Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, и касается способа стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора in vitro. Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro заключается в культивировании прилипающих клеток костного мозга в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в среде, содержащей 90% RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина и стимулятор. В качестве стимулятора используют ингибиторы C-Jun N-terminal kinase (JNK): ингибитор JNK «SP600125» в концентрации 10 микромоль (мкМ) или ингибитор JNK «IQ-1S» в концентрации 20 мкМ. Использование данного способа позволяет эффективно стимулировать выработку гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга при блокаде JNK в условиях in vitro. 1 табл.

 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, и касается способа стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) in vitro.

Наиболее близким по технической сущности, механизму действия и достигаемому результату является способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора in vitro прилипающими клетками костного мозга с помощью ингибитора протеинкиназы р38, который добавляют в концентрации 300 мкМ в культуру ткани и инкубируют при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов [1]. Указанный способ выбран в качестве прототипа.

Недостатком данного способа является его низкая эффективность.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.

Поставленная задача достигается тем, что in vitro культивируют прилипающую фракцию клеток костного мозга в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, при добавлении ингибитора C-Jun N-terminal kinase (JNK).

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве стимулятора выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора прилипающими клетками костного мозга ингибитора JNK.

На сегодняшний день из большого разнообразия фармакологических веществ, применяемых для стимуляции гемопоэза [2, 3], наиболее широко используются препараты на основе ростовых факторов (эритропоэтин и колониестимулирующие факторы), взаимодействующих со специфическими рецепторами кроветворных клеток. Недостатком данных средств является достаточно высокий риск развития при их применении побочных эффектов и осложнений, связанных с плейотропностью и полифункциональностью цитокинов, а также их иммуногенностью, обусловленной белковой природой указанных регуляторов физиологических функций [4-8].

Выявленные ранее в НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (Томский НИМЦ) особенности внутриклеточного сигналинга в прогениторных клетках различного класса позволили предложить «Стратегию фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках» [8], предполагающую использование в качестве мишеней отдельных внутриклеточных сигнальных молекул клеток-предшественников и элементов микроокружения, опосредовано влияющих на течение репаративных процессов, в том числе за счет выработки ростовых факторов. При этом для разработки лекарственных препаратов с подобным таргетным действием [4, 6], исследование секреции Г-СКФ в системе in vitro представляет собой основу методологии создания средств с гемостимулирующей активностью в отношении гранулоцитарного ростка кроветворения [3].

Известен ряд сигнальных молекул, участвующих в реализации функциональной, в том числе секреторной, активности некоторых клеток костного мозга [8, 9]. Однако участие и роль C-Jun N-terminal kinase (JNK) в продукции гранулоцитарного колониестимулирующего фактора прилипающими клетками костного мозга до сих пор не известна.

Факт использования прилипающей фракции клеток костного мозга при добавлении в культуральную среду ингибиторов JNK с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции выработки Г-КСФ in vitro, для специалиста является неочевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом.

Взвесь клеток костного мозга мышей (5×10⁶ клеток/мл) разделяют на прилипающую и неприлипающую фракции. Полученные прилипающие клетки инкубируются в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, при добавлении ингибиторов JNK в эффективной концентрации в СО₂-инкубаторе при 37°C, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов. По окончании инкубации кондиционные среды после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут собирают с помощью пипетки.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах-самцах линии C57BI/6 в количестве 16 шт., массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ. Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Пример 1.

Суспензию костномозговых клеток, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 45 мин в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащей 10% ЭТС («Sigma», США), в 35 мм пластиковых чашках Петри («Corning», США) в течение 40-50 мин при 37°C, 5% СО₂ и 100% влажности для выделения прилипающей фракции миелокариоцитов. После чего с помощью пипетки собирали и удаляли неприлипающие миелокариоциты, а прилипающие миелокариоциты инкубировались в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), с добавлением 10 мкМ ингибитора JNK «SP600125» (InvivoGen», США), либо 20 мкМ ингибитора JNK «IQ-1S» (Tocris Bioscience, США), при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности.

Концентрации ингибиторов JNK «SP600125» в 10 мкМ и «IQ-1S» в 20 мкМ были отобраны в предварительных экспериментах в качестве наиболее эффективных.

Контролем служили культуры клеток без добавления ингибитора JNK и способ прототип [1]. Выработка гранулоцитарного колониестимулирующего фактора способа прототипа являлась критерием эффективности предлагаемого изобретения. По способу прототипу: полученные прилипающие клетки (в концентрации 2×10⁶ клеток/мл) инкубировали в течение 24 часов в полной культуральной среде: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), с добавлением ингибитора протеинкиназы р38 «SB203580» (Calbiochem, США) в концентрации 300 мкМ, при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности.

По окончании инкубации собирали кондиционные среды (супернатанты) и определяли в них уровень содержания гранулоцитарного колониестимулирующего фактора методом ИФА, с помощью набора фирмы «R&D Systems» (USA) согласно методическим указаниям производителя.

В ходе эксперимента показано, что добавление любого из используемых ингибиторов JNK в культуру прилипающих клеток костного мозга значительно повышало уровень содержания Г-КСФ в кондиционных средах. При этом увеличение данного параметра регистрировалось как в сравнении с таковым в кондиционных средах, полученных от прилипающих клеток костного мозга без ингибиторов, так и в отношении аналогичного показателя при добавлении в культуру прилипающих миелокариоцитов ингибитора протеин-киназы р38 (по способу прототипу) (табл.).

Полученные результаты свидетельствуют о важной роли C-Jun N-terminal kinase-опосредованного сигналинга в регуляции секреторной функции стромальных элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения [2, 3]. При этом блокада JNK в прилипающих клетках костного мозга в условиях in vitro сопровождалась выраженной стимуляцией продукции ими гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.

Предлагаемый в качестве изобретения способ позволяет эффективно стимулировать выработку Г-КСФ клетками костного мозга in vitro.

Цитируемая литература

1. Патент (RU) на изобретение №2527888 от 14.06.2014 г. Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro. Авторы: Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Удут Е.В., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Чайковский А.В., Хричкова Т.Ю., Бурмина Я.В.

2. Дыгай A.M., Жданов В.В. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические аспекты. Москва, 2009, с. 18-19.

3. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е., Зюзьков Г.Н., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Мирошниченко Л.А., Ставрова Л.А. Методические рекомендации по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2013. - С. 759-766 (944 с.).

4. Жданов В.В., Мирошниченко Л.А., Удут Е.В., Полякова Т.Ю., Зюзьков Г.Н., Симанина Е.В., Шерстобоев Е.Ю., Ставрова Л.А., Агафонов В.И., Минакова М.Ю., Дыгай A.M. Роль сигнальных молекул в регуляции гранулоцитопопэза при стрессиндуцирующем воздействии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2018. Т. 166, №9. С. 315-319.

5. Grimberg A. Mechanisms by which IGF-I may promote cancer. // Cancer Biol Ther, 2003, 2, P. 630-635.

6. Dygai A.M., Zhdanov V.V., Zyuzkov G.N., Udut E.V., Miroshnichenko L.A., Simanina E.V., Chaikovskii A.V., Stavrova L.A., Danilets M.G. Role of NF-кВ-dependent signaling and p38 mapk signaling pathway in the control of hemopoiesis during cytostatic administration // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014. T. 157. №1. C. 32-36.

7. Зюзьков Г.Н., Жданов B.B., Удут E.B., Мирошниченко Л.А., Симанина Е.В., Полякова Т.Ю., Ставрова Л.А., Удут В.В., Минакова М.Ю., Дыгай A.M. Участие JAK1, JAK2 и JAK3 в стимуляции функций мезенхимных клеток-предшественников фактором роста фибробластов // Бюл. эксперим. биол. и медицины, 2016-№8. - С. 206-209.

8. Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Полякова Т.Ю., Ставрова Л.А., Удут В.В. Стратегия фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в регенераторно-компетентных клетках // Бюл. эксперим. биол. и медицины, 2018.-№10. - С. 435-445.

9. Зюзьков Г.Н., Суслов Н.И., Поветьева Т.Н., Нестерова Ю.В., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Полякова Т.Ю., Афанасьева О.Г., Жданов В.В. Механизмы церебропротекторного действия ингибитора C-Jun N-terminal kinase (JNK) // Экспериментальная и клиническая фармакология, 2017. - Том 80. - №6. - С. 14.

Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro, заключающийся в культивировании прилипающих клеток костного мозга в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в среде, содержащей 90% RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина и стимулятор, отличающийся тем, что в качестве стимулятора используют ингибиторы C-Jun N-terminal kinase (JNK): ингибитор JNK «SP600125» в концентрации 10 микромоль (мкМ) или ингибитор JNK «IQ-1S» в концентрации 20 мкМ.