Генерализованное стохастическое секвенирование сверхразрешения

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ секвенирования полинуклеотидов и система визуализации для осуществления указанного способа. Способ включает присоединение первой и второй молекул ДНК-матрицы к первому и второму элементам для присоединения, соответственно, обеспечение включающей набор нуклеотидов химии стохастического фотопереключения, визуализацию серии событий включения и выключения для первой и второй молекул ДНК-матрицы в реальном времени. Система содержит контейнер для образца с множеством элементов для присоединения молекул ДНК-матрицы и визуализатор для визуализации происходящего на первом и втором элементах для присоединения фотопереключения. Причем серия событий включения и выключения для первой и второй молекул ДНК-матрицы являются стохастическими и не синхронизированными, а расстояние между первым элементом для присоединения и вторым элементом для присоединения меньше, чем предел Аббе. Изобретения обеспечивают одновременную реакцию для всех молекул в пределах поля зрения, а также визуализацию процесса в реальном времени. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил.

 

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Многочисленные технологии в области биологии, включая технологии, используемые в секвенировании ДНК, выиграли от улучшенных систем и методик визуализации. Ранние подходы к секвенированию ДНК включали способ терминации дидезоксицепи (т.е. секвенирование по Сэнджеру) и способ химической деградации (т.е. секвенирование по Максаму-Джильберту). Потребность в более дешевой и более быстрой альтернативе данным методикам привела к разработке подхода группового секвенирования, известного как секвенирование посредством синтеза (SBS). В данном способе единичные молекулы матрицы сначала химически амплифицируются с получением связанных с поверхностью «кластеров» молекул, имеющих одинаковую последовательность. Как только получены кластеры, начинается секвенирование, при котором флуоресцентные нуклеотиды добавляются модифицированной полимеразой на основе последовательности матрицы. Данные кластеры затем возбуждаются источником света, приводя к испусканию характерного флуоресцентного сигнала для распознавания основания. Красители затем удаляются, наряду с 3'-терминатором цепи, и данный цикл повторяется для следующего основания в последовательности.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Разные примеры технологий, раскрытых в данном документе, предоставляют способы и методики для секвенирования сверхразрешения. В одном примере система и способ секвенирования целого ряда полинуклеотидов включают: присоединение одной молекулы ДНК-матрицы к каждому из множества элементов для присоединения на контейнере для образца, где среднее расстояние между смежными элементами меньше, чем предел Аббе; применение химии стохастического фотопереключения ко всем молекулам одновременно для вызова флуоресценции присоединенных молекул в событиях включения и выключения вплоть до четырьмя разными цветами посредством стохастического фотопереключения; и визуализация событий включения и выключения в цветовом канале для каждого цвета в реальном времени, по мере того, как события включения и выключения происходят в отношении присоединенных молекул. Среднее расстояние между смежными элементами может быть меньше, чем примерно 20 нм, или оно может находиться в пределах интервала от примерно 2 нм до примерно 20 нм.

В другом примере способ секвенирования полинуклеотидов может включать: предоставление массива нуклеотидных последовательностей, заякоренных на твердой подложке, где среднее расстояние между смежными якорями меньше, чем предел Аббе; предоставление к данному массиву смеси, содержащей фермент, способный связывать нуклеотиды, деблокирующий агент, нуклеиновую кислоту, связанную с нитью нуклеотидов, имеющую последовательность, комплементарную нуклеотидным последовательностям, заякоренным на твердой подложке, и более чем один аналог нуклеотида, содержащий основание с группировкой метки и соответствующей группировкой гасителя, связанной с ним, где группировки метки коррелируют с группировкой специфического основания; и обеспечение того, чтобы шло последовательное добавления целого ряда аналогов нуклеотидов к нуклеиновой кислоте посредством нескольких циклов реакции в данной смеси, при сопутствующей визуализации группировок меток в пределах массива; где каждый цикл реакции может включать: (i) полимеразу, добавляющую аналог нуклеотида к нуклеиновой кислоте посредством отщепления группировки гасителя и образования временного соединения нуклеиновой кислоты, содержащего группировку метки; и (и) деблокирующий агент, модифицирующий временное соединение нуклеиновой кислоты для удаления данной группировки метки. В некоторых примерах применения среднее расстояние между смежными якорями меньше, чем 20 нм. В других примерах применения среднее расстояние между смежными якорями находится в пределах от 2 нм до 20 нм. Фермент, способный связывать нуклеотиды, может включать полимеразу, миозин или киназу.

Аналог нуклеотида может включать пентозную группировку, имеющую 3'-углерод и группировку метки, которая может быть присоединена к данному нуклеотиду по 3'-углероду. В другом примере аналог нуклеотида может включать трифосфатную группировку, а группировка гасителя может быть присоединена к трифосфатной группировке.

В некоторых примерах применения деблокирующий агент может включать фермент фосфоэстеразу (например, фосфодиэстераза, фосфотриэстераза и т.д.). Фосфоэстераза может быть включена для селективного удаления фосфодиэфирной группировки или фосфотриэфирной группировки от временных соединений нуклеиновой кислоты. Фосфоэстераза может быть выбрана из группы, состоящей из эндонуклеазы IV и АР эндонуклеазы.

В качестве примера, временное соединение нуклеиновой кислоты может присутствовать в течение по меньшей мере 1 миллисекунды до того, как деблокирующий агент модифицирует временное соединение нуклеиновой кислоты с удалением группировки метки. В качестве другого примера, временное соединение нуклеиновой кислоты может присутствовать в течение не больше, чем 30 секунд до того, как деблокирующий агент модифицирует временное соединение нуклеиновой кислоты с удалением группировки метки.

В различных примерах применения несколько циклов реакции могут включать по меньшей мере 100 циклов реакции, при этом нуклеиновая кислота удлиняется посредством добавления по меньшей мере 100 аналогов нуклеотидов. В различных примерах применения фермент, способный связывать нуклеотиды, включает полимеразу, миозин или киназу.

В других примерах способ секвенирования множества полинуклеотидов включает: присоединение одной молекулы ДНК-матрицы к каждому из множества элементов для присоединения на контейнере для образца, где среднее расстояние между смежными элементами меньше, чем предел Аббе; применение химии стохастического фотопереключения ко всем молекулам одновременно для вызова флуоресценции присоединенных молекул в событиях включения и выключения вплоть до четырьмя разными цветами посредством стохастического фотопереключения; и визуализацию событий включения и выключения в цветовом канале для каждого цвета в реальном времени, по мере того, как события включения и выключения происходят в отношении присоединенных молекул. Из-за стохастической природы фотопереключения в разных примерах вероятность того, что событие включения для данного основания для данной молекулы будет происходить в то же самое время, что и событие включения для того же самого основания на молекуле, смежной с данной молекулой, составляет меньше, чем 0,5%. Концентрация реактивов для стохастического фотопереключения может быть выбрана таким образом, что вероятность того, событие включения для данного основания для данной молекулы будет происходить в то же самое время, что и событие включения для того же самого основания на смежной молекуле с данной молекулой составляет меньше, чем 0,5%. В других примерах можно использовать другие концентрации. Среднее расстояние между смежными элементами может составлять меньше, чем примерно 20 нм, или оно может находиться в пределах интервала от примерно 2 нм до примерно 20 нм. В некоторых примерах применения каждый из множества элементов для присоединения на контейнере для образца может находиться в пределах поля зрения визуализатора, используемого для визуализации событий включения и выключения, таким образом, что визуализация событий включения и выключения происходит в то же самое время для присоединенных молекул на множестве элементов для присоединения. Применение химии стохастического фотопереключения ко всем присоединенным молекулам одновременно может включать применение стохастической оптической реконструкционной микроскопии, накопления точек ДНК для визуализации в наноразмерной топографии или химии стохастического фотопереключения прямой стохастической оптической реконструкционной микроскопии ко всем молекулам одновременно.

Данный способ может дополнительно включать осуществление контроля скорости, с которой случаются события включения и выключения, для контроля вероятности того, что событие включения для данного основания для данной молекулы произойдет одновременно с событием включения для такого же основания на смежной молекуле относительно данной молекулы. В некоторых примерах применения осуществление контроля скорости, с которой случаются события включения и выключения, может включать корректировку концентраций нуклеотидов и фермента в химии стохастического фотопереключения. В других примерах применения осуществление контроля скорости, с которой случаются события включения и выключения, включает корректировку времени включения и выключения таким образом, что вероятность того, что событие включения для данного основания для данной молекулы произойдет одновременно с событием включения для такого же основания на смежной молекуле относительно данной молекулы ниже, чем определенная частота ошибок при секвенировании, в котором применяется данный способ.

В некоторых примерах применения данный способ может дополнительно включать определение того, больше ли интенсивность свечения выявленного события включения в цветовом канале, чем заданный порог. Данный способ также может включать определение того, больше ли размер пятна выявленного события включения в цветовом канале, чем заданный порог.

Система визуализации может включать контейнер для образца, содержащий множество элементов для присоединения, причем предусмотрено присоединение одной молекулы ДНК-матрицы к каждому из элементов для присоединения, и при этом среднее расстояние между смежными элементами для присоединения меньше, чем предел Аббе; и визуализатор, установленный для визуализации фотопереключения, происходящего на множестве элементов для присоединения, посредством фиксации событий включения и выключения во множестве цветовых каналов в то же самое время, когда происходят события включения и выключения для присоединенных молекул, когда химия стохастического фотопереключения применяется ко всем присоединенным молекулам одновременно, вызывая флуоресценцию присоединенных молекул при событиях включения и выключения вплоть до четырьмя разными цветами. Контейнер для образца может включать проточную ячейку, которая содержит множество элементов для присоединения во множестве мест для образца. В разных примерах среднее расстояние между смежными элементами составляет меньше, чем примерно 20 нм, или оно может находиться в пределах интервала от примерно 2 нм до примерно 20 нм. В разных примерах каждый из множества элементов для присоединения на контейнере для образца находится в пределах поля зрения визуализатора, используемого для визуализации фотопереключения таким образом, что фиксация событий включения и выключения происходит в то же самое время для присоединенных молекул на множестве элементов для присоединения. Химия стохастического фотопереключения, применяемая ко всем присоединенным молекулам одновременно, может включать стохастическую оптическую реконструкционную микроскопию, накопление точек ДНК для визуализации в наноразмерной топографии или химию стохастического фотопереключения прямой стохастической оптической реконструкционной микроскопии.

В системе визуализации может использоваться стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия, накопление точек ДНК для визуализации в наноразмерной топографии или прямое переключение, управляемое фотохимическими реакциями, когда химия стохастического фотопереключения применялась для того, чтобы вызывать флуоресценцию присоединенных молекул. Концентрация реактивов для стохастического фотопереключения является такой, что вероятность того, что событие включения для данного основания для данной молекулы произойдет одновременно с событием включения для такого же основания на молекуле, смежной с данной молекулой, составляет меньше, чем 0,5%.

Система визуализации может применяться таким образом, что скорость, с которой происходят события включения и выключения, дает меньшую вероятность того, что событие включения для данного основания для данной молекулы будет происходить одновременно с событием включения для такого же основания на смежной молекуле с данной молекулой, чем определенная частота ошибок при секвенировании, в котором применяется данный способ. Система визуализации может дополнительно определять, больше ли интенсивность свечения или размер пятна, выявленного события включения в цветовом канале, чем заданный порог.

Другие характеристики и аспекты раскрытой технологии станут очевидными из следующего подробного описания, взятого в сочетании с сопровождающими графическими материалами, которые иллюстрируют, в качестве примера, характеристики согласно применениям раскрытой технологии. Подразумевается то, что краткое изложение сущности изобретения не ограничивает объем любых изобретений, описанных в данном документе, которые определяются формулой изобретения и эквивалентами.

Следует понимать то, что все комбинации вышеизложенных идей (при условии, что такие идеи не являются взаимоисключающими) рассматриваются как часть предмета изобретения, раскрытого в данном документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Технология, раскрытая в данном документе согласно одному или более чем одному примеру, подробно описывается со ссылкой на следующие графические материалы. Данные Фиг. приводятся для облегчения понимания читателем раскрытой технологии и не предназначены для того, чтобы быть исчерпывающими или ограничивать раскрытие точными раскрытыми формами. В самом деле, графические материалы на Фиг. приводятся лишь с целями иллюстрации и просто показывают типичные или показательные примеры раскрытой технологии. Кроме того, следует отметить то, что для ясности и легкости иллюстрации элементы на Фиг. не обязательно изображены в масштабе.

На Фиг. 1 проиллюстрирована упрощенная блок-схема одного примера системы сканирования изображения, с которой можно применять системы и способы, раскрытые в данном документе.

На Фиг. 2 проиллюстрирован пример контейнера для образца, включающий множество точек для присоединения или якорей.

На Фиг. 3 проиллюстрирован пример бокового вида ряда контейнера, проиллюстрированного на Фиг. 2, в контексте конкретной химии стохастического фотопереключения.

На Фиг. 4 проиллюстрирован пример способа секвенирования сверхразрешения.

На Фиг. 5 проиллюстрирован пример компонентов реверсивной биохимии, которые могут использоваться в примерах секвенирования сверхразрешения, описанных в данном документе.

На Фиг. 6 проиллюстрирован пример химического процесса при включении нуклеотидов.

На Фиг. 7 проиллюстрирован пример способа сверхразрешающей визуализации с использованием вышеописанного химического процесса.

Следует понимать то, что раскрытая технология может воплощаться на практике с модификацией и изменением, и что раскрытая технология ограничивается только формулой изобретения и ее эквивалентами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В разных примерах, раскрытых в данном документе, предложено секвенирование сверхразрешения с использованием однореакторной гомогенной реакции, в которой стохастическое переключение флуорофоров сочетается с самой реакцией секвенирования, и визуализация происходит для многочисленных смежных молекул в реальном времени во время включения. В частности, в некоторых примерах применения предложен контейнер для образца со множеством лунок или элементов для присоединения, расположенных на расстоянии, которое меньше, чем расстояние, допускаемое в иных случаях для разрешения индивидуальных элементов в рамках предела Аббе. Одна молекула ДНК-матрицы присоединяется к каждому элементу для присоединения в контейнере для образца для секвенирования. Применяется химия секвенирования, которая обеспечивает стохастическое фотопереключение всех молекул в группе визуализируемых молекул. Визуализация реакций происходит в реальном времени для всех молекул в то же самое время, когда флуорофоры включаются и выключаются в пределах данной группы. Поскольку реакции являются стохастическими и несинхронизированными среди молекул, имеется статистическая вероятность того, что смежные молекулы не будут включать одинаковое основание одновременно.

В некоторых применениях секвенирование происходит посредством полимеразы, включающей правильный нуклеотид, и во время события включения флуорофор включается на короткое время и вновь выключается. Визуализация происходит в реальном времени во время события включения. Одновременно события включения происходят на многих элементах для присоединения в контейнере для образца. Поскольку переключение на данных разных молекулах является стохастическим и несинхронизированным между молекулами, они все могут быть визуализированы в то же самое время, когда происходят реакции таким образом, что не требуется последовательный и более времязатратный способ.

Перед подробным описанием разных способов сверхразрешения полезно описать типичное окружение с которым можно осуществлять такие способы. Одним таким типичным окружением является окружение системы сканирования изображения, такое как окружение, проиллюстрированное на Фиг. 1. Типичная система сканирования изображения может включать устройство для получения или производства изображения области. На примере, описанном на Фиг. 1, показана типичная конфигурация визуализации на основе конструкции с задней подсветкой.

Как можно видеть в примере Фиг. 1, подвергаемые воздействию образцы располагаются на контейнере для образца 110, который расположен на столе для образца 170 под линзой объектива 142. Источник света 160 и ассоциированное оптическое устройство направляют пучок света, такого как лазерный свет, в выбранное место образца на контейнере для образца 110. Образец флуоресцирует, и образующийся свет собирается линзой объектива 142 и направляется к системе фотовыявляющей камеры 140 для выявления флуоресценции. Стол для образца 170 перемещается относительно линзы объектива 142 для устанавливания положения следующего образца на контейнере для образца 110 в фокусной точке линзы объектива 142. Перемещение контейнера для образца 110 относительно линзы объектива 142 может достигаться посредством перемещения самого стола для образца, линзы объектива, всего оптического стола или любой комбинации вышеизложенных. Другие примеры также могут включать перемещение всей системы визуализации над неподвижным образцом.

Модуль доставки жидкости или устройство 100 направляет поток реактивов (например, флуоресцентных нуклеотидов, буферов, ферментов, расщепляющих реактивов и т.д.) в (и через) контейнер для образца 110 и клапан для отходов 120. В некоторых применениях контейнер для образца 110 может применяться в виде проточной ячейки, которая включает кластеры последовательностей нуклеиновой кислоты во множестве мест для образца на контейнере для образца 110. Образцы, подлежащие секвенированию, могут быть присоединены к субстрату проточной ячейки, наряду с другими возможными компонентами.

Данная система также содержит привод температурной станции 130 и нагреватель/охладитель 135, который возможно может регулировать температурные условия жидкостей в пределах контейнера для образца 110. Система камеры 140 может быть включена для фиксации и отслеживания секвенирования контейнера для образца 110. Система камеры 140 может применяться, например, в качестве CCD (детектор с зарядовой связью) камеры, которая может взаимодействовать с разными фильтрами в пределах узла переключения фильтров 145, линзы объектива 142 и фокусирующего лазера 150. Система камеры 140 не ограничивается CCD камерой и другими камерами, и могут использоваться другие камеры и технологии сенсоров изображений.

Источник света 160 (например, возбуждающий лазер в пределах узла, возможно содержащего многие лазеры) или другой источник света может быть включен для освещения флуоресцентных реакций секвенирования в пределах образцов посредством освещения через оптоволоконный интерфейс 161 (который возможно может содержать одну или более чем одну линзу повторной визуализации, оптоволоконные принадлежности и т.д.). В показанном примере также представлены маломощная лампа 165, фокусировочный лазер 150, фокусировочный детектор 141 и обратный светоделитель 185. Фокусировочный лазер 150 может использоваться вместе с фокусировочным детектором 141 для автофокусировки системы, т.е. посредством корректировки расстояния между объективом 142 и образцом 110, или с использованием других методик фокусировки, как известно в данной области. В некоторых примерах применения фокусировочный лазер 150 может выключаться во время визуализации. В других примерах применения альтернативная конфигурация фокусировки может включать вторую фокусирующую камеру (не показана), которая может представлять собой квадрантный детектор, детектор положения (PSD) или аналогичный детектор для измерения положения рассеянного пучка, отраженного от поверхности, сопутствующе со сбором данных.

Несмотря на то, что проиллюстрировано устройство с задней подсветкой, другие примеры могут включать свет от лазера или другого источника света (не показанного), который направляется через линзу объектива 142 на образцы на контейнере для образца 110. Контейнер для образца 110 может быть в конечном счете смонтирован на столе для образца 170 с обеспечением перемещения и выравнивания контейнера для образца 110 относительно линзы объектива 142. Стол для образца может иметь один или более чем один привод для обеспечения его перемещения в любом из трех направлений. Например, в показателях декартовой системы координат могут быть предоставлены приводы для обеспечения перемещения стола в направлениях X, Y и Z относительно линзы объектива. Это может обеспечивать то, что одно или более чем одно положение образца на контейнере для образца 110 помещается при оптическом выравнивании с линзой объектива 142.

В данном примере фокусировочный (Z-ось) компонент 175 показан как включенный в контроль позиционирования оптических компонентов относительно контейнера для образца 110 в направлении фокуса (типично именуемого ось z или z направление). Фокусировочный компонент 175 может включать один или более чем один привод, физически связанный с оптическим столом или столом для образца, или с обеими, для перемещения контейнера для образца 110 на столе для образце 170 относительно оптических компонентов (например, линзы объектива 142) для обеспечения правильной фокусировки для операции визуализации. Например, привод может быть физически связан с соответствующим столом, как, например, посредством механического, магнитного, жидкостного или другого присоединения, или прямого или опосредованного контакта со столом. Один или более чем один привод может быть сконфигурирован для перемещения стола в z направлении, при поддержании стола для образца в той же самой плоскости (например, поддержание уровня или горизонтального положения, перпендикулярного оптической оси). Один или более чем один привод также может быть сконфигурирован для наклона стола. Это может осуществляться, например, таким образом, что контейнер для образца 110 может динамически выравниваться для принятия во внимание любого наклона его поверхностей.

Фокусировкой системы обычно может называться выравнивание фокусной плоскости линзы объектива с образцом, подлежащим визуализации, в выбранном месте образца. Однако фокусировка также может относиться к корректировкам системы для получения желательной характеристики для представления образца, как, например, с желательным уровнем резкости или контраста в отношении изображения анализируемого образца. Поскольку применимая глубина поля фокусной плоскости линзы объектива может быть очень маленькой (иногда порядка 1 мкм или меньше), фокусировочный компонент 175 близко следует визуализируемой поверхности. Поскольку контейнер для образца не является идеально плоским, когда он устанавливается в приборе, фокусировочный компонент 175 может быть установлен для следования данному профилю по мере перемещения вдоль направления сканирования (типично именуемого в данном документе ось у).

Свет, исходящий от анализируемого образца в визуализируемом месте образца, может быть направлен на один или более чем один детектор, включающий, например, систему камеры 140. Детекторы могут включать, например, CCD камеру. Апертура может быть включена и расположена для обеспечения прохождения к детектору только света, исходящего от фокусной области. Апертура может быть включена для улучшения качества изображения посредством отфильтровывания компонентов света, которые исходят от областей, которые находятся вне фокусной области. Эмиссионные фильтры могут быть включены в узел переключения фильтров 145, который может быть выбран для записи определенных длин волн испускания и для отсечения любого отклонившегося света лазера.

В разных примерах контейнер для образца 110 может включать один или более чем один субстрат, на котором предоставляются образцы. Например, в случае системы для анализа большого числа разных последовательностей нуклеиновой кислоты контейнер для образца 110 может включать один или более чем один субстрат, на котором нуклеиновые кислоты, подлежащие секвенированию, связываются, к которому присоединяются или с которым ассоциируют.В разных примерах данный субстрат может включать любой инертный субстрат или матрицу, к которой могут быть присоединены нуклеиновые кислоты, как, например, стеклянные поверхности, пластмассовые поверхности, латекс, декстран, полистирольные поверхности, полипропиленовые поверхности, полиакриламидные гели, золотые поверхности и кремниевые пластины. В некоторых примерах применения данный субстрат находиться в пределах канала или другой области во множестве мест, образованных в матрице или массиве по контейнеру для образца 110.

Может быть предоставлен один или более чем один контроллер (не проиллюстрирован) для контроля работы системы сканирования, такой как типичная система сканирования, описанная выше со ссылкой на Фиг. 1. Данный контроллер может применяться для контроля таких аспектов работы системы, как, например, фокусировка, перемещение стола и операции визуализации. В различных применениях контроллер может применяться с использованием аппаратных средств, программы или комбинации вышеупомянутых. Например, в некоторых применениях контроллер может включать один или более чем один CPU (процессор вычислительной машины) или процессоры с ассоциированной памятью. В качестве другого примера, контроллер может включать аппаратные средства или другую схемотехнику для упавления операцией. Например, данная схемотехника может включать одно или более чем одно из следующего: логическая матрица, программируемая пользователем (FPGA), специализированная интегральная микросхема (ASIC), программируемое логическое устройство (PLD), сложное программируемое логическое устройство (CPLD), программируемая логическая матрица интегральной схемы (PLA), программируемые матричные логические схемы (PAL) или другие аналогичные устройство обработки или схемотехника. В качестве еще одного другого примера контроллер может включать комбинацию данной схемотехники с одним или более чем одним процессором.

Технологии секвенирования, которые можно использовать с такими системами, как описанные со ссылкой на Фиг. 1, включают технологии секвенирования следующего поколения (NGS). Секвенирование посредством синтеза (SBS) представляет собой широко применяемую технологию NGS, в которой используются модифицированные дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфаты), содержащие терминатор, который блокирует дальнейшую полимеризацию. Реакция секвенирования может проводиться одновременно на большом числе матричных молекул. При SBS флуоресцентно меченый обратимый терминатор визуализируется по мере того, как добавляется каждый дНТФ, и затем отщепляется для обеспечения включения следующего основания. Поскольку во время каждого цикла секвенирования присутствуют все 4 дНТФ, связанных с обратимым терминатором, естественная конкуренция минимизирует систематическую ошибку при включении. Это приводит к секвенированию основания за основанием, которое обеспечивает точные данные для широкого спектраприменений.

При NGS ДНК-полимераза катализирует включение флуоресцентно меченых дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ) в нить ДНК-матрицы во время последовательных циклов синтеза ДНК. Во время каждого цикла в момент включения нуклеотиды идентифицируются посредством возбуждения флуорофора. Одним отличием является то, что, вместо секвенирования одного фрагмента ДНК, NGS продолжает этот процесс среди миллионов фрагментов массово параллельным способом.

Один подход NGS включает четыре основные стадии: получение библиотеки, генерацию кластеров, секвенирование и анализ данных. При получении библиотеки библиотеку для секвенирования получают случайной фрагментацией образца ДНК или кДНК, с последующим 5' и 3' лигированием адаптера. В качестве альтернативы, реакции фрагментации и лигирования объединяются в одном этапе, что значительно увеличивает эффективность способа получения библиотеки. Лигированные с адаптером фрагменты затем подвергаются ПЦР(полимеразная цепная реакция)-амплификации и очищаются на геле.

Для генерации кластеров библиотека загружается в проточную ячейку, где фрагменты захватываются на лужайке связанных с поверхностью олигонуклеотидов, комплементарных адаптерам библиотеки. Каждый фрагмент затем амплифицируется в отличные клональные кластеры посредством мостиковой амплификации. При завершении генерации кластеров матрицы готовы для секвенирования. В одном подходе SBS используется способ на основе обратимого терминатора, в котором выявляются одиночные основания, по мере их включения в нити ДНК-матрицы. Поскольку все четыре дНТФ, связанных с обратимым терминатором, присутствуют во время каждого цикла секвенирования, естественная конкуренция минимизирует систематическую ошибку включения и уменьшает частоту грубых ошибок по сравнению с другими технологиями. Во время анализа данных и выравнивания вновь идентифицированные считываемые фрагменты последовательности выравниваются относительно эталонного генома. После выравнивания возможны многие вариации анализа, как, например, идентификация однонуклеотидного полиморфизма (SNP) или вставки-делеции (indel), подсчет считываемых фрагментов для способов в отношении РНК, филогенетический или метагеномный анализ и другие.

В системах визуализации важной является скорость, с которой могут происходить операции сканирования. Рассмотрите, например, системы секвенирования. В таких системах часто желательно увеличивать скорость, с которой могут считываться молекулы образца. Одним способом увеличения производительности систем визуализации является уменьшение размера и расстояния между визуализируемыми структурами. В системах секвенирования это может осуществляться посредством более плотной друг к другу упаковки молекул-матрицы для увеличения числа считываемых фрагментов, которые можно получать для данной единицы площади. Однако разрешение системы визуализации ограничивается длиной волны света, апертурой оптики и другими факторами.

В 1873 г. немецкий физик по имени Эрнест Аббе опубликовал формулу, определяющую предел разрешения микроскопа. Предел Аббе определяется как:

где λ представляет собой длину волны волн света, освещающего образец, или длину волны полосы возбуждения при флуоресценции. NA представляет собой числовую апертуру линзы объектива, которая определяется показателем преломления передающей среды, n, умноженным на синус угла апертуры (sin(α)), где α равен половине угла максимального конуса света, который может войти или выйти из линзы. Соответственно, NA может быть изложен как NA=n⋅sin(α), и предел Аббе может быть переписан как:

Этот предел разрешения, часто именуемый дифракционным барьером, определяет способность оптического прибора различать два объекта, разделенных боковым расстоянием, меньшим, чем приблизительно половина длины волны света, используемого для визуализации образца. В 2014 г. Нобелевская премия по химии была присуждена за обход данного научного ограничения. В самом деле, предел Аббе теперь был преодолен целым рядом методик. Они включают: стохастическую оптическую реконструкционную микроскопию (STORM), микроскопию снижения индуцированной эмиссии (STED), микроскопию локализованной фотоактивации (PALM) и микроскопию структурированного освещения (SIM). Все эти методы обеспечивают достижение разрешений значительно меньше, чем 200 нм - вплоть до порядка 20 нм для STORM, STED и PALM, и примерно 100 нм для SIM.

STORM, например, основывается на стохастическом переключении одномолекулярной флуоресценции таким образом, что только маленькая доля флуорофоров стохастически активируется в любое данное время. Активированные флуорофоры достаточно разделены таким образом, что они могут разрешаться в пределах предела Аббе. Это обеспечивает определение их положений с достаточной точностью. Однако часто она включает повторение процесса и снимок многочисленных изображений (мгновенный снимок), каждый из которых фиксирует случайный набор флуорофоров таким образом, что может быть реконструировано конечное изображение. Конечное изображение генерируется накоплением многочисленных изображений. Соответственно, активации физически разделяются таким образом, что их можно оптически разрешить.

Хотя системы и способы и могут описываться в данном документе время от времени в контексте данной типичной системы Фиг. 1, это лишь один пример, с которым данные системы и способы могут осуществляться. Системы и способы, описанные в данном документе, могут осуществляться с использованием данного и других сканеров, микроскопов и других систем визуализации.

Контейнер для образца для системы визуализации может быть построен в виде массива элементов для присоединения одиночных молекул. Типичный контейнер для одномолекулярного стохастического секвенирования проиллюстрирован на Фиг. 2. Такой контейнер со многими рядами элементов для присоединения 212 может обеспечивать параллельное индивидуальное секвенирование нескольких молекул ДНК. Однако минимальное расстояние - d -элементов для присоединения 212 в разных случаях применения может ограничиваться оптическим разрешением системы. В некоторых примерах применения элементы для присоединения 212 могут включать волноводы с нулевой модой, которые представляют собой оптические наноструктуры, которые служат для ограничения наблюдаемого объема, увеличивая, посредством этого, концентрации для одномолекулярной микроскопии.

На Фиг. 3 проиллюстрирован пример бокового вида ряда контейнера, проиллюстрированного на Фиг. 2. На Фиг. 4 проиллюстрирован типичный процесс секвенирования. При операции 410 контейнер для образца изготавливается и обеспечивается элементами для присоединения или якорями (например, элементы присоединения 212). Предоставляются элементы для присоединения, имеющие шаг d. В некоторых применениях шаг d может быть одинаковым в обоих направлениях, тогда как в других применениях он может варьировать. Например, шаг d в некоторых применениях может составлять меньше, чем примерно 20 нм. В качестве другого примера, в некоторых применениях шаг может варьировать в измерении от примерно 2 нм до примерно 20 нм. В некоторых применениях шаг может быть больше или меньше, чем данный интервал измерений. В других примерах шаг может быть уменьшен до наименьшего возможного измерения без того, что индивидуальные молекулы подвергались влиянию физических взаимодействий между ними, таких как, например, взаимодействия заряд-заряд между молекулами.

В данном примере для секвенирования используется однореакторная химия в реальном времени. Предоставляются индивидуальные молекулы ДНК-матрицы 310. Они могут заякориваться на элементах для присоединения 212 (например, одна на элемент для присоединения 212), как показано на Фиг. 3 в 302. Соответственно, при операции 412 одна молекула ДНК-матрицы 310 присоединяется к каждому элементу для присоединения. В одном примере для обеспечения того, что на упорядоченную точку для присоединения 212 существует только одна молекула, данные точки для присоединения могут быть изготовлены в очень маленьком масштабе, приближающемся к молекулярному масштабу (больше порядка 20 нм). Данным способом, посредством стерического препятствия это может помогать обеспечению того, что только одна молекула ДНК присоединяется в каждом месте. Секвенирование одиночных молекул может обеспечивать высокую плотность кластеров, так как данные кластеры могут иметь наименьший возможный размер. Это позволяет устранять эффект размера кластеров в качестве фактора, определяющего минимальный шаг. Также с одномолекулярным секвенированием существует малый риск или отсутствует риск «скачков на площадке», при которых кластер растет через промежуточное пространство и создает дупликацию соседей. Эти скачки являются следствием процесса амплификации и обычно не будут происходить при отсутствие амплификации. Также, поскольку нет амплификации, это также может сохранять не только время, но и снижать затраты на требующиеся реактивы. Посредством проведения одномолекулярного секвенирования тогда возможно учитывать ошибки фазирования в каждой молекуле во время секвенирования.

При операциях 414 и 416 присоединяется праймер для секвенирования и добавляются реактивы одного сосуда. Это показано на Фиг. 3 в 304. Данные реактивы 314 могут включать набор четырех нуклеотидов, которые имеют 5'-дифосфатную гасящую молекулу и 3'-фосфатный блок, с группировкой метки (например, молекула красителя).

Термин «нуклеиновая кислота» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к по меньшей мере двум мономерам аналогов нуклеотидов, связанных друг с другом. Нуклеиновая кислота может содержать фосфодиэфирные связи, однако, в некоторых применениях нуклеиновая кислота может представлять собой аналог, имеющий другие типы остовов, содержащий, например, фосфорамид, фосфоротиоат, фосфородитиоат, остовы и связи пептидной нуклеиновой кислоты, положительно заряженные остовы или неионные остовы. Нуклеиновая кислота может включать пентозную группировку, такую как рибоза (присутствует во встречающейся в природе РНК), дезоксирибозу (присутствует во встречающейся в природе ДНК) или дидезоксирибозу. В некоторых применениях нуклеиновая кислота может иметь непентозную группировку или карбоциклический сахар вместо рибозной или дезоксирибозной группировки. Нуклеиновая кислота может иметь одну или более чем одну отличную группировку основания, включающую аденин (А), гуанин (G), тимин (Т), урацил (U), цитозин (С), инозин, ксантанин, гипоксантин, изоцитозин, изогуанин, нитропиррол (включая 3-нитропиррол) и/или нитроиндол (включая 5-нитроиндол), но не ограничивающуюся ими. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, как определено, или содержать части и двухцепочечной, и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК (например, геномную ДНК или кДНК), РНК или гибрид.

Подразумевается то, что термин «аналог нуклеотида» в том виде, в котором он используется в данном документе, включает природные нуклеотиды, неприродные нуклеотиды, рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, дидезоксирибонуклеотиды и другие молекулы, известные как нуклеотиды. Данный термин может использоваться для названия мономерного звена, которое присутствует в полимере, например, для идентификации субъединицы, присутствующей в нити ДНК или РНК. Данный термин также может использоваться для названия мономерной молекулы, которая не обязательно присутствует в полимере, например, молекулы, которая способна включаться в полинуклеотид полимеразой способом, зависимым от матрицы. Данный термин может относиться к нуклеозидному звену, имеющему, например, 0, 1, 2, 3, 4, 5 или больше фосфатов на 5'-углероде. Аналог нуклеотида может иметь группировку основания, включающую аденин (А), гуанин (G), тимин (Т), урацил (U), цитозин (С), инозин, ксантанин, гипоксантанин, изоцитозин, изогуанин, нитропиррол (включая 3-нитропиррол) и/или нитроиндол (включая 5-нитроиндол), но не ограничивающуюся ими. Типичные природные нуклеотиды включают, без ограничения, АТФ, УТФ, ЦТФ, ГТФ, АДФ, УДФ, ЦДФ, ГДФ, АМФ, УМФ, ЦМФ, ГМФ, дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ, дАДФ, дТДФ, дЦДФ, дГДФ, дАМФ, дТМФ, дЦМФ и дГМФ.

Неприродные нуклеотиды включают нуклеотиды, которые не присутствуют в природной биологической системе. Неприродный нуклеотид может не иметь способности к дальнейшему удлинению после включения в полинуклеотид. Примеры включают аналоги нуклеотидов, имеющие обратимую или необратимую блокирующую группировку. Природный или неприродный нуклеотид может иметь способность к дальнейшему удлинению после включения в полинуклеотид. Примеры включают аналоги нуклеотидов, имеющие 3'-гидроксил. В некоторых применениях аналог(ги) нуклеотида(дов) не будет(дут) включать обратимую блокирующую группировку, или аналог(ги) нуклеотида(дов) не будет(дут) включать необратимую блокирующую группировку, или аналог(ги) нуклеотида(дов) вообще не будет(дут) включать какую-либо блокирующую группировку.

Термин «блокирующая группировка» в том виде, в котором он используется в данном документе, при применении в связи с аналогом нуклеотида, означает часть аналога нуклеотида, которая ингибирует или предотвращает образование аналогом нуклеотида ковалентной связи со вторым аналогом нуклеотида. Например, в случае аналогов нуклеотидов, имеющих пентозную группировку, блокирующая группировка может предотвращать образование фосфодиэфирой связи между 3'-кислородом нуклеотида и 5'-фосфатом второго нуклеотида. Блокирующая группировка может быть частью нуклеотида, который представляет собой мономерное звено, присутствующее в полимере нуклеиновой кислоты, или блокирующая группировка может быть частью свободного аналога нуклеотида (например, нуклеотидтрифосфата). Блокирующая группировка, которая является частью аналога нуклеотида, может быть обратимой таким образом, что данную блокирующую группировку можно модифицировать, чтобы сделать аналог нуклеотида способным к образованию ковалентной связи со вторым аналогом нуклеотида. Особенно полезными обратимыми блокирующими группировками являются фосфаты, фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, фосфоротиоатные сложные эфиры и сложные эфиры углерода. Другие примеры обратимых блокирующих группировок, которые можно использовать, излагаются ниже и в ссылках, включенных в данный документ посредством ссылки, как изложено ниже. В конкретных примерах применения блокирующая группировка, такая как обратимая блокирующая группировка, может быть присоединена в 3' положении или 2' положении пентозной группировки аналога нуклеотида.

Термин «группировка метки» в том виде, в котором он используется в данном документе, при применении в отношении аналога нуклеотида, означает часть аналога нуклеотида, которая дает отличимую характеристику, которая в противном случае не проявляется у аналога нуклеотида. Отличимой характеристикой может быть, например, оптический сигнал, такой как поглощение излучения, испускание флуоресценции, испускание люминисценции, время жизни флуоресценции, поляризация флуоресценции или тому подобное; аффинность связывания в отношении лиганда или рецептора; магнитные свойства; электрические свойства; заряд; масса; радиоактивность или тому подобное. Типичные группировки метки включают, без ограничения, флуорофор, люминофор, хромофор, радиоактивный изотоп, массовую метку, заряженную метку, спиновую метку, рецептор, лиганд или тому подобное. Группировка метки может быть частью нуклеотида, который является мономерным звеном, присутствующим в полимере нуклеиновой кислоты, или группировка метки может быть частью свободного аналога нуклеотида (например, нуклеотидтрифосфата).

Термин «группировка - модификатор метки» в том виде, в котором он используется в данном документе, при применении в отношении аналога нуклеотида, имеющего группировку метки, означает часть аналога нуклеотида, которая изменяет отличимую характеристику группировки метки. Типично заряд в отличимой характеристике проявляется в присутствии группировки - модификатора метки, но не в отсутствие группировки - модификатора метки. Например, группировка - модификатор метки может представлять собой гаситель, который уменьшает испускание флуоресценции или люминисценции от метки. В другом примере группировка - модификатор метки может быть донором или акцептором Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET), который изменяет интенсивность или длину волны испускания флуоресценции или люминисценции, выявленного от метки. Группировка - модификатор метки может быть частью нуклеотида, который является мономерным звеном, присутствующим в полимере нуклеиновой кислоты, или группировка - модификатор метки может быть частью мономерного аналога нуклеотида (например, нуклеотидтрифосфата).

Термин «деблокирующий агент» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает катализатор, фермент, реактив или другое вещество, которое способно модифицировать или удалять блокирующую группировку. В конкретных применениях деблокирующий агент может иметь специфичность в отношении блокирующей группировки, которая является частью нуклеотида, который представляет собой мономерное звено, присутствующее в полимере нуклеиновой кислоты. Деблокирующий агент, как таковой, может селективно удалять блокирующую группировку от аналога нуклеотида, который присутствует в нуклеиновой кислоте, по сравнению с блокирующей группировкой, которая является частью мономерного аналога нуклеотида (например, нуклеотидтрифосфата). Альтернативно или дополнительно, деблокирующий агент может селективно удалять блокирующую группировку от аналога нуклеотида, который присутствует в двухцепочечной нуклеиновой кислоте, по сравнению с блокирующей группировкой, которая является частью мономерного аналога нуклеотида (например, нуклеотидтрифосфата) или частью аналога нуклеотида, который является мономером в одноцепочечной нуклеиновой кислоте. Соответственно, в некоторых применениях деблокирующий агент может иметь малую способность или не иметь способности удалять блокирующую группировку от мономерного аналога нуклеотида (например, нуклеотидтрифосфата) или от аналога нуклеотида, который является мономером в одноцепочечной нуклеиновой кислоте. Типичные деблокирующие агенты включают фермент, такой как фосфоэстераза, фосфодиэстераза, фосфотриэстераза, эстераза, алкилтрансфераза или метилтрансфераза; или химический реактив, но не ограничиваются ими.

Подразумевается то, что ссылка на «селективное» манипулирование (например, на «селективное» удаление) первой вещью по сравнению со второй вещью в том виде, в котором она используется в данном документе, означает то, что данное манипулирование имеет большее влияние на первую вещь по сравнению с влиянием на вторую вещь. Данная манипуляция не обязательно имеет влияние на вторую вещь. Данная манипуляция может иметь влияние на первую вещь, которое по меньшей мере на 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% или 99% больше, чем влияние на вторую вещь. Данная манипуляция может иметь влияние на первую вещь, которое по меньшей мере в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 100 раз, 1×103 раз, 1×104 раз или 1×106 раз больше, чем влияние на вторую вещь. Данная манипуляция может включать, например, модифицирование, приведение в контакт, осуществление обработки, изменения, расщепления (например, химической связи), фотохимического расщепления (например, химической связи), образования (например, химической связи), фотохимического образования (например, химической связи), ковалентное модифицирование, нековалентное модифицирование, осуществление разрушения, фотоабляции, удаления, синтеза, полимеризации, фотополимеризации, амплификации (например, нуклеиновой кислоты), копирования (например, нуклеиновой кислоты), удлинения (например, нуклеиновой кислоты), лигирования (например, нуклеиновой кислоты) или другую манипуляцию, изложенную в данном документе или иным образом известную в данной области. Термин «временный» в том виде, в котором он используется в данном документе, при применении по отношению к соединению в реакции или цикле реакций, означает то, что данное соединение лишь временно присутствует по ходу реакции или цикла реакций. Временное соединение может присутствовать, например, в течение периода времени, который не больше, чем примерно 10 минут, 1 минута, 30 секунд, 10 секунд, 1 секунда, 100 миллисекунд, 10 миллисекунд, 1 миллисекунда, 100 наносекунд, 10 наносекунд или 1 наносекунда. В конкретных применениях временное соединение присутствует в течение короткого периода времени, который является достаточным для обеспечения выявления временного соединения. Например, дополнительно или альтернативно к типичным максимальным периодам времени, изложенным выше, временное соединение может присутствовать в течение по меньшей мере 1 минуты, 30 секунд, 10 секунд, 1 секунды, 100 миллисекунд, 10 миллисекунд, 1 миллисекунды, 100 наносекунд, 10 наносекунд, 1 наносекунды или 1 пикосекунды.

Термин «цикл реакций» в том виде, в котором он используется в данном документе, при применении по отношению к реактиву и продукту, означает последовательность двух или более чем двух реакций, которые превращают реагент до по меньшей мере одного временного соединения и затем превращают по меньшей мере одно временное соединение до продукта. Цикл реакций может повторяться, например, таким образом, что продукт служит в качестве реагента в той же самой последовательности реакций. Например, праймер нуклеиновой кислоты может достраиваться на один нуклеотид в первом цикле реакции с получением продукта достройки праймера (имеющего один нуклеотид, добавленный к исходному праймеру), и затем данный продукт достройки праймера может быть опять достроен во втором цикле реакций с получением продукта достройки праймера (имеющего два нуклеотида, добавленных к исходному праймеру). При повторении цикла могут использоваться слегка отличные реактивы, например, в последовательных циклах достройки праймера могут добавляться разные аналоги нуклеотидов. Однако цикл реакций не обязательно повторяется. Цикл реакций нуклеиновой кислоты, например, приводит к добавлению одного нуклеотида к праймеру (например, в реакции, катализируемой полимеразой) или к добавлению одного олигонуклеотида к праймеру (например, в реакции, катализируемой лигазой).

Метки, которые выявляются оптически, являются особенно полезными. Примеры включают хромофоры, люминофоры и флуорофоры. Флуорофоры являются особенно полезными и включают, например, флуоресцентные нанокристаллы; квантовые точки, флуоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метилкумарины, пирен, мелацитовый зеленый, Су3, Су5, стильбен, люцифер желтый, каскадный синий, техасский красный, красители Alexa, красители SETA, красители Atto, фикоэритрин, бодипай и их аналоги. Полезные оптические зонды описываются в Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, Oreg.) 6th Edition; The Synthegen catalog (Houston, Tex.), Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Ed., Plenum Press New York (1999) или WO 98/59066; WO 91/06678 или публ. заявки на патент США №2010/0092957 А1, каждая из которых включается в данный документ посредством ссылки. Оптические метки дают преимущество быстрого, относительно неинвазивного выявления, обеспечивающего, посредством этого, мониторинг циклической реакции в реальном времени.

В разных применениях способов и композиций, изложенных в данном документе, можно использовать другие метки, некоторые из которых представляют собой неоптические метки. Примеры включают, без ограничения, изотопную метку, такую как не часто встречающийся в природе радиоактивный или тяжелый изотоп; магнитное вещество; электронбогатое вещество, такое как металл; электрохемилюминисцентную метку, такую как Ru(bpy)32+; или группировку, которая может быть выявлена на основе ядерной магнитной, парамагнитной, электрической характеристики, отношения заряда к массе или тепловой характеристики. Метки также могут включать магнитные частицы или оптически закодированные наночастицы. Такие метки могут быть выявлены с использованием подходящих способов, известных специалистам в данной области. Например, заряженная метка может быть выявлена с использованием электрического детектора, такого как детекторы, используемые в имеющихся в продаже системах секвенирования от Ion Torrent (Guilford, Conn., подразделение Life Technologies) или системах выявления, описанных в публ. заявок на патенты США №2009/0026082 А1; 2009/0127589 А1; 2010/0137143 А1 и 2010/0282617 А1, каждая из которых включается в данный документ посредством ссылки. Будет понятно то, что для некоторых применений аналог нуклеотида не обязательно должен иметь метку.

Другой тип метки, которая может быть полезной, представляет собой вторичную метку, которая выявляется опосредованно, например, через взаимодействие с первичной меткой, связывающейся с рецептором, или превращение до выявляемого продукта ферментативным катализатором или другим веществом. Типичная вторичная метка представляет собой лиганд, такой как биотин или его аналоги, который может быть выявлен через связывание с рецептором, таким как авидин, стрептавидин или его аналоги. Другие полезные лиганды представляют собой эпитопы, которые могут связываться с рецепторами, такими как антитела или их активные фрагменты, и углеводы, которые могут связываться с рецепторами, такими как лектины. Рецепторы могут быть меченными, например, оптической меткой, для обеспечения их выявления. В конкретных применениях лиганд может быть присоединен к аналогу нуклеотида способом, который уменьшает или предотвращает аффинность к рецептору. Высвобождение лиганда может затем выявляться на основе аффинности данного лиганда в отношении соответствующего ему рецептора, при отсоединении от аналога нуклеотида. Лиганд может дополнительно присоединяться к блокирующей группировке или может сам функционировать в качестве блокирующей группировки, как изложено выше в более общих понятиях для группировок меток. Таким образом, удаление лиганда от аналога нуклеотида может функционировать для деблокирования аналога нуклеотида и предоставления выявляемого события.

Другой типичной вторичной меткой является пирофосфат или его аналоги. Пирофосфат может быть выявлен твердофазными хелаторами и/или электронными биосенсорами. В некоторых применениях пирофосфат может быть выявлен каскадом ферментов, которые превращают пирофосфат до АТФ и затем до хемилюминисценции. Типичные каскады ферментов включают каскады, типично используемые в пиросеквенировании и/или описанные в публ. заявки на патент США №2005/0244870 А1, которая включается в данный документ посредством ссылки. В некоторых примерах применения для применения системы выявления на основе каскада ферментов, который продуцирует АТФ, может потребоваться применение аналога нуклеотида аденина, такого как АТФγS, который включается в праймер полимеразой, но не вызывает фонового сигнала, который конкурирует с пирофосфатным сигналом. В конкретных применениях пирофофат или его аналог может присоединяться к аналогу нуклеотида в положении, отличном от 5'-положения, где находится трифосфат. Данный аналог нуклеотида может давать два сигнала, индуцированных пирофосфатом, в подходящей системе выявления: один, обусловленный высвобождением пирофосфата из 5'-положения (из-за полимеразной активности), и второй, обусловленный высвобождением из другого положения, например, посредством деблокирующего агента. Производство двух сигналов, индуцированных пирофосфатом, может давать преимущество повышенного отношения сигнала к шуму на этапе выявления или повышенную точность при оценке данных секвенирования. Особенно полезный аналог пирофосфата, при присутствии на аналоге нуклеотида, будет иметь нейтральный заряд на одной или более чем одной группировке кислорода, которая типично отрицательно заряжена в пирофосфате. В одном примере аналог пирофосфата может не иметь заряженных атомов кислорода. Нейтральность заряда может благоприятствовать взаимодействиям с некоторыми видами полимераз. Аналог пирофосфата сразу после высвобождения может превращаться в форму для взаимодействия с ферментами в каскаде выявления, если это является подходящим или желательным с иной точки зрения.

Меченая группировка, которая используется в способе или композиции, изложенных в данном документе, может представлять собой внутреннюю метку (например, эндогенную метку), которая присутствует в выявляемой молекуле, встречающейся в природе, такую как протон или пирофосфат, который высвобождается из нуклеотидного аналога при включении в удлиненный праймер. Высвобождение пирофосфата можно выявлять с использованием пиросеквенирования или аналогичной методики, примеры которых коммерчески доступны от 454 Life Sciences (Branford, Conn., a Roche Company) или описаны в публ. заявки на патент США №2005/0244870 А1, которая включается в данный документ посредством ссылки. Типичные системы для выявления достройки праймера на основе высвобождения протонов включают системы, которые имеются в продаже у Ion Torrent (Guilford, Conn., подразделение Life Technologies) или описываются в публ. заявок на патенты США №2009/0026082 А1; 2009/0127589 А1; 2010/0137143 А1 и 2010/0282617 А1, каждая из которых включается в данный документ посредством ссылки. Альтернативно или дополнительно выявлению внутренней метки, можно выявлять метку, которая является экзогенной по отношению к аналогу природного нуклеотида. Таким образом, в некоторых применениях выявляются исключительно экзогенные зонды таким образом, что эндогенные зонды не выявляются, в других применениях выявляются исключительно эндогенные зонды таким образом, что экзогенные зонды не выявляются, и в некоторых примерах применения выявляется комбинация экзогенных и эндогенных зондов.

В некоторых примерах применения группировка метки, которая выявляется при используемых условиях, не является необходимой или не является желательной. Таким образом, аналог нуклеотида, который присутствует в реакционной смеси или используется в реакции, изложенной в данном документе, может не иметь конкретной выявляемой группировки метки при нахождении в мономерной форме и при включении в достроенный праймер. Аналог нуклеотида, тем не менее, может включать блокирующую группировку. В таких примерах применения выявление может вообще не осуществляться.

Помимо группировки метки, аналог нуклеотида может дополнительно включать группировку-модификатор метки. Группировка-модификатор метки может функционировать для модификации сигнала, продуцируемого группировкой метки. В некоторых примерах применения сигнал, который продуцируется группировкой метки в присутствии группировки-модификатора метки, может быть отличен от сигнала, который продуцируется группировкой метки в отсутствие группировки-модификатора метки. Например, группировка метки и группировка-модификатор метки могут представлять собой донорно-акцепторную пару Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET). В силу этого, может быть выявлено изменение длины волны кажущегося испускания флуоресценции от аналога нуклеотида, и оно будет указывать на присутствие или отсутствие группировки-модификатора метки. Типичные флуорофоры, которые можно использовать в качестве членов пар FRET, включают флуоресцентные нанокристаллы; квантовые точки; акцепторные красители на основе d-родамина, включающие дихлор[R110], дихлор[R6G], дихлор[TAMRA], дихлор[ROX] или тому подобные; донорные красители на основе флуоресцеина, включающие флуоресцеин, 6-FAM или тому подобные; цианиновые красители, такие как Су3В; красители Alexa, красители SETA, красители Atto, такие как Atto 647N, который образует пару FRET с Су3В, и тому подобные, но не ограничиваются ими.

В другом примере интенсивность сигнала от меченой группировки, который возникает в присутствии группировки-модификатора метки, может быть отличена от интенсивности сигнала, который продуцируется в отсутствие группировки-модификатора метки. Например, данная метка может представлять собой флуорофор, и группировка-модификатор метки может представлять собой гаситель таким образом, что отсутствие группировки-модификатора метки может быть выявлено как кажущееся увеличение испускания флуоресценции от аналога нуклеотида. Типичные гасители включают DACYL(4-(4'-диметиламинофенилазо)бензойную кислоту), гасители Black Hole (Biosearch Technologies, Novato, Calif.), гасители Qxl (Anaspec, Freemont, Calif.), гасители Iowa black, DABCYL, BHQ1, BHQ2, QSY7, QSY9, QSY21, QSY35, BHQO, BHQ1, BHQ2, QXL680, ATTO540Q, ATTO580Q, ATT0612Q, DYQ660, DYQ661 и гасители QC-1 инфракрасных красителей, но не ограничиваются ими.

Пример компонентов реверсивной биохимии показан на Фиг. 5. Данный пример включает 3'-фосфатные красители и 5'-трифосфатный гаситель. Этот типичный набор также включает полимеразу, которая может включать нуклеотиды, и также фермент, специфичный в отношении дцДНК (двухцепочечная ДНК), который будет отщеплять 3'-фосфатный блок, но только от нуклеотидов, которые были включены.

В способе или композиции, изложенных в данном документе, можно использовать любую из множества полимераз, включая, например, ферменты на основе белка, выделенные из биологических систем, и их функциональные варианты. Будет понятно то, что ссылка на конкретную полимеразу, как, например, на полимеразы, проиллюстрированные ниже, включает их функциональные варианты, если не указано иное. Особенно полезной функцией полимеразы является катализ полимеризации нити нуклеиновой кислоты с использованием существующей нуклеиновой кислоты в качестве матрицы. Другие функции, которые являются полезными, описываются в данном документе в других местах. Примеры полезных полимераз включают ДНК-полимеразы и РНК-полимеразы. Особенно полезные полимеразы включают Pol217 и Pol427, как изложено ниже в разделе Примеров, и другие полимеразы, описанные в US 2006/0240439 А1, которые включаются в данный документ посредством ссылки.

Для некоторых применений может быть полезной полимераза, имеющая собственную 3'-5' корректирующую экзонуклеазную активность. Полимеразы, которые по существу не имеют 3'-5' корректирующей экзонуклеазной активности, также являются полезными в некоторых применениях, например, в большинстве применений секвенирования. Отсутствие экзонуклеазной активности может быть характеристикой дикого типа или характеристикой, придаваемой вариантом структуры или генетически модифицированной структурой полимеразы. Например, экзо минус фрагмент Кленова представляет собой мутировавшую версию фрагмента Кленова, у которой отсутствует 3'-5' корректирующая экзонуклеазная активность. Полимеразы могут характеризоваться согласно их скорости диссоциации от нуклеиновых кислот.В конкретных применениях желательно применять полимеразу, которая имеет относительно высокую скорость диссоциации. Это может быть полезным, например, в случаях применения, где диссоциация полимеразы обеспечивает ход стадии деблокирования. Например, фермент при использовании в качестве деблокирующего агента может быть стерически блокирован полимеразой таким образом, что предотвращается удаление ферментом блокирующей группировки от достроенного праймера. В таком случае на время жизни достроенного праймера, имеющего блокирующую группировку, может влиять скорость диссоциации полимеразы. Скорость диссоциации представляет собой активность полимеразы, которая может быть скорректирована для настройки скоростей реакции в способах, изложенных в данном документе.

В зависимости от примера, который следует использовать, полимераза может быть либо термофильной, либо инактивированной нагреванием. Термофильные полимеразы типично являются полезными для условий высокой температуры или в условиях термоциклирования, таких как условия, применяемые для методик полимеразной цепной реакции (ПЦР). Примеры термофильных полимераз включают ДНК-полимеразу 9° N, ДНК-полимеразу Taq, ДНК-полимеразу Phusion®, ДНК-полимеразу Pfu, ДНК-полимеразу RB69, ДНК-полимеразу KOD и ДНК-полимеразу VentR®, но не ограничиваются ими. Большинство полимераз, выделенных из нетермофильных организмов являются инактивируемыми нагреванием. Примерами являются ДНК-полимеразы из фага. Будет понятно то, что полимеразы из любого из множества источников могут быть модифицированы для увеличения или уменьшения их устойчивости к условиям высокой температуры.

На Фиг. 6 проиллюстрирован пример химического процесса при включении нуклеотидов. Ссылаясь теперь на Фиг. 6, в 614 когда нуклеотид включается, 5'-трифосфат расщепляется. Поскольку присоединена молекула-гаситель, данная молекула-гаситель также отщепляется. В результате, флуоресцентный краситель больше не гасится и может испускать флуоресценцию, как показано в 616. В 618 теперь, когда нуклеотид включается в дцДНК, тогда второй фермент способен отщеплять 3'-фосфат, наряду с присоединенным красителем. Это показано на Фиг. 3 в 306. Это делает данную молекулу вновь темной, как показано в 620, и генерирует новую 3'-ОН, готовую для следующего включения (показанного в 622). Существует некоторое время, которое проходит между происходящим событием включения и включением флуорофора, и удалением фосфатного блока, вызывающим диффузию (из возбуждаемого объема) и выключение флуорофора.

В качестве другого примера в некоторых примерах применения способ секвенирования может включать предоставление смеси, включающей фермент, способный связывать нуклеотиды, деблокирующий агент, нуклеиновую кислоту, связанную с нитью нуклеотидов, имеющей последовательность, комплементарную нуклеотидным последовательностям, заякоренным на твердой подложке, и более чем один аналог нуклеотида, включающий основание с группировкой метки и соответствующую группировку гасителя, связанную с ними. Группировки метки могут коррелировать с конкретной группировкой основания. Данный способ может дополнительно обеспечивать то, что в смеси идет последовательное добавление множества аналогов нуклеотидов к нуклеиновой кислоте через несколько циклов реакции при сопутствующей визуализации (например, операция 418 ниже) группировок метки в пределах массива. В некоторых примерах применения каждый цикл реакции может включать: (i) полимеразу, добавляющую аналог нуклеотида к нуклеиновой кислоте посредством отщепления группировки гасителя и образования временного соединения нуклеиновой кислоты, содержащего группировку метки; и (и) деблокирующий агент, модифицирующий временное соединение нуклеиновой кислоты для удаления группировки метки. В разных применениях несколько циклов реакции могут включать по меньшей мере 100 циклов реакции, при этом нуклеиновая кислота удлиняется добавлением по меньшей мере 100 аналогов нуклеотидов. Фермент, способный связывать нуклеотиды, может включать полимеразу, миозин или киназу. Аналог нуклеотида может включать пентозную группировку, имеющую 3'-углерод, и группировка метки может быть присоединена к данному нуклеотиду на 3'-углероде. В другом примере аналог нуклеотида может включать трифосфатную группировку, и группировка гасителя может быть присоединена к трифосфатной группировке.

В некоторых применениях деблокирующий агент может включать фермент фосфоэстеразу (например, фосфодиэстераза, фосфотриэстераза), которая может быть включена для селективного удаления группировки фосфодиэфира или группировки фосфотриэфира от временного соединения нуклеиновой кислоты. Фосфоэстераза может быть выбрана из группы, состоящей из эндонуклеазы IV и эндонуклеазы АР. Временное соединение нуклеиновой кислоты может присутствовать в течение по меньшей мере 1 миллисекунды до модификации деблокирующим агентом временного соединения нуклеиновой кислоты с удалением группировки метки. В качестве другого примера, временное соединение нуклеиновой кислоты может присутствовать в течение не более чем 30 секунд до модификации деблокирующим агентом временного соединения нуклеиновой кислоты с удалением группировки метки.

Возвращаясь теперь к Фиг. 4, при операции 418 система визуализации секвенатора выявляет интенсивность сигнала в каждом из четырех каналов (ACGT), и флуоресценция красителя проявляется в виде увеличения сигнала, соответствующего основанию, которое было включено. Соответственно, флуоресценция выявляется сенсором изображений в системе визуализации (например, системой камеры 140 в типичной системе визуализации Фиг. 1), и изображения могут быть записаны. Система визуализации и записи может визуализировать и записывать многие каналы одновременно (например, один канал для каждого основания), и каждый канал может визуализировать и записывать последовательности включений и выключений для данного канала во всех местах в пределах его поля зрения. Из-за стохастической природы данного процесса все молекулы в пределах поля зрения системы визуализации могут активироваться одновременно, и происходящие реакции могут записываться в каждом канале одновременно для всех молекул в пределах поля зрения.

Другими словами, в разных применениях секвенирование происходит посредством включения правильных нуклеотидов полимеразой для данной молекулы, в то время как другие события включения вокруг продолжаются случайным образом, и визуализация может идти в реальном времени для выявления реакций на каждой из молекул по мере того, как они происходят. Как отмечено, визуализация может быть организована для наблюдения четырех разных цветовых каналов - одного для каждого основания -, и каждый канал может выявлять и записывать включение и выключение его флуоресценции.

На Фиг. 7 проиллюстрирован пример способа визуализации со сверхразрешением с использованием вышеописанного химического процесса. Это показывает пример событий «включения» и «выключения» 742 по мере того, как с течением времени происходят события включения и деблокирования для одной молекулы 722. Следы во времени состояния включения/выключения для каждой молекулы служат для определения последовательности данной молекулы. В проиллюстрированном примере состояния «включения» 744 иллюстрируются для молекулы 722 в последовательности ACTGCT.

В разных применениях события включения и деблокирования являются стохастическими и несинхронизированными между молекулами. Следовательно, статистически события «включения» для данного основания для данной молекулы в данном месте могут происходить в разное время от событий «включения» для данного основания для другой молекулы в смежных или окружающих местах. Соответственно, для каждого канала имеется статистическая вероятность того, что события включения для данного канала являются достаточно разделенными в пространстве-времени таким образом, что они являются разрешимыми системой визуализации в качестве отдельных событий, несмотря на то, что данные молекулы распределяются с шагом, меньшим, чем в противном случае позволялось бы пределом Аббе. Данное случайно генерированное пространственно-временное разделение между событиями включения для данного основания обеспечивает больший эффективный шаг между событиями, чем фактическое хорошее разделение в пространстве, делая события «включения» разрешимыми оптикой системы визуализации. Пример этого демонстрируется в 304 на Фиг. 3. В данном примере каждая из молекул в этом среднем ряду в текущее время демонстрирует событие включения для основания, которое отличается от его смежных молекул. В данном примере молекулы слева направо демонстрируют события включения для оснований А, С, G, Т, G, А, С, Т и С.Самыми ближними появлениями события включения для одинаковых оснований являются два события С на правой стороне дорожки и 2 события G ближе к центру ряда. В каждом случае они разделены в двух измерениях или находятся в двух средних шагах элементов для присоединения 212.

Поскольку фотопереключение является стохастическим, могут быть случаи, когда две или более чем две молекулы, находящиеся ближе друг к другу, чем в противном случае разрешалось бы пределом Аббе (например, 2 смежные молекулы), включаются для одинакового основания в то же самое время. В данном случае эти молекулы могут не быть разрешены. Эта возможность может быть ослаблена посредством контроля скоростей переключения для того, чтобы сделать данные совпадающие смежные события редкими. Например, концентрации нуклеотидов и фермента могут корректироваться для обеспечения того, что красители остаются «включенными» в течение достаточного времени для идентификации основания. Также данные концентрации могут быть выбраны таким образом, что не только время «включения» является достаточным, но также и таким образом, что время «выключения» является достаточно длительным так, что имеется мало или нет аналогичных событий «выключения», случающихся в тесной близости друг к другу. Например, в одном применении время включения и выключения выбрано таким образом, что вероятность включения красителя для данного места в то же самое время, что и включения красителя в непосредственно смежном месте, составляет меньше чем или равна 0,5%. В другом применении время включения и выключения выбрано таким образом, что вероятность включения красителя для данного места в то же самое время, что и включения красителя в непосредственно смежном месте больше чем или равна 0,5%. В других применениях время включения и выключения выбрано таким образом, что вероятность включения красителя для данного места в то же самое время, что и включения красителя в непосредственно смежном месте, находится в интервале от 0,1% до 0,5%. В других применениях время включения и выключения выбрано таким образом, что вероятность включения красителя для данного места в то же самое время, что и включения красителя в непосредственно смежном месте, находится в интервале от 0,1% до 0,8%. В другом применении время включения и выключения выбирают таким образом, что вероятность данной смежности меньше, чем приемлемая частота ошибок в данном применении секвенирования, в котором оно применяется.

Также могут быть другие способы разрешения ситуации, в которой события «включения» для данного канала случаются слишком близко друг к другу, чтобы разрешаться системой визуализации. В одном примере система может выявлять интенсивность свечения, большую, чем средняя или базовая интенсивность свечения, или другое пороговое значение, указывая на то, что случились события свечения для данного основания для двух или более чем двух молекул, расположенных ближе друг к другу, чем предел Аббе. Подобным образом, размер пятна или форму пятна также можно использовать для определения ситуации, в которой две или более чем две молекулы, расположенные ближе друг к другу, чем предел Аббе, демонстрируют событие включения одновременно для данного основания. Соответственно, сравнение события свечения с порогом интенсивности свечения, порогом размера пятна или обоими может быть методикой, используемой для обеспечения определения системой того, демонстрировали ли две смежные молекулы событие включения одновременно для того же самого основания. Это может обеспечивать повышенную устойчивость системы к данным смежным положениям, что, в свою очередь, может обеспечивать то, что время включения и выключения выбрано для обеспечения большей вероятности смежного положения, чем, в противном случае, можно допускать без определений одного из двух или обоих данных порогов. Также можно применять другие примеры таким образом, что при выравнивании с эталонным геномом кажущиеся «делеционные» ошибки могут быть исправлены посредством наблюдения того, какие основания появлялись в соседних считываемых фрагментах в тот же самый момент времени. Например, делеция, которая должна была быть «С» совпадает с правильно названным «С» в соседнем месте.

Способы, описанные в данном документе, обеспечивают способ достижения фотопереключения посредством ферментативного циклирования флуорофоров между темным и светящимся состояниями. Данное циклирование могло бы осуществляться посредством одного из многих ферментов, например, полимераз, таких как полимеразы, описанные в данном документе. Оно также могло бы осуществляться посредством других ферментов, которые обеспечивают обмен нуклеотидов (например, аденозинтрифосфата (АТФ) посредством миозинов или кинезинов), или любого многокомпонентного субстрата, в котором ферментативный процесс отделяет части (например, гаситель от флуоресцентного красителя). Они могли бы гаситься на 5'-конце (с меткой в виде 3'-красителя) аналогично способу, описанному выше, и, следовательно, при их гидролизе они флуоресцируют и затем возвращаются в темное состояние при высвобождении продуктов в виде АДФ. Другим примером могут быть ферментативные процессы, которые связывают друг с другом нефлуоресцентные молекулы в реакции, которая дает функциональный флуорофор. Данный флуорофор может затем вновь распадаться посредством применения ортогональной химии.

В других примерах применения в системах и способах, описанных в данном документе, можно использовать альтернативные методики по отношению к вышеописанному способу реверсивной химии для достижения стохастического фотопереключения молекул в одновременных смежных реакциях. Например, можно использовать методики фотопереключения STORM (стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия) или методики накопления ДНК точек для визуализации в наноразмерной топографии (DNA-PAINT), как описано выше, с аналогичными эффектами, что и достигаемые посредством вышеописанной химии. Соответственно, переключение включения и выключения может достигаться целым рядом разных способов, таких как, например, прямое переключение, управляемое фотохимическими реакциями (dSTORM), или кратковременная гибридизация ДНК ДНК-меток (DNA-PAINT). Могли бы быть созданы разные реактивы, с использованием, например, антител против специфических мишеней, связанных с такими ферментативными группировками для управления фотопереключением.

Например, STORM исходно преодолела предел Аббе посредством наличия флуорофоров, которые включаются и выключаются в пространственно отдаленных местах, и записываются последовательные снимки данных событий по мере изменения мест. В любом данном снимке только небольшая доля флуорофоров была бы включена, и они являются достаточно разделенными, находящимися по ту сторону предела Аббе. Однако это последовательный процесс, в котором флуорофоры энергизуются, записываются и стираются, и данный процесс затем должен быть повторен для всех мест, пока не зафиксированы все молекулы. Это потребовало бы получения многих последовательных снимков таким образом, что могут быть записаны все молекулы, и может быть получено полное изображение объекта. Однако применения способов, описанных в данном документе, обеспечивают то, что реакции для всех молекул в пределах поля зрения происходят одновременно (вместо энергизации, стирания и повторения для достаточно разделенных молекул), и обеспечивают визуализацию данного процесса в реальном времени по мере того, как он происходит. Это использует преимущество стохастической природы реакций таким образом, что они статистически часто не происходят рядом друг с другом, и они могут быть зафиксированы посредством многих каналов (например, одного для каждого основания) системы визуализации в реальном времени.

В то время как выше были описаны разные примеры раскрытой технологии, следует понимать то, что они были представлены лишь в качестве примера, а не ограничения. Подобным образом, на разных диаграммах может быть показан пример архитектурной или другой конфигурации для раскрытой технологии, который приводится для помощи в понимании характеристик и функциональности, которая может быть включена в раскрытую технологию. Раскрытая технология не ограничивается проиллюстрированными типичными архитектурами или конфигурациями, но желательные характеристики могут применяться с использованием множества альтернативных архитектур и конфигураций. В самом деле, специалисту в данной области будет очевидно, как может применяться альтернативное функциональное, логическое или физическое разделение и конфигурации для применения желательных характеристик технологии, раскрытой в данном документе. Также к разным частям может применяться множество разных названий составных модулей, отличных от модулей, показанных в данном документе. Кроме того, в отношении блок-схем, операционных описаний и пунктов формулы, касающихся способов, порядок, в котором в данном документе представляются этапы, не должен предписывать то, что разные примеры будут воплощаться для осуществления перечисленной функциональности в том же самом порядке, если контекст не диктует иное.

Хотя раскрытая технология описывается выше в показателях разных типичных примеров и воплощений, следует понимать то, что разные характеристики, аспекты и функциональность, описанные в одном или более чем одном индивидуальном примере, не ограничиваются их применимостью к конкретному примеру, с которым они описываются, но, вместо этого, могут применяться, одни или в разных комбинациях, к одному или более чем одному другому примерам раскрытой технологи, независимо от того, описываются или нет такие примеры, и представляются ли или нет такие характеристики как часть описанного примера. Таким образом, широта и объем технологии, раскрытой в данном документе, не должны ограничиваться любыми из вышеописанных типичных примеров. Следует понимать то, что все комбинации вышеописанных идей (при условии, что такие идеи не являются взаимно несовместимыми) рассматриваются как часть объекта изобретения, раскрытого в данном документе. В частности, все комбинации заявленного объекта, появляющиеся в конце данного раскрытия, рассматриваются как часть объекта изобретения, раскрытого в данном документе.

Термины и фразы, используемые в данном документе, и их вариации следует истолковывать, если прямо не утверждается иное, как неограничивающие, в отличие от ограничивающих. В качестве примера вышеописанного: термин «включающий» следует читать как означающий «включающий без ограничения» или тому подобное; термин «пример» используется для предоставления типичных примеров рассматриваемого предмета, не являющихся их исчерпывающим или ограничивающим списком; термины в единственном числе следует читать как означающие «по меньшей мере один», «один или более чем один» или тому подобные; и прилагательные, такие как «обычный», «традиционный», «нормальный», «стандартный», «известный» и термины с аналогичным значением не следует истолковывать как ограничивающие описанный предмет данным периодом времени или предметом, доступным в данное время, но вместо этого следует читать как охватывающие обычные, традиционные, нормальные или стандартные технологии, которые могут быть доступны или известны теперь или в любое время в будущем. В данном документе подразумевается то, что термин «содержащий» является неограничивающим, включающим не только перечисленные элементы, но также и любые дополнительные элементы. Подобным образом, где данный документ относится к технологиям, которые были бы очевидными или известными обычному специалисту в данной области, такие технологии охватывают технологии, очевидные или известные квалифицированному специалисту сейчас или в любое время в будущем. В применимой степени термины «первый», «второй», «третий» и т.д. в данном документе просто используются для демонстрации соответствующих объектов, описываемых данными терминами как отдельные предметы и не означают ассоциацию со смыслом хронологического порядка, если в данном документе прямо не утверждается иное.

Термин «связанный» относится к прямому или опосредованному объединению, соединению, пристегиванию, приведению в контакт или связыванию и может относиться к разным формам связывания, таким как физическое, оптическое, электрическое, жидкостное, механическое, химическое, магнитное, электромагнитное, коммуникационное или любое другое связывание, или к комбинации вышеизложенных. Когда определяется одна форма связывания, это не подразумевает то, что исключаются другие формы связывания. Например, один компонент, физически связанный с другим компонентом, может обозначать физическое присоединение или контакт между двумя данными компонентами (прямо или опосредованно), но не исключает другие формы связывания между данными компонентами, такие как, например, связь коммуникаций (например, RF (радиочастота) или оптическая связь), также коммуникационно связывающая два компонента. Подобным образом, сами разные термины не подразумеваются как взаимоисключающие. Например, жидкостное связывание, магнитное связывание или механическое связывание, среди прочих, могут представлять собой форму физического связывания.

Термины «по существу» и «примерно», используемые во всем данном раскрытии, включая формулу изобретения, используются для описания и объяснения маленьких флуктуации, таких как обусловленные вариациями в переработке. Например, они могут относиться к меньшему чем или равному плюс/минус 5%, как, например, меньшему чем или равному плюс/минус 2%, как, например, меньшему чем или равному плюс/минус 1%, как, например, меньшему чем или равному плюс/минус 0,5%, как, например, меньшему чем или равному плюс/минус 0,2%, как, например, меньшему чем или равному плюс/минус 0,1%, как, например, меньшему чем или равному плюс/минус 0,05%.

Присутствие расширяющих слов и фраз, таких как «один или более чем один», «по меньшей мере», «но не ограниченный» или других подобных фраз в некоторых случаях не следует читать как означающее то, что подразумевается или требуется более узкий случай, когда такие расширяющие фразы могут отсутствовать. Применение термина «компонент» не подразумевает то, что элементы или функциональности, описанные или заявленные как часть компонента, все конфигурируются в общем пакете. В самом деле, любой или все из разных элементов компонента, включая структурные элементы, могут объединяться в одном пакете или поддерживаться отдельно и могут дополнительно распространяться в многих группах или пакетах.

Дополнительно разные примеры, изложенные в данном документе, описываются в показателях диаграмм примеров и других иллюстраций. Как станет очевидным обычному специалисту в данной области после прочтения данного документа, иллюстрированные примеры и их разные альтернативы могут применяться без ограничения данными иллюстрированными примерами. Например, блок-схемы и их сопровождающее описание не должны истолковываться как диктующие конкретную архитектуру или конфигурацию.

Следует понимать то, что все комбинации вышеизложенных идей и дополнительных идей, обсуждаемых более подробно ниже (при условии, что такие идеи не являются взаимно несовместимыми), рассматриваются как часть объекта изобретения, раскрытого в данном документе. В частности, все комбинации заявленных объектов, появляющихся в конце данного раскрытия, рассматриваются как часть объекта изобретения, раскрытого в данном документе.

1. Способ секвенирования полинуклеотидов, включающий:

присоединение первой молекулы ДНК-матрицы к первому элементу для присоединения из множества элементов для присоединения контейнера для образца и присоединение второй молекулы ДНК-матрицы ко второму элементу для присоединения из множества элементов для присоединения, где расстояние между первым элементом для присоединения и вторым элементом для присоединения меньше, чем предел Аббе;

обеспечение химии стохастического фотопереключения к контейнеру для образца, при этом химия стохастического фотопереключения включает набор нуклеотидов, которые имеют 5'-дифосфатную гасящую молекулу и 3'-фосфатный блок с группировкой метки, полимеразу для включения нуклеотида из набора нуклеотидов и отщепления 5'-дифосфатной гасящей молекулы, и фермент для отщепления 3'-фосфатного блока с группировкой метки;

визуализацию серии событий включения и выключения для первой молекулы ДНК-матрицы в реальном времени по мере того, как происходят события включения и выключения, при этом каждое событие включения происходит, когда полимераза включает нуклеотид из набора нуклеотидов и отщепляет 5'-дифосфатную гасящую молекулу, а каждое событие выключения происходит, когда фермент отщепляет 3'-фосфатный блок с группировкой метки; и

визуализацию серии событий включения и выключения для второй молекулы ДНК-матрицы в реальном времени по мере того, как происходят события включения и выключения;

где серия событий включения и выключения для первой молекулы ДНК-матрицы и серия событий включения и выключения для второй молекулы ДНК-матрицы являются стохастическими и не синхронизированы.

2. Способ по п. 1, в котором каждый из множества элементов для присоединения на контейнере для образца находится в пределах поля зрения визуализатора, используемого для визуализации событий включения и выключения, таким образом, что визуализация событий включения и выключения происходит одновременно для первой молекулы ДНК-матрицы и второй молекулы ДНК-матрицы.

3. Способ по п. 1, дополнительно включающий осуществление контроля скорости, с которой происходят события включения и выключения, для контроля вероятности того, что событие включения для первого нуклеотидного основания для первой молекулы ДНК-матрицы будет происходить одновременно с событием включения для нуклеотидного основания для второй молекулы ДНК-матрицы на основании концентрации первого нуклеотидного основания из набора нуклеотидов и концентрации фермента.

4. Способ по п. 1, дополнительно включающий (i) определение того, больше ли интенсивность свечения выявленного события включения в цветовом канале, чем заданный порог; или (ii) определение того, больше ли размер пятна выявленного события включения в цветовом канале, чем заданный порог.

5. Способ по п. 1, в котором расстояние между первым элементом для присоединения и вторым элементом для присоединения составляет менее 20 нм или предпочтительно находится в интервале от 2 нм до 20 нм.

6. Система визуализации для осуществления способа по п. 1, содержащая:

контейнер для образца, содержащий множество элементов для присоединения, причем предусмотрено присоединение первой молекулы ДНК-матрицы к первому элементу для присоединения и присоединение второй молекулы ДНК-матрицы ко второму элементу для присоединения, при этом среднее расстояние между смежными элементами для присоединения меньше, чем предел Аббе; и

визуализатор, установленный для визуализации фотопереключения, происходящего на первом элементе для присоединения и втором элементе для присоединения, посредством фиксации событий включения и выключения во множестве цветовых каналов в то же самое время, когда события включения и выключения происходят для первой молекулы ДНК-матрицы и второй молекулы ДНК-матрицы при применении химии стохастического фотопереключения.

7. Система визуализации по п. 6, в которой контейнер для образца содержит проточную ячейку, которая содержит множество элементов для присоединения во множестве мест для образца.

8. Система визуализации по п. 6, в которой каждый из множества элементов для присоединения на контейнере для образца находится в пределах поля зрения визуализатора, используемого для визуализации фотопереключения таким образом, что фиксация событий включения и выключения происходит одновременно.

9. Система визуализации по п. 6, где среднее расстояние между смежными элементами меньше чем 20 нм.