Реагент для выявления, набор для выявления и способ выявления метилирования гена itga4

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой набор для выявления и способ выявления метилирования гена ITGA4. Праймер и зонд, предусмотренные в настоящем изобретении, являются соответствующими, что дает возможность осуществлять выявление с использованием образца фекалий в качестве объекта, и таким образом выявление является простым, удобным и быстрым. Экспериментально доказано, что для образца фекалий, в случае если специфичность составляет 95,2%, чувствительность выявления метилированного ITGA4 по отношению к раку кишечника и аденоидной опухоли составляет соответственно 83,8% и 41,6%; и для ткани рака кишечника, в случае если специфичность составляет 97,6% (40/41), частота выявления колоректального рака и аденоидной опухоли составляет соответственно 96,2% (101/105) и 71,6% (78/109). Эти результаты превосходят результаты выявления, полученные при использовании других праймеров или зондов. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Настоящая заявка испрашивает приоритет заявки на китайский патент № 201710236243.9, под названием «Реагент для выявления, набор для выявления и способ выявления метилирования гена ITGA4», и поданной в Китайское патентное ведомство 12 апреля 2017 года, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к технической области выявления генов, в частности к реагенту для выявления, набору для выявления и способу выявления метилирования гена ITGA4.

Предпосылки изобретения

Фекальный иммунохимический тест на ДНК (FIT-DNA) был включен в способы скрининга колоректального рака в 2016 году Американской рабочей группой по профилактическим мероприятиям (USPSTF). Одним из принципов этого теста является выявление уровней метилирования специфических генов в слущивающихся клетках в фекалиях. Основой этого теста является выбор маркеров метилирования ДНК с очень высокой чувствительностью и специфичностью к раку кишечника. Современные исследования показывают, что выявление метилирования гена ITGA4 характеризуется высокой чувствительностью выявления и специфичностью к раку кишечника в образцах тканей и фекалий.

Исследование показывает, что чувствительность выявления метилированного ITGA4 по отношению к аденоидной опухоли в образцах фекалий составляет 69% (9/13), а специфичность - 79% (22/28). Другое исследование показывает, что при выявлении метилированного ITGA4 в образцах фекалий, в случае если специфичность составляет 100% (31/31), частота выявления колоректального рака и колоректальной аденоидной опухоли составляет соответственно 36,7% (11/30) и 16% (4/25). Эти результаты исследований показывают, что все еще есть большие возможности для улучшения чувствительности и специфичности выявления этого гена, связанного с раком кишечника и аденоидной опухолью, в образцах фекалий.

Ключевым фактором, влияющим на чувствительность и специфичность выявления маркеров, являются последовательности праймеров; таким образом, имеет большое значение в дальнейшем полагаться на использование праймеров для выявления с высокой чувствительностью и специфичностью в отношении метилирования гена ITGA4.

Краткое описание

В связи с вышеизложенным техническая задача, которая подлежит решению с помощью настоящего изобретения, состоит в том, чтобы предоставить набор для выявления и способ выявления метилирования гена ITGA4. Наборы как для количественного, так и для качественного выявления, предусматриваемые настоящим изобретением, могут обеспечить выявление, характеризующееся специфичностью и чувствительностью в отношении метилирования гена ITGA4.

Настоящее изобретение предусматривает:

набор для качественного выявления метилирования гена ITGA4, в котором используются в качестве образца для осуществления выявления фекалии, ткань или клетки, и который содержит реагент для захвата гена ITGA4 и реагент для качественного выявления метилирования гена ITGA4.

В примере настоящего изобретения реагент для захвата гена ITGA4 содержит комплекс зонда с магнитным микроносителем. В некоторых конкретных примерах последовательность зонда показана под SEQ ID NO: 1.

Реагент для качественного выявления метилирования гена ITGA4 содержит праймер для выявления, и при этом нуклеотидная последовательность праймера для выявления показана под SEQ ID NO: 2-3.

Настоящее изобретение также предусматривает набор для количественного выявления метилирования генов ITGA4, в котором используются в качестве подлежащего выявлению образца фекалии, ткани или клетки, и который содержит реагент для захвата генов ITGA4 и реагент для количественного выявления метилирования генов ITGA4.

В примере настоящего изобретения реагент для захвата генов ITGA4 содержит комплекс зондов с магнитными микроносителями. В некоторых конкретных примерах последовательность зонда показана под SEQ ID NO: 1.

В примере настоящего изобретения реагент для количественного выявления метилирования генов ITGA4 содержит праймер для выявления и зонд для выявления, где нуклеотидная последовательность праймера для выявления показана под SEQ ID NO: 4-5; и нуклеотидная последовательность зонда для выявления показана под SEQ ID NO: 6.

Настоящее изобретение также предусматривает набор для выявления метилирования генов ITGA4, в котором используются фекалии, ткани или клетки в качестве подлежащего выявлению образца, и который содержит реагент для захвата генов ITGA4, реагент для качественного выявления метилирования генов ITGA4 и реагент для количественного выявления метилирования генов ITGA4.

Реагент для захвата генов ITGA4 содержит комплекс зондов с магнитными микроносителями; при этом в комплексе зондов с магнитными микроносителями нуклеотидная последовательность зонда показана под SEQ ID NO: 1;

реагент для качественного выявления метилирования генов ITGA4 содержит праймер для выявления; нуклеотидная последовательность праймера для выявления показана под SEQ ID NO: 2-3; и

реагент для количественного выявления метилирования генов ITGA4 содержит праймер для выявления и зонд для выявления; нуклеотидная последовательность праймера для выявления показана под SEQ ID NO: 4-5, и нуклеотидная последовательность зонда для выявления показана под SEQ ID NO: 6.

Гены ITGA4 захватывают в образцах фекалий с помощью последовательности для захвата нуклеотидной последовательности, показанной под SEQ ID NO: 1, и уровень метилирования ITGA4 выявлен в 240 образцах фекалий (80 случаев рака кишечника, 77 случаев аденоидной опухоли, превышающей или равной 1 см, и 83 случая с нормальными образцами). Результаты показывают, что в случае если специфичность составляет 95,2%, чувствительность выявления метилированного ITGA4 по отношению к раку кишечника и аденоидной опухоли составляет соответственно 83,8% и 41,6%.

Уровень метилирования ITGA4 выявлен в 105 образцах, содержащих нормальную и патологическую ткань, при раке кишечника, в 109 случаях ткани аденоидной опухоли, превышающей или равной 1 см, и в 41 случае нормальной эпителиальной ткани кишечника с использованием праймера и зонда для теста qMSP. В случае если специфичность составляет 97,6%, частота выявления колоректального рака и аденоидной опухоли составляет соответственно 96,2% и 71,6%.

Уровень метилирования генов ITGA4 выявлен в шести клеточных линиях колоректального рака, включая Widr, SW480, HCT15, HT29, Caco2 и DLD1, с использованием праймера для теста MSP. Результат показывает, что ITGA4 является метилированным во всех шести типах клеток колоректального рака.

Предпочтительно, образец для осуществления выявления с помощью набора, предусмотренного настоящим изобретением, представляет собой фекалии и/или ткань;

в некоторых конкретных примерах образец для осуществления выявления представляет собой фекалии.

Настоящее изобретение также предусматривает способ качественного выявления метилирования генов ITGA4, включающий: использование образца для осуществления выявления в качестве матрицы, захват генов ITGA4 с помощью реагента для захвата, а затем модификацию бисульфитом, амплификацию с помощью реагента для качественного выявления и определение того, являются ли гены ITGA4 метилированными или неметилированными в соответствии с продуктом амплификации;

где образец для осуществления выявления являет собой фекалии, ткань или клетки;

реагент для захвата содержит комплекс зонда с магнитным микроносителем; при этом нуклеотидная последовательность зонда, входящего в состав комплекса зонда с магнитным микроносителем, представлена под SEQ ID NO: 1;

реагент для качественного выявления содержит праймер для выявления; нуклеотидная последовательность праймера для выявления представлена под SEQ ID NO: 2-3.

В частности, использование подлежащего выявлению образца в качестве матрицы, захват генов ITGA4 с помощью последовательности для захвата генов ITGA4 нуклеотидной последовательности, показанной под SEQ ID NO: 1, затем обработка и модификация бисульфитом, затем амплификация с помощью праймера для качественного выявления метилирования генов ITGA4 нуклеотидной последовательности, показанной под SEQ ID NO: 2-3, и определение того, являются ли метилированными гены ITGA4 в соответствии с продуктом амплификации или не являются; и при этом подлежащий выявлению образец являет собой фекалии, ткани или клетки.

Предпочтительно, подлежащий выявлению образец являет собой фекалии, колоректальный рак, колоректальную аденоидную опухоль, нормальную кишечную эпителиальную ткань или клеточные линии. Предпочтительно, подлежащий выявлению образец являет собой фекалии.

В способе с захватом магнитными микроносителями магнитные микроносители берут в качестве твердофазного адсорбционного носителя, и используют специально разработанную систему реагентов и процедуру выделения («Detection and Extraction of Free Methylated DNA in Urine by Applying Magnetic Bead Method», Journal of China Medical University, 2015, (10)).

В настоящем изобретении последовательность показана под SEQ ID NO. 1. Гены ITGA4, содержащиеся в фекалиях, могут быть извлечены и обогащены с помощью захвата магнитными микроносителями.

В некоторых случаях, необязательно, фекалии могут быть обработаны с помощью: равномерного смешивания фекалий в буферном растворе, центрифугирования, перенесения супернатанта в другую пробирку, добавления магнитных микроносителей с определенными последовательностями для захвата комплементарных олигонуклеотидов к супернатанту, после инкубации и гибридизации, притягивания магнитных микроносителей на одну сторону стенки пробирки с помощью магнита и после многократной промывки, элюирования ДНК гена-мишени с помощью буферного раствора. Целевые гены могут быть захвачены с помощью этого способа, и процесс обогащения длится приблизительно 2 часа.

Захваченную ДНК обрабатывают и модифицируют бисульфитом для последующего выявления с помощью флуоресцентной количественной ПЦР.

Система амплификации: вода без нуклеаз 10,5 мкл, 2× ферментный реакционный раствор - 12,5 мкл, прямой праймер и обратный праймер (концентрация 5 мкМ) - по 0,5 мкл каждого, и подлежащая выявлению ДНК - 1 мкл, всего 25 мкл.

Программа амплификации: 95°C 5 мин., (95°C 30 с, 64°C 30 с и 72°C 30 с) × 34 цикла, 72°C 5 мин. и 37°C 30 с.

В соответствии с результатом амплификации, если появляется полоса амплификации, то гены являются метилированными.

Кроме того, настоящее изобретение предусматривает способ количественного выявления метилирования генов ITGA4, включающий:

использование подлежащего выявлению образца в качестве матрицы, захват генов ITGA4 с помощью реагента для захвата, затем модификация бисульфитом, осуществление количественного выявления с помощью реагента для количественного выявления, и определение уровня метилирования генов ITGA4 в соответствии с количественным результатом;

где подлежащий выявлению образец являет собой фекалии, ткани или клетки;

реагент для захвата содержит комплекс зондов с магнитными микроносителями; при этом в комплексе зондов с магнитными микроносителями нуклеотидная последовательность зонда показана под SEQ ID NO: 1;

реагент для количественного выявления содержит праймер для выявления и зонд для выявления; нуклеотидная последовательность праймера для выявления показана под SEQ ID NO: 4-5, и нуклеотидная последовательность зонда для выявления показана под SEQ ID NO: 6.

В частности, использование подлежащего выявлению образца в качестве матрицы, захват генов ITGA4 с помощью последовательности для захвата генов ITGA4 нуклеотидной последовательности, показанной под SEQ ID NO: 1, затем обработка и модификация бисульфитом, затем осуществление количественного выявления с помощью праймера для количественного выявления метилирования генов ITGA4 нуклеотидной последовательности, показанной под SEQ ID NO: 4-5, и зонда для количественного выявления метилирования генов ITGA4 нуклеотидной последовательности, показанной под SEQ ID NO: 6, и уровень метилирования генов ITGA4 определяют в соответствии с количественным результатом; и подлежащий выявлению образец являет собой фекалии, ткани или клетки.

Предпочтительно, подлежащий выявлению образец являет собой фекалии, колоректальный рак, колоректальную аденоидную опухоль, нормальную кишечную эпителиальную ткань или клеточные линии. Предпочтительно, подлежащий выявлению образец являет собой фекалии.

В способе с захватом магнитными микроносителями магнитные микроносители используются в качестве твердофазного адсорбционного носителя, а также используются специально разработанная система реагентов и процедура экстракции («Detection and Extraction of Free Methylated DNA in Urine by Applying Magnetic Bead Method», Journal of China Medical University 2015, (10)).

В настоящем изобретении последовательность показана под SEQ ID NO. 1. Гены ITGA4 в фекалиях можно извлечь и обогатить с помощью захвата магнитными микроносителями.

В некоторых случаях, необязательно, фекалии могут быть обработаны с помощью: равномерного смешивания фекалий в буферном растворе, центрифугирования, перенесения супернатанта в другую пробирку, добавления магнитных микроносителей с определенными последовательностями для захвата дополнительных комплементарных олигонуклеотидов к супернатанту, после инкубации и гибридизации, притягивания магнитных микроносителей на одну сторону стенки пробирки с помощью магнита и после многократной промывки, элюирования ДНК гена-мишени с помощью буферного раствора. Целевые гены могут быть захвачены с помощью этого способа, и процесс обогащения длится приблизительно 2 часа.

Захваченную ДНК обрабатывают и модифицируют бисульфитом для последующего выявления с помощью флуоресцентной количественной ПЦР.

Реакционная система амплификации: нуклеазная вода - 8,2 мкл, 5× ферментный реакционный буферный раствор - 5 мкл, MgCl₂ (25 мМ) - 5 мкл, дНТФ (10 мМ) - 1 мкл, фермент реакции - 0,5 мкл, прямой праймер (100 мкМ) - 0,125 мкл, обратный праймер (100 мкМ) - 0,125 мкл, зонд (100 мкМ) - 0,05 мкл и подлежащая выявлению ДНК - 5 мкл, всего 25 мкл.

Процедура: 95°C 4 мин., (95°C 20 с, 56°C 30 с и 72°C 30 с) × 45 циклов и 37°C 30 с.

В соответствии с количественным результатом относительный уровень метилирования генов ITGA4 получают путем расчета, принимая ген ACTB в качестве референсного гена.

Праймер и зонд, предусмотренные настоящим изобретением, являются соответствующими, что дает возможность осуществлять выявление с использованием образца фекалий, и таким образом выявление является простым, удобным и быстрым. Согласно настоящему изобретению выявление также можно осуществлять с использованием образцов ткани. Более того, способ выявления с использованием этих образцов также предусматривает улучшение специфичности и чувствительности выявления. Экспериментально доказано, что для образца фекалий, в случае если специфичность составляет 95,2%, чувствительность выявления метилированного ITGA4 по отношению к раку кишечника и аденоидной опухоли составляет соответственно 83,8% и 41,6%; и для ткани рака кишечника, в случае если специфичность составляет 97,6% (40/41), частота выявления колоректального рака и аденоидной опухоли составляет соответственно 96,2% (101/105) и 71,6% (78/109). Эти результаты превосходят результаты выявления, полученные при использовании других праймеров или зондов.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показан точечный график уровней метилирования генов ITGA4 в образцах рака, аденоидной опухоли и нормальной группы, где **** означает, что P меньше чем 0,0001;

на фиг. 2 показан график ROC, где AUC (рак по сравнению с нормой) равен 0,953 (95% ДИ: 0,920-0,985); и AUC (аденоидная опухоль по сравнению с нормой) равна 0,735 (95% ДИ: 0,657-0,814);

на фиг. 3 показана кривая амплификации градиентно-разбавленных S1-S6 и построенная из них стандартная кривая, где NTC означает нематричный контроль, WT означает ДНК дикого типа в качестве контроля, и каждый образец в лунках содержался в трех повторностях;

на фиг. 4 показана стандартная кривая с линейностью R2, равной 0,995, и эффективностью амплификации, равной 97,96%; и

на фиг. 5 приведены кривые амплификации для разных праймеров и зондов.

Подробное описание

Настоящее изобретение предусматривает реагент для выявления, набор для выявления и способ выявления метилирования генов ITGA4, которое может быть выполнено специалистом в данной области техники, руководствуясь содержанием данного документа и соответственно с улучшением параметров способа. В частности, отмечается, что все подобные заменители и модификации, очевидные для специалиста в данной области техники, считаются включенными в настоящее изобретение. Способы и варианты применения настоящего изобретения были описаны с помощью предпочтительных примеров, и специалисту в данной области техники будет очевидно, что технология настоящего изобретения может быть применена на практике с модификацией или соответствующим изменением и комбинацией способов и вариантов применения, описанных в данном документе, без отступления от содержания, сущности и объема настоящего изобретения.

Материалы для тестирования, реагенты и инструменты, используемые в настоящем изобретении, являются общераспространенными коммерческими продуктами и могут быть приобретены на рынке.

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Качественное выявление

Отбирали шесть клеточных линий колоректального рака, включая Widr, SW480, HCT15, HT29, Caco2 и DLD1, и дополнительно в качестве контроля использовали здоровые клетки CCD-18CO. Тест MSP использовали для выявления метилирования генов ITGA4 в этих клетках; и при этом выявление с использованием каждой клеточной линии повторяли 10 раз.

Способ включает следующие стадии.

1. Клеточные осадки собирали и переносили в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл, предварительно содержащую 3 мл клеточного лизата.

Добавляли 100 мкл магнитных микроносителей для захвата в центрифужную пробирку, где магнитные микроносители для захвата содержали последовательность для захвата (5'-TGCTTCTCCGGGTACGGGCCGCTGGGTGGGGTC-3), представляющую собой последовательность, показанную как последовательность для захвата под SEQ ID NO: 1. Смесь инкубировали на водяной бане при 92°C в течение 10 мин. и на шейкере при комнатной температуре при 100 об/мин. в течение 1 ч., а затем помещали на магнитный штатив на 5 мин. после короткого центрифугирования с удалением супернатанта.

Добавляли 500 мкл промывочного раствора в центрифужную пробирку объемом 15 мл, качали и встряхивали, чтобы достичь полного подвешивания магнитных микроносителей на стенке пробирки, и переносили в новую центрифужную пробирку объемом 2 мл после короткого центрифугирования. Смесь инкубировали на бане сухого нагрева при комнатной температуре при 900 об/мин. в течение 1 мин., а затем помещали на магнитный штатив на 1 мин. с удалением супернатанта. Процесс повторяли 4 раза.

Добавляли 55 мкл элюента, центрифугировали в течение непродолжительного периода времени, инкубировали на бане сухого нагрева при 92°C и при 900 об/мин. в течение 10 мин., центрифугировали в течение непродолжительного периода времени, помещали на магнитный штатив и переносили в новую пробирку для электрофореза в течение 3 мин.

2. Бисульфитную трансформацию осуществляли с помощью набора для метилирования ДНК EZ (ZYMO RESEARCH).

3. Амплификация. Праймеры включали:

последовательность прямого праймера 5'-TCGGAGAAGTAGCGCGAGTATTC-3' (SEQ ID NO: 2);

последовательность обратного праймера 5'-AAATCGACCCACCGCGAACG-3' (SEQ ID NO: 3).

Система: 25 мкл (схема 1×: вода без нуклеаз - 10,5 мкл, бесцветный мастер-микс для горячего старта GoTaq - 12,5 мкл, прямой праймер и обратный праймер (концентрация 5 мкМ) - по 0,5 мкл каждого и подлежащая выявлению ДНК - 1 мкл)

Процедура: 95°C 5 мин., (95°C 30 с, 64°C 30 с и 72°C 30 с) × 34 цикла, 72°C 5 мин. и 37°C 30 с.

4. Оценка результатов амплификации.

В соответствии с результатом амплификации проводят электрофорез в агарозном геле на продукте ПЦР, и наличие полос означает метилирование.

Результаты: метилирование ITGA4 было выявлено во всех шести типах клеток рака кишечника с точностью 10-повторного выявления вплоть до 100%, в то время как в здоровых клетках метилирование не было выявлено.

Пример 2. Количественное выявление

1. Фекалии в качестве образца

Отбирали 240 образцов фекалий, в том числе 80 случаев рака кишечника, 77 случаев аденоидной опухоли, большей или равной 1 см, и 83 случая нормы, основанные на энтероскопии, и осуществляли количественное выявление уровня метилирования генов ITGA4.

Процесс тестирования: Гены ITGA4 захватывали с использованием последовательности для захвата (SEQ ID NO: 1) в образцах фекалий; и условия захвата и процесс были такими же, как в примере 1), и количественное выявление уровня метилирования генов ITGA4 в образцах осуществляли с помощью теста qMSP с использованием ACTB в качестве референсного гена.

Праймеры и зонды для количественного выявления:

последовательность прямого праймера 5'-ACGCGAGTTTTGCGTAGTC-3' (SEQ ID NO: 4).

последовательность обратного праймера 5'-TCCGAATACGAACCGCTAA-3' (SEQ ID NO: 5).

Последовательность зонда для выявления: 5'-ACGGAGTTCGGTTTTGCGTTTTC-3' (SEQ ID NO: 6).

Система: 25 мкл (схема 1×: вода без нуклеазы - 8,2 мкл, 5× бесцветный буфер GoTaq Flexi - 5 мкл, MgCl₂ (25 мМ) - 5 мкл, дНТФ (10 мМ) - 1 мкл, полимераза для горячего старта GoTaq - 0,5 мкл, прямой праймер (100 мМ) - 0,125 мкл, обратный праймер (100 мкМ) - 0,125 мкл, зонд (100 мкМ) - 0,05 мкл и ДНК - 5 мкл).

Процедура: 95°C 4 мин., (95°C 20 с, 56°C 30 с и 72°C 30 с) × 45 циклов и 37°C 30 с.

В 240 образцах фекалий (80 случаев рака кишечника, 77 случаев аденоидной опухоли, большей или равной 1 см, и 83 случаев нормы) выявили уровень метилирования ITGA4, и результаты показали, что при специфичности 95,2% чувствительность метилированных ITGA4 к раку кишечника и аденоидной опухоли составила соответственно 83,8% и 41,6% (рис. 1-2).

2. Ткань в качестве образца

Выбирали колоректальный рак, колоректальную аденоидную опухоль и образцы нормальной кишечной эпителиальной ткани, вырезанные хирургическим или эндоскопическим методом, и осуществляли количественное выявление уровня метилирования генов ITGA4 со следующими образцами: 105 пар ткани рака кишечника и параканкрозной спаренной ткани, 109 случаев аденоидной опухолевой ткани, большей или равной 1 см, и 41 случай нормальной эпителиальной ткани кишечника.

ДНК каждой ткани экстрагировали, обрабатывали и модифицировали бисульфитом, а затем осуществляли количественное выявление уровня метилирования генов ITGA4 в образцах с помощью теста qMSP.

Кривую ROC (фиг. 2) строили в соответствии с количественным результатом, и результат показал: в случае если специфичность составляла 97,6% (40/41), - частота выявления колоректального рака и аденоидной опухоли составляла соответственно 96,2% (101/105) и 71,6% (78/109). Площади под кривой соответственно следующие: 0,958 (95% ДИ: 0,909-1) и 0,832 (95% ДИ: 0,761-0.902), (P обоих меньше чем 0,001).

Пример 3. Предел выявления

Бисульфитную трансформацию осуществляли с использованием метилированной ДНК CpGenomeUniversal (приобретено в Millipore) для получения 20 нг/мкл матричной ДНК, и S1, S2, S3, S4, S5 и S6 получали путем 5-кратных градиентных разбавлений с концентрациями соответственно 20 нг/мкл, 4 нг/мкл, 0,8 нг/мкл, 0,16 нг/мкл, 0,032 нг/мкл и 0,0064 нг/мкл.

Количественную ПЦР осуществляли с загрузочной матрицей в количестве 5 мкл (способ и праймер являются такими же, как в примере 2). Как видно, фактические количества добавляемой ДНК S1-S6 составляли соответственно 100 нг, 20 нг, 4 нг, 0,8 нг, 0,16 нг и 0,032 нг. Результат количественной ПЦР показал, что количество ДНК, выявляемое зондом праймера гена, варьировалось от 0,032 нг до 100 нг (фиг. 3).

Сравнительный пример 1

Бисульфитную трансформацию осуществляли с использованием метилированной ДНК CpGenomeUniversal (приобретено в Millipore); и ACTB использовали в качестве контрольного гена, а затем различные праймеры и зонды использовали для количественного выявления, чтобы исследовать результат амплификации для каждого набора зондов и праймеров.

Используемые праймеры и зонды показаны в таблице 1.

Таблица 1. Праймеры и зонды

Результаты амплификации с использованием каждого набора зондов и праймеров показаны на фиг. 5, и результат амплификации в случае набора 1 ссылался на результаты определения предела выявления из примера 3 (матрица для выявления S3 в случае определения предела выявления была такой же, как матрица для выявления в этом сравнительном примере). Как видно из данных в таблице, в конкретном процессе амплификации, нацеленном на ген-мишень, значение Ct, полученное в результате амплификации с использованием набора 1, было минимальным, что указывает на лучший результат амплификации и превосходит зонды из других наборов.

Выше приведены только предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Следует отметить, что многочисленные модификации и адаптации могут быть выполнены специалистом в данной области техники без отклонения от принципов настоящего изобретения, и такие модификации и адаптации должны рассматриваться в пределах объема правовой охраны настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> КРИЭЙТИВ БАЙОСАЙЕНСИЗ (ГУАНЧЖОУ) КО., ЛТД.

<120> РЕАГЕНТ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ, НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНА ITGA4

<130> OP171076

<160> 24

<170> PatentIn версия 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность для захвата

<400> 1

tgcttctccg ggtacgggcc gctgggtggg gtc 33

<210> 2

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер ITGA4

<400> 2

tcggagaagt agcgcgagta ttc 23

<210> 3

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер ITGA4

<400> 3

aaatcgaccc accgcgaacg 20

<210> 4

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер из набора 1

<400> 4

acgcgagttt tgcgtagtc 19

<210> 5

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер из набора 1

<400> 5

tccgaatacg aaccgctaa 19

<210> 6

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд из набора 1

<400> 6

acggagttcg gttttgcgtt ttc 23

<210> 7

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер из набора 2

<400> 7

gttttcgtat tacgttcggg 20

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер из набора 2

<400> 8

tcgaaccgac ctaaaatacc 20

<210> 9

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд из набора 2

<400> 9

aatcgggagt ggggtcgggc ga 22

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер из набора 3

<400> 10

tatcgagagc gtatggtttg 20

<210> 11

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер из набора 3

<400> 11

ccacgttata aaaacgaccg 20

<210> 12

<211> 23

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд из набора 3

<400> 12

agggtcgtcg ttcgggagac ggt 23

<210> 13

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер из набора 4

<400> 13

agagttattt cgcgttttgc 20

<210> 14

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер из набора 4

<400> 14

atcccgaacg taatacgaaa 20

<210> 15

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд из набора 4

<400> 15

tgggaggttc gggttaggac gcga 24

<210> 16

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер из набора 5

<400> 16

tgcgttttcg tattacgttc 20

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер из набора 5

<400> 17

ccaaccgaaa acttcgaata 20

<210> 18

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд из набора 5

<400> 18

gcggttcgta ttcggagaag tagcgcg 27

<210> 19

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер из набора 6

<400> 19

gcggttcgta ttcggagaag 20

<210> 20

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер из набора 6

<400> 20

tctaccgcca accgaaaact 20

<210> 21

<211> 13

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд из набора 6

<400> 21

agcgcgagta ttc 13

<210> 22

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер из набора 7

<400> 22

tgcggaggcg tagggtc 17

<210> 23

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер из набора 7

<400> 23

caaccgaaat tccccaacg 19

<210> 24

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд из набора 7

<400> 24

cctacaaccg cgcgtaaaca aaaacg 26

<---

1. Набор для выявления метилирования гена ITGA4, отличающийся тем, что в качестве образца для осуществления выявления используются фекалии, ткань или клетки, и содержащий реагент для захвата гена ITGA4 и реагент для качественного выявления метилирования гена ITGA4;

при этом реагент для качественного выявления метилирования гена ITGA4 содержит праймер для выявления; и при этом нуклеотидная последовательность праймера для выявления представлена под SEQ ID NO: 2-3.

2. Набор для выявления метилирования гена ITGA4, отличающийся тем, что в качестве образца для осуществления выявления используются фекалии, ткань или клетки, и содержащий реагент для захвата гена ITGA4 и реагент для количественного выявления метилирования гена ITGA4;

при этом реагент для количественного выявления метилирования гена ITGA4 содержит праймер для выявления и зонд для выявления; и при этом нуклеотидная последовательность праймера для выявления представлена под SEQ ID NO: 4-5 и нуклеотидная последовательность зонда для выявления представлена под SEQ ID NO: 6.

3. Набор для выявления метилирования гена ITGA4, отличающийся тем, что в качестве образца для осуществления выявления используются фекалии, ткань или клетки, и содержащий реагент для захвата гена ITGA4 и реагент для качественного выявления метилирования гена ITGA4;

при этом реагент для захвата гена ITGA4 содержит комплекс зонда с магнитным микроносителем.

4. Набор для выявления метилирования гена ITGA4, отличающийся тем, что в качестве образца для осуществления выявления используются фекалии, ткань или клетки, и содержащий реагент для захвата гена ITGA4 и реагент для количественного выявления метилирования гена ITGA4;

при этом реагент для захвата гена ITGA4 содержит комплекс зонда с магнитным микроносителем.

5. Набор для выявления по любому из пп. 1, 2, отличающийся тем, что реагент для захвата гена ITGA4 содержит комплекс зонда с магнитным микроносителем.

6. Набор для выявления по любому из пп. 3-5, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность зонда, входящего в состав комплекса зонда с магнитным микроносителем, представлена под SEQ ID NO: 1.

7. Набор для выявления метилирования гена ITGA4, отличающийся тем, что в качестве образца для осуществления выявления используются фекалии, ткань или клетки, и содержащий реагент для захвата гена ITGA4, реагент для качественного выявления метилирования гена ITGA4 и реагент для количественного выявления метилирования гена ITGA4;

при этом

реагент для захвата гена ITGA4 содержит комплекс зонда с магнитным микроносителем; при этом нуклеотидная последовательность зонда, входящего в состав комплекса зонда с магнитным микроносителем, представлена под SEQ ID NO: 1;

реагент для качественного выявления метилирования гена ITGA4 содержит праймер для выявления; при этом нуклеотидная последовательность праймера для выявления представлена под SEQ ID NO: 2-3; и

реагент для количественного выявления метилирования гена ITGA4 содержит праймер для выявления и зонд для выявления; при этом нуклеотидная последовательность праймера для выявления представлена под SEQ ID NO: 4-5 и нуклеотидная последовательность зонда для выявления представлена под SEQ ID NO: 6.

8. Способ выявления опухоли, включающий:

получение образца;

экстрагирование ДНК из указанного образца;

амплификацию ДНК и определение уровня метилирования гена ITGA4 с помощью набора для выявления по любому из пп. 1-7; и

выявление присутствия опухоли у пациента согласно уровню метилирования гена ITGA4.

9. Способ по п. 8, где образец выбран из по меньшей мере одного из фекалий, тканей и клеток.

10. Способ по п. 8, где образец представляет собой фекалии.

11. Способ по п. 8, где опухоль выбрана из по меньшей мере одного из рака кишечника и предраковой аденомы кишечника.