Антитела против il-33, композиции, способы и их применение

Изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с IL-33, а также к плазмиде для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, к вектору экспрессии, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, к клетке-хозяину для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, к фармацевтической композиции и к способу лечения. 9 н. и 12 з.п. ф-лы, 3 ил., 44 табл., 29 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с интерлейкином-33, а также к композициям, способам и их применению.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

IL-33 является важнейшим членом семейства IL-1, который усиливает ответы клеток многих типов, которые вовлечены в астму и атопическое воспаление. IL-33 связывается с белком 1, подобным рецептору интерлейкина-1 (IL1RL1; также известным как супрессор онкогенности 2 [ST2]), с высокой аффинностью и образует тройной комплекс с IL1RAcP для того, чтобы формировать сигнальный комплекс. Этот сигнальный комплекс ведет к серии событий, которая зависит от миддосомы, с MyD88 и членами семейства IRAK. Эта сигнализация в конечном итоге ведет к активации NFKb и других путей в конкретном контексте клеточного и цитокинового окружения. При стимуляции клеток, таких как тучные клетки или базофилы, под действием IL-33, происходит образование цитокинов 2 типа, таких как IL-4, 5 и 13.

Показано, что IL-33 играет ключевую роль во многих доклинических моделях астмы и аллергического заболевания, когда его активность блокируют с помощью фармакологических или генетических подходов. Блокаду пути выполняли с помощью нейтрализующих антител к IL-33 или рецептору IL1RL1, генетической делеции IL-33 или IL1RL1 или растворимых форм рецептора IL1RL1, сопряженного в виде слитого белка с Fc (Coyle et al., 1999, J. Exper. Med 190(7): 895-902). В большинстве модельных систем, где используют физиологические аллергены, которые содержат протеолитический аллерген, такой как в пылевом клеще, таракане или грибе альтернарии, IL-33 играет важную роль в управлении воспалением и другими аспектами ремоделирования дыхательных путей (Chu et al., 2013, J. Allergy Clin. Immunol. 131: 187-200). В фармакологических моделях, которые основаны на адъювантах для сенсибилизации, таких как гидроксид алюминия (квасцы) или кристаллы урата мононатрия, IL-33 играет важную роль в фазе сенсибилизации модели и индукции цитокинов 2 типа, таких как IL-5 и IL13 (Hara et al., 2014, J. Immunol. 192(9): 4032-4042). Также обнаружено, что IL-33 играет важную роль в воспалительной реакции, связанной с вирусными инфекциями в дыхательных путях. Повреждение эпителия дыхательных путей вирусными инфекциями может запускать высвобождение IL-33 и модифицировать тип иммунного ответа.

Заболевания, такие как хронический риносинусит с носовыми полипами (CRSwNP), атопический дерматит (AD) и астма, представляют собой заболевания, в патогенез которых вероятно вовлечено множество цитокинов.

Рецептор IL-33, ST2, экспрессируют клетки многих типов, связанные с воспалением 2 типа, в том числе тучные клетки, базофилы, Th2-T-клетки, врожденные лимфоидные клетки 2 типа и другие (Cayrol & Girard, 2014, Current Opinion in Immunology 31: 31-37; Molofsky et al. 2015, Immunity 42(6): 1005-1019). Первичным ответом клеток этих типов на IL-33 является продуцирование воспалительных цитокинов и, в частности, тех, которые связаны с воспалением 2 типа, в том числе IL-5, IL-13, IL-4, IL-31 и IL-9 (Molofsky et al., 2015, Immunity 42(6): 1005-1019; Rivelleseet al, 2014, Eur. J. Immunol. 44(10): 3045-3055; Suzukawaet al., 2008, J. Immunology 181(9): 5981-5989; Vocca et al. Immunobiology 220(8): 954-963; Maier et al., 2014, J. Immunology 193(2): 645-654). Также происходит продуцирование других цитокинов, а также хемокинов, которые важны для управления рекрутированием дополнительных клеток воспалительных типов в место в ткани (Cayrol & Girard, 2014; Molofsky et al., 2015). Начальное высвобождение IL-33 запускается повреждением эпителия на поверхностях организма или слизистых. Релевантные триггеры заболеваний включают аллергены с протеолитической активностью, физическое повреждение эпителия, вирусы, а также грибы и бактерии, которые обычно находятся на поверхностях организма. При заболеваниях, где ткань богата эозинофилами и тучными клетками, повреждение эпителия запускает каскад, в результате чего происходит высвобождение IL-33, действует на локальные клетки-мишени и управляет продуцированием множества цитокинов, которые являются центральными для воспалительной реакции 2 типа.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к антителам (и их антигенсвязывающим фрагментам), которые специфически связываются с IL-33, а также к применению и способам, связанных с ними. Специалистам в данной области будет понятно или они смогут получить, используя не более чем стандартное экспериментирование, большое число эквивалентов конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем описании. Такие эквиваленты предназначены и включены в следующие варианты осуществления (E).

E1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с IL-33 человека.

E2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по E1, которые содержат одно последовательность CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 32, 90, 94, 97, 113, 118, 121, 124, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 152, 155, 158, 161, 163, 165, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 184, 186, 201, 204, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231 и 234.

E3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E2, которые содержат последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 36, 81, 91, 98, 115, 189, 192, 195, 198 и 207.

E4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из E1-E3, содержащие одну или несколько из (i)-(vi):

(i) CDR-L1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 37, 190, 193, 257, 258, 259 и 260,

(ii) CDR-L2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, 196, 199, 261, 262, 263 и 264,

(iii) CDR-L3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, 38, 208, 265, 26, 267 и 268,

(iv) CDR-H1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 33, 269, 270 и 271,

(v) CDR-H2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, 34, 168, 171, 174, 180, 202, 205, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 235, 272, 273, 274 и 275,

(vi) CDR-H3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, 35, 114, 119, 122, 127, 130, 133, 136, 139, 142, 145, 148, 153, 156, 159, 177, 187, 276, 277, 278 и 279.

E5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из E1-E4, содержащие

(i) CDR-L1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 257, 258, 259 и 260,

(ii) CDR-L2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 261, 262, 263 и 264,

(iii) CDR-L3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 265266267 и 268,

(iv) CDR-H1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 269, 270 и 271,

(v) CDR-H2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 272273274 и 275,

(vi) CDR-H3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 276277278, и 279.

E6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из E1-E5, содержащие

(i) CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 257,

(ii) CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 261,

(iii) CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 265,

(iv) CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 269,

(v) CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 272,

(vi) CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 276.

E7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из E1-E6, содержащие

(i) CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 258,

(ii) CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 262,

(iii) CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 266,

(iv) CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 270,

(v) CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 273,

(vi) CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 277.

E8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как в любом одном из E1-E7, содержащие

(i) CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 259,

(ii) CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 263,

(iii) CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 267,

(iv) CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 271,

(v) CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 274,

(vi) CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 278.

E9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из E1-E8, содержащие

(i) CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 260,

(ii) CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 264,

(iii) CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 268,

(iv) CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 271,

(v) CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 275,

(vi) CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 278.

E10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как в любом одном из E1-E9, содержащие

(i) CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 20,

(ii) CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 21,

(iii) CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 208,

(iv) CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 16,

(v) CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 226,

(vi) CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 18.

E11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E10, которые содержат последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 из SEQ ID NO: 225.

E12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E11, которые содержат последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 из SEQ ID NO: 207.

E13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E12, которые содержат одну или несколько из следующих замен:

(i) 1, 2, 3, 4, 5 или 6 замен в CDR L1 на соответствующий остаток последовательности VL зародышевой линии человека,

(ii) 1, 2, 3, 4 или 5 замен в CDR L2 на соответствующий остаток последовательности VL зародышевой линии человека,

(iii) 1, 2, 3, 4, 5 или 6 замен в CDR L3 на соответствующий остаток последовательности VL зародышевой линии человека,

(iv) 1 замена в CDR H1 на соответствующий остаток последовательности VH зародышевой линии человека,

(v) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 замен в CDR H2 на соответствующий остаток последовательности VH зародышевой линии человека,

где последовательность VL зародышевой линии человека выбрана из группы, состоящей из DPK9, DPK12, DPK18, DPK24, HK102_V1, DPK1, DPK8, DPK3, DPK21, Vg_38K, DPK22, DPK15, DPL16, DPL8, V1-22, консенсусного Vλ, консенсусного Vλ1, консенсусного Vλ3, консенсусного Vκ, консенсусного Vκ1, консенсусного Vκ2 и Vκ3, и VH зародышевой линии человека выбрана из группы, состоящей из DP54, DP47, DP50, DP31, DP46, DP71, DP75, DP10, DP7, DP49, DP51, DP38, DP79, DP78, DP73, VH3, VH5, VH1 и VH4.

E14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E13, которые содержат каркасную последовательность VH, полученную из последовательности VH зародышевой линии человека, выбранной из группы, состоящей из DP54, DP47, DP50, DP31, DP46, DP71, DP75, DP10, DP7, DP49, DP51, DP38, DP79, DP78, DP73, VH3, VH5, VH1 и VH4.

E15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E14, которые содержат каркасную последовательность VH, полученную из последовательности VH3 зародышевой линии человека.

E16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E15, которые содержат каркасную последовательность VH, полученную из последовательности VH зародышевой линии человека, выбранной из группы, состоящей из DP54, DP47, DP50, DP31, DP46, DP49 и DP51.

E17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E16, которые содержат каркасную последовательность VH, полученную из последовательности VH зародышевой линии человека, выбранной из группы, состоящей из DP54, DP47, DP50 и DP31.

E18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E17, которые содержат каркасную последовательность VH, полученную из последовательности DP54 зародышевой линии человека.

E19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E18, которые содержат каркасную последовательность VL, полученную из последовательности VL зародышевой линии человека, выбранной из группы, состоящей из DPK9, DPK12, DPK18, DPK24, HK102_V1, DPK1, DPK8, DPK3, DPK21, Vg_38K, DPK22, DPK15, DPL16, DPL8, V1-22, консенсусного Vλ, консенсусного Vλ1, консенсусного Vλ3, консенсусного Vκ, консенсусного Vκ1, консенсусного Vκ2 и Vκ3.

E20. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E19, которые содержат каркасную последовательность VL, полученную из последовательности VL зародышевой линии человека, выбранной из группы, состоящей из DPK9, DPK12, DPK18, DPK24, HK102_V1, DPK1, DPK8, DPK3, DPK21, Vg_38K, DPK22, DPK15, консенсусного Vκ, консенсусного Vκ1, консенсусного Vκ2 и Vκ3.

E21. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E20, которые содержат каркасную последовательность VL, полученную из последовательности Vκ1 зародышевой линии человека.

E22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E21, которые содержат каркасную последовательность VL, полученную из последовательности VL зародышевой линии человека, выбранной из группы, состоящей из DPK9, HK102_V1, DPK1 и DPK8.

E23. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E22, которые содержат каркасную последовательность VL, полученную из последовательности DPK9 зародышевой линии человека.

E24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E23, которые содержат каркасную последовательность VL и каркасную последовательность VH и в которых одна или обе каркасных последовательностей VL или каркасных последовательностей VH по меньшей мере на 90% идентичны последовательностям зародышевой линии человека, из которых они получены.

E25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E24, которые содержат каркасную последовательность VL и каркасную последовательность VH и где одна или обе каркасных последовательностей VL или каркасных последовательностей VH по меньшей мере на 66%, 76%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны последовательностям зародышевой линии человека, из которых они получены.

E26. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E25, которые содержат каркасную последовательность VL и каркасную последовательность VH и где одна или обе каркасных последовательностей VL или каркасных последовательностей VH идентичны последовательностям зародышевой линии человека, из которых они получены.

E27. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E26, которые содержат VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 225.

E28. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E27, которые содержат VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 92% идентична SEQ ID NO: 225.

E29. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E28, которые содержат VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 225.

E30. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E29, которые содержат VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 66% идентична SEQ ID NO: 207.

E31. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E30, которые содержат VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 66%, 76%, 80%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 207.

E32. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E31, которые содержат VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 207.

E33. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E32, которые содержат Fc-домен.

E34. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E33, в которых Fc-домен представляет собой Fc-домен из IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgD, IgE, IgM или IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄).

E35. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E34, в которых Fc-домен представляет собой Fc-домен из IgG.

E36. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E35, в которых IgG выбрана из группы, состоящей из IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄.

E37. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E36, в которых IgG представляет собой IgG₁.

E38. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E37, которые содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 244.

E39. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E38, которые содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 244

E40. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E39, которые содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 244.

E41. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E40, которые содержат LC, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 209.

E42. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E41, которые содержат LC, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 209.

E43. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E42, которые содержат LC, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209.

E44. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E43, которые содержат последовательность VH, кодируемую плазмидой, депонированной в ATCC и имеющей номер доступа ATCC PTA-122724.

E45. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E44, которые содержат последовательность VL, кодируемую плазмидой, депонированной в ATCC и имеющей номер доступа ATCC PTA-122725.

E46. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют за связывание с IL-33 человека с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из E1-E45.

E47. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют за связывание с IL-33 человека с одним или несколькими из 7E8_chimera, 9B3_chimera, 9B3_chimera_huJseg, трансплантата CDR 7E8, IL33-10, трансплантата CDR 9B3, 9B3_1, 9B3_2A, 9B3_2B, 9B3_3, 9B3_5, 9B3_7 9B3_13, 9B3_15, 9B3_17, 9B3_22, 9B3_31V2, 9B3_36, 9B3_79, 9B3_124, 9B3_162, 7E8H/9B3K, 9B3_563, IL33-11, IL33-12, IL33-13, IL33-45, IL33-55, IL33-56, IL33-57, IL33-58, IL33-61, IL33-62, IL33-68, IL33-74, IL33-75, IL33-80, IL33-81, IL33-103, IL33-117, IL33-136, IL33-153, IL33-154, IL33-155, IL33-156, IL33-157, IL33-158, IL33-167, IL33-168, IL33-169, IL33-170, IL33-171, IL33-172, IL33-175, IL33-186, IL33-187, IL33-188,IL33-158-152, IL33-167-153, IL33-158LS и IL33-167LS.

E48. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют за связывание с IL-33 человека с IL33-158LS или антигенсвязывающим фрагментом из IL33-158LS.

E49. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E48, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой слитый белок Fc, монотело, макситело, бифункциональное антитело, scFab, scFv, пептидное антитело.

E50. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E49, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывают IL-33 человека с K_D приблизительно или меньше чем значение, выбранное из группы, состоящей из приблизительно 10 нМ, 5 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 900 пМ, 800 пМ, 700 пМ, 600 пМ, 500 пМ, 400 пМ, 300 пМ, 250 пМ, 200 пМ, 150 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 25 пМ, 20 пМ, 15 пМ, 10 пМ, 5 пМ и 1 пМ.

E51. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E50, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с IL-33 яванского макака с K_D приблизительно или меньше чем значение, выбранное из группы, состоящей из приблизительно 10 нМ, 5 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 900 пМ, 800 пМ, 700 пМ, 600 пМ, 500 пМ, 400 пМ, 300 пМ, 250 пМ, 200 пМ, 150 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 25 пМ, 20 пМ, 15 пМ, 13 пМ, 10 пМ, 5 пМ и 1 пМ.

E52. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E51, где K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака находится в пределах 1 порядка величины K_D связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 человека.

E53. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E52, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 человека по сравнению со связыванием с IL-33 яванского макака составляет между 5: 1 и 1: 5.

E54. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E53, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 человека по сравнению со связыванием с IL-33 яванского макака составляет между 2: 1 и 1: 2.

E55. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E54, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывают активный IL-33 с более низкой K_D, чем K_D, с которой они связывают неактивный IL-33.

E56. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E55, где K_D антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, связывающихся с активным IL-33, по меньшей мере в 10 раз меньше, чем K_D антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, связывающихся с неактивным IL-33.

E57. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E56, где K_D антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, связывающихся с активным IL-33, составляет по меньшей мере в 10, 100, 1×10³, 1×10⁴, 1×10⁵, 1×10⁶, 1×10⁷ раз меньше, чем K_D антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, связывающихся с неактивной формой IL-33.

E58. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E57, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывают активный IL-33, но не связывают неактивный IL-33.

E59. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E55-E58, где измерение K_D активного IL-33 выполняют с использованием варианта IL-33, в котором аминокислотный остаток цистеина в положении 208 (C208), в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 396, заменяют на аминокислотный остаток не цистеина.

E60. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E55-E59, где измерение K_D активного IL-33 выполняют с использованием варианта IL-33, в котором C208 и C232, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 396, заменяют на аминокислотный остаток не цистеина.

E61. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E55-E60, где измерение K_D активного IL-33 выполняют с использованием восстановленной формы IL-33 дикого типа.

E62. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E55-E61, где измерение K_D неактивного IL-33 выполняют с использованием не восстановленной формы IL-33 дикого типа.

E63. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E55-E62, где IL-33 представляет собой IL-33 человека.

E64. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E55-E62, где IL-33 представляет собой IL-33 яванского макака.

E65. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E64, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака по сравнению со связыванием с IL-33 человека находится в диапазоне, нижнее значение которого выбрана из группы, состоящей из 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7,1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5 и 6,2, и верхнее значение которого выбрана из группы, состоящей из 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 6,2, 9, 9,2 и 10.

E66. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E55, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака по сравнению со связыванием с IL-33 человека составляет между приблизительно 0,5 и приблизительно 3,0.

E67. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E56, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака по сравнению со связыванием с IL-33 человека составляет между приблизительно 1,2 и приблизительно 2,4.

E68. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E57, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака по сравнению со связыванием с IL-33 человека составляет между приблизительно 1 и приблизительно 2.

E69. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-58, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака по сравнению со связыванием с IL-33 человека составляет между приблизительно 1,3 и приблизительно 2,3.

E70. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E59, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака по сравнению со связыванием с IL-33 человека составляет между приблизительно 1,3 и приблизительно 1,8.

E71. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E70, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака SEQ ID NO: 5 по сравнению со связыванием с IL-33 человека SEQ ID NO: 3 составляет между приблизительно 1,0 и приблизительно 2,3.

E72. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E71, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака SEQ ID NO: 5 по сравнению со связыванием с IL-33 человека SEQ ID NO: 3 составляет между приблизительно 1,0 и приблизительно 2,0.

E73. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E72, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака SEQ ID NO: 5 по сравнению со связыванием с IL-33 человека SEQ ID NO: 3 составляет между приблизительно 1,3 и приблизительно 1,8.

E74. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E73, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака SEQ ID NO: 5 по сравнению со связыванием с IL-33 человека SEQ ID NO: 3 измеряют посредством сравнения результатов репортерного анализа с HEK293 ST2 NFκB по нейтрализации IL-33 яванского макака и человека.

E75. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-74, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака SEQ ID NO: 397 по сравнению со связыванием с IL-33 человека SEQ ID NO: 1 составляет между приблизительно 4 и приблизительно 10.

E76. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E75, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака SEQ ID NO: 397 по сравнению со связыванием с IL-33 человека SEQ ID NO: 1 составляет между приблизительно 4,2 и приблизительно 9,2.

E77. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E76, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака SEQ ID NO: 397 по сравнению со связыванием с IL-33 человека SEQ ID NO: 1 составляет приблизительно 4,2.

E78. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E77, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака SEQ ID NO: 397 по сравнению со связыванием с IL-33 человека SEQ ID NO: 1 составляет приблизительно 6,2.

E79. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E78, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака SEQ ID NO: 397 по сравнению со связыванием с IL-33 человека SEQ ID NO: 1 составляет приблизительно 9,2.

E80. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по E1-E79, где соотношение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака SEQ ID NO: 397 по сравнению со связыванием с IL-33 человека SEQ ID NO: 1 измеряют посредством сравнения результатов репортерного анализа с HEK293 ST2 NFκB по нейтрализации IL-33 яванского макака и человека.

E81. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E50-E80, где значение K_D измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

E82. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E50-E81, где значение K_D измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и иммобилизуют IL-33.

E83. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E82, где конечное время полужизни у яванских макаков составляет по меньшей мере приблизительно 15 суток.

E84. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E83, где конечное время полужизни у яванских макаков составляет по меньшей мере приблизительно 16 суток.

E85. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E84, где конечное время полужизни у яванских макаков составляет по меньшей мере приблизительно 18 суток.

E86. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E85, где конечное время полужизни у человека составляет по меньшей мере приблизительно 30 суток.

E87. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E86, где конечное время полужизни у человека составляет по меньшей мере приблизительно 50 суток.

E88. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E87, где конечное время полужизни у человека составляет по меньшей мере приблизительно 55 суток.

E89. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E88, где конечное время полужизни у человека составляет по меньшей мере приблизительно 60 суток.

E90. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E89, где конечное время полужизни у человека составляет по меньшей мере приблизительно 65 суток.

E91. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E90, где конечное время полужизни у человека составляет по меньшей мере приблизительно 70 суток.

E92. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E91, где конечное время полужизни у человека составляет по меньшей мере приблизительно 75 суток.

E93. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E92, где конечное время полужизни у человека составляет по меньшей мере приблизительно 80 суток.

E94. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E93, где конечное время полужизни у человека составляет по меньшей мере приблизительно 85 суток.

E95. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E94, где конечное время полужизни у человека составляет по меньшей мере приблизительно 90 суток.

E96. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E95, где антитело имеет длину волны максимального поглощения относительно пустой пробы меньше чем 15 нм в спектроскопическом анализе самовзаимодействия наночастиц с аффинным захватом.

E97. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E96, где антитело имеет длину волны максимального поглощения относительно пустой пробы меньше чем 10 нм в спектроскопическом анализе самовзаимодействия наночастиц с аффинным захватом.

E98. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E97, где антитело имеет длину волны максимального поглощения относительно пустой пробы меньше чем 5 нм в спектроскопическом анализе самовзаимодействия наночастиц с аффинным захватом.

E99. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E98, где антитело имеет длину волны максимального поглощения относительно пустой пробы меньше чем 1 нм в спектроскопическом анализе самовзаимодействия наночастиц с аффинным захватом.

E100. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E99, где антитело имеет оценку связывания ДНК, нормализованную по пустой пробе, меньше чем 19.

E101. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E100, где антитело имеет оценку связывания ДНК, нормализованную по пустой пробе, меньше чем 15.

E102. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E101, где антитело имеет оценку связывания ДНК, нормализованную по пустой пробе, меньше чем 10.

E103. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E102, где антитело имеет оценку связывания ДНК, нормализованную по пустой пробе, меньше чем 7,55.

E104. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют за связывание с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из E1-E103.

E105. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают тот же эпитоп, что и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E104.

E106. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат CDR антитела, выбранные из группы, состоящей из 7E8_chimera, 9B3_chimera, 9B3_chimera_huJseg, трансплантата CDR 7E8, IL33-10, трансплантата CDR 9B3, 9B3_1, 9B3_2A, 9B3_2B, 9B3_3, 9B3_5, 9B3_7 9B3_13, 9B3_15, 9B3_17, 9B3_22, 9B3_31V2, 9B3_36, 9B3_79, 9B3_124, 9B3_162, 7E8H/9B3K, 9B3_563, IL33-11, IL33-12, IL33-13, IL33-45, IL33-55, IL33-56, IL33-57, IL33-58, IL33-61, IL33-62, IL33-68, IL33-74, IL33-75, IL33-80, IL33-81, IL33-103, IL33-117, IL33-136, IL33-153, IL33-154, IL33-155, IL33-156, IL33-157, IL33-158, IL33-167, IL33-168, IL33-169, IL33-170, IL33-171, IL33-172, IL33-175, IL33-186, IL33-187, IL33-188,IL33-158-152, IL33-167-153, IL33-158LS и IL33-167LS.

E107. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат VL и VH антитела, выбранные из группы, состоящей из 7E8_chimera, 9B3_chimera, 9B3_chimera_huJseg, трансплантата CDR 7E8, IL33-10, трансплантата CDR 9B3, 9B3_1, 9B3_2A, 9B3_2B, 9B3_3, 9B3_5, 9B3_7 9B3_13, 9B3_15, 9B3_17, 9B3_22, 9B3_31V2, 9B3_36, 9B3_79, 9B3_124, 9B3_162, 7E8H/9B3K, 9B3_563, IL33-11, IL33-12, IL33-13, IL33-45, IL33-55, IL33-56, IL33-57, IL33-58, IL33-61, IL33-62, IL33-68, IL33-74, IL33-75, IL33-80, IL33-81, IL33-103, IL33-117, IL33-136, IL33-153, IL33-154, IL33-155, IL33-156, IL33-157, IL33-158, IL33-167, IL33-168, IL33-169, IL33-170, IL33-171, IL33-172, IL33-175, IL33-186, IL33-187, IL33-188,IL33-158-152, IL33-167-153, IL33-158LS и IL33-167LS.

E108. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранные из группы, состоящей из 7E8_chimera, 9B3_chimera, 9B3_chimera_huJseg, трансплантата CDR 7E8, IL33-10, трансплантата CDR 9B3, 9B3_1, 9B3_2A, 9B3_2B, 9B3_3, 9B3_5, 9B3_7 9B3_13, 9B3_15, 9B3_17, 9B3_22, 9B3_31V2, 9B3_36, 9B3_79, 9B3_124, 9B3_162, 7E8H/9B3K, 9B3_563, IL33-11, IL33-12, IL33-13, IL33-45, IL33-55, IL33-56, IL33-57, IL33-58, IL33-61, IL33-62, IL33-68, IL33-74, IL33-75, IL33-80, IL33-81, IL33-103, IL33-117, IL33-136, IL33-153, IL33-154, IL33-155, IL33-156, IL33-157, IL33-158, IL33-167, IL33-168, IL33-169, IL33-170, IL33-171, IL33-172, IL33-175, IL33-186, IL33-187, IL33-188,IL33-158-152, IL33-167-153, IL33-158LS и IL33-167LS.

E109. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E108.

E110. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты как приведено в одной или нескольких из SEQ ID NO: 398, 399, 400 и 401.

E111. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты как приведено в SEQ ID NO: 398.

E112. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты как приведено в одной или нескольких из SEQ ID NO: 398, 399, 400 и 401.как приведено в SEQ ID NO: 399.

E113. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты как приведено в SEQ ID NO: 400.

E114. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты как приведено в SEQ ID NO: 401.

E115. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая кодирующую последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, депонированной в ATCC и имеющей номер доступа PTA-122724.

E116. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая кодирующую последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, депонированной в ATCC и имеющей номер доступа PTA-122725.

E117. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из E109-E116.

E118. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из E109-E116 или вектор по E117.

E119. Клетка-хозяин по E118, где указанная клетка представляет собой клетку млекопитающего.

E120. Клетка-хозяин по E119, где указанная клетка-хозяин представляет собой клетку CHO, клетку HEK-293 или клетку Sp2.0.

E121. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который включает культивирование клетки-хозяина по любому из E119-E120, в условиях, в которых указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент экспрессируют посредством указанной клетки-хозяина.

E122. Способ по E121, дополнительно включающий выделение указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

E123. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E108 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

E124. Способ снижения активности IL-33, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления E1-E108 или фармацевтической композиции по E123.

E125. Способ лечения воспалительного заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из E1-E108 или фармацевтической композиции по E123.

E126. Способ лечения атопического дерматита, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из E1-E108 или фармацевтической композиции по E123.

E127. Способ лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из E1-E108 или фармацевтической композиции по E123.

E128. Способ по любому из E121-E127, в котором указанным субъектом является человек.

E129. Способ по любому из E121-E128, который включает внутривенное введение указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической композиции.

E130. Способ по любому из E121-E128, который включает подкожное введение указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической композиции.

E131. Способ по любому из E121-E130, в котором указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или фармацевтическую композицию вводят приблизительно два раза в неделю, раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели, раз в четыре недели, раз в пять недель, раз в шесть недель, раз в семь недель, раз в восемь недель, раз в девять недель, раз в десять недель, два раза в месяц, раз в месяц, раз в два месяца, раз в три месяца или раз в четыре месяца.

E132. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E108 или фармацевтическая композиция по E123 для применения в качестве лекарственного средства.

E133. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-108 или фармацевтическая композиция по E123, для использования в снижении активности IL-33 у субъекта.

E134. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E108 или фармацевтическая композиция по E123 для использования в лечении воспалительного заболевания у субъекта.

E135. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из E1-E108 или фармацевтическая композиция по E123 для использования в лечении атопического дерматита у субъекта.

E136. Способ лечения медицинского состояния, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из E1-E108 или фармацевтической композиции по E123.

E137. Способ по E136, в котором состояние выбрано из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, аллергий, аллергического ринита, аллергического конъюнктивита, весеннего кератоконъюнктивита, сезонной аллергии, аллергии на домашних животных, астмы, пищевой аллергии, аллергии на арахис, атопического дерматита, хронического риносинусита с носовыми полипами (CRSwNP), аллергического ринита, бронхита, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), вирусных обострений дыхательного заболевания, вирусной инфекции у детей и взрослых, (респираторный синцитиальный вирус (RSV), риновирус, грипп), уртикарий, эозинофильного эзофагита, хронического фиброза, фиброза печени, неалкогольного стеатогепатита (NASH), хронической почечной недостаточности, идиопатического фиброза легких (IPF), склеродермии, системного склероза, острого повреждения почек, сепсиса, панкреатита, диабета 1 типа, реакции трансплантат против хозяина (GVHD), тканевого трансплантата, Альцгеймера, ревматоидного артрита: синдрома раздраженной кишки (IBS), болезни Крона, язвенного колита, рассеянного склероза, псориаза, глютеновой болезни и болезни или феномена Рейно.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1A-1C представлены диаграммы, показывающие кривые поверхностного плазмонного резонанса при связывании IL-33 с захваченным 7E8 Fab крысы. На фиг. 1A представлено связывание 7E8 Fab крысы с иммобилизованным IL-33 человека (mm2). На фиг. 1B представлено связывание 7E8 Fab крысы с иммобилизованным IL-33 человека (WT) в отсутствие восстанавливающего средства. На фиг. 1C представлено связывание 7E8 Fab крысы с иммобилизованным IL-33 человека (WT) в присутствии восстанавливающего средства (DTT).

На фиг. 2A-2B представлены изображения выравнивания последовательностей оптимизированных вариабельных областей против IL-33 с зародышевыми линиями DP-54/DPK9 человека. На фиг. 2A. представлено выравнивание VH (SEQ ID NO: 225) и VL (SEQ ID NO: 207) из IL33-158-152/IL33-158LS с последовательностями зародышевых линий DP-54/JH4 (SEQ ID NO: 7) и DPK9/JK4 (SEQ ID NO: 11) человека. На фиг. 2B представлено выравнивание VH (SEQ ID NO: 210) и VL (SEQ ID NO: 91) из IL33-167-153/IL33-167LS с последовательностями зародышевой линии DP-54/JH4 (SEQ ID NO: 7) и DPK9/JK4 (SEQ ID NO: 11) человека

На фиг. 3A-3B представлены диаграммы, показывающие связывание цитокинов с антителами по изобретению, иммобилизованными на чипе. На фиг. 3A представлено связывание цитокинов с иммобилизованным Fab IL33-158LS. На фиг. 3B представлено связывание цитокинов с иммобилизованным Fab 7E8.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антитела

«Антигенсвязывающий фрагмент» антитела относится к фрагменту полноразмерного антитела, который сохраняет способность к специфическому связыванию с антигеном (предпочтительно по существу с той же аффинностью связывания). Примеры антигенсвязывающего фрагмента включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')₂-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., 1989 Nature 341: 544-546), который состоит из домена VH; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR), связанные дисульфидом Fv (dsFv) и антиидиотипические (против Id) антитела и интраантитела. Кроме того, несмотря на то, что два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируют отдельные гены, их можно объединять, используя рекомбинантные способы, с помощью синтетического линкера, что позволяет получать их в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH образуют пары для того, чтобы формировать одновалентные молекулы (известные как одноцепочечный Fv (scFv)); см. например, Bird et al. Science 242: 423-426 (1988) и Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883. Также предусмотрены другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела,. Диатела представляют собой двухвалентные, биспецифические антитела, в которых домены VH и VL экспрессированы в одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который слишком короток для того, чтобы сделать возможным образование пар между двумя доменами одной и той же цепи, тем самым принуждая домены образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих участка (см. например, Holliger et al, 1993,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak et al., 1994, Structure 2: 1121-1123).

«Вариабельный домен» антитела относится к вариабельной области легкой цепи (VL) антитела или вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела, или отдельно или в комбинации. Как известно в данной области, каждая из вариабельных областей тяжелых и легких цепей состоит из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя определяющими комплементарность областями (CDR), и вносит вклад в формирование антигенсвязывающего участка антител.

«Определяющие комплементарность области» (CDR) можно идентифицировать в соответствии с определениями по Kabat, Chothia, совокупности определений и по Kabat и по Chothia, AbM, контактных, North и/или конформационных определений или любым способом определения CDR, хорошо известным в данной области. См., например, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд. (гипервариабельные области); Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883 (структуры структурных петель). Идентичность аминокислотных остатков в конкретном антителе, которые образуют CDR, можно определять с использованием способов, хорошо известных в данной области. Определение CDR по AbM представляет собой компромисс между Kabat и Chothia и использует программное обеспечение моделирования антител Oxford Molecular's AbM (Accelrys®). «Контактное» определение CDR основано на наблюдаемых антигенных контактах, изложенных в MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262: 732-745. «Конформационное» определение CDR основано на остатках, которые вносят энтальпийный вклад в связывание антигена (см., например, Makabe et al., 2008, J. Biol. Chem., 283: 1156-1166). North идентифицировал канонические конформации CDR с использованием другого предпочтительного набора определений CDR (North et al., 2011, J. Mol. Biol. 406: 228-256). В другом подходе, обозначаемом в настоящем описании как «конформационное определение» CDR, положения CDR можно идентифицировать в качестве остатков, которые вносят энтальпийный вклад в связывание антигена (Makabe et al., 2008, J Biol. Chem. 283: 1156-1166). Другие определения границ CDR могут не строго придерживаться одного из вышеуказанных подходов, но тем не менее будут перекрываться с по меньшей мере частью CDR по Kabat, несмотря на то, что могут быть укорочены или удлинены в свете предсказаний или экспериментальных находок в отношении того, что конкретные остатки или группы остатков или даже целые CDR не оказывают значительного влияния на связывание антигена. Как используют в настоящем описании, CDR могут относиться к CDR, определяемым любым подходом, известным в данной области, в том числе комбинациями подходов. В способах, используемых в настоящем описании, можно использовать CDR, определяемые в соответствии с любым из этих подходов. Для любого заданного варианта осуществления, содержащего больше чем один CDR, CDR (или другой остаток антитела) можно определять в соответствии с любыми из определений по Kabat, Chothia, North, расширенным, AbM, контактным и/или конформационным определениям.

Остатки в вариабельном домене нумеруют в соответствии с Kabat, который представил систему нумерации, используемую для вариабельных доменов тяжелых цепей или вариабельных доменов легких цепей для компиляции антител. См., Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. При использовании этой системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее или большее число аминокислот, соответствующее укорочению или инсерции в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать инсерцию одной аминокислоты (остаток 52a в соответствии с Kabat) после остатка 52 в H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c в соответствии с Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Kabat можно определять для данного антитела посредством выравнивания в областях гомологии последовательности антитела с последовательностью со «стандартной» нумерацией по Кэбат. Доступны различные алгоритмы присвоения нумерации по Kabat. Алгоритм, реализованный в выпуске Abysis версии 2.3.3 (www.abysis.org,) используют в настоящем описании для присвоения нумерации по Kabat вариабельным областям CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H2 и CDR-H3. AbM определение используют для CDR-H1.

Конкретные положения аминокислотных остатков в антителе также можно нумеровать в соответствии с Kabat.

Остатки «каркаса» (FR) представляют собой остатки вариабельного домена антитела, отличные от остатков CDR. Каркас домена VH или VL содержит четыре подобласти каркаса, FR1, FR2, FR3 и FR4, чередующиеся с CDR в следующей структуре: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.

«Эпитоп» относится к участку или области антигена, с которыми специфически связывается антитело, например, к участку или области, содержащим остатки, которые взаимодействуют с антителом. Эпитопы могут быть линейными или конформационными.

Антитело, которое «предпочтительно связывается» или «специфически связывается» (используют взаимозаменяемо в настоящем описании) с эпитопом, является понятием, хорошо известным в данной области, и способы определения такого специфического или предпочтительного связывания также хорошо известны в данной области. Говорят, что молекула проявляет «специфические связывание» или «предпочтительное связывание», если она реагирует или ассоциируется более часто, более быстро, с большей длительностью и/или с большей аффинностью с конкретной клеткой или веществом, чем с альтернативными клетками или веществами. Антитело «специфически связывается» или «предпочтительно связывается» с мишенью, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или с большей длительностью, чем оно связывается с другими веществами. Например, антитело, которое специфически или предпочтительно связывается с определенным эпитопом IL-33, представляет собой антитело, которое связывает этот эпитоп с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или с большей длительностью, чем оно связывается с другими эпитопами IL-33 или эпитопами не IL-33. При прочтении этого определения также понятно, что, например, антитело (или фрагмент или эпитоп), которое специфически или предпочтительно связывается с первой мишенью, может специфически или предпочтительно связываться или не связываться со второй мишенью. По существу, «специфическое связывание» или «предпочтительное связывание» не обязательно требует (хотя оно может включать) исключительное связывание. В целом, но не обязательно, упоминание о связывании обозначает предпочтительное связывание. «Специфическое связывание» или «предпочтительное связывание» включает соединение, например, белок, нуклеиновую кислоту, антитело и т. п., которое распознает и связывается с конкретной молекулой, но по существу не распознает или не связывается с другими молекулами в образце. Например, антитело или рецептор пептида, которые распознают и связываются с когнатным лигандом или партнером связывания (например, антитело против опухолевого антигена человека, которое связывает опухолевый антиген) в образце, но по существу не распознают или не связывают другие молекулы в образце, специфически связываются с этим когнатным лигандом или партнером связывания. Таким образом, при обозначенных условиях анализа, конкретный связывающий фрагмент (например, антитело или его антигенсвязывающая часть или рецептор или его связывающая лиганд часть) связывается предпочтительно с конкретной целевой молекулой и не связывается в значимом количестве с другими компонентами, присутствующими в тестовом образце.

Анализ в различных форматах можно использовать для того, чтобы отбирать антитело или пептид, которые специфически связывают молекулу, представляющую интерес. Например, твердофазный иммунологический анализ ELISA, иммунопреципитацию, BIAcore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ), активируемую флуоресценцией сортировку клеток (FACS), Octet™ (, Inc., Menlo Park, CA) и анализ вестерн-блоттинга входят в число множества анализов, которые можно использовать для того, чтобы идентифицировать антитело, которое вступает в специфическую реакцию с антигеном, или рецептор или его связывающую лиганд часть, которые специфически связываются с когнатным лигандом или партнером связывания. Обычно специфическая или избирательная реакция по меньшей мере в два раза превышает фоновый сигнал или шум и более обычно больше чем в 10 раз превышает фон, даже более конкретно, говорят, что антитело «специфически связывает» антиген, когда равновесная константа диссоциации (K_D) составляет ≤1 мкМ, предпочтительно ≤100 нМ, более предпочтительно ≤10 нМ, даже более предпочтительно, ≤100 пМ, еще более предпочтительно, ≤10 пМ и даже более предпочтительно ≤1 пМ.

Термин «конкурировать», как используют в настоящем описании по отношению к антителу, обозначает, что связывание первого антитела или его антигенсвязывающей части, с антигеном снижает последующее связывание того же антигена вторым антителом или его антигенсвязывающей частью. В целом, связывание первого антитела вызывает стерическое затруднение, конформационное изменение или связывание с общим эпитопом (или его частью) так, что происходит снижение связывания второго антитела с тем же антигеном. Стандартный конкурентный анализ можно использовать для того, чтобы определять, конкурируют ли два антитела друг с другом. Один подходящий анализ конкуренции антител включает использование технологии Biacore, которая позволяет измерять степень взаимодействий с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR), обычно с использованием системы биодатчиков (такой как система BIACORE®). Например, SPR можно использовать в анализе ингибирования конкурентного связывания in vitro для того, чтобы определять способность одного антитела ингибировать связывание второго антитела. В другом анализе для измерения конкуренции антител используют подход на основе ELISA.

Кроме того, высокопропускной процесс для «группировки» антител на основе их конкуренции описан в международной патентной заявке № WO 2003/48731. Конкуренция присутствует, если одно антитело (или фрагмент) уменьшает связывание другого антитела (или фрагмента) с IL-33. Например, можно использовать последовательный анализ конкуренции за связывание с различными антителами, которые добавляют последовательно. Первое антитело можно добавлять для поиска связывания, которое близко к насыщению. Затем добавляют второе антитело. Если связывание второго антитела с IL-33 не обнаруживают или оно значительно снижено (например, снижение по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80% или по меньшей мере приблизительно на 90%) по сравнению с параллельным анализом в отсутствие первого антитела (это значение можно принимать за 100%), два антитела считают конкурирующими друг с другом. Образцовый анализ конкуренции антител (и анализ перекрывающихся эпитопов) с помощью SPR приведен в примере 4.

«Слитый белок Fc» представляет собой белок, в котором один или несколько полипептидов функционально связаны с Fc полипептидом. Слитый Fc объединяет Fc-область иммуноглобулина с партнером слияния.

Термин «лечение» включает профилактическое и/или терапевтическое лечение. Если его вводят прежде клинической манифестации состояния, лечение считают профилактическим. Терапевтическое лечение включает, например, улучшение или снижение тяжести заболевания или уменьшение длительности заболевания.

Аффинность связывания

Аффинность связывания антитела можно выражать в виде значения K_D, которое относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело. K_D представляет собой соотношение скорости диссоциации, также называемой «скоростью диссоциации k_off», и скорости ассоциации или «скорости ассоциации k_on». Таким образом, K_D равна k_off/k_on, и ее выражают в виде молярной концентрации (M), и чем меньше K_D, тем выше аффинность связывания. Значения K_D для антител можно определять с использованием способов, общепризнанных в данной области. Один образцовый способ измерения K_D представляет собой поверхностный плазмонный резонанс (SPR), обычно с использованием системы биодатчиков, такой как система BIACORE®. Кинетический анализ BIAcore включает анализ связывания и диссоциации антигена с чипов с иммобилизованными молекулами (например, молекулами, содержащим связывающие эпитоп домены), на своей поверхности. Другой способ определения K_D антитела опосредован использованием интерферометрии биослоев, обычно с использованием технологии OCTET® (система Octet QKe, ForteBio). Альтернативно или кроме того, также можно использовать анализ KinExA® (анализ кинетического исключения), доступный в Sapidyne Instruments (Boise, Id.).

В некоторых аспектах значение K_D измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR). IL-33 можно иммобилизовать. IL-33 можно иммобилизовать на твердой поверхности. IL-33 можно иммобилизовать на чипе, например, посредством ковалентного связывания (такого как аминное сочетание). Чип может представлять собой чип датчиков CM5.

По мере связывания анализируемого вещества с лигандом, накопление белка на поверхности датчика вызывает увеличение показателя преломления. Это изменение показателя преломления измеряют в реальном времени (дискретизация в эксперименте кинетического анализа составляет 0,1 с) и результат наносят на график в виде единиц ответа (RU) в зависимости от времени (называемый сенсограммой). Что важно, генерация ответа (фонового ответа) также происходит, если имеет место различие в показателях преломления подвижного буфера и буфера образца. Этот фоновый ответ следует вычитать из сенсограммы для получения фактического ответа связывания. Фоновый ответ регистрируют посредством впрыскивания анализируемого вещества через контрольную или эталонную проточную кювету, которая не содержит лиганд или нерелевантный лиганд, иммобилизованный на поверхности датчика. Измерение ассоциации и диссоциации взаимодействия связывания в реальном времени делает возможным вычисление констант скоростей ассоциации и диссоциации и соответствующих констант сродства. Одна RU представляет связывание 1 пг белка на мм². В целом, на практике необходимо связывание больше чем 50 пг анализируемого вещества на мм² для того, чтобы создавать ответы с хорошей воспроизводимостью. Можно иммобилизовать IL-33 от 85 до 370 RU. Можно иммобилизовать IL-33 от 85 до 225 RU.

Мониторинг диссоциации антитела от IL-33 можно осуществлять в течение приблизительно 3600 с. Можно проводить SPR анализ и собирать данные между приблизительно 15°C и приблизительно 37°C. Можно проводить SPR анализ и собирать данные между приблизительно 25°C и 37°C. Можно проводить SPR анализ и собирать данные приблизительно при 37°C. Можно проводить SPR анализ и собирать данные при 37°C. Значение K_D можно измерять посредством SPR с использованием прибора BIAcore T200. Уровни SPR и аффинности можно определять посредством аппроксимации данных получаемых сенсограмм к модели 1: 1 в программном обеспечении BIAcore T200 Evaluation версии 1.0. Скорость сбора может составлять приблизительно 1 Гц.

Термин «молекула IL-33» относится к молекулам, которые демонстрируют более высокую идентичность последовательностей с IL-33 дикого типа, чем с другими членами цитокинового семейства IL-1, (такие сравнения выполняют в пределах одного и того же биологического вида). Термин молекула IL-33 включает мутанты, варианты, усечения, фрагменты, сплайсинговые варианты, видовые варианты и IL-33-подобные части слитых белков.

IL-33 получают в виде предшественника с N-концевым доменом, который отвечает за транслокацию в ядро и связывание с хроматином, и C-концевым доменом бета-трилистника из 12 тяжей, который взаимодействует с рецептором ST2 и отвечает за биологическую активность IL-33. Полноразмерная форма IL-33 человека, как представлено под номером доступа UniProtKB/Swiss-Prot O95760.1, в настоящем описании предоставлена в виде SEQ ID NO: 396.

При высвобождении IL-33 из клеток происходит отщепление N-концевого домена, ведущее к высвобождению C-концевого домена с более высокой активностью, чем таковая у полноразмерного белка. Множество различных протеаз, как эндогенных по отношению ко клеточному источнику IL-33, таких как кальпаины, так и экзогенных протеаз, происходящих из воспалительных клеток, таких как тучные клетки и нейтрофилы, может расщеплять молекулу предшественника IL-33. Точный сайт расщепления IL-33 варьирует в зависимости от протеаз, которые имеют место. Рекомбинантная форма C-концевого домена IL-33 из аминокислот 112-270 в SEQ ID NO: 396 представляет активные C-концевые формы IL-33 и приведена в виде SEQ ID NO: 1.

Структура IL-33 подсказывает, что он представляет собой белок бета-трилистник с четырьмя свободными остатками цистеина (C208, C232, C227 и C259, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 396). Свидетельства подсказывают, что IL-33 существует в активной форме, с этими четырьмя восстановленными цистеинами, и неактивной форме с дисульфидными связями между парами остатков цистеина (включая дисульфидные связи между парами C208-C259 и C227-C232), которые вероятно совпадают с существенными конформационными изменениями, в том числе разрушение в высокоаффинном сайте связывания ST2, таким образом предоставляя возможное структурное объяснение утраты связывания ST2 (Cohen et al., 2015, Nature Communications 6: 8327; doi: 10.1038/ncomms9327). Мутационное свидетельство дополнительно подсказывает, что остатки цистеина C208 и C232 также могут образовывать дисульфидную связь, которая ведет к инактивации IL-33 (Cohen et al., 2015).

Конститутивно активную форму IL-33 можно создавать посредством мутирования одного или нескольких остатков цистеина в остаток не цистеина. Обнаружено, что остаток C208 особенно важен для процесса инактивации, причем также похоже, что мутация остатка C232 придает устойчивость к инактивации. Свидетельство также подсказывает, что возможные дисульфидные связи между C208-C259 и C227-C232 не представляют собой весь источник инактивации, поскольку мутации в C227 и C259 не придают схожих уровней устойчивости к неактивности; таким образом, для IL-33 может существовать несколько паттернов формирования дисульфидных связей. (Cohen_2015).

«Активный IL-33» можно определять как молекулу IL-33, способную связывать ST2. Активный IL-33 можно определять как молекулу IL-33, в которой отсутствует одна или две внутримолекулярные ковалентные связи между парами остатков в положениях 208, 227, 232 и 259 (в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 396). Активный IL-33 можно определять как молекулу IL-33, в которой отсутствуют две внутримолекулярные ковалентные связи между парами остатков в положениях 208, 227, 232 и 259 (в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 396). В некоторых аспектах активный IL-33 представляет собой молекулу IL-33, в которой отсутствует ковалентная связь между остатками 208 и 259. В некоторых аспектах активный IL-33 представляет собой молекулу IL-33, в которой отсутствует ковалентная связь между остатками 227 и 232. В некоторых аспектах активный IL-33 представляет собой молекулу IL-33, в которой отсутствует ковалентная связь между остатками 208 и 227. В некоторых аспектах активный IL-33 представляет собой молекулу IL-33, в которой отсутствует ковалентная связь между остатками 208 и 232. В некоторых аспектах активный IL-33 представляет собой молекулу IL-33, в которой отсутствует ковалентная связь между парами остатков 208/259 и 227/232 или между парами остатков 208/232 и 227/259. Следовательно, активный IL-33 включает восстановленные формы IL-33 дикого типа и мутантные формы IL-33, в которых по меньшей мере один, два, три или четыре остатка в положениях с номерами 208, 227, 232 и 259 не являются цистеином. В некоторых аспектах по меньшей мере один из остатков 208 и 232 не является цистеином. В некоторых аспектах по меньшей мере остаток 208 не является цистеином. В некоторых аспектах по меньшей мере остатки 208 и 232 не являются цистеином. В некоторых аспектах каждый из остатков 208, 227, 232 и 259 не является цистеином. В некоторых аспектах один или несколько из остатков 208, 227, 232 и 259 представляют собой серин. Ковалентная связь может представлять собой дисульфидную связь. Вышеуказанная нумерация остатков находится в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах активный IL-33 содержит полностью восстановленную молекулу, содержащую SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах активный IL-33 содержит полностью восстановленную молекулу, содержащую SEQ ID NO: 4. В некоторых аспектах активный IL-33 содержит молекулу, содержащую SEQ ID NO: 3. В некоторых аспектах активный IL-33 содержит молекулу, содержащую SEQ ID NO: 5.

Неактивный IL-33 можно определять как молекулу IL-33, которая связывает ST2 с аффинностью по меньшей мере 10-кратно меньшей, чем активный IL-33. В некоторых аспектах неактивный IL-33 связывает ST2 с аффинностью по меньшей мере 100-кратно меньшей, чем активный IL-33. В некоторых аспектах неактивный IL-33 связывает ST2 с аффинностью по меньшей мере 1000-кратно меньшей, чем активный IL-33. В некоторых аспектах неактивный IL-33 связывает ST2 с аффинностью по меньшей мере на 4 порядка величины меньшей, чем активный IL-33. В некоторых аспектах неактивный IL-33 связывает ST2 с аффинностью по меньшей мере на 5 порядков величины меньшей, чем активный IL-33. В некоторых аспектах неактивный IL-33 содержит ковалентную связь между одной или обеими парами остатков 208/259 и 227/232. В некоторых аспектах неактивный IL-33 содержит ковалентную связь между одной или обеими парами остатков 208/232 и 227/259. В некоторых аспектах неактивный IL-33 содержит ковалентную связь между остатками 208 и 232. В некоторых аспектах неактивный IL-33 содержит ковалентную связь между остатками 208 и 259. В некоторых аспектах неактивный IL-33 содержит ковалентную связь между остатками 227 и 232. В некоторых аспектах неактивный IL-33 содержит ковалентную связь между обеими парами остатков 208/259 и 227/232. Один или несколько из остатков могут представлять собой цистеины. Одна или обе ковалентные связи могут представлять собой дисульфидную связь. Вышеуказанная нумерация остатков находится в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 396.

В некоторых аспектах IL-33 представляет собой IL-33 человека. В некоторых аспектах последовательность IL-33 дикого типа представляет собой SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах IL-33 представляет собой IL-33 крысы. В некоторых аспектах IL-33 представляет собой IL-33 мыши. В некоторых аспектах IL-33 представляет собой IL-33 примата. В некоторых аспектах IL-33 представляет собой IL-33 человекообразной обезьяны. В некоторых аспектах, IL-33 представляет собой IL-33 мартышки. В некоторых аспектах IL-33 представляет собой IL-33 яванского макака.

Измерение K_D активного IL-33 можно выполнять с использованием варианта IL-33, в котором по меньшей мере C208 заменяют на другой аминокислотный остаток. В некоторых аспектах измерение K_D активного IL-33 выполняют с использованием варианта IL-33, в котором по меньшей мере C232 заменяют на другой остаток. В некоторых аспектах измерение K_D активного IL-33 выполняют с использованием варианта IL-33, в котором заменяют по меньшей мере C208 и C232. В некоторых аспектах измерение K_D активного IL-33 выполняют с использованием варианта IL-33, в котором заменяют C208, C227, C232 и C259. В некоторых аспектах один или несколько остатков цистеина заменяют на серин.

Антитела к IL-33

В некоторых аспектах изобретение относится к антагонистическим антителам к IL-33. Высокоаффинный антагонист пути IL-33 может быть эффективным для клеток множества типов, и множества тканевых компартментов, где, как полагают, IL-33 действует на свои клетки-мишени. В некоторых аспектах антитела по изобретению могут иметь доступ к местам, где происходит высвобождение IL-33 из клеток, в частности, клеток эпителия и эндотелия. В некоторых аспектах изобретение относится к антителу к IL-33, которое может распределять по внеклеточным пространствам в легких и других тканях, может эффективно конкурировать со связыванием IL-33 с рецептором клеточной поверхности и имеет относительно длительное время полужизни с тем, чтобы было возможно нечастое дозирование. Антитела по изобретению имеют потенциал модифицировать важный путь, который обеспечивает развитие и воспаление, связанное с астмой.

Нейтрализующее или «блокирующее» антитело относится к антителу, у которого связывание с IL-33: (i) препятствует, ограничивает или ингибирует взаимодействие между IL-33 или фрагментом IL-33 и компонентом рецептора IL-33 (например, ST2, IL-1 RAcP и т. д.); и/или (ii) ведет к ингибированию по меньшей мере одной биологической функции IL-33. Анализы для определения нейтрализации посредством антитела по изобретению описаны в другом месте в настоящем описании и хорошо известны в данной области.

Настоящее изобретение предусматривает антитела, которые специфически связываются с IL-33. В некоторых аспектах изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые нейтрализуют IL-33 по меньшей мере на 50%. В некоторых аспектах изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые нейтрализуют IL-33 по меньшей мере на 60%. В некоторых аспектах изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые нейтрализуют IL-33 по меньшей мере на 70%. В некоторых аспектах изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые нейтрализуют IL-33 по меньшей мере на 80%. В некоторых аспектах изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые нейтрализуют IL-33 по меньшей мере на 90%. В некоторых аспектах изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые нейтрализуют IL-33 по меньшей мере на 95%. В некоторых аспектах изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые нейтрализуют IL-33 по меньшей мере на 96%. В некоторых аспектах изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые нейтрализуют IL-33 по меньшей мере на 97%. В некоторых аспектах изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые нейтрализуют IL-33 по меньшей мере на 98%. В некоторых аспектах изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые нейтрализуют IL-33 по меньшей мере на 99%.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно выбирать из группы, состоящей из 7E8_chimera, 9B3_chimera, 9B3_chimera_huJseg, трансплантата CDR 7E8, IL33-10, трансплантата CDR 9B3, 9B3_1, 9B3_2A, 9B3_2B, 9B3_3, 9B3_5, 9B3_7, 9B3_13, 9B3_15, 9B3_17, 9B3_22, 9B3_31V2, 9B3_36, 9B3_79, 9B3_124, 9B3_162, 7E8H/9B3K, 9B3_563, IL33-11, IL33-12, IL33-13, IL33-45, IL33-55, IL33-56, IL33-57, IL33-58, IL33-61, IL33-62, IL33-68, IL33-74, IL33-75, IL33-80, IL33-81, IL33-103, IL33-117, IL33-136, IL33-153, IL33-154, IL33-155, IL33-156, IL33-157, IL33-158, IL33-167, IL33-168, IL33-169, IL33-170, IL33-171, IL33-172, IL33-175, IL33-186, IL33-187, IL33-188, IL33-158-152, IL33-167-153, IL33-158LS и IL33-167LS, их антигенсвязывающих фрагментов и мутантов, вариантов, производных и их по существу схожих версий.

Консенсусные последовательности CDR

В некоторых аспектах CDR содержат SEQ ID NO: 257, 261, 265, 269, 272 и 276. Эти последовательности CDR включают консенсус на основе всех доступных данных (ABS+мутации+репертуар крысы), тестированных VH зародышевой линии и мутаций, которые основаны на моделировании для сохранения/усовершенствования связывания с IL-33 или снижения способности к полиреактивности или обременения последовательности, не нарушая связывание.

CDR H1: последовательность с обширным консенсусом для CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 269, на основе полноты доступной информации. Дополнительно уточненный поднабор консенсусных последовательностей для CDR H1 представляет собой SEQ ID NO: 270, включая результаты оптимизации родительских антител крысы 7E8 и 9B3 и расширенных бинарных замен (ABS). Консенсусная последовательность CDR H1 для оптимизированного 7E8 представляет собой ²⁶GF(T/E)F(S/E)(N/S)YWMY³² (SEQ ID NO: 270). Замена CDR H1 из 9B3, которая вводила мутацию S31N, или введение мутаций T28E или S30E позволяло сохранять полную активность. Мутагенез с расширенными бинарными заменами показывал сильное предпочтение к Y в положении 35 вместо остатка S зародышевой линии DP54. Консенсусная последовательность CDR H1 для оптимизированного 7E8, направленная на последовательность 9B3 в положении 31 и ABS предпочтения в положении 35, представляет собой SEQ ID NO: 271.

CDR H2: последовательность с обширным консенсусом для CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 272 на основе полноты доступной информации. Дополнительно уточненный поднабор консенсусных последовательностей для CDR H2 представляет собой SEQ ID NO: 273, включая результаты оптимизации 7E8 и 9B3 и расширенных бинарных замен (ABS). Консенсусная последовательность CDR H2 для оптимизированного 7E8 представляет собой ⁵⁰(S/A)I(T/N)(P/N)(N/D)(G/A)(G/S/H)(N/D/E)(T/K/D/E)YY(P/V/L)(D/E)SV(K/Q)G⁶⁶ (SEQ ID NO: 273). Введение мутаций S50A, G55A, G56H, N57D, N57E, T58D, T58E, D62E или K65Q позволяло сохранять активность нейтрализации IL-33 человека без существенного увеличения неспецифического связывания. N54I, N54L, N54V, N54Y и N54W позволяли сохранять активность нейтрализации IL-33 человека, но вызывали увеличенное неспецифическое связывание. Замена в CDR H2 от 9B3 к 7E8, которая вводила четыре изменения (T52N, P53N, N54D и P61L), позволяла сохранять сильную нейтрализацию IL-33 человека, но вела к снижению активности нейтрализации IL-33 яванского макака. Мутагенез с расширенными бинарными заменами демонстрировал сильное предпочтение к S, T и P в положениях 50, 52 и 53 вместо остатков N, K и Q зародышевой линии DP54, но встраивание генеративных мутаций DP54 N54D, G56S, N57E, T58K и P61V было допустимо. Консенсусная последовательность CDR H2 для оптимизированного 7E8, направленная на предпочтения ABS в положениях 52 и 53 и последовательности 9B3, допускавшие нейтрализацию IL-33 человека, представляет собой SEQ ID NO: 274. Консенсусная последовательность CDR H2 для оптимизированного 7E8, направленная на предпочтения ABS в положениях 52 и 53, представляет собой SEQ ID NO: 275.

CDR H3: последовательность с обширным консенсусом для CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 276 на основе полноты доступной информации. Дополнительно уточненный поднабор консенсусных последовательностей для CDR H3 представляет собой SEQ ID NO: 277, в том числе результаты оптимизации 7E8 и 9B3 и анализа последовательности из репертуара антител крысы, иммунизированной с использованием IL-33 человека. Консенсусная последовательность CDR H3 для оптимизированного 7E8 представляет собой ⁹⁹G(H/Y)Y(Y/S)(Y/H)(T/S/N)(S/A)YS(L/F)(G/S)Y¹¹⁰ (SEQ ID NO: 278). Введение мутаций H100Y, Y103H, T104N, T104S или S105A допускало сохранение активности нейтрализации IL-33 человека без существенного увеличения неспецифического связывания. Мутации S105D и S105N вели к утрате активности нейтрализации IL-33 человека. Замена CDR H3 от 9B3 к 7E8, которая вводила мутации Y102S, T104S, L108F и G109S, допускала сохранение сильной нейтрализации IL-33 человека, но вела к снижению активности нейтрализации IL-33 яванского макака. Встраивание последовательностей CDR H3, родственных 7E8, которые идентифицировали в репертуаре антител крысы, иммунизированной с использованием IL-33 человека, показывало, что следующие аминокислоты совместимы с высокой активностью нейтрализации IL-33 человека: R100, F101, N104, I108, A109, H110, N110, S110 и F110. Консенсусная последовательность CDR H3 для оптимизированного 7E8, направленная на последовательности 9B3, допускавшие нейтрализацию IL-33 человека, представляет собой SEQ ID NO: 279.

CDR L1: последовательность с обширным консенсусом для CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 257 на основе полноты доступной информации. Дополнительно уточненный поднабор консенсусных последовательностей для CDR L1 представляет собой SEQ ID NO: 258, в том числе результаты оптимизации 7E8 и 9B3 и расширенных бинарных замен (ABS). Консенсусная последовательность CDR L1 для оптимизированного 7E8 представляет собой ²⁴(K/R)AS(Q/H)(N/S)I(N/S)(K/S)HLD³⁴ (SEQ ID NO: 259). Мутагенез с расширенными бинарными заменами показывал сильное предпочтение H и D в положениях 32 и 34 вместо остатков зародышевой линии DPK9 Y32 и N34, но встраивание генеративных мутаций DPK9 K24R, N28S, N30S и K31S было допустимо. Замена легкой цепью 9B3 вместо легкой цепи 7E8 (которая включает вариацию последовательности легкой цепи Q27H) допускала сохранение активности нейтрализации IL-33, без привнесения неспецифического связывания. Введение мутаций N30H, K31R и H32Y допускало сохранение нейтрализации IL-33 человека, но увеличивало неспецифическое связывание, тогда как мутации N30Y, N30D, N30W, K31E и K31D снижали активность и/или привносили более сильное неспецифическое связывание. Консенсусная последовательность CDR L1 для оптимизированного 7E8, направленная на предпочтения ABS в положениях 32 и 34, без возможности вариации последовательности легкой цепи в положении 27, представляет собой SEQ ID NO: 260.

CDR L2: последовательность с обширным консенсусом для CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 261 на основе полноты доступной информации. Дополнительно уточненный поднабор консенсусных последовательностей для CDR L2 представляет собой SEQ ID NO: 262, в том числе результаты оптимизации 7E8 и 9B3 и расширенных бинарных замен (ABS). Консенсусная последовательность CDR L2 для оптимизированного 7E8 представляет собой ⁵⁰F(T/A)(N/S)(N/S)LQ(T/S)⁵⁶ (SEQ ID NO: 263). Мутагенез с расширенными бинарными заменами показывал сильное предпочтение к F в положении 50 вместо остатка A зародышевой линии DPK9, но встраивание генеративных мутаций DPK9 T51A, N52S, N53S и T56S было допустимо. Введение мутаций N52Y или N53R допускало сохранение нейтрализации IL-33 человека, но увеличивало неспецифическое связывание, тогда как мутации F50H, T56D, T56E и T56Q снижали активность и/или привносили более высокое неспецифическое связывание. Консенсусная последовательность CDR L2 для оптимизированного 7E8, не допускающая вариацию в положении 53, представляет собой SEQ ID NO: 264.

CDR L3: последовательность с обширным консенсусом для CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 265 на основе полноты доступной информации. Дополнительно уточненный поднабор консенсусных последовательностей для CDR L3 представляет собой SEQ ID NO: 266, в том числе результаты оптимизации 7E8 и 9B3 и расширенных бинарных замен (ABS). Консенсусная последовательность CDR L3 для оптимизированного 7E8 представляет собой ⁸⁹(F/Q)QY(N/Y)(N/S/Q/R)GWT⁹⁶ (SEQ ID NO: 267). Введение мутации N93Q допускало сохранение активности нейтрализации IL-33 человека без существенного увеличения неспецифического связывания, тогда как мутация N93R допускала сохранение активности нейтрализации IL-33 человека при небольшом увеличении неспецифического связывания. Мутации N92R и G94R допускали сохранение активности нейтрализации IL-33 человека, но вели к увеличению неспецифического связывания. Замена легкой цепью 9B3 вместо легкой цепи 7E8 (которая содержит вариацию последовательности легкой цепи N93S) допускала сохранение активности нейтрализации IL-33 без привнесения неспецифического связывания. Мутагенез с расширенными бинарными заменами показывал сильное предпочтение к Y и G в положениях 91 и 94 вместо остатков S и T зародышевой линии DPK9, но введение генеративных мутаций DPK9 F89Q, N92Y и N93S было допустимо. Сохранение остатка W95 J-сегмента крысы значительно предпочтительнее замены остатка W95L из JK4 человека. Консенсусная последовательность CDR L3 для оптимизированного 7E8, направленная на предпочтения ABS в положениях 91 и 94, без возможности введения R в положение 93, представляет собой SEQ ID NO: 268.

В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 257, CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 261, CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 265, CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 269, CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 272, и CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 276

В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 258, CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 262, CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 266, CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 270, CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 273, и CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 277.

В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 259, CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 263, CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 267, CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 271, CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 274, и CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 278.

В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 260, CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 264, CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 268, CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 271, CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 275, и CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 279.

В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 20, CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 21, CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 208, CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 16, CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 226, и CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 18.

В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 из SEQ ID NO: 225.

В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 из SEQ ID NO: 207.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 225. VH может содержать аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 225. VH может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 225.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 207. VL может содержать аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 207. VL может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 207.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать HC, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 244. HC может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 244.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать LC, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 209. LC может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209.

В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 20, CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 21, CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 22, CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 16, CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 211, и CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 18.

В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 из SEQ ID NO: 210.

В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 из SEQ ID NO: 91.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 210. VH может содержать аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 210. VH может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 210.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 91. VL может содержать аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 91. VL может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать HC, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 245. HC может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 245.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать LC, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO: 93. LC может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93.

Замены зародышевой линии

В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит следующие последовательности CDR тяжелой цепи: (i) CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 16, CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 226, и CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 18; и/или (ii) следующие последовательности CDR легкой цепи: CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 20, CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 21, и CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 208.

В определенных вариантах осуществления не больше чем 11 или не больше чем 10, не больше чем 9, не больше чем 8, не больше чем 7, не больше чем 6, не больше чем 5, не больше чем 4, не больше чем 3, не больше чем 2 или не больше чем 1 замену выполняют в CDR-L1, относительно SEQ ID NO: 20. В определенных вариантах осуществления не больше чем 6, не больше чем 5, не больше чем 4, не больше чем 3, не больше чем 3, не больше чем 2 или не больше чем 1 замену выполняют в CDR-L2, относительно SEQ ID NO: 21. В определенных вариантах осуществления не больше чем 8, не больше чем 7, не больше чем 6, не больше чем 5, не больше чем 4, не больше чем 3, не больше чем 3, не больше чем 2 или не больше чем 1 замену выполняют в CDR-L3, относительно SEQ ID NO: 208. В некоторых вариантах осуществления не больше чем 10, не больше чем 9, не больше чем 8, не больше чем 7, не больше чем 6, не больше чем 5, не больше чем 4, не больше чем 3, не больше чем 2 или не больше чем 1 замену выполняют в CDR-H1, относительно SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления не больше чем не больше чем 17, не больше чем 16, не больше чем 15, не больше чем 14, не больше чем 13, не больше чем 12, не больше чем 11, или не больше чем 10, не больше чем 9, не больше чем 8, не больше чем 7, не больше чем 6, не больше чем 5, не больше чем 4, не больше чем 3, не больше чем 2 или не больше чем 1 замену выполняют в CDR-H2, относительно SEQ ID NO: 211. В некоторых вариантах осуществления не больше чем 12, не больше чем 11, или не больше чем 10, не больше чем 9, не больше чем 8, не больше чем 7, не больше чем 6, не больше чем 5, не больше чем 4, не больше чем 3, не больше чем 2 или не больше чем 1 замену выполняют в CDR-H3, относительно SEQ ID NO: 18. В определенных вариантах осуществления замена(ы) не изменяет значение аффинности связывания (K_D) больше чем 1000-кратно, больше чем 100-кратно или 10-кратно. В определенных вариантах осуществления замена представляет собой консервативную замену в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1: Консервативные замены

Остаток	Консервативная замена	Остаток	Консервативная замена
	Ser	Leu	Ile, Val
Arg			Arg, Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu, Ile
Asp	Glu	Phe	Met, Leu, Tyr
Cys	Ser	Ser	Thr; Gly
Gln	Asn	Thr	Ser, Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp, Phe
His	Asn, Gln	Val	Ile, Leu
Ile	Leu, Val	Pro	-

В определенных вариантах осуществления замена представляет собой замену зародышевой линии человека, где остаток CDR заменяют на соответствующий остаток зародышевой линии человека, чтобы увеличивать содержание аминокислот человека и потенциально снижать иммуногенность антитела. Например, если используют каркас зародышевой линии человека DPK9 и образцовое антитело IL-33-158LS, то выравнивание CDR-L1 антитела IL33-158LS (SEQ ID NO: 20) и зародышевой линии человека DPK9 представляет собой следующее:

Положение	24	25	26	27	28	29	30	31	32	33	34
Зародышевая линия человека DPK9	R	A	S	Q	S	I	S	S	Y	L	N
IL33-158LS (SEQ ID NO: 20)	K	A	S	Q	N	I	N	K	H	L	D

Для положений 25 26, 27, 29, 33 и 34 остаток зародышевой линии человека и соответствующий остаток IL33-158LS представляют собой одно и то же, и замена зародышевой линии не возможна. Для положений 24, 28, 30, 31 и 32 (полужирным с подчеркиванием) остаток зародышевой линии человека и соответствующий остаток IL33-158LS различаются. Остатки IL33-158LS в этих положениях можно заменить на соответствующий остаток зародышевой линии человека DPK9, чтобы дополнительно увеличивать содержание остатков человека.

Способы и библиотеки для введения остатков зародышевой линии человека в CDR антител описаны подробно в предварительной заявке США 62/162,905 и (Townsend et al., 2015, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112(50): 15354-15359), и то и другое включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать каркас VH, содержащий каркасную последовательность VH зародышевой линии человека. Каркасная последовательность VH может быть из зародышевой линии VH3 человека, зародышевой линии VH1, зародышевой линии VH5 или зародышевой линии VH4. Предпочтительные каркасы тяжелых цепей зародышевой линии человека представляют собой каркасы, получаемые из зародышевых линий VH1, VH3 или VH5. Например, можно использовать каркасы VH из следующих зародышевых линий: IGHV3-23, IGHV3-7 или IGHV1-69 (названия зародышевых линий основаны на определении зародышевых линий IMGT). Предпочтительные каркасы легких цепей зародышевой линии человека представляют собой каркасы, получаемые из VK или Vλ зародышевых линий. Например, можно использовать каркасы VL из следующих зародышевых линий: IGKV1-39 или IGKV3-20 (названия зародышевых линий основаны на определении зародышевых линий IMGT). Альтернативно или кроме того, каркасная последовательность может представлять собой консенсусную каркасную последовательность зародышевой линии человека, такую как каркас консенсусной последовательности Vλ1 человека, консенсусной последовательности VK1, консенсусной последовательности VK2, консенсусной последовательности VK3, консенсусной последовательности зародышевой линии VH3, консенсусной последовательности зародышевой линии VH1, консенсусной последовательности зародышевой линии VH5 или консенсусной последовательности зародышевой линии VH4. Последовательности каркасов зародышевой линии человека доступны в различных публичных базах данных, таких как V-base, IMGT, NCBI или Abysis.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать каркас VL, содержащий каркасную последовательность VL зародышевой линии человека. Каркас VL может содержать одну или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций, при этом все же сохраняя функциональное и структурное сходство с зародышевой линией, из которой он получен. В некоторых аспектах каркас VL по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичен каркасной последовательности VL зародышевой линии человека. В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит каркас VL, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 аминокислотных замен, добавлений или делеций относительно каркасной последовательности VL зародышевой линии человека. В некоторых аспектах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен, добавлений или делеций имеют место только в каркасных областях. В некоторых аспектах % идентичности основан на сходстве с VL, за исключением тех частей, которые в настоящем описании определяют как CDR.

Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас DPK9 (название IMGT: IGKV1-39). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас DPK12 (название IMGT: IGKV2D-29). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас DPK18 (название IMGT: IGKV2-30). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас DPK24 (название IMGT: IGKV4-1). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас HK102_V1 (название IMGT: IGKV1-5). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас DPK1 (название IMGT: IGKV1-33). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас DPK8 (название IMGT: IGKV1-9). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас DPK3 (название IMGT: IGKV1-6). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас DPK21 (название IMGT: IGKV3-15). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас Vg_38K (название IMGT: IGKV3-11). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас DPK22 (название IMGT: IGKV3-20). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас DPK15 (название IMGT: IGKV2-28). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас DPL16 (название IMGT: IGLV3-19). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас DPL8 (название IMGT: IGLV1-40). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас V1-22 (название IMGT: IGLV6-57). Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас консенсусной последовательности Vλ человека. Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас консенсусной последовательности Vλ1 человека. Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас консенсусной последовательности Vλ3 человека. Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас консенсусной последовательности VK человека. Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас консенсусной последовательности VK1 человека. Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас консенсусной последовательности VK2 человека. Каркас VL зародышевой линии человека может представлять собой каркас консенсусной последовательности VK3 человека.

В некоторых аспектах каркас VL представляет собой DPK9. Также предсказано, что другие схожие каркасные области обеспечат благоприятные антитела по изобретению, содержащие CDR из SEQ ID NO: 257, 261 и 265; или SEQ ID NO: 258, 262 и 266; или SEQ ID NO: 259, 263 и 267; или SEQ ID NO: 260, 264 и 268; или SEQ ID NO: 20, 21 и 208; включая DPK5, DPK4, DPK1, IGKV1-5*01, DPK24, DPK21, DPK15, IGKV1-13*02, IGKV1-17*01, DPK8, IGKV3-11*01 и DPK22, которые соответственно обладают 99, 97, 97, 96, 80, 76, 66, 97, 97, 96, 76, и 74% идентичностью с FW областью DPK-9 и одним или меньше аминокислотным различием в общих структурных признаках (нумерация по Kabat) (A) остатки непосредственно под CDR (зона Верньера), L2, L4, L35, L36, L46, L47, L48, L49, L64, L66, L68, L69, L71, (B) остатки, упаковывающие цепь VH/VL: L36, L38, L44, L46, L87 и (C) канонические остатки структурной поддержки CDR L2, L48, L64, L71 (см. Lo, «Antibody Humanization by CDR Grafting», (2004) Antibody Engineering, том 248, Methods in Molecular Biology, стр. 135-159, и O'Brien and Jones, «Humanization of Monoclonal Antibodies by CDR Grafting», (2003) Recombinant Antibodies for Cancer Therapy, том 207, Methods in Molecular Biology, стр. 81-100). Особенно предпочтительными являются каркасные области DPK5, DPK4, DPK1, IGKV1-5*01, DPK24, DPK21, DPK15, обладающие 99, 97, 97, 96, 80, 76, 66% идентичностью с DPK9, соответственно, и не имеющие аминокислотных различий в этих общих структурных признаках. В некоторых аспектах % идентичности основан на сходстве с VL, за исключением тех частей, которые в настоящем описании определяют как CDR.

Остатки в CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 антител (и фрагментов) по изобретению можно замещать на соответствующие остатки зародышевой линии, как показано в таблице 2.

Таблица 2

SEQ ID		Легкая цепь
280	DPK9 CDR-L1	RASQSISSYLN
281	DPK9 CDR-L2	AASSLQS
282	DPK9 CDR-L3	QQSYSTP
283	DPK12 CDR-L1	KSSQSLLHSDGKTYLY
284	DPK12 CDR-L2	EVSNRFS
285	DPK12 CDR-L3	MQSIQLP
286	DPK18 CDR-L1	RSSQSLVYSDGNTYLN
287	DPK18 CDR-L2	KVSNRDS
288	DPK18 CDR-L3	MQGTHWP
289	DPK24 CDR-L1	KSSQSVLYSSNNKNYLA
290	DPK24 CDR-L2	WASTRES
291	DPK24 CDR-L3	QQYYSTP
292	HK102_V1 CDR-L1	RASQSISSWLA
293	HK102_V1 CDR-L2	DASSLES
294	HK102_V1 CDR-L3	QQYNSYS
295	DPK1 CDR-L1	QASQDISNYLN
296	DPK1 CDR-L2	DASNLET
297	DPK1 CDR-L3	QQYDNLP
298	DPK8 CDR-L1	RASQGISSYLA
299	DPK8 CDR-L2	AASTLQS
300	DPK8 CDR-L3	QQLNSYP
301	DPK21 CDR-L1	RASQSVSSNLA
302	DPK21 CDR-L2	GASTRAT
303	DPK21 CDR-L3	QQYNNWP
304	Vg_38K CDR-L1	RASQSVSSYLA
305	Vg_38K CDR-L2	DASNRAT
306	Vg_38K CDR-L3	QQRSNWP
307	DPK22 CDR-L1	RASQSVSSSYLA
308	DPK22 CDR-L2	GASSRAT
309	DPK22 CDR-L3	QQYGSSP
310	DPK15 CDR-L1	RSSQSLLHSNGYNYLD
311	DPK15 CDR-L2	LGSNRAS
312	DPK15 CDR-L3	MQALQTP
313	DPL16 CDR-L1	QGDSLRSYYAS
314	DPL16 CDR-L2	GKNNRPS
315	DPL16 CDR-L3	NSRDSSGNH
316	DPL8 CDR-L1	TGSSSNIGAGYDVH
317	DPL8 CDR-L2	GNSNRPS
318	DPL8 CDR-L3	QSYDSSLSG
319	V1-22 CDR-L1	TRSSGSIASNYVQ
320	V1-22 CDR-L2	EDNQRPS
321	V1-22 CDR-L3	QSYDSSN
322 323	Vλ CDR-L1	TGSSSGGSYYVS или TGSSSDVGGSYYVS
324 325	Vλ CDR-L2	ENDSNRPS или EDSNR(S/D)K(Q/G)QKPS
326 327	Vλ CDR-L3	QSWDSSA(N/T) или QSWDSSA(N/T)F(F/V)(G/V)
328 329	Vλ1 CDR-L1	SGSSSNIGNN(A/Y)V(N/H/S) или SGSSSNIIGNN(A/Y)V(N/H/S)
330	Vλ1 CDR-L2	GNN(K/N/Q)RPS
331	Vλ1 CDR-L3	AAWDDSL(N/S)G
332	Vλ3 CDR-L1	CSGD(A/V)LG(K/S)KYAH
333	Vλ3 CDR-L2	KDSERPS
334 335	Vλ3 CDR-L3	QSWDSSG(N/D/T/A) или QSWDSSG(N/D/T/A)H
336 337	VK CDR-L1	RASQSLLHSDGISSYLA или RASQGISSYLA
338	VK CDR-L2	AASSRAS
339	VK CDR-L3	QQYNSYP
340	VK1 CDR-L1	RASQGIS(N/S)YLA
341	VK1 CDR-L2	AASSLQS
342	VK1 CDR-L3	QQYNSYP
343 344	VK2 CDR-L1	RSSQSLLHSDGNTYLD или RSSQSLLHSDDGNTYLD
345	VK2 CDR-L2	(K/T)(V/I)SNR(A/F)S
346	VK2 CDR-L3	MQATQFP
347	VK3 CDR-L1	RASQS(S/V)(S/V)SSYLA
348	VK3 CDR-L2	GASTRAT
349	VK3 CDR-L3	QQY(S/N/G/H)NWP
350	DPK3 CDR-L1	RASQGIRNDLG
351	DPK3 CDR-L2	AASSLQS
352	DPK3 CDR-L3	LQDYNYPLT

Предусмотрены альтернативные последовательности для консенсусной последовательности с пропусками и без них. В положениях, где консенсус отсутствует, остатки в () представляют собой те, которые являются наиболее частыми остатками.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать каркас VH, содержащий каркасную последовательность VH зародышевой линии человека. Каркас VH может содержать одну или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций, при этом все еще сохраняя функциональное и структурное сходство с зародышевой линией, из которой он получен. В некоторых аспектах каркас VH по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичен каркасной последовательности VH зародышевой линии человека. В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит каркас VH, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 аминокислотных замен, добавлений или делеций относительно каркасной последовательности VH зародышевой линии человека. В некоторых аспектах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен, добавлений или делеций находятся только в каркасных областях. В некоторых аспектах % идентичности основан на сходстве с VH, за исключением тех частей, которые в настоящем описании определяют как CDR.

Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP54 или IGHV3-7. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP47 или IGHV3-23. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP71 или IGHV4-59. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP75 или IGHV1-2_02. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP10 или IGHV1-69. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP7 или IGHV1-46. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP49 или IGHV3-30. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP51 или IGHV3-48. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP38 или IGHV3-15. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP79 или IGHV4-39. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP78 или IGHV4-30-4. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP73 или IGHV5-51. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP50 или IGHV3-33. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP46 или IGHV3-30-3. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас DP31 или IGHV3-9. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас консенсусной последовательности VH зародышевой линии человека. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас консенсусной последовательности VH3 зародышевой линии человека. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас консенсусной последовательности VH5 зародышевой линии человека. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас консенсусной последовательности VH1 зародышевой линии человека. Каркас VH зародышевой линии человека может представлять собой каркас консенсусной последовательности VH4 зародышевой линии человека.

В некоторых аспектах каркас VH представляет собой DP-54. Также предсказано, что другие схожие каркасные области обеспечат благоприятные антитела по изобретению, содержащие CDR SEQ ID NO: 269, 272 и 276; или SEQ ID NO: 270, 273 и 277; или SEQ ID NO: 271, 274 и 278; или SEQ ID NO: 271, 275 и 278; или SEQ ID NO: 16, 226 и 18; включая DP-50, IGHV3-30*09, IGHV3-30*15, IGHV3-48*01, DP-77, DP-51, IGHV3-66*01, DP-53, DP-48, IGHV3-53*01, IGHV3-30*02 и DP-49, которые соответственно обладают 93, 92, 92, 99, 97, 97, 96, 96, 94, 94, 93, 92% идентичностью с FW областью DP-54 и одним или меньше аминокислотным различием в общих структурных признаках (нумерация по Kabat) (A) остатки непосредственно под CDR (зона Верньера), H2, H47, H48 и H49, H67, H69, H71, H73, H93, H94, (B) остатки, упаковывающие цепь VH/VL: H37, H39, H45, H47, H91, H93 и (C) канонические остатки структурной поддержки CDR H24, H71, H94 (см. Lo 2004 и O'Brien and Jones 2003). Особенно предпочтительны каркасные области DP-50, IGHV3-30*09, IGHV3-30*15, обладающие 93, 92 и 92% идентичностью с DP-54, соответственно, и не имеющие аминокислотных различий в этих общих структурных признаках. В некоторых аспектах % идентичности основан на сходстве с VH, за исключением тех частей, которые в настоящем описании определяют как CDR.

Остатки в CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 антител (и фрагментов) по изобретению можно замещать соответствующими остатками зародышевой линии, как показано в таблице 3.

Таблица 3

SEQ ID		Тяжелая цепь
353	DP54 CDR-H1	GFTFSSYWMS
354	DP54 CDR-H2	ANIKQDGSEKYYVDSVKG
355	DP47 CDR-H1	GFTFSSYAMS
356	DP47 CDR-H2	AISGSGGSTYYADSVKG
357	DP71 CDR-H1	GGSISSYYWS
358	DP71 CDR-H2	GYIYYSGSTNYNPSLKS
359	DP75 CDR-H1	GYTFTGYYMH
360	DP75 CDR-H2	GWINPNSGGTNYAQKFQG
361	DP10 CDR-H1	GGTFSSYAIS
362	DP10 CDR-H2	GGIIPIFGTANYAQKFQG
363	DP7 CDR-H1	GYTGTSYYMH
364	DP7 CDR-H2	GIINPSGGSTSYAQKFQG
365	DP49 CDR-H1	GFTFSSYGMH
366	DP49 CDR-H2	AVISYDGSNKYYADSVKG
367	DP51 CDR-H1	GFTFSSYSMN
368	DP51 CDR-H2	SYISSSSSTIYYADSVKG
369	DP38 CDR-H1	GFTFSNAWMS
370	DP38 CDR-H2	GRIKSKTDGGTTDYAAPVKG
371	DP79 CDR-H1	GGSISSSSYYWG
372	DP79 CDR-H2	GSIYYSGSTYYNPSLKS
373	DP78 CDR-H1	GGSISSGDYYWS
374	DP78 CDR-H2	GYIYYSGSTYYNPSLKS
375	DP73 CDR-H1	GYSFTSYWIG
376	DP73 CDR-H2	GIIYPGDSDTRYSPSFQG
377 378	VH консенсус CDR-H1	GFTFSSYAM(H/S) или GFTFSSYAM(H/S)WS
379 380	VH консенсус CDR-H2	GWISPNGGSTYYADSVKG или GWISPKANGGSTYYADSVKG
381	VH3 консенсус CDR-H1	GFTFSSYAMS
382 383	VH3 консенсус CDR-H2	SVISSDG(G/S)STYYADSVKG или SVISSKADG(G/S)STYYADSVKG
384	VH5 консенсус CDR-H1	GYSFTSYWI(S/G/H)
385	VH5 консенсус CDR-H2	G(R/I/S)IYPGDSDTRYSPSFQG
386	VH1 консенсус CDR-H1	GYTFTSY(A/Y)(I/M)H
387	VH1 консенсус CDR-H2	GWINP(G/Y)NGNTNYAQKFQ
388	VH4 консенсус CDR-H1	GGSISSG(N/Y)YYWS
389	VH4 консенсус CDR-H2	GYIYYSGSTYYNPSLKS
390	DPK50 CDR-L1	GFTFSSYGMH
391	DPK50 CDR-L2	VIWYDGSNKYYADSAKG
392	DPK46 CDR-L1	GFTFSSYAMH
393	DPK46 CDR-L2	VISYDGSNKYYADSVKG
394	DPK31 CDR-L1	GFTFDDYAMH
395	DPK31 CDR-L2	GISWNSGSIGYADSVKG

Предусмотрены альтернативные последовательности для консенсусной последовательности с пропусками или без них. В положениях, где консенсус отсутствует, остатки в ()представляют собой те, которые являются наиболее частыми остатками.

В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (i) VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 225, и/или (ii) VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 207. Изобретение также охватывает любую комбинацию этих последовательностей VL и VH.

В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (i) HC, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 244; и/или (ii) LC, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична SEQ ID NO: 209. Изобретение также охватывает любую комбинацию этих последовательностей HC и LC.

В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат Fc-домен. Fc-домен можно получать из IgA (например, IgA₁ или IgA₂), IgG, IgE или IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, содержат (i) VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична одному из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 32, 43, 54, 61, 72, 90, 94, 97, 101, 106, 111, 113, 118, 121, 124, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 152, 155, 158, 161, 163, 165, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 184, 186, 201, 204, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231 и 234, и/или (ii) VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична любой из SEQ ID NO: 19, 36, 47, 56, 65, 76, 81, 84, 86, 88, 91, 98, 103, 108, 115, 189, 192, 195, 198 и 207. Изобретение также охватывает любую комбинацию этих последовательностей VL и VH. В некоторых аспектах VH не является одним или несколькими, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43, 54 и 101. В некоторых аспектах VL не является одним или несколькими, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 47, 56 и 103.

Также изобретением предусмотрены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют за связывание с IL-33 человека с любым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, описанными в настоящем описании, такими как любое одно из антител, предусмотренных в настоящем описании (или его антигенсвязывающий фрагмент). Например, если связывание антитела или его антигенсвязывающей части с IL-33 человека затрудняет последующее связывание с IL-33 человека для IL33-158LS, антитело или его антигенсвязывающая часть конкурирует с IL33-158LS за связывание IL-33 человека.

Также изобретением предусмотрены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом IL-33 человека, что и любые антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, такое как любое одно из антител, предоставленных в настоящем описании, или его антигенсвязывающий фрагмент. Например, анализ конкуренции антител (и анализ перекрывающихся эпитопов) можно оценивать посредством SPR, как описано подробно в настоящем описании.

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, предусмотренные изобретением, включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fc и т. д.), химерные антитела, биспецифические антитела, гетероконъюгированные антитела, одноцепочечный Fv (ScFv), их мутанты, слитые белки, содержащие часть антитела, доменные антитела (dAb), гуманизированные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит участок узнавания антигена требуемой специфичности, в том числе гликозилированные варианты антител, варианты аминокислотных последовательностей антител и ковалентно модифицированные антитела. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут происходить от мыши, крысы, человека или из любого другого источника (включая химерные или гуманизированные антитела). В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой химерное, гуманизированное антитело или антитело человека. В определенных вариантах осуществления антитело представляет собой антитело человека. В определенных вариантах осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело.

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕПОНИРОВАНИЕ

Репрезентативные материалы по настоящему изобретению депонировали в American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA, 23 декабря 2015 года. Вектор VH-IL33-158LS, имеющий № доступа ATCC PTA-122724, содержит вставку ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела IL33-158LS, и вектор VL-IL33-158LS, имеющий № доступа ATCC PTA-122725, содержит вставку ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела IL33-158LS. Депонирование выполняли в соответствии с положениями Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and Regulations (Budapest Treaty). Это обеспечивает сохранение жизнеспособной культуры депозита в течение 30 лет от даты депонирования. Депозит доступен в ATCC на условиях Budapest Treaty и является предметом договора между Pfizer Inc. и ATCC, что обеспечивает постоянную и неограниченную доступность потомства культуры депозита для общественности после выдачи соответствующего патента США или открытого предоставления общественности любой патентной заявки США или иностранной патентной заявки, что наступит первым, и обеспечивает доступность потомства для тех, кто определен в U.S. Commissioner of Patents and Trademarks в качестве обладающего правом в соответствии с разделом 122 в 35 U.S.C. и правилами Commissioner'а, которые относятся к этому (в том числе раздел 1.14 в 37 C.F.R., с конкретной ссылкой на 886 OG 638).

Правоприобретатель по настоящей заявки согласился, что если культура материалов в депозите погибнет или будет утрачена или уничтожена при культивировании в подходящих условиях, материалы, по уведомлению, будут быстро замены на другие такие же. Доступность депонированного материала не следует толковать в качестве лицензии на практическую реализацию изобретения в нарушение прав, предоставляемых по поручению любого правительства в соответствии с его патентным законодательством.

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим любые из антител, в том числе частей антител, и модифицированных антител, описанных в настоящем описании. Изобретение также относится к способу получения любого из полинуклеотидов, описанных в настоящем описании. Полинуклеотиды можно создавать и экспрессировать известными в данной области способами.

Последовательность желаемого антитела, определенного фрагмента антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и нуклеиновую кислоту, кодирующую такое антитело или его фрагмент, можно определять с использованием стандартных способов секвенирования. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую желаемое антитело, определенный фрагмент антитела или его антигенсвязывающий фрагмент, можно вставлять в различные векторы (такие как клонирующие и экспрессирующие векторы) для рекомбинантного продуцирования и определения характеристик. Нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь, определенный фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент тяжелой цепи, и нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, определенный фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент легкой цепи, можно клонировать в один и тот же вектор или в различные векторы.

В одном из аспектов изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим аминокислотные последовательности любого из следующих антител к IL-33 и их антигенсвязывающих частей: 7E8_chimera, 9B3_chimera, 9B3_chimera_huJseg, трансплантат CDR 7E8, IL33-10, трансплантат CDR 9B3, 9B3_1, 9B3_2A, 9B3_2B, 9B3_3, 9B3_5, 9B3_7 9B3_13, 9B3_15, 9B3_17, 9B3_22, 9B3_31V2, 9B3_36, 9B3_79, 9B3_124, 9B3_162, 7E8H/9B3K, 9B3_563, IL33-11, IL33-12, IL33-13, IL33-45, IL33-55, IL33-56, IL33-57, IL33-58, IL33-61, IL33-62, IL33-68, IL33-74, IL33-75, IL33-80, IL33-81, IL33-103, IL33-117, IL33-136, IL33-153, IL33-154, IL33-155, IL33-156, IL33-157, IL33-158, IL33-167, IL33-168, IL33-169, IL33-170, IL33-171, IL33-172, IL33-175, IL33-186, IL33-187, IL33-188,IL33-158-152, IL33-167-153, IL33-158LS и IL33-167LS.

Изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим аминокислотные последовательности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают по существу тот же эпитоп, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из: 7E8_chimera, 9B3_chimera, 9B3_chimera_huJseg, трансплантата CDR 7E8, IL33-10, трансплантата CDR 9B3, 9B3_1, 9B3_2A, 9B3_2B, 9B3_3, 9B3_5, 9B3_7 9B3_13, 9B3_15, 9B3_17, 9B3_22, 9B3_31V2, 9B3_36, 9B3_79, 9B3_124, 9B3_162, 7E8H/9B3K, 9B3_563, IL33-11, IL33-12, IL33-13, IL33-45, IL33-55, IL33-56, IL33-57, IL33-58, IL33-61, IL33-62, IL33-68, IL33-74, IL33-75, IL33-80, IL33-81, IL33-103, IL33-117, IL33-136, IL33-153, IL33-154, IL33-155, IL33-156, IL33-157, IL33-158, IL33-167, IL33-168, IL33-169, IL33-170, IL33-171, IL33-172, IL33-175, IL33-186, IL33-187, IL33-188,IL33-158-152, IL33-167-153, IL33-158LS и IL33-167LS.

Изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим аминокислотные последовательности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые конкурируют за связывание с IL-33 с антителом, выбранным из группы, состоящей из: 7E8_chimera, 9B3_chimera, 9B3_chimera_huJseg, трансплантата CDR 7E8, IL33-10, трансплантата CDR 9B3, 9B3_1, 9B3_2A, 9B3_2B, 9B3_3, 9B3_5, 9B3_7 9B3_13, 9B3_15, 9B3_17, 9B3_22, 9B3_31V2, 9B3_36, 9B3_79, 9B3_124, 9B3_162, 7E8H/9B3K, 9B3_563, IL33-11, IL33-12, IL33-13, IL33-45, IL33-55, IL33-56, IL33-57, IL33-58, IL33-61, IL33-62, IL33-68, IL33-74, IL33-75, IL33-80, IL33-81, IL33-103, IL33-117, IL33-136, IL33-153, IL33-154, IL33-155, IL33-156, IL33-157, IL33-158, IL33-167, IL33-168, IL33-169, IL33-170, IL33-171, IL33-172, IL33-175, IL33-186, IL33-187, IL33-188,IL33-158-152, IL33-167-153, IL33-158LS и IL33-167LS.

Изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим один или несколько белков, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 1-279.

Изобретение относится к полинуклеотидам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, как приведено в одной или нескольких из SEQ ID NO: 398, 399, 400 и 401. Изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты как приведено в SEQ ID NO: 398. Изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты как приведено в SEQ ID NO: 399. Изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты как приведено в SEQ ID NO: 400. Изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты как приведено в SEQ ID NO: 401.

Изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему одну или обе из кодирующей последовательности вставки ДНК молекулы нуклеиновой кислоты, депонированной в ATCC и имеющей номер доступа PTA-122724, и № доступа PTA-122725. Изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, депонированную в ATCC и имеющую № доступа PTA-122724. Изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, депонированную в ATCC и имеющую № доступа PTA-122725.

Изобретение относится к клеткам, содержащим одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, как приведено в одной или нескольких из SEQ ID NO: 398, 399, 400 и 401. Изобретение относится к клеткам, содержащим одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты как приведено в SEQ ID NO: 398 и 399. Изобретение относится к клеткам, содержащим одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты как приведено в SEQ ID NO: 400 и 401.

В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотидам и их вариантам, кодирующим антитело против IL-33, где такие варианты полинуклеотидов обладают по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с любой из конкретных последовательностей нуклеиновой кислоты, раскрытых в настоящем описании. Эти количества не обозначают ограничение, и приращения между указанными процентными долями конкретно предусмотрены в качестве части раскрытия.

Изобретение относится к полипептидам, кодируемым молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления домены VH и VL или их антигенсвязывающая часть или полноразмерный HC или LC кодируют отдельные полинуклеотиды. Альтернативно и VH и VL или их антигенсвязывающую часть или HC и LC кодирует один полинуклеотид.

Настоящее раскрытие также охватывает полинуклеотиды, комплементарные любым таким последовательностям. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой молекулы ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. РНК молекулы включают молекулы HnRNA, которые содержат интроны и соответствует молекуле ДНК один-в-один, и молекулы мРНК, которые не содержат интроны. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но не обязательно, присутствовать в полинуклеотиде по настоящему раскрытию, и полинуклеотид можно, но не обязательно, связывать с другими молекулами и/или материалами подложек.

Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т. е. эндогенную последовательность, которая кодирует антитело или его часть) или могут содержать вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотидов содержат одну или несколько замен, добавлений, делеций и/или инсерций так, что иммунореактивность кодируемого полипептида не уменьшена, относительно нативной иммунореактивной молекулы. Эффект кодируемого полипептида, оказываемый на иммунореактивность, в целом, можно оценивать, как раскрыто в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления варианты обладают по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует нативное антитело или его часть. Эти количества не обозначают ограничение, и приращения между указанными процентными долями конкретно предусмотрены в качестве части раскрытия.

Две полинуклеотидные или полипептидные последовательности называют «идентичными», если последовательность нуклеотидов или аминокислот в двух последовательностях является одинаковой при выравнивании по максимальному соответствию, как описано ниже. Сравнения между двумя последовательностями обычно осуществляют посредством сравнения последовательностей в окне сравнения, чтобы идентифицировать и сравнивать локальные области сходства последовательностей. «Окно сравнения», как используют в настоящем описании, относится к сегменту из по меньшей мере приблизительно 20 смежных положений, обычно от 30 приблизительно до 75 или от 40 приблизительно до 50, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью из того же числа смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить с использованием программы MegAlign® в пакете биоинформационного программного обеспечения Lasergene® (DNASTAR®, Inc., Madison, WI), используя параметры по умолчанию. В этой программе реализовано несколько схем выравнивания, описанных в следующих источниках: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ред.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, том 5, прил. 3, стр. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes стр. 626-645 Methods in Enzymology, том 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5: 151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4: 11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11: 105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730.

В некоторых вариантах осуществления «процентную долю идентичности последовательностей» определяют посредством сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения по меньшей мере в 20 положений, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т. е. пропуски) 20% или меньше, обычно от 5 до 15% или от 10 до 12% по сравнению с эталонными последовательностями (которые не содержат добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процентную долю вычисляют посредством определения числа положений, в которых встречаются идентичные основания нуклеиновой кислоты или аминокислотные остатки в обеих последовательностях, чтобы получать число совпадающих положений, и число совпадающих положений делят на общее число положений в эталонной последовательности (т. е. размер окна) и умножают результат на 100, чтобы получать процентную долю идентичности последовательностей.

Варианты также могут быть или альтернативно по существу могут быть гомологичными нативному гену или его части или комплементу. Такие варианты полинуклеотидов способны к гибридизации при умеренно строгих условиях со встречаемой в природе последовательностью ДНК, кодирующей нативное антитело (или комплементарной последовательностью).

Подходящие «умеренно строгие условия» включают предварительное промывание в растворе 5× SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (pH 8,0); гибридизацию при 50°C-65°C, 5× SSC, в течение ночи; после чего следует промывание два раза при 65°C в течение 20 минут каждым из 2×, 0,5× и 0,2× SSC, содержащих 0,1% SDS.

Как используют в настоящем описании, «крайне строгие условия» или «условия с высокой строгостью» представляют собой те, при которых: (1) используют низкую ионную силу и высокую температуру для промывания, например, 0,015 M хлорид натрия/0,0015 M цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°C; (2) используют во время гибридизации денатурирующее средство, такое как формамид, например, 50% (об./об.) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/0,1% Ficoll/0,1% поливинилпирролидоном/50 мМ натрий-фосфатным буфером при pH 6,5 с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42°C; или (3) используют 50% формамид, 5× SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5× раствор Денхардта, обработанную звуком сперму лосося ДНК (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% декстрансульфат при 42°C, с промываниями при 42°C в 0,2× SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55°C, после чего следует промывание высокой степени строгости, состоящее из 0,1× SSC, содержащего EDTA, при 55°C. Специалист в данной области знает, как корректировать температуру, ионную силу и т. д. по мере необходимости, чтобы компенсировать такие факторы, как длина зонда и т. п.

Средние специалисты в данной области примут во внимание, что в результате вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, как раскрыто в настоящем описании. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют минимальную гомологию с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Тем не менее, полинуклеотиды, которые варьируют из-за различий в использовании кодонов, в частности, предусмотрены настоящим раскрытием. Кроме того, аллели генов, содержащих полинуклеотидные последовательности, предоставленные в настоящем описании, входят в объем настоящего раскрытия. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые изменяются в результате одной или нескольких мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Получаемые мРНК и белок могут, но не обязательно, иметь измененную структуру или функцию. Аллели можно идентифицировать с использованием стандартных способов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей из баз данных).

Полинуклеотиды по этому раскрытию можно получать с использованием химического синтеза, рекомбинантных способов или ПЦР. Способы химического синтеза полинуклеотидов хорошо известны в данной области, и здесь не требуют подробного описания. Специалист в данной области может использовать последовательности, предоставленные в настоящем описании, и коммерческий ДНК синтезатор для получения желаемой последовательности ДНК.

Для получения полинуклеотидов с использованием рекомбинантных способов, полинуклеотид, содержащий желаемую последовательность, можно вставлять в подходящий вектор, и вектор в свою очередь можно вводить в подходящую клетку-хозяина для репликации и амплификации, как дополнительно рассмотрено в настоящем описании. Полинуклеотиды можно вставлять в клетки-хозяева с помощью любого средства, известного в данной области. Клетки трансформируют посредством введения экзогенного полинуклеотида с помощью непосредственного захвата, эндоцитоза, трансфекции, F-скрещивания или электропорации. После введения экзогенный полинуклеотид может сохраняться в клетке в виде не интегрированного вектора (такого как плазмида) или интегрированного в геном клетки-хозяина. Полинуклеотид, амплифицированный таким образом, можно выделять из клетки-хозяина способами, хорошо известными в данной области. См., например, Sambrook et al., 1989.

Альтернативно, ПЦР позволяет репродуцировать последовательности ДНК. Технология ПЦР хорошо известна в данной области и описана в патентах США №№ 4683195, 4800159, 4754065 и 4683202, а также PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. ред., Birkauswer Press, Boston, 1994.

РНК можно получать с использованием выделенной ДНК в подходящем векторе и его введения в подходящую клетку-хозяина. После репликации клеток и транскрипции ДНК в РНК, РНК можно выделять с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, как приведено в, например, Sambrook et al., 1989.

Подходящие клонирующие и экспрессирующие векторы могут включать различные компоненты, такие как промотор, энхансер и другие транскрипционные регуляторные последовательности. Вектор также можно конструировать для того, чтобы сделать возможным последующее клонирование вариабельного домена антитела в различные векторы. Подходящие клонирующие векторы можно конструировать в соответствии со стандартными способами или можно отбирать из большого числа клонирующих векторов, доступных в данной области. Хотя выбранный клонирующий вектор может варьировать в соответствии с клеткой-хозяином, предположительно подлежащей использованию, эффективные клонирующие векторы в целом обладают способностью к саморепликации, могут иметь одну мишень для конкретной рестрикционной эндонуклеазы и/или могут нести гены маркера, который можно использовать при отборе клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают плазмиды и бактериальные вирусы, например, pUC18, pUC19, Bluescript (например, pBS SK+) и его производные, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, фаговую ДНК и челночные векторы, такие как pSA3 и pAT28. Эти и многие другие клонирующие векторы доступны у коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Strategene и Invitrogen. Кроме того, предусмотрены экспрессирующие векторы. Экспрессирующие векторы в целом представляют собой реплицируемые полинуклеотидные конструкции, которые содержат полинуклеотид в соответствии с раскрытием. Это подразумевает, что экспрессирующий вектор должен быть реплицируемым в клетках-хозяевах, или в качестве эписом или в качестве составной части хромосомной ДНК. Подходящие экспрессирующие векторы включают, но не ограничиваясь этим, плазмиды, вирусные векторы, в том числе аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и экспрессирующий вектор(ы), раскрытый в публикации PCT № WO 87/04462. Компоненты векторов в целом могут включать, но не ограничиваясь этим, одно или несколько из следующего: сигнальная последовательность; участок начала репликации; один или несколько маркерных генов; подходящие транскрипционные управляющие элементы (такие как промоторы, энхансеры и терминатор). Для экспрессии (т. е. трансляции) также обычно необходимы один или несколько трансляционных управляющих элементов, таких как участки связывания рибосомы, сайты инициации трансляции и терминирующие кодоны.

Векторы, содержащие полинуклеотиды, представляющие интерес, и/или сами полинуклеотиды можно вводить в клетку-хозяина с помощью любого из множества подходящих средств, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфекцию (например, где вектор представляет собой инфекционный агент, такой как вирус осповакцины). Выбор введения векторов или полинуклеотидов часто зависит от признаков клетки-хозяина.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно создавать рекомбинантно с использованием подходящей клетки-хозяина. Нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, можно клонировать в экспрессирующий вектор, который затем можно вводить в клетку-хозяина, такую как клетка E. coli, дрожжевая клетка, клетка насекомого, клетка COS обезьяны, клетка яичника китайского хомяка (CHO) или миеломная клетка, где клетка иным образом не продуцирует белок иммуноглобулина, чтобы добиваться синтеза антитела в рекомбинантной клетке-хозяине. Предпочтительные клетки-хозяева включают клетку CHO, клетку эмбриональной почки человека 293 (HEK) или клетку Sp2.0, помимо многих клеток, хорошо известных в данной области. Фрагмент антитела можно получать посредством протеолитического или другого разрушения полноразмерного антитела, рекомбинантными способами или химическим синтезом. Полипептидный фрагмент антитела, в частности, более короткие полипептиды приблизительно до 50 аминокислот, можно в целях удобства получать химическим синтезом. Способы химического синтеза белков и пептидов известны в данной области и коммерчески доступны.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению может быть аффинно зрелым. Например, аффинно зрелое антитело можно получать известными в данной области способами (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10: 779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169: 147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7): 3310-9; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226: 889-896; и WO 2004/058184).

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ И МЕДИЦИНСКАЯ ТЕРАПИЯ

В некоторых аспектах изобретение относится к терапевтическим способам ингибирования активности IL-33 с использованием антитела против IL-33 или его антигенсвязывающего фрагмента, где терапевтические способы включают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Нарушение, которое лечат, представляет собой любое заболевание или состояние, которое усовершенствуют, улучшают, ингибируют или предотвращают посредством удаления, ингибирования или снижения активности или передачи сигналов IL-33.

В некоторых аспектах нарушение представляет собой воспалительное заболевание или нарушение или состояние с по меньшей мере одним симптомом, связанным с воспалительным заболеванием или нарушением. Воспалительное заболевание или нарушение или симптом можно облегчать или снижать его тяжесть, длительность или частоту возникновения.

Аллергические, а также другие заболевания на слизистых или поверхностях организма, где могут быть эффективны антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению, включают: аллергии, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, весенний кератоконъюнктивит, сезонные аллергии, аллергию на домашних животных, астму, пищевые аллергии, аллергию на арахис, атопический дерматит, хронический риносинусит с носовыми полипами (CRSwNP), аллергический ринит, бронхит, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), вирусные обострения дыхательного заболевания, вирусные инфекции у детей и взрослых (респираторный синцитиальный вирус (RSV), риновирус, грипп), уртикарии и эозинофильный эзофагит. Заболевания с вовлечением хронического фиброза, также можно лечить антителами и их антигенсвязывающими фрагментами по изобретению. Они включают: фиброз печени, неалкогольный стеатогепатит (NASH), хроническую почечную недостаточность, идиопатический фиброз легких (IPF), склеродермию, системный склероз. Заболевания с вовлечением острого повреждения тканей также можно лечить антителами и их антигенсвязывающими фрагментами по изобретению, включая: острое повреждение почек, сепсис, панкреатит, диабет 1 типа, реакцию трансплантат против хозяина (GVHD), тканевой трансплантат. Другие хронические дегенеративные или хронические воспалительные заболевания, которые можно лечить антителами и их антигенсвязывающими фрагментами по изобретению, включают: Альцгеймера, ревматоидный артрит, воспалительные заболевания кишечника: синдром раздраженной кишки (IBS), болезнь Крона, язвенный колит. Дополнительные заболевания, которые можно лечить антителами и их антигенсвязывающими фрагментами по изобретению, включают рассеянный склероз, псориаз, глютеновую болезнь и болезнь Рейно.

Антитела и фрагменты этих антител можно вводить в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями. Дополнительные терапевтически активные соединения включают антагонисты одного или нескольких из IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, IL-25, IL-26, IL-31, IL36 IFNα, IFNγ или антагонисты соответствующих им рецепторов, НПВП, стероиды и кортикостероиды.

Антитела против IL-33 по настоящему изобретению также можно использовать для того, чтобы обнаруживать и/или измерять IL-33 или IL-33-экспрессирующие клетки в образце, например, для диагностических целей. Например, антитело против IL-33 или его фрагмент можно использовать для того, чтобы диагностировать состояние или заболевание, которое отличается аберрантной экспрессией (например, сверхэкспрессией, недостаточной экспрессией, отсутствием экспрессии и т. д.) у IL-33. Образцовые диагностические анализы для IL-33 могут включать, например, приведение образца, полученного у пациента, в контакт с антителом против IL-33 по изобретению, где антитело против IL-33 метят поддающейся обнаружению меткой или репортерной молекулой.

Как используют в настоящем описании, «фармацевтически приемлемый носитель» или «фармацевтически приемлемый эксципиент» включает любой материал, который при объединении с активным ингредиентом позволяет ингредиенту сохранять биологическую активность и который не обладает реактивностью для иммунной системы субъекта. Примеры включают, но не ограничиваясь этим, любые из стандартных фармацевтических носителей, таких как фосфатно-солевой буферный раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, и смачивающие средства различных типов. Предпочтительные разбавители для аэрозольного или парентерального введения представляют собой фосфатно-солевой буфер (PBS) или нормальный (0,9%) солевой раствор. Композиции, содержащие такие носители, формулируют хорошо известными стандартными способами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., A. Gennaro, ред., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; и Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20-е изд., Mack Publishing, 2000).

КОМПОЗИЦИИ

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно формулировать в качестве фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция дополнительно может содержать фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент и/или стабилизатор (Remington: The Science and practice of Pharmacy, 20-е из., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, ред. K. E. Hoover), в форме лиофилизированного состава или водного раствора. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы не токсичны для реципиентов в определенных дозах и концентрациях и могут содержать буферы, такие как фосфатный, цитратный, и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (меньше чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстраны; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, например, натрия; комплексные соединения с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные средства, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG). Фармацевтически приемлемые эксципиенты дополнительно описаны в настоящем описании.

Доза

Как используют в настоящем описании, «эффективная доза», «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для того, чтобы вызывать любой один или несколько полезных или желаемых результатов. Для профилактического использования полезные или желаемые результаты включают устранение или снижение риска, уменьшение тяжести или отсрочивание начала заболевания, в том числе биохимических, гистологических и/или поведенческих симптомов заболевания, его осложнений и промежуточных патологических фенотипов, представленных во время развития заболевания. Для терапевтического использования полезные или желаемые результаты включают клинические результаты, такие как снижение воспаления или одного или нескольких симптомов, возникающих в результате высокой экспрессии активного IL-33, снижение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, усиление эффекта другого лекарственного средства и/или замедление прогрессирования заболевания у пациентов. Эффективную дозу можно вводить одним или несколькими введениями. Для целей данного изобретения эффективная доза лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для выполнения профилактического или терапевтического лечения, непосредственно или опосредованно. Как понятно в клиническом контексте, эффективная доза лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может быть или может не быть достигнута в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, «эффективную дозу» можно рассматривать в контексте введения одного или нескольких терапевтических средств, и одно средство можно рассматривать как даваемое в эффективном количестве, если, в сочетании с одним или несколькими другими средствами, желательного результата достигают или он может быть достигнут.

«Индивидуумом» или «субъектом» является млекопитающее, более предпочтительно человек. Млекопитающие также включают, но не ограничиваясь этим, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних животных, приматов, лошадей, собак, кошек, мышей и крыс.

В некоторых вариантах осуществления способ или использование включает введение начальной дозы приблизительно от 0,025 мг/кг приблизительно до 20 мг/кг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической композиции по изобретению. За начальной дозой может следовать одна или несколько последующих доз. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько последующих доз можно вводить согласно любому из по меньшей мере из одного раза в неделю, одного раза в две недели, одного раза в три недели, одного раза в четыре недели, одного раза в пять недель, одного раза в шесть недель, одного раза в семь недель, одного раза в восемь недель, одного раза в девять недель, одного раза в десять недель, одного раза в одиннадцать недель или одного раза в двенадцать недель.

В некоторых вариантах осуществления способ или использование включает введение фиксированной дозы приблизительно от 0,25 мг приблизительно до 2000 мг антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в пять недель, один раз в шесть недель, один раз в семь недель, один раз в восемь недель, один раз в девять недель, один раз в десять недель, один раз в одиннадцать недель или один раз в двенадцать недель.

НАБОРЫ

Изобретение также относится к наборам или промышленному изделию, которые содержат антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, и инструкции для использования. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления предусмотрен набор или промышленное изделие, которые содержат контейнер, композиция в контейнере содержит антагонистическое антитело против IL-33, и вкладыш в упаковку содержит инструкции по введению терапевтически эффективного количества антагонистического антитела против IL-33 для лечения пациента, нуждающегося в этом.

В определенных вариантах осуществления набор может содержать и первый контейнер, содержащий высушенный белок, и второй контейнер, содержащий водный состав. В определенных вариантах осуществления включены наборы, содержащие предварительно заполненные шприцы с одной или несколькими камерами (например, жидкостные шприцы и лиошприцы).

Инструкции, относящиеся к использованию антител или их антигенсвязывающих фрагментов по изобретению, в целом включают информацию о дозе, режиме дозирования и пути введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут представлять собой стандартные дозы, упаковки без деления на дозы (например, упаковки нескольких доз) или субстандартные дозы. Инструкции, поставляемые в наборах по изобретению, обычно представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыше в упаковку (например, бумажном листе, включенном в набор), но машиночитаемые инструкции (например, инструкции, хранящиеся на магнитном или оптическом запоминающем диске) также приемлемы.

Наборы по данному изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, но не ограничиваясь этим, флаконы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, запечатанные Mylar или пластмассовые мешки) и т. п. Также предусмотрены упаковки для использования в комбинации с конкретным устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, атомизатор) или инфузионное устройство, такое как мининасос. Набор может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой мешок или флакон внутривенного раствора, имеющий стопор, прокалываемый иглой для подкожных инъекций). Контейнер также может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой мешок или флакон внутривенного раствора, имеющий стопор, прокалываемый иглой для подкожных инъекций). Контейнер дополнительно может содержать второе фармацевтически активное средство.

Наборы необязательно могут предусматривать дополнительные компоненты, такие как буферы и интерпретируемая информация. Обычно набор содержит контейнер и этикетку или вкладыш(и) в упаковку на контейнере или связанные с ним.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

«Приблизительно», когда используют в связи с поддающейся измерению числовой переменной, относится к указанному значению переменной и ко всем значениям переменной, которые находятся в пределах экспериментальной ошибки указанного значения (например, в пределах 95% доверительной области для среднего) или в пределах 10% от указанного значения, смотря что больше. Числовые диапазоны включают числа, которые определяют диапазон.

Как используют в настоящем описании, «вектор» обозначает конструкцию, которая способна доставлять и предпочтительно экспрессировать один или несколько генов или последовательностей, представляющих интерес, в клетке-хозяине. Примеры векторов включают, но не ограничиваясь этим, вирусные векторы, экспрессирующие депротеинизированную ДНК или РНК векторы, плазмиду, космиду или фаговые векторы, экспрессирующие ДНК или РНК векторы, связанные с катионными конденсирующими средствами, Экспрессирующие ДНК или РНК векторы, инкапсулированные в липосомах, и определенные эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.

Термин «идентичность», как известно в данной области, относится ко взаимосвязи между последовательностями двух или больше полипептидных молекул или двух или больше молекул нуклеиновой кислоты, как определяют посредством сравнения последовательностей. В данной области «идентичность» также обозначает степень родства последовательностей между последовательностями полипептидов или молекул нуклеиновой кислоты, в зависимости от случая, как определяют по совпадениям между строками нуклеотидных или аминокислотных последовательностей. «Идентичность» измеряет процент идентичных совпадений между двумя или больше последовательностями с использованием выравниваний с пропусками, который относится к конкретной математической модели в компьютерных программах (т. е. «алгоритмах»).

Термин «сходство» представляет собой связанное понятие, но в отличие от «идентичности», относится к мере сходства, которая включает и идентичные совпадения и совпадения с консервативными заменами. Поскольку консервативные замены применимы к полипептидам, но не молекулам нуклеиновой кислоты, сходство имеет дело только со сравнением полипептидных последовательностей. Если две полипептидные последовательности имеют, например, 10 из 20 идентичных аминокислот, а все остальные представляют собой неконсервативные замены, то процент идентичности и сходства будет в обоих случаях 50%. Если в том же примере еще 5 положений представляют собой консервативные замены, то процент идентичности остается 50%, но процент сходства составит 75% (15 из 20). Следовательно, в случае, когда имеют место консервативные замены, степень сходства между двумя полипептидными последовательностями будет выше чем, процент идентичности между этими двумя последовательностями.

ПРИМЕРЫ

Образцовые способы и материалы описаны в настоящем описании, хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем описании, также можно использовать при практической реализации или тестировании настоящего изобретения. Материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения.

ПРИМЕР 1

Выделение моноклональных антител крысы, которые связываются с IL-33 человека

Крыс Sprague-Dawley иммунизировали несколькими подкожными инъекциями рекомбинантного IL-33 человека (SEQ ID NO: 1), аминокислоты S112-T270, R&D Systems, Minneapolis, MN; № по каталогу 3625-IL/CF) в адъюванте из квасцов. Сыворотки, которые демонстрировали активность связывания с биотинилированным IL-33 человека, иммобилизовали на планшете для ELISA, покрытом стрептавидином, также осуществляли скрининг блокирования связывания 10 нг/мл биотинилированного IL-33 человека с ST2-Fc человека (SEQ ID NO: 2), который захватывали с помощью средства против Fc человека, иммобилизованного на планшете для ELISA. Для анализа активность цитокина поддерживали посредством восстановления IL-33 дикого типа с использованием дитиотреитола (DTT) или с использованием варианта IL-33 человека, mm2 (SEQ ID NO: 3), в котором все четыре остатка цистеина мутированы в серин. От крысы с наивысшим титром, гибридомах и культивируемых B-клетках, обогащенных на бусах, покрытых IL-33, осуществляли скрининг антител с активностью связывания IL-33 человека, блокирования IL-33 человека/связывания ST2-Fc и нейтрализации IL-33 человека на клетках HEK-293, стабильно экспрессирующих ST2 и плазмиду, экспрессирующую секретируемую щелочную фосфатазу под управлением NFkB-чувствительного промотора. Идентифицировали двести двадцать семь IL-33-связывающих антител, среди которых для молекулярного клонирования и последующего анализа выбирали 6 антител (30A1, 30B11, 7E8, 9B3, 12F9 и 14D8), которые также нейтрализовали связывание IL33-ST2 и активность репортерных клеток,.

ПРИМЕР 2

Клонирование вариабельных областей легких и тяжелых цепей антител крысы против IL-33

Вариабельные области тяжелых цепей и легких цепей нейтрализующих антител против IL-33 клонировали с использованием системы синтеза кДНК SMART® (Clontech Laboratories Inc. of Mountain View, California), после чего следовала ПЦР амплификация. кДНК синтезировали из 1 мкг общей РНК, выделенной приблизительно из 500000 клонированных B-клеток (14D8, 12F9) или гибридомных клеток 7E8, 9B3, 30A1, 30B11, используя набор RNEasy (Qiagen) и SMART® IIA oligo (Clontech Laboratories Inc.) с обратной транскриптазой SuperscriptII™ (Clontech Laboratories Inc.). Затем кДНК амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймера, который отжигается к последовательности SMART® IIA oligo и специфичный праймер к константной области крысы (κ крысы для легкой цепи и IgG₁ крысы для тяжелой цепи) с использованием полимеразного мастер-микса GoTaq Green (Promega). Продукты ПЦР тяжелых и легких цепей субклонировали в вектор pCR4-TOPO (Invitrogen) и определяли последовательность нуклеиновой кислоты. Этот способ полезен в том отношении, что не требуется никаких предварительных сведений о последовательности ДНК. Кроме того, получаемую последовательность ДНК не изменяют с использованием вырожденных праймеров для ПЦР.

Затем вариабельные тяжелые области клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих pSMED2, содержащий константную область человек IgG₁ (SEQ ID NO: 9), которую мутировали для устранения эффекторной функции (Leu234Ala, Leu235Ala и Gly237Ala, нумерация EU; патент США № 5624821), получая химерные тяжелые цепи. Вариабельные легкие области клонировали в экспрессирующие векторы млекопитающих pSMEN3, содержащие константную область κ человек (SEQ ID NO: 30), чтобы получать химерные легкие цепи. В случае антител 9B3, 14D8, 30A1 и 30B11 также использовали ближайшие J-сегменты κ-цепи человека (SEQ ID NO: 12, 82) для замены J-сегментов κ-цепи крысы, чтобы усовершенствовать экспрессию химерных антител.

ПРИМЕР 3

Нейтрализация IL-33 с помощью антител против IL-33 человека

Продемонстрировано шесть химерных антител, которые связывают IL-33 человека и нейтрализуют его активность в репортерном анализе на основе HEK293 ST2 NFkB-клеток, описанных в примере 1, как показано в таблице 4.

Таблица 4. Ингибирование активности IL-33 (mm2) в репортерном анализе на основе HEK293 ST2 NFkB-клеток с использованием родительских антител крысы против IL-33 и их химер крыса/человек

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 человека (mm2)	Повторения
Гибридома 7E8			0,018	3
Гибридома 9B3			0,076	3
Гибридома 30A1			0,665	3
Гибридома 30B11			0,056	3
Химера 7E8	28	31	0,049	3
Химера 9B3/hu J	40	83	0,056	3
Химера 30A1	69	71	0,270	3
Химера 30B11/hu J	78	89	0,028	3
Химера 12F9	51	53	2,71	3
Химера 14D8/hu J	59	85	2,03	3
Enzo ALX-804-728 mAb (IL33026B)			32,8% при 952 нМ	3
Enzo ALX-804-840 Nessy1 mAb			238,74	3
Abcam ab-72844 mAb, клон [4E9]			10,6% при 952 нМ	3

Химерные антитела также тестировали для того, чтобы определять их способность нейтрализовать IL-33 яванского макака, используя HEK293 ST2 NFkB анализ с вариантом IL-33 яванского макака, в котором его три остатка цистеина мутированы в серин (SEQ ID NO: 5). 7E8, 30A1 и 30B11 способны нейтрализовать IL-33 яванского макака при IC₅₀ 0,21, 2,95 и 0,20 нМ, соответственно, тогда как 12F8 и 14B8 нет, и 9B3 демонстрировал только слабую нейтрализацию (таблица 5).

Таблица 5. Ингибирование активности IL-33 яванского макака в репортерном анализе на основе ST2-NFkB клеток с использованием антител против IL-33. Антитела титровали против IL-33 яванского макака 0,1 нг/мл.

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 яванского макака	Повторения
7E8 крысы			0,21	3
9B3 крысы			23% при 20 нМ	3
30A1 крысы			2,95	3
30B11 крысы			0,20	3
9B3_chimera	40	42	35% при 20 нМ	3
12F9_chimera	51	53	3,6% при 20 нМ	3
Химера 30B11/hu J	78	89	0,11	3
Химера 14D8/hu J	59	85	11% при 20 нМ	3
ST2-Fc человека	2	0,045	3

ПРИМЕР 4

Группировка антител против IL-33 по эпитопам

Шесть нейтрализующих антител группировали в группы по эпитопам на основе конкурентного анализа, используя биодатчик Octet. Покрытые стрептавидином кончики Octet нагружали с использованием 10 мкг/мл биотин-hIL-33 (mm2) в течение 150 с, переносили в блокирующий буфер (1% BSA в PBS) на 50 с, затем переносили в лунку, содержащую одно из шести антител на 290 с для того, чтобы сделать возможным связывание первого антитела с IL-33. Затем кончики переносили во вторую лунку, содержащую второе антитело, на 290 с. Антитела оценивали как не конкурирующие, если второе антитело демонстрировало увеличение сигнала биодатчика выше того, которое вызывало первое антитело, и их оценивали как конкурирующие, если второе антитело не вызывало дополнительного увеличения сигнала (таблица 6). На основе этих данных о конкуренции, антитела 7E8, 9B3, 30A1 и 30B11 определяли группу одного эпитопа, а 12F9 и 14D8 определяли второй, не перекрывающийся эпитоп.

Таблица 6. Группировка антител против IL-33 по эпитопам с использованием биодатчика Octet

1-е Ab (ряды), 2-е Ab (колонки)	7E8	9B3	30A1	30B11	12F9	14D8
7E8	-	-	-	-	+	+
9B3	-	-	-	-	+	+
30A1	-	-	-	-	+	+
30B11	-	-	-	-	+	+
12F9	+	+	+	+	-	-
14D8	+	+	+	+	-	-
Таблица 6. Антитела последовательно связывали с IL-33-насыщенными кончиками Octet. «+» указывает на то, что второе антитело (указанное в заголовке колонки) связано в присутствии первого антитела (указанного в заголовке строки). «-» указывает на то, что не наблюдали увеличение сигнала при добавлении второго антитела.

ПРИМЕР 5

Гуманизация антител крысы против IL-33

Гуманизированные версии нейтрализующих антител крысы 7E8, 9B3, 12F9 и 30B11 создавали посредством трансплантации определяющих комплементарность областей (CDR) (обозначено далее как «с трансплантацией CDR»). CDR тяжелых цепей трансплантировали в каркасную область DP-54 человека (подгруппа VH3; SEQ ID NO: 7) с JH4-сегментом (SEQ ID NO: 8), тогда как CDR легких цепей трансплантировали в каркас DPK9 человека (подгруппа VKI; SEQ ID NO: 11) с JK4-сегментом (SEQ ID NO: 12). Гуманизированные области VH соединяли с константной областью IgG₁ человека с мутированной эффекторной функцией (SEQ ID NO: 9) и затем субклонировали в проприетарный экспрессирующий вектор для того, чтобы создавать тяжелые цепи с трансплантацией CDR SEQ ID NO: 92 (трансплантат CDR 7E8), 99 (трансплантат CDR 9B3), 104 (трансплантат CDR 12F9) и 109 (трансплантат CDR 30B11). Вторая версия 30B11 с трансплантацией CDR содержала остаток крысы (валин) в положении 71 в тяжелой цепи вместо остатка зародышевой линии аргинина, полученная тяжелая цепь имеет обозначение SEQ ID NO: 112. Гуманизированные области VL сливали с константной областью κ человека (SEQ ID NO: 13) и затем субклонировали в проприетарный экспрессирующий вектор для того, чтобы создавать легкие цепи с трансплантацией CDR SEQ ID NO: 93 (трансплантат CDR 7E8), 100 (трансплантат CDR 9B3), 105 (трансплантат CDR 12F8) и 110 (трансплантат CDR 30B11). 7E8 также трансплантировали в другие каркасы VH3 зародышевой линии (DP47, № доступа CAA78217.1; DP31, № доступа CAA78203.1; DP50, № доступа CAA78220.1), и оно имело клеточную активность и неспецифическое связывание, схожие с таковыми у 7E8 с трансплантацией CDR (SEQ ID NO: 92, 93).

Пример 6

Нейтрализация рекомбинантного и нативного IL-33 человека и рекомбинантного IL-33 яванского макака с помощью гуманизированных антител к IL-33

Показано, что 7E8, 9B3, 12F9 и 30B11 с трансплантацией CDR нейтрализуют активность IL-33 человека в HEK293 ST2 NFkB репортерном анализе, описанном в примере 1. В частности, 7E8 с трансплантацией CDR демонстрировало IC₅₀ 0,019 нМ, которая почти идентична IC₅₀ 0,024 нМ, которую демонстрировала гибридома 7E8 (таблица 7). 12F9 с трансплантацией CDR демонстрировало только частичное ингибирование в высокой концентрации (таблица 7) вместо полного ингибирования при IC₅₀ 2,71 нМ, которую наблюдали для химерного 12F9 (таблица 4). 9B3 и 30B11 с трансплантацией CDR имели значения IC₅₀ 0,520 и 0,368 нМ, соответственно (таблица 7), приблизительно 10-кратно сниженную активность относительно химерных версий этих антител (таблица 4). Вторая версия 30B11 с трансплантацией CDR, содержащая обратную мутацию R71V каркаса тяжелой цепи, демонстрировала схожее снижение активности по сравнению с химерой, IC₅₀ 0,278 нМ против 0,028 нМ (таблица 7, таблица 4).

Таблица 7: активность нейтрализации IL-33 человека (mm2) с помощью антител к IL-33 с трансплантацией CDR в HEK293 ST2 NFkB репортерном анализе

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	IC50 (нМ)	Повторения
7E8 с трансплантацией CDR	92	93	0,019	3
9B3 с трансплантацией CDR	99	100	0,520	3
12F9 с трансплантацией CDR	104	105	34% при 125 нМ	3
30B11 с трансплантацией CDR	109	110	0,368	3
30B11 с трансплантацией CDR R71V	112	110	0,278	3
ST2-Fc человека	2	0,043	3
7E8 крысы			0,024	3

Кроме того, показывали, что 7E8 с трансплантацией CDR и гибридома 7E8 имеют схожую нейтрализующую активность в ST2-NFkB репортерном анализе с IL-33 яванского макака (0,069 нМ и 0,032 нМ, соответственно; таблица 8), которая похожа на их активность в ST2-NFkB репортерном анализе с IL-33 человека (mm2) (IC₅₀ 0,043 нМ для 7E8 с трансплантацией CDR и гибридомы 7E8; таблица 8). 7E8 с трансплантацией CDR и растворимый рецептор IL-33 человека ST2-Fc демонстрировали схожую нейтрализующую активность на IL-33 человека (mm2) (0,043 нМ и 0,056 нМ, соответственно) и на IL-33 человека, который сохранял остатки цистеина дикого типа (3,21 нМ и 1,89 нМ, соответственно; таблица 8).

Таблица 8: ингибирование нейтрализации IL-33 в HEK293 ST2 NFkB анализе с помощью антител гибридомного происхождения и 7E8 с трансплантацией CDR.

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	IC50 HEK293 ST2 NFkB IL-33 человека (mm2)(нМ)	IC50 HEK293 ST2 NFkB IL-33 яванского макака (нМ)	IC50 HEK293 ST2 NFkB IL-33 человека (R&D)(нМ)
7E8			0,043	0,032	ND
9B3			0,17	2,72	ND
30A1			0,47	0,14	ND
30B11			0,038	0,084	ND
7E8 с трансплантацией CDR	92	93	0,043	0,069	3,21
ST2-Fc человека	2	0,056	0,005	1,89
Таблица 8: ингибирование нейтрализации IL-33 в HEK293 ST2 NFkB анализе с помощью родительских антител крысы гибридомного происхождения и гуманизированного 7E8 с трансплантацией CDR. Серии разведений антител тестировали против IL-33 (mm2) 0,1 нг/мл, IL-33 яванского макака 0,1 нг/мл и IL-33 человека (R&D) 2 нг/мл. Анализы проводили в трех повторениях в диапазоне доз 0,0018-30 нМ IL-33 (R&D). ND - не определяли.

ПРИМЕР 7

Нейтрализация активности нативного IL-33 из клеточных экстрактов человека с помощью антител к IL-33

Кроме того, показывали, что 7E8 с трансплантацией CDR нейтрализует активность нативного IL-33 человека, продуцируемого культивируемыми фибробластами легких человека. Ранние пассирования линии фибробластов легких человека HFL-1 (ATCC) выращивали в DMEM+10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотке (FBS)+L-глутамине/пенициллине/стрептомицине+1/100 HEPES. Когда клетки достигали конфлюентности 95-100%, среду удаляли и заменяли на ту же среду без сыворотки и инкубировали в течение 24 ч. Затем среду удаляли, заменяли на 20 нг/мл TNF-α и инкубировали в течение дополнительных 14 ч. Клетки собирали посредством трипсинизации, осаждали и замораживали в бессывороточной среде. Лизаты получали с помощью пяти циклов замораживания-оттаивания при -20°C, доводили до 10 мМ DTT и образцы центрифугировали и разводили для оценки активности IL-33. Демонстрировали, что лизаты клеток HFL-1 активировали репортерный ген NFkB в HEK293 ST2 NFkB репортерном анализе, и эту активность можно частично блокировать растворимым ST2-Fc человека (SEQ ID NO: 2) и поликлональным нейтрализующим антителом против IL-33. Активность полностью блокировали с помощью антител крысы 7E8, 9B3, 30A11 и 30B11 и химер и с помощью химерного 14D8, что указывает на то, что эти антитела могут распознавать и нейтрализовать эндогенный IL-33, продуцируемый первичными клетками человека.

Таблица 9. Ингибирование нативного IL-33 человека из лизата фибробластов легких человека с помощью антител против IL-33

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	% ингибирования 10 нМ Ab	% ингибирования 1 нМ Ab	% ингибирования 0,1 нМ Ab	Повторения
7E8			112,9	110,5	112,1	3
9B3			107,7	99,2	55,1	3
30A1			107,9	77,3	35,4	3
30B11			112,7	108,4	93,5	3
Химера 9B3	40	42	111,3	96,0	52,5	3
Химера 12F9	51	53	104,0	82,6	44,3	3
Химера 30A1/hu J	69	87	107,2	98,5	63,8	3
Химера 30B11 /huJ	78	89	109,8	109,3	101,7	3
Химера 14D8/ huJ	59	60	107,2	99,6	61,1	3
ST2-Fc человека	2	53,9	43,4	30,6	3
Поликлональное Ab против IL-33 R&D (AF3625)			84,6	-2,4	-0,9	3
Изотипический контроль IgG1 крысы			-8,2	2,5	1,9	3
Контрольный Fc человека			-11,3	-6,9	-3,5	3
Таблица 9. Лизат фибробластов легких человека (HFL-1) при 64-кратном разведении инкубировали с 0,1, 1 или 10 нМ антителами в HEK293 ST2 NFkB анализе. Отдельно лизат вызывал 3,9-кратное снижение сигнала относительно отдельно среды. Процент ингибирования вычисляют как 100 × (1 - (тестируемый образец - отдельно среда)/(отдельно лизат - отдельно среда)).

ПРИМЕР 8

Антитела против IL-33 нейтрализуют IL-33 с высокой активностью

Для того чтобы измерять аффинность связывания антитела с IL-33 в анализе, на который не влияет концентрация лиганда, ставили эксперименты с использованием системы HEK293 ST2 NFkB репортерного анализа, в которой анализ Schild'а можно выполнять для того, чтобы вычислять, независимо от анализа и концентрации лиганда, меру аффинности 7E8 к IL-33 (Arunlakshana and Schild, 1959). EC₅₀ для IL-33 определяли при нескольких концентрациях трансплантата CDR 7E8 (SEQ ID NO: 92, 93) в NFkB ST2 репортерном анализе и kB 6,01 пМ (таблица 10) для IL-33 (mm2) и 83,45 пМ для IL-33 дикого типа (R&D).

IL-33 также является мощным костимулятором продуцирования IFNγ естественными киллерными клетками в крови, когда вспомогательным стимулом является IL-12. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) человека очищали от свежей гепаринизированной крови человека с помощью Ficoll и затем обрабатывали с использованием IL-12 в течение 2 ч, после чего следовала обработка смесью IL-33 5 пМ и титрование дозы антител против IL-33. Культуральный супернатант собирали через 20 ч после добавления IL-33 и измеряли уровни IFNγ с помощью считывателя планшетов MSD (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). В PBMC человека, сходно с наблюдениями, выполненными в HEK293 ST2 NFkB репортерном анализе, ингибирование IL-33 (mm2) с использованием 7E8 давало вычисленный kB 1,04 и 6,64 пМ у двух доноров. Таким образом, кажущаяся аффинность трансплантата CDR 7E8 к IL-33 (mm2) очень высока, в диапазоне единиц пикомолей, и ниже 100 пМ для IL-33 дикого типа.

Таблица 10. Анализ Schild'а для ингибирования активности IL-33 трансплантатом CDR 7E8 в HEK293 ST2 NFkB репортерных клетках и PBMC человека

Обработка	EC50 (пМ) для HEK293 ST2 NFkB репортерных клеток, IL-33 (mm2)	EC50 (пМ) для HEK293 ST2 NFkB репортерных клеток, IL-33 (R&D Systems)	EC50 (пМ) для PBMC человека, IL-33 (mm2)
			донор 149	донор 172
Отдельно IL-33	1,0	8,4	1,0	19,7
IL-33+20 нМ 7E8	2826,5	653,4	ND	ND
IL-33+2 нМ 7E8	262,4	102,7	2826,5	1216,1
IL-33+200 пМ 7E8	29,1	25,8	262,4	399,6
IL-33+20 пМ 7E8	2,6	10,2	29,1	154,4
IL-33+2 пМ 7E8	ND	8,0	2,6	23,2
IL-33+0,2 пМ 7E8	ND	ND	0,9	15,1
Вычисленн. KB (пМ)	6,01	83,45	1,04	6,64
Таблица 10: 0,028 пМ - 55,5 нМ (n=3 повторения). ND - не определяли. Анализ Schild'а для нейтрализации IL-33 (mm2) или IL-33 дикого типа (R&D Systems) трансплантатом CDR 7E8 при конкретных концентрациях в HEK293 ST2 NFkB репортерных клетках или PBMC человека. График log([A']/[A])-1) в сравнении с -log[B], где A' представляет собой EC50 IL-33 в присутствии антитела, A представляет собой EC50 IL-33 в отсутствие антитела и B представляет собой концентрацию антитела, дает отрезок X, равный kB, аппроксимация равновесной константы для связывания антитела с IL-33.

ПРИМЕР 9

Аффинность связывания антител к IL-33 с IL-33 человека и яванского макака

Связывание с IL-33 человека и яванского макака измеряли посредством поверхностного плазмонного резонанса с использованием прибора BIAcore T200. Антитело против Fc человека иммобилизовали на чипе CM5 и захватывали антитела против IL-33. IL-33 человека (mm2) или IL-33 яванского макака пропускали над чипом на скорости 50 мкл/мин в течение 45 с. в диапазоне концентраций 3,9-125 нМ и оставляли диссоциировать на 240-1500 с. значения аффинности определяли как показано далее в таблице 11. Все антитела связывались с IL-33 человека с аффинностью в диапазоне 171-540 пМ. Захваченные химерное 12F9 и химерное 14D8 не связывались с 125 нМ IL-33 яванского макака в растворе, тогда как 7E8 с трансплантацией CDR, химерное 9B3, химерное 30A1 и химерное 30B11 связывались с IL-33 человека и яванского макака в растворенной фазе.

Таблица 11. Аффинность связывания IgG против IL-33 с IL-33 человека и яванского макака, которую измеряли посредством поверхностного плазмонного резонанса в формате с захватом IgG

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	KD (пМ) IL-33 человека (mm2)	KD (пМ) IL-33 яванского макака
Трансплантат CDR 7E8	92	93	171±21,8	142,4±4,6
Химера 9B3	40	42	456,96±56,75	835,9±42,3
Химера 12F9	51	53	408,15±46,75	Связывание отсутствует (125 нМ IL-33)
14D8 huJseg	59	85	394,45±30,45	Связывание отсутствует (125 нМ IL-33)
30A1 hu Jseg	69	87	540,3±52,2	196,5±7,8
30B11 hu Jseg	78	89	366,7±5	148,25±15,95

ПРИМЕР 10

Оценка кинетики 7E8 с использованием поверхностного плазмонного резонанса и способа KinExA™

Поскольку кажущаяся аффинность антител, измеренных в виде захваченных IgG, значительно ниже их активности при нейтрализации IL-33 в растворенной фазе (пример 11), использовали два альтернативных подхода к определению аффинности. Для того чтобы устранять влияние двухвалентного представления двух связывающих плеч молекулы IgG, одновалентные Fab-фрагменты антител против IL-33 получали посредством расщепления 7E8 с трансплантацией CDR (SEQ ID NO: 92, 93) папаином. Аффинность Fab-фрагмента измеряли двумя способами, посредством поверхностного плазмонного резонанса с использованием прибора BIAcore, с Fab или IL-33, захваченными на чипе, и равновесных измерений аффинности в растворе с использованием прибора KinExA, для Fab и IL-33 в растворе.

Эксперименты поверхностного плазмонного резонанса проводили в двух форматах. Когда 7E8 Fab захватывали с помощью набора для захвата против Fab человека (GE Healthcare №, по каталогу 28958325), аффинность (таблица 12) измеряли при 249,5 пМ для IL-33 (mm2) и 290 пМ для IL-33 (R&D), сходно с результатами, которые получали с использованием IgG, захваченного в схожем формате (таблица 11). Однако когда биотинилированный hIL-33 (mm2) захватывали на покрытом стрептавидином биодатчике BIAcore и на поверхность датчика впрыскивали серию титрований 7E8 Fab, измеряли аффинность 7E8 Fab к IL-33 (mm2), которая составляла 3,06 пМ (таблица 12). Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, различие в результатах между двумя форматами может возникать из-за эффектов матрицы, например, при pH 7,4 ожидают притяжение положительно заряженного Fab (pI 8,52) в растворе к отрицательно заряженному чипу датчика CM5, как и отталкивание отрицательно заряженного IL-33 в растворе (pI 5,2 для IL-33 mm2, 4,45 для IL-33 WT и 5,48 для биотинилированного IL-33 mm2) и отрицательно заряженного чипа датчика CM5 (Drake et al. 2012, Anal. Biochem. 429(1): 58-69). Принципиально другой подход к измерению аффинности описан далее в примере 10.

Для того, чтобы оценивать связывание 7E8 с IL-33 дикого типа, рекомбинантный белок IL-33 с остатками цистеина дикого типа (SEQ ID NO: 4) ковалентно связывали с чипом датчика CM5 (№ по каталогу BR100530, GE Healthcare) с использованием набора для аминного сочетания (№ по каталогу BR100050, GE Healthcare) в соответствии с протоколом производителя. Осуществляли параллельные исследования с не восстановленным IL-33 и с образцами IL-33, которые восстанавливали с использованием 3 мМ DTT в течение 3 ч. при комнатной температуре перед иммобилизацией. Схожие уровни IL-33 иммобилизовали (293 и 370 резонансных единиц, соответственно, для не восстановленного и восстановленного IL-33). Проточную кювету 1 активировали и блокировали для применения в качестве эталонной проточной кюветы. Осуществляли серию титрований родительского Fab 7E8 крысы с использованием 10 мМ HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% P-20 (HBS-EP+) в качестве подвижного буфера и буфера образца, при скорости потока 50 мкл в минуту. Мониторинг диссоциации осуществляли в течение 3600 с. Анализ кинетики Biacore проводили при 37°C и скорости сбора 1 Гц на приборе Biacore T200 (GE Healthcare). Константы скорости и аффинности определяли посредством аппроксимации полученных данных сенсограмм к модели 1: 1 в программном обеспечении BIAcore T200 Evaluation версии 1.0 (GE Healthcare). Измеряли аффинность 7E8 Fab крысы к IL-33 человека дикого типа, который предварительно обрабатывали с использованием DTT, которая составляла 44,23 пМ (таблица 12), хотя 7E8 Fab не связывался с не восстановленным IL-33 (фиг. 1). Это наблюдение указывает на то, что 7E8 избирательно связывает активный IL-33 и не связывает IL-33, который инактивирован посредством окисления, и указывает на то, что в терапевтической ситуации присутствие инактивированного IL-33 не будет препятствовать способности производного 7E8 антитела связывать активный IL-33.

Таблица 12. Аффинность связывания 7E8 Fab с IL-33 человека, измеренная посредством поверхностного плазмонного резонанса в формате с захватом Fab и с иммобилизованным IL-33

	Захваченный Fab, IL-33 в растворе	Иммобилизованный IL-33; Fab в растворе
Лиганд	ka (1/Мс) ± SEM	KD (1/с) ± SEM	KD (пМ) ± SEM (n)	ka (1/Мс)	KD (1/с)	KD (пМ) ± SEM (n)
Hu IL-33 mm2	1,38E+06±7,00E+05	3,01E-04±6,50E-06	249,5±120,5 (2)	5,47E+06±7,95E+05	1,68E-05±3,20E-06	3,06±0,14 (2)
Восстановленный Hu IL-33 WT	2,06E+06±1,12E+06	3,77E-04±3,20E-05	290±143 (2)	2,55E+06±2,22E+05	1,16 E-04±1,18E-05	44,23±5,25 (3)
Не восстановленный Hu IL-33 WT	ND	Связывание отсутствует
Таблица 12. Аффинность связывания 7E8 Fab с IL-33 человека, измеренная посредством поверхностного плазмонного резонанса. Fab в растворенной фазе тестировали при 0,78-12,5 нМ и IL-33 в растворенной фазе тестировали при 0,78-25 нМ.

Для того чтобы разобраться с зависящими от формата различиями в аффинности, измеряемой посредством поверхностного плазмонного резонанса при различных ориентациях реактивов, принципиально другой способ использовали для того, чтобы оценивать аффинность 7E8 Fab к IL-33, с обоими партнерами связывания в растворе. Прибор для анализа кинетического исключения (KinExA) (модель 3200, Sapidyne) использовали для того, чтобы определять аффинность связывания 7E8 Fab с huIL-33 (mm2) (SEQ ID NO: 3) и huIL33wt (SEQ ID NO: 4). HuIL33wt восстанавливали в 3 мМ DTT в течение минимум двух часов перед использованием. Определение аффинности выполняли при комнатной температуре с использованием формата анализа с фиксированным антигеном. Равновесного связывания достигали посредством инкубации при 25°C в течение 72 ч. Анализ данных осуществляли с использованием программного обеспечения KinExA Pro версии 3.6.5 (Sapidyne). Модель «стандартной аффинности» использовали для того, чтобы анализировать данные и определять кажущиеся KD и кажущиеся активные концентрации huIL33 mm2 и восстановленного huIL33wt. «Коррекцию дрейфа» использовали, когда это подходило. В независимых экспериментах получали несколько кривых, рецепторных и K_D контролируемых, и проводили анализ с использованием инструмента «n-curve analysis», чтобы получать глобальные значения наилучших соответствий для K_D и активной концентрации. Программное обеспечение сообщает о каждом значении наилучшего соответствия вместе с 95% доверительной областью. Анализ KinExA показывал, что 7E8 Fab связывает IL-33 человека с очень высокой аффинностью, с измеренной K_D 0,35 пМ для формы mm2 hIL-33 и 4,04 пМ для восстановленной формы WT (таблица 13). Эти результаты находятся в соответствии с результатами клеточных анализов, которые проводили с использованием анализа Schild'а (пример 8), которые показывали, что в равновесных условиях в растворе трансплантат CDR 7E8 связывается с IL-33 в растворе с низкой пикомолярной аффинностью.

Таблица 13. Аффинность 7E8 Fab к IL-33 человека (mm2) и IL-33 человека (WT), измеренная с помощью KinExA

Форма IL-33	KD (пМ)	Процентная ошибка
huIL-33 (mm2)	0,351 (0,202-0,526)	1,36
hu IL-33 (WT+DTT)	4,04 (2,60-5,76)	0,90

Таблица 13. Определение аффинности выполняли с использованием анализа в формате с фиксированным антигеном. 7E8 Fab титровали от 15 фМ до 0,25 нМ при фиксированных концентрациях huIL-33 (mm2) 4 пМ и 100 пМ и титровали от 244 фМ до 2 нМ при фиксированных концентрациях hu IL-33 (WT) 100 пМ и 500 пМ. 95% доверительную область, приведенную в круглых скобках вместе с K_D, и процентную ошибку вычисляют с помощью программного обеспечения KinExA на основе аппроксимации способом наименьших квадратов теоретического уравнения связывания к измеряемым сигналам.

ПРИМЕР 11

Определение паратопов антител против IL-33 с помощью расширенных бинарных замен

Использовали три способа идентификации аминокислот, критичных для функции антитела 7E8. В первом осуществляли систематическое исследование остатков CDR, которые различаются между последовательностями CDR mAb крысы и последовательностями CDR зародышевой линии человека для того, чтобы определять, в каких положениях необходима исходная последовательность крысы и в каких допустимы изменения. Этот способ направлен на последовательности в CDR-H1 и CDR-H2 тяжелой цепи и CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 легкой цепи. Второй способ (пример 12) направлен на допустимость вариаций последовательности CDR-H3, которые не кодирует зародышевая линия. Вариации последовательностей, присутствующие в селезеночных B-клетках иммунизированной крысы, от которой получали родительское 7E8, определяли с помощью секвенирования нового поколения (NGS) и определяли частоту вариаций в каждом положении CDR-H3. Функцию поднабора вариантов последовательностей CDR тестировали для того, чтобы определять влияние наблюдаемых изменений последовательностей. Третий способ, в котором исследовали функциональные остатки CDR, состоял в исследовании конкретных сконструированных аминокислотных вариантов в процессе конструирования антител (см. примеры 14-16).

Описан способ определения критических остатков CDR, с помощью которого функциональный варианты антител выбрана из библиотеки, содержащей или остаток зародышевой линии человека или соответствующий остаток грызуна в каждом положении CDR, за исключением CDR-H3 (Townsend et al., 2015). Конструировали фаговую библиотеку scFv, в которой все положения CDR в 7E8, которые отличались от зародышевой линии человека (DP54/DPK9), рандомизировали так, что приблизительно 50% клонов кодировали аминокислоту 7E8 крысы и приблизительно 50% кодировали аминокислоту зародышевой линии человека в этом положении (таблица 14). Получали библиотеки и проводили 3-4 раунда отбора на IL-33 человека (mm2). Извлекали клоны, которые сохраняли связывание с IL-33, и определяли их последовательности. В этом эксперименте положения, в которых последовательность человека наблюдали меньше чем приблизительно в 20% связывающих клонов, определяли как важные остатки крысы. Остатки крысы предпочтительно сохраняли в 11 положениях (остатки тяжелых цепей Y35, S50, T52 и P53; остатки легких цепей H32, D34, F50, N53, Y91, G94 и W95), что указывает на то, что замена этих остатков на остатки зародышевой линии человека крайне неблагоприятна. Замену F50 в легкой цепи на A не наблюдали, что указывает на то, что F является крайне предпочтительной аминокислотой в этом положении. Остатки крысы и человека встречали со схожей частотой в остатках тяжелых цепей 54 (N/D), 56 (G/S), 57 (N/E), 58 (T/K) и 61 (P/V) и остатках легких цепей 24 (K/R), 28 (N/S), 30 (N/S), 31 (K/S), 52 (N/S), 56 (T/S), 89 (F/Q), 92 (N/Y) и 93 (N/S), что указывает на то, что последовательность крысы в этих положениях не является критичной. Положение 51 в легкой цепи кодировало остаток треонина в клоне 7E8 крысы, но предпочтителен аланин, кодируемый последовательностью зародышевой линии человека DPK9, который встроен у 86% связывающих клонов (таблица 14). Хотя начальная частота аланиновых кодонов в положении 51 в библиотеке составляла 68%, что больше, чем у большинства, но схоже с несколькими другими остатками, другие положения со схожим начальным смещением (например, 65% аргининовых кодонов в положении L24 и 63% сериновых кодонов в положении L30 в начальной библиотеке) имели почти равное распределение аминокислот в отобранных клонах. Это наблюдение подсказывает, что аланин является крайне предпочтительным в положении 51.

Таблица 14. Частота встраивания аминокислот человека в положениях CDR 7E8, которые тестировали посредством расширенных бинарных замен

Сайт	Аминокислота из 7E8 крысы	Аминокислота зародышевой линии человека	% человеческих в начальной библиотеке	% человеческих связывающих клонов
H35	Y	S	52	5,88
H50	S	N	37	7,84
H52	T	K	51	2,6
H53	P	Q	48	5,22
H54	N	D	56	43,13
H56	G	S	40	49,0
H57	N	E	54	48,36
H58	T	K	53	51,63
H61	P	V	47	48,36
L24	K	R	65	48,36
L28	N	S	52	42,48
L30	N	S	63	49,67
L31	K	S	36	33,98
L32	H	Y	42	16,99
L34	D	N	41	13,72
L50	F	A	55	0
L51	T	A	68	86,27
L52	N	S	47	48,36
L53	N	S	46	20,26
L56	T	S	45	59,48
L89	F	Q	56	54,25
L91	Y	S	43	16,33
L92	N	Y	52	54,9
L93	N	S	65	49,01
L94	G	T	56	20,26
L95	W	L	36	7,10

Таблица 14. Сайты пронумерованы как в вариабельных областях тяжелых цепей (H) или легких цепей (L) на основе SEQ ID NO: 94 и SEQ ID NO: 91, соответственно.

ПРИМЕР 12

Допустимые вариации в последовательностях CDR-H3 антитела против IL-33 у крыс, иммунизированных с использованием IL-33 человека.

Допустимость вариаций последовательности CDR H3 в антителах, родственных IL-33 нейтрализующим антителам, описанным в примере 1, исследовали посредством секвенирования иммунного репертуара того же животного, у которого получали антитела. РНК выделяли из ткани селезенки от иммунизированной крысы, подготавливали посредством RACE ПЦР с обратной транскрипцией, как описано в примере 2, и подвергали секвенированию нового поколения на приборе Roche FLX+. Среди 62484 ридов последовательностей идентифицировали наборы из генов VH с последовательностями CDR3, родственными таковым из нейтрализующих антител в примере 1. В наборе уникальных последовательностей CDR3 вычисляли частоты, с которыми аминокислоты отклонялись от последовательностей нейтрализующих антител в каждом положении, без корректировки по частоте каждой последовательности CDR3 в популяции (таблица 15). Высоко консервативные последовательности в CDR3 из 7E8 и 9B3 (<15% вариаций в не взвешенном образце) представляли собой G99, H100, Y101, Y103, S105, Y106 и S107. Вариации в Y106 не наблюдали среди 72 вариантов последовательностей, идентифицированных в репертуаре крысы, и вариации в Y103, S105 и S107 наблюдали меньше чем в 3 процентах последовательностей.

Таблица 15: Частота аминокислотных отличий от CDR-H3 7E8 и 9B3, найденных среди вариантов, присутствующих в иммунном репертуаре иммунизированной крысы

CDR H3 из 7E8	G99	H100	Y101	Y102	Y103	T104	S105	Y106	S107	L108	G109	Y110
Частота отличий от 7E8	4,2	6,9	8,3	27,8	1,4	73,6	1,4	0	2,8	87,5	65,3	30,6
CDR H3 из 9B3	G99	H100	Y101	S102	Y103	S104	S105	Y106	S107	F108	S109	Y110
Частота отличий от 9B3	4,2	6,9	8,3	73,6	1,4	31,9	1,4	0	2,8	25	97,2	30,6

Таблица 15. Числа представляют частоты аминокислотных замен, наблюдаемых в каждом положении CDR H3 в наборе уникальных последовательностей CDR H3, родственных 7E8 и 9B3, которые идентифицированы в репертуаре иммунизированной крысу, у которой получали это антитела. Частота, с которой заданную последовательность CDR H3 наблюдали в репертуаре, не учитывали при этом вычислении.

Поднабор последовательностей CDRH3, родственных 9B3 и 7E8, который представлен в таблице 16, клонировали в каркас тяжелой цепи химерного 9B3, создавая тяжелые цепи, обозначенные как SEQ ID NO: 116, 120, 123, 125, 128, 131, 134, 137, 140, 143, 146, 149, 151, 154, 157 и 160. Эти тяжелые цепи трансфицировали совместно с химерной легкой цепью 9B3 (SEQ ID NO: 117) и получаемые антитела экспрессировали, очищали и анализировали по скорости диссоциации с IL-33 с помощью анализа BIAcore и ингибированию передачи сигнала IL-33 в HEK293 ST2 NFkB репортерном анализе. Скорости диссоциации измеряли после связывания с 125 нМ IL-33 (mm2) с использованием интактного IgG, захваченного иммобилизованным антителом против Fc человек, как описано в примере 9. Оба анализа показывали, что большинство вариантов последовательностей CDRH3, присутствующих в репертуаре крысы, вносили небольшое или нулевое изменение в скорость диссоциации или активность нейтрализации по сравнению с таковыми у родительского 9B3, что показывает, что наблюдаемые вариации последовательностей представляют собой вполне допустимые изменения. Скорости диссоциации всех 18 тестированных антител находились в пределах 2,5 крат от таковой у 9B3. Снижение клеточной активности вплоть до 4-кратного наблюдали у четырех из 18 антител. Более крупные изменения активности нельзя приписывать конкретным единичным изменениям, поскольку все четыре из этих антител содержали мутации, наблюдаемые в других вариантах с минимальными функциональными эффектами. Замена двух высоко консервативных аминокислот на химически схожие боковые цепи (замена ароматической боковой цепи Y101F в антителе 9B3-22 и замена положительно заряженной боковой цепи H100R в антителе 9B3-7) не вела к значительным изменениям в функции антитела в контексте дополнительных замен в этих антителах. В совокупности, вариации аминокислотных последовательностей, наблюдаемые в иммунизированном репертуаре, подсказывают, что остатки G99, H100, Y101, Y103, S105, Y106 и S107 или остатки с химически схожими боковыми цепями благоприятны в CDR H3 антитела 9B3 и близкородственного ему 7E8.

Таблица 16. Активность нейтрализации IL-33 и скорости диссоциации вариантов химеры 9B3, содержащих CDR-H3, идентифицированные в репертуаре иммунизированной крысы.

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	Частота	конец FW3 (нижний регистр)+CDR H3	IC50 (нМ), оцениваемая в HEK293 ST2 NFkB анализа	Скорость диссоциации (KD; 1/с)
9B3-1	116	117	1	cakGHYYYSSYSLGY	0,039	5,69E-04
9B3-2A	120	117	2	cakGHYSYSSYSFGY	0,056	4,37E-04
9B3-2B	123	117	2	cvkGHYSYSSYSIDY	0,048	5,06E-04
9B3-3	125	117	3	cakGHYSYSSYSIDY	0,048	4,24E-04
9B3-5	128	117	5	cakGHYSYTSYSFGY	0,106	3,25E-04
9B3-7	131	117	7	cakGRYYYSSYSFAY	0,069	5,89E-04
Химера 9B3 huJseg	40	83	8	cakGHYSYSSYSFSY	0,061	4,51E-04
9B3-13	134	117	13	carGHYYYNSYSFAH	0,175	3,26E-04
9B3015	137	117	15	cakGHYSYSSYSFAN	0,101	4,79E-04
9B3-17	140	117	17	caeGHYYYSSYSFGS	0,040	5,09E-04
9B3-22	143	117	22	cakGHFSYTSYSFAN	0,153	5,31E-04
9B3-31v2	146	117	31	cakGHYYYSSYSFAF	0,202	7,06E-04
9B3-36	149	117	36	cakGHYYYTSYSFAY	0,251	2,89E-04
9B3-79	151	117	79	carGHYYYTSYSFAY	0,063	5,43E-04
9B3-124	154	117	124	cakGHYYYTSYSLGF	0,081	3,98E-04
9B3-162	157	117	162	cakGHYYYSSYSFGY	0,067	6,42E-04
7E8H/9B3K	28	117	234	cakGHYYYTSYSLGY	0,015	3,85E-04
9B3-563	160	117	563	cakGHYYYSSYSFAY	0,177	1,09E-03

Таблица 16. Активность нейтрализации IL-33 и скорость диссоциации вариантов химеры 9B3, содержащих CDR-H3, идентифицированные в репертуаре иммунизированной крысы. Частота относится к числу раз, когда последовательность CDR3 получали в цикле секвенирования нового поколения из репертуара иммунизированной крысы. Последовательности, отличающиеся от 9B3, показаны полужирным начертанием с подчеркиванием. Последовательности на C-конце каркаса 3 показаны в нижнем регистре.

ПРИМЕР 13

Оценка неспецифического связывания антител против IL-33

Существует предположение, что неспецифическое связывание антител с молекулами, отличными от своих мишеней, является механизмом быстрого клиренса in vivo ( et al., 2010, MAbs 4(6): 753-760). Доказательство такого полиреактивного связывания вне мишени можно получать через измерение связывания с препаратами мембран (Xu et al., 2013, Protein Eng. Des. Select. 26(10): 663-70;), бакуловирусными частицами ( et al., 2012, mAbs 4: 753-60) или отрицательно заряженными субстратами, такими как ДНК, инсулин и гепарин (Tiller et al., 2008,J. Immunol. Methods 329(1-2): 112-124).

В ELISA для ДНК и инсулина использовали протокол низкой степени строгости, исходно разработанный для обнаружения низкоаффинных аутоантител от пациентов с волчанкой (Tiller et al., 2008). Планшеты для ELISA Nunc Maxisorp покрывали инсулином 5 мкг/мл или одноцепочечной или двухцепочечной ДНК 10 мкг/мл в PBS в течение ночи. Лунки промывали 3× водой, затем блокировали буфером для ELISA (PBS/0,05% Tween/1 мМ EDTA) 1 ч при комнатной температуре. Антитела 3-10 мкг/мл в буфере для ELISA инкубировали в лунках в течение 1 ч при комнатной температуре, и лунки промывали 3× водой, инкубировали с HRP-конъюгированным IgG козы против человека 1:5000 в буфере для ELISA в течение 1 ч при комнатной температуре. После 3 промываний водой окраску развивали с использованием TMB в течение 5 мин и реакцию останавливали 0,1 M серной кислотой. ELISA для связывания с бакуловирусными (BV) частицами основан на способе, описанном в Hotzel, 2012. Антиген иммобилизовали в планшетах для ELISA Nunc Maxisorp посредством добавления 4% BV суспензии в 50 мМ натрий-карбонатный буфер pH 9,6 в каждую лунку и предоставления частицам возможности адсорбироваться на планшетах в течение ночи при 4°C. Лунки блокировали блокирующим буфером (PBS/0,5% BSA) 1 ч при комнатной температуре. После 3 промываний в PBS, антитела по 10 мкг/мл в блокирующем буфере добавляли в лунки ELISA и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали 6 раз в PBS и инкубировали с 20 нг/мл HRP-антитела козы против человека (Jackson ImmunoResearch, № по каталогу 109-035-008) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали 6 раз в PBS и в каждую лунку добавляли 25 мкл субстрата TMB и оставляли для проявки в течение 15 мин и затем останавливали посредством добавления 1 M фосфорной кислоты в каждую лунку. На любой стадии в буферы не добавляли детергенты. Сигналы A450 при 10 мкг/мл Ab нормализовали по сигналу от пустой лунки для сравнения образцов.

Обнаруживали, что химерные 7E8 и 7E8 с трансплантацией CDR имеют умеренное связывание с ДНК и инсулином в полиреактивном ELISA низкой степени строгости, тогда как химерный 9B3 демонстрировал связывание ДНК и инсулина, близкое к таковому у антитела отрицательного контроля, несмотря на сходство последовательностей с 7E8 (таблица 17). Замена CDR-H2 из 7E8 на ее аналог из 9B3 вызывает частичное снижение полиреактивности, тогда как замена CDR H1 или CDR H3 имела минимальный эффект.

Активность блокирования IL-33 человека (mm2) у 9B3 ниже таковой у 7E8 (0,264 нМ в HEK293 ST2 NFkB анализе для 9B3 против 0,059 нМ для 7E8). Различие более выражено при ингибировании IL-33 яванского макака: 7E8 ингибирует с активностью (0,131 нМ), схожей с его активностью в отношении IL-33 человека, тогда как 9B3 по существу слабее на IL-33 яванского макака, осуществляя только частичное блокирование при 20 нМ. Замена CDR H2 7E8 на CDR H2 9B3 ведет к большой утрате активности против IL-33 яванского макака (снижение IC₅₀ с 0,131 нМ до 3,46 нМ) и, аналогичным образом, замена CDR H3 7E8 на CDR H3 9B3 ведет к утрате активности против IL-33 яванского макака (7,65 нМ). Таким образом, CDR H2 несет детерминанты специфической и неспецифической активности семейства 7E8/9B3 нейтрализующих IL-33 антител, а CDR H3 несет детерминанты специфической активности.

Таблица 17. ДНК-связывающая активность и нейтрализация IL-33 человека и яванского макака вариантами трансплантата CDR 7E8

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	Описание VH	Описание VL	ДНК-связывание 2,2 нМ Ab, нормализованное по пустой пробе ± SEM (n)	ДНК-связывание 6,7 нМ Ab, нормализованное по пустой пробе ± SEM (n)	ДНК-связывание 20 нМ Ab, нормализованное по пустой пробе ± SEM (n)	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 человека (mm2) ± SEM (n)	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 яванского макака ± SEM (n)
Химера 7E8	28	31	Химера 7E8	Химера 7E8	20,12	20,39	26,82
Химера 9B3	40	42	Химера 9B3	Химера 9B3	6,26	7,64	11,98
Химера 9B3/hu J	40	83	Химера 9B3	Химера 9B3/J-сегмент человека	3,19	5,91	9,54	0,264±0,029 (2)	71,6% при 20 нМ
Трансплантат CDR 7E8	92	93	Трансплантат CDR 7E8	Трансплантат CDR 7E8	23,54	24,68	27,19	0,059±0,001 (2)	0,131±0,008 (2)
IL33-10	95	93	Трансплантат CDR 7E8	Трансплантат CDR 7E8	25,40	25,16	27,51	0,017	0,132
IL33-11	162	93	VH 7E8 с H1 9B3	Трансплантат CDR 7E8	24,02	24,29	26,71	0,090	0,204
IL33-12	164	93	VH 7E8 с H2 9B3	Трансплантат CDR 7E8	12,64	19,21	24,68	0,144	3,460
IL33-13	166	93	7E8 с H3 9B3	Трансплантат CDR 7E8	23,14	22,50	25,89	0,220	7,651
Отрицательный контроль полиреактивности (8.8)					2,52±0,11 (2)	4,49±0,81 (2)	8,08±0,46 (2)
Положительный контроль полиреактивности (scFv-Fc)					15,69	20,84	26,22

ПРИМЕР 14

Оценка неспецифического связывания и активности вариантов CDR из 7E8

Полиреактивность связывали с дисбалансом положительных зарядов в CDR (Datta-Mannan et al., 2015, MAbs 7(3): 483-493). Между легкими цепями 7E8 и 9B3 не существует зарядовых различий. Проверка последовательностей CDR-H2 и CDR-H3 из 7E8 и 9B3 (SEQ ID NO: 17, 34, 18 и 35) выявила четыре отличия в CDR-H2 и четыре отличия в CDR-H3, из которых только одно (в положении 54, N в 7E8 и D в 9B3) будет вести к отличию в заряде. Модификация 7E8 мутацией N54D для того, чтобы создавать IL33-45 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 169), оказывала только умеренные эффекты на полиреактивность, но значительно снижала нейтрализацию IL-33 яванского макака, таким образом, который схож с тем, что наблюдали при замене CDR H2 из 7E8 на таковую из 9B3 (таблица 18). По этой причине дополнительные варианты последовательностей необходимы для того, чтобы идентифицировать изменения в последовательностях, которые позволят сохранять активность 7E8 в отношении обоих IL-33 человека и яванского макака, при этом снижая полиреактивность 7E8.

Таблица 18. ДНК-связывающая активность и нейтрализация IL-33 человека и яванского макака с вариантами 7E8, содержащими последовательности CDR H2 из 9B3

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	Описание VH	Описание VL	ДНК-связывание 2,22 нМ Ab, нормализованное по пустой пробе	ДНК-связывание 6,67 нМ Ab, нормализованное по пустой пробе	ДНК-связывание 20 нМ Ab, нормализованное по пустой пробе	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB mm2	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 яванского макака
7E8 с трансплантацией CDR	92	93	Трансплантат CDR родительского 7E8	Трансплантат CDR 7E8	28,20	30,33	30,66	0,057	0,077
Химера 9B3/hu J	40	83	Химера 9B3	Химера 9B3/J-сегмент человека	8,40	13,40	18,48	ND	ND
IL33-12	164	93	VH 7E8 с H2 9B3	Трансплантат CDR 9B3	25,47	29,34	29,03	0,140	0,943
IL33-45	169	93	N54D	Трансплантат CDR 7E8	17,36	24,44	29,20	0,325	0,535
Отрицательный контроль полиреактивности (8.8)					1,95	4,41	7,17
Положительный контроль полиреактивности (MJ4-2 v1.1/P33)					28,09	35,44	35,43

ПРИМЕР 15

Оптимизация антитела против IL-33 7E8

Выполняли серию мутаций в 7E8 для того, чтобы идентифицировать изменения, которые будут снижать полиреактивность без потери активности. Хотя замена N54 в CDR H2 на аспарагиновую кислоту слегка снижала полиреактивность, но вела к сниженной клеточной активности, замена N54 на другие аминокислоты (I, L, V, W, Y) увеличивала неспецифическое связывание с бакуловирусом, при этом оставляя клеточную активность интактной.

Замена остатка N57 в CDR H2 на любой из двух отрицательно-заряженных остатков, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты, вела к значительному снижению полиреактивности, как измеряли по связыванию с бакуловирусными частицами, ДНК или инсулинов, но эти мутации не снижают активность нейтрализации (таблица 19). К удивлению, добавление отрицательного заряда в CDR3 тяжелой цепи (S105D) вело к нежелательным изменениям в полиреактивности и клеточной активности, а добавление отрицательных зарядов в легкую цепь (мутации N30D, K31D, T56D или T56E) увеличивало полиреактивность. Следовательно, варианты N57D и N57E необычны в том отношении, что они усовершенствуют полиреактивность без ослабления нейтрализации IL-33 человека или яванского макака. Эти результаты подсказывают, что имеет значение положение отрицательных зарядов, а не просто суммарный заряд на вариабельном домене.

Таблица 19. Активность связывания бакуловирусов и нейтрализация IL-33 человека и яванского макака одноаминокислотными вариантами 7E8 с трансплантацией CDR

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	Описание VH	Описание VL	Связывание бакуловирусов, нормализованное по пустой пробе	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 человека (mm2)	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 яванского макака
Трансплантат CDR 7E8	92	93	Трансплантат CDR 7E8	Трансплантат CDR 7E8	1,27	0,040	0,054
IL33-12	164	93	VH 7E8 с H2 9B3	Трансплантат CDR 7E8	0,51
IL33-55	172	93	N57D	Трансплантат CDR 7E8	0,97	0,084	0,19
IL33-56	175	93	N57E	Трансплантат CDR 7E8	1,00	0,053	0,104
IL33-57	178	93	S105D	Трансплантат CDR 7E8	3,17	0,310
IL33-58	181	93	N54L	Трансплантат CDR 7E8	5,04	0,027
IL33-61	183	93	N57E S105D	Трансплантат CDR 7E8	2,48	0,595
IL33-62	185	93	N57D S105D	Трансплантат CDR 7E8	2,48	0,885
IL33-68	188	93	S105A	Трансплантат CDR 7E8	1,73	0,046	0,062
IL33-74	95	191	Трансплантат CDR 7E8	K31D	4,02	0,174
IL33-75	95	194	Трансплантат CDR 7E8	N30D	5,14	0,156
IL33-80	95	197	Трансплантат CDR 7E8	T56D	3,49	0,161
IL33-81	95	200	Трансплантат CDR 7E8	T56E	4,68	0,168
Отрицательный контроль полиреактивности (бевацизумаб)					0,52
Положительный контроль полиреактивности (MJ4-2 VH1.1/P33)					5,83

Серию дополнительных мутаций CDR тяжелых цепей, для которых предсказывали введение отрицательного заряда, удаление гидрофобных остатков или модификацию остатков вблизи положения 57, исследовали в сочетании с N57E. Полиреактивность 7E8 с мутацией N57E оставалась в целом низкой при встраивании индивидуальных мутаций в CDR-H2 (S50A, T58D; таблица 20), и в HEK293 ST2 NFkB-клеточном анализе (таблица 21), активность 7E8 с мутацией N57E главным образом не изменялась при встраивании S50A или T58D. Аналогичным образом, полиреактивность 7E8 с мутацией N57E оставалась в целом низкой при встраивании дополнительных индивидуальных мутаций в CDR H1 (T28E), H2 (G56H, T58D, D62E, S63A или K65Q) или H3 (H100Y, Y102H, Y103H, Y103W, T104N или T104S). Аналогичным образом, в HEK293 ST2 NFkB-клеточном анализе, активность 7E8 с мутацией N57E главным образом не изменялась при встраивании дополнительных индивидуальных мутаций в CDR H1 (T28E), H2 (K65Q) или H3 (H100Y, T104N или T104S).

IL-33 может стимулировать продуцирование IFNγ в цельной крови человека при совместной стимуляции с использованием IL-12 в формате, почти идентичном тому, что использовали для анализа PBMC, описанного в примере 8, за исключением того, что для ответа цельной крови необходима более высокая концентрация IL-33 (100 пМ) по сравнению с 5 пМ IL-33 для PBMC. Подобно результатам, которые наблюдали в HEK293 ST2 NFkB анализе, активность в цельной крови у 7E8 с мутацией N57E главным образом не изменялась при встраивании индивидуальных мутаций S50A или T58D (таблица 21). Аналогичным образом, активность 7E8 с мутацией N57E главным образом не менялась при встраивании дополнительных индивидуальных мутаций в CDR H1 (T28E), H2 (S63A или K65Q) или H3 (Y103H, T104N или T104S).

Мутацию, разработанную для устранения потенциального сайта посттрансляционной модификации (N93Q легкой цепи, которая удаляет потенциальный сайт дезамидирования аспарагина NG (Chelius et al., 2005, Anal. Chem. 77(18): 6004-6011), комбинировали с мутацией N57E тяжелой цепи в антителе IL33-136 и обнаруживали, что это вело к сохранению клеточной активности (таблица 21) с частичным сохранением усовершенствованной полиреактивности (таблица 20).

Таблица 20. Связывание вариантов CDR H2 и CDR L3 из 7E8 с трансплантацией CDR с бакуловирусом, ДНК и инсулином

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	Описание VH	Описание VL	ДНК-связывание, нормализованное по пустой пробе ± SEM (n)	Связывание инсулина, нормализованное по пустой пробе±SEM (n)	Связывание бакуловируса, нормализованное по пустой пробе ±SEM (n)
IL33-10	95	93	Трансплантат CDR 7E8	Трансплантат CDR 7E8	13,22±2,06 (4)	16,6±1,77 (4)	2,32±0,29 (5)
IL33-12	164	93	VH 7E8 с H2 9B3	Трансплантат CDR 7E8	5,76±0,44 (4)	7,79±0,47 (4)	1,57±0,29 (5)
IL33-45	169	93	N54D	Трансплантат CDR 7E8	6,91±0,7 (4)	8,6±1,69 (4)	3,93±0,61 (5)
IL33-55	172	93	N57D	Трансплантат CDR 7E8	4,94±0,67 (4)	6,96±0,68 (4)	1,14±0,09 (5)
IL33-56	175	93	N57E	Трансплантат CDR 7E8	6,13±0,96 (4)	8,81±0,87 (4)	1,5±0,34 (5)
IL33-103	203	93	N57E S50A	Трансплантат CDR 7E8	6,09±1,01 (4)	9,1±0,64 (4)	1,44±0,24 (5)
IL33-117	206	93	N57E T58D	Трансплантат CDR 7E8	6,46±0,99 (4)	8,96±1,5 (4)	1,47±0,18 (5)
IL33-136	175	209	N57E	N93Q	11,33±2,14 (4)	13,9±1,4 (4)	4,34±1,59 (5)
Отрицательный контроль полиреактивности (8.8)					5,71±1,12 (4)	7,17±0,87 (4)	2,19±0,21 (5)
Положительный контроль полиреактивности (MJ4-2 VH1.1/P33)					35,06±4,1 (4)	39,06±1,33 (4)	10,54±1,68 (5)

Таблица 21. Клеточная активность вариантов CDR H2 и CDR L3 из 7E8 с трансплантацией CDR

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	Описание VH	Описание VL	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB mm2	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 яванского макака	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB WT IL-33	IC50 (нМ) для цельной крови
IL33-10	95	93	Трансплантат CDR 7E8	Трансплантат CDR 7E8	0,031	0,059	0,117	0,121±0,025 (4)
IL33-103	203	93	N57E S50A	Трансплантат CDR 7E8	0,028	0,07	0,178	0,104±0,008 (4)
IL33-117	206	93	N57E T58D	Трансплантат CDR 7E8		0,052	0,155	0,106±0,014 (2)
IL33-136	175	209	N57E	N93Q			0,037	0,098±0,033 (4)

Комбинации этих мутаций и двух дополнительных мутаций тяжелых цепей (G55A, которая допускала удаление потенциального сайта дезамидирования аспарагина NG, и D62E, которая удаляет потенциальный сайт изомеризации аспарагиновой кислоты DS; (Chelius, D., et al. (2005) исследовали на активность и полиреактивность и идентифицировали набор клонов с клеточной активностью (в HEK293 ST2 NFkB репортерном анализе, анализах цельной крови человека и PBMC человека) в пределах приблизительно 2 крат относительно трансплантата CDR 7E8 начального клона и полиреактивностью в пределах 2 крат относительно антитела отрицательного контроля (таблица 22, таблица 23).

Таблица 22. Связывание вариантов 7E8 с трансплантацией CDR, содержащих несколько мутаций CDR H2 и CDR L3, с бакуловирусом, ДНК и инсулином

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	Описание VH	Описание VL	ДНК-связывание, нормализованное по пустой пробе ± SEM (n)	Связывание инсулина, нормализованное по пустой пробе ±SEM (n)	Связывание бакуловируса, нормализованное по пустой пробе ±SEM (n)
IL33-153	212	209	G55A N57E T58D	N93Q	4,6±0,4 (2)	6,67±1,14 (2)	1,42 (1)
IL33-154	215	209	G55A N57E T58D D62E	N93Q	4,94±0 (2)	6,21±1,65 (2)	1,25 (1)
IL33-155	218	209	S50A N57E T58D	N93Q	4,05±0,29 (2)	5,18±0,9 (2)	1,25 (1)
IL33-156	221	209	S50A N57E T58D D62E	N93Q	4,32±0,04 (2)	5,75±1,32 (2)	1,15 (1)
IL33-157	224	209	S50A G55A N57E T58D	N93Q	4,74±0,16 (2)	5,71±1,67 (2)	1,55 (1)
IL33-158	227	209	S50A G55A N57E T58D D62E	N93Q	5,25±0,09 (2)	6,42±1,82 (2)	1,43 (1)
IL33-167	212	93	G55A N57E T58D	Трансплантат CDR 7E8	5,71±0,8 (2)	8,01±2,63 (2)	1,47 (1)
IL33-168	215	93	G55A N57E T58D D62E	Трансплантат CDR 7E8	4,58±0,07 (2)	6,26±0,95 (2)	1,03 (1)
IL33-169	218	93	S50A N57E T58D	Трансплантат CDR 7E8	5,71±1,63 (2)	6,34±1,84 (2)	1,24 (1)
IL33-170	221	93	S50A N57E T58D D62E	Трансплантат CDR 7E8	5,91±0,89 (2)	6,35±2,29 (2)	0,96 (1)
IL33-171	224	93	S50A G55A N57E T58D	Трансплантат CDR 7E8	5,4±0,83 (2)	5,45±0,99 (2)	1,15 (1)
IL33-172	227	93	S50A G55A N57E T58D D62E	Трансплантат CDR 7E8	5,4±1,16 (2)	6,2±1,4 (2)	1,51 (1)
IL33-175	230	93	S50A G55A N57E D62E	Трансплантат CDR 7E8	6,2±0,28 (2)	8,55±2,19 (2)	1,57 (1)
IL33-186	233	209	S50A N57E D62E	N93Q	4,92±0,11 (2)	7,77±1,63 (2)	1,01 (1)
IL33-187	236	209	S50A G55A N57E	N93Q	6,43±0,53 (2)	7,21±1,59 (2)	0,96 (1)
IL33-188	230	209	S50A G55A N57E D62E	N93Q	5,52±0,04 (2)	7,28±1,35 (2)	0,92 (1)
Отрицательный контроль полиреактивности (8.8)					3,42±1,07 (2)	3,44±0,86 (2)	1,36 (1)
Положительный контроль полиреактивности (MJ4-2 v1.1/P33)					18,19±8,12 (2)	15,37±3,16 (2)	4,77 (1)

Таблица 23. Клеточная активность вариантов 7E8 с трансплантацией CDR, содержащих несколько мутаций CDR H2 и CDR L3

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	Описание VH	Описание VL	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB ±SEM (n)	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 яванского макака ±SEM (n)	IC50 (нМ) для mm2 цельной крови ±SEM (n)	IC50 (нМ) для PBMC mm2 ±SEM (n)
Трансплантат CDR 7E8	92	93	Трансплантат CDR 7E8	Трансплантат CDR 7E8	0,114±0,042 (3)	0,18±0,015 (2)	0,009±0,002 (8)	0,004±0,001 (2)
IL33-153	212	209	G55A N57E T58D	N93Q	0,087 (1)	0,122 (1)	0,014±0,004 (4)
IL33-154	215	209	G55A N57E T58D D62E	N93Q	0,188±0,061 (3)	0,133±0,018 (2)	0,01±0,003 (6)	0,007±0,002 (2)
IL33-155	218	209	S50A N57E T58D	N93Q	0,171 (1)	0,239 (1)	0,025±0,008 (4)
IL33-156	221	209	S50A N57E T58D D62E	N93Q	0,116±0,038 (3)	0,087±0,015 (2)	0,004±0,001 (6)	0,004±0,001 (2)
IL33-157	224	209	S50A G55A N57E T58D	N93Q	0,118 (1)	0,161 (1)	0,016±0,007 (4)
IL33-158	227	209	S50A G55A N57E T58D D62E	N93Q	0,131±0,033 (3)	0,125±0,033 (2)	0,007±0,002 (6)	0,004±0,001 (2)
IL33-167	212	93	G55A N57E T58D	Трансплантат CDR 7E8	0,049±0,014 (3)	0,062±0,01 (2)	0,008±0,004 (6)	0,001±0 (2)
IL33-168	215	93	G55A N57E T58D D62E	Трансплантат CDR 7E8	0,109 (1)	0,264 (1)	0,014±0,005 (4)
IL33-169	218	93	S50A N57E T58D	Трансплантат CDR 7E8	0,071 (1)	0,176 (1)	0,009±0,003 (4)
IL33-170	221	93	S50A N57E T58D D62E	Трансплантат CDR 7E8	0,176±0,091 (2)	0,218±0,033 (2)	0,005±0,001 (4)
IL33-171	224	93	S50A G55A N57E T58D	Трансплантат CDR 7E8	0,145 (1)	0,216 (1)	0,012±0,004 (4)
IL33-172	227	93	S50A G55A N57E T58D D62E	Трансплантат CDR 7E8	0,201±0,105 (2)	0,222±0,07 (2)	0,012±0,004 (4)
IL33-175	230	93	S50A G55A N57E D62E	Трансплантат CDR 7E8	0,059±0,011 (2)	0,086 (1)	0,006±0,002 (6)	0,004±0 (2)
IL33-186	233	209	S50A N57E D62E	N93Q	0,109 (1)	0,144 (1)	0,012±0,006 (4)
IL33-187	236	209	S50A G55A N57E	N93Q	0,15 (1)	0,282 (1)	0,006±0,002 (3)
IL33-188	230	209	S50A G55A N57E D62E	N93Q	0,147 (1)	0,351 (1)	0,017±0,01 (3)

ПРИМЕР 17

Добавление увеличивающих время полужизни мутаций в оптимизированные варианты антитела 7E8

Создавали две версии вариантов тяжелых цепей антител IL33-158 и IL33-167, одна - вариант Fc (SEQ ID NO: 237), содержащий мутации L234A L235A и G237A в Fc для снижения эффекторной функции (описано в патенте США № 5624821) и делецию остатка лизина на C-конце для того, чтобы снижать гетерогенность продукта, и другая (SEQ ID NO: 238) -содержащая мутации L234A L235A и G237A, C-концевую делецию лизина и двойную мутацию M432L N438S для усиления связывания с неонатальным Fc-рецептором FcRn при кислом pH, что предположительно ведет к пролонгированному времени полужизни in vivo (Zalevsky et al., 2010, Nature Biotechnol. 28(2): 157-159). Каждую конструкцию создавали в векторе pRY19 и стабильно трансфицировали в клетки CHO. Получаемые антитела представляли собой IL33-158-152 (SEQ ID NO: 241, SEQ № 209), IL33-167-153 (SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 93), IL33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209) и IL33-167LS (SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 93). Выравнивания последовательностей вариабельных областей оптимизированных антител с соответствующими последовательностями зародышевой линии человека представлены на фиг. 2.

ПРИМЕР 18

Снижение полиреактивности у оптимизированных молекул

Антитела L33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209) и IL33-167LS (SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 93), которые получали из стабильно трансфицированных клеток CHO, демонстрировали уровни полиреактивности, сравнимые с таковыми у моноклонального антитела отрицательного контроля бевацизумаб (таблица 24). Эти уровни сравнимы с таковыми у IL33-158 (SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 209) и IL33-167 (SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 93), показанными в таблице 22, что указывает на то, что добавление мутаций константных областей L234A L235A, G237A, M432L и N438S и делеция C-концевого лизина по существу не изменяют полиреактивность получаемой молекулы.

Таблица 24. Связывание оптимизированных вариантов 7E8 с трансплантацией CDR с ДНК и инсулином

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	Описание VH	Описание VL	ДНК-связывание, нормализованное по пустой пробе±SEM (n)	Связывание инсулина, нормализованное по пустой пробе ±SEM (n)
IL33-158LS	244	209	S50A G55A N57E T58D D62E	N93Q	7,45±0,10 (8)	8,08±0,48 (8)
IL33-167LS	245	93	G55A N57E T58D	Трансплантат CDR 7E8	6,23±0,31 (8)	5,33±1,05 (8)
трансплантат CDR 7E8	92	93	Трансплантат CDR 7E8	Трансплантат CDR 7E8	25,42±0,36 (8)	14,58±1,93 (8)
IL33-10	95	93	Трансплантат CDR 7E8	Трансплантат CDR 7E8	26,92±0,77 (8)	12,26±0,38 (8)
Положительный контроль полиреактивности (MJ4-2 v1.1/P33)					39,62±0,24 (8)	42,20±0,34 (8)
Отрицательный контроль полиреактивности (бевацизумаб)					7,66±0,36 (8)	9,87±0,27 (8)
Отрицательный контроль полиреактивности (8.8)					1,50±0,06 (6)	4,47±0,09 (6)

ПРИМЕР 19

Активность нейтрализации IL-33 человека и яванского макака у оптимизированных антител против IL-33 в клеточных анализах

Антитела IL33-158-152 (SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 209), IL33-167-153 (SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 93), IL33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209) и IL33-167LS (SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 93), получаемые из стабильно трансфицированных клеток CHO, демонстрировали нейтрализацию IL-33 в HEK293 ST2 NFkB репортерном анализе, схожую с таковой у трансплантата CDR родительского антитела 7E8 (SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93) в отношении IL-33 человека (mm2), IL-33 человека (WT) и IL-33 яванского макака (cys mut).

Таблица 25. Активность нейтрализации у оптимизированных вариантов 7E8 с трансплантацией CDR в HEK293 ST2 NFkB репортерном клеточном анализе

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB hIL-33 (mm2) ± SEM (n)	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB hIL-33 (R&D) ± SEM (n)	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 яванского макака (cys mut) ± SEM (n)
IL33-158LS	244	209	0,162±0,058 (3)	0,983±0,149 (2)	0,198±0,068 (3)
IL33-167LS	245	93	0,13±0,035 (3)	0,685±0,089 (2)	0,162±0,071 (3)
IL33-158-152	241	209	0,095±0,032 (3)	0,62±0,103 (2)
IL33-167-153	242	93	0,129±0,042 (3)	0,749±0,227 (2)
Трансплантат CDR 7E8	92	93	0,093±0,029 (3)	0,322±0,011 (2)	0,184±0,056 (3)

ПРИМЕР 20

Активность нейтрализации IL-33 у оптимизированных антител против IL-33 в PBMC и цельной крови

Антитела IL33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209) и IL33-167LS (SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 93), получаемые из стабильно трансфицированных клеток CHO, демонстрировали нейтрализацию IL-33 (mm2) в PBMC человека, схожую с таковой у трансплантата CDR родительского антитела 7E8 (SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93).

Таблица 26. Активность нейтрализации у оптимизированных вариантов 7E8 с трансплантацией CDR в PBMC человека

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	IC50 (нМ) ± SEM (n)
IL33-158LS	244	209	0,0014±0,0001 (4)
IL33-167LS	245	93	0,0011±0,0002 (4)
Трансплантат CDR 7E8	92	93	0,0014±0,0004 (4)

Таблица 26: Нейтрализация продуцирования IFN-γ в PBMC. PBMC человека примировали с использованием 16,67 пМ IL-12, затем обрабатывали с использованием 5 пМ IL-33 человека (mm2).

Антитела IL33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209) и IL33-167LS (SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 93), получаемые из стабильно трансфицированных клеток CHO, демонстрировали нейтрализацию стимулируемого IL-33 продуцирования INFγ у человека в цельной крови человека, схожую с таковой у трансплантата CDR родительского антитела 7E8 (SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93) в отношении IL-33 человека (mm2) и IL-33 человека (WT).

Таблица 27. Активность нейтрализации у оптимизированных вариантов 7E8 с трансплантацией CDR в цельной крови человека

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	IC50 (нМ) для IL-33 человека (mm2) ± SEM (n)	IC50 (нМ) для IL-33 человека (R&D) ± SEM (n)
IL33-158LS	244	209	0,021±0,003 (6)	0,868±0,235 (2)
IL33-167LS	245	93	0,013±0,001 (6)	0,451±0,154 (2)
Трансплантат CDR 7E8	92	93	0,014±0,002 (6)	0,387±0,216 (2)

Таблица 27: Цельную кровь стимулировали с использованием IL-12, после чего следовало 125 нМ IL-33 человека (mm2 или R&D).

Антитело IL33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209), получаемое из стабильно трансфицированных клеток CHO, демонстрировало нейтрализацию IL-33 человека (mm2) и IL-33 человека (R&D), при этом коммерчески доступное Nessy-1 не демонстрировало значительной нейтрализации. Коммерчески доступное моноклональное антитело 19G8 демонстрировало более слабую нейтрализацию IL-33 человека (mm2), чем IL33-158LS, и сравнимую нейтрализацию IL-33 человека (R&D) (таблица 28). Таким образом, высоко избирательная нейтрализация активной формы IL-33 человека, представленная с помощью IL-33 (mm2), является характеристическим свойством IL33-158LS.

Таблица 28. Активность нейтрализации IL33-158LS в HEK293 ST2 NFkB анализе по сравнению с таковой у коммерческих антител против IL-33

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	IC50 (нМ) для IL-33 (mm2) ± SEM (n)	IC50 (нМ) для IL-33 (R&D) ± SEM (n)
IL33-158LS	244	209	0,079±0,029 (2)	2,658±1,243 (2)
ALX-804-840-C100 (Nessy-1)			Нейтрализация отсутствует (1)	Нейтрализация отсутствует (1)
mabg-hIL-33 (19G8)			0,283±0,001 (2)	1,952±0,94 (2)

Выводы:

Гуманизированные оптимизированные антитела против IL-33 человека IL33-158-152, IL33-167-153, IL33-158LS и IL33-167LS являются мощными нейтрализаторами биологической активности IL-33 в спектре биологических анализов с использованием клеточных линий, первичных моноцитов человека и цельной крови человека.

ПРИМЕР 21

Кинетическая оценка оптимизированных антител против IL-33 с использованием поверхностного плазмонного резонанса

Кинетический анализ Biacore проводили при 37°C и скорости сбора 1 Гц на приборе Biacore T200 (GE Healthcare). IL-33 человека (mm2), IL-33 яванского макака и восстановленный huIL33wt ковалентно связывали с чипом датчика CM5 (№ по каталогу BR100530, GE Healthcare) с использованием набора для аминного сочетания (№ по каталогу BR100050, GE Healthcare) в соответствии с протоколом производителя. Уровни иммобилизации составляли 260 RU для IL-33 человека (mm2), 85 RU для IL-33 яванского макака и 108-225 RU для восстановленного IL-33 человека (WT), проточную кювету 1 активировали и блокировали для применения в качестве эталонной проточной кюветы. Серию титрований лидирующих Fab против IL-33 158LS, 167LS и родительского Fab 7E8 впрыскивали при скорости потока 50 мкл/мин и осуществляли мониторинг диссоциации в течение 3600 с. Буфером для разведения и подвижным буфером являлся HBS-EP+ (10 мМ HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% P-20). Константы скорости и аффинности определяли посредством аппроксимации данных получаемых сенсограмм к модели 1: 1 в программном обеспечении BIAcore T200 Evaluation версии 1.0 (GE Healthcare).

Аффинность Fab-фрагментов оптимизированных антител IL33-158LS и IL33-167LS измеряли посредством поверхностного плазмонного резонанса, как описано в примере 10, с IL-33, иммобилизованным на чипе датчика, и Fab-фрагментами в растворенной фазе. Оба оптимизированных антитела демонстрировали аффинности связывания с IL-33 человека (mm2), IL-33 человека (WT) и IL-33 яванского макака, сравнимые с аффинностями, демонстрируемыми Fab родительского 7E8 с трансплантацией CDR (таблица 29).

Таблица 29. Кинетические параметры связывания Fab-фрагментов трансплантата CDR 7E8, IL33-158LS и IL33-167LS с IL-33 человека и яванского макака, измеренные посредством поверхностного плазмонного резонанса

Fab	Форма IL-33	ka (1/Мс) ± SEM	kd (1/с) ± SEM	kD (пМ) ± SEM (n)
Трансплантат CDR 7E8	huIL-33 (mm2)	2,74E+06±1,15E+05	4,17E-05±3,82E-06	15,48±2,10 (4)
Трансплантат CDR 7E8	hu IL-33 (WT+DTT)	3,05E+06±2,15E+05	5,79E-05±5,10E-06	19,05±0,35 (2)
Трансплантат CDR 7E8	IL-33 яванского макака (cys mut)	2,81E+06±2,50E+04	4,07E-05±5,25E-06	14,45±1,75 (2)
IL33-158LS	huIL-33 (mm2)	2,42E+06±3,75E+05	3,09E-05±2,20E-06	13,00±1,10 (2)
IL33-158LS	hu IL-33 (WT+DTT)	1,86E+06±2,65E+04	1,29E-04±2,73E-06	69,57±2,46 (3)
IL33-158LS	IL-33 яванского макака (cys mut)	1,64E+06±4,50E+04	1,71E-05±7,00E-07	10,45 ±0,15 (2)
IL33-167LS	huIL-33 (mm2)	4,75E+06±3,00E+04	4,80E-05±7,90E-06	10,11±1,59 (2)
IL33-167LS	hu IL-33 (WT+DTT)	1,45E+06±3,00E+04	6,56E-05±2,50E-07	45,25±0,85 (2)
IL33-167LS	IL-33 яванского макака (cys mut)	1,57E+06±6,00E+04	2,09E-05±1,00E-07	13,35±0,45 (2)

ПРИМЕР 22

Цитокиновая специфичность средства против IL-33

Для того чтобы оценивать цитокиновую специфичность антител против IL-33 7E8 и IL33-158LS, оценивали панель не целевых цитокинов на связывание с этими антителами посредством поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore T-200. Панель цитокинов включала IL-1α, IL-1β, IL-18, IL-36α и IL-36γ. Результаты (таблица 30, фиг. 3) показывали, что отсутствовало связывание не родственных цитокинов при 100 нМ, хотя антитела против IL-33 7E8 и IL33-158LS связывают IL-33 mm2 и восстановленный IL-33 WT при очень схожих значениях %Rmax. Связывание с IL-33 не наблюдали в отсутствие восстановления.

Таблица 30. Цитокиновая избирательность 7E8 и IL33-158LS

Цитокин	%Rmax Fab 7E8	%Rmax Fab IL33-158LS
IL-33 mm2	61	65
IL-33 WT	NB	NB
IL-33 WT+DTT	52	52
IL-1α	NB	NB
IL-1β	NB	NB
IL-18	NB	NB
IL-36α	NB	NB
IL-36γ	NB	NB
Таблица 30. Связывание указанного Fab с 100 нМ цитокина измеряли посредством поверхностного плазмонного резонанса. Fab захватывали с использованием Human Fab Capture Kit (GE Healthcare), и каждый цитокин впрыскивали на захваченный Fab по 100 нМ. На связывание указывает значение %Rmax. %Rmax представляет собой соотношение экспериментально наблюдаемого Rmax и теоретического Rmax (исходя из 100% связывания), выраженное в виде процентной доли, и теоретический Rmax представляет собой резонансные единицы захваченного Fab, умноженные на соотношение молекулярных масс цитокина и Fab. NB - связывание отсутствует.

ПРИМЕР 23

Конкуренция с ST2 человека за связывание с IL-33

Способность IL33-158LS блокировать связывание рецептора ST2 с IL-33 тестировали в анализе связывания Octet. Антитела или ST2-Fc человека (SEQ ID NO: 6) захватывали на кончиках Octet, покрытых средством против Fc человека, свободные сайты связывания блокировали избытком контрольного антитела IgG₁ человека и смесь IL-33 (R&D) и второго антитела или ST2-Fc наносили на кончики. Комплекс IL33-158LS и IL-33 человека способен связываться с контрольным не нейтрализующим антителом против IL-33, IL33-271 (SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 256), захваченным на кончике Octet, и наоборот, комплекс IL33-271 и IL-33 человека способен связываться с иммобилизованным IL33-158LS. Аналогичным образом, ST2-Fc человека и IL33-271 способны связываться с IL-33 человека одновременно в любой ориентации. Однако иммобилизованное IL33-158LS не способно связываться с комплексом IL-33 и ST2-Fc, и наоборот, иммобилизованный ST2-Fc не способен связываться с комплексом IL-33 и IL33-158LS. Эти результаты показывают, что IL33-158LS и ST2-Fc конкурируют за перекрывающиеся сайты связывания на IL-33.

Таблица 31. Конкуренция IL33-158LS с рецептором IL-33 ST2 за связывание с IL-33

Молекула, захваченная на кончике против Fc		Смесь, наносимая на захваченную молекулу
HC SEQ №	LC SEQ №	IL33-158LS+IL-33	hST2-Fc+IL-33	IL33-271+IL-33	Отдельно IL-33
IL33-158LS	244	209	-	-	+	+
hST2-Fc	2	-	-	+	+
IL33-271	256	256	+	+	-	+

Таблица 31: (+) обозначает комплекс второго антитела и IL-33, который связан с первым антителом, которое захвачено на кончике Octet. (-) указывает на то, что не наблюдали увеличение сигнала при добавлении смеси IL-33 и второго антитела.

ПРИМЕР 24

Тепловая стабильность оптимизированных антител против IL-33

Дифференциальную сканирующую калориметрию использовали для того, чтобы определять стабильность IL33-158-152, IL33-158LS, IL33-167-153 и IL33-167LS. Для этого анализа образцы 0,3 мг/мл распределяли в лоток для образцов MicroCal VP-Capillary DSC с использованием автоматического пробоотборника (Malvern Insturments, Inc.), который уравновешивали в течение 5 мин при 10°C и затем сканировали вплоть до 110°C на скорости 100°C в час. Выбирали период фильтрования 16 с. Исходные данные корректировали по базовому уровню и нормализовали концентрации белка. Программное обеспечение Origin 7.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) использовали для аппроксимации данных к MN2-State Model с подходящим числом переходов. Ниже в таблице 32 представлены температуры плавления (T_m1 - T_m3) молекул в 20 мМ гистидине pH 5,8, 8,5% сахарозе, 0,05 мг/мл EDTA. Все четыре молекулы демонстрируют хорошую стабильность, с первым переходом в домене CH2 (T_m1) больше 65°C. Дополнительно, введение мутации LS оказывает очень небольшое влияние (≤1°C) на стабильность молекул.

Таблица 32. Тепловая стабильность оптимизированных вариантов 7E8

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	Tm1	Tm2	Tm3
IL33-158-152	241	209	71,35±0,09	83,58±0,61	85,93±0,15
IL33-167-153	242	93	71,13±0,03	82,71±0,08	84,31±0,04
IL33-158LS	244	209	70,26±0,11	82,20±0,38	85,81±0,06
IL33-167LS	245	93	70,45±0,10	81,38±0,43	84,03±0,10

Таблица 32: тепловые переходы для молекул, полученных из IL33-158 и IL33-167, в 20 мМ гистидине pH 5,8, 8,5% сахарозе, 0,05 мг/мл EDTA, которые определяли посредством дифференциальной сканирующей калориметрии.

ПРИМЕР 25

Захват IL-33 яванского макака антителами против IL-33, вводимыми in vivo

IL33-158LS тестировали на его способность захватывать нативный IL-33 яванского макака. После внутривенного дозирования яванских макаков при 0,14 или 14 мг/кг IL33-158LS, посредством интраперитонеальной инъекции вводили гидроксид алюминия (квасцы) (1 мг в 0,1 мл). Образцы крови брали вплоть до 72 ч после квасцов. Общий IL-33 яванского макака, связанный с IL33-158LS, измеряли с использованием иммуноаффинного способа LC\MS\MS. Биотин-конъюгированные антитела против Fc человека инкубировали с каждым образцом плазмы и инкубировали в течение ночи при 4°C для того, чтобы связывать весь цитокин, связанный с антителом против IL-33. Стрептавидиновые бусы добавляли в каждый образец и инкубировали в течение 30 мин, промывали и затем цитокин высвобождали из антител с использованием элюирующего буфера с низким pH, после чего следовала нейтрализация Tris-буфером. Затем протяженные меченные стабильными изотопами пептиды с характеристическими последовательностями для IL-33 добавляли в каждый образец и затем все образцы восстанавливали с использованием DTT, алкилировали йодацетамидом и расщепляли трипсином. Затем триптические пептиды идентифицировали с использованием тандемной масс-спектрометрической системы 2D nano UPLC. Предел количественного определения для этого анализа составляет 50 пг/мл для IL-33 яванского макака при использовании 20 мкл плазмы. Измерения IL-33, связанного с IL33-158LS, возрастали с течением времени после введения 14,3 мг/кг и стимуляции квасцами по сравнению с низкой дозой IL33-158LS 0,14 мг/кг (таблица 33). Эти результаты показывают, что IL33-158LS связывается с нативным IL-33 яванского макака в зависимости от дозы и вызывает поддающиеся измерению эффекты, которые можно использовать для моделирования фармакодинамики у человека.

Конечное время полужизни в сыворотке IL33-158LS у яванского макака составляло 18 суток, что допускало параметризацию двухкомпартментной PK модели. Аллометрическое масштабирование константы скорости с аллометрической экспонентой 0,75 для клиренса вело к предсказанному конечному времени полужизни из сыворотки человека в 41 сутки. Это значительно больше по сравнению с типично наблюдаемым временем полужизни в 20 суток для антител у человека (Brekke and Sandlie (2003), Nature Reviews, том 2, стр. 52-62) и 17 суток для человеческих или гуманизированных биотерапевтических антител IgG (получено из PK параметров, приведенных в Singh, et al. (глава 5 «Application of mechanistic pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling towards the development of biologics» в Kumar S, Kumar Singh S, ред. Developability of Biotherapeutics: Computational Approaches. CRC Press; 2015: стр. 109-34).

К удивлению, предварительная оценка у здоровых людей-добровольцев указывает на то, что период полувыведения из сыворотки (β-фаза) для IL33-158LS составляет по меньшей мере 50 суток. В некоторых аспектах изобретения конечное время полужизни антитела или его антигенсвязывающей части составляет по меньшей мере приблизительно 50 суток. В некоторых аспектах изобретения конечное время полужизни антитела или его антигенсвязывающей части составляет по меньшей мере приблизительно 55 суток. В некоторых аспектах изобретения конечное время полужизни антитела или его антигенсвязывающей части составляет по меньшей мере приблизительно 60 суток. В некоторых аспектах изобретения конечное время полужизни антитела или его антигенсвязывающей части составляет по меньшей мере приблизительно 65 суток. В некоторых аспектах изобретения конечное время полужизни антитела или его антигенсвязывающей части составляет по меньшей мере приблизительно 70 суток. В некоторых аспектах изобретения конечное время полужизни антитела или его антигенсвязывающей части составляет по меньшей мере приблизительно 75 суток. В некоторых аспектах изобретения конечное время полужизни антитела или его антигенсвязывающей части составляет по меньшей мере приблизительно 80 суток. В некоторых аспектах изобретения конечное время полужизни антитела или его антигенсвязывающей части составляет по меньшей мере приблизительно 85 суток. В некоторых аспектах изобретения конечное время полужизни антитела или его антигенсвязывающей части составляет по меньшей мере приблизительно 90 суток. Неожиданно большое время полужизни может быть обусловлено модификациями в вариабельных областях и CDR, а также Fc-домене.

Таблица 33. Динамика концентрации общего циркулирующего IL-33 у яванских макаков, которым дозировали IL33-158LS и которых стимулировали гидроксидом алюминия (квасцами)

	Доза 0,14 мг/кг	Доза 14,3 мг/кг
Время после стимуляции квасцами (ч)	Усредненный IL-33, связанный с IL33-158LS (пг/мл) (n=3 +/- SEM)	Усредненный IL-33, связанный с IL33-158LS (пг/мл) (n=3 +/- SEM)
0	52,0±12,7	64,5±12,7
1	62,5±3,6	52,5±8,4
2	61±4,0	59,1±11,5 (n=2)
4	71,3±8,9	45,5±2,0
8	84±23,3	63,5±4,7
10	48±10,7 (n=2)	84,2±11,9 (n=2)
24	61,7±18,7	137,3±16,0
48	47,8±17,8	217±22,8
72	54,8±11,0	311,3±10,4

ПРИМЕР 26

Создание и тестирование сравнительных антител к IL-33

Создавали IgG₁ версии многих антител hIgG₄, описанных в WO 2014164959 (таблица 35) (связывающие свойства выделенного Fab-фрагмента не зависят от Fc-области, и ожидают, что связывающие свойства интактного IgG₄ по существу идентичны в IgG₁). H4H9675P (соответствующее IL33-265), H4H9659P (соответствующее IL33-266) и H4H9665P (соответствующее IL33-267) раскрыты в качестве обладающих наивысшей аффинностью к IL-33 человека при 37°C или IL-33 мартышки (таблицы 3 и 6 в WO 2014164959). Начальная функциональная оценка показывала, что IL33-267 менее активно, чем IL33-265 и IL-33-266. Более детальная оценка показывала, что IL33-265 в 8-10 раз активнее, чем IL33-266 (таблица 36). Анализ BIAcore связывания IgG с иммобилизованным IL-33 человека дикого типа показывал, что IL33-265 связывался только с восстановленной формой IL-33, но не с не восстановленным IL-33.

Таблица 35

Антитело (IgG1)	SEQ ID	Антитело (IgG4)	WO 2014164959 SEQ ID
HC	VL	VH	VL	VH-ДНК	VL-ДНК
IL33-265	282	283	H4H9675P	274	282	273	281
IL33-266			H4H9659P	98	106	97	105
IL33-267			H4H9665P	178	186	177	185

Таблица 36

	Титрование с 0,1 нг/мл pur mm2	Титрование с 0,1 нг/мл R&D rhIL-33
	IC50	SEM	n	IC50	SEM	n
IL33-265	0,061	0,021	3	0,128	0,018	3
IL33-266	0,719	0,159	2	0,998	0,076	2

Создавали антитело IgG₁ IL33-310 (SEQ ID NO: 287 (HC) и SEQ ID NO: 288 (LC)), которое получали из IgG₄ 10C12.38.H6. 87Y.581 из WO 2016077381, которое раскрыто в качестве обладающего высокой аффинностью к IL-33 человека и яванского макака.

10C12.38.H6. 87Y.581 состоит из SEQ ID NO: 306 (HC) и SEQ ID NO: 307 (LC) из WO 2016077381. Для получения нуклеотидных последовательностей для использования в экспрессии, последовательности вариабельной область подвергали обратной трансляции с использованием программного обеспечения Vector NTI. Нуклеотидную последовательность стандартной константной области κ, которая кодирует аминокислотную последовательность, идентичную таковой в SEQ ID NO: 307 из WO 2016077381, использовали для экспрессионной конструкции. Нуклеотидная последовательность стандартной константной области IgG₄ кодировала аминокислотную последовательность с тремя отличиями от таковой из SEQ ID NO: 306 из WO 2016077381, и ее модифицировали в этих трех кодонах, чтобы кодировать константную область из SEQ ID NO: 306 из WO 2016077381. Нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерную последовательность SEQ ID NO: 402, помещали с сохранением рамки считывания выше от кодирующих последовательностей VH и VL. В таблице 37 представлены данные сравнения IL-167/LS, IL-158/LS, IL33-265 и IL33-310 в клеточном анализе.

Таблица 37

	Титрование с 0,1 нг/мл mm2 CYS IL-33 человека	Титрование с 0,1 нг/мл cyIL33_3cys	Соотношение IC50 яв. макак: человекдля cys мутанта	Титрование с 0,1 нг/мл R&D rhIL-33 (+ предварительная обработка 10 мМ DTT)	Титрование 0,1 нг/мл pfe cyno WT IL-33 (+ предварительная обработка 10 мМ DTT)	Соотношение IC50 яв. макак: человек для WT
	IC50 (нМ)	SEM	n	IC50 (нМ)	SEM	n		IC50 (нМ)	SEM	N	IC50 (нМ)	SEM	n
IL33-167/LS	0,037	0,012	2	0,036	0,006	3	1,0	0,250	0,019	4	1,560	0,317	7	6,2
IL33-158/LS	0,019	0,004	3	0,034	0,009	3	1,8	0,331	0,085	5	1,391	0,331	7	4,2
IL33-265	0,014	0,003	5	1,562	0,243	4	108,9	0,050	0,010	6	12,691	2,484	5	255,7
IL33-310	0,018	0,002	3	0,590	0,041	3	32,5	0,061	0,011	3	1,644	0,421	4	27,1

Антитело IgG₁ IL33-244 основано на APE04909, раскрытом как SEQ ID NO: 136 и SEQ ID NO: 171 в WO 2015/106080. APE04909 представляет собой нейтрализующее антитело, подробно описанное, например, в примере 2 (клеточные анализы in vitro) и примере 5 (исследование in vivo пролиферации эозинофилов, зависящей от IL-33 человека, у мышей, пример 5). Однако когда создавали антитело в соответствии c SEQ ID NO: 136/171 из WO 2015/106080, оно плохо экспрессировалось и имело гетерогенный SEC профиль. Чтобы устранять возможность того, что использование плохих кодонов вносило вклад в плохую экспрессию, в качестве начальной точки использовали последовательности ДНК схожих хорошо экспрессируемых антител, которые корректировали, чтобы кодировать вышеуказанные последовательности с использованием высокочастотных кодонов человека, где изменения необходимы. Однако экспрессия все еще оставалась плохой после этой стадии и SEC паттерны все еще демонстрировали гетерогенность (таблица 38).

Таблица 38

Название антитела	VH SEQ ID NO:	VL SEQ ID NO:	Выход белка (мг/л)	Площадь% (SEC)	IC50 с 0,1 нг/мл IL-33 человека mm2 в 239 ST2 NFkB анализе, за исключением rts16-42
IL33-244	136	171	9	Слишком мала для интегрирования	10,9

IL33-248 описано в WO 2015/099175 как 3H04 и A25 (см. фиг. 8), и IL33-247 описано в WO 2015/099175 как 1C04 и A10 (см. фиг. 9). Нуклеотидные последовательности вариабельных областей из WO 2015/099175 синтезировали и клонировали в экспрессирующие векторы IgG₁ человека и λ человека (см. последовательности из WO 2015/099175 в таблице 39). IL33-247 и IL33-248 имеют отдельный эпитоп IL-158/LS и IL33-167/LS и выход 90,75 мг/л CM и площадь под кривой 100% для IL33-247 и 36 мг/л CM и площадь под кривой 85,3% для IL33-248, которая также демонстрировала асимметричный пик с большим временем удержания.

Таблица 39

Антитело (IgG1)	Антитело (IgG4)	SEQ ID в WO 2015/099175
VH	VL	ДНК VH	ДНК VL
IL33-247	1C04/ A10	105	79	254	228
IL33-248	3H04/ A25	115	92	264	241

Антитело IgG₁ IL33-312 основано на 33_640087-7B из WO 16156440 (SEQ ID NO: 615 и SEQ ID NO: 617) (см., например, фиг. 52 и пример 11-12). Антитело IgG₁ IL33-313 основано на 33 640237-2B из WO 16156440 (SEQ ID NO: 623 и SEQ ID NO: 625).

ПРИМЕР 27

Активность нейтрализации IL-33 человека и яванского макака у оптимизированных антител против IL-33 и сравнительных антител в клеточном анализе

Антитела IL33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209), IL33-167LS (SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 93), IL33-265 (SEQ ID NO: 403 SEQ ID NO: 404) и IL33-310 (SEQ ID NO: 405 SEQ ID NO: 406) тестировали в HEK293 ST2 NFkB репортерном анализе на нейтрализацию IL-33 человека и яванского макака (таблица 40). IL33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209) демонстрировало схожую активность нейтрализации против цистеиновых мутантных форм IL-33 человека и яванского макака (с соотношением IC₅₀ мартышки: IC₅₀ человека 1,8). Аналогичным образом, схожа активность нейтрализации IL33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209) против IL-33 человека и яванского макака дикого типа (SEQ ID NO: 397) (при соотношении IC₅₀ мартышки: IC₅₀ человека 4,2). IL33-167LS (SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 93) аналогичным образом демонстрировало близкую нейтрализацию IL-33 мартышки и человека. Два других антитела IL33-265 (SEQ ID NO: 403 SEQ ID NO: 404) и IL33-310 (SEQ ID NO: 405 SEQ ID NO: 406) демонстрировали более широкие различия между нейтрализацией IL-33 человека и яванского макака (соотношения IC₅₀ мартышки: IC₅₀ человека в диапазоне от 28,7 до более чем 250).

Во втором эксперименте IL33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209), IL33-310 (SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 406), IL33-312 (SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 408) и IL33-313 (SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 410) тестировали в HEK293 ST2 NFkB репортерном анализе на нейтрализацию IL-33 человека и яванского макака (таблица 41). IL33-158LS и IL33-312 аналогичным образом имели близкую относительную нейтрализацию цистеинового мутанта IL-33 мартышки и человека (соотношения IC₅₀ яванского макака: IC₅₀ человека 1,4 и 1,1, соответственно). Относительная нейтрализация IL-33 человека и яванского макака дикого типа также схожа для IL33-158LS и IL33-312 (соотношения IC₅₀ яванского макака: IC₅₀ человека 9,2 и 5,4, соответственно). IL33-310 и IL33-313 демонстрировали более широкие различия между IC₅₀ человека и яванского макака (соотношения IC₅₀ мартышки: IC₅₀ человека в диапазоне от 29,2 до 528,1; таблица 41). Вместе данные показывают, что IL33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209) имеет наиболее схожую нейтрализацию IL-33 человека и яванского макака дикого типа в этой панели высоко активных антител против IL-33 человека, сравнимую с IL33-312.

Таблица 40. Нейтрализация IL-33 человека и яванского макака в HEK293 ST2 NFkB репортерном клеточном анализе

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB hIL-33 (mm2) ± SEM (n)	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 яванского макака (cys mut) ± SEM (n)	Соотношение IC50 яванского макака: человека для цистеинового мутанта IL-33	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB hIL-33 (R&D) ± SEM (n)	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 яванского макака (дикого типа) ± SEM (n)	Соотношение IC50 яванского макака: человека для IL-33 дикого типа
IL33-158LS	244	209	0,019±0,004(3)	0,034±0,009(3)	1,8	0,331±0,085(5)	1,391±0,331(7)	4,2
IL33-167LS	245	93	0,037±0,012(2)	0,036±0,006(3)	1,0	0,250±0,019(4)	1,560±0,317(7)	6,2
IL33-265	403	404	0,014±0,003(5)	1,562±0,243(4)	108,9	0,050±0,010(6)	12,691±2,484(5)	255,7
IL33-310	405	406	0,018±0,002(3)	0,590±0,041(3)	32,5	0,061±0,011(3)	1,644±0,421(4)	27,1

Таблица 41. Нейтрализация IL-33 человека и яванского макака в HEK293 ST2 NFkB репортерном клеточном анализе

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB hIL-33 (mm2)	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 яванского макака (cys mut)	Соотношение IC50 яванского макака: человека для цистеинового мутанта IL-33	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB hIL-33 (R&D)	IC50 (нМ) для HEK293 ST2 NFkB IL-33 яванского макака (дикого типа)	Соотношение IC50 яванского макака: человека для IL-33 дикого типа
IL33-158LS	244	209	0,009	0,013	1,4	0,061	0,562	9,2
IL33-310	405	406	0,007	0,213	29,2	0,021	2,185	103,5
IL33-312	407	408	0,003	0,003	1,1	0,008	0,043	5,4
IL33-313	409	410	0,006	1,197	206,2	0,027	14,131	528,1
n=1

Пример 28

Оценка кинетики антител против IL-33 с использованием поверхностного плазмонного резонанса

Кинетический анализ Biacore проводили при 37°C и скорости сбора 1 Гц на приборе Biacore T200 (GE Healthcare). Восстановленной и не восстановленный IL-33 человека дикого типа и восстановленный IL-33 яванского макака дикого типа ковалентно связывали с чипом датчика CM5 (№ по каталогу BR100530, GE Healthcare) с использованием набора для аминного сочетания (№ по каталогу BR100050, GE Healthcare) в соответствии с протоколом производителя. Проточную кювету 1 активировали и блокировали для применения в качестве эталонной проточной кюветы. В одном эксперименте уровни иммобилизации составляли 218 RU для восстановленного IL-33 человека дикого типа и 248 RU для восстановленного IL-33 яванского макака дикого типа. В этом эксперименте серию титрований Fab против IL-33 158LS и 167LS впрыскивали при скорости потока 50 мкл/мин и осуществляли мониторинг диссоциации в течение 3600 с. Во втором эксперименте уровни иммобилизации составляли 130 RU для восстановленного IL-33 человека дикого типа, 97 RU для не восстановленного IL-33 человека дикого типа и 88 RU для восстановленного IL-33 яванского макака дикого типа. В этом эксперименте серию титрований Fab против IL-33 158LS, 167LS и IL33-265 впрыскивали при скорости потока 50 мкл/мин и осуществляли мониторинг диссоциации в течение 900 с. Буфер для разведения и подвижный буфер представляли собой HBS-EP+ (10 мМ HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% P-20). Константы скорости и аффинности определяли посредством аппроксимации данных получаемых сенсограмм к модели 1: 1 в программном обеспечении BIAcore T200 Evaluation версии 1.0 (GE Healthcare). Интактный IL33-0310 IgG также тестировали в этом формате и наблюдали связывание при быстрой ассоциации и очень медленной диссоциации с восстановленным IL-33 человека и восстановленным IL-33 яванского макака, но он не связывался с не восстановленным IL-33 человека (таблица Y). Кинетические свойства двухвалентного IgG нельзя непосредственно сравнивать с таковыми у одновалентных Fab-фрагментов и не представлены здесь.

Все Fab против IL-33 158LS, 167LS, IL33-265 и IgG против IL33 IL33-310 прочно связывались с IL-33 человека и яванского макака дикого типа, обработанными DTT. В отличие от этого, ни одно из этих антител не связывалось с не восстановленным IL-33 человека дикого типа (таблица 42).

Схожи аффинности Fab из IL33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209) к IL-33 человека и яванского макака дикого типа (SEQ ID NO: 397) (при соотношении K_D мартышки: K_D человека 1,3 и 2,3 в двух независимых экспериментах). IL33-167LS (SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 93) аналогичным образом демонстрировал близкую аффинность к IL-33 мартышки и человека. IL33-265 (SEQ ID NO: 403 SEQ ID NO: 1003) демонстрировал более широкие различия между аффинностями к IL-33 человека и яванского макака дикого типа, при соотношении K_D мартышки: K_D человека 57,8 (таблица 42).

Таблица 42. Кинетические параметры Fab-фрагментов для Fab 158LS, 167LS и IL33-265, связывающихся с IL-33 человека и яванского макака дикого типа, которые измеряли посредством поверхностного плазмонного резонанса

Fab	Форма IL-33	ka (1/Мс) ± SEM	KD (1/с) ± SEM	KD (пМ) ± SEM (n)	Соотношение KD яванского макака/KD человека
Эксперимент 1
IL33-158LS	huIL-33 (WT+DTT)	3,13E+06±3,00E+05	3,30E-04±5,00E-07	106±11	1,3
IL33-158LS	IL-33 яванского макака (WT+DTT)	4,50E+06±5,05E+05	6,20E-04±3,65E-05	139±8
IL33-167LS	huIL-33 (WT+DTT)	3,03E+06±8,50E+04	2,76E-04±1,50E-05	91±2	1,5
IL33-167LS	IL-33 яванского макака (WT+DTT)	4,81E+06±2,80E+05	6,65E-04±3,20E-05	139±2
Эксперимент 2
IL33-158LS	huIL-33 (WT без DTT)			(связывание отсутствует)
IL33-158LS	huIL-33 (WT+DTT)	4,11E+06±5,00E3	4,17E-04±3,30E-05	101±8	2,3
IL33-158LS	IL-33 яванского макака (WT+DTT)	5,32E+06±4,82E+05	1,21E-03±1,01E-04	228±2
IL33-167LS	huIL-33 (WT без DTT)			(связывание отсутствует)
IL33-167LS	huIL-33 (WT+DTT)	3,96E+06±5,00E+03	3,50E-04±1,30E-05	89±3	2,5
IL33-167LS	IL-33 яванского макака (WT+DTT)	5,50E+06±5,30E+05	1,19E-03±1,04E-04	218±2
IL33-265	huIL-33 (WT без DTT)			(связывание отсутствует)
IL33-265	huIL-33 (WT+DTT)	2,89E+06±6,00E+04	8,07E-05±1,27E-05	28±5	57,8
IL33-265	IL-33 яванского макака (WT+DTT)	2,58E+06±5,59E+05	3,80E-03±1,60E-04	1618±342
IL33-310 IgG	huIL-33 (WT без DTT)			(связывание отсутствует)

ПРИМЕР 29

Самовзаимодействие и полиреактивность оптимизированных антител против IL-33 и сравнительных антител

Антитела IL33-158 (SEQ ID NO: 227 SEQ ID NO: 209), IL33-158LS (SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 209) и IL33-312 (SEQ ID NO: 407 SEQ ID NO: 408) тестировали на связывание с ДНК и инсулином и вдобавок тестировали на самовзаимодействие в анализе AC-SINS (спектроскопия самовзаимодействия наночастиц с аффинным захватом; Liu et al., 2014, mAbs 6: 483-92). В анализе AC-SINS mAb, захваченные на золотых наносферах, вызывают сдвиг максимума поглощения, если они связываются друг с другом и тем самым заставляют бусины образовывать кластеры, и высокие оценки в этом анализе предположительно коррелируют с растворимостью и неспецифическими взаимодействиями с мембранами (Liu et al., 2014, mAbs 6: 483-92). IL33-158 и IL33-158LS имели очень низкие оценки AC-SINS, сравнимые с таковыми у отрицательного контроля, тогда как IL33-312 имело оценку, сравнимую с положительным контролем (таблица 43). IL33-312 также имело высокую оценку связывания ДНК, сравнимую с положительным контролем, тогда как IL33-158 и IL33-158LS демонстрировали более умеренные оценки. В совокупности, эти результаты показывают, что IL33-158 и IL33-158LS имели по существу более низкие показатели неспецифического связывания, чем IL33-312.

Таблица 43. Неспецифическое связывание и самовзаимодействие антител к IL-33

Антитело	HC SEQ №	LC SEQ №	AC-SINS (длина волны максимального поглощения относительно пустой пробы, нм)	ДНК-связывание, нормализованное по пустой пробе	Связывание инсулина, нормализованное по пустой пробе
IL33-158	227	209	0	5,25±0,09 (2)	6,42±1,82 (2)
L33-158LS	244	209	0	7,45±0,10 (8)	8,08±0,48 (8)
IL33-312	407	408	18±0,22	19,93	8,83
Отрицательный контроль полиреактивности (8.8)			1±0,07	2,14	3,22
Положительный контроль полиреактивности (MJ4-2 v1.1/P33)			22±1,11	21,78	14,77

Таким образом, изобретение раскрыто широко и проиллюстрировано в отношении репрезентативных вариантов осуществления, описанных выше. Специалистам в данной области понятно, что в настоящем изобретении можно выполнять различные модификации, не отступая от его сущности и объема. Все публикации, патентные заявки и выданные патенты включены в настоящее описание посредством ссылки в той же степени, как если бы каждую индивидуальную публикацию, патентную заявку или выданный патент конкретно и индивидуально указывали для включения посредством ссылки в полном объеме. Определения, которые содержатся в тексте, включенном посредством ссылки, исключены в такой степени, в какой они противоречат определениям в этом раскрытии.

Принимают во внимание, что определенные признаки изобретения, которые для прозрачности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, также можно предоставлять в комбинации в одном варианте осуществления. Наоборот, различные признаки по изобретению, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также можно предоставлять отдельно или в любой подходящей подкомбинации.

Конкретно предусмотрено, что любое ограничение, рассмотренное в отношении одного из вариантов осуществления изобретения, можно применять к любому другому варианту осуществления изобретения. Кроме того, любую композицию по изобретению можно использовать в любом способе по изобретению и любой способ по изобретению можно использовать для получения или использования любой композиции по изобретению. В частности, любой аспект изобретения, описанный в формуле изобретения, отдельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными пунктами формулы изобретения, и/или аспекты описания следует понимать в качестве комбинируемых с другими аспектами изобретения, приведенными в другом месте в формуле изобретения и/или описании и/или списках последовательностей и/или рисунках.

В той мере, в которой конкретные примеры, встречающиеся в настоящем описании, не попадают в объем изобретения, можно явно отказываться от указанного конкретного примера.

Использование термина «или» в формуле изобретения служит для обозначения «и/или», если явно не указано только на альтернативы или альтернативы являются взаимоисключающими, несмотря на то, что раскрытие допускает определение, которое относится только к альтернативам и «и/или». Как используют в настоящем описании, формы единственного числа могут обозначать единственное или множественное число, если явно не указано иное. Как используют в настоящем описании в пункте(ах) формулы изобретения, когда используют в сочетании со словом «содержать», формы единственного числа могут обозначать единственное или множественное число. Как используют в настоящем описании, «другой» может обозначать по меньшей мере второй или больше. Если не определено иное в настоящем описании, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, должны иметь значения, в которых их обычно понимают средние специалисты в данной области. Кроме того, пока контекст не требует иного, термины в единственном числе включают множественное число, и термины во множественном числе включают единственное число. Слова «содержит/содержащий» и слова «имеющий/включающий», когда используют в настоящем описании со ссылкой на настоящее изобретение, используют для того, чтобы обозначать присутствие указанных признаков, целых, стадий или компонентов, но они не отменяют присутствие или добавление одного или нескольких других признаков, целых, стадий, компонентов или их групп.

Несмотря на то, что раскрытые положения описаны со ссылкой на различные применения, способы и композиции, следует принимать во внимание, что различные изменения модификации можно выполнять, не отступая от положений настоящего описания и изобретения, заявленного далее. Примеры предоставлены для того, чтобы лучше иллюстрировать раскрытые положения, и не предназначены для ограничения объема положений, представленных в настоящем описании. Хотя данные положения описаны в терминах этих образцовых вариантов осуществления, многие вариации и модификации этих образцовых вариантов осуществления возможны без излишних экспериментов. Все такие вариации и модификации входят в объем данных положений.

Когда аспекты или варианты осуществления изобретения описаны в терминах группы Маркуша или других группировок альтернатив, настоящее изобретение относится не только ко всей группе, приведенной в целом, и к каждому элементу группы индивидуально и всем возможным подгруппам основной группы, а также к основной группе, в которой отсутствует один или несколько элементов группы. Настоящее изобретение также предусматривает явное исключение одного или нескольких из любых элементов группы в описываемом в заявке изобретении.

Все цитируемые в данном описании источники, в том числе патенты, патентные заявки, публикации, книги и т. п., а также цитируемые в них ссылки, в той степени, в которой они еще не, включены, таким образом, посредством ссылки в полном объеме. В том случае, если один или несколько включенных источников и схожих материалов отличается от этой заявки или противоречит ей, включая в качестве неограничивающих примеров определенные термины, использование терминов, описанные способы или тому подобное, эта заявка имеет решающее значение.

Описание и примеры детализируют определенные конкретные варианты осуществления изобретения и описывают лучший вариант, предусмотренный авторами изобретения. Однако следует принимать во внимание, что независимо от того, как детализированное выше появляется в тексте, изобретение можно осуществлять на практике многими путями, и изобретение следует толковать в соответствии с приложенной формулой изобретения и любыми ее экваивалентами.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ	Описание	Последовательность
1	IL-33 человека WT (R&D) C208, C227, C232 и C259, соответствующие C208, C227, C232 и C259 в SEQ ID NO: 396, выделены полужирным с подчеркиванием	SITGISPITE YLASLSTYND QSITFALEDE SYEIYVEDLK KDEKKDKVLL SYYESQHPSN ESGDGVDGKM LMVTLSPTKD FWLHANNKEH SVELHKCEKP LPDQAFFVLH NMHSNCVSFE CKTDPGVFIG VKDNHLALIK VDSSENLCTE NILFKLSET
2	ST2-Fc-His человека (R&D)	KFSKQSWGLE NEALIVRCPR QGKPSYTVDW YYSQTNKSIP TQERNRVFAS GQLLKFLPAE VADSGIYTCI VRSPTFNRTG YANVTIYKKQ SDCNVPDYLM YSTVSGSEKN SKIYCPTIDL YNWTAPLEWF KNCQALQGSR YRAHKSFLVI DNVMTEDAGD YTCKFIHNEN GANYSVTATR SFTVKDEQGF SLFPVIGAPA QNEIKEVEIG KNANLTCSAC FGKGTQFLAA VLWQLNGTKI TDFGEPRIQQ EEGQNQSFSN GLACLDMVLR IADVKEEDLL LQYDCLALNL HGLRRHTVRL SRKNPSKECF IEGRMDPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKHHH HHH
3	IL-33 человека (mm2) Остатки, соответствующие C208, C227, C232 и C259 в SEQ ID NO: 396, выделены полужирным с подчеркиванием	MSITGISPIT EYLASLSTYN DQSITFALED ESYEIYVEDL KKDEKKDKVL LSYYESQHPS NESGDGVDGK MLMVTLSPTK DFWLHANNKE HSVELHKSEK PLPDQAFFVL HNMHSNSVSF ESKTDPGVFI GVKDNHLALI KVDSSENLST ENILFKLSET HHHHHH
4	IL-33 человека WT FLAG остатки, соответствующие C208, C227, C232 и C259 в SEQ ID NO: 396, выделены полужирным с подчеркиванием	SITGISPITE YLASLSTYND QSITFALEDE SYEIYVEDLK KDEKKDKVLL SYYESQHPSN ESGDGVDGKM LMVTLSPTKD FWLHANNKEH SVELHKCEKP LPDQAFFVLH NMHSNCVSFE CKTDPGVFIG VKDNHLALIK VDSSENLCTE NILFKLSETL EDYKDDDDK
5	IL-33 яванского макака (CID42) Остатки, соответствующие C208, C227, C232 в SEQ ID NO: 396, выделены полужирным с подчеркиванием	MSITGISPIT ESLASLSTYN DQSITFALED ESYEIYVEDL KKDKKKDKVL LSYYESQHPS SESGDGVDGK MLMVTLSPTK DFWLQANNKE HSVELHKSEK PLPDQAFFVL HNRSFNSVSF ESKTDPGVFI GVKDNHLALI KVDYSENLGS ENILFKLSEI HHHHHH
6	human ST2-hIgG2Fc	KFSKQSWGLENEALIVRCPRQGKPSYTVDWYYSQTNKSIPTQERNRVFASGQLLKFLPAAVADSGIYTCIVRSPTFNRTGYANVTIYKKQSDCNVPDYLMYSTVSGSEKNSKIYCPTIDLYNWTAPLEWFKNCQALQGSRYRAHKSFLVIDNVMTEDAGDYTCKFIHNENGANYSVTATRSFTVKDEQGFSLFPVIGAPAQNEIKEVEIGKNANLTCSACFGKGTQFLAAVLWQLNGTKITDFGEPRIQQEEGQNQSFSNGLACLDMVLRIADVKEEDLLLQYDCLALNLHGLRRHTVRLSRKNPSKECFVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGMEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
7	Каркасная область DP-54 (подгруппа VH3) с JH4-сегментом	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYFDYWGQGTLVTVSS
8	JH4	WGQGTLVTVSS
9	Константная область с нулевой функцией эффектора IgG1 человека	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
10	Константная область IgG1 человека дикого типа	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
11	Каркас DPK9 (подгруппа VKI) с JK4-сегментом	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
12	JK4	FGGGTKVEIK
13	Константный домен κ человека	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
14	VH химеры 7E8	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCKTSGFTFSSYWMYWIRQAPGKGLEWVSSITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAENTIYLQMSSLRSEDTATYFCAKGHYYYTSYSLGYWGQGSLVTVSS
15	Секреторная лидерная последовательность VH химеры 7E8	MGWSCIILFLVATATGAHS
16	CDRH1 химеры 7E8	GFTFSSYWMY
17	CDRH2 химеры 7E8	SITPNGGNTYYPDSVKG
18	CDRH3 химеры 7E8	GHYYYTSYSLGY
19	VL химеры 7E8	EIQMTQSPSVLSASVGDRVTLSCKASQNINKHLDWYQQKLGEAPKLLIYFTNNLQTGIPSRFSGSGSGTDCTLTINSLQPGDVATYFCFQYNNGWTFGGGTKLELD
20	CDRL1 химеры 7E8	KASQNINKHLD
21	CDRL2 химеры 7E8	FTNNLQT
22	CDRL3 химеры 7E8	FQYNNGWT
23	JH химеры 7E8	WGQGSLVTVSS
24	CH1 hIgG1 WT	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
25	Шарнир IgG1 человека	EPKSCDKTHTCPPCP
26	CH2 эффектора hIgG1 с нулевой функцией	APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
27	CH3 hIgG1 WT	GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
28	HC химеры 7E8	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCKTSGFTFSSYWMYWIRQAPGKGLEWVSSITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAENTIYLQMSSLRSEDTATYFCAKGHYYYTSYSLGYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
29	JK химеры 7E8	FGGGTKLELD
30	CL	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
31	LC химеры 7E8	EIQMTQSPSVLSASVGDRVTLSCKASQNINKHLDWYQQKLGEAPKLLIYFTNNLQTGIPSRFSGSGSGTDCTLTINSLQPGDVATYFCFQYNNGWTFGGGTKLELDRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
32	VH химеры 9B3	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYSYSSYSFSYWGQGTLVTVSS
33	CDRH1 химеры 9B3	GFTFSNYWMY
34	CDRH2 химеры 9B3	SINNDGGNTYYLDSVKG
35	CDRH3 химеры 9B3	GHYSYSSYSFSY
36	VL химеры 9B3	DIQMTQSPSVLSASVGDRVTLSCKASHNINKHLDWCQQKVGEAPKLLIYFTNNLQTGIPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCFQYNSGWTFGGGTKLELK
37	CDRL1 химеры 9B3	KASHNINKHLD
38	CDRL3 химеры 9B3	FQYNSGWT
39	JH химеры 9B3	WGQGTLVTVSS
40	HC химеры 9B3	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYSYSSYSFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
41	JK химеры 9B3	FGGGTKLELK
42	LC химеры 9B3	DIQMTQSPSVLSASVGDRVTLSCKASHNINKHLDWCQQKVGEAPKLLIYFTNNLQTGIPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCFQYNSGWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
43	VH химеры 12F9	EVQLVESGGDLVQPGRSLKLSCVTSGFIFKNYWMTWIRQVPGKGLEWVASITNTGGATYYPDSVKGRFTISRDNSENTLYLQMNSLRSEDTATYYCARDRRYNSGSPFAYWGQGTLVTVSS
44	CDRH1 химеры 12F9	GFIFKNYWMT
45	CDRH2 химеры 12F9	SITNTGGATYYPDSVKG
46	CDRH3 химеры 12F9	DRRYNSGSPFAY
47	VL химеры 12F9	DIQLTQSPSTLAASLGERVTISCRASQSISNSLIWFQQKPDGTIKRLIYSSSTLESGVPSRFSGSGSGTDYSLSISSLESEDFAMYYCLQYATYPWTFGGGTKLELR
48	CDRL1 химеры 12F9	RASQSISNSLI
49	CDRL2 химеры 12F9	SSSTLES
50	CDRL3 химеры 12F9	LQYATYPWT
51	HC химеры 12F9	EVQLVESGGDLVQPGRSLKLSCVTSGFIFKNYWMTWIRQVPGKGLEWVASITNTGGATYYPDSVKGRFTISRDNSENTLYLQMNSLRSEDTATYYCARDRRYNSGSPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
52	JK химеры 12F9	FGGGTKLELR
53	LC химеры 12F9	DIQLTQSPSTLAASLGERVTISCRASQSISNSLIWFQQKPDGTIKRLIYSSSTLESGVPSRFSGSGSGTDYSLSISSLESEDFAMYYCLQYATYPWTFGGGTKLELRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
54	VH химеры 14D8	EVQLVDSGGDQVQPGRSLKLSCVASGFIFKNYWMTWIRQVPGKGLEWIASITNSGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKDTLYLQMNSLRSEDTATYYCARDRRYNSGSPFAYWGQGTLVTVSS
55	CDRH2 химеры 14D8	SITNSGGNTYYPDSVKG
56	VL химеры 14D8	DIQLTQSPSTLPASLGERVTISCRTSQSINNNLCWYQQKPDGTVKRLIYSTSTLESGVPSRFSGSGSGTDYSLSISSLESQDFAMYYCLQYATYPWTFGGGTKLELK
57	CDRL1 химеры 14D8	RTSQSINNNLC
58	CDRL2 химеры 14D8	STSTLES
59	HC химеры 14D8	EVQLVDSGGDQVQPGRSLKLSCVASGFIFKNYWMTWIRQVPGKGLEWIASITNSGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKDTLYLQMNSLRSEDTATYYCARDRRYNSGSPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
60	LC химеры 14D8	DIQLTQSPSTLPASLGERVTISCRTSQSINNNLCWYQQKPDGTVKRLIYSTSTLESGVPSRFSGSGSGTDYSLSISSLESQDFAMYYCLQYATYPWTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
61	VH химеры 30A1	QVNLLQSGATLVKPGASMKMSCKASGYSFTDYWVSWVKQSHGKSLEWIGEIYPNSGANNFNKEFKDKATLTVDKSTSTAYMELTRLTSEDSAVYYCTRGPYYYSSQIIFAYWGQGTLVTVSS
62	CDRH1 химеры 30A1	GYSFTDYWVS
63	CDRH2 химеры 30A1	EIYPNSGANNFNKEFKD
64	CDRH3 химеры 30A1	GPYYYSSQIIFAY
65	VL химеры 30A1	IIVMTQSPKSMSISVGDRVTMNCKASQNVGNNIAWYRQKPGQSPELLIYYASNRYTGVPDRFTGGGYGTDFTLTINSVQAEDAAFYYCQRIYNSPPTFGGGTKVELK
66	CDRL1 химеры 30A1	KASQNVGNNIA
67	CDRL2 химеры 30A1	YASNRYT
68	CDRL3 химеры 30A1	QRIYNSPPT
69	HC химеры 30A1	QVNLLQSGATLVKPGASMKMSCKASGYSFTDYWVSWVKQSHGKSLEWIGEIYPNSGANNFNKEFKDKATLTVDKSTSTAYMELTRLTSEDSAVYYCTRGPYYYSSQIIFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
70	JK химеры 30A1	FGGGTKVELK
71	LC химеры 30A1	IIVMTQSPKSMSISVGDRVTMNCKASQNVGNNIAWYRQKPGQSPELLIYYASNRYTGVPDRFTGGGYGTDFTLTINSVQAEDAAFYYCQRIYNSPPTFGGGTKVELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
72	VH химеры 30B11	QVKLLQSGAALVKPGASVKMSCATSGFSFTDYWVSWVKQSHGKGLEWIGEIYPNSGADNFNENFKGKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTRGPYYYSTQIIFAYWGQGTLVTVSS
73	CDRH1 химеры 30B11	GFSFTDYWVS
74	CDRH2 химеры 30B11	EIYPNSGADNFNENFKG
75	CDRH3 химеры 30B11	GPYYYSTQIIFAY
76	VL химеры 30B11	NIVMTQSPKSMSISVGDRVTMNCKASQNVGNNLAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGGGYGTDFTLTINSVQAEDAAFYYCQRIYNSPPTFGGGTKVELR
77	CDRL1 химеры 30B11	KASQNVGNNLA
78	HC химеры 30B11	QVKLLQSGAALVKPGASVKMSCATSGFSFTDYWVSWVKQSHGKGLEWIGEIYPNSGADNFNENFKGKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTRGPYYYSTQIIFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
79	JK химеры 30B11	FGGGTKVELR
80	LC химеры 30B11	NIVMTQSPKSMSISVGDRVTMNCKASQNVGNNLAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGGGYGTDFTLTINSVQAEDAAFYYCQRIYNSPPTFGGGTKVELRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
81	Химера 9B3/hu J VL	DIQMTQSPSVLSASVGDRVTLSCKASHNINKHLDWCQQKVGEAPKLLIYFTNNLQTGIPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCFQYNSGWTFGQGTKVEIK
82	Химера 9B3/hu J JK	FGQGTKVEIK
83	Химера 9B3/hu J LC	DIQMTQSPSVLSASVGDRVTLSCKASHNINKHLDWCQQKVGEAPKLLIYFTNNLQTGIPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCFQYNSGWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
84	Химера 14D8/hu J VL	DIQLTQSPSTLPASLGERVTISCRTSQSINNNLCWYQQKPDGTVKRLIYSTSTLESGVPSRFSGSGSGTDYSLSISSLESQDFAMYYCLQYATYPWTFGQGTKVEIK
85	Химера 14D8/hu J LC	DIQLTQSPSTLPASLGERVTISCRTSQSINNNLCWYQQKPDGTVKRLIYSTSTLESGVPSRFSGSGSGTDYSLSISSLESQDFAMYYCLQYATYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
86	Химера 30A1/hu J VL	IIVMTQSPKSMSISVGDRVTMNCKASQNVGNNIAWYRQKPGQSPELLIYYASNRYTGVPDRFTGGGYGTDFTLTINSVQAEDAAFYYCQRIYNSPPTFGGGTKVEIK
87	Химера 30A1/hu J LC	IIVMTQSPKSMSISVGDRVTMNCKASQNVGNNIAWYRQKPGQSPELLIYYASNRYTGVPDRFTGGGYGTDFTLTINSVQAEDAAFYYCQRIYNSPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
88	Химера 30B11/hu J VL	NIVMTQSPKSMSISVGDRVTMNCKASQNVGNNLAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGGGYGTDFTLTINSVQAEDAAFYYCQRIYNSPPTFGGGTKVEIK
89	Химера 30B11/hu J LC	NIVMTQSPKSMSISVGDRVTMNCKASQNVGNNLAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGGGYGTDFTLTINSVQAEDAAFYYCQRIYNSPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
90	VH трансплантата CDR 7E8	HSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
91	VL трансплантата CDR 7E8	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNNGWTFGGGTKVEIK
92	HC трансплантата CDR 7E8	HSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
93	LC трансплантата CDR 7E8	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNNGWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
94	IL33-10 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
95	IL33-10 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
96	CH2 hIgG1 WT	APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
97	VH трансплантата CDR 9B3	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMYWVRQAPGKGLEWVASINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYSYSSYSFSYWGQGTLVTVSS
98	VL трансплантата CDR 9B3	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASHNINKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNSGWTFGGGTKVEIK
99	HC трансплантата CDR 9B3	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMYWVRQAPGKGLEWVASINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYSYSSYSFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
100	LC трансплантата CDR 9B3	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASHNINKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNSGWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
101	VH трансплантата CDR 12F9	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKNYWMTWVRQAPGKGLEWVASITNTGGATYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRYNSGSPFAYWGQGTLVTVSS
102	CDRH1 трансплантата CDR 12F9	GFTFKNYWMT
103	VL трансплантата CDR 12F9	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNSLIWYQQKPGKAPKLLIYSSSTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYATYPWTFGGGTKVEIK
104	HC трансплантата CDR 12F9	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKNYWMTWVRQAPGKGLEWVASITNTGGATYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRRYNSGSPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
105	LC трансплантата CDR 12F9	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNSLIWYQQKPGKAPKLLIYSSSTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYATYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
106	VH трансплантата CDR 30B11	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYWVSWVRQAPGKGLEWVAEIYPNSGADNFNENFKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPYYYSTQIIFAYWGQGTLVTVSS
107	CDRH1 трансплантата CDR 30B11	GFTFTDYWVS
108	VL трансплантата CDR 30B11	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGNNLAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQRIYNSPPTFGGGTKVEIK
109	HC трансплантата CDR 30B11	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYWVSWVRQAPGKGLEWVAEIYPNSGADNFNENFKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPYYYSTQIIFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
110	LC трансплантата CDR 30B11	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGNNLAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQRIYNSPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
111	VH трансплантата CDR 30B11_R71V	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYWVSWVRQAPGKGLEWVAEIYPNSGADNFNENFKGRFTISVDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPYYYSTQIIFAYWGQGTLVTVSS
112	HC трансплантата CDR 30B11_R71V	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYWVSWVRQAPGKGLEWVAEIYPNSGADNFNENFKGRFTISVDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPYYYSTQIIFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
113	9B3-1 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYYYSSYSLGYWGQGTLVTVSS
114	9B3-1 CDRH3	GHYYYSSYSLGY
115	9B3-1 VL	DIQMTQSPSVLSASVGDRVTLSCKASHNINKHLDWYQQKVGEAPKLLIYFTNNLQTGIPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCFQYNSGWTFGQGTKVEIK
116	9B3-1 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYYYSSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
117	9B3-1 LC	DIQMTQSPSVLSASVGDRVTLSCKASHNINKHLDWYQQKVGEAPKLLIYFTNNLQTGIPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCFQYNSGWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
118	9B3-2A VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYSYSSYSFGYWGQGTLVTVSS
119	9B3-2A CDRH3	GHYSYSSYSFGY
120	9B3-2A HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYSYSSYSFGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
121	9B3-2B VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCVKGHYSYSSYSIDYWGQGTLVTVSS
122	9B3-2B CDRH3	GHYSYSSYSIDY
123	9B3-2B HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCVKGHYSYSSYSIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
124	9B3-3 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYSYSSYSIDYWGQGTLVTVSS
125	9B3-3 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYSYSSYSIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
126	9B3-5 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYSYTSYSFGYWGQGTLVTVSS
127	9B3-5 CDRH3	GHYSYTSYSFGY
128	9B3-5 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYSYTSYSFGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
129	9B3-7 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGRYYYSSYSFAYWGQGTLVTVSS
130	9B3-7 CDRH3	GRYYYSSYSFAY
131	9B3-7 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGRYYYSSYSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
132	9B3-13 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCARGHYYYNSYSFAHWGQGTLVTVSS
133	9B3-13 CDRH3	GHYYYNSYSFAH
134	9B3-13 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCARGHYYYNSYSFAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
135	9B3-15 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYSYSSYSFANWGQGTLVTVSS
136	9B3-15 CDRH3	GHYSYSSYSFAN
137	9B3-15 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYSYSSYSFANWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
138	9B3-17 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCARGHYYYSSYSFGSWGQGTLVTVSS
139	9B3-17 CDRH3	GHYYYSSYSFGS
140	9B3-17 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCARGHYYYSSYSFGSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
141	9B3-22 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHFSYTSYSFAYWGQGTLVTVSS
142	9B3-22 CDRH3	GHFSYTSYSFAY
143	9B3-22 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHFSYTSYSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
144	9B3-31V2 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYYYSSYSFAFWGQGTLVTVSS
145	9B3-31V2 CDRH3	GHYYYSSYSFAF
146	9B3-31V2 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYYYSSYSFAFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
147	9B3-36 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYYYTSYSFAYWGQGTLVTVSS
148	9B3-36 CDRH3	GHYYYTSYSFAY
149	9B3-36 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYYYTSYSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
150	9B3-79 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCARGHYYYTSYSFAYWGQGTLVTVSS
151	9B3-79 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCARGHYYYTSYSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
152	9B3-124 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYYYTSYSFGYWGQGTLVTVSS
153	9B3-124 CDRH3	GHYYYTSYSFGY
154	9B3-124 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYYYTSYSFGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
155	9B3-162 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYYYSSYSFGYWGQGTLVTVSS
156	9B3-162 CDRH3	GHYYYSSYSFGY
157	9B3-162 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYYYSSYSFGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
158	9B3-563 VH	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYYYSSYSFAYWGQGTLVTVSS
159	9B3-563 CDRH3	GHYYYSSYSFAY
160	9B3-563 HC	EVQLVETGGGLVQPGRSLKLSCVASGFTFSNYWMYWIRQAPGMGLEWVSSINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRNNAENTVYLQMNSLRSEDTATYYCAKGHYYYSSYSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
161	IL33-11 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
162	IL33-11 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
163	IL33-12 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
164	IL33-12 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASINNDGGNTYYLDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
165	IL33-13 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYSYSSYSFSYWGQGTLVTVSS
166	IL33-13 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYSYSSYSFSYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
167	IL33-45 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPDGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
168	IL33-45 CDRH2	SITPDGGNTYYPDSVKG
169	IL33-45 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPDGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
170	IL33-55 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGDTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
171	IL33-55 CDRH2	SITPNGGDTYYPDSVKG
172	IL33-55 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGDTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
173	IL33-56 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGETYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
174	IL33-56 CDRH2	SITPNGGETYYPDSVKG
175	IL33-56 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGETYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
176	IL33-57 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTDYSLGYWGQGTLVTVSS
177	IL33-57 CDRH3	GHYYYTDYSLGY
178	IL33-57 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTDYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
179	IL33-58 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPLGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
180	IL33-58 CDRH2	SITPLGGNTYYPDSVKG
181	IL33-58 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPLGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
182	IL33-61 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGETYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTDYSLGYWGQGTLVTVSS
183	IL33-61 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGETYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTDYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
184	IL33-62 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGDTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTDYSLGYWGQGTLVTVSS
185	IL33-62 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGDTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTDYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
186	IL33-68 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTAYSLGYWGQGTLVTVSS
187	IL33-68 CDRH3	GHYYYTAYSLGY
188	IL33-68 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTAYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
189	IL33-74 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINDHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNNGWTFGGGTKVEIK
190	IL33-74 CDRL1	KASQNINDHLD
191	IL33-74 LC	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINDHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNNGWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
192	IL33-75 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIDKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNNGWTFGGGTKVEIK
193	IL33-75 CDRL1	KASQNIDKHLD
194	IL33-75 LC	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIDKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNNGWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
195	IL33-80 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNNGWTFGGGTKVEIK
196	IL33-80 CDRL2	FTNNLQD
197	IL33-80 LC	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNNGWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
198	IL33-81 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNNGWTFGGGTKVEIK
199	IL33-81 CDRL2	FTNNLQE
200	IL33-81 LC	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNNGWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
201	IL33-103 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNGGETYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
202	IL33-103 CDRH2	AITPNGGETYYPDSVKG
203	IL33-103 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNGGETYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
204	IL33-117 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGEDYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
205	IL33-117 CDRH2	SITPNGGEDYYPDSVKG
206	IL33-117 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNGGEDYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
207	IL33-136 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNQGWTFGGGTKVEIK
208	IL33-136 CDRL3	FQYNQGWT
209	IL33-136 LC	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKHLDWYQQKPGKAPKLLIYFTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQYNQGWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
210	IL33-153 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNAGEDYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
211	IL33-153 CDRH2	SITPNAGEDYYPDSVKG
212	IL33-153 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNAGEDYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
213	IL33-154 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNAGEDYYPESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
214	IL33-154 CDRH2	SITPNAGEDYYPESVKG
215	IL33-154 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNAGEDYYPESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
216	IL33-155 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNGGEDYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
217	IL33-155 CDRH2	AITPNGGEDYYPDSVKG
218	IL33-155 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNGGEDYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
219	IL33-156 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNGGEDYYPESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
220	IL33-156 CDRH2	AITPNGGEDYYPESVKG
221	IL33-156 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNGGEDYYPESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
222	IL33-157 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNAGEDYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
223	IL33-157 CDRH2	AITPNAGEDYYPDSVKG
224	IL33-157 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNAGEDYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
225	IL33-158 VH	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMYWVRQA PGKGLEWVAA ITPNAGEDYY PESVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARGH YYYTSYSLGY WGQGTLVTVS S
226	IL33-158 CDRH2	AITPNAGEDYYPESVKG
227	IL33-158 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNAGEDYYPESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
228	IL33-175 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNAGETYYPESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
229	IL33-175 CDRH2	AITPNAGETYYPESVKG
230	IL33-175 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNAGETYYPESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
231	IL33-186 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNGGETYYPESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
232	IL33-186 CDRH2	AITPNGGETYYPESVKG
233	IL33-186 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNGGETYYPESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
234	IL33-187 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNAGETYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSS
235	IL33-187 CDRH2	AITPNAGETYYPDSVKG
236	IL33-187 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNAGETYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
237	Константная область IgG1 человека с нулевой эффекторной функцией, лизин удален	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
238	Константная область IgG1 человека с нулевой эффекторной функцией, лизин удален, LS	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG
239	Секреторная лидерная последовательность VH IL33-158-152	MGWSCIILFLVATATGVHS
240	CH3 hIgG1 ΔK	GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
241	IL33-158-152 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNAGEDYYPESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
242	IL33-167-153 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNAGEDYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
243	CH3 hIgG1 LS	GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG
244	IL33-158LS HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVAAITPNAGEDYYPESVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG
245	IL33-167LS HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVASITPNAGEDYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGHYYYTSYSLGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG
246	IL33-271 VH	QVLLVQSGAEVKKPGATVKVSCKASGSTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNNGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARELRYNWKSWGQGTLVTVSS
247	IL33-271 CDRH1	GSTFTGYYMH
248	IL33-271 CDRH2	WINPNNGGTNYAQKFQG
249	IL33-271 CDRH3	ELRYNWKS
250	IL33-271 VL	EIVLTQSPGTLSLSPGERVTLSCRASQSVGRPYLAWYQQIPGQAPRLLIYGASSRATDIPDRFSGNGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDNSPYTFGQGTRLEIK
251	IL33-271 CDRL1	RASQSVGRPYLA
252	IL33-271 CDRL2	GASSRAT
253	IL33-271 CDRL3	QQYDNSPYT
254	IL33-271 HC	QVLLVQSGAEVKKPGATVKVSCKASGSTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNNGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARELRYNWKSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
255	IL33-271 JK	FGQGTRLEIK
256	IL33-271 LC	EIVLTQSPGTLSLSPGERVTLSCRASQSVGRPYLAWYQQIPGQAPRLLIYGASSRATDIPDRFSGNGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDNSPYTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
257	Обширный консенсус CDR L1	(K/S/H/T/Q/W/Y/F/R)(A/S/G)(S/A/D)(Q/H/S/E/D/T)(N/S/D/R/K/Y/E/G)(I/V)(N/F/K/H/R/L/M/I/E/S)(K/Q/ E/R/W/F/Y/N/A/S/H)(H/F/R/W)(L/I/V/A)(D/S/A)
258	Консенсус CDR L1 7E8 9B3 зародышевой линии, ABS мутагенез	(K/R)AS(Q/H)(N/S)(I/V)(N/S)(K/S/N)HLD
259	Консенсус CDR L1 7E8 9B3, ABS мутагенез	(K/R)AS(Q/H)(N/S)I(N/S)(K/S)HLD
260	Консенсус CDR L1 7E8, ABS	(K/R)ASQ(N/S)I(N/S)(K/S)HLD
261	Обширный консенсус CDR L2	(F/W/Y/D/E/G/S)(T/G/R/A/N/V)(N/W/Y/R/F/K/Q/E/D/H/S)(N/F/Y/I/M/Q/L/A/R/G/P/S)(L/I/V/R)(Q/R/K/F/H/L/W/Y/A/E)(T/S/N/Y)
262	Консенсус CDR L2 7E8 зародышевой линии, ABS мутагенез	(F/Y)(A/T)(N/S)(N/S)L(Q/E)(T/S)
263	Консенсус CDR L2 7E8, ABS мутагенез	F(T/A)(N/S)(N/S)LQ(T/S)
264	Консенсус CDR L2 7E8, ABS	F(A/T)(N/S)NLQ(T/S)
265	Обширный консенсус CDR L3	(F/Q/W/H/A)(Q/S/T/A)(Y/H/F)(N/W/F/Y/R/K/H/D)(N/S/Q/W/K/R/H/Y/D/G/T/V)(G/R/P/K/W/F/I/N/Q)(W/H)(T/S/Q)
266	Консенсус CDR L3 7E8 9B3, ABS мутагенез	(F/Q)Q(Y/F)(N/Y)(N/S/Q/R/Y)GWT
267	Консенсус CDR L3 7E8 9B3, ABS	(F/Q)QY(N/Y)(N/S/Q/R)GWT
268	Консенсус CDR L3 7E8, ABS	(F/Q)QY(N/Y)(N/S/Q)GWT
269	Обширный консенсус CDR H1	G(F/Y/H)(T/Q/N/S/E/D/R/Y)(F/Y/H)(S/E/D/T/W)(N/S/T/E/D/H/L/I/Y/R/K/G)(Y/F/H)(W/H/Y/A/G)(M/E/Q/I)(Y/F/H/N)
270	Консенсус CDR H1 7E8 9B3, ABS мутагенез	GF(T/E)F(S/E)(N/S)YWMY
271	Консенсус CDR H1 7E8 9B3, ABS	GFTFS(N/S)YWMY
272	Консенсус CDR H2 Broad	(S/A/T)(I/V)(T/H/N/S)(P/N/F/M)(N/I/D/Y/W)(G/A)(G/H/D/E/R/K/Y/S)(N/Y/D/E/Q/H)(T/K/E/S/I/A/D)(Y/H/W)(Y/F/H)(P/V/L/D/S)(D/E/Q/A)(S/A/N/D)(V/D/T)(K/N/D/S/E/Q)G
273	Консенсус CDR H2 7E8 9B3, ABS мутагенез	(S/A)I(T/N)(P/N)(N/D)(G/A)(G/S/H)(N/D/E)(T/K/D/E)YY(P/V/L)(D/E)SV(K/Q)G
274	Консенсус CDR H2 7E8 9B3, ABS	(S/A)I(T/N)(P/N)(N/D)(G/A)(G/S)(N/E)(T/K/D)YY(P/V/L)(D/E)SVKG
275	Консенсус CDR H2 7E8, ABS	(S/A)ITP(N/D)(G/A)(G/S)(N/E)(T/K/D)YY(P/V)(D/E)SVKG
276	Обширный консенсус CDR H3	(G/S/A/T/D)(H/K/R/Y)(Y/H/F/S)(Y/H/R/S)(Y/H/W/F/R/S)(T/N/V/I/S/A/G/Y)(S/N/A/Q/D/G/R/Y)(Y/W/H/F/G/D/N)(S/A/G)(L/M/F/I)(G/A/Y/S/D)(Y/N/S/F/E/D/H/I/V)
277	Консенсус CDR H3 7E8 9B3, мутагенез и репертуар	G(H/R/Y)(Y/F)(Y/S)(Y/H)(T/S/N)(S/A)YS(L/F/I)(G/S/A)(Y/H/N/S/F)
278	Консенсус CDR H3 7E8 9B3, мутагенез	G(H/Y)Y(Y/S)(Y/ H)(T/S/N)(S/A)YS(L/F)(G/S)Y
279	Консенсус CDR H3 7E8 9B3	GHY(Y/S)Y(T/S)SYS(L/F)(G/S)Y
SEQ ID NO: 280-352 и 353-395 см. В таблицах 2 и 3, соответственно.
396	Полноразмерный IL-33 человека Swiss Prot O95760-1. Остатки C208, C227, C232 и C259 выделены полужирным с подчеркиванием	MKPKMKYSTN KISTAKWKNT ASKALCFKLG KSQQKAKEVC PMYFMKLRSG LMIKKEACYF RRETTKRPSL KTGRKHKRHL VLAACQQQST VECFAFGISG VQKYTRALHD SSITGISPIT EYLASLSTYN DQSITFALED ESYEIYVEDL KKDEKKDKVL LSYYESQHPS NESGDGVDGK MLMVTLSPTK DFWLHANNKE HSVELHKCEK PLPDQAFFVL HNMHSNCVSF ECKTDPGVFI GVKDNHLALI KVDSSENLCT ENILFKLSET
397	IL-33 яванского макака дикого типа	SITGISPITE SLASLSTYND QSITFALEDE SYEIYVEDLK KDKKKDKVLL SYYESQHPSS ESGDGVDGKM LMVTLSPTKD FWLQANNKEH SVELHKCEKP LPDQAFFVLH NRSFNCVSFE CKTDPGVFIG VKDNHLALIK VDYSENLGSE NILFKLSEIH HHHHH
398	ДНК последовательность, кодирующая легкую цепь IL33-158LS	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAAAGCAAGTCAGAATATTAATAAACACTTAGACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTTTACAAACAATTTACAAACTGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCTTTCAGTATAACCAGGGGTGGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
399	ДНК последовательность, кодирующая тяжелую цепь IL33-158LS	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCAGTTCCTACTGGATGTACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGCCATTACTCCTAATGCCGGTGAGGACTACTATCCAGAGTCTGTGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTCCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCCATTATTACTATACCAGCTATTCGCTTGGATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCTGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCTGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGTTGCATGAGGCTCTGCACTCCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGA
400	ДНК последовательность, кодирующая легкую цепь IL33-167LS	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAAAGCAAGTCAGAATATTAATAAACACTTAGACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTTTACAAACAATTTACAAACTGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCTTTCAGTATAACAATGGGTGGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
401	ДНК последовательность, кодирующая тяжелую цепь IL33-167LS	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCAGTTCCTACTGGATGTACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCTCCATTACTCCTAATGCCGGTGAGGACTACTATCCAGACTCTGTGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTCCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCCATTATTACTATACCAGCTATTCGCTTGGATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCTGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCTGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGTTGCATGAGGCTCTGCACTCCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGA
402	Лидерная последовательность	MGWSCIILFL VATATGAHS
403	Тяжелая цепь IL33-265, основанная на H4H9675P в US 2014/0271658, SEQ ID NO: 274	EVQLVESGGN LEQPGGSLRL SCTASGFTFS RSAMNWVRRA PGKGLEWVSG ISGSGGRTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLSAED TAAYYCAKDS YTTSWYGGMD VWGHGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPEAA GAPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
404	Легкая цепь IL33-265, основанная на H4H9675P в US 2014/0271658, SEQ ID NO: 282	DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCRASQGIF SWLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAIYYCQQ ANSVPITFGQ GTRLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
405	Тяжелая цепь IL33-310, основанная на 10C12.38.H6. 87Y.581 IgG4 в US 2016/0168242, SEQ ID NO: 306	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVAT ISGGKTFTDY VDSVKGRFTI SRDDSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTRAN YGNWFFEVWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPPCPA PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSQEEMTKN QVSLSCAVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLVSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLG
406	Легкая цепь IL33-310, основанная на 10C12.38.H6. 87Y.581 IgG4 в US 2016/0168242, SEQ ID NO: 307	EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVA KYGLSLLNWF QQKPGQPPRL LIFAASNRGS GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSKEVPF TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
407	Тяжелая цепь IL33-312, основанная на 33_640087-7B в WO 16156440,SEQ ID NO: 615	EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWVSG ISAIDQSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARQK FMQLWGGGLR YPFGYWGQGT MVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA PEFEGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
408	Легкая цепь IL33-312, основанная на 33_640087-7B в WO 16156440, SEQ ID NO: 617	SYVLTQPPSV SVSPGQTASI TCSGEGMGDK YAAWYQQKPG QSPVLVIYRD TKRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCGVI QDNTGVFGGG TKLTVLGQPK AAPSVTLFPP SSEELQANKA TLVCLISDFY PGAVTVAWKA DSSPVKAGVE TTTPSKQSNN KYAASSYLSL TPEQWKSHRS YSCQVTHEGS TVEKTVAPTE CS
409	Тяжелая цепь IL33-313, основанная на 33 640237-2B в WO 16156440, SEQ ID NO: 623	EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWVSG IADDFTSTYY ADPVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL WMMNYAGGLR YPFGYWGQGT MVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA PEFEGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
410	Легкая цепь IL33-313, основанная на 33 640237-2B в WO 16156440, SEQ ID NO: 625	SYVLTQPPSV SVSPGQTASI TCSGERMGDK YAAWYQQKPG QSPVLVIYRD TKRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCGVL KQDTGVFGGG TKLTVLGQPK AAPSVTLFPP SSEELQANKA TLVCLISDFY PGAVTVAWKA DSSPVKAGVE TTTPSKQSNN KYAASSYLSL TPEQWKSHRS YSCQVTHEGS TVEKTVAPTE CS

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с IL-33 человека и IL-33 яванского макака, содержащее:

(i) CDR-L1, содержащую SEQ ID NO: 20, в соответствии с нумерацией по Кэбат,

(ii) CDR-L2, содержащую SEQ ID NO: 21, в соответствии с нумерацией по Кэбат,

(iii) CDR-L3, содержащую SEQ ID NO: 208, в соответствии с нумерацией по Кэбат,

(iv) CDR-H1, содержащую SEQ ID NO: 16, в соответствии с нумерацией по Кэбат,

(v) CDR-H2, содержащую SEQ ID NO: 226, в соответствии с нумерацией по Кэбат,

(vi) CDR-H3, содержащую SEQ ID NO: 18, в соответствии с нумерацией по Кэбат.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащее VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 225, и VL с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 207.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, содержащее каркасную VL и каркасную VH, и

где последовательность одной или обеих каркасных VL или каркасных VH по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности зародышевой линии человека, из которой она получена, и

где последовательность VL зародышевой линии человека, из которой получена каркасная VL, выбрана из группы, состоящей из DPK9, DPK12, DPK18, DPK24, HK102_V1, DPK1, DPK8, DPK3, DPK21, Vg_38K, DPK22, DPK15, DPL16, DPL8, V1-22, консенсусной Vλ, консенсусной Vλ1, консенсусной Vλ3, консенсусной Vκ, консенсусной Vκ1, консенсусной Vκ2 и Vκ3, и

где последовательность VH зародышевой линии человека, из которой получена каркасная VH, выбрана из группы, состоящей из DP54, DP47, DP50, DP31, DP46, DP71, DP75, DP10, DP7, DP49, DP51, DP38, DP79, DP78, DP73, VH3, VH5, VH1 и VH4.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, содержащее VH, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 225, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 207.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, содержащее VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 225, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 207.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, содержащее Fc-домен, и

где Fc-домен представляет собой Fc-домен из IgA₁, IgA₂, IgD, IgE, IgM, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, содержащее HC, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 244, и LC, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 209.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-7, содержащее НС, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 244, и LC, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 209.

9. Плазмида для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8, депонированная в ATCC и имеющая номер доступа ATCC PTA-122724, или депонированная в ATCC и имеющая номер доступа ATCC PTA-122725.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пп.1-9, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается:

а) с IL-33 человека со значением K_D, равным приблизительно или меньше значения, выбранного из группы, состоящей из приблизительно 10 нМ, 5 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 900 пМ, 800 пМ, 700 пМ, 600 пМ, 500 пМ, 400 пМ, 300 пМ, 250 пМ, 200 пМ, 150 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 25 пМ, 20 пМ, 15 пМ, 10 пМ, 5 пМ и 1 пМ, и/или

b) с IL-33 яванского макака со значением K_D, равным приблизительно или меньше значения, выбранного из группы, состоящей из приблизительно 10 нМ, 5 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 900 пМ, 800 пМ, 700 пМ, 600 пМ, 500 пМ, 400 пМ, 300 пМ, 250 пМ, 200 пМ, 150 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 25 пМ, 20 пМ, 15 пМ, 13 пМ, 10 пМ, 5 пМ и 1 пМ.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пп.1-10, где:

а) значение K_D связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с IL-33 яванского макака приблизительно в 10 раз выше K_D связывания с IL-33 человека; и/или

b) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с активным IL-33 с более низким значением K_D, чем значение K_D, при котором они связываются с неактивным IL-33.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пп.1-11, где конечное время полужизни в организме человека составляет по меньшей мере приблизительно 31 день.

13. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8 или 10, 11, содержащая:

(i) одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8 или 10, 11; или

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, как показано в одной или нескольких SEQ ID NO: 398, 399, 400 и 401.

14. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8 или 10, 11, депонированная в ATCC и имеющая номер доступа PTA-122724 или номер доступа PTA.122725.

15. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.13 или 14.

16. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8 или 10, 11, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.13 или 14, или вектор по п.15.

17. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который включает культивирование клетки-хозяина по п.16 в условиях, при которых указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется указанной клеткой-хозяином.

18. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или состояния, которое ингибируется или предотвращается при удалении, ингибировании или снижении активности передачи сигналов IL-33, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8 или 10, 11 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

19. Способ лечения медицинского состояния, включающий введение больному терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8 или 10, 11 или фармацевтической композиции по п.18,

где медицинское состояние выбрано из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, аллергий, аллергического ринита, аллергического конъюнктивита, весеннего кератоконъюнктивита, сезонной аллергии, аллергии на домашних животных, астмы, пищевой аллергии, аллергии на арахис, атопического дерматита, хронического риносинусита с носовыми полипами (CRSwNP), аллергического ринита, бронхита, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), вирусных обострений дыхательного заболевания, вирусной инфекции у детей и взрослых (респираторный синцитиальный вирус (RSV), риновирус, грипп), крапивницы, эозинофильного эзофагита, хронического фиброза, фиброза печени, неалкогольного стеатогепатита (NASH), хронической почечной недостаточности, идиопатического фиброза легких (IPF), склеродермии, системного склероза, острого повреждения почек, сепсиса, панкреатита, диабета 1 типа, реакции трансплантат против хозяина (GVHD), реакции тканевого трансплантата, болезни Альцгеймера, ревматоидного артрита, синдрома раздраженной кишки (IBS), болезни Крона, язвенного колита, рассеянного склероза, псориаза, глютеновой болезни и болезни или феномена Рейно.

20. Способ по п.19, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или указанную фармацевтическую композицию вводят в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.

21. Способ по п.20, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или указанную фармацевтическую композицию вводят в сочетании с антагонистом IL-4 и/или антагонистом IL-13.