например, перемешиванием компонента в условиях давления азота.

На стадии (d) общий объем регулируют добавлением воды и перемешивают до гомогенного состояния. Вода может быть заменена водой для инъекций, которая является такой же, как описано выше. На стадии (d) может быть выполнено добавление регулятора pH. На этой стадии, для обеспечения стабильности продукта в соответствии с распределением препарата для инъекций, pH можно регулировать, применяя раствор кислоты или буфер (регулятор pH), такой как фосфат, который можно применять в качестве инъекции, и может быть получен физически или химически стабильный препарат для инъекций. Тип или количество регулятора рН, который можно применять в настоящем изобретении, являются такими, как описано выше.

Кроме того, способ может дополнительно включать (е) фильтрацию раствора, перемешиваемого на стадии (d), с получением фильтрата с диаметром частиц фосфатидилхолина от 2 до 10 нм.

Стадия (е) представляет собой стадию отделения молекул фосфатидилхолина, имеющих диаметр частиц от 2 до 10 нм при высокой концентрации, посредством фильтрации. Фильтрацию можно выполнять с применением обычных средств фильтрации, известных в данной области техники, и фильтрацию можно выполнять, например, с помощью шприцевого фильтра. Диаметр частиц предпочтительно может составлять от 2 до 5 нм.

В качестве предпочтительного варианта осуществления настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции для нехирургического удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где способ включает добавление фосфатидилхолина и по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли,

где по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, добавлено той же массой, что и фосфатидилхолин, или менее. Что касается этих конкретных примеров, то конкретный состав материала, соотношение компонентов в смеси и т.п. могут быть поняты из вышеприведенного описания композиции и препарата по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, включающему введение эффективного количества фосфатидилхолина, и по меньшей мере одного солюбилизирующего фосфатидилхолин агента, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, субъекту, имеющему локализованное отложение жира.

Таким образом, в указанном выше способе фосфатидилхолин содержится в концентрации от 0,625 до 15 мас./об.% от общей массы композиции в фармацевтически приемлемом инъецируемом растворе (композиции) для введения фосфатидилхолина, предпочтительно в концентрации от 1,25 до 12,5 мас./об.% и более предпочтительно в концентрации от 2,5 до 10,0 мас./об.% в композиции. В этом случае, однократная доза композиции для введения фосфатидилхолина может составлять 500 мл, 400 мл, 300 мл, 200 мл, 100 мл, 90 мл, 80 мл, 70 мл, 60 мл, 50 мл, 40 мл, 30 мл, 20 мл, 10 мл, 9 мл, 8 мл, 7 мл, 6, мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2 мл, 1 мл, 0,9 мл, 0,8 мл, 0,7 мл, 0,6 мл, 0,5 мл, 0,4 мл, 0,3 мл, 0,2 мл, 0,1 мл, 0,09 мл, 0,08 мл, 0,07 мл, 0,06 мл, 0,05 мл, 0,04 мл, 0,03 мл, 0,02 мл, 0,01 мл, 0,009 мл, 0,008 мл, 0,007 мл, 0,006 мл, 0,005 мл, 0,004 мл, 0,003 мл, 0,002 мл, 0,001 мл, 0,0009 мл, 0,0008 мл, 0,0007 мл, 0,0006 мл, 0,0005 мл, 0,0004 мл, 0,0003 мл, 0,0002 мл или 0,0001 мл или менее. Конкретно, однократная доза (единичная лекарственная форма) композиции для введения фосфатидилхолина в область воздействия может составлять от 0,1 до 500 мл, предпочтительно от 1 до 200 мл и более предпочтительно от 1 до 100 мл от общего объема.

В указанном выше способе солюбилизирующий фосфатидилхолин агент и фосфатидилхолин можно вводить в молярном отношении (солюбилизирующий агент/фосфатидилхолин) от 0,7 до 3,0, более предпочтительно от 0,7 до 2,60, наиболее предпочтительно от 0,7 до 1,73.

Фосфатидилхолин и солюбилизирующий фосфатидилхолин агент можно вводить одновременно или последовательно. Например, когда каждый компонент, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой единую композицию, их можно вводить одновременно. Если композиция не является единой композицией, то один компонент можно вводить до или после введения другого компонента в течение нескольких минут. Предпочтительно солюбилизирующий фосфатидилхолин агент и фосфатидилхолин могут быть введены одновременно. Независимо от того, вводят ли каждый компонент одновременно или последовательно, предпочтительно, чтобы каждый из этих компонентов содержался в фармацевтически приемлемом инъецируемом растворе (композиции), и композиция, содержащая каждый компонент, не обязательно должна соответствовать композиции по настоящему изобретению, описанной выше, и может быть применен способ, в котором результат введения субъекту удовлетворяет молярному соотношению каждого компонента.

В указанном способе по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из изотонического агента и регулятора рН, можно вводить одновременно или последовательно с фосфатидилхолином и/или солюбилизирующим фосфатидилхолин агентом. Конкретные концентрации этих компонентов и т.п. могут быть поняты из вышеприведенного описания.

Введение может предпочтительно представлять собой прямую инъекцию в участок локализованного отложения жира (накопления), и инъекция предпочтительно включает подкожную инъекцию, внутрикожную инъекцию и т.п.

Субъект предпочтительно представляет собой млекопитающее. К таким млекопитающим относятся люди или приматы (например, обезьяны, шимпанзе и т.д.), домашние животные (например, собаки, кошки, лошади и т.д.), сельскохозяйственные животные (например, козы, овцы, свиньи, коровы и т.д.) или лабораторные животные (например, мыши, крысы и т.д.). Субъект также может представлять собой клетку животного происхождения, ткань, орган или т.п. Предпочтительно субъект может представлять собой человека, нуждающегося в удалении локализованного отложения жира (накопления), и удаление включает как косметические, так и терапевтические цели. В качестве примера это может быть пациент, нуждающийся в лечении патологического состояния (заболевания) вследствие атипичного локализованного отложения жира.

Например, композиции по настоящему изобретению можно применять для лечения определенных состояний жировой ткани у пациента, включая липому, пролапс, атеросклероз, синдром Маделунга, отек губ, узелок фиозооспермии, желтую кардиому, жировую дистрофию и целлюлит. В определенных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению можно применять для лечения состояний жировой ткани в таких местах, как локализованное отложение жира под глазами, подбородком, руками, на бедрах, икрах, спине, боковой поверхности бедра, лодыжках или животе млекопитающего.

Термин "лечение", в контексте настоящего документа, представляет собой концепцию, включающую ингибирование, устранение, облегчение, улучшение и/или предотвращение заболевания, или симптома или состояния, вызванного заболеванием.

Настоящее изобретение также относится к способу уменьшения отложения жира (особенно подкожного жира) у млекопитающих, где настоящее изобретение предпочтительно применяют для нехирургического удаления локализованного отложения жира у субъекта. В качестве конкретного примера, нехирургический способ по настоящему изобретению не включает липосакцию, липопластическую операцию или ингаляционную подкожную липэктомию.

Способ по настоящему изобретению отличается тем, что боль и побочные эффекты уменьшены (по существу, снижены до уровня "Отсутствуют"), и подробное описание болевого синдрома и побочных эффектов можно понять из вышеприведенного описания.

Предпочтительно настоящее изобретение обеспечивает способ нехирургического удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, имеющего локализованное отложение жира, где способ включает введение препарата, содержащего (i) фосфатидилхолин, и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли. Препарат или композиция, содержащиеся в препарате, применяемом в настоящем способе, могут представлять собой единую композицию или препарат, соответствующие вышеописанной композиции по настоящему изобретению. В качестве других примеров, препарат или композиция, содержащаяся в препарате, не обязательно соответствует вышеописанной композиции по настоящему изобретению, и может быть осуществлен способ, в котором результат введения субъекту соответствует молярному отношению (ii) к (i) от 0,7 до 3,0, предпочтительно от 0,7 до 2,60, наиболее предпочтительно от 0,7до 1,73.

В качестве предпочтительного примера, настоящее изобретение относится к способу нехирургического удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта, включающий введение препарата, содержащего (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, субъекту, имеющему локализованное отложение жира,

где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0.

В вышеупомянутом способе препарат может быть понят с точки зрения композиции, содержания и характеристик и т.д. из вышеприведенного описания в описании настоящего изобретения, а способ удаления локализованного отложения жира по настоящему изобретению включает или состоит из местного введения однократная дозы (общего количества) одной или более композиций, или препаратов, описанных выше в описании настоящего изобретения, в участок отложения жира (область воздействия) субъекта (млекопитающих). Касательно композиции, препарата и их однократной дозы, они будут понятны из вышеприведенного описания.

Способ по настоящему изобретению относится к способу уменьшения отложения подкожного жира. Такие способы могут включать или состоять из локального введения однократной дозы одной или более композиций, или препаратов по настоящему изобретению в место отложения жира у млекопитающего.

Препарат вводят субъекту, нуждающемуся в этом, в эффективном количестве, причем "эффективное количество" относится к количеству, обеспечивающему локализованное расщепление жира (включая облегчение, лечение, профилактику заболеваний, связанных с отложением жира). Как правило, общее вводимое количество, однократная доза и количество обработок будут меняться в зависимости от количества жира в целевом участке, расположения целевого участка, формы композиции жира и желаемого результата. Как правило, чем больше количество жира, подлежащего лечению, тем больше вводимое количество. Поскольку количество композиции по настоящему изобретению, которое представляет собой "терапевтически эффективное количество", будет варьировать в зависимости от состояния заболевания и его тяжести, возраста пациента, подлежащего лечению, и т.д., терапевтически эффективное количество не ограничивается количеством, описанным в настоящем документе, и может быть определено рутинным способом специалистом в данной области техники.

Вышеуказанный способ введения может быть понят из вышеприведенного описания, и в качестве предпочтительного примера его можно применять чрескожно или подкожно посредством подкожной инъекции с применением шприца в целевом участке. Целевой участок может иметь размер, например, от 0,1 см × 0,1 см до приблизительно 5 см × 5 см. Композиции по настоящему изобретению можно вводить в один и тот же целевой участок, в примыкающий или соседний участок, с различными интервалами, дозами и количествами, описанными в настоящем документе.

Преимущественные эффекты

Инъецируемая композиция для уменьшения локализованного отложения жира по настоящему изобретению, содержащая таурохолевую кислоту или гликохолевую кислоту (или их соль) и фосфатидилхолин (PPC) в определенном соотношении компонентов смеси, имеет стабильный и безопасный состав и оказывает большое влияние на липолиз, специфический для адипоцитов, и апоптоз, специфический для адипоцитов, без некроза адипоцитов, который возникает в результате воздействия обычного препарата PPC, содержащего DCA (такого как Lipostabil®), и препарата, содержащего только DCA (такого как Kybella). Следовательно, достигнут превосходный эффект уменьшения адипоцитов без побочных эффектов, таких как боль, отек, парестезия, обширная отечность, эритема, уплотнение, парестезия, узелковые утолщения, зуд, ощущение жжения и некроз мышечных клеток, фибробластов и сосудистых эндотелиальных клеток, отличных от адипоцитов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1А и 1В представлена серия изображений, на которых PPC без добавления солюбилизирующего агента диспергируют с помощью смесителя и гомогенизатора высокого давления. На фиг. 1А показаны изображения композиции, полученные сразу после добавления только PPC 5 мас./об.% к воде для инъекций с последующим перемешиванием в течение 72 часов в смесителе, и изображения полученные через 1 день после окончательного перемешивания. На фиг. 1В показаны изображения композиции, полученные сразу после добавления PPC в различных концентрациях (0,625 мас./об.%, 1,25 мас./об.%, 2,5 мас./об.%, 5,0 мас./об.%, 7,5 мас./об.%, 10,0 мас./об.%, слева) к воде для инъекций с последующим перемешиванием в течение 1 часа и диспергированием в гомогенизаторе высокого давления, и изображения полученные через 7 дней и 30 дней после получения композиции.

На фиг. 2A-2J представлена серия изображений композиции PPC 5,0 %, солюбилизированного DCA, GCA, TCA, CA, CDCA, UDCA, GDCA, TDCA, HDCA и TUDCA в различных концентрациях, демонстрирующих стабильность состава, причем изображения были получены сразу после и через 30 дней после получения композиции.

На фиг. 2А представлена характеристика состава в зависимости от концентрации мас./об.% дезоксихолевой кислоты (DCA) из расчета PPC 5 мас./об.%.

На фиг. 2B представлена характеристика состава в зависимости от концентрации мас./об.% гликохолевой кислоты (GCA) из расчета PPC 5 мас./об.%.

На фиг. 2C представлена характеристика состава в зависимости от концентрации мас./об.% таурохолевой кислоты (TCA) из расчета PPC 5 мас./об.%.

На фиг. 2D представлена характеристика состава в зависимости от концентрации мас./об.% холевой кислоты (СА) из расчета PPC 5 мас./об.%.

На фиг. 2Е представлена характеристика состава в зависимости от концентрации мас./об.% хенодезоксихолевой кислоты (CDCA) из расчета PPC 5 мас./об.%.

На фиг. 2F представлена характеристика состава в зависимости от концентрации мас./об.% урсодезоксихолевой кислоты (UDCA) из расчета PPC 5 мас./об.%.

На фиг. 2G представлена характеристика состава в зависимости от концентрации мас./об.% гликодезоксихолевой кислоты (GDCA) из расчета PPC 5 мас./об.%.

На фиг. 2H представлена характеристика состава в зависимости от концентрации мас./об.% тауродезоксихолевой кислоты (TDCA) из расчета PPC 5 мас./об.%.

На фиг. 2I представлена характеристика состава в зависимости от концентрации мас./об.% гиодезоксихолевой кислоты (HDCA) из расчета PPC 5 мас./об.%.

На фиг. 2J представлена характеристика состава в зависимости от концентрации мас./об.% тауроурсодеоксихолевой кислоты (TUDCA) из расчета PPC 5 мас./об.%.

На фиг. 3А и 3В представлен пример желчных кислот, которые не могут солюбилизировать PPC, и описание комплексного препарата PPC, солюбилизированного GCA в различных концентрациях. На фиг. 3А представлено изображение комплексной композиции PPC, солюбилизированного литохолевой кислотой (LCA), где было невозможно получить смешанные мицеллы. На фиг. 3B представлено изображение комплексной композиции PPC, солюбилизированного дегидрохолевой кислотой (DHCA), где было невозможно получить стабильные смешанные мицеллы.

На фиг. 4А-4Q представлены графики, показывающие результат испытаний на отек, при котором уровень отека (толщина лап у крыс (мм)) измеряли сразу после и через 1 час и 2 часа после введения 0,1 мл композиции, содержащей только PPC, композиции, содержащей только различные соли желчных кислот (DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA, CA, GCA, TCA и TUDCA), комплексных композиций с различными концентрациями PPC, солюбилизированного желчной кислотой (DCA, GCA, TCA и др.), и PBS (толщина лапы у крысы (мм)) в лапы крысам. Испытание проводили в четырех повторах для каждой обработки и осуществляли штангенциркулем. Далее в описании, % относится к мас./об.%.

На фиг. 4А представлены результаты сравнения отека после инъекции композиции, содержащей только PPC в различных концентрациях (от 1,25 до 15,0 %) и композиции, содержащей только DCA 1 %.

На фиг. 4В представлены результаты сравнения отека после инъекции композиции, содержащей только DCA в различных концентрациях (от 1,0 до 7,5 %).

На фиг. 4С представлены результаты сравнения отека после инъекции композиции, содержащей только HDCA в различных концентрациях (от 1,0 до 7,5 %) и композиции, содержащей только DCA 1 %.

На фиг. 4D представлены результаты сравнения отека после инъекции композиции, содержащей только UDCA в различных концентрациях (от 1,0 до 7,5 %) и композиции, содержащей только DCA 1 %.

На фиг. 4Е представлены результаты сравнения отека после инъекции композиции, содержащей только TDCA в различных концентрациях (от 1,0 до 7,5 %) и композиции, содержащей только DCA 1 %.

На фиг. 4F представлены результаты сравнения отека после инъекции композиции, содержащей только GDCA в различных концентрациях (от 1,0 до 7,5 %) и композиции, содержащей только DCA 1 %.

На фиг. 4G представлены результаты сравнения отека после инъекции композиции, содержащей только CDCA в различных концентрациях (от 1,0 до 7,5 %) и композиции, содержащей только DCA 1 %.

На фиг. 4Н представлены результаты сравнения отека после инъекции композиции, содержащей только СА в различных концентрациях (от 1,0 до 7,5 %) и композиции, содержащей только DCA 1 %.

На фиг. 4I представлены результаты сравнения отека после инъекции композиции, содержащей только GCA в различных концентрациях (от 1,0 до 7,5 %) и композиции, содержащей только DCA 1 %.

На фиг. 4J представлены результаты сравнения отека после инъекции композиции, содержащей только TCA в различных концентрациях (от 1,0 до 7,5 %) и композиции, содержащей только DCA 1 %.

На фиг. 4K представлены результаты сравнения отека после инъекции композиции, содержащей только TUDCA в различных концентрациях (от 1,0 до 7,5 %) и композиции, содержащей только DCA 1 %.

На фиг. 4L представлены результаты сравнения отека через 2 часа после инъекции композиции, содержащей только PPC 5,0 %, и композиций, содержащих только соли желчных кислот в концентрации, необходимой для солюбилизации PPC (обычно приблизительно 2,5 %, но для UDCD подходит 3 %, а для TUDCA подходит 4 %).

На фиг. 4М представлены результаты сравнения отека через 2 часа после инъекции композиций, содержащих только желчные кислоты в концентрации, необходимой для солюбилизации PPC, и комплексной композиции PPC 5,0 %, солюбилизированного вышеуказанными соответствующими желчными кислотами.

На фиг. 4N представлены результаты сравнения отека после инъекции комплексной композиции PPC (от 2,5 % до 15,0 %), солюбилизированного GCA в различных концентрациях (от 1,25 до 7,5 %), и композиции, содержащей только DCA 1 %.

На фиг. 4O представлены результаты сравнения отека после инъекции комплексной композиции PPC (от 2,5 % до 15,0 %), солюбилизированного TCA в различных концентрациях (от 1,25 до 7,5 %), и композиции, содержащей только DCA 1 %.

На фиг. 4P представлены результаты сравнения отека после инъекции комплексной композиции PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA в различных концентрациях (от 2,5 до 25 %).

На фиг. 4Q представлены результаты сравнения отека после инъекции комплексной композиции PPC 5,0 %, солюбилизированного TCA в различных концентрациях (от 2,5 до 25 %).

На фиг. 5A-5F представлена серия изображений участка введения, полученных через 2 часа после введения композиции, содержащей только 1,0 мл PPC (от 1,25 до 15,0 %) и PBS (фиг. 5A), композиций, содержащих только различные соли желчных кислот (DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA, CA, GCA, TCA и TUDCA) в концентрациях от 1,0 до 7,5 % (фиг. 5B и 5C), комплексных композиций PPC 5,0 %, солюбилизированного различными солями желчных кислот (фиг. 5D), комплексных композиций PPC (от 2,5 до 15,0 %), солюбилизированного GCA (от 1,25 до 7,5 %) (фиг. 5E), или комплексных композиций PPC (5,0 %), солюбилизированного GCA (от 2,5 до 20,0 %) (фиг. 5F), в лапы крысам. Изображения лап были получены с применением шкалы 4 × 4 см.

На фиг. 6A-6F представлена серия изображений гистологического испытания. Крыс умерщвляли через 3 часа после введения композиции, содержащей только 1,0 мл PPC (от 1,25 до 15,0 %) и PBS (фиг. 6A), композиции, содержащей только различные соли желчных кислот (DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA, CA (GCA, TCA и TUDCA) в концентрациях от 1,0 до 7,5 % (фиг. 6B и 6C), комплексных композиций PPC 5,0 %, солюбилизированного различными солями желчных кислот (фиг. 6D), комплексных композиций PPC (от 2,5 до 15,0 %), солюбилизированного GCA (от 1,25 до 7,5 %) (фиг. 6E) или комплексных композиций PPC (5,0 %), солюбилизированного GCA (от 2,5 до 20,0 %) (фиг. 6F). Инъецированный участок иссекали, фиксировали 10 % формалином и затем подвергали гистологическому исследованию с применением оптического микроскопа. Окраска гематоксилин-эозином демонстрирует воспаление обработанных лап (увеличение ×200).

На фиг. 7A-7I представлена серия изображений, демонстрирующих снижение жизнеспособности адипоцитов 3T3-L1, обработанных испытуемыми веществами. Жизнеспособность адипоцитов измеряли с помощью анализа 3-(4,5-диметилтазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромидом (МТТ). Испытание проводили в трех повторах для каждой обработки, и результаты выражали в общей процентной доле жизнеспособных клеток по сравнению с необработанным контролем. Измеряли жизнеспособность адипоцитов через 24 часа (фиг. 7А), 48 часов (фиг. 7В), 72 часа (фиг. 7С) и 96 часов (фиг. 7D) после обработки дифференцированных адипоцитов 3T3-L1 композицией, содержащей только PPC (от 0,3125 до 15,0 %), комплексной композицией PPC (от 0,3125 до 15,0 %), солюбилизированного TUDCA (от 0,25 до 12,0 %), комплексной композицией PPC (от 0,3125 до 15,0 %), солюбилизированного TCA (от 0,1563 до 7,5 %), или комплексной композицией PPC (от 0,3125 до 15,0 %), солюбилизированного GCA (от 0,1563 до 7,5 %).

На фиг. 7E представлен график, демонстрирующий жизнеспособность адипоцитов через 96 часов после обработки композициями, содержащими только DCA (1,0 %) и только PPC (5,0 %), и комплексными композициями PPC (5,0 %) плюс GCA (2,5 %), PPC (от 5,0 до приблизительно 15,0 %) плюс TCA (от 2,5 до приблизительно 7,5 %) и PPC (от 5,0 до приблизительно 15,0 %) плюс TUDCA (от 4,0 до приблизительно 12,0 %).

На фиг. 7F-7H представлены графики, демонстрирующие жизнеспособность адипоцитов через 96 часов после обработки композициями, содержащими только PPC (от 2,5 до приблизительно 10,0 %), DCA (от 1,1 до приблизительно 4,4 %) и GCA (от 1,25 до приблизительно 5,0 %) и комплексными композициями PPC (от 2,5 до приблизительно 10,0 %) плюс GCA (от 1,25 до приблизительно 5,0 %) и PPC (от 2,5 до приблизительно 10,0 %) плюс DCA (от 1,1 до приблизительно 4,4 %).

На фиг. 7I представлен график, демонстрирующий жизнеспособность адипоцитов через 96 часов после обработки композицией, содержащей только PPC (5,0 %), и комплексной композицией PPC (5,0 %), солюбилизированного GCA в различных концентрациях (от 2,5 до 8,75 %).

На фиг. 8A-8D представлена серия изображений, демонстрирующих снижение жизнеспособности клеток скелетных мышц (фиг. 8A), нормальных фибробластов (фиг. 8B), сосудистых эндотелиальных клеток (фиг. 8C) и адипоцитов 3T3-L1 (фиг. 8D), обработанных композицией, содержащей только PPC 5,0 %, и комплексными композициями PPC, солюбилизированного желчными кислотами (PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс TCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс TUDCA 4,0 %, PPC 5,0 % плюс DCA 2,2 %, PPC 5,0 % плюс HDCA 2, 5%, PPC 5,0 % плюс UDCA 3,0 %, PPC 5,0 % плюс TDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс GDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс CDCA 2,5 % и PPC 5,0 % плюс CA 2,5 %). Жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа 3-(4,5-диметилтазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромидом (МТТ). Испытание проводили в трех повторах для каждой обработки, и результаты выражали в общей процентной доле жизнеспособных клеток по сравнению с необработанным контролем.

На фиг. 9А и 9В показано состояние до (фиг. 9А) и после (фиг. 9В) дифференцировки адипоцитов 3T3-L1. Дифференцировку адипоцитов-предшественников 3T3-L1 (изображение слева) индуцировали с применением среды для дифференцировки. Дифференцированные адипоциты (изображение справа) окрашивали, применяя масляный красный О, и окрашивали при увеличении ×200.

На фиг. 10А-10D представлена серия изображений, демонстрирующих, что инъецируемая композиция по настоящему изобретению, в частности, обладает эффектом апоптоза, а не некроза адипоцитов, посредством анализа активности каспазы-3, и эффектом липолиза посредством измерения высвобождения глицерина.

На фиг. 10А и 10В показан результат активности каспазы-3. Адипоциты 3T3-L1 высевали по 1 × 10⁵ клеток в каждую лунку и добавляли препараты, содержащие PPC 5,0 %, PPC 5,0 % плюс DCA 2,2 %, PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс GCA 5,0 %, DCA 1,0 % или GCA (от 1,0 до приблизительно 5,0 %) и контроль PBS и инкубировали в течение от 0 до 48 часов при температуре 37 °С (повторяли 3 раза). Затем результат измеряли на спектрофотометре при длине волны 405 нм, через 24 часа (фиг. 10А) и 48 часов (фиг. 10В).

На фиг. 10C и 10D представлен результат высвобождения глицерина. Обработку каждым испытуемым материалом проводили таким же образом, как на фиг. 10А и 10В. Обработанные адипоциты культивировали при температуре 37 °С в течение от 0 до 48 часов для индуцирования липолиза. После инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут, на спектрофотометре измеряли поглощающую способность (OD570) (повторяли 3 раза).

На фиг. 11А-11D представлены изображения, демонстрирующие гистологические изменения, наблюдаемые у мыши в скоплениях жировой ткани, в которые вводили исследуемые вещества. На фиг. 11А показан результат введения композиции, содержащей только PPC (от 2,5 до 15,0 %).

На фиг. 11В показан результат инъекции PBS, Isuprel или DCA 1,0 % в виде односоставной композиции и комплексных композиций PPC 5,0 % плюс DCA 2,2 %, PPC 5,0 % плюс CDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс HDCA 2,5 % или PPC 5,0 % плюс UDCA 3,0 %.

На фиг. 11С показан результат инъекции комплексных композиций PPC 5,0 % плюс GDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс TDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс CA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс TCA 2,5 % или PPC 5,0 % плюс TUDCA 4,0 %.

На фиг. 11D показан результат инъекции композиций, содержащих только PBS, PPC 5,0 % или GCA 2,5 % и комплексных композиций PPC (от 2,5 до приблизительно 10,0 %) плюс GCA (от 1,25 до приблизительно 5,0 %).

Участки жировой ткани, в которые выполняли инъекции, иссекали. Иссеченную ткань фиксировали формальдегидом, заключали в парафиновые блоки, а затем разделяли по предметным стеклам. Наблюдали некроз тканей, апопоз и деградацию при окрашивании гематоксилин-эозином (H&E).

На фиг. 12А-12С представлены изображения результатов однократного подкожного введения комплексной композиции PPC плюс GCA собаке, собаке породы бигль, для наблюдения токсической реакции. Через 14 дней после введения было проведено вскрытие для гистопатологического исследования, и изображения были сделаны после окрашивания гематоксилин-эозином (H&E).

На фиг. 12А представлен результат группы, получающей низкие дозы (комплексная композиция PPC (90 мг/кг) плюс GCA (50,4 мг/кг)), на фиг. 12B представлен результат группы, получающей средние дозы (комплексная композиция PPC (180 мг/кг) плюс GCA (100,8 мг/кг)), а на фиг. 12C представлены результаты для группы, получающей высокие дозы (комплексная композиция PPC (360 мг/кг) плюс GCA (201,6 мг/кг)) для самок и самцов собак породы бигль.

На фиг. 13А и 13В представлены результаты оценки степени индукции болевого синдрома in vivo путем измерения расстояния перемещения (см) и скорости движения (см/с) экспериментальных животных. В частности, 100 мкл каждого испытуемого вещества вводили в подошву лап крыс, и наблюдали появление отека. В результате было подтверждено, что наиболее тяжелый отек появлялся через 2 часа после инъекции, и этот момент времени был установлен максимальный показатель болевого синдрома. Движение до и после введения испытуемого вещества сравнивали по расстоянию и времени. Движение до и после инъекции измеряли с применением системы Noldus Video Traking и сравнивали с расстоянием перемещения (фиг. 13A) и скоростью движения (фиг. 13B).

На фиг. 14А и 14В представлены результаты эффективности уменьшения содержания жирового слоя под подбородком у субъекта, получившего комплексную композицию PPC, солюбилизированного GCA, по настоящему изобретению. После местной анестезии 9,6 % лидокаиновой мазью в месте введения (под подбородком) вводили 10 мл инъецируемой комплексной композиции PPC 5,0 % плюс GCA 2,8 % (PPC 500 мг плюс GCA 280 мг) 6 раз с интервалами в 4 недели в жировой слой под подбородком (всего 50 точек, 0,2 см³ на точку, интервал 1,0 см, глубина от 6 до 8 мм и инъекционная игла 30G 13 мм). Через 12 недель получали серию изображений. На фиг. 14А представлено изображение, полученное стандартным методом клинической фотографии, а фиг. 14B представляет собой серию изображений, показывающих уменьшение толщины жирового слоя под подбородком с помощью компьютерной томографии.

На фиг. 15A-15C представлен результат сравнения примеров болевого синдрома, отека и вредных последствий введения комплексной композиции PPC, солюбилизированного GCA, 6 субъектам, которым уже вводили инъецируемую композицию PPC, солюбилизированного DCA. Исследуемые вещества представляли собой 10 мл раствора, в котором Lipobean i.v. (PPC 50,0 мг плюс DCNa 24,0 мг в 1 мл) разбавляли инъецируемым 0,9 % солевым раствором в соотношении 1:1 (т.е. PPC 25,0 мг плюс DCNa 12,0 мг), 10 мл PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA 2,8 % (PPC 50,0 мг плюс GCA 28,0 мг в 1 мл) и 10 мл PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA 4,0 % (PPC 50,0 мг плюс GCA 40,0 мг в 1 мл). Каждый испытуемый материал инъецировали в жировой слой под подбородком (всего 50 точек, 0,2 см³ на точку, интервал 1,0 см, глубина от 6 до 8 мм и инъекционная игла 30G 13 мм), и опросники заполняли в то же время через 1, 3, 7 и 10 дней после введения каждого вещества.

На фиг. 15А представлена оценка выраженности болевого синдрома, измеренная визуальной аналоговой шкалой (ВАШ) 100 мм, на фиг. 15B представлена оценка выраженности отека в соответствии с оценочной шкалой отеков (0: нет-0 мм, 1: легкий-2 мм, 2: умеренный-4 мм, 3: тяжелый-6 мм, 4: крайне тяжелый-8 мм)), и на фиг. 15C представлены примеры вредных побочных эффектов, включая обширные отечности, гематомы, кровоподтеки, эритему, узелковые утолщения и зуд в месте введения по 5-ти балльной шкале (0: отсутствует, 1: легкий, 2: умеренный, 3: тяжелый, 4: крайне тяжелый).

На фиг. 16 представлены изображения, сравнивающие поражение кожи (эритема, кровоподтеки и гематома) после введения раствора, в котором Lipobean i.v. (PPC 50,0 мг плюс DCNa 24,0 мг в 1 мл) разбавляли инъецируемым 0,9 % солевым раствором в соотношении 1:1 (т.е. PPC 25,0 мг плюс DCNa 12,0 мг в 1 мл раствора) или комплексной композиции PPC, солюбилизированного GCA (PPG 50 мг плюс GCA 40 мг в 1 мл). После местной анестезии 9,6 % лидокаиновой мазью в месте введения (под подбородком) в течение 30 минут вводили 50 мл каждого тестируемого вещества в подкожно-жировой слой на боку (всего 100 точек, 0,5 см³ на точку, интервал 1,5 см, глубина от 10 до 12 мм и инъекционная игла 30G 13 мм). Изображения были сделаны через 2 дня после введения. В участке введения инъецируемого препарата PPC, солюбилизированного DCA, повреждения кожи, такие как эритема, кровоподтеки и гематома наблюдали вдоль области, распределения лекарственного средства. Однако инъецируемый комплексный препарат PPC, солюбилизированный GCA по настоящему изобретению, показал появление только гематомы и синяка вследствие введения иглы.

Варианты осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет подробно описано со ссылкой на следующие примеры. Однако следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Материалы

Материалы, добавляемые в состав инъецируемых композиций по настоящему изобретению и сравнительных композиций, представляют собой:

Фосфатидилхолин (PPC, S-100, LIPOID GmbH, 784 г/моль на основе олеоил-линолеоил-глицерофосфохолина), холевая кислота (гликохолевая кислота, CA, New Zealand pharm), дезоксихолевая кислота (DCA, Sigma-Aldrich), дезоксихолат натрия (DCNa, New Zealand pharm), гликохолевая кислота (GCA, New Zealand pharm), гликохолат натрия (GCNa, New Zealand pharm), таурохолевая кислота (TCA, Sigma-Aldrich), таурохолат натрия (TCNa, New Zealand pharm), хенодезоксихолевая кислота (CDCA, Sigma-Aldrich), урозодезоксихолевая кислота (UDCA, Sigma-Aldrich), гликодезоксихолевая кислота (GDCA, Sigma-Aldrich), тауродезоксихолевая кислота (TDCA, Sigma-Aldrich), гиодезоксихолевая кислота (HDCA, Sigma-Aldma) литохолевая кислота (LCA, Sigma-Aldrich), дигидрохолевая кислота (DHCA, Sigma-Aldrich), тауроурсодеоксихолевая кислота (TUDCA, Tokyo Chemical Industry), бензиловый спирт (Sigma-Aldrich, 0,9 мас./об.%), хлорид натрия (Sigma-Aldrich, 0,44 мас./об.%), гидроксид натрия (Sigma-Aldrich, от 0,04 до 0,76 мас./об.%), соляная кислота (Sigma-Aldrich, от 0,001 до 0,6 мас./об.%) и вода для инъекций. Среди добавляемых материалов изотонический агент (хлорид натрия) применяли вместе с бензиловым спиртом в примерах и сравнительных примерах.

Аналитические устройства

Устройства, применяемые при анализе инъецируемых композиций по настоящему изобретению и сравнительных композиций представлены далее.

Размер частиц измеряли с применением анализатора размера наночастиц (Microtrac Wave, MICROTRACT, США). Разделение слоев вследствие осаждения наблюдали с помощью камеры (Nikkon, D5200, AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR объектив). Прозрачность измеряли с применением спектрофотометра (CM-3600d, KONICA MINOLTA, Япония). Значение pH измеряли с помощью прибора для измерения рН (ST3100, OHAUS, Германия), изотоничность измеряли с помощью прибора для определения осмотического давления (Vapro 5600, Elitech Group, Токио, Япония), а вязкость анализировали с применением вискозиметра (Digital Viscometer CL- 2, CAS, Корея).

Композиции по настоящему изобретению (примеры) и сравнительные композиции (сравнительные примеры) в качестве композиций на основе PPC для уменьшения локализованного жира в соответствии с типом солюбилизирующего агента получали следующим образом. Далее % композиции относится к мас./об.%.

Сравнительный пример 1: инъецируемые композиции, содержащие только PPC

Композицию, содержащую только фосфатидилхолин без солюбилизирующего агента (концентрация PPC от 0,313 до приблизительно 15,0 %) получают следующим образом. Инъецируемые композиции, содержащие PPC 3,125 мг (0,3125 %), 6,25 мг (0,625 %), 12,5 мг (1,25 %), 25,0 мг (2,5 %), 50,0 мг (5,0 %), 75,0 мг (7,5 %), 100,0 мг (10,0 %), 125,0 мг (12,5 %) или 150,0 мг (15,0 %), соответственно и бензиловый спирт 9 мг (0,9 %) в 1 мл получают с применением гомогенизатора высокого давления. И показательные результаты приведены в таблице 1 ниже. Далее % композиции относится к мас./об.%.

Конкретный способ получения заключается в следующем. В промытый и стерилизованный резервуар для получения загружают воду для инъекций (при комнатной температуре) и добавляют фосфатидилхолин (РРС) и бензиловый спирт, и смесь перемешивают при 200 об/мин в течение 2 часов в условиях давления азота, затемнения и при комнатной температуре. После завершения перемешивания смесь переносят в гомогенизатор сверхвысокого давления (Nano Disperser NLM100, Ilshin Autoclave, Корея) под давлением азота. Гомогенизацию при сверхвысоком давлении (дисперсию) проводят при 12000 фунт/кв.дюйм (82,74 МПа) в течение 7 циклов, и частицы становились мелкоизмельченными. Затем доводят значение pH. После фильтрации через фильтр 0,2 мкм, смесь переносят во флакон и герметизируют.

Таблица 1. Инъецируемые композиции, содержащие только PPC, диспергированные в гомогенизаторе высокого давления

	Сравнительный пример 1-1	Сравнительный пример 1-2	Сравнительный пример 1-3	Сравнительный пример 1-4	Сравнительный пример 1-5	Сравнительный пример 1-6
PPC (мас./об.%)	0,625	1,25	2,5	5,0	7,5	10,0
Свойство (после получения)	Слегка мутный	Слегка мутный	Слегка мутный	Мутный	Мутный	Мутный
Свойство (через 30 дней после получения)	Слегка мутный	Слегка мутный	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок
Прозрачность (660нм)	97,87	86,72	84,03	77,24	77,11	67,47
Размер частиц (нм)	17,16± 5,88	17,88± 5,74	18,43± 6,16	17,07± 5,19	15,27± 4,73	16,69± 4,51

Как показано на фиг. 1А, композиция PPC 5,0 % без солюбилизирующего агента имела мутный вид сразу после перемешивания в течение от 24 до 72 часов. Через 1 день после последнего перемешивания композиция имела плохую стабильность состава из-за того, что PPC не диспергировался в воде для инъекций, и промышленное применение было ограничено. Также, как показано на фиг. 1B и в Таблице 1, композиция, в которой PPC от 0,625 до 10,0 % диспергируют в гомогенизаторе высокого давления без добавления солюбилизирующего агента, демонстрировала легкую мутность или мутность в зависимости от концентрации, и размер частиц липосомной системы составлял от 17,16 ± 5,88 до 16,69 ± 4,51 нм и частицы были нестабильно рассеяны. В результате наблюдения свойств через 30 дней после получения было подтверждено, что PPC выпадал в осадок и не диспергировался в воде для инъекций в концентрации 2,5 % или более и не подходил в качестве промышленного инъецируемого препарата из-за низкой стабильности состава (Фиг. 1В).

Для того чтобы получить прозрачную инъецируемую композицию мицеллярной структуры, в которой PPC стабильно диспергируется при размере частиц 10 нм или менее, комплексную композицию PPC получают путем солюбилизации различными желчными кислотами (ЖК), такими как DCA, CA GCA, TCA, CDCA, UDCA, GDCA, TDCA, HDCA, LCA, DHCA и TUDCA в различных концентрациях. Композиции и их состав подробно описаны в нижеследующих сравнительных примерах и примерах.

Сравнительный пример 2: инъецируемые формы PPC, солюбилизированного DCA

Как показано в приведенной ниже таблице 2, композиции на основе фосфатидилхолина (PPC 5,0%), солюбилизированного дезоксихолевой кислотой (DCA), такие же, как композиция известного состава Lipostabil® и т.п., получают добавлением 50,0 мг PPC (5,0 %) и 10,0 мг (1,0 %), 15,0 мг (1,5 %), 20,0 мг (2,0 %), 21,0 мг (2,1 %), 22,0 мг (2,2 %), 23,0 мг (2,3 %), 24,0 мг (2,4 %), 25,0 мг (2,5 %) или 30,0 мг (3,0 %) DCA соответственно и добавлением 9 мг бензилового спирта (0,9 %) в 1 мл. В частности, воду для инъекций помещают в резервуар для получения, который очищают и стерилизуют (при комнатной температуре), и в воду для инъекций добавляют гидроксид натрия. Затем добавляют дезоксихолевую кислоту и бензиловый спирт, перемешивают и растворяют. Затем добавляют фосфатидилхолин и смесь перемешивают при 200 об/мин в течение примерно 24 часов при затенении, герметизации, комнатной температуре (25 °С) и давлении азота. После завершения перемешивания, pH доводят до нужного значения (при необходимости, дополнительным количеством гидроксида натрия или соляной кислоты), фильтруют через фильтр 0,2 мкм, смесь переносят во флакон и герметизируют. В таблице 2 приведены свойства инъецируемой формы PPC, солюбилизированного DCA в различных концентрациях.

Таблица 2. Инъецируемая форма PPC, солюбилизированного DCA

	Сравнительный пример 2-1	Сравнительный пример 2-2	Сравнительный пример 2-3	Сравнительный пример 2-4	Сравнительный пример 2-5	Сравнительный пример 2-6	Сравнительный пример 2-7	Сравнительный пример 2-8	Сравнительный пример 2-9
PPC (мас./об.%)	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
DCA (мас./об.%)	1,0	1,5	2,0	2,1	2,2	2,3	2,4	2,5	3,0
DCA/PPC молярное отношение	0,41	0,62	0,83	0,87	0,91	0,95	0,99	1,03	1,24
Свойство (после получения)	Сильно мутный	Сильно мутный	Слегка мутный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Свойство (через 30 дней после получения)	Осадок	Осадок	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	23,7	26,92	91,7	99,41	99,52	99,26	99,71	99,57	99,89
Размер частиц (нм)	50,80± 330,0	72,70± 492,0	39,60± 26,14	8,57± 0,660	3,21± 0,920	3,23± 0,780	3,20± 0,690	3,19± 0,820	2,68± 0,850

Стабильность состава инъецируемой композиции PPC, солюбилизированного дезоксихолевой кислотой (DCA), оценивают сразу после получения и через 30 дней после получения (после отстаивания при комнатной температуре), и результаты оценки показаны на фиг. 2А. Стабильность фармацевтического состава наблюдают, когда DCA добавляют при 2,1 % или более для PPC 5 %, а композиция проявляла свойства прозрачного (чистого) раствора (сравнительные примеры с 2-4 по 2-9). Сравнительными примерами с 2-1 по 2-3 подтверждено, что состав нестабилен из-за осаждения. На основании приведенного сравнения был сделан вывод о том, что стабильный инъецируемый препарат можно получить при концентрации DCA 2,1 % или более в расчете на PPC 5 %. В частности, в сравнительных примерах с 2-1 по 2-3 размер частиц фосфатидилхолина составлял от 50,80 ± 330,0 до 39,60 ± 26,14 нм, и он представлял собой нестабильную эмульсию или липосомную структуру, которая не является мицеллярной. В сравнительных примерах с 2-4 по 2-9 обеспечены мицеллярные структуры размером 10 нм или менее. Как описано выше, композицию с молярным отношением DCA к PPC (DCA/PPC) менее 0,87, считают неподходящей в качестве инъецируемого препарата, поскольку состав по существу не был стабильным.

Пример 1. Получение инъецируемых форм PPC, солюбилизированного GCA.

Как показано в таблицах 3 и 4 ниже, композиции на основе фосфатидилхолина (PPC), солюбилизированного гликохолевой кислотой (GCA), получают добавлением 50,0 мг PPC (5,0 %) и 10,0 мг (1,0 %), 15,0 мг (1,5 %), 20,0 мг (2,0 %), 21,0 мг (2,1 %), 22,0 мг (2,2 %), 23,0 мг (2,3 %), 24,0 мг (2,4 %), 25,0 мг (2,5 %), 26,0 мг (2,6 %), 27,0 мг (2,7 %), 28,0 мг (2,8 %), 29,0 мг (2,9 %), 30,0 мг (3,0 %), 35,0 мг (3,5 %), 40,0 мг (4,0 %) или 45,0 мг (4,5 %) GCA соответственно и добавлением 9 мг бензилового спирта (0,9 %) в 1 мл. В частности, воду для инъекций помещают в резервуар для получения, очищенный и стерилизованный (комнатная температура), и к воде для инъекций добавляют гидроксид натрия (от 0,04 до 0,72 %). Затем добавляют гликохолевую кислоту и бензиловый спирт, перемешивают и растворяют. Затем добавляют фосфатидилхолин и смесь перемешивают при 200 об/мин в течение примерно 24 часов при затенении, герметизации, комнатной температуре (25 °С) и давлении азота. После завершения перемешивания, pH доводят до нужного значения (при необходимости, дополнительным количеством гидроксида натрия или от 0,001 до 0,6 % соляной кислоты), фильтруют через фильтр 0,2 мкм, смесь переносят во флакон и герметизируют. В таблицах 3 и 4 показаны свойства инъецируемой формы PPC, солюбилизированного GCA в различных концентрациях.

Таблица 3.

	Сравнительный пример 1-1	Сравнительный пример 1-2	Сравнительный пример 1-3	Сравнительный пример 1-4	Пример 1-1	Пример 1-2	Пример 1-3	Пример 1-4
PPC мас./об.%	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
GCA мас./об.%	1,0	1,5	2,0	2,1	2,2	2,3	2,4	2,5
GCA/PPC молярное отношение	0,35	0,52	0,69	0,73	0,76	0,80	0,83	0,87
Свойство (после получения)	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Слегка мутный	Слегка мутный	Слегка мутный	Слегка мутный	Прозрачный
Свойство (через 30 дней после получения)	Осадок	Осадок	Осадок	Слегка прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	21,03	24,18	30,05	35,24	88,0	88,05	87,78	99,79
Размер частиц (нм)	198,2± 721,0	117,5±2533	194,9± 2752	28,2± 11,35	9,84± 1,780	8,41± 1,210	7,01± 1,200	7,13± 0,880
pH	7,18	7,24	7,27	7,18	7,22	7,20	7,24	7,23

Таблица 4.

	Пример 1-5	Пример 1-6	Пример 1-7	Пример 1-8	Пример 1-9	Пример 1-10	Пример 1-11	Пример 1-12
PPC мас./об.%	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
GCA мас./об.%	2,6	2,7	2,8	2,9	3,0	3,5	4,0	4,5
GCA/PPC молярное отношение	0,90	0,94	0,97	1,01	1,04	1,21	1,39	1,56
Свойство (после получения)	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Свойство (через 30 дней после получения)	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	99,82	99,8	99,71	99,83	99,9	99,73	99,74	99,87
Размер частиц (нм)	7,43± 1,190	6,07± 0,870	3,93± 0,750	4,00± 0,760	3,64± 0,730	2,89± 0,830	2,38± 0,760	2,28± 0,670
pH	7,20	7,22	7,28	7,22	7,26	7,24	7,19	7,26

Стабильность состава инъецируемых композиций PPC, солюбилизированного гликохолевой кислотой (GCA), в таблицах 3 и 4 оценивают сразу после получения и через 30 дней после получения (хранение в холодильнике). Результаты оценки показаны на фиг. 2B. Стабильность состава подтверждают, когда GCA добавляют при 2,2 % или более для PPC 5,0 %, а композиция проявляла свойства прозрачного (чистого) раствора (примеры с 1-1 по 1-12). Сравнительными примерами с 1-1 по 1-4 подтверждено, что состав нестабилен из-за осаждения. Композиции в примерах с 1-1 по 1-3 были слегка мутными сразу после получения, но после фильтрации через фильтр 0,2 мкм становились прозрачными и, таким образом, было подтверждено, что их можно применять в качестве инъецируемого препарата. В результате был сделан вывод о том, что стабильные инъецируемые препараты можно получить при концентрации DCA 2,2 % или более в расчете на PPC 5 %. Размер частиц композиций сравнительных примеров с 1-1 по 1-4 составляет от 198,2 ± 721,0 до 28,2 ± 11,35 нм, т.е. композиция диспергирована в виде нестабильной эмульсии или липосомы, так что считают, что состав по существу не был стабильным и не подходил в качестве инъецируемого препарата. Кроме того, комплексные композиции PPC (примеры с 1-1 по 1-12) с добавлением GCA 2,2 % или более (молярное отношение GCA/PPC 0,76 или более), состояли из мицелл размером 10 нм или менее и комплексные композиции PPC (примеры с 1-7 по 1-12) с добавлением GCA 2,8 % или более (молярное отношение GCA/PPC 0,97 или более), состояли из мицелл размером 5 нм или менее, и было обнаружено, что они подходят в качестве инъецируемого препарата.

Поскольку вязкость комплексной композиции PPC, солюбилизированного GCA, увеличивается пропорционально концентрации PPC, испытание на вязкость проводят для различных композиций. В частности, исследуют характеристики комплексной композиции PPC (от 2,5 до приблизительно 20,0 %), солюбилизированного GCA (от 1,4 до приблизительно 11,2 %), и комплексной композиции PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA (от 4,2 до приблизительно 12,6 %), исходя из концентрации GCA равной 2,8 %, где PPC 5,0 % диспергируется с размером частиц 5 нм или менее. 500 мл каждой из вышеуказанных композиций измеряют при комнатной температуре (25 °С) в течение 3 минут при 60 об/мин после установки вращающейся иглы № 1. В результате испытания было подтверждено, что размер частиц составлял от 4,23 ± 1,69 до 1,37 ± 0,530 нм, и прозрачность (660 нм) составляла 99,11 ± 0,77 %. В таблице 5 приведены характеристики вязкости инъецируемых препаратов PPC, солюбилизированного различными концентрациями GCA. На основании приведенной ниже таблицы 5 было подтверждено, что при концентрации PPC выше 15 мас./об.%, он не подходит для введения вследствие высокой вязкости.

Таблица 5.

PPC мас./об.%	GCA мас./об.%	Вязкость (cP)	PPC мас./об.%	GCA мас./об.%	Вязкость (cP)
2,5	1,4	0,02	5,0	2,8	0,25
5,0	2,8	0,25		4,2	0,09
6,0	3,4	1,90		5,6	0,43
7,0	3,9	5,71		7,0	0,44
8,0	4,5	7,22		8,4	0,44
9,0	5,0	7,87		9,8	0,49
10,0	5,6	8,70	12,6	0,96
11,0	6,2	12,87
12,0	6,7	14,76
13,0	7,3	17,86
14,0	7,8	22,16
15,0	8,4	24,16
16,0	9,0	25,96
17,0	9,5	27,95
18,0	10,1	50,49
19,0	10,6	74,20
20,0	11,2	176,00

Пример 2. Получение инъецируемых форм PPC, солюбилизированного TCA.

Как показано в таблицах 6 и 7 ниже, композиции на основе фосфатидилхолина (PPC), солюбилизированного таурохолевой кислотой (TCA), получают добавлением 50,0 мг PPC (5,0 %) и 10,0 мг (1,0 %), 15,0 мг (1,5 %), 20,0 мг (2,0 %), 21,0 мг (2,1 %), 22,0 мг (2,2 %), 23,0 мг (2,3 %), 24,0 мг (2,4 %), 25,0 мг (2,5 %), 26,0 мг (2,6 %), 27,0 мг (2,7 %), 28,0 мг (2,8 %), 29,0 мг (2,9 %), 30,0 мг (3,0 %), 35,0 мг (3,5 %), 40,0 мг (4,0 %) или 45,0 мг (4,5 %) ТСА соответственно и добавлением 9 мг бензилового спирта (0,9 %) в 1 мл. Конкретный способ получения соответствует способу в вышеупомянутом примере 1. В таблицах 6 и 7 представлены характеристики инъецируемого препарата PPC, солюбилизированного TCA в различных концентрациях.

Таблица 6.

	Сравнительный пример 2-1	Сравнительный пример 2-2	Сравнительный пример 2-3	Сравнительный пример 2-4	Сравнительный пример 2-5	Сравнительный пример 2-6	Сравнительный пример 2-7	Пример 2-1
PPC мас./об.%	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
TCA мас./об.%	1,0	1,5	2,0	2,1	2,2	2,3	2,4	2,5
TCA/PPC молярное отношение	0,31	0,47	0,63	0,66	0,69	0,72	0,75	0,78
Свойство (после получения)	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Мутный	Слегка мутный
Свойство (через 30 дней после получения)	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	28,26	28,58	30,97	34,54	36,24	36,74	43,88	94,2
Размер частиц (нм)	139,6± 126,14	160,0± 158,80	170,8± 121,60	153,2± 2474	120,3± 1,60	149,5± 798,0	146,1± 2908	9,88± 1,420
pH	7,22	7,26	7,22	7,25	7,22	7,24	7,25	7,15

Таблица 7.

	Пример 2-2	Пример 2-3	Пример 2-4	Пример 2-5	Пример 2-6	Пример 2-7	Пример 2-8	Пример 2-9
PPC мас./об.%	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
GCA мас./об.%	2,6	2,7	2,8	2,9	3,0	3,5	4,0	4,5
GCA/PPC молярное отношение	0,81	0,85	0,88	0,91	0,94	1,10	1,25	1,41
Свойство (после получения)	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Свойство (через 30 дней после получения)	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	97,39	95,29	99,6	99,54	99,83	99,82	99,81	99,76
Размер частиц (нм)	7,01± 1,030	6,63± 0,960	3,74± 0,820	2,710± 1,030	3,56± 0,750	2,88±0,600	2,39±0,510	2,78±0,690
pH	7,19	7,17	7,15	7,26	7,20	7,21	7,25	7,20

Стабильность состава инъецируемых композиций PPC, солюбилизированного таурохолевой кислотой (TCA) в таблицах 6 и 7, оценивают сразу после получения и через 30 дней после получения (хранение в холодильнике), и результаты оценки представлены на фиг. 2C. Стабильность состава подтверждают, когда TCA добавляют при 2,5 % или более по отношению к PPC 5,0 %, а композиция проявляла свойства прозрачного (чистого) раствора (примеры с 2-1 по 2-9). В сравнительных примерах с 2-1 по 2-7 было подтверждено, что состав не стабилен из-за осаждения. Композиции в примерах 2-1 были слегка мутными сразу после получения, но после фильтрации через фильтр 0,2 мкм становились прозрачными и, таким образом, было подтверждено, что их можно применять в качестве инъецируемого препарата. В результате был сделан вывод, что стабильные инъецируемые препараты можно получить при концентрации ТСА 2,5 % или более в расчете на PPC 5,0 %. Размер частиц композиций сравнительных примеров с 2-1 по 2-7 составлял от 139,6 ± 126,14 до 146,1 ± 2908 нм, т.е. композиция диспергирована в виде нестабильной эмульсии или липосомы, так что считают, что состав по существу не был стабильным и не подходила в качестве инъецируемого препарата. Помимо этого, комплексные композиции PPC (примеры с 2-1 по 2-9) с добавлением TCA 2,5 % или более (молярное отношение TCA/PPC 0,78 или более), состояли из мицелл размером 10 нм или менее, и комплексные композиции PPC (примеры с 2-4 по 2-9) с добавлением TCA 2,8 % или более (молярное отношение TCA/PPC 0,88 или более), состояли из мицелл размером 5 нм или менее, и было обнаружено, что они подходят в качестве инъецируемого препарата.

Сравнительный пример 3: инъецируемые формы PPC, солюбилизированного CA

Как показано в Таблице 8 ниже, композиции на основе фосфатидилхолина (PPC), солюбилизированного холевой кислотой (CA), получают добавлением 50,0 мг PPC (5,0 %) и 10,0 мг (1,0 %), 15,0 мг (1,5 %), 20,0 мг (2,0 %), 21,0 мг (2,1 %), 22,0 мг (2,2 %), 23,0 мг (2,3 %), 24,0 мг (2,4 %), 25,0 мг (2,5 %) или 30,0 мг (3,0 %) CA соответственно, и добавлением 9 мг бензилового спирта (0,9 %) в 1 мл. Конкретный способ получения соответствует способу в вышеупомянутом примере 1.

Пример 1

Таблица 8.

	Сравнительный пример 3-1	Сравнительный пример 3-2	Сравнительный пример 3-3	Сравнительный пример 3-4	Сравнительный пример 3-5	Сравнительный пример 3-6	Сравнительный пример 3-7	Сравнительный пример 3-8	Сравнительный пример 3-9
PPC мас./об.%	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
CA мас./об.%	1,00	1,50	2,00	2,10	2,20	2,30	2,40	2,50	3,00
CA/PPC молярное отношение	0,40	0,60	0,80	0,84	0,88	0,91	0,95	0,99	1,19
Свойство (после получения)	Сильно мутный	Сильно мутный	Мутный	Мутный	Почти прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Свойство (через 30 дней после получения)	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	24,2	27,41	44,46	63,64	95,56	99,66	99,62	99,71	99,73
Размер частиц (нм)	50,80± 330,0	72,70± 492,0	2105± 956	583,0± 293	6,22± 0,880	3,20± 0,760	3,20± 0,690	3,21± 0,660	2,63± 0,580

Стабильность состава инъецируемых композиций PPC, солюбилизированного холевой кислотой (СА), в таблицах 8 оценивают сразу после получения и через 30 дней после получения (хранение в холодильнике), и результаты оценки представлены на фиг. 2D. Стабильность состава подтверждают, когда CA добавляют при 2,2 % или более по отношению к PPC 5,0 %, а композиция проявляла свойства прозрачного (чистого) раствора (сравнительные примеры с 3-5 по 3-9). В сравнительных примерах с 3-1 по 3-4 было подтверждено, что состав не стабилен из-за осаждения. Композиция в сравнительном примере 3-5 была почти прозрачной сразу после получения, а после фильтрации через фильтр 0,2 мкм стала прозрачной. В результате был сделан вывод, что стабильные инъецируемые препараты можно получить при концентрации СА 2,2 % или более в расчете на PPC 5,0 %. Размер частиц композиций сравнительных примеров с 3-1 по 3-4 составляет от 50,80 ± 330 до 583,00 ± 293 нм, то есть композиция диспергирована в виде нестабильной эмульсии или липосомы, но композиции в сравнительных примерах с 3-5 по 3-9 состояли из мицелл размером 10 нм или менее. Как описано выше, считают, что состав по существу не был стабильным в композиции, имеющей молярное отношение CA/PPC менее 0,88, и не подходил в качестве инъецируемого препарата.

Сравнительный пример 4: инъецируемые формы PPC, солюбилизированного CDCA

Как показано в приведенной ниже таблице 9, композиции на основе фосфатидилхолина (PPC), солюбилизированного хенодезоксихолевой кислотой (CDCA), получают добавлением 50,0 мг PPC (5,0 %) и 10,0 мг (1,0 %), 15,0 мг (1,5 %), 20,0 мг (2,0 %), 21,0 мг (2,1 %), 22,0 мг (2,2%), 23,0 мг (2,3 %), 24,0 мг (2,4 %), 25,0 мг (2,5 %) или 30,0 мг (3,0 %) CDCA соответственно, и добавлением 9 мг бензилового спирта (0,9 %) в 1 мл. Конкретный способ получения соответствует способу в вышеупомянутом примере 1.

Таблица 9.

	Сравнительный пример 4-1	Сравнительный пример 4-2	Сравнительный пример 4-3	Сравнительный пример 4-4	Сравнительный пример 4-5	Сравнительный пример 4-6	Сравнительный пример 4-7	Сравнительный пример 4-8	Сравнительный пример 4-9
PPC мас./об.%	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
CDCA мас./об.%	1,0	1,5	2,0	2,1	2,2	2,3	2,4	2,5	3,0
CDCA/PPC молярное отношение	0,40	0,61	0,81	0,85	0,89	0,93	0,97	1,01	1,21
Свойство (после получения)	Сильно мутный	Сильно мутный	Мутный	Мутный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Свойство (через 30 дней после получения)	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	21,4	21,47	37,46	48,38	98,79	99,05	98,78	99,45	99,28
Размер частиц (нм)	80,05± 280,0	1250± 478,0	93,76± 6,100	35,73± 0,830	3,47± 0,960	3,98± 0,910	3,64± 0,941	3,08± 0,920	3,89± 0,890

Стабильность состава инъецируемых композиций PPC, солюбилизированного хенодзоксихолевой кислотой (CDCA) в таблице 9, оценивают сразу после получения и через 30 дней после получения (хранение в холодильнике), и результаты оценки представлены на фиг. 2E. Стабильность состава подтверждают, когда CDCA добавляют при 2,2 % или более по отношению к PPC 5,0 %, а композиция проявляла свойства прозрачного (чистого) раствора (сравнительные примеры с 4-5 по 4-9). В сравнительных примерах с 4-1 по 4-4 было подтверждено, что состав не стабилен из-за осаждения. В результате был сделан вывод, что стабильные инъецируемые препараты можно получить при концентрации CDCA 2,2 % или более в расчете на PPC 5,0 %. Размер частиц композиций сравнительных примеров от 4-1 до 4-4 составлял от 80,05 ± 280,0 до 35,73 ± 0,830 нм, то есть композиция диспергирована в виде нестабильной эмульсии или липосомы, но композиции в сравнительных примерах с 4-5 по 4-9 состояли из мицелл размером 10 нм или менее. Как описано выше, считают, что состав по существу не был стабильным в композиции, имеющей, молярное отношение CDCA/PPC менее 0,89, и не подходил в качестве инъецируемого препарата.

Сравнительный пример 5: инъецируемые формы PPC, солюбилизированного UDCA

Как показано в приведенной ниже таблице 10, композиции на основе фосфатидилхолина (PPC), солюбилизированного урсодезоксихолевой кислотой (UDCA), получают добавлением 50,0 мг PPC (5,0 %) и 10,0 мг (1,0 %), 15,0 мг (1,5 %), 25,0 мг (2,5 %), 26,0 мг (2,6 %), 27,0 мг (2,7 %), 28,0 мг (2,8 %), 29,0 мг (2,9 %) или 30,0 мг (3,0 %) UDCA соответственно, и добавлением 9 мг бензилового спирта (0,9 %) в 1 мл. Конкретный способ получения соответствует способу в вышеупомянутом примере 1.

Таблица 10.

	Сравнительный пример 5-1	Сравнительный пример 5-2	Сравнительный пример 5-3	Сравнительный пример 5-4	Сравнительный пример 5-5	Сравнительный пример 5-6	Сравнительный пример 5-7	Сравнительный пример 5-8	Сравнительный пример 5-9
PPC мас./об.%	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
UDCA мас./об.%	1,0	1,5	2,0	2,5	2,6	2,7	2,8	2,9	3,0
UDCA/PPC молярное отношение	0,42	0,62	0,83	1,04	1,08	1,12	1,16	1,20	1,25
Свойство (после получения)	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Мутный	Почти прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Свойство (через 30 дней после получения)	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	30,79	37,9	38,48	52,4	66,43	92,59	99,45	99,65	99,82
Размер частиц (нм)	289,0± 265,0	2698± 2475	83,20± 773,1	69,43± 315,0	42,42± 250	6,24± 0,430	2,31± 0,380	2,09± 0,450	2,22± 0,410

Стабильность состава инъецируемых композиций PPC, солюбилизированного урсодезоксихолевой кислотой (UDCA) в таблице 10, оценивают сразу после получения и через 30 дней после получения (хранение в холодильнике), и результаты оценки показаны на фиг. 2F. Стабильность состава подтверждают, когда UDCA добавляют при 2,7 % или более по отношению к PPC 5,0 %, а композиция проявляла свойства прозрачного (чистого) раствора (сравнительные примеры с 5-6 по 5-9). В сравнительных примерах с 5-1 по 5-5 было подтверждено, что состав не стабилен из-за осаждения. Композиция в сравнительном примере 5-6 была почти прозрачной сразу после получения, а после фильтрации через фильтр 0,2 мкм стала прозрачной. В результате был сделан вывод о том, что стабильные инъецируемые препараты можно получить при концентрации UDCA 2,7 % или более в расчете на PPC 5,0 %. Размер частиц композиций сравнительных примеров 5-1-5-5 составлял от 289,0 ± 265,0 до 42,42 ± 250 нм, то есть композиция диспергирована в виде нестабильной эмульсии или липосомы, но композиции в сравнительных примерах с 5-6 по 5-9 состояли из мицелл размером 10 нм или менее. Как описано выше, считают, что состав по существу не был стабильным в композиции, имеющей молярное отношение UDCA/PPC менее 1,12, и не подходил в качестве инъецируемого препарата.

Сравнительный пример 6: инъецируемые формы PPC, солюбилизированного GDCA

Как показано в приведенной ниже таблице 11, композиции на основе фосфатидилхолина (PPC), солюбилизированного гликодезоксихолевой кислотой (GDCA), получают добавлением 50,0 мг PPC (5,0 %) и 10,0 мг (1,0 %), 15,0 мг (1,5 %), 20,0 мг (2,0 %), 21,0 мг (2,1 %), 22,0 мг (2,2 %), 23,0 мг (2,3 %), 24,0 мг (2,4 %), 25,0 мг (2,5 %) или 30,0 мг (3,0 %) GDCA соответственно, и добавлением 9 мг бензилового спирта (0,9 %) в 1 мл. Конкретный способ получения соответствует способу в вышеупомянутом примере 1.

Таблица 11.

	Сравнительный пример 6-1	Сравнительный пример 6-2	Сравнительный пример 6-3	Сравнительный пример 6-4	Сравнительный пример 6-5	Сравнительный пример 6-6	Сравнительный пример 6-7	Сравнительный пример 6-8	Сравнительный пример 6-9
PPC мас./об.%	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
GDCA мас./об.%	1,0	1,5	2,0	2,1	2,2	2,3	2,4	2,5	3,0
GDCA/PPC молярное отношение	0,36	0,54	0,73	0,76	0,80	0,84	0,87	0,91	1,09
Свойство (после получения)	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Мутный	Мутный	Мутный	Почти прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Свойство (через 30 дней после получения)	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	21,68	34,67	30,94	46,88	48,39	58,6	92,43	99,76	99,83
Размер частиц (нм)	204,4± 1880	344,0± 3215	95,22± 246,0	231,3± 348,2	155,4± 270,3	134,8± 680,1	3,91± 0,420	4,87± 0,300	2,78± 0,260

Стабильность состава инъецируемых композиций PPC, солюбилизированного гликодезоксихолевой кислотой (GDCA) в таблице 11, оценивают сразу после получения и через 30 дней после получения (хранение в холодильнике), и результаты оценки представлены на фиг. 2G. Стабильность состава подтверждают, когда GDCA добавляют при 2,4 % или более по отношению к PPC 5,0 %, а композиция проявляла свойства прозрачного (чистого) раствора (сравнительные примеры с 6-7 по 6-9). В сравнительных примерах с 6-1 по 6-6 было подтверждено, что состав не был стабильным из-за осаждения. Композиция в сравнительном примере 6-7 была почти прозрачной сразу после получения, и после фильтрации через фильтр 0,2 мкм стала прозрачной. В результате был сделан вывод о том, что стабильные инъецируемые препараты можно получить при концентрации GDCA 2,4 % или более в расчете на PPC 5,0 %. Размер частиц композиций сравнительных примеров от 6-1 до 6-6 составлял от 204,4 ± 1880 до 134,8 ± 680,1 нм, то есть композиция диспергирована в виде нестабильной эмульсии или липосомы, но композиции в сравнительных примерах с 6-7 по 6-9 состояли из мицелл размером 10 нм или менее. Как описано выше, считают, что состав по существу не был стабильным в композиции, имеющей молярное отношение GDCA/PPC менее 0,87, и не подходил в качестве инъецируемого препарата.

Сравнительный пример 7: инъецируемые формы PPC, солюбилизированного TDCA

Как показано в Таблице 12 ниже, композиции на основе фосфатидилхолина (PPC), солюбилизированного тауродезоксихолевой кислотой (TDCA), получают добавлением 50,0 мг PPC (5,0 %) и 10,0 мг (1,0 %), 15,0 мг (1,5 %), 20,0 мг (2,0 %), 21,0 мг (2,1 %), 22,0 мг (2,2 %), 23,0 мг (2,3 %), 24,0 мг (2,4 %), 25,0 мг (2,5 %) или 30,0 мг (3,0 %) TDCA соответственно, и добавлением 9 мг бензилового спирта (0,9 %) в 1 мл. Конкретный способ получения соответствует способу в вышеупомянутом примере 1.

Таблица 12.

	Сравнительный пример 7-1	Сравнительный пример 7-2	Сравнительный пример 7-3	Сравнительный пример 7-4	Сравнительный пример 7-5	Сравнительный пример 7-6	Сравнительный пример 7-7	Сравнительный пример 7-8	Сравнительный пример 7-9
PPC мас./об.%	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
TDCA мас./об.%	1,0	1,5	2,0	2,1	2,2	2,3	2,4	2,5	3,0
TDCA/PPC молярное отношение	0,32	0,48	0,64	0,67	0,71	0,74	0,77	0,80	0,96
Свойство (после получения)	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Мутный	Почти прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Свойство (через 30 дней после получения)	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	33,24	29,56	25,12	41,58	53,68	87,82	99,45	99,78	99,98
Размер частиц (нм)	185,1± 1834	307,2± 90,90	199,2± 163,2	229,0± 330,9	123,5± 72,0	1,46± 0,410	1,80± 0,320	1,71± 0,450	1,85± 0,380

Стабильность состава инъецируемых композиций PPC, солюбилизированного тауродезоксихолевой кислотой (TDCA) в таблице 12, оценивают сразу после получения и через 30 дней после получения (хранение в холодильнике), и результаты оценки представлены на фиг. 2H. Стабильность состава подтверждают, когда TDCA добавляют при 2,3 % или более по отношению к PPC 5,0 %, а композиция проявляла свойства прозрачного (чистого) раствора (сравнительные примеры с 7-6 по 7-9). В сравнительных примерах с 7-1 по 7-5 было подтверждено, что состав не был стабильным из-за осаждения. Композиция в сравнительном примере 7-6 была почти прозрачной сразу после получения, а после фильтрации через фильтр 0,2 мкм стала прозрачной. В результате был сделан вывод, что стабильные инъецируемые препараты можно получить при концентрации TDCA 2,3 % или более в расчете на PPC 5,0 %. Размер частиц композиций сравнительных примеров от 7-1 до 7-5 составлял от 185,1 ± 1834 до 123,5 ± 72,0 нм, то есть композиция диспергирована в виде нестабильной эмульсии или липосомы, но композиции в сравнительных примерах с 7-6 по 7-9 состояли из мицелл размером 10 нм или менее. Как описано выше, считают, что состав по существу не был стабильным в композиции, имеющей молярное отношение TDCA/PPC менее 0,74, и не подходил в качестве инъецируемого препарата.

Сравнительный пример 8: инъецируемые формы PPC, солюбилизированного HDCA

Как показано в таблице 13 ниже, композиции на основе фосфатидилхолина (PPC), солюбилизированного гиодезоксихолевой кислотой (HDCA), получают добавлением 50,0 мг PPC (5,0 %) и 10,0 мг (1,0 %), 15,0 мг (1,5 %), 20,0 мг (2,0 %), 21,0 мг (2,1 %), 22,0 мг (2,2 %), 23,0 мг (2,3 %), 24,0 мг (2,4 %), 25,0 мг (2,5 %) или 30,0 мг (3,0 %) HDCA соответственно, и добавлением 9 мг бензилового спирта (0,9 %) в 1 мл. Конкретный способ получения соответствует способу в вышеупомянутом примере 1.

Таблица 13.

	Сравнительный пример 8-1	Сравнительный пример 8-2	Сравнительный пример 8-3	Сравнительный пример 8-4	Сравнительный пример 8-5	Сравнительный пример 8-6	Сравнительный пример 8-7	Сравнительный пример 8-8	Сравнительный пример 8-9
PPC мас./об.%	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
HDCA мас./об.%	1,0	1,5	2,0	2,1	2,2	2,3	2,4	2,5	3,0
HDCA/PPC молярное отношение	0,41	0,62	0,82	0,86	0,91	0,95	0,99	1,03	1,24
Свойство (после получения)	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Почти прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Свойство (через 30 дней после получения)	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	26,53	26,89	25,97	26,74	35,61	96,38	99,94	99,73	99,91
Размер частиц (нм)	537,2± 320	469,8± 33,20	168,3± 122	83,05± 650,5	81,65± 24,30	3,30± 0,980	3,21± 0,800	2,92± 1,150	3,47± 0,820

Стабильность состава инъецируемых композиций PPC, солюбилизированного гиодезоксихолевой кислотой (HDCA) в таблице 13, оценивают сразу после получения и через 30 дней после получения (хранение в холодильнике), и результаты оценки представлены на фиг. 2I. Стабильность состава подтверждают, когда HDCA добавляют при 2,3 % или более по отношению к PPC 5,0 %, а композиция проявляла свойства прозрачного (чистого) раствора (сравнительные примеры с 8-6 по 8-9). В сравнительных примерах с 8-1 по 8-5 было подтверждено, что состав не был стабильным из-за осаждения. Композиция в сравнительном примере 8-6 была почти прозрачной сразу после получения, а после фильтрации через фильтр 0,2 мкм стала прозрачной. В результате был сделан вывод о том, что стабильные инъецируемые препараты можно получить при концентрации HDCA 2,3 % или более из расчета PPC 5,0 %. Размер частиц композиций сравнительных примеров с 8-1 по 8-5 составлял от 537,2 ± 320 до 81,65 ± 24,30 нм, то есть композиция диспергирована в виде нестабильной эмульсии или липосомы, но композиции в сравнительных примерах с 8-6 по 8-9 состояли из мицелл размером 10 нм или менее. Как описано выше, считают, что состав по существу не был стабильным в композиции, имеющей молярное отношение HDCA/PPC менее 0,95, и не подходил в качестве инъецируемого препарата.

Авторами неожиданно было обнаружено, что комплексная композиция PPC, солюбилизированного HDCA, становилась мутной при хранении при низких температурах (от 4 до 8 °C) и снова становилась прозрачной при комнатной температуре. Был сделан вывод, что комплексная композиция PPC плюс HDCA имеет плохую стабильность состава при хранении в холодильнике и должна храниться при комнатной температуре в течение длительного времени. Однако установили, что HDCA является не подходящим солюбилизирующим агентом для качественной комплексной композиции PPC из-за увеличения лизофосфатидилхолина, который вызывает гемолиз, при хранении композиции PPC плюс HDCA при комнатной температуре в течение длительного времени.

Сравнительный пример 9: инъецируемые формы PPC, солюбилизированного TUDCA

Как показано в таблице 14 ниже, композиции на основе фосфатидилхолина (PPC), солюбилизированного тауроурсодеоксихолевой кислотой (TUDCA), получают путем добавления 50,0 мг PPC (5,0 %) и 10,0 мг (1,0 %), 15,0 мг (1,5 %), 20,0 мг. (2,0 %), 25,0 мг (2,5 %), 30,0 мг (3,0 %), 35,0 мг (3,5 %), 40,0 мг (4,0 %), 45,0 мг (4,5 %) или 50,0 мг (5,0 %) TUDCA соответственно, и добавление 9 мг бензилового спирта (0,9 %) в 1 мл. Конкретный способ получения такой же, как и в вышеупомянутом примере 1.

Таблица 14.

	Сравнительный пример 9-1	Сравнительный пример 9-2	Сравнительный пример 9-3	Сравнительный пример 9-4	Сравнительный пример 9-5	Сравнительный пример 9-6	Сравнительный пример 9-7	Сравнительный пример 9-8	Сравнительный пример 9-9
PPC мас./об.%	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
TUDCA мас./об.%	1,0	1,5	2,0	2,5	3,0	3,5	4,0	4,5	5,0
TUDCA/PPC молярное отношение	0,32	0,48	0,64	0,80	0,97	1,13	1,29	1,45	1,61
Свойство (после получения)	Сильно мутный	Сильно мутный	Сильно мутный	Мутный	Мутный	Мутный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Свойство (через 30 дней после получения)	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Осадок	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	19,56	21,2	24,8	38,43	42,16	62,49	98,87	99,13	99,56
Размер частиц (нм)	86,30± 850,3	77,72± 110,3	51,02± 120,0	41,2± 58,2	26,2± 18,6	22,8± 0,980	2,07± 0,450	1,92± 0,650	2,20± 0,420

Стабильность состава инъецируемых композиций PPC, солюбилизированных тауроурсодеоксихолевой кислотой (TUDCA) в таблице 14, оценивают сразу после получения и через 30 дней после получения (хранение в холодильнике), и результаты оценки представлены на фиг. 2J. Стабильность состава подтверждают, когда TUDCA добавляют при 4,0 % или более по отношению к PPC 5,0 %, а композиция проявляла свойства прозрачного (чистого) раствора (сравнительные примеры с 9-7 по 9-9). В сравнительных примерах с 9-1 по 9-6 было подтверждено, что состав был нестабильным из-за осаждения. В результате был сделан вывод о том, что стабильные инъецируемые препараты можно получить при концентрации TUDCA 4,0 % или более в расчете на PPC 5,0 %. Размер частиц композиций сравнительных примеров с 9-1 по 9-6 составлял от 86,30 ± 850 до 22,8 ± 0,980 нм, то есть композиция диспергирована в виде нестабильной эмульсии или липосомы, но композиции в сравнительных примерах с 9-7 по 9-9 состояли из мицелл размером 10 нм или менее. Как описано выше, считают, что состав по существу не был стабильным в композиции, имеющей молярное отношение TUDCA/PPC менее 1,29, и не подходила в качестве инъецируемого препарата.

В таблице 15 ниже представлены наиболее предпочтительные минимальные молярные отношения различных желчных кислот (ЖК) к PPC (ЖК/PPC) среди предпочтительного молярного отношения ЖК/PPC, требуемого для получения инъецируемых композиций PPC, как описано в сравнительных примерах 1-9 и примере 1 и 2. Соли желчных кислот (ЖК), которые можно применять для получения стабильных прозрачных инъецируемых композиций, в которых РРС диспергирован в виде мицелл размером 10 нм или менее при низких температурах и при комнатной температуре, представляют собой дезоксихолевую кислоту (DCA), холевую кислота (CA), гликохолевую кислоту (GCA), таурохолевую кислоту (TCA), хенодезоксихолевую кислоту (CDCA), урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), гликодезоксихолевую кислоту (GDCA), тауродезоксихолевую кислоту (TDCA) и тауроурсодеоксихолевую кислоту (TUDCA) и в условиях комнатной температуры гиодезоксихолевую кислоту (HDCA). При вышеупомянутых минимальных молярных отношениях они солюбилизируют PPC, который диспергируется в виде мицелл стабильного прозрачного раствора. Наиболее предпочтительное минимальное молярное отношение ЖК/PPC для солюбилизации PPC желчными кислотами (ЖК) составляет 0,92 ± 0,17. То есть наиболее предпочтительное минимальное молярное отношение ЖК/PPC составляет от 0,74 до 1,29, как показано в таблице 15 ниже. Для солюбилизации PPC 5%, ЖК следует смешать при концентрации по меньшей мере 2,49 ± 0,56 мас./об.%.

Таблица 15.

	DCA	CA	GCA	TCA	CDCA	UDCA	GDCA	TDCA	HDCA	TUDCA
PPC мас./об.%	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
ЖК мас./об.%	2,1	2,2	2,2	2,5	2,2	2,7	2,4	2,3	2,3	4,0
ЖК/PPC молярное отношение	0,87	0,88	0,76	0,78	0,89	1,12	0,87	0,74	0,95	1,29
Свойство (после получения)	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Свойство (через 30 дней после получения)	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный	Прозрачный
Прозрачность (660нм)	99,41	95,56	88,0	94,2	98,79	92,59	92,43	87,82	96,38	98,87
Размер частиц (нм)	8,57 ±0,7	3,22 ±0,9	9,84±1,8	9,88 ±1,4	3,47 ±1,0	2,24 ±0,4	3,91 ±0,4	1,46 ±0,4	3,30 ±1,0	2,07 ±0,5

Сравнительный пример 10: инъецируемые формы PPC, солюбилизированного LCA

Композиции на основе фосфатидилхолина (PPC 5,0 %), солюбилизированного литохолевой кислотой (LCA) 3,0 мас./об.%, получали способом в соответствии с примером 1.

Однако, как показано на фиг. 3А, литохолевая кислота (LCA) проявляла свойства мутности и осаждения из-за явления гелеобразования, когда PPC солюбилизировали гидроксидом натрия.

Сравнительный пример 11: инъецируемые формы PPC, солюбилизированного DHCA

Композиции на основе фосфатидилхолина (PPC 5,0 %), солюбилизированного дигидрохолевой кислотой (DHCA) 2,5 %, 3,0 %, 4,0 % или 5,0 %, получают способом, аналогичным описанному в примере 1. Однако, как показано на фиг. 3B, дигидрохолевая кислота (DHCA) проявляла свойства мутности и осаждения, когда pH регулировают после солюбилизации PPC гидроксидом натрия, так что ее считают не подходящей в качестве инъецируемой композиции.

Сравнительный пример с 12 по 30: получение композиций, содержащих только PPC, композиций, содержащих только ЖК и комплексных композиций PPC плюс ЖК

Инъецируемые композиции, содержащие только дезоксихолевую кислоту (DCA) (сравнительный пример 12), только холевую кислоту (CA) (сравнительный пример 13), только гликохолевую кислоту (GCA) (сравнительный пример 14), только таурохолевую кислоту (TCA) (сравнительный пример 15), только хенодезоксихолевую кислоту (CDCA) (сравнительный пример 16), только урсодезоксихолевую кислоту (UDCA) (сравнительный пример 17), только гликодезоксихолевую кислоту (GDCA) (сравнительный пример 18), только тауродезоксихолевую кислоту (TDCA) (сравнительный пример 19), только гиодезоксихолевую кислоту (HDCA) (сравнительный пример 20) и только тауроурсодезоксихолевую кислоту (TUDCA) (сравнительный пример 21) в различных концентрациях (от 1,0 до 7,5 мас./об.% и т.п.) получают в виде односоставных композиций. Конкретно, композицию получают добавлением 10,0 мг (1,0 %), 25,5 мг (2,5 %), 50,0 мг (5,0 %) или 75,5 мг (7,5 %) желчной кислоты соответственно и добавлением 9 мг (0,9 %) бензилового спирта. Способ состоял в том, что воду для инъекций помещают в резервуар для получения, который очищают и стерилизуют (комнатная температура), и к воде для инъекций добавляют гидроксид натрия. Затем добавляют желчные кислоты (соли) и бензиловый спирт, перемешивают и растворяют. Затем перемешивают при 200 об/мин в течение приблизительно 2 часов при затенении, герметизации, комнатной температуре (25 °С) и давлении азота. После завершения перемешивания, pH доводят до нужного значения, фильтруют через фильтр 0,2 мкм, смесь переносят во флакон и герметизируют.

Кроме того, были получены композиции, содержащие только PPC в различных концентрациях [(PPC 1,25 %, 2,50 %, 5,0 %, 7,5 %, 10,0 %, 12,5 % и 15,0 %) (сравнительный пример 22)]. Конкретный способ получения соответствует способу в вышеупомянутом примере 1.

И композиции PPC 5,0 % плюс DCA 2,2 % (сравнительный пример 23), PPC 5,0 % плюс HDCA2,5% (сравнительный пример 24), PPC 5,0 % плюс UDCA 3,0 % (сравнительный пример 25), PPC 5,0 % плюс TDCA 2,5 % (сравнительный пример 26), PPC 5,0 % плюс GDCA 2,5 % (сравнительный пример 27), PPC 5,0 % плюс CDCA 2,5 % (сравнительный пример 28), PPC 5,0 % плюс CA 2,5 % (сравнительный пример 29) и PPC 5,0 % плюс TUDCA 4,0 % (сравнительный пример 30) получают в виде комплексных композиций. Конкретный способ получения такой же, как в сравнительном примере 2-9.

Пример 3 и 4: получение комплексных композиций PPC, солюбилизированного GCA или TCA

Получают композиции PPC плюс GCA [(PPC 2,5 % плюс GCA 1,25 %, PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 %, PPC 7,5 % плюс GCA 3,75 %, PPC 10,0 % плюс GCA 5,0 %, PPC 15,0 % плюс GCA 7,5 %, PPC 5,0 % плюс GCA 5,0 %, PPC 5,0 % плюс GCA 7,5 %, PPC 5,0 % плюс GCA 10,0 %, PPC 5,0 % плюс GCA 15,0 %, PPC 5,0 % плюс GCA 20,0 % и PPC 5,0 % плюс GCA 25,0 %) (пример 3)] и PPC плюс TCA [(PPC 2,5 % плюс TCA 1,25 %, PPC 5,0 % плюс TCA 2,5 %, PPC 7,5 % плюс TCA 3,75 %, PPC 10,0 % плюс TCA 5,0 %, PPC 15,0 % плюс TCA 7,5 %, ПК 5,0 % плюс TCA 5,0 %, PPC 5,0 % плюс TCA 7,5 %, PPC 5,0 % плюс TCA 10,0 %, PPC 5,0 % плюс TCA 15,0 %, PPC 5,0 % плюс TCA 20,0 % и PPC 5,0 % плюс TCA 25,0 %) (пример 4)]. Конкретный способ получения такой же, как в Примерах 1 и 2.

Экспериментальный пример 1: сравнение побочных эффектов (воспаление, отек и поражение кожи)

Проводят испытания в отношении появления отека, поражения кожи и воспаления, композиции, содержащей только фосфатидилхолин (PPC) в различной концентрации (сравнительный пример 22), только желчную кислоту (ЖК) (сравнительные примеры с 12 по 21), комплексной композиции PPC, солюбилизированного DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA или CA (сравнительные примеры с 23 по 29) и комплексной композиции PPC, солюбилизированного GCA или TCA (примеры 3 и 4).

Воспаление, отек и локальные или обширные поражения кожи в месте введения являются типично наблюдаемыми локальными побочными эффектами общеизвестных и применяемых инъецируемых композиций, содержащих только DCA (таких как Kybella) или инъецируемых композиций PPC (таких как Lipostabil, Lipobean и др.). Далее представлены результаты испытания in vivo в отношении появления отека, воспаления и повреждения кожи при подкожном введении композиций, содержащих только желчные кислоты (соли), композиций, содержащих только PPC, и комплексной композиции PPC, солюбилизированного желчной кислотой. На основании полученных результатов было обнаружено, что инъецируемые композиции PPC, солюбилизированного GCA, TCA или TUDCA при определенном молярном отношении, по существу не вызывают воспаление и отек или облегчают их прявление на 80 %. Такие результаты были получены неожиданно при оценке эффективности отдельных веществ. Следующие способы испытаний и результаты описаны ниже. Далее % композиции относится к мас./об.%.

1-1: отек лапы крысы

Чтобы оценить степень отека, каждую тестируемую композицию, описанную выше, вводят в лапу крысе. В частности, самцов крыс Sprague Dawley (в возрасте 6 недель) покупают и применяют после одной недели адаптации. Крыс (масса тела от 170 до 200 г) отбирают случайным образом, и толщину лапы крысы измеряют штангенциркулем перед введением тестируемых композиций. Для наблюдения за отеком, вводят 0,1 мл PBS и различных тестируемых композиций в лапы крыс. Измерения объема лапы проводят штангенциркулем непосредственно перед инъекцией, сразу после инъекции и через 1 или 2 часа после инъекции. Кроме того, при измерении толщины лапы, выполняют фотографирование подошвы лапы для наблюдения за поражением кожи в месте инъекции (с применением шкалы 4 × 4 см).

Степень выраженности отека оценивают от 0 до 4 баллов. Степень отека сразу после инъекции и через 1 или 2 часа после инъекции оценивают по сравнению с состоянием до инъекции, когда степень выраженности отека оценивают как его отсутствие [-, (степень отека 0% по сравнению с состоянием до инъекции)], легкий отек [+, (степень отека 1-20% по сравнению с состоянием до инъекции)], умеренный отек [++, (степень отека 20-40% по сравнению с состоянием до инъекции)], тяжелый отек [+++, (степень отека 40-60% по сравнению с состоянием до инъекции)] и крайне тяжелый отек [++++, (степень отека 60% или более по сравнению с состоянием до инъекции)] ,

Результаты оценки отека через 2 часа после введения (когда отек наиболее тяжелый) для композиции, содержащей только PPC (1,25 %, 2,50 %, 5,0 %, 7,5 %, 10,0 %, 12,5 % или 15,0 %) были следующими: в приведенной ниже таблице 16 показано, что оценка "легкий" сохранялась для PPC от 1,25 % до 10,0 %, оценка "умеренный" для PPC 12,5 % и 15,0 %. Отек через 2 часа после введения DCA 1,0 % увеличился до "тяжелого" (фиг. 4A). В заключение, композиция, содержащая только PPC, при высокой концентрации показала зависимый от концентрации отек, но композиция, содержащая только PPC 15 %, то есть в самой высокой концентрации, вызывала отек в значительно меньшей степени по сравнению с DCA 1,0 %.

Таблица 16.

PPC мас./об.%	Сразу после введения	1 час после введения	2 часа после введения
1,25	+	+	+
2,50	+	+	+
5,00	+	+	+
7,50	++	+	+
10,0	++	+	+
12,5	++	++	++
15,0	+++	++	++

Результаты оценки выраженности отека через 2 часа после введения различных концентраций желчных кислот (1,0 %, 2,5 %, 5,0 %, 7,5 %), когда отек был наиболее тяжелым, представлены в следующей таблице 17, где оценка "легкий" показана для TUDCA 1,0 %, 2,5 %, GCA 1,0 % и TCA 1,0 %, оценка "умеренный" показана для UDCA 1,0 %, GDCA 1,0 %, CA 1,0 %, GCA от 2,5 до приблизительно 5,0 %, TCA от 2,5 до приблизительно 5,0 % , TUDCA от 5,0 до приблизительно 7,5 %, и для оставшихся различных концентраций желчных кислот показаны оценки выраженности отека "тяжелый" и "крайне тяжелый " (фиг. 4B-4K).

Таблица 17.

ЖК	мас./об.%	Сразу после введения	1 час после введения	2 часа после введения
DCA	1,0	++	+++	+++
	2,5	++	++++	++++
	5,0	++	++++	++++
7,5	++	++++	++++
HDCA	1,0	++	++	+++
	2,5	++	++	+++
	5,0	++	++++	++++
7,5	++	++++	++++
UDCA	1,0	++	++	++
	2,5	++	+++	++++
	5,0	++	++++	++++
7,5	++	++++	++++
TDCA	1,0	++	+++	+++
	2,5	++	+++	+++
	5,0	++	++++	++++
7,5	++	++++	++++
GDCA	1,0	++	+++	++
	2,5	++	+++	+++
	5,0	++	++++	++++
7,5	++	++++	++++
CDCA	1,0	++	+++	+++
	2,5	++	+++	++++
	5,0	++	++++	++++
7,5	++	++++	++++
CA	1,0	++	++	++
	2,5	++	++	+++
	5,0	++	+++	++++
7,5	++	++++	++++
GCA	1,0	+	+	+
	2,5	++	++	++
	5,0	++	++	++
7,5	++	++++	++++
TCA	1,0	++	+	+
	2,5	++	++	++
	5,0	++	++	++
7,5	++	+++	++++
TUDCA	1,0	++	+	+
	2,5	++	+	+
	5,0	++	+	++
7,5	++	++	++

В частности, как показано в результатах испытания на жизнеспособность адипоцитов in vitro, описанного ниже, PPC 5 % продемонстрировал способность к уменьшению адипоцитов, эквивалентному уменьшению для DCA 1 %. При сравнении результатов, полученных при концентрации желчных кислот 2,5 %, которая нормально и обычно требуется для солюбилизации PPC 5 %, степень выраженности отека была "легкой" для TUDCA, "умеренной" для GCA и TCA, "тяжелой" для HDCA, TDCA, GDCA и CA, и "крайне тяжелой" для DCA, UDCA, CDCA через 2 часа после введения, как показано в таблице 17. На фиг. 4L представлены результаты сравнения отека через 2 часа после введения композиции, содержащей только PPC 5,0 %, композиций, содержащих только каждую желчную кислоту в отдельности, в концентрации, требуемой для солюбилизации PPC 5,0 % (обычно около 2,5 %, но 3 % для UDCA, 4% для TUDCA), или PBS, и полученный результат соответствовал результатам в таблице 17.

В связи с этим, чтобы подтвердить степень выраженности воспаления при введении комплексных композиций PPC, солюбилизированного различными желчными кислотами, сравнивают степень отека через 2 часа после введения комплексной композиции PPC 5,0 %, солюбилизированного каждой желчной кислотой. Как показано в таблице 18, было подтверждено, что для GCA, TCA и TUDCA показано "отсутствие отека", для CA показана оценка "умеренный", а для HDCA, UDCA, TDCA, GDCA и CDCA показана оценка "тяжелый" (фиг. 4M).

Таблица 18.

PPC мас./об.%	ЖК мас./об.%	Сразу после введения	1 час после введения	2 часа после введения
5,0	DCA 2,2	+++	+++	+++
5,0	HDCA 2,5	++	+++	+++
5,0	UDCA 3,0	++	+++	+++
5,0	TDCA 2,5	+++	+++	+++
5,0	GDCA 2,5	+++	+++	+++
5,0	CDCA 2,5	++	+++	+++
5,0	CA 2,5	+++	+++	++
5,0	GCA 2,5	+	-	-
5,0	TCA 2,5	+	+	-
5,0	TUDCA 4,0	+	+	-

Авторами неожиданно обнаружено, что степень выраженности отека, вызванного композициями, содержащими только GCA (2,5 %), TCA (2,5 %) и TUDCA (5,0 %), была умеренной (таблица 17), но степень выраженности отека, вызванного комплексной композицией PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA (2,5 %), TCA (2,5 %) и TUDCA (4,0 %) снижалась до нулевой или легкой (фиг. 4M).

Для того, чтобы наблюдать отек в соответствии с изменениями концентрации, сравнивают комплексные композиции PPC, солюбилизированного GCA или TCA, по степени отека в зависимости от времени. В результате для комплексных композиций, соответствующих PPC от 2,5 до 5,0 %, показано "отсутствие отека", для комплексных композиций, соответствующих PPC от 7,5 до 10,0 % показан "легкий" отек, а для комплексных композиций, соответствующих PPC 15,0 %, показан "умеренный" через 2 часа после введения, как показано в таблицах 19 и 20 (фиг. 4N-4O).

Таблица 19.

PPC мас./об.%	GCA мас./об.%	Сразу после введения	1 час после введения	2 часа после введения
2,50	1,25	+	-	-
5,00	2,50	+	-	-
7,50	3,75	+	+	+
10,0	5,00	+	+	+
15,0	7,50	++	++	++

Таблица 20.

PPC мас./об.%	TCA мас./об.%	Сразу после введения	1 час после введения	2 часа после введения
2,50	1,25	+	-	-
5,00	2,50	+	+	-
7,50	3,75	++	+	+
10,0	5,00	++	+	+
15,0	7,50	++	++	++

В комплексной композиции PPC, солюбилизированного желчными кислотами, время получения стабильного прозрачного раствора сокращается по мере увеличения концентрации добавляемых желчных кислот. По этой причине отек оценивают с помощью композиций, в которых повышена концентрация GCA или TCA, способных солюбилизировать PPC 5,0 %. Испытуемые композиции представляют собой комплексные композиции PPC 5,0 %, смешанные с 2,5 %, 5,0 %, 7,5 %, 10,0 %, 5,0 %, 20,0 % или 25,0 % GCA или TCA, соответственно. Как показано в таблице 21 и таблице 22, предпочтительное молярное отношение GCA/PPC, при котором отсутствует или появляется легкий отек, составляло 2,60 моль/моль или менее, а при молярном отношении 3,47 моль/моль или менее от вышеуказанного значения, отек оценивают, как легкий и умеренный и тяжелый отек отмечают при молярном отношении более 3,47 моль/моль. Кроме того, предпочтительное молярное отношение TCA/PPC, при котором отсутствует или появляется легкий отек, составляло 2,35 моль/моль или менее, а при молярном отношении 3,13 моль/моль или менее от вышеуказанного значения, отек оценивают, как легкий и умеренный и тяжелый отек отмечают при молярном отношении более 3,13 моль/моль (фиг. 4P и 4Q).

Таблица 21.

PPC мас./об.%	GCA мас./об.%	GCA/PPC молярное отношение (моль/моль)	Сразу после введения	1 час после введения	2 часа после введения
5,00	2,50	0,87	+	-	-
	5,00	1,73	+	+	-
	7,50	2,60	+	+	+
	10,0	3,47	+	++	++
	15,0	5,20	++	+++	++
	20,0	6,94	++	+++	++
25,0	8,67	++	++	++

Таблица 22.

PPC мас./об.%)	TCA мас./об.%	TCA/PPC молярное отношение (моль/моль)	Сразу после введения	1 час после введения	2 часа после введения
5,00	2,50	0,78	+	+	-
	5,00	1,57	+	+	+
	7,50	2,35	+	+	+
	10,0	3,13	+	++	++
	15,0	4,70	++	+++	+++
	20,0	6,26	++	+++	++
25,0	7,83	++	+++	+++

По общим результатам оценки степени выраженности отека in vivo, для композиции, содержащей только PPC от 1,25 до 10,0%, показан "легкий" отек через 2 часа после введения, когда отек был наиболее тяжелым, как показано в таблицах 16-22 и на фиг. 4 (фиг. 4A-4Q). Для желчных кислот (ЖК), выбранных для устранения ограничения промышленного применения, из-за низкой стабильности состава, содержащих только PPC, DCA 2,5 %, UDCA 2,5 %, CDCA 2,5 %, HDCA 2,5 %, TDCA 2,5 %, GDCA 2,5 % и CA 2,5 % показан "тяжелый" и "крайне тяжелый" отек, а для GCA 2,5 %, TCA 2,5 % и TUDCA 5,0 % показан "умеренный" отек. Но для комплексной композиции PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA, TCA или TUDCA, показано "отсутствие" отека или "легкий" отек. В результате наблюдения изменений отека в зависимости от концентраций и количества смешиваемых компонентов, для комплексной композиции PPC от 2,5 до 10,0 %, солюбилизированного от 1,25 до 5,0 % GCA или TCA, показано "отсутствие" отека или "легкий" отек. Молярное отношение GCA/PPC, равное 3,47 моль/моль или менее, предпочтительно 2,60 моль/моль или менее, и молярное отношение TCA/PPC, равное 3,13 моль/моль или менее, предпочтительно 2,35 моль/моль или менее, показало "отсутствие" отека или "легкий" отек. Согласно результатам предыдущих исследований и результатам испытания на жизнеспособность адипоцитов (см. испытание 2, описанное ниже), TUDCA оказалась неподходящим солюбилизирующим агентом вследствие ингибирования апоптоза, который является механизмом лизиса адипоцитов PPC.

1-2: Оценка тяжести поражения кожи (эритема)

Для оценки неблагоприятных эффектов на коже после введения испытуемых композиций, фотографируют повреждения кожи подошвы лап крысы (с применением шкалы 4 см х 4 см) при измерении толщины лап в экспериментальном примере 1-1. Тяжесть поражения кожи оценивают от 0 до 4 баллов. Оценки тяжести поражения кожи сразу после инъекции и через 1 или 2 часа после инъекции сравнивают с оценкой до инъекции, когда степень тяжести поражения кожи оценивают, как отсутствие эритемы (-), очень незначительно выраженная эритема [(едва различимая визуально), легкая (+)], выраженная эритема (умеренная, ++), слегка выраженная эритема (тяжелая, +++) и тяжелая эритема (крайне тяжелая, ++++).

Во-первых, эритема вообще отсутствовала при введении композиций, содержащих только PPC во всех концентрациях (от 1,25 до 15,0 %), как показано в таблице 23 (фиг. 5A).

Таблица 23.

PPC мас./об.%	Сразу после введения	1 час после введения	2 часа после введения
1,25	-	-	-
2,50	-	-	-
5,00	-	-	-
7,50	-	-	-
10,0	-	-	-
12,5	-	-	-
15,0	-	-	-

Далее, результаты оценки тяжести поражения кожи для односоставных композиций с различными концентрациями (ЖК 1,0 %, 2,5 %, 5,0 % и 7,5 %) представлены в таблице 24, где для DCA, HDCA, UDCA, GDCA, TDCA и CDCA в концентрации 2,5 % или более и СА 5,0 % или более показана тяжелая и крайне тяжелая эритема. И было подтверждено, что GCA и TCA 5,0 % или менее не вызывают или вызывают легкую эритему, а TUDCA не приводила к появлению эритемы (фиг. 5B и 5C).

Таблица 24.

ЖК	мас./об.%	Сразу после введения	1 час после введения	2 часа после введения
DCA	1,0	++	++	++
	2,5	++	++++	+++
	5,0	++	++++	++++
7,5	++	++++	++++
HDCA	1,0	+	+	+
	2,5	+	+++	+++
	5,0	+	++++	++++
7,5	++	++++	++++
UDCA	1,0	+	++	++
	2,5	++	++	+++
	5,0	++	++++	++++
7,5	++	++++	++++
TDCA	1,0	+	+++	++
	2,5	++	+++	+++
	5,0	++	++++	++++
7,5	++	++++	++++
GDCA	1,0	++	++	++
	2,5	++	++++	++++
	5,0	++	++++	++++
7,5	++	++++	++++
CDCA	1,0	+	++	++
	2,5	++	++++	++++
	5,0	++	++++	++++
7,5	++	++++	++++
CA	1,0	-	+	+
	2,5	-	++	++
	5,0	++	+++	+++
7,5	++	++++	++++
GCA	1,0	-	-	-
	2,5	+	+	+
	5,0	+	+	+
7,5	+	++	++
TCA	1,0	-	-	-
	2,5	+	+	+
	5,0	+	+	+
7,5	+	++	++
TUDCA	1,0	-	-	-
	2,5	-	-	-
	5,0	-	-	-
7,5	-	-	-

Результаты оценки тяжести поражения кожи для комплексных композиций PPC 5,0 %, солюбилизированного различными желчными кислотами представлены в таблице 25, где для комплексной композиции PPC 5,0 %, солюбилизированного DCA, HDCA, UDCA или CDCA, показана тяжелая эритема, для комплексной композиции PPC 5,0 %, солюбилизированного TDCA, GDCA или СА показана умеренная эритема, а комплексная композиция PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA, TCA и TUDCA не приводила к появлению эритемы через 2 часа после введения (фиг. 5D).

Таблица 25.

PPC мас./об.%	ЖК мас./об.%	Сразу после введения	1 час после введения	2 часа после введения
5,0	DCA 2,2	+	+++	+++
5,0	HDCA 2,5	+	+++	+++
5,0	UDCA 3,0	+	+++	+++
5,0	TDCA 2,5	+	++	++
5,0	GDCA 2,5	+	++	++
5,0	CDCA 2,5	+	+++	+++
5,0	CA 2,5	-	++	++
5,0	GCA 2,5	-	-	-
5,0	TCA 2,5	-	-	-
5,0	TUDCA 4,0	-	-	-

Для того, чтобы наблюдать тяжесть поражения кожи в соответствии с изменениями концентрации, степень тяжести поражения сравнивают с различными концентрациями комплексной композиции PPC, солюбилизированного GCA. Как показано в таблице 26, поражения отсутствуют для PPC 10,0 % плюс GCA 5,0 % или менее, и легкие поражения показаны для PPC 15,0 % плюс GCA 7,5 % (фигура 5E).

Таблица 26.

PPC мас./об.%	GCA мас./об.%	Сразу после введения	1 час после введения	2 часа после введения
2,50	1,25	-	-	-
5,00	2,50	-	-	-
7,50	3,75	-	-	-
10,0	5,00	-	-	-
15,0	7,50	+	+	+

Поражения оценивают для композиций с повышенной концентрацией GCA, способных к солюбилизации PPC 5,0 %. Как показано в таблице 27, предпочтительное молярное отношение GCA/PPC, при котором повреждение кожи отсутствует или оценивается как легкое, составляло 2,60 моль/моль или менее, и при молярном отношении 3,47 моль/моль или более наблюдают тяжелое или крайне тяжелое повреждение (фиг. 5F).

Таблица 27.

PPC мас./об.%	GCA мас./об.%	GCA/PPC молярное отношение (моль/моль)	Сразу после введения	1 час после введения	2 часа после введения
5,00	2,50	0,87	-	-	-
	5,00	1,73	-	-	-
	7,50	2,60	-	+	+
	10,0	3,47	+	+++	+++
	15,0	5,20	+++	++++	++++
	20,0	6,94	+++	++++	++++
25,0	8,67	++++	++++	++++

По общим результатам оценки степени тяжести поражения кожи in vivo, как показано в таблицах 23-27 и на фиг. 5, для композиции, содержащей только PPC от 1,25 до 10,0 % показано отсутствие поражения. Для желчных кислот (ЖК), выбранных для устранения ограничения промышленного применения, из-за низкой стабильности состава, содержащей только PPC, DCA 2,5 %, UDCA 2,5 %, CDCA 2,5 %, HDCA 2,5 %, TDCA 2,5 %, GDCA 2,5 % и CA 5,0 % или более, показано "тяжелое" и "крайне тяжелое" поражение, для GCA и TCA 5,0 % или менее показано отсутствие поражения или легкая степень поражения, а TUDCA не приводила к появлению поражения. В случае комплексных композиций PPC 5,0 %, солюбилизированного дополнительными желчными кислотами, комплексных композиций PPC 5,0 %, солюбилизированного DCA, HDCA, UDCA или CDCA, показано тяжелое поражение, в случае комплексных композиций PPC 5,0 %, солюбилизированного TDCA, GDCA или CA, показано умеренное поражение, но в случае комплексных композиций PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA, TCA или TUDCA, показано отсутствие поражения. По результатам изменений тяжести поражения в зависимости от концентрации и количества смешиваемых компонентов, комплексная композиция PPC от 2,5 до 10,0 %, солюбилизированного GCA от 1,25 до 5,0 %, показала отсутствие повреждений, а комплексная композиция PPC 15,0 %, солюбилизированного GCA 7,5 %, показала легкую степень повреждения. Кроме того, было подтверждено, что при молярном отношении GCA/PPC, равном 2,60 моль/моль или менее, повреждение кожи отсутствует или оценивается как легкое.

1-3: гистологический анализ при окрашивании гематоксилин-эозином (H&E) (воспаление)

Крыс умерщвляют через 3 часа после завершения экспериментальных примеров 1-1 и 1-2 для оценки степени воспаления после инъекции испытуемых композиций. Ткани инъецированной области иссекают, фиксируют 10 % формалином, а затем получают образец и фиксируют изображения с помощью оптического микроскопа. Степень воспаления оценивают следующим образом.

Отсутствие воспаления (-) указывает на то, что функциональные ткани, такие как потовые железы, кровеносные сосуды и жировая ткань, находятся в хорошем состоянии, а воспалительные клетки не видны. Легкое (+) воспаление указывает на то, что форма функциональных тканей (потовых желез, кровеносных сосудов, жировой ткани и т.д.) хорошо сохранена и редко появляются воспалительные клетки. Умеренное (++) воспаление указывает на то, что морфология функциональных тканей (потовых желез, кровеносных сосудов, жировой ткани и т.д.) нарушена и в тканях появляются воспалительные клетки. Тяжелое (+++) воспаление указывает на то, что морфология функциональных тканей нарушена и воспалительные клетки увеличены, а воспалительные клетки, такие как нейтрофилы, мононуклеарные клетки и т.п., мигрируют в ткани вокруг кровеносных сосудов. Крайне тяжелое (+++) воспаление указывает на то, что морфология функциональной ткани нарушается отеком и воспалением, а воспалительные клетки, такие как нейтрофилы, мононуклеарные клетки и т.п., не только увеличиваются, но также распространяются на папиллярную дерму и явно наблюдается повреждение ткани.

Во-первых, по результатам оценки воспаления для всех концентраций композиций, содержащих только PPC (от 1,25 до 15,0 %), для PPC от 2,50 до 7,50 % показано "отсутствие" воспаления, для PPC от 10,0 до 12,5 % показано "легкое", а PPC 15,0 % показано "умеренное" воспаление, как показано в следующей таблице 28 (фиг. 6A).

Таблица 28.

PPC мас./об.%	GCA мас./об.%	GCA/PPC молярное отношение (моль/моль)	Воспаление	PPC мас./об.%	ЖК мас./об.%	Воспаление
2,50	0,0		-	5,0	DCA 2,2	++++
5,00	0,0		-		HDCA 2,5	++++
7,50	0,0		-		UDCA 3,0	++++
10,0	0,0		+		TDCA 2,5	+++
12,5	0,0		+		GDCA 2,5	+++
15,0	0,0	++	CDCA 2,5		++++
2,50	1,25	0,87	-		CA 2,5	++
5,00	2,50		-		GCA 2,5	-
7,50	3,75		-		TCA 2,5	-
10,0	5,00		+	TUDCA 4,0	-
15,0	7,50	++
5,0	2,5	0,87		-
	5,0	1,73		-
	7,5	2,60		-
	10,0	3,47		+
	15,0	5,20		++++
	20,0	6,94		++++
25,0	8,67	++++

Затем, по результатам оценки воспаления для желчных кислот различных концентраций (ЖК 1,0 %, 2,5 %, 5,0 % и 7,5 %), для концентрации 1,0 % или более DCA, HDCA и UDCA показано тяжелое и крайне тяжелое воспаление, для 2,5 % или более TDCA, GDCA, CDCA и CA показано тяжелое и крайне тяжелое воспаление. И для 2,5 % или более GCA и TCA показано умеренное воспаление, а для высокой концентрации TUDCA показано только легкое воспаление (фиг. 6B и 6C).

Таблица 29.

ЖК мас./об.%	1,0	2,5	5,0	7,5
DCA	+++	++++	++++	++++
HDCA	+++	++++	++++	++++
UDCA	+++	++++	++++	++++
TDCA	++	++++	++++	++++
GDCA	++	+++	++++	++++
CDCA	++	+++	+++	++++
CA	++	+++	++++	++++
GCA	+	++	++	++
TCA	+	++	++	++
TUDCA	-	-	-	+

Для оценки степени воспаления, вызываемого комплексными композициями PPC, солюбилизированного желчными кислотами, получают комплексные композиции PPC 5,0 %, солюбилизированного различными желчными кислотами, и оценивают степень воспаления. Как показано в таблице 29, для комплексных композиций PPC, солюбилизированного DCA, HDCA UDCA или CDCA, показано "крайне тяжелое" воспаление, для комплексных композиций PPC, солюбилизированного TDCA или GDCA, показано "тяжелое" воспаление, а для комплексной композиции PPC, солюбилизированного CA, показано "умеренное". С другой стороны, комплексная композиция PPC, солюбилизированного GCA, TCA или TUDCA, однозначно не приводила к появлению воспаления. Неожиданным оказалось то, что композиции, содержащие только GCA 2,5 % и TCA 2,5 % показали умеренное воспаление, но комплексные композиции PPC 5,0 %, солюбилизированные GCA 2,5 % или TCA 2,5 %, показали отсутствие воспаления (фиг. 6D).

Для оценки степени воспаления в соответствии с изменением концентрации, сравнивают степень воспаления, вызываемого различными комплексными композициями PPC, солюбилизированного GCA. В результате для PPC 7,5 % плюс GCA 3,75 % или менее показано "отсутствие" воспаления, для PPC 10,0 % плюс GCA 5,0 % показано легкое воспаление, а для PPC 15,0 % плюс GCA 7,50 % показано умеренное воспаление (фиг. 6E).

Для оценки степени воспаления в соответствии с увеличением количества смешиваемого солюбилизирующего агента, получают композиции, содержащие повышенную концентрацию GCA, способную солюбилизировать PPC 5,0 %, и оценивают степень воспаления. Как показано в таблице 28, предпочтительное молярное отношение GCA/PPC, при котором воспаление отсутствует или оценивается как легкое, составляло 3,47 моль/моль или менее, и при молярном отношении 3,47 моль/моль или более наблюдают крайне тяжелое воспаление (фиг. 6F).

Суммарные результаты испытаний in vivo в отношении выраженности отека, повреждения и воспаления, вызванных подкожной инъекцией для уменьшения локализованного жира, выглядит следующим образом. Для получения PPC 5,0 %, обладающего эффективностью, эквивалентной DCA 1,0 %, уменьшения адипоцитов, в качестве стабильной композиции, желчные кислоты следует смешивать в общем в концентрации 2,5 %, но было показано, что DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA и CA в концентрации 2,5 % вызывают тяжелые и крайне тяжелые отеки и поражения, вызванные воспалением. Кроме того, комплексные композиции PPC 5,0 %, составленные из вышеупомянутых желчных кислот, приводят к появлению значительного болевого синдрома и отека. Следовательно, эти желчные кислоты не пригодны в качестве солюбилизирующих агентов для включения в инъецируемую композицию на основе PPC для уменьшения локализованного жира по настоящему изобретению. С другой стороны, препараты GCA плюс PPC и препараты TCA плюс PPC не приводят к появлению болевого синдрома, отеков и поражений, и такие результаты оказались неожиданными для композиции, содержащей только PPC, GCA или TCA.

Таким образом, было обнаружено, что комплексные препараты GCA плюс PPC и комплексные препараты TCA плюс PPC по настоящему изобретению предпочтительно имеют молярное отношение желчной кислоты к PPC (то есть молярное отношение GCA/PPC или молярное отношение TCA/PPC) от 0,7 до 3,0. При молярном отношении (моль/моль) менее 0,7, стабильность состава снижалась, поскольку образование стабильных мицелл было затруднено. Следовательно, предпочтительное молярное отношение составляет по меньшей мере 0,7 или более, более предпочтительно 0,76 или более, и оно является наиболее выгодным с точки зрения стабильности и продолжительности способа. При молярном отношении, превышающем значение 3,04, побочные эффекты, такие как воспаление, отек и поражения кожи, были значительно индуцированы, и вероятность некроза была увеличена, и не было выявлено положительного влияния в отношении апоптоза адипоцитов и липолиза. При молярном отношении 3,0 или менее такие побочные эффекты и болевой синдром были значительно снижены. В частности, при молярном отношении 2,60 или менее в пределах вышеуказанного диапазона, побочные эффекты и болевой синдром были снижены, по существу, такие побочные эффекты и боль практически отсутствовали. Подтверждено, что наиболее предпочтительное молярное отношение составляло 1,73 или менее, при котором была получена превосходная композиция для уменьшения жира, не приводящая к появлению воспалений, отеков и повреждений. Результаты, полученные в отношении болевого синдрома дополнительно описаны в следующих экспериментальных примерах.

Кроме того, было подтверждено, что более предпочтительным с точки зрения болевого синдрома, отека и побочных эффектов является абсолютное содержание PPC предпочтительно составляющее 12,5 мас./об.% или менее, а более предпочтительно 10,0 мас./об.% или менее от общей композиции.

Экспериментальный пример 2: Сравнение эффекта уменьшения клеток

2-1: сравнение эффекта уменьшения адипоцитов (3T3-L1)

Испытания проводят для сравнения активности уменьшения адипоцитов композиции, содержащей только PPC, и композиции PPC, солюбилизированного желчными кислотами. Дифференцированные линии адипоцитов 3T3L-1 применяют для наблюдения за активностью уменьшения адипоцитов, а жизнеспособность клеток контролируют с помощью анализа МТТ. Следующие результаты были получены путем сравнения жизнеспособности адипоцитов для каждого испытуемого вещества. В частности, композиция, в которой смешаны TUDCA, GCA или TCA, которые представляли собой солюбилизирующий агент, выбранное по результатам испытания in vivo, с PPC, повлияла на жизнеспособность адипоцитов по результатам следующего испытания in vitro с неожиданным соотношением смешивания, и в следующих данных отражено такое неожиданное открытие. Материалы и способы, применяемые в следующих экспериментах, описаны ниже. Далее % композиции относится к мас./об.%.

Конкретные способы заключаются в следующем. Дифференцированные адипоциты 3T3-L1 культивируют при слиянии клеток 85-92 %. Клетки обрабатывают каждой из следующих испытуемых композиций и культивируют при 37 °С в течение от 0 до 96 часов: композиция, содержащая только PPC (PPC 0,3125 %, 0,625 %, 1,25 %, 2,5 %, 5,0 %, 7,5 %, 10,0 %, 15,0 %), композиция, содержащая только DCA (DCA 1,0 %, 1,1 %, 2,2 %), композиция, содержащая только GCA (GCA 1,25 %, 2,5 %, 5,0 %), комплексная композиция PPC, солюбилизированного GCA (PPC 0,3125 % плюс GCA 0,1563 %, PPC 0,625 % плюс GCA 0,3125 %, PPC 1,25 % плюс GCA 0,625 %, PPC 2,5 % плюс GCA 1,25 %, PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 %, PPC 7,5 % плюс GCA 3,75 %, PPC 10,0 % плюс GCA 5,0 %, PPC 15,0 % плюс GCA 7,5 %, PPC 5,0 % плюс GCA 3,75 %, PPC 5,0 % плюс GCA 5,0 %, PPC 5,0 % плюс GCA 6,25 %, PPC 5,0 % плюс GCA 7,5 %, PPC 5,0 % плюс GCA 8,75 %), комплексная композиция PPC, солюбилизированного TCA (PPC 0,3125 % плюс TCA 0,1563 %, PPC 0,625 % плюс TCA 0,3125 %, PPC 1,25 % плюс TCA 0,625 %, PPC 2,5 % плюс TCA 1,25 %, PPC 5,0 % плюс TCA 2,5 %, PPC 7,5 % плюс TCA 3,75 %, PPC 10,0 % плюс TCA 5,0 %, PPC 15,0 % плюс TCA 7,5 %), комплексная композиция PPC, солюбилизированного TUDCA (PPC 0,3125 % плюс TUDCA 0,25 %, PPC 0,625 % плюс TUDCA 0,5 %, PPC 1,25 % плюс TUDCA 1,0 % , PPC 2,5 % плюс TUDCA 2,0 %, PPC 5,0 % плюс TUDCA 4,0 %, PPC 7,5 % плюс TUDCA 6,0 %, PPC 10,0 % плюс TUDCA 8,0 %, PPC 15,0 % плюс TUDCA 12,0 %), комплексная композиция PPC, солюбилизированного DCA (PPC 2,5 % плюс DCA 1,1 %, PPC 5,0 % плюс DCA 2,2 %, PPC 10,0% плюс DCA 4,4 %) или комплексная композиция PPC, солюбилизированного другими желчными кислотами (PPC 5,0 % плюс HDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс UDCA 3,0 %, PPC 5,0 % плюс TDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс GDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс CDCA 2,5 % PPC 5,0 % плюс CA 2,5 %). Клетки дважды промывают PBS, обрабатывают реагентом МТТ (50 мкл) и оставляют при 37 °С на 2 часа. После удаления супернатанта кристаллы формазана МТТ растворяют в ДМСО и измеряют оптическую плотность при 540 нм с применением микропланшетного ридера.

В результате, как показано на фиг. 7A-7D, композиция, содержащая только PPC, и комплексная композиция PPC плюс GCA проявляют сходную активность по уменьшению адипоцитов в зависимости от времени и концентрации. И композиция PPC плюс TCA показала сниженный эффект уменьшения адипоцитов, чем композиция, содержащая только PPC и композиция PPC плюс GCA, при той же концентрации. Однако при обработке композицией PPC плюс TUDCA не выявлено уменьшения жизнеспособности адипоцитов (фиг. 7A-7D).

Кроме того, как показано на фиг. 7E, композиция, содержащая только PPC 5,0 %, PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 % и PPC 15,0 % плюс TCA 7,5 % показали активность по уменьшению адипоцитов, сходную с композицией, содержащей только DCA 1,0 %, через 96 часов. Таким образом, препараты с такой же активностью по уменьшению адипоцитов, что и Kybella (DCA 1,0 %), одобренной FDA в качестве средства, улучшающего внешность и лизирующего клетки, представляют собой композицию, содержащую только PPC 5,0% и комплексную композицию PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 % и более. Не выявлено статистически достоверных различий между указанными экспериментальными группами (фиг. 7E).

Композиция, содержащая только PPC, показала зависимый от времени и концентрации эффект уменьшения адипоцитов, а комплексная композиция PPC плюс GCA показала аналогичный эффект при той же концентрации (подразумеваются экспериментальные группы с той же концентрацией PPC). Для сравнения, для PPC плюс TCA показан сниженный эффект уменьшения адипоцитов при той же концентрации, что позволяет предположить, что TCA ингибирует эффект PPC по уменьшению адипоцитов. Вследствие этого, состав "PPC плюс TCA" следует применять в очень высоких дозах для достижения эффекта уменьшения адипоцитов, аналогичного действующим в настоящее время коммерческим продуктам. То есть, как показано на фиг. 7E, для получения эффекта уменьшения адипоцитов, сходного с эффектом известного препарата, такого как Kybella (DCA 1,0 %), необходимо применять препарат PPC плюс TCA при значениях PPC 15,0 % плюс TCA 7,5 %. Но композиция PPC 15 %, солюбилизированного TCA 7,5 %, имеет проблему, связанную с трудностью введения многократных доз с помощью инъекционной иглы 30G из-за высокой вязкости 20 cP или более. Таким образом, полагают, что препарат "PPC плюс TCA" имеет некоторые преимущества с точки зрения побочных эффектов. Однако, принимая во внимание промышленную экономическую осуществимость и другие дополнительные проблемы, связанные с введением высоких доз, препараты "PPC плюс GCA" превосходят препараты "PPC плюс TCA".

Кроме того, было обнаружено, что PPC, солюбилизированный TUDCA, не проявляет эффекта уменьшения адипоцитов даже при высоких концентрациях, даже при очень высоких дозах (PPC 15 % плюс TUDCA 12 %). Таким образом, было обнаружено, что TUDCA ингибирует апоптоз и деградацию адипоцитов. В этой связи были опубликованы данные исследований по ингибированию TUDCA клеточного апоптоза (Andrew L.Rivard, Administration of Tauroursodeoxycholic acid reduced apoptosis following myocardial infarction in rat, The American Journal of Chinese Medicine, Vol. 2, 279-295, 2007). Эти результаты предполагают, что PPC по-разному влияет на уменьшение адипоцитов в зависимости от выбора солюбилизирующего агента и может по-разному влиять на некроз клеток и апоптоз.

В отношении комплексной композиции PPC, солюбилизированного GCA (PPC плюс GCA), которая была выбрана в качестве предпочтительной в результате вышеуказанных испытаний, и комплексной композиции PPC, солюбилизированного DCA (PPC плюс DCA), которая представляет собой известный коммерческий продукт, наблюдают воздействие желчных кислот GCA и DCA, выбранных в качестве солюбилизирующих агентов, в отношении активности по уменьшению адипоцитов, кроме активности по уменьшению адипоцитов композиции, содержащей только PPC. Результаты испытаний представлены на фиг. с 7F по 7H. Через 96 часов композиция, содержащая только PPC, и PPC плюс GCA показали аналогичный уровень уменьшения адипоцитов при той же концентрации (подразумеваются экспериментальные группы с той же концентрацией PPC), но композиция, содержащая только GCA, показала сниженный эффект уменьшения адипоцитов, по сравнению с композицией PPC плюс GCA.

Для PPC плюс DCA показан более высокий эффект уменьшения адипоцитов при той же концентрации по сравнению с композицией, содержащей только PPC, и более высокий эффект уменьшения адипоцитов, по сравнению с композицией, содержащей только DCA (фиг. 7F-7H), но, как показано в следующем экспериментальном примере 2-3, такой эффект был обусловлен некрозом клеток (фиг. 10A и 10B). Кроме того, HDCA, UDCA, CDCA, TDCA, GDCA и CA, которые представляют собой другие желчные кислоты, которые, как было обнаружено в вышеприведенных экспериментальных примерах, являются токсичными, сходными с DCA (т.е. в испытаниях на отек, поражения и воспаление после подкожной инъекции in vivo), также было обнаружено, что они имеют эффект уменьшения адипоцитов способом индукции некроза клеток, а не апоптоза и деградации адипоцитов, которые являются неотъемлемыми механизмами воздействия PPC (фиг. 8D). Таким образом, эти виды желчных кислот являются не подходящими солюбилизирующими агентами, потому что они вызывают боль, отек и побочные эффекты, хотя эффект уменьшения адипоцитов может показаться несколько высоким.

Минимальное молярное отношение GCA к PPC (GCA/PPC), необходимое для получения прозрачных смешанных мицелл PPC, которые подходят для стабильного введения, составляет 0,76 моль/моль, и для этого требуется 12 или более часов перемешивания и 2 дня рабочего времени. По этой причине, увеличение количества вводимого GCA может сократить время получения. Тем не менее, чрезмерные дозы добавляемых веществ могут привести к отрицательному воздействию на присущую PPC фармакологическую активность в отношении апоптоза и деградации адипоцитов, а также на безопасность, поэтому концентрацию PPC (5,0 %) фиксируют, а концентрацию GCA (от 2,5 % до 8,75 %) увеличивают для наблюдения эффекта уменьшения адипоцитов.

В результате, как показано на фиг. 7I, при сравнении композиции, содержащей только PPC 5,0 %, и композиции PPC плюс GCA, не было выявлено статистически достоверных различий в жизнеспособности адипоцитов между тестируемыми группами при молярном отношении GCA к PPC (GCA/PPC) 2,60 моль/моль (PPC 5,0 % плюс GCA 7,50 %) или менее, и были выявлены статистически достоверные различия в отношении жизнеспособности адипоцитов между экспериментальными группами при молярном отношении GCA к PPC (GCA/PPC) 3,04 моль/моль (PPC 5,0 % плюс GCA 8,75 %) или более. То есть, когда молярное отношение GCA/PPC составляет 3,04 моль/моль (PPC 5,0 % плюс GCA 8,75 %) или более, вероятность неблагоприятного воздействия на положительную активность, присущую PPC, увеличивается.

2-2: Сравнение жизнеспособности адипоцитов, фибробластов, клеток скелетных мышц и эндотелиальных сосудов с комплексной композицией PPC, солюбилизированного желчными кислотами. Специфичность адипоцитов по настоящему изобретению

Согласно предыдущим исследованиям, DCA или композиция PPC, солюбилизированного DCA, вызывает серьезные клинические побочные эффекты, связанные с лизированием не только адипоцитов, но также фибробластов, клеток скелетных мышц и эндотелиальных клеток сосудов. В этом отношении оценивают эффект комплексной композиции PPC плюс GCA по настоящему изобретению.

Конкретный способ и материалы испытания были следующими:

Жизнеспособность клеток измеряют с помощью анализа МТТ через 72 часа после обработки адипоцитов 3T3-L1, нормальных фибробластов, клеток скелетных мышц и эндотелиальных клеток комплексными композициями PPC (PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс TCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс TUDCA 4,0 %, PPC 5,0 % плюс DCA 2,2 %, PPC 5,0 % плюс HDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс UDCA 3,0 %, PPC 5,0 % плюс TDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс GDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс CDCA 2,5 % или PPC 5,0 % плюс CA 2,5 %) соответственно, и результаты рассчитывают как общий процент жизнеспособных клеток по сравнению с необработанной контрольной группой.

Адипоциты 3T3-L1 (ATCC) культивируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) (Invitrogen) с добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в условиях 5 % CO₂ и 37 °C. Дифференциация адипоцитов продолжалась в течение 2 или 4 дней, до 100 % слияния клеток, и дифференциацию индуцируют в течение 3 дней в среде DMEM, содержащей 1 мкг/мл инсулина, 500 мкМ метилизобутилксантина и 250 нМ дексаметазона (адипоциты перед дифференциацией и после дифференциации представлены на фиг. 9А и 9В). Впоследствии среду заменяют средой DMEM, содержащей 1 мкг/мл инсулина (Sigma), и культуральную среду поддерживают и меняют каждые 2-3 дня, пока степень дифференциации не достигла максимума. Если это занимало более 7 дней, клетки оставляют в нормальной культуральной среде DMEM до начала испытаний. После 72 часов инкубации с испытуемыми веществами, раствор МТТ разбавляют до 1 мг/мл в PBS, и 50 мкл раствора МТТ (Sigma) добавляют в лунки, каждую из которых освобождают от культуральной среды. После того как клетки инкубируют в течение 3 часов в условиях 37 °С и 5 % СО₂, раствор МТТ удаляют. После растворения 200 мкл ДМСО (Sigma) проводят анализ МТТ (измерения при 570 нм).

Фибробласты (CCD-986sk, человеческий фибробласт, пассаж № 2) культивируют до 85% слияния клеток, а затем удаляют культуральную среду (IMDM, 10 % FBS, 1 % смесь антибиотиков). После смешивания и обработки испытуемых веществ в новой культуральной среде, культуральную среду удаляют в заранее установленное время обработки и проводят анализ МТТ (измерение при 570 нм).

Клетки скелетных мышц (C2C12; мышиный миоцит, пассаж № 2) культивируют до 80 % слияния клеток, а затем удаляют культуральную среду (DMEM, 10 % FBS, 1 % смесь антибиотиков). И клетки культивируют в течение 4 дней в среде DMEM, содержащей 2 % лошадиной сыворотки. Удлиненную форму клеток наблюдают при 80 % или более, и испытуемые вещества смешивают и обрабатывают в новой культуральной среде, а затем культуральную среду удаляют в заранее определенное время обработки и проводят анализ МТТ (измерение при 570 нм).

Эндотелиальные клетки сосудов (HUVEC: человеческий эндотелий, пассаж № 3) оставляют при комнатной температуре на 1 день в культуральной чашке, покрытой 1 % желатином. После культивирования до достижения 80 % слияния клеток в культуральной чашке, культуральную среду (EGM-Plus, 10 % FBS, 1 % смесь антибиотиков) удаляют. После смешивания и обработки испытуемых веществ в новой культуральной среде, культуральную среду удаляют в заранее установленное время обработки и проводят анализ МТТ (измерение при 570 нм). (Примечание: не учитывать, если клетки проходят пассаж № 6 или более).

В результате наблюдения жизнеспособности различных клеток, как показано на фиг. 8A-8D было обнаружено, что комплексные композиции PPC, солюбилизированного GCA или TCA, избирательно уменьшают только адипоциты, в отличие от комплексных композиций PPC, солюбилизированного с помощью DCA, UDCA, HDCA, CDCA, TDCA, GDCA или CA. Это говорит о том, что, когда композицию по настоящему изобретению, PPC плюс GCA, применяют к реальному человеку, она может специфически уменьшать только адипоциты, не оказывая неблагоприятного воздействия на ткани человека вокруг адипоцитов.

2-3: анализ активности каспазы-3

Анализ активности каспазы-3 проводят с испытуемыеми веществами, чтобы определить, была ли гибель клеток в результате анализа МТТ вызвана некрозом или апоптозом. Каспаза-3 специфически увеличивается при апоптозе и является маркером апоптоза. Набор для анализа активности каспазы-3 (колориметрический) от Abcam применяют в соответствии с инструкцией производителя, следующим способом: по 1×10⁵ клеток адипоцитов 3T3-L1 распределяют в каждую лунку, и обрабатывают препаратами, содержащими PPC 5,0 %, PPC 5,0 % плюс DCA 2,2 %, PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс GCA 5,0 %, DCA 1,0 %, GCA 1,0 % или GCA 5,0 % и PBS, с последующей инкубацией в течение от 0 до 48 часов при 37 °C. Затем клетки обрабатывают 50 мкл буфера для лизиса клеток (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ NaH₂PO₄/NaHPO₄, pH 7,5, 130 мМ NaCl, 1 % Triton X-100 и 10 мМ пирофосфата натрия) и оставляют при 4 °C в течение 10 мин. Супернатант собирают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 1 минуты, и количественное определение белка проводили способом BCA. 50 мкл реакционного буфера (4 мМ HEPES, рН 7,5, 10 % глицерин, 2 мМ дитиотреитол) и 0,5 мкл 4 мМ DEVD-p-NA добавляют к каждому образцу и проводят реакцию при 37 °С в течение 1 часа. Затем измеряют длину волны с помощью спектрофотометрии при 405 нм.

В результате, как показано на фиг. 10А и 10В, для PBS не выявлена индукция активности каспазы-3 в адипоцитах. Композиция, содержащая только PPC, и комплексная композиция PPC плюс GCA продемонстрировали зависимую от времени индукцию активности каспазы-3 в значительной степени. Однако комплексная композиция PPC плюс DCA ингибировала активность капазы-3 по сравнению с PPC или PPC плюс GCA. Интересно, что при обработке DCA 1,0% показана некоторая активность каспазы-3 до 24 часов, но через 48 часов активность каспазы-3 возвращалась к уровням, определяемым до обработки. Считается, что это явление связано с действием клеточного апоптоза в течение 24 часов после обработки композицией, содержащей только DCA, а затем с реакцией, в которой клетки становятся некротическими вследствие последующей воспалительной реакции. Активность каспазы-3 наблюдают в группе, получавшей GCA, но не было выявлено изменений, зависящих от времени или концентрации. С другой стороны, было подтверждено, что активность каспазы-3, как было показано, является высокой при обработке комплексной композицией GCA плюс PPC в зависимости от времени и концентрации. При смешивании PPC с DCA, активность каспазы-3, которая индуцируется композицией, содержащей только PPC, была значительно снижена. Эти результаты указывают на то, что специфический эффект композиции, содержащей только PPC, в отношении апоптоза, ингибируется DCA, и что DCA, добавленная к PPC, вызывает больший некроз адипоцитов, который связан с воспалением, и т.п.

2-4: оценка липолиза

Анализ активности глицерина проводят с испытуемыми веществами, чтобы определить, была ли гибель клеток в анализе МТТ вызвана некрозом или липолизом. Глицерин является специфическим маркером, который увеличивается, при расщеплении жира. Набор для анализа липолиза Abcam (колориметрический) применяют в соответствии с инструкцией производителя следующим способом: по 1×10⁵ клеток адипоцитов 3T3-L1 распределяют в каждую лунку, и обрабатывают препаратами, содержащими PPC 5,0 %, PPC 5,0 % плюс DCA 2,2 %, PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс GCA 5,0 %, DCA 1,0 %, GCA 1,0 % или GCA 5,0 % и PBS с последующей инкубацией в течение от 0 до 48 часов при 37 °С. Затем индуцируют лизис. 30 мкл буфера для анализа липолиза (137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 4,2 мМ NaHCO₃, 1,3 мМ CaCl₂, 0,5 мМ KH₂PO₄, 0,5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ MgSO₄, 5 мМ глюкоза, 20 мМ Hepes (pH 7,4), 1% BSA, 1 мкМ изопротеренола) добавляютк культуральной среде, доводя общий объем до 50 мкл, и инкубируют в течение 20 минут. После добавления комплекса для анализа глицерина (50 мкл), раствор инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Поглощающую способность измеряют при OD 570 (применяя стандартную кривую для абсолютного определения).

В результате, как показано на фиг. 10C и 10D, PBS не индуцирует секрецию глицерина в адипоцитах. Через 24 часа, за исключением DCA 1,0 % и PPC 5,0 % плюс GCA 5,0 %, испытуемые вещества аналогично индуцируют секрецию глицерина. Через 48 часов композиция, содержащая только PPC, PPC плюс DCA, композиция, содержащая только DCA и только GCA, продемонстрировали немного более высокую цитолитическую активность, по сравнению с показателями активности через 24 часа. В частности, композиция PPC плюс GCA продемонстрировала гораздо более высокий апоптотический эффект на клетки, по сравнению с композицией, содержащей только PPC.

Экспериментальный пример 3: Оценка эффективности и выраженности побочных эффектов инъецируемых препаратов на модели ожирения у мышей, вызванного диетой с высоким содержанием жиров.

Приобретают самцов мышей C57BL/6 (4 недели). Мышей содержат в течение 12 недель на диете с высоким содержанием жиров (исследовательская диета, 60 % ккал липидов), с целью вызвать у них ожирение. После этого композиции, содержащие только PPC (2,5 %, 5,0 %, 10,0 % и 15,0 %), PBS (отрицательный контроль), Isuprel (положительный контроль), DCA 1,0 % и GCA 2,5 %, и комплексные композиции PPC 5,0 % плюс DCA 2,2 %, PPC 5,0 % плюс HDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс UDCA 3,0 %, PPC 5,0 % плюс TDCA 2,5, PPC 5,0 % плюс GDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс CDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс CA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс TUDCA 4,0 %, PPC 5,0 % плюс TCA 2,2 % и PPC (от 2,5 до приблизительно 10,0 %) плюс GCA (от 1,25 до приблизительно 5,0 %) непосредственно вводят в жировую ткань паховой области (подкожная жировая клетчатка) модели ожирения у мышей, вызванного диетой с высоким содержанием жира, соответственно, и in vivo снижение жира не наблюдают. Каждое испытуемое вещество вводят один раз. 0,2 мл каждого испытуемого вещества вводят подкожно в жировую ткань паховой области мышей. Затем, мышей умерщвляют через 8 дней после инъекции. Жировую ткань паховой области умерщвленных мышей иссекают и подкожный жир быстро удаляют и фиксируют в 4% растворе формальдегида. После фиксации жировую ткань промывают и обезвоживают, заключают в парафиновые блоки, окрашивают гематоксилином и эозином и наблюдают с помощью оптического микроскопа.

Во-первых, в ткани, в которую вводят композицию, содержащую только PPC, апоптоз и деградацию адипоцитов индуцируют зависимым от концентрации образом в интервале концентраций от 2,5 % до 10 %, и размер адипоцитов в жировой ткани уменьшался. Некоторые из уменьшенных адипоцитов склеивались, область мертвых клеток была чистой, а адипоциты, по-видимому, были увеличены из-за слияния деградированных адипоцитов. При концентрации 15,0 % было выявлено не только уменьшение адипоцитов, но также развитие макрофагов вокруг адипоцитов (фиг. 11A).

Затем, в случае комплексной композиции PPC, солюбилизированного желчными кислотами, четко наблюдался апоптоз адипоцитов, наблюдают мелкие адипоциты и фагоцитоз, опосредованный макрофагами, вокруг адипоцитов в жировых тканях, инъецированных комплексными композициями PPC, солюбилизированного DCA, CDCA, HDCA, UDCA, GDCA, TDCA или CA. В жировых тканях, инъецированных Isuprel, группе отрицательного контроля, размер адипоцитов был уменьшен, наблюдают апоптоз клеток и инфильтрацию клеток, отличных от адипоцитов, для очистки апоптотической клетки. В жировых тканях, инъецированных композицией, содержащей только DCA, или композициями PPC, солюбилизированного DCA, в месте введения композиций возникало сильное воспаление, и клетка лизировалась в результате некроза, и происходило значительное разрушение. Композиция, содержащая только DCA, показала сильное воспаление, даже несмотря на то, что концентрация DCA была низкой, равной 1 %, и действие, индуцирующее воспаление, было выше, по сравнению с композицией, содержащей только PPC, и комплексной композицией PPC плюс GCA. Относительно, жировые ткани, инъецированные PBS (отрицательный контроль) или PPC 5,0 % плюс TUDCA 4,0 % имели четкую границу клеточной мембраны и хорошо сформированную клеточную форму и состоят только из адипоцитов в тканях. В жировых тканях, инъецированных PPC 5,0 % плюс TCA 2,5 %, размер адипоцитов уменьшился в целом, и инфильтрация клеток, отличных от адипоцитов, для очистки апоптотических клеток наблюдалась на небольшой площади. В жировых тканях, инъецированных PPC 5,0 % плюс GCA 2,5% по настоящему изобретению, воспаление не выявлено, размер адипоцитов уменьшался, область апоптоза была четкой, и адипоциты, по-видимому, увеличивались вследствие слияния деградированных адипоцитов (фиг. 11B и 11C).

Как показано на фиг. 11D, по результатам изучения влияния комплексной композиции PPC плюс GCA по настоящему изобретению не только на адипоциты, но также на дерму и эпидермис после инъекции в жировой слой крысы, после инъекции PBS дермальные и эпидермальные ткани были хорошо сохранены и не было выявлено воспалительных клеток, таких как нейтрофилы. Выявлены четкие границы клеточной мембраны и хорошо сформированная форма клеток в жировых тканях, а жировые ткани состояли только из адипоцитов. После инъекции композиции, содержащей только PPC 5,0 %, дермальная и эпидермальная ткани хорошо сохранились и воспалительных клеток, таких как нейтрофилы, не было обнаружено. В жировой ткани размер адипоцитов уменьшался, некоторые клеточные мембраны деградировали, а некоторые адипоциты, по-видимому, увеличивались вследствие слияния деградированных адипоцитов. После введения комплексной композиции PPC 2,5 % плюс GCA 1,25 %, дермальная и эпидермальная ткани хорошо сохранились и воспалительных клеток, таких как нейтрофилы, не было обнаружено. В жировой ткани размер адипоцитов уменьшался, некоторые клеточные мембраны деградировали, а некоторые адипоциты, по-видимому, увеличивались вследствие слияния деградированных адипоцитов. После инъекции комплексной композиции PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 % дермальная и эпидермальная ткани хорошо сохранились и воспалительных клеток, таких как нейтрофилы, не было обнаружено. В жировой ткани размер адипоцитов был уменьшен, область апоптоза была четкой, и некоторые адипоциты, по-видимому, были увеличены из-за слияния деградированных адипоцитов. После введения комплексной композиции PPC 10,0 % плюс GCA 5,0 % дермальная и эпидермальная ткани были слегка повреждены, были выявлены воспалительные клетки и наблюдался небольшой отек. В жировой ткани размер адипоцитов был уменьшен, и был выявлен фагоцитоз макрофагов в области апоптоза и дебрис нуклеиновых кислот вследствие апоптоза, и некоторые адипоциты, по-видимому, увеличивались вследствие слияния деградированных адипоцитов. После введения композиции, содержащей только GCA 2,5 %, дермальная и эпидермальная ткани были слегка повреждены, и были выявлены воспалительные клетки, такие как нейтрофилы и т.п., таким образом четко наблюдают воспаление. Наблюдают четкие границы клеточной мембраны и хорошо сформированную форму клеток в жировых тканях, а жировые ткани состояли только из адипоцитов. Исходя из вышеприведенных результатов, было подтверждено, что воспалительные реакции на адипоцитах, дерме и эпидермисе в значительной степени были индуцированы при лечении композицией, содержащей только GCA, по сравнению с комплексными композициями GCA и PPC.

Таким образом, в жировой ткани, инъецированной композицией, содержащей только DCA, или комплексной композицией PPC, солюбилизированного DCA, HDCA, UDCA, CDCA, TDCA, GDCA или CA, в месте введения наблюдают появление сильного воспаления, клетки подвергались лизированию путем некроза, и было индуцировано значительное разрушение. Однако в жировой ткани, инъецированной комплексной композицией PPC плюс GCA по настоящему изобретению, размер адипоцитов был уменьшен, и область апоптоза была четкой. И некоторые адипоциты увеличились в размере вследствие слияния деградированных адипоцитов. Хотя зависимое от концентрации воспаление было незначительным, наблюдают морфологические признаки повреждения мембраны адипоцитов.

Экспериментальный пример 4: Оценка токсичности инъецируемых препаратов PPC, солюбилизированных с помощью GCA

Токсические эффекты инъецируемого препарата PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA, 2,8 % оценивают при однократном подкожном введении собакам породы бигль. В частности, все животные были проверены по клейму, и их общее состояние, массу и температуру тела измеряют по прибытии. В течение 12 дней карантина и периода адаптации после прибытия общие симптомы наблюдают один раз в неделю, массу тела измеряют один раз в неделю, а состояние здоровья животных проверяют в конце периода карантина и адаптации. После окончания периода карантина и адаптации животных распределяют по показателям массы тела в контрольную группу одного самца и одну самку, а в каждую испытуемую группу двух самцов и двух самок. Количество подопытных животных составило в общей сложности 14 собак породы бигль (самцы: от 5 до приблизительно 6 месяцев, от 7,05 до приблизительно 8,16 кг, и самки: от 5 до приблизительно 6 месяцев, от 5,83 до приблизительно 7,14 кг) в каждой 7 самцов и 7 самок собак, и дозы введения на животное рассчитывают исходя из массы тела в день введения, а затылочную часть эпилируют перед введением. Испытуемые вещества вводият подкожно в левую и правую сторону затылка с помощью одноразового шприца (10 мл, 23G). Испытуемые группы определяют как группа с низкой дозой (доза: PPC 90 мг/кг плюс GCA 50,4 мг/кг, количество инъекции: 1,8 мл/кг, максимальное количество инъекции на участок: 0,8 мл/участок), группа со средней дозой (доза : PPC 180 мг/кг плюс GCA 100,8 мг/кг, количество инъекции: 3,6 мл/кг, максимальное количество инъекции на участок: 1,6 мл/участок), группа с высокой дозой (доза: PPC 360 мг/кг плюс GCA 201,6 мг/кг, количество инъекции: 7,2 мл/кг, максимальное количество инъекции на участок: 3,2 мл/участок) и контрольная группа (физиологический раствор, количество инъекции: 7,2 мл/кг, максимальное количество инъекции на участок: 3,2 мл/участок). Подробные результаты испытаний описаны ниже.

1) наличие или отсутствие гибели; в течение тестового периода не выявлено случаев гибели во всех испытуемых и контрольной группах.

2) общие симптомы; в течение тестового периода не выявлено никаких симптомов во всех испытуемых и контрольной группах.

3) изменение массы тела; в течение тестового периода не выявлено аномальных изменений во всех испытуемых и контрольных группах.

4) вскрытие; не выявлено никаких аномальных изменений во всех испытуемых и контрольных группах.

5) гистопатологическое исследование; выявлено гранулематозное воспаление в незначительной или легкой степени в подкожных тканях у самцов и самок в группе с высокой дозой (см. фиг. 12А-12С). Как описано выше, очень легкое воспаление наблюдают только в группе с высокой дозой, которой вводят инъецируемый препарат по настоящему изобретению. Однако с точки зрения установления подходящей концентрации дозы при введении людям и другим животным такую степень воспаления можно рассматривать как отсутствие побочных эффектов.

Экспериментальный пример 5: сравнение выраженности болевого синдрома in vivo

Следующие результаты были получены путем оценки степени болевого синдрома, вызванного композицией, содержащей только DCA, GCA или PPC, и комплексной композицией PPC, солюбилизированного желчной кислотой, путем измерения расстояния перемещения и скорости движения животного in vivo. Далее % композиции относится к мас./об.%.

В частности, отек наблюдают после введения 100 мкл односоставной композиции (DCA 1,0 %, PPC 5,0 % или GCA 2,5 %) или комплексной композиции (PC 5,0 % плюс DCA 2,2 %, PPC 5,0 % HDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс UDCA 3,0 %, PPC 5,0 % плюс TDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс GDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс CDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс CA 2,5%, PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс TCA 2,5 % или PPC 5,0 % плюс TUDCA 4,0 %) в лапу крысы. После подтверждения того, что отек был максимальным через 2 часа после введения, сравнивают расстояние перемещения (см) и скорость движения (см/с) в течение 5 минут с применением системы Noldus Video Traking.

Как показано на фиг. 13A и 13B, расстояние перемещения и скорость движения для композиции, содержащей только PPC 5,0 %, группы PPC 5,0 % плюс TUDCA 4,0 %, PPC 5,0 % плюс GCA 2,5 % и PPC 5,0 % плюс TCA 2,5 % не изменились или были немного увеличены. С другой стороны, расстояние перемещения и скорость перемещения для композиций PPC 5,0 % плюс DCA 2,2 %, PPC 5,0 % плюс HDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс UDCA 3,0 %, PPC 5,0 % плюс TDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс GDCA 2,5 %, PPC 5,0 % плюс CDCA 2,5 % и PPC 5,0 % плюс CA 2,5 % в группе уменьшились примерно на 20 %, и эти результаты рассматривают как следствие снижения активности из-за болевого синдрома. Это говорит о том, что инъецируемый препарат по настоящему изобретению значительно менее болезнен (по существу, не вызывает боли), чем существующие коммерческие продукты.

Экспериментальный пример 6: Клиническая оценка композиций PPC, солюбилизированного GCA

6-1: Клиническая оценка эффективности снижения жира

Среди композиций по настоящему изобретению инъецируемую композицию PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA 2,8 %, вводят пациентам с локализованным отложением жира под подбородком. В частности, после местной анестезии с применением 9,6 % лидокаиновой мази в течение 30 минут или более в шприц объемом 5 см³ вводят инъекционную иглу 13 мм 30G, и композицию вводят 6 раз с интервалами в 4 недели в жировой слой под подбородком (всего 50 точек, 0,2 см³ на точку и всего 10 мл, с интервалом 1,0 см и глубиной от 6 до 8 мм). Через 12 недель оценивают стандартные клинические фотографии, КТ (компьютерную томографию), улучшения, сообщаемые исследователями, улучшения, сообщаемые субъектами, и удовлетворенность субъектов.

Клинические фотографии делают до введения и через 12 недель после последнего введения, и фотографируют субъекты фронтально, в перспективе слева, в перспективе справа, и левую и правую стороны, при следующих условиях: на фронтальных фотографиях субъект смотрел на камеру в положении, в котором Франкфуртская горизонтальная плоскость, представляющая собой плоскость, в которой встречаются трагион обоих ушей субъекта и самая нижняя часть орбитального неба, была горизонтальной. На фотографиях в перспективе, после поворота тела субъекта на 45 градусов, субъект смотрел на камеру в положении, в котором лицо было расположено так, чтобы кончик носа совпадал с краем шара, а также Франкфуртская горизонтальная плоскость была горизонтальной. На боковых фотографиях субъекта поворачивал тело на 90 градусов от фронтального положения, так, чтобы линия проходила по кончику носа и подбородку. На этой стадии подтверждают, что противоположные брови не были видны, и что осанка была правильной, так что тело не наклонялось в сторону, не сгибалось и не растягивалось. И затем субъект смотрел на камеру в положении, при котором линия, соединяющая заднюю часть предмета и заднюю часть головы, была вертикальной, а Франкфуртская горизонтальная плоскость была горизонтальной. Камера, применяемая для фотографирования, представляла собой DSLR-камеру Nikon D5200 с 60-мм короткофокусным объективом.

КТ-изображения делают до введения и через 12 недель после последнего введения, и измеряют толщину и площадь жирового слоя под подбородком. Субъект по просьбе подавлял глотание слюны, лежал удобно со специальной накладкой и повязкой на голове.

КТ-изображения делают до введения и через 12 недель после последнего введения, и измеряют толщину и площадь жирового слоя под подбородком. Субъект по просьбе подавлял глотание слюны, лежал удобно со специальной накладкой и повязкой на голове. В это время подушка для компьютерной томографии была типа NECK, и голову субъекта фиксируют по лазерной направляющей линии, которая проходила через лоб, нос, подбородок и середину ключицы. Параметры визуализации компьютерной томографии: диапазон сканирования (от слухового прохода до дна ключицы), срез (5,0 мм), поле зрения с кожей, размер матрицы 512×512, время вращения 0,5 с и коллимация пучка 64×0,6 мм. Устройство предоставлено GE Medical Systems, и изображение анализируют с применением Xelis 1.0 6.0 BN 6 3D от Infinity.

Клиническая эффективность инъецируемой композиции по настоящему изобретению хорошо показана на фиг. 16А и 16В. Фиг. 14А представляет собой фотографию, на которой показано клиническое изображение субъекта до введения и через 12 недель после последнего введения, где комплексную композицию РРС, солюбилизированного GCA по настоящему изобретению, вводят 6 раз с интервалами в 4 недели в дозе 0,2 см³ на точку, всего 50 точек, всего 10 мл на субъект, и уменьшение количества жирового слоя под подбородком наблюдают даже невооруженным глазом. Уровень удовлетворенности субъекта составлял 4 из 5, а улучшение, оцененное после сравнения изображений до введения, составляло 1,5 балла. Интересно, что субъект ранее получал инъецируемую композицию PPC, солюбилизированного DCNa (коммерчески доступную как Lipobean iv), и для субъекта было неожиданным то, что действие композиции по настоящему изобретению безболезненно после введения, сразу после введения, и через некоторое время.

Кроме того, на фиг. 14В представлен результат количественной оценки уменьшенного локального жира с помощью КТ. Толщина предплатизмального жирового слоя под подбородком, расположенного на 3 см ниже конечной точки нижней челюсти сагиттальной плоскости КТ, проходящей через срединный подбородок, уменьшилась на 30,36 % с 5,6 мм до введения до 3,9 мм после 12 недель после последнего введения.

6-2: Клиническая оценка болевого синдрома, отека и побочного эффекта

Шесть пациентов мужского и женского пола, которые получают инъецируемую композицию PPC, солюбилизированного DCA (коммерческая), проходят клиническую оценку выраженности болевого синдрома, отека и побочного эффекта после введения инъецируемой композиции PPC, солюбилизированного GCA по настоящему изобретению. В частности, после местной анестезии 9,6 % лидокаиновой мазью в течение 30 минут или более, 10 мл композиций по настоящему изобретению (инъецируемый препарат PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA 2,8 % (молярное отношение GCA к PPC составляет 0,97) или инъецируемый препарат PPC 5,0 %, солюбилизированного GCA 4,0 % (молярное отношение GCA к PPC составляет 1,39)), вводят субъектам, которые получают 10 мл композиции, в которой Lipobean iv (5 мл) разбавляют инъецируемым физиологическим раствором (5 мл) в соотношении 1:1 (то есть PPC 2,5 % плюс DCNa 1,2 %) с помощью шприцов с инъекционной иглой 30G 13 мм в область живота и боков (интервал 1,5 см, глубина от 10 до 12 мм, 0,5 см³ на точку, и всего от 50 мл до 100 мл на введение) или в жировой слой под подбородком (интервал 1,0 см, глубина от 6 до 8 мм, 0,2 см³ на точку и общее количество 10 мл на введение) теми же способами введения. После введения субъектам дают опросник, линейку длиной 10 см и ручки с синим маслом для оценки болевого синдрома по шкале ВАШ (визуально-аналоговой шкале), а также оценивают выраженность болевого синдрома, отека, отёчности, гематомы, синяка, эритемы, потерю чувствительности, уплотнение, парестезию, узелковое утолщение и зуд после введения, и через 1, 3, 7 и 10 дней после введения. Болевой синдром оценивают, применяя линейку 10 см и ручку с длинной линии 10 см, чтобы зафиксировать отсутствие боли на левом конце и наиболее сильную боль, которую можно представить, на правом конце. В случае отека и отечности, после нажатия на участок введения и другой участок, используя линейку 10 см и глядя в зеркало, субъект записывал свои показания как 0. Отсутствует, 1. Легкий (2 мм или менее), 2. Умеренный (от 2 до 4 мм), 3. Тяжелый (от 4 до 6 мм) и 4. Крайне тяжелый (от 6 до 8 мм). В случае гематомы, ушиба и эритемы субъект записывал свои показания как 0. Отсутствует, 1. Легкий, 2. Умеренный, 3. Тяжелый и 4. Крайне тяжелый по сравнению с прилагаемыми примерами изображений. В случае потери чувствительности, уплотнения, парестезии, узелковых утолщений и зуда, которые являются субъективными симптомами, субъект записывал свои показания как 0. Отсутствует, 1. Легкий, 2. Умеренный, 3. Тяжелый и 4. Крайне тяжелый, после нажатия на весь участок введения.

Как показано на фиг. 15 (фиг. 15C) и фиг. 16, субъекты, которым вводят инъецируемую композицию PPC, солюбилизированного DCNa, особенно жаловались на боль и отек во время введения и через 10 дней после введения, и субъект регистрировал кожные поражения, такие как эритема, гематома и синяк, и о местные неблагоприятные воздействия, такие как уплотнение, узелковые утолщения, зуд и ощущение жжения. Однако неожиданным было то, что субъекты, которым вводят инъецируемые препараты PPC, солюбилизированного GCA по настоящему изобретению, отмечают умеренные уровни, практически отсутствие, болевого синдрома (фиг. 15А) и отека (фиг. 15В). В частности, как показано на фиг. 15А, неожиданным было то, что при введении комплексной композиции PPC плюс GCA по настоящему изобретению субъект почти не испытывает боли даже во время инъекции. Принимая во внимание тот факт, что инъецируемый препарат PPC, солюбилизированного DCNa (натриевая соль DCA), который представляет собой обычный известный препарат, применяемый в качестве сравнительного примера, имеет характеристики частиц, сходные (мицеллы, размер частиц и т.д.) с композициями по настоящему изобретению, и эти инъецируемые препараты вводят при значении рН, соответствующем человеческому организму, такой эффект композиции по настоящему изобретению является уникальным эффектом, который является не очевидным из ранее предшествующего уровня техники.

Кроме того, как показано на фиг. 16, гематома и эритема, вызванные исследуемыми веществами, были уменьшены после введения композиции по настоящему изобретению до нулевого или умеренного уровня, за исключением синяка, вызванного самой инъекционной иглой, или гематомы, вызванной повреждением сосудов во время инъекции. В частности, как показано на фиг. 15C, не выявлено такого побочного эффекта как повреждения нерва, потеря чувствительности, обширная отечность, гематома, вызванная лекарственным средством, синяки, эритема, уплотнение, парестезия, узелковые утолщения, зуд, ощущение жжения (тепло), дисфагия и т.п. Принимая во внимание результаты испытаний in vivo, in vitro и токсичности однократной дозы, эффекты композиций PPC, солюбилизированного GCA, на апоптоз адипоцитов и расщепление жира могут быть клинически продемонстрированы на людях с безопасностью и высокой эффективностью.

Промышленная применимость

Как описано выше, настоящее изобретение относится к композиции, применимой для уменьшения жира без хирургического вмешательства без боли, отека и побочного эффекта у субъекта, имеющего локализованное отложение жира, с применением фармацевтически активного фосфатидилхолина, и к способу ее получения. Более конкретно, к композиции и препарату для уменьшения локализованного жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта (особенно некроз мышечных клеток, фибробластов и эндотелиальных клеток сосудов, кроме адипоцитов; отек; потеря чувствительности мест введения; обширная отечность; эритема; уплотнение; парестезия, узелковое утолщение, зуд, ощущение жжения, повреждение нерва или дисфагия), где композиция содержит: (i) фосфатидилхолин; и (ii) по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0, к набору, содержащему ее, к способу ее получения и к способу нехирургического удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта с применением композиции или препарата.

Установлено, что композиции, содержащие только дезоксихолевую кислоту (DCA) или комплексные композиции фосфатидилхолина (PPC) и дезоксихолевой кислоты (DCA), обычных инъецируемых препаратов для уменьшения локализованного жира, вызывают побочные эффекты, вызванные некрозом адипоцитов и цитолизом фибробластов, эндотелиальных клеток и клеток скелетных мышц, такие как потеря чувствительности, обширная отечность, гематома, вызванная лекарственным средством, кровоподтеки, эритема, уплотнение, парестезия, узелковое утолщение, зуд, ощущение жжения (тепло), дисфагия и т.п. Однако, поскольку инъецируемый препарат для уменьшения локализованного жира по настоящему изобретению уменьшает локализованный жир путем избирательной индукции липолиза и апоптоза только адипоцитов, композиция по настоящему изобретению не только демонстрирует значительный эффект в отношении уменьшения адипоцитов, но также демонстрирует значительное понижение болевого синдрома и побочных эффектов, которые сопровождают применение обычных цитолитических инъецируемых композиций. Таким образом, соблюдение режима терапии субъектами значительно улучшается, и, в конечном счете, улучшается качество жизни субъектов, которые хотят уменьшить локализованные отложения жира. Таким образом, можно говорить о высокой промышленной применимости.

1. Композиция для уменьшения локализованного жира, содержащая активные ингредиенты, состоящие из:

(i) фосфатидилхолина; и

(ii) по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли,

где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0.

2. Композиция по п. 1, которая сопровождается пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где побочный эффект представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из некроза мышечных клеток, фибробластов и эндотелиальных клеток сосудов, отличных от адипоцитов, отека, потери чувствительности в месте введения, обширной отечности, эритемы, уплотнения, парестезии, узелкового утолщения, зуда, ощущения жжения, повреждения нерва и дисфагии.

3. Композиция по п. 1, где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 2,6.

4. Композиция по п. 1, где концентрация фосфатидилхолина в композиции составляет от 0,625 до 15 мас./об.%.

5. Композиция по п. 4, где концентрация фосфатидилхолина в композиции составляет от 1,25 до 12,5 мас./об.%.

6. Композиция по п. 1, где соль представляет собой натриевую соль, калиевую соль или аммониевую соль.

7. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из консерванта, изотонического агента и регулятора pH.

8. Композиция по п. 1, предназначенная для нехирургического удаления локализованного отложения жира у субъекта.

9. Композиция по п. 1, представляющая собой инъецируемую композицию.

10. Композиция по п. 1, специфически индуцирующая апоптоз и липолиз адипоцитов.

11. Препарат для удаления локализованного отложения жира у субъекта, содержащий активные ингредиенты, состоящие из:

(i) фосфатидилхолина; и

(ii) по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли,

где молярное отношение (ii) к (i) в препарате составляет от 0,7 до 3,0.

12. Препарат по п. 11, предназначенный для нехирургического удаления локализованного отложения жира у субъекта.

13. Препарат по п. 11, где концентрация фосфатидилхолина в препарате составляет от 0,625 до 15 мас./об.%.

14. Препарат по п. 11, где значение рН препарата составляет от 6,8 до 7,8.

15. Препарат по п. 11, дополнительно содержащий по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из консерванта, изотонического агента и регулятора pH.

16. Препарат по п. 11, представляющий собой инъецируемый препарат.

17. Набор для уменьшения или удаления локализованного отложения жира, содержащий:

(I) первый контейнер, содержащий композицию или препарат для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где композиция или препарат содержит активные ингредиенты, состоящие из: (i) фосфатидилхолина и (ii) по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, где молярное отношение (ii) к (i) в композиции или препарате составляет от 0,7 до 3,0; и

(II) устройство для доставки композиции или препарата к месту отложения жира.

18. Набор по п. 17, где композиция или препарат предназначены для нехирургического удаления локализованного отложения жира у субъекта.

19. Набор по п. 17, где композиция или препарат обеспечены в виде инъецируемого состава.

20. Набор по п. 17, где устройство для доставки предварительно заполнено инъецируемым составом или препаратом.

21. Набор по п. 17, где концентрация фосфатидилхолина в композиции или препарате составляет от 0,625 до 15 мас./об.% от общей массы композиции или препарата.

22. Набор по п. 17, где композиция или препарат дополнительно содержит по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из консерванта, изотонического агента и регулятора pH.

23. Набор по п. 17, содержащий письменное описание по применению композиции или препарата для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта.

24. Набор для уменьшения или удаления локализованного отложения жира, содержащий:

(I) первый контейнер, содержащий композицию или препарат для удаления локализованного отложения жира с пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта, где композиция или препарат содержит активные ингредиенты, состоящие из: (i) фосфатидилхолина и (ii) по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли,

где по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, имеет ту же массу, что и фосфатидилхолин, или менее,

где молярное отношение по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, к фосфатидилхолину составляет от 0,7 до 3,0; и

(II) устройство для доставки композиции или препарата к месту отложения жира.

25. Способ получения инъецируемой композиции для уменьшения локализованного жира, включающий стадии:

(а) добавления по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, к воде для инъекций с последующим растворением при перемешивании для получения прозрачной смеси;

(b) добавления консерванта с последующим перемешиванием;

(с) добавления фосфатидилхолина с последующим перемешиванием при комнатной температуре; и

(d) доведения общего объема композиции водой с последующим перемешиванием,

где молярное отношение по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, к фосфатидилхолину составляет от 0,7 до 3,0.

26. Способ по п. 25, где концентрация фосфатидилхолина составляет от 0,625 до 15 мас./об.% от общей массы композиции.

27. Способ по п. 25, где молярное отношение по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, к фосфатидилхолину составляет от 0,7 до 2,6.

28. Способ по п. 25, где консервант представляет собой бензиловый спирт.

29. Способ по п. 25, где стадия (b) дополнительно включает добавление изотонического агента.

30. Способ по п. 25, где композиция специфически индуцирует апоптоз и липолиз адипоцитов.

31. Способ получения фармацевтической композиции для нехирургического удаления локализованного отложения жира, включающий добавление по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли к фосфатидилхолину (РРС),

где по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, имеет ту же массу, что и фосфатидилхолин, или менее,

где молярное отношение по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, к фосфатидилхолину составляет от 0,7 до 3,0.

32. Способ по п. 31, где концентрация фосфатидилхолина составляет от 0,625 до 15 мас./об.% от общей массы композиции.

33. Способ по п. 31, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из консерванта, изотонического агента и регулятора pH.

34. Способ удаления локализованного отложения жира у субъекта, включающий введение эффективного количества фосфатидилхолина и по меньшей мере одного солюбилизирующего фосфатидилхолин агента, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, субъекту, имеющему локализованное отложение жира,

где молярное отношение по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты (GCA), таурохолевой кислоты (TCA) и их соли, к фосфатидилхолину составляет от 0,7 до 3,0.

35. Способ по п. 34, где локализованное отложение жира удаляют нехирургическим путем.

36. Способ по п. 34, который сопровождается пониженным проявлением болевого синдрома и побочного эффекта у субъекта и где побочный эффект представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из отека, некроза мышечных клеток, фибробластов и эндотелиальных клеток сосудов, отличных от адипоцитов, потери чувствительности в месте введения, обширной отечности, эритемы, уплотнения, парестезии, узелкового утолщения, зуда, ощущения жжения, повреждения нерва и дисфагии.

37. Способ по п. 34, где стадия введения включает подкожную инъекцию.

38. Способ нехирургического удаления локализованного отложения жира у субъекта, имеющего локализованное отложение жира, включающий введение препарата, содержащего активные ингредиенты, состоящие из (i) фосфатидилхолина и (ii) по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, состоящей из гликохолевой кислоты, таурохолевой кислоты и их соли, субъекту, имеющему локализованное отложение жира,

где молярное отношение (ii) к (i) в композиции составляет от 0,7 до 3,0.

39. Способ по п. 38, где препарат находится в форме инъецируемой композиции.