Способ производства четырехвалентной субъединичной вакцины против гриппа без адъювантов

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к способу производства четырехвалентной субъединичной вакцины без адъювантов для профилактики гриппа, согласно которому а) получают четыре моновакцины, содержащие один из серотипов вирусов гриппа H1N1, H3N2, В (линия Виктория) или В (линия Ямагата), причем для получения моновакцин получают вируссодержащую аллантоисную жидкость, затем инактивируют ее бета-пропиолактоном и очищают и концентрируют методами микрофильтрации, ультрафильтрации и двумя циклами ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы; разрушают вирионы в полученном очищенном вирусном концентрате последовательной обработкой Тритоном Х-100 и ТДТАБ; удаляют субвирионные структуры методами ультрацентрифугирования и микрофильтрации и детергенты методами ультрафильтрации и концентрирования полученного очищенного супернатанта с последующей очисткой методом гидрофобной хроматографии с применением технологии «ExpandedBedAdsorption»; разбавляют концентрат фосфатным буферным раствором, содержащим Тритон Х-100, с получением моновакцины; б) объединяют четыре моновакцины в единую лекарственную форму. Технический результат заключается в улучшении очистки и иммуногенности четырехвалентной субъединичной вакцины без адъювантов при ее производстве в соответствии с заявленным способом. 3 з.п. ф-лы, 14 ил., 2 табл., 11 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа производства четырехвалентной субъединичной вакцины для профилактики гриппа без адъювантов.

Предшествующий уровень техники

Согласно практике мирового здравоохранения, основным средством борьбы с заболеваемостью гриппом является иммунизация населения инактивированными вакцинами против гриппа. Инактивированные вакцины против гриппа разделяются на цельновирионные, расщепленные и субъединичные. В период с 40-х - 60-х гг. XX века в мире для вакцинации населения использовались преимущественно цельновирионные вакцины. Эти вакцины индуцировали устойчивый протективный иммунитет у привитых людей, однако они обладали высокой реактогенностью и поэтому не могли применяться для вакцинации детей. В 60-70 годы появились два новых класса вакцин. Первой была разработана вакцина расщепленная, в состав которой входили как поверхностные, так и внутренние антигены вирусов гриппа, но которая уже не содержала вирионных и субвирионных структур. Этот класс вакцин обладал существенно меньшей реактогенностью по сравнению с цельновирионными вакцинами, но остаточная реактогенность у этих вакцин все-таки была, предположительно в следствии наличия в их составе агрегированных и частично денатурированных форм мембранного белка (M1). В середине 70-х гг. стали появляться субъединичные вакцины, в состав которых входили преимущественно поверхностные антигены вирусов гриппа (1). За счет отсутствия различных форм мембранного белка в их составе, а также за счет более высокого качества очистки вирионов, этот класс вакцин является наименее низкой реактогенным, обладает достаточной иммуногенностью и поэтому может применяться для вакцинации населения всех возрастов.

Последние несколько лет международными центрами ВОЗ было выявлено, что в течении текущих эпидемиологических сезонов в человеческой популяции циркулируют не три серотипа вирусов гриппа (H3N2, H1N1, В), как это было раньше, а четыре. Было установлено, что серотип В разделился на две независимые линии, а именно линия Ямагато и линия Виктория. Поэтому ВОЗ рекомендует всем производителям вакцин против гриппа переходить на выпуск четырехвалентных препаратов, которые более полно защищают людей от этого заболевания.

Большое значение для производства всех типов инактивированных вакцин имеет качество очистки вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) от дебрисных структур, которые образуются в процессе размножения вирусов гриппа в куриных эмбрионах (КЭ). В РФ первоначально для очистки от этих структур использовалась технология сорбции-элюции на формализированных куриных эритроцитах (4). Эта технология позволяла в достаточно высокой степени очищать ВАЖ от дебрисных структур, однако не позволяла добиться воспроизводимых результатов из-за различной способности штаммов вирусов гриппа сорбироваться на формализированные куриные эритроциты. По причине не воспроизводимости результатов на этой технологической стадии проведение процесса валидации согласно правилам GMP («надлежащей производственной практики»)было практически невозможно. В рекомендациях ВОЗ относительно производства препаратов для вакцинации людей указывается, что для основных технологических стадий должны быть проведены процессы валидации в соответствии с правилами GMP. В процессе развития современной биотехнологии в РФ были разработаны технологические подходы, которые позволили проводить очистку ВАЖ без использования эритроцитов. В одной из этих технологий при очистке ВАЖ использовались методы сепарации с использованием центрифугирования, различные виды микрофильтрации и ультрафильтрации, а для получения ОВК использовали метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы (5). Эти же авторы провели дальнейшую оптимизацию своей технологии с использованием нейтральных и основных аминокислот, а также детергентов (6).

Необходимо отметить, что в обоих этих изобретениях для проведения инактивации инфекционной активности вирусов гриппа указано использование метода ультрафиолетового облучения, который также не позволяет получать воспроизводимые результаты и, поэтому, не позволяет провести валидацию всего производственного процесса согласно требованиям GMP. Требования к производству и качеству инактивированных гриппозных вакцин подробно указаны в нормативном документе ЕС от 2014 года (2) и ГФ РФ издание XIV (14). В этих документах указано, что для проведения инактивации инфекционной активности вирусов гриппа в процессе получения вакцин необходимо использовать обработку дезинфектантами: формалином или бета-пропиолактоном, так как использование этих дезинфектантов обеспечивает надежную и воспроизводимую инактивацию вирусов гриппа. Использование бета-пропиолактона для инактивации инфекционной активности вирусов гриппа в составе ВАЖ было впервые проведено в 1991 году (11). Позднее было показано, что использование этого дезинфектанта в процессе инактивации вирусов гриппа не влияет на антигенную структуру антигена ГА в отличие от использования дезинфектанта формалина (10).

В РФ был разработан способ получения расщепленной вакцины (7), в котором для инактивации вирусов гриппа в составе ВАЖ используется дезинфектант бета-пропиолактон, для предварительной очистки ВАЖ используются 2 каскада глубинных фильтров с диаметрами пор 5 мкм и 1 мкм, окончательная очистка вирионного концентрата проводится путем однократного ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Для получения расщепленной вакцины разрушение ОВК проводится детергентом Октилглюкозидом, очистка антигенов от субвирионных структур проводится методам микрофильтрации через глубинные фильтры с диаметром пор 10 мкм и методом ультрацентрифугирования, очистка от детергента проводится последовательно методам диафильтрафильтрации и методом гель-хроматографии с использованием носителя «WorkBeads 40/100» производства фирмы «Bio-Works», Швеция.

Недостатками этого способа являются: 1) методика предварительной очистки ВАЖ с использованием только двух каскадов глубинных фильтров с диаметрами пор 5 мкм и 1 мкм не позволяет полностью очистить ВАЖ от дебрисных структур; 2) использование только одного цикла ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы не позволяет полностью очистить конечный препарат ОВК от примесей овальбумина; 3) использование детергента Октилглюкозид не позволяет получать препараты моновакцин, очищенные от внутренних антигенов вирусов гриппа; 4) использование глубинных фильтров с диаметром пор 10 мкм на стадии микрофильтрации расщепленного ОВК не позволяет добиться адекватной очистки препарата на этой технологической стадии от субвирионных структур; 5) в результате совокупного действия вышеуказанных факторов полученные препараты моновакцин имеют достаточно высокий уровень показателя мутности.

Расщепленные и субъединичные вакцины против гриппа отличаются между собой, как по технологии получения, так и по составу (14). Расщепленные вакцины в своем составе могут содержать как поверхностные, так и внутренние антигены вирусов гриппа, тогда как субъединичные вакцины должны иметь в составе преимущественно поверхностные антигены, а именно, гемагглютинин (ГА) и нейраминедазу (НА). Кроме того, согласно требованиям ГФ РФ XIV(14), эти вакцины отличаются соотношением общего белка к антигену ГА, при этом в расщепленных вакцинах это соотношение может составлять (6,7:1), тогда как в субъединичных оно не должно быть больше, чем (3,7:1).

В патенте РФ №2446824 (3) описана технология, согласно которой производится субъединичная вакцина с адъювантом «Совигрипп» в объемах десятков миллионов доз ежегодно. Эта технология включает в себя: культивирование вирусов гриппа в КЭ; получение ВАЖ и ее предварительную очистку; получение ОВК методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы; инактивацию вирусного материала с использованием метода ультрафиолетового облучения; расщепление ОВК детергентом ТДТАБ; очистку антигенов от детергента методом диафильтрации.

Недостатками этого способа являются: 1) использование куриных эритроцитов для предварительной очистки ВАЖ, что не позволяет проводить процесс валидации всего производственного процесса согласно требованиям GMP; 2) использование ультрафиолетового облучения для инактивации вирусов, что также не позволяет проводить процесс валидации согласно требованиям GMP; 3) отсутствие стадии микрофильтрации на этапе выделения моновакцин для проведения дополнительной очистки препарата от субвирионных структур, что не позволяет получать моновакцины с низким уровнем показателя мутности; 4) использование только одного метода диафильтрации на этапе выделения моновакцин, что недостаточно для эффективной очистки поверхностных антигенов от детергента ТДТАБ. Кроме вышеуказанных недостатков, в процессе производства вакцины «Совигрипп» стали выявляться проблемы, связанные с различной эффективностью технологии производства на стадии расщепления ОВК для производственных штаммов вируса гриппа серотипов H1N1 и H3N2c одной стороны, и производственных штаммов вирусов гриппа серотипа В, с другой стороны.

Влитературе описанпатент фирмы «Новартис» (8). В этом патентерекомендуется с целью увеличения эффективности технологиипоследовательно добавлять два детергента в процессе разрушения ОВК. При этом неионный детергент (ТВИН-80) добавлялся первым для проведения процесса дезаггрегации, а потом добавлялся второй детергент катионного типа (ЦТАБ, ТДТАБ и др.) для поведения процесса собственно расщепления. Именно за счет использования обоих детергентов удавалось достичь повышения процента расщепления по сравнению с использованием только одного катионного детергента. Однако, в вышеуказанном патенте не указаны технологические параметры процесса расщепления с использованием двух детергентов. Кроме того, детергент ТВИН-80 определяется в составе моновакцин с большими трудностями в связи со своей химической структурой. Соответственно, при использовании этого детергента в промышленном производстве могут возникнуть серьезные проблемы с методикой его обнаружения в составе полученных моновакцин и готовой лекарственной формы, так как детергенты, входящие в систему разрушения ОВК, должны определятся с помощью методик производственного контроля, прошедших процедуру валидации(2, 14). Это означает, что для проведения подобных контролей должно использоваться оборудование, достаточно доступное для соответствующих производственных подразделений. В частности, для определения следов детергента ТВИН-80 в составе моновакцин необходимо использование Масс-спектрометрического детектора, который в связи со своей высокой стоимостью недоступен в качестве средства производственного контроля в РФ.

Раскрытие изобретения

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в создании нового высокоэффективного способа производства четырехвалентной субъединичной вакцины против гриппа.

Технические результаты предлагаемого изобретения заключаются в следующем:

1. Создание новой технологии предварительной очистки ВАЖ с максимально сниженным содержанием дебрисных структур в полученном фильтрате.

2. Создание новой технологии очистки ОВК с максимально сниженным содержанием овальбумина и других белков КЭ.

3. Создание новой технологии расщепления ОВК детергентами с увеличенной эффективностью технологии на этом этапе для всех серотипов вирусов гриппа.

4. Создание новой технологии очистки расщепленного препарата ОВК от субвирионных структур с максимальным снижением показателям мутности в препаратах моновакцин.

5. Создание новой высокоэффективной технологии очистки поверхностных антигенов от детергентов с максимальным снижением содержания детергентов в препаратах полученных моновакцин.

6. Создание новой технологии приготовления лекарственной формы четырехвалентной субъединичной вакцины без адъювантов.

Продукт, получаемый заявленным способом, является высокоочищенной и высокоиммуногеной субъединичной вакциной с низкими показателями ректогенности для привитых людей.

Сущность изобретения заключается в создании нового способа производства, который позволяет не только получать высокоочищенные препараты черырехвалентной субъединичной вакцины, но и позволяет добиваться высокого показателя эффективности технологии всего производственного процесса. Способ включает в себя получение вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), инактивацию ВАЖ, предварительную очистку ВАЖ от дебрисных структур методом трехступенчатой микрофильтрации, концентрирование ВАЖ методом ультрафильтрации и окончательную очистку вирионов методом последовательного двойного ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Далее полученный таким образом очищенный вирусный концентрат (ОВК) с целью расщепления последовательно обрабатывают детергентами Тритон Х-100 и ТДТАБ, субвирионные структуры из суспензии удаляют методами ультрацентрифугирования и двухступенчатой микрофильтрации. Удаление детергентов из полученного препарата проводят с использованием методов тангенциальной ультрафильтрации и промышленной хроматографии. Хроматографию проводят с использованием гидрофобного носителя «SDRHyperD», фирмы Pall (USA) с применением специальной технологии проведения хроматографического процесса. Полученный очищенный препарат разводят буфером, содержащим детергент Тритон Х-100 в качестве средства дезаггрегации, после чего проводят стадию стерилизующей фильтрации с использованием картриджей с диаметром пор 220 нм. Полученные таким 4 моновалента 4 различных серотипов сводят в единую лекарственную форму таким образом, чтобы конечная концентрация каждого моновалента была в диапозоне от 25,6 до 34,4 мкг/мл по белку гемагглютинину. К полученному раствору добавляют детергент Тритон Х-100 в качестве дезаггрегирующей добавки, раствор тщательно перемешивают, подвергают стерилизующей фильтрации, после чего разливают по стерильным флаконам или специальным шприцам. Применение способа по настоящему изобретению обеспечивает производство высокоочищенной и высокоиммуногенной субъединичной вакцины, а также позволяет увеличить эффективность технологии на различных стадиях производственного процесса по сравнению с прототипами.

Технический результат достигается тем, что проводят культивирование вирусов гриппа в КЭ, отбор ВАЖ, инактивацию ВАЖ дезинфектантом бета-пропиолактоном. Предварительную очистку ВАЖ проводят методом микрофильтрации с использованием трех каскадов складчатых фильтров и получение ОВК проводят с использованием двух последовательных циклов ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Расщепление ОВК проводят смесью детергентов Тритон Х-100 и ТДТАБ в определенных соотношениях. Удаление субвирионных структур после расщепления проводят последовательно методом ультрацентрифугирования и методом микрофильтрации с использованием двух каскадов складчатых фильтров. Очистку поверхностных антигенов от детергентов проводят последовательно методом диафильтрации и методом гидрофобной хроматографии с использованием промышленного хроматографического носителя. Для сохранения специфической активности в процессе хранения лекарственной формы вакцины используется дезаггрегирующая добавка детергента Тритон Х-100.

Краткое описание фигур чертежей

Фиг. 1. представляет анализ полипептидного состава образцов антигенов серотипа B/Phuket/3073/2013, полученных с использованием детергентов Октилглюкозид и ТДТАБ, методом электрофореза в нередуцирующих условиях.

Позиции на Фиг. 1:

1 - стандарт молекулярных весов фирмы «Биорад»;

2 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок:детергент (1:1). Специфическая активность по ОРИД не выявлена;

3 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид белок: детергент в соотношении (1:15). Специфическая активность - 432 мкг/мл;

4 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид белок: детергент в соотношении (1:10). Специфическая активность - 451 мкг/мл;

5 - образец исходного очищенного вирусного концентрата (ОВК) без обработки детергентами. Специфическая активность по ОРИД - 514 мкг/мл.

На Фиг. 2 показан анализ полипептидного состава образцов антигенов серотипа B/Brisbane/60/2008, полученных с использованием детергентов Октилглюкозид и ТДТАБ методом электрофореза в нередуцирующих условиях.

Позиции на Фиг. 2:

1 - стандарт молекулярных весов фирмы «Bio-Rad»;

2 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок: детергент (1:1). Специфическая активность не выявлена.

3 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок: детергент (1:0,8). Специфическая активность - 223 мкг/мл (бледные кольца);

4 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид в соотношении белок: детергент (1:15). Специфическая активность - 317 мкг/мл;

5 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид в соотношении белок: детергент (1:10). Специфическая активность - 286 мкг/мл;

6 - исходный образец ОВК без добавления детергентов. Специфическая активность - 362 мкг/мл.

На Фиг. 3 показан анализ полипептидного состава образцов антигенов серотипа B/Maryland/15/2016 с использованием детергентов ТДТАБ и Октилглюкозид, методом электрофореза в нередуцирующих условиях.

Позиции на Фиг. 3:

1 - стандарт молекулярных весов фирмы «Bio-Rad»;

2 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок:детергент (1:0,4). Специфическая активность - 191 мкг/мл;

3 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок:детергент в соотношении (1:0,5). Специфическая активность - 273 мкг/мл;

4 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок:детергент (1:0,6). Специфическая активность - 224 мкг/мл;

5 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок:детергент (1:0,8). Специфическая активность не выявлена;

6 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид в соотношении белок:детергент (1:10). Специфическая активность - 354 мкг/мл;

7 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид в соотношении белок:детергент (1:12). Специфическая активность - 348 мкг/мл;

8 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид в соотношении белок:детергент (1:15). Специфическая активность - 338 мкг/мл;

9 - Образец исходного ОВК без обработки детергентами. Специфическая активность - 368 мкг/мл.

Фиг. 4 показывает анализ морфологии колец преципитации в реакции ОРИД образцов антигена серотипа B/Brisbane/60/2008, полученных с использованием детергентов Октилглюкозид, ТДТАБ и ТДТАБ Плюс.

Позиции на Фиг. 4:

1 - образец антигена, полученный при использовании смеси детергентов в соотношении белок:ТДТАБ Плюс (1:1);

2 - международный стандарт ОРИД;

3 - образец антигена, полученный при использовании смеси детергентов в соотношении белок:ТДТАБ Плюс (1:0,8);

4 - образец антигена, полученный при использовании детергента Октилглюкозид в соотношении белок:детергент (1:10);

5 - образец антигена, полученный при использовании смеси детергентов в соотношении белок:ДТАБ Плюс (1:1);

6 - международный стандарт ОРИД;

7 - образец антигена, полученный при использовании смеси детергентов в соотношении белок:ТДТАБ Плюс (1:0,8);

8 - образец антигена, полученный при использовании детергента Октилглюкозид в соотношении белок:детергент (1:10).

На Фиг. 5 представлен анализ полипептидного состава антигенов серотипа А/Мичиган/45/2105(Н1N1), полученных с использованием детергентов ТБТАБ Плюс, ТДТАБ и Октилглюкозид.

Позиции на Фиг. 5:

1 - стандарт молекулярных весов фирмы «Bio-Rad»;

2 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ Плюс в соотношении белок: детергент (1:1). Специфическая активность - 503 мкг/мл;

3 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ Плюс в соотношении белок: детергент (1:0,8). Специфическая активность - 528 мкг/мл;

4 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок:детергент (1:1). Специфическая активность - 490 мкг/мл;

5 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид в соотношении белок: детергент (1:15). Специфическая активность - 496 мкг/мл;

6 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид в соотношении белок: детергент (1:10). Специфическая активность - 480 мкг/мл;

7 - образец исходного ОВК без добавления детергентов. Специфическая активность - 587 мкг/мл.

На Фиг. 6 представлен анализ полипептидного состава образцов антигена сертипа A/HongKong/4801/2014 (H3N2), полученных с использованием детергентов ТДТАБ, Октилглюкозид и ТДТАБ Плюс.

Позиции на Фиг. 6:

1 - стандарт молекулярных весов фирмы «Bio-Rad»;

2 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок: детергент (1:0,8). Специфическая активность - 489 мкг/мл;

3 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид в соотношении белок: детергент (1:15). Специфическая активность - 637 мкг/мл;

4 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ Плюс в соотношении белок: детергент (1:0,8). Специфическая активность - 456 мкг/мл;

5 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ Плюс в соотношении белок: детергент (1:1). Специфическая активность - 394 мкг/мл;

6 - образец исходного ОВК без добавления детергентов. Специфическая активность -663 мкг/мл.

На Фиг. 7 показан анализ полипептидного состава образцов антигенов серотипа B/Brisbane/60/2008, полученных с использованием детергентов Октилклюкозид, ТДТАБ и ТДТАБ Плюс методом электрофореза в нередуцирующих условиях.

Позиции на Фиг. 7:

1 - стандарт молекулярных весов фирмы «Bio-Rad»;

2 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ Плюсв соотношении белок:детергент(1:1). Специфическая активность - 316 мкг/мл;

3 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ Плюс в соотношении белок:детергент (1:0,8). Специфическая активность - 340 мкг/мл;

4 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ (1:1). Колец преципитации не обнаружено;

5 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок:детергент (1:0,8). Специфическая активность - 255 мкг/мл (бледные кольца);

6 - Образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид в соотношении белок:детергент (1:15). Специфическая активность - 336 мкг/мл;

7 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид в соотношении белок:детергент (1:10). Специфическая активность - 291 мкг/мл;

8 - исходный образец ОВК без добавления детергентов; Специфическая активность - 384 мкг/мл.

Фиг. 8 представляет анализ полипептидного состава образцов антигенов серотипа B/Phuket/3073/2013, полученных с использованием детергентов Октилклюкозид, ТДТАБ и ТДТАБ Плюс методом электрофореза в нередуцирующих условиях.

Позиции на Фиг. 8:

1 - стандарт молекулярных весов фирмы «Bio-Rad»;

2 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ Плюс в соотношении белок:детергент(1:1). Специфическая активность - 481 мкг/мл;

3 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ Плюс в соотношении белок:детергент (1:0,8). Специфическая активность - 507 мкг/мл;

4 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок:детергент (1:1). Колец преципитации не обнаружено;

5 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид в соотношении белок:детергент (1:15). Специфическая активность - 428 мкг/мл;

7 - образец антигена, полученный с использованием детергента Октилглюкозид в соотношении белок:детергент (1:10). Специфическая активность - 437 мкг/мл;

8 - образец антигена без добавления детергентов; Специфическая активность - 544 мкг/мл.

Фиг. 9 демонстрирует анализ полипептидного состава образцов ОВК серотипа B/Maryland/15/2016, обработанных детергентами ТДТАБ И ТДТАБ ПЛЮС методом электрофореза в нередуцирующих условиях.

Позиции на Фиг. 9:

1 - стандарт молекулярных весов фирмы «Bio-Rad»;

2 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок:детергент (1:0,4). Специфическая активность - 252 мкг/мл;

3 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок:детергент (1:0,5). Специфическая активность - 280 мкг/мл;

4 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок:детергент (1:0,6). Специфическая активность - 242 мкг/мл;

5 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белок:детергент (1:0,8). Кольца преципитации не выявлены;

6 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ плюс в соотношении белок:детергент (1:1); Специфическая активность - 359 мкг/мл;

7 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ плюс в соотношении белок:детергент (1:0,8); Специфическая активность - 365 мкг/мл;

8 - образец антигена, полученный с использованием детергента ТДТАБ плюс в соотношении белок:детергент (1:0,7); Специфическая активность - 354 мкг/мл;

9 - образец ОВК серотип B/Maryland/15/2016 без обработки детергентами. Специфическая активность - 368 мкг/мл.

Фиг. 10 представляет анализ морфологии антигена ГА серотипа B/Brisbane/60/2008 МЕТОДОМ электронной микроскопии, размер линейки сравнения -100 mn.

На Фиг. 11 - анализ морфологии моновакцины серотипа A/HongKong/4801/2014 (H3N2) методом электронной микроскопии, размер линейки сравнения - 100 nm.

На Фиг. 12 представлен анализ полипептидного состава экспериментальной моновакцины A/HongKong/4801/2014 (H3N2) методом электрофореза в нередуцирующих условиях.

Позиции на Фиг. 12:

1 - образец ОВК, из которого была получена экспериментальная моновакцина;

2 - образец экспериментальной моновакцины, полученный с использованием детергента ТДТАБ Плюс;

3 - стандарт молекулярных весов фирмы «BioRad».

Фиг. 13 демонстрирует анализ полипептидного состава экспериментальной моновакцины B/Brisbane/60/2008 методом электрофореза в нередуцирующих условиях.

Позиции на Фиг. 13:

1 - стандарт молекулярных весов фирмы «BioRad»;

2 - образец экспериментальной моновакцины, полученный с использованием детергента ТДТАБ Плюс;

3 - образец ОВК, из которого была получена экспериментальная моновакцина.

Фиг. 14 показывает анализ полипептидного состава экспериментальной моновакцины A/Michigan/45/2015 (H1N1) методом электрофореза в нередуцирующих условиях.

Позиции на Фиг. 14:

1 - стандарт молекулярных весов фирмы «BioRad»;

2 - образец экспериментальной моновакцины, полученный с использованием детергента ТДТАБ Плюс;

3 - образец ОВК, из которого была получена экспериментальная моновакцина.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1 раскрывает оптимизацию процессов предварительной очистки ВАЖ и очистки ОВК в градиенте плотности сахарозы и показывает достижение технического результата - создание новой технологии предварительной очистки ВАЖ с максимально сниженным содержанием дебрисных структур в полученном фильтрате и создание новой технологии очистки ОВК с максимально сниженным содержанием овальбумина и других белков КЭ.

На основании проведенного поиска технологических подходов был сделан вывод, что для увеличения степени очистки ВАЖ от дебрисных структур в процессе микрофильтрации необходимо изменить, как тип самих фильтров, так и размер пор этих фильтров. Дело в том, что глубинные фильтры, которые были использованы на стадии микрофильтрации ВАЖ в источнике (7), обладают высокой грязеемкостью, но имеют очень большой разброс диаметров пор (относительный рейтинг пропускания). По этой причине нельзя подобрать эти глубинные фильтры таким образом, чтобы они максимально удерживали дебрисные структуры, но при этом не задерживали прохождение вирионных частиц. Поэтому для оптимизации процесса микрофильтрации ВАЖ было решено использовать принципиально другой тип фильтров, а именно складчатые фильтры.

Пример 1.

Использование трех каскадов складчатых фильтров с различными диаметрами пор позволило осуществлять процесс микрофильтрации ВАЖ таким образом, чтобы в конечном фильтрате ВАЖ дебрисных структур практически не оставалось, однако, удержания вирионных частиц в процессе микрофильтрации не происходило.

Для увеличения степени очистки ОВК от овальбумина и других белков КЭ наиболее оптимальным оказалось использование технологии двойного последовательного ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Следует отметить, что в рамках этой технологии для снижения уровня агрегации вирионных частиц в ходе проведения первого цикла ультрацентрифугирования оказалось оптимальным введение в первый сахарозный градиент дезагрегирующих добавок, а именно цитрата натрия. В процессе второго цикла ультрацентрифугирования этот реагент отделялся от вирионных частиц вследствие своей химической структуры.

Два технологических эксперимента демонстрируют эффективность вышеуказанных новых подходов. Для проведения этих экспериментов было получено 1010 литров ВАЖ серотипа A/Michigan/45/2015 (H1N1) с использованием 108 тыс. КЭ. Этот объем ВАЖ был разделен на две равные части.

Первую часть ВАЖ (510 литров) использовали для проведения эксперимента №1, в котором первый этап получения ОВК проводился согласно способу, указанному в источнике (7). В этом эксперименте №1 микрофильтрацию ВАЖ проводили через два каскада глубинных фильтров с диаметрами пор 5 мкм и 1 мкм, процесс ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы проводили один раз без добавления цитрата натрия.

В эксперименте №2 были использованы другие 510 литров ВАЖ. В этом эксперименте для процесса микрофильтрации использовались три последовательных каскада складчатых фильтров с диаметрами пор 10 мкм, 1,2 мкм и 0,6 мкм. Процесс ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы проводился двукратно, при этом в состав первого градиента был включен раствор цитрата натрия до конечной концентрации 0,2 М. Образцы двух ОВК, полученных в результате проведения вышеуказанных экспериментов, были проанализированы на содержание общего белка. Далее были проведены два независимых эксперимента по получению субъединичных моновакцин с использованием детергентом ТДТАБ согласно способу, указанному в другом источнике (З).Полученные экспериментальные моновакцины были проанализированы по содержанию общего белка, специфической активности и содержанию овальбумина. На основании полученных результатов были рассчитаны такие показатели, как эффективность технологии на стадии получения моновакцин (количество ГА, полученное с 1 КЭ); относительное содержания овальбумина на 100 мкг антигена ГА в каждой из моновакцин и отношение содержания общего белка к содержанию ГА. Данные представлены в Таблице 1.

Из представленных данных следует, что использование новых технологических подходов на первом этапе в процессе получения ОВК позволило существенно улучшить качество моновакцин, которые были получены из этих ОВК в ходе дальнейшего технологического процесса. Важно, что использование этих новых технологических подходов практически не привело к уменьшению такого важного показателя технологического процесса, как эффективность технологии, но при этом существенно улучшились такие важные показатели очистки моновакцин, как снижение содержания овальбумина и снижение относительной нагрузки общего белка.

В мировой литературе качество очистки инактивированных гриппозных вакцин сравнивают именно по этим показателям для оценки потенциальной реактогенности. Кроме того, отношение содержания общего белка к содержанию ГА имеет дополнительное значение в связи с тем, что именно по этому показателю вакцины разделяются на расщепленные и субъединичные (2,14). Таким образом, предлагаемые новые подходы позволили существенно оптимизировать первый этап технологии (получение ОВК) и, в результате, получать препараты моновакцин с более высокими показателями качества.

Пример 2.

Действие детергента ТДТАБ на антигены ГА вирусов гриппа различных серотипов

Данный пример показывает достижение такого технического результата, как создание новой технологии расщепления ОВК детергентами с увеличенной эффективностью технологии на этом этапе для всех серотипов вирусов гриппа.

Далее были проведены исследования с целью изучения процесса расщепления ОВК различных серотипов вирусов гриппа с использованием детергента ТДТАБ. Для проведения этих исследований использовались препараты ОВК, полученные согласно новым технологическим подходам, описанным в примере 1. Процесс расщепления проводили согласно способу, указанному в источнике(3).Методика изучения этого воздействия была расширена по сравнению с методикой, описанной в источнике. Было проведено изучение не только эффективности расщепления, но также изучен полипептидный состав образцов после соответствующей обработки ОВК и удаления субвирионных структур. Изучение полипептидного состава образцов ГА позволяет сделать заключение о сохранении конформационной структуры этого антигена в процессе воздействия детергента. В качестве объектов изучения были взяты образцы ОВК, которые были получены с использованием производственных штаммов последних нескольких лет всех трех серотипов (H1N1,H3N2 и В). Чтобы убедиться в том, что полученные результаты связаны именно с воздействием детергента ТДТАБ, в ряде экспериментов в качестве детергента сравнения был использован детергент Октилглюкозид, который используется для выделения ГА в технологии производства расщепленной вакцины «Ультрикс».

На первом этапе исследований было выявлено, что детергент ТДТАБ не оказывал какого-либо деструктивного действия на антигены ГА серотипов H1N1 и H3N2. Однако, в процессе экспериментов с ОВК, полученных с использованием вируса гриппа серотипа В, были выявлены факты снижения показателя эффективности технологии на этапе получения моновакцин. Было выявлено, что в реакции ОРИД антигены ГА серотипа В образовывали бледно окрашенные кольца преципитации с размытыми краями, в отличие от колец преципитации, которые образовывались в этой же реакции с образцами исходного ОВК или международным стандартом антигена (производство NIBCS). Как указано выше, в этих экспериментах был изучен также полипептидный состав образцов ГА после обработки ТДТАБ. Это позволило сделать вывод о том, в каком состоянии находится конформационная структура антигена ГА в составе образца. Из литературы известно, что если полипептид НО в составе препарата спонтанно расщепляется на полипептиды НА1 (тяжелая цепь) и НА2 (легкая цепь), то конформационная структура этого антигена уже не соответствует той, которая должна быть в интактномвирионном препарате. Изменение нативной конформационной структуры антигена ГА свидетельствует о том, что иммунохимическая структура этого антигена уже не соответствует той, которая была у этого антигена в составе вирионного препарата до обработки детергентами (9). Результаты представлены на Фигурах 1-3.

Из представленных результатов можно сделать вывод, что образцы антигенов ГА, полученные с использованием трех производственных штаммов серотипа В, действительно имели чувствительность к денатурирующему действию детергента ТДТАБ. В экспериментах, где соотношение общего белка ОВК к детергенту ТДТАБ составляло 1:1, в реакции ОРИД колец преципитации не обнаруживалось при анализе антигенов ГА всех трех серотипов. В экспериментах, в которых образцы ОВК серотипа B/Brisbane/60/2008 обрабатывались детергентом ТДТАБ в соотношении (1:0,8), специфическая активность определялась, однако значительно меньше по сравнению с экспериментами с использованием детергента Октилклюкозида. При обработке образцов ОВК, полученных с использованием двух других производственных штаммов серотипа В, обработка детергентом ТДТАБ в соотношении (1:0,8) приводила к полной потере специфической активности антигена ГА в этих образцах. Для ОВК серотипа В, обработка детергентом ТДТАБ в соотношениях (1:0,4), (1:0,5), (1:0,6) и (1:0,7) позволяла получать антигены ГА, в которых можно было определить специфическую активность. Но в реакции ОРИД с этими антигенами кольца преципитации были бледные и с размытыми краями, что затрудняло определение специфической активности антигена ГА в этих образцах.

Так как в качестве детергента сравнения в данных экспериментах использовался детергент Октилглюкозид, который денатурирующим действием на эти образцы не обладал, то можно утверждать, что денатурация антигенов ГА в процессе обработки ОВК серотипа В происходила именно от воздействия детергента ТДТАБ. Как следует из данного исследования, при любых соотношениях эффективность расщепления с использованием детергента ТДТАБ была значительно ниже по сравнению с эффективностью расщепления этих же образцов ОВК с использованием детергента Октилклюкозид.

Анализ полипептидного состава образцов антигенов, полученных с использованием детергента ТДТАБ, выявил феномен спонтанного расщепления, при котором молекула НА0 без всякого постороннего воздействия расщепляется на полипептиды НА1 и НА2. При использовании для расщепления детергента Октилглюкозид феномена спонтанного расщепления не наблюдалось. Так как такое расщепление свидетельствует об изменении конформационной структуры ГА, то, согласно литературным данным, можно сделать вывод о том, что иммунохимическая структура антигена ГА изменилась тоже (9). Таким образом, использование детергента ТДТАБ для получения моновакцин серотипа В не является оптимальным по причине низкой эффективности технологии, а также по причине риска появления антигенов ГА с измененной иммунохимической структурой.

Следует отметить, что те производственные штаммы серотипа В, которые были использованы в данном исследовании для получения образцов ОВК, являлись теми штаммами, которые входили в состав инактивированных гриппозных вакцин в последние годы согласно рекомендациям ВОЗ. Это означает, что рекомендованные ВОЗ в последнее время производственные штаммы серотипа В имели чувствительность к денатурирующему действию детергента ТДТАБ.

Пример 3.

Разработка новых технологических подходов к оптимизации стадии расщепления ОВК

Данный пример показывает достижение такого технического результата, как создание новой оптимальной технологии расщепленния препарата ОВК различными детергентами для достижения максимального сохранения иммунохимической активности полученных поверхностных антигенов и увеличения эффективности производственного процесса на этой стадии.

В результате проведенных экспериментов было выявлено, что оптимальной технологией для проведения стадии расщепления ОВК является последовательное использование не ионного детергента Тритон Х-100 и детергента ТДТАБ. Было установлено, что изменения соотношений общего белка к этим детергентам не влияло на иммунохимическую нативность полученных антигенов ГА (Фиг. 4).

Было также показано, что очень важна последовательность добавления детергентов и время инкубации. В начале должен добавляться детергент Тритон X-100 и взаимодействовать с ОВК в течение как минимум 20 минут, а далее добавляться детергент ТДТАБ. Вторая инкубация должна проходить в течение 40 минут.Разработанная таким образом система детергентов получила название ТДТАБ Плюс.

Пример 4.

Воздействие системы детергентов ТДТАБ Плюс на антигены ГА вирусов гриппа серотипов H1N1, H3N2 и В

Анализ образцов поверхностных антигенов, полученных с использованием системы детергентов ТДТАБПлюс проводили теми же методами, что и в примере 2. Для большей иллюстративности материала одновременно изучались образцы антигенов ГА, полученные с использованием детергентов ТДТАБ Плюс, ТДТАБ и Октилглюкозид. Это позволило оценить сравнительную эффективность расщепления ОВК с использованием трех различных детергентов (см. Фигуры 5-9).

В результате изучения сравнительного действия трех различных детергентов на антигены ГА различных серотипов вирусов гриппа были получены данные, на основании которых можно сделать следующие выводы:

1. На антигены ГА серотипов H1N1, H3N2hB детергенты ТДТАБ Плюс, ТДТАБ и Октилглюкозид действуют по-разному. Это различие проявляется в проценте расщепления, морфологии колец преципитации в реакции ОРИД и в полипептидном составе, который был изучен методом электрофореза в нередуцирующих условиях.

2. Детергенты ТДТАБ Плюс и Октилглюкозид воздействовали на антигены ГА всех трех серотипов таким образом, что нативная конформационная (иммунохимическая) структура этих антигенов не менялась. Это выражалось в том, что полученные антигены ГА в реакции ОРИД образовывали кольца преципитации, морфология которых не отличалась от морфологии колец преципитации с образцами международных стандартных антигенов, а также образцами исходных ОВК. При анализе полипептидного состава этих антигенов феномена спонтанного расщепления молекул НА0 выявлено не было.

3. Детергент ТДТАБ на антигены ГА серотипов H1N1 и H3N2 воздействовал примерно также, как и два других детергента. Однако, изучение действия детергента ТДТАБ на антигены серотипа В выявило тот факт, что этот детергент в процессе расщепления оказывает деструктирующее действие на антигены ГА четырех производственных штаммов вирусов гриппа серотипа В. Это выражалось в том, что при низких соотношениях белок:детергент (1:0,4), (1:0,5) и (1:0,6) полученные образцы антигенов в реакции ОРИД образовывали бледно окрашенные кольца преципитации с размытыми краями. При более высоких соотношениях белок:детергент (1:1) полученные таким образом антигены ГА в реакции ОРИД кольца преципитации не образовывали. При изучении полипептидного состава образцов антигенов ГА, полученных с использованием детергента ТДТАБ в различных соотношениях, наблюдался феномен спонтанного расщепления. Это свидетельствует о том, что часть молекул антигена ГА перешла из так называемой «предфузионной» формы в «постфузионную» форму с соответствующими большими изменениями в конформационной и иммунохимической структуре (9).

4. В результате проделанных исследований можно сделать вывод о том, что с вирусами серотипа H1N1 детергент ТДТАБ Плюс дает максимальный процент расщепления (90%) по сравнению с двумя другими детергентами.

5. С вирусами серотипа H3N2 максимальный процент расщепления показал детергент Октилглюкозид (96%).

6. С вирусами серотипа В (B/Brisbane/60/2008, B/Phuket/3073/2013 и B/Maryland/15/2016) действие системы детергентов ТДТАБ Плюс позволило достичь более высоких процентов расщепления (93%, 93% и 99%) по сравнению с действием детергента Октилглюкозид (87%, 80%).

7. Несмотря на то, что детергент ТДТАБ оказывал в процессе расщепления деструктирующее действие на антигены ГА всех изученных производственных штаммов серотипа В, степень его деструктирующего действия зависела от конкретного производственного штамма и соотношения белокгдетергент. В частности, при соотношении белок:детергент (1:0,8) выделенные антигены серотипа B/Brisbane/60/2008 в реакции ОРИД образовывали кольца преципитации, а антигены ГА других изученных серотипов В, выделенные с использованием детергента ТДТАБ в соотношении белокгдетергент (1:0,8), колец преципитации не образовывали.

8. На основании вышеизложенных выводов можно сделать заключение, что детергенты ТДТАБ Плюс и Октилглюкозид с точки зрения процесса получения моновакцин являются универсальными для серотипов вирусов гриппа Н1N1, H3N2 и В (линии Виктория и Ямагато), которые входят в состав «сезонных» вакцин.

При этом использование детергента ТДТАБ Плюс позволяет получить более высокую эффективность технологии на 3-х из 4-х серотипов, входящих в состав четырехвалентных вакцин по сравнению с использованием детергента Октилглюкозид.

Использование детергента ТДТАБ для получения моновакцин серотипов Вне является оптимальным, так как его применение приводит к занижению показателя эффективности технологии на стадии расщепления ОВК, а также может привести к изменению иммунохимической структуры выделенных антигенов ГА.

9. Таким образом, для производства четырехвалентных субъединичных вакцин наиболее оптимальным является использование детергента ТДТАБ Плюс.

Пример 5.

Разработка технологии очистки вирусных антигенов от детергента ТДТАБ Плюс и субвирионных структур.

Данный пример демонстрирует достижение технических результатов - создание новых оптимальных технологий очистки поверхностных антигенов от детергента ТДТАБ Плюс и субвирионных структур.

В источнике (3) была описана технология расщепления ОВК с использованием единственного детергента ТДТАБ и последующая технология схемы очистки антигенов после расщепления. В этом способе субвирионные структуры удаляют из суспензии только методом ультрацентрифугирования. Далее супернатант концентрируют методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с диаметром пор 30 КД, после чего сконцентрированный супернатант подвергают процессу длительной диафильтрации с большим объемом буфера для очистки от ТДТАБ. После того, как концентрация детергента ТДТАБ в растворе будет ниже, чем 10 мкг на 50 мкг антигена ГА, процесс диафильтрации прекращают, полученную суспензию разводят буфером без каких-либо добавок и подвергают процессу стерилизующей фильтрации для получения моновакцины.

При использовании системы детергентов ТДТАБ Плюс для получения моновакцин согласно примеру 4, вышеуказанная технология очистки поверхностных антигенов (3) не давала адекватных результатов. Дело в том, что в водных растворах детергент ТДТАБ образует мицеллы незначительного размера, которые могут быть отделены от поверхностных антигенов методом диафильтрации с использованием мембраны с диаметром пор 30 КД. Однако детергент Тритон Х-100, входящий в состав системы детергентов ТДТАБ Плюс, образует в водных растворах мицеллы очень большого размера, которые не проходят через мембрану с диаметром пор 30 КД. Это означает, что с использованием только одного метода диафильтрации отделить мицеллы Тритона Х-100 от антигена ГА не представляется возможным. Следует отметить, что в результате полного удаления детергентов антигены ГА собираются в надмолекулярные структуры, которые обладают высокой иммуногенностью (13). Таким образом, для получения вакцин с высоким протективным потенциалом необходимо, чтобы в процессе выделения моновакцин происходил процесс самосборки ГА в эти надмолекулярные структуры. Если же в процессе получения моновакцины в суспензии остается большое количество детергента, то процесс самосборки будет блокирован.

Для того, чтобы обеспечить получение высокоочищенных антигенов ГА с высокой иммуногенностью, необходимо было разработать эффективнные технологии очистки поверхностных антигенов как от субвирионных структур, так и от смеси детергентов Тритон Х-100 и ТДТАБ..

После выполнения ряда экспериментов была разработана комплексная технология получения моновакцин, с использованием которой процесс самосборки проходил эффективно. Эта технология состояла из следующих стадий:

1. Проточное ультрацентрифугирование со скоростью 20 тыс.об.в течение трех часов.

2. Последовательная микрофильтрация полученного супернатанта через два каскада складчатых фильтров с диаметром пор 0,6 мкм и 0,2 мкм.

3. Ультрафильтрация с использованием мембран с размером отсечки 30 КД и концентрирование полученного очищенного супернатанта до объема 3-4 литра.

4. Хроматография полученного раствора концентрата с использованием гидрофобного носителя «SDRHyperD», производства фирмы Раll(USА) и колонки «Streamline 200» производства фирмы GE-Healthcare(USA) по методу «Expandedbedadsorption». Использование этого носителя, а также такого метода хроматографии позволило резко увеличить эффективность процесса удаления детергентов и получить препараты моновакцин, в которых содержание детергента ТДТАБ не превышало 5 мкг/мл, а содержание детергента Тритон Х-100 было ниже предела определения метода. Это связано с тем, что при использовании хроматографии по методу «Expandedbedadsorption» поток материала идет снизу вверх, и при этом хроматографический носитель переходит в суспензионное состояние, что позволяет увеличить время контакта жидкости с поверхностью сорбента.

5. После проведения хроматографии и оценки содержания белка в полученном препарате проводилось разведение препарата буфером, содержащим в качестве дезагрегирующей добавки детергент Тритон Х-100 в концентрациях от 200 до 300 мкг/мл.

6. Разведенный таким образом раствор подвергали процедуре стерилизующей фильтрации через мембрану с диаметром пор 220 нм.

По сравнению с процессом диафильтрации, указанным в источнике (3), процесс комбинированной очистки методами микрофильтраци, концентрирования и хроматографии занимал в два раза меньше времени.

В качестве иллюстрации того, что при использовании предлагаемой технологии очистки антигены ГА действительно собираются в надмолекулярные структуры, представлены результаты анализа морфологии методом электронной микроскопии образцов моновакцин серотипов В и H3N2.

Анализ проводился с применением техники негативного контрастирования с использованием реагентауранил ацетата и с использованием электронного микроскопа «Jeol-100В». Результаты были получены с использованием увеличения в 50 тыс. раз.

В процессе изучения каждого из препаратов было просмотрено не менее двухсот полей зрения и были выбраны наиболее типичные морфологические структуры. В качестве сравнительного размера представлена линейка 100 нанометров внизу каждого рисунка.

На представленных Фигурах 10 и 11 видно, что типичными морфологическими структурами изученных субъединичных моновакцин являются специфические агрегаты молекул ГА, которые имеют неправильную шаровидную форму и размер от 25 до 40 нм. В структуре этих агрегатов выявляются отдельные морфологические структуры тримеров ГА, так называемые «шипы».

Таким образом, из представленных результатов следует, что предлагаемая технология очистки действительно позволяет обеспечить удаление детергентов из раствора препарата таким образом, что самосборка антигенов ГА произошла полностью. Следует отметить, что после того, как самосборка антигенов ГА уже произошла, добавление детергента Тритон Х-100 в концентрациях 200-300 мкг/мл ужене способно разрушить образовавшиеся надмолекулярные структуры. Согласно данным литературы (12), детергент Тритон Х-100 в таких концентрациях действует только в качестве дезагрегирующей добавки и не действует на морфологическую структуру антигена ГА в составе вирионов или других субвирусных структур.

При анализе коммерческой расщепленной вакцины «Fluzone», производства фирмы SANOFI-PASTER, были выявлены похожие морфологические формы организации молекул ГА (13). Следует отметить, что у авторов этой публикации четкость изображения на представленных ими рисунках была выше, так как для анализа они использовали более современную технику криогенной электронной микроскопии. Эта информация подтверждает наши результаты в той части, что в составе коммерческих вакцин антиген ГА образует агрегаты примерно такого размера и морфологии, как и на представленных нами рисунках.

Согласно данным литературы, вакцина «Fluzone» содержит в своем составе детергент Тритон Х-100 в концентрации 200 мкг/мл в качестве дезагрегирующей добавки. Это подтверждает наше наблюдение о том, что детергент Тритон Х-100 в этой концентрации в качестве дезагрегирующей добавки не влияет на морфологию надмолекулярных структур ГА после их самосборки.

Пример 6.

Получение моновакцины серотипа H3N2 согласно заявленному способу

В примерах 1, 3, 5 описаны новые технологические подходы на стадиях предварительной очистки ВАЖ, получения ОВК, расщепления ОВК системой детергентов ТДТАБ Плюс, очистки расщепленного ОВК от субвирионных структур и очистки выделенных поверхностных антигенов от системы детергентов ТДБАБ Плюс. На основании этих новых технологических подходов был разработан новый способ получения субъединичных моновакцин. Для иллюстрации пригодности и высокой эффективности заявленного способа было проведено выделение моновакцин серотипа H3N2 (пример 6), серотипа В (пример 7) и серотипа H1N1 (пример 8).

КЭ в возрасте 10 суток в количестве 45 тыс.шт.были получены с птицефабрики и подвергнуты визуальному контролю с целью отбраковки. Далее были дезинфицированы при поступлении в цех двумя партиями дезинфектантом 2%-м раствором «Оксоний Актив» в течение 30 минут при температуре (+34 С°). Далее дезинфицированные КЭ перевозили в камеру для предварительной инкубации. Инкубация проходила в диапазоне температур (от +36 до +37 С°), относительной влажности 55-65% в течение 16 часов. После этого проводилось заражение КЭ седьмым пассажным уровнем реассортантного штамма серотипа A/HongKong/4801/2014 (H3N2). Заражение проводилось с использованием автоматической линии заражения производства фирмы Technolabo (Italy). Процесс заражения 45 тыс. КЭ проходил в течение 2-х часов. После заражения КЭ перемещались в термальную камеру для инкубации с температурой (+36,5 С°) и относительной влажностью 65%. Инкубация проходила в течение 44 часов, после чего икубированные КЭ были перевезены в специальную холодильную камеру с температурой (от +3 до +5 С°). Охлаждение КЭ проводилось в течение 16 часов, после чего охлажденные КЭ поступали на автоматическую линию отбора ВАЖ производства Technolabo (Italy). После соответствующей отбраковки для отбора ВАЖ было использовано 42 тыс. КЭ. Общий объем собранной ВАЖ составил 420 литров. Сбор ВАЖ происходил в реактор вместимостью 630 литров. Перед началом сбора ВАЖ этот реактор охлаждали до температуры (от +5 до +8 С°). Общее время сбора ВАЖ составило 4 часа. В реактор после окончания сбора ВАЖ добавляли40 литров стерильного раствора 2-х молярного NaCl и перемешивали содержимое в течение 15 минут. Далее в реактор добавляли дезинфектантбета-пропиолактон до конечной концентрации в реакторе0,1% и содержимое перемешивали еще 30 минут.Далее мешалки отключали, а содержимое реактора инкубировали при температуре (от +5 до +8 С°) в течение 16-20 часов. После обработки бета-пропиолактоном последующие операции с полученной ВАЖ проводились в так называемой «чистой зоне». Предварительная очистка ВАЖ проводилась с использованием трех каскадов складчатых фильтров с размерами пор 10 мкм, 1,0 мкм и 0,6 мкм производства фирмы Domnic Hunter (USA). Параллельно с процессом микрофильтрации осуществлялся процесс концентрирования с использованием метода тангенциальной ультрафильтрации на мембранах с диаметром пор 300 КД. Весь этот этап проводился при комнатной температуре. Процессы предварительной очистки и концентрирования 440 литров ВАЖ были проведены в течение 3 часов. Общий объем полученного концентрата ВАЖ был 30 литров.

Далее проводили очистку концентрата ВАЖ в градиенте плотности сахарозы в два этапа. Для этой цели использовали промышленные центрифуги модели ЕК2, производства фирмы Alfa Wassermann (USA). На первом этапе использовались градиенты плотности сахарозы, в состав которых входил цитрат натрия в конечной концентрации 0,2 М. Отбор фракций после процесса ультрацентрифугирования проводили в диапазоне концентраций сахарозы от 32 до 50% и с титром ГА во фракции 1:16000 и более. Отобранные после первых градиентов фракции разводили фосфатным буферным раствором (ФБР) и повторяли очистку на сахарозном градиенте еще раз. Второй сахарозный градиент приготовлялся с использованием ФБР без каких-либо других добавок. Весь процесс центрифугирования и отбора фракций как в первом, так и во втором случае, происходил в течение 7-ми часов, скорость центрифугирования была 32-34 тыс. об./мин при охлаждении (от +3 до +5 С°). После второго центрифугирования отбор фракций проводился в более жестком диапазоне от 34 до 48% концентрации сахарозы и титром ГА не менее 1:64000. Из объема 30 литров концентрированной ВАЖ было получено 500 мл ОВК в сахарозе после проведения второго цикла ультрацентрифугирования. Аликвоты полученных фракций второго сахарозного градиента объединяли и в них определяли содержание белка по Лоури. Общее содержание белка в 500 мл ОВК составило 16 граммов. Фракции ОВК хранились при температуре (от +3 до +6 С°) в течение нескольких дней для последующего получения моновакцины.

Для выделения моновакцины эти фракции разводили ФБР, тщательно перемешивали и добавляли раствор детергента Тритон Х-100 до его общего количества в реакции 24 грамма (отношение общего белка к детергенту составило 1:1,5). После этого полученный раствор тщательно перемешивали в течение 20 минут, после чего к нему добавляли детергент ТДТАБ таким образом, чтобы его общее количество в конечном растворе составило 16 граммов (отношение общего белка к детергенту ТДТАБ составило 1:1). После добавления второго детергента раствор тщательно перемешали в течение еще 40 минут, после чего передали на стадию ультрацентрифугирования. Общий объем раствора составил 12 литров. Ультрацентрифугирование проводили на центрифуге модели ЕК2, производства фирмы AlfaWassermann (USA). Ультрацентрифугирование проходило на проточном роторе при 20000 об./мин. в течение 3-х часов при скорости подачи жидкости через ротор 10 л/час. После окончания центрифугирования полученный супернатант передали на следующую стадию очистки. Эта стадия очистки была проведена методом двухкаскадной микрофильтрации с использованием складчатых фильтров с диаметрами пор 0,6 мкм и 0,2 мкм производства фирмы DomnicHunter(USA). После конца микрофильтрации картриджи промывали буфером, после чего промывочный раствор и фильтрат объединяли и концентрировали методом тангенциальной ультрафильтрации с мембранами с диаметром пор 30 КД. В данном эксперименте объем супернатанта, а также объем растворов после промывки ротора и картриджей составил 16 литров, после концентрирования этот объем составил 4 литра. Финальную очистку поверхностных антигенов проводили методом промышленной хроматографии с использованием гидрофобного носителя «SDRHyperD» производства фирмы Pall (USA). Этот носитель работает по принципу гидрофобных взаимодействий и способен удалять из водных растворов практически все детергенты, имеющие гидрофобные цепи. Для сокращения времени хроматографии был использован специальный технологический подход «ExpandedBedAdsorbtion», суть которого состоит в том, что препарат для очистки подается снизу колонки, а верхний слой гидрофобного носителя не фиксирован. С целью осуществления этого подхода была использована специальная колонка «StreamLine 200»производства фирмы GE-Healthcare(USA). Объем носителя в этой колонке был 3,5 литра. На эту колонку нанесли 4 литра сконцентрированного супернатанта и провели пять циклов циркуляции раствора через этот объем носителя со скоростью 10 л/час. После пятого цикла провели отбор пробы и убедились, что содержание детергента ТДТАБ там было 11 мкг/мл. Весь процесс очистки поверхностных антигенов, начиная с микрофильтрации и заканчивая хроматографической очисткой, происходил при комнатной температуре и занял 3 часа. В результате был получен концентрат с содержанием общего белка 9,0 граммов в объеме 5 литров (вместе с буфером промывки). Этот объем концентрата разбавили до объема 25 литровбуфером ФБР, содержащим детергент Тритон Х-100 до конечной концентрации 300 мкг/мл. Полученные 25 литров раствора тщательно перемешали в стерильном реакторе с мешалкой, после чего провели стерилизующую фильтрацию через стерильный картридж с размером пор 0,22 мкм фирмы Millipore (USA). Фильтрацию проводили в стерильный одноразовый мешок производства фирмы HyClone (USA). Объем профильтрованной жидкости составил 23 литра. Из полученного раствора моновакцины отобрали образцы для проведения контролей согласно спецификации, указанной в ГФ РФ XIV. Согласно полученным результатам, общее содержание белка в моновакцине составило 7,5 граммов, общее содержание антигена ГА составило 2,7 граммов. Концентрация детергента ТДТАБ в полученном растворе моновакцины была определена 2,5 мкг/мл. Уровень эффективности технологии на стадии моновакцины в этом эксперименте составил 64 мкг ГА с 1 КЭ. Полипептидный состав образца полученной экспериментальной моновакцины представлена Фиг. 12.

Из представленных данных следует, что основным полипептидом в составе экспериментальной моновакцины является полипептид НА0 (нерасщепленная форма антигена ГА). Полипептид нуклеокапсида (NP) присутствует в следовых количествах по сравнению с относительным содержанием полипептида нуклеокапсида в препарате ОВК, из которого была получена экспериментальная моновакцина. Полипептид мембранного белка (M1) в составе моновакцины не выявлен. Наличие полипептидов НА1 (тяжелая цепь антигена ГА) и НА2 (легкая цепь антигена ГА) практически не обнаружена, что свидетельствует об отсутствии феномена спонтанного расщепления в процессе выделения моновакцины.

Пример 7.

Получение моновакцины серотипа В (линия Виктория) согласно заявленному способу

Для получения моновакцины серотипа В (линия Виктория) было использована 44 тыс. шт. КЭ. Для заражения КЭ был использован посевной вирус 8-го пассажного уровня серотипа B/Brisbane/60/2008. Процедуры обработки эмбрионов, предварительной инкубации и заражения КЭ вирусом проводились также, как и в примере 6. Однако инкубацию КЭ после заражения проводили при температуре (+32, 5 С°) в течение 68 часов. После стадии инкубации и охлаждения было собрано 410 литров ВАЖ, которые были получены в объеме 30 литров после соответствующей обработки, очистки и концентрирования. В результате, после двух циклов ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы было отобрано 6 фракций градиента с общим содержанием белка 14 граммов. Выделение моновакцины проводили, как указано в примере 6, однако, соотношения общий белок:детергент Тритон Х-100: детергент ТДТАБ было выбрано как (1:1,2:0,8). Объем разрушения составил 14 литров. После стадии ультрацентрифугирования и микрофильтрации вместе с буфером промывки объем составил 22 литра, которые были сконцентрированы до объема 5 литров. Для очистки полученного концентрата было проведено четыре цикла циркуляции со скоростью 10 л/час, после чего содержание детергента ТДТАБ достигло уровня 4 мкг/мл. Общее содержание белка составило 7 граммов. Этот раствор был разведен до объема 20 литров буфером ФБР, содержащим детергент Тритон Х-100. В результате было получено 19 литров моновакцины. Общее содержание белка в моновакцине составило 7,2 граммов, общее содержание ГА - 2,5 грамма. Эффективность технологии в этом эксперименте составила 56 мкг ГА на 1 шт. КЭ. Содержание детергента ТДТАБ составило 2 мкг/мл. Полипептидный состав образца полученной экспериментальной моновакцины представлен на Фиг. 13.

Из представленных данных следует, что основным полипептидом в составе экспериментальной моновакцины является полипептид НАО (нерасщепленная форма антигена ГА). Полипептид нуклеокапсида (NP) также обнаруживается в составе моновакцины, однако его сравнительное содержание по отношению к полипептиду НАО меньше, чем в препарате ОВК, из которого была получена экспериментальная моновакцина. Полипептид мембранного белка (M1) в составе моновакцины не выявлен. Наличие полипептидов НА1 (тяжелая цепь антигена ГА) и НА2 (легкая цепь антигена ГА) практически не обнаружена, что свидетельствует об отсутствии феномена спонтанного расщепления в процессе выделения моновакцины.

Пример 8.

Получение моновакцины серотипа В (линия Ямагато) согласно заявленному способу

Для получения моновакцины серотипа В (линия Ямагато) были использованы 46 тыс. шт. КЭ. Для заражения КЭ был использован в качестве посевного материала вирус серотипа B/Phuket/3073/2013 на 10-ом пассажном уровне. Процедуры обработки эмбрионов, предварительной инкубации и процесс заражения КЭ вирусом проводились также, как и в примерах 6 и 7. Однако инкубацию КЭ после заражения проводили при температуре (+33,0 С°) в течение 64 часов. После стадии инкубации и охлаждения было собрано 480 литров ВАЖ, которые после соответствующей обработки, очистки и концентрирования были получены в объеме 35 литров. После двух циклов ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы было отобрано 7 фракций градиента с общим содержанием белка 16 граммов. Выделение моновакцины проводили, как указано в примере 7.

Соотношение Общий белок: детергент Тритон Х-100: детергент ТДТАБ было выбрано (1:1,2:0,8), как и в примере 7. Объем разрушения составил 13 литров. После стадии ультрацентрифугирования и микрофильтрации вместе с буфером промывки объем составил 21 литра, которые были сконцентрированы до объема 4 литров. Для очистки полученного концентрата было проведено пять циклов циркуляции со скоростью 10 л/час, после чего содержание детергента ТДТАБ в растворе достигло уровня 5 мкг/мл. Общее содержание белка составило 7,9 граммов. Этот раствор был разведен до объема 22 литров буфером ФБР, содержащим детергент Тритон Х-100. В результате было получено 21 литр моновакцины. Общее содержание белка в моновакцине составило 7,7 граммов, общее содержание ГА-2,8 грамма. Эффективность технологии в этом эксперименте составила 68 мкг ГА на 1 шт. КЭ. Содержание детергента ТДТАБ в растворе моновакцины составило 2 мкг/мл. Полипептидный состав образца полученной экспериментальной моновакцины был аналогичен представленному на Фиг. 13 (пример 7).

Пример 9.

Получение моновакцины серотипа H1N1 согласно заявленному способу

Для получения моновакцины серотипа H1N1 было использовано 48 тыс. шт. КЭ и посевной вирус 6-го пассажного уровня серотипа A/Michigan/45/2105 (H1N1). После заражения КЭ инкубация проходила при температуре (+35,5 С°) в течение 48 часов. Из полученного количества КЭ было собрано 470 литров ВАЖ. Все параметры дальнейшей очистки также соответствовали параметрам, указанным в примере 6. Концентрат после микрофильтрации собрали в объеме 30 литров. После второго градиента было собрано 5 фракций, в которых содержалось 9 граммов общего белка. Разрушение ОВК проводилось при соотношениях общий

белок:детергент Тритон Х-100:детергент ТДТАБ как 1:1,5:1. После удаления детергентов общее количество белка составило 4 грамма, которые были разведены до объема 12 литровбуфером ФБР. В полученной моновакцине содержание общего белка составило 3,5 грамма, содержание общего ГА - 1,9 грамма. Концентрация детергента ТДТАБ составила 3,2 мкг/мл. Эффективность технологии в этом эксперименте составила 39,6 мкг ГА на 1 шт. КЭ. Полипептидный состав образца полученной экспериментальной моновакцины представлен на Фигуре 14.

В результате проведенного анализа было показано, что в составе экспериментальной моновакцины присутствует только антиген ГА в виде двух форм: полипептида НАО (нерасщепленная форма) и полипептида димера НАО (специфический агрегат антигена ГА). Полипептидов нуклеокапсида (NP), мембранного белка (M1), а также феномена спонтанного расщепления выявлено не было.

Пример 10.

Приготовление лекарственной формы четырехвалентной субъединичной вакцины без адъювантов.

Для приготовления лекарственной формы вакцины были использованы препараты моновакцин, процесс получения которых был описан в примерах №6, 7, 8, 9.

Согласно рекомендациям ВОЗ, четырехвалентные инактивированные вакцины против гриппа без адъювантов должны содержать в своем составе антигены ГА каждого из 4-х рекомендованных серотипов в диапазоне концентраций от 25,6 мкг/мл до 34,4 мкг/мл по каждому серотипу. Существуют также рекомендации, что для приготовления стерильных однодозных упаковок вакцины не следует добавлять какие-либо консерванты бактериального роста.

Из данных литературы следует, что зарубежные производители инактивированных вакцин против гриппа для сохранения специфической активности лекарственной формы в процессе ее хранения используют различные дезагрегирующие добавки, в том числе детергент Тритон Х-100.

Исходя из этой информации было проведено сведение экспериментальной серии четырехвалентной вакцины в объеме 10 литров. Расчет этого сведения проводился таким образом, чтобы в конечном растворе вакцины концентрация антигенов ГА каждого из четырех серотипов была в вышеуказанном диапазоне, а концентрация детергента Тритон Х-100 была от 150 мкг/мл до 200 мкг/мл. Из этого объема сведения был отобран образец 10 мл, в котором были изучены выше перичисленные параметры. После получения позитивных результатов весь объем сведения был стерилизован с использованием стерильных одноразовых капсюлей МиллиПак-60 фирмы Миллипоре (США) согласно правилам GMP. Далее стерильный раствор вакцины был разлит по стерильным флаконам объемом 1 мл. Объем розлива в каждый флакон составлял по,55 мл (одна доза). После розлива несколько флаконов были взяты для проведения анализов.

По результатам этих анализов было установлено, что содержание ГА серотипа H1N1 в одной дозе вакцины составляет 16,2 мкг, ГА серотипа H3N2 составляет 16,4 мкг, ГА серотипа В (линия Виктория) составляет 15,9 мкг, ГА серотипа В (линия Ямагато) составляет 16,7 мкг. Концентрация детергента Тритон Х-100 была 170 мкг/мл, а концентрация детергента ТДТАБ была 2 мкг/мл. Проведенный контроль на стерильность показал, что полученная лекарственная форма стерильна и может использоваться для дальнейших исследований.

Пример 11

Сравнительное изучение антигенной активности вакцины, полученной по предлагаемому способу

Для того, чтобы подтвердить, что полученная предлагаемым способом экспериментальная вакцина обладает высокой антигенной активностью, было проведено сравнительное исследование этой вакцины и расщепленной вакцины «Ваксигрипп», производства фирмы SANOFI-Pasteur, (France). Вакцина «Ваксигрипп» была взята в качестве вакцины сравнения, так как, согласно данным мировой литературы, она обладает высокой антигенной активностью и, соответственно, высокой иммуногенностью при вакцинации людей. Для того, чтобы получить более адекватные результаты, в исследования было взято по 40 беспородных мышей для изучения каждого из двух препаратов. Контрольная группа составила 20 лабораторных животных. В каждое животное вводили по 0,2 мл испытуемого препарата внутрибрюшинно, вакцинацию проводили двукратно с интервалом в 21 день. На 21-й день после первой вакцинации и на 14-й день после второй вакцинации у каждого животного отбирали сыворотку крови для изучения в реакции торможения геммаглютинирующей активности (РТГА). Анализ РТГА проводили согласно методике, указанной в ГФ РФ (14). Кроме того, было проведено дополнительное изучение титров антител в реакции микронейтрализации (РМН). РМН, согласно данным мировой литературы, значительно более адекватно выявляет протективные способности антигена ГА по сравнению с РТГА. Оценка титров проводилась, как по изменению титров антител после первой и второй иммунизации, так и по соответствующим уровням серопротекции после каждой иммунизации. Данные представлены в Таблице 2.

Согласно представленным данным, оба изученных препарата показали высокую антигенную активность. Уже после первой иммунизации уровень специфических антител в реакции РТГА достигал защитного уровня (не менее титра 1:40), при этом в группе мышей, иммунизированных предлагаемой вакциной, этот уровень был достоверно выше по всем серотипам по сравнению с вакциной Ваксигрипп. Уровень серопротекции в реакции РТГА по всем серотипам после первой иммунизации также достигал уровня, указанного в соответствующих рекомендациях ВОЗ (не менее 70%). Но по показателю серопротекции в реакции РМН по серотипу B/Brisbane/60/2008 была выявлена разница между предлагаемой вакциной и вакциной «Ваксигрипп», которая в данном эксперименте не набрала уровень серопротекции 70% после первой иммунизации.

Что касается титров антител, а также уровней серопротекции после второй иммунизации, особых различий выявлено не было. Таким образом, предлагаемая субъединичная вакцина проявила антигенную активность, не уступающую таковой вакцине «Ваксигрипп», которая в мировой практике вакцинации считается «золотым» стандартом иммуногенности. Таким образом, вакцина, полученная по предлагаемому способу, обладает высокой антигенной активностью.

Список литературы

1. Patent USA US 4064232A US «Process for isolating for immunogenic components of influenza viruses», начало срока действия патента с 14.01.1974. Авторы: Bachmayer Н., Schmidt G., USA.

2. European Medicines Agency (EMA) «Guideline on Influenza Vaccines-QualityModule»,oпyбликoвaнa в бюллетене EMA/CHMP/BWP/310834/2012, 25.04.2014.

3. Патент РФ RU 2446824 C2 «Вакцина против гриппа и способ ее получения», начало срока действия патента 20.07.2010. Авторы: Алсынбаев М.М, Загидуллин Н.В. Кедик С.А.

4. Патент РФ RU 2283139 С1 «Способ получения антигенов для вакцины против вирусов гриппа», начало срока действия патента с 21.03.2005. Авторы: Гельфанд А.С, Брызгалова СИ., Мельников С.Я., Гусарова Н.А., Ярославцев И.В.

5. Патент РФ RU 2493872 С1 «Способ очистки вирусов гриппа», начало срока действия патента с 08.08.2012. Авторы: Загидуллин Н.В., Кызин А.А., Исрафилов А.Г., Гелич Л.В., Катаева В.В.

6. Патент РФ RU 2523614 С1 «Вакцина против гриппа и способ ее получения», начало срока действия патента с 09.04.2013. Авторы: Загидуллин Н.В., Исрафилов А.Г., Гелич Л.В., Кызин А.А., Ерастова Н.П.

7. Патент РФ RU 2584594 С1 «Вакцина гриппозная инактивированная расщепленная и способ ее получения», начало срока действия патента с 02.07.2015. Авторы: Трухин В.П., Петровский СВ. Аракелов С.А., Быков Д.Г., Евтушенко А.Э., Уйба СВ., Грановский В.Н., Савина Н.Н.

8. Patent USA US2011/0014230 Al «Preparation of influenza virus vaccine antigens», начало срока действия патента с 17.09.2010. Авторы: Haussmann С, Hauschild F., Jobst В.

9. Wang W, DeFeo CJ, Alvarado-Facundo EJ at all. «Intermonomer Interactions in Hemagglutinin Subunits HA1 and HA2 Affecting Hemagglutinin Stability and Influenza Virus Infectivity», J Virol. 2015 October, v. 89: pp 10602-10611.

10. Budimir N., Huckriede A., Meijerhof T. at all.«Induction of Heterosubtypic Cross-Protection against Influenza by a Whole Inactivated Virus Vaccine: The Role of Viral Membrane Fusion Activity)). PLoSOne. 2012; 7(1): e30898. Publishedonline 2012 Jan 27. doi: 10.1371/journal.pone.0030898.

11. Budowsky E.I., Friedman E.A., Zheleznova N.V., at all«Principles of selective inactivation of viral genome». Vaccine, 1991;v,9(6); pp 398-402.

12. Patent ЕСЕР 2493501A1 «Process for producing influenza vaccines», начало срока действия патента с 27.10.2009. Авторы: Hondt E.J., Engelmann Н.В.

13. Gallagher J. R., McCraw D. M., Torian U., at all. «Review Characterization of Hemagglutinin Antigens on Influenza Virus and within Vaccines Using Electron Microscopy)). Vaccines, 2018; v, 6; p. 31-52.

14. ФС.3.3.1.0028.15 «Вакцина гриппозная инактивированная», Государственная фармакопея Российской Федерации, МЗ РФ, ХIV издание, том IV, Москва, год 2018, стр. 5402-5418.

1. Способ производства четырехвалентной субъединичной вакцины без адъювантов для профилактики гриппа, согласно которому

а) получают четыре моновакцины, содержащие один из серотипов вирусов гриппа H1N1, H3N2, В (линия Виктория) или В (линия Ямагата), причем для получения моновакцин

1) получают вируссодержащую аллантоисную жидкость (ВАЖ);

2) инактивируют ВАЖ дезинфектантом бета-пропиолактоном;

3) очищают и концентрируют ВАЖ методами микрофильтрации с использованием трех последовательных каскадов складчатых фильтров с диаметрами пор 10 мкм, 1,0 мкм и 0,6 мкм, ультрафильтрации и двумя последовательными циклами ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы с получением очищенного вирусного концентрата (ОВК);

4) разрушают вирионы в полученном ОВК последовательной обработкой детергентами Тритон Х-100 и ТДТАБ;

5) удаляют субвирионные структуры из полученного на стадии 4) раствора методами ультрацентрифугирования и микрофильтрации через складчатые фильтры с диаметрами пор 0,6 мкм и 0,2 мкм;

6) удаляют детергенты из полученного раствора методами ультрафильтрации с использованием мембран с размером отсечки 30 КД и концентрирования полученного очищенного супернатанта с последующей очисткой полученного раствора концентрата методом гидрофобной хроматографии с применением технологии «ExpandedBedAdsorption», которая заключается в том, что подачу препарата для очистки осуществляют через нижнее основание колонки, а верхняя часть хроматографического носителя не фиксируется;

7) разбавляют концентрат фосфатным буферным раствором, содержащим детергент Тритон Х-100, с получением моновакцины;

б) объединяют четыре моновакцины, содержащие серотипы вирусов гриппа H1N1, H3N2, В (линия Виктория) и В (линия Ямагата), в единую лекарственную форму при добавлении детергента Тритон Х-100 в качестве дезагрегирующей добавки с последующими фильтрующей стерилизацией и розливом полученной лекарственной формы четырехвалентной вакцины в стерильные емкости.

2. Способ по п. 1, в котором для гидрофобной хроматографии используют носитель «SDRHyperD», производства фирмы Раll (USA).

3. Способ по п. 1, в котором взаимодействие Тритона Х-100 с очищенными вирионами проводят в течение 20 мин, а взаимодействие ТДТАБ с очищенными вирионами в течение 40 мин.

4. Способ по п. 1, в котором розлив лекарственной формы проводят в стерильные флаконы, ампулы и специальные шприцы для преднаполнения вакцины.