Улучшенные способы производства средств адоптивной клеточной терапии

Настоящая группа изобретений относится к клеточной биологии. Предложены способ производства Т-клеток и способ производства терапевтического средства на основе Т-клеток человека, предусматривающие культивирование популяции мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), которая содержит Т-клетки и антиген-презентирующие клетки (APC), в течение от 20 часов до 24 часов в среде, содержащей экзогенный интерлейкин-2 (IL-2), антитело к CD3 или его CD3-связывающий фрагмент и антитело к CD28 или его CD28-связывающий фрагмент, B7-1 или его CD28-связывающий фрагмент, или B7-2 или его CD28-связывающий фрагмент; и трансдукцию популяции PBMC с помощью лентивирусного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор (CAR) к B-клеточному антигену созревания (BCMA). Данная группа изобретений может найти применение в производстве средств для адоптивной терапии. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр., 18 ил.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии с § 119(e) раздела 35 Свода федеральных законов США на основании предварительной заявки на патент США №61/984558, поданной 25 апреля 2014 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ЗАЯВЛЕНИЕ В ОТНОШЕНИИ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей, связанный с настоящей заявкой, предоставлен в виде файла в текстовом формате вместо бумажной копии и, тем самым, включен посредством ссылки в настоящее описание. Название текстового файла, содержащего перечень последовательностей, BLBD_028_01WO_ST25.txt. Текстовый файл размером 3 килобайт, был создан 24 апреля 2015 года и предоставляется на рассмотрение в электронном виде посредством EFS-Web одновременно с подачей настоящего описания.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область техники

Настоящее изобретение относится к улучшенным платформам и связанным способам производства иммунных эффекторных клеток. Более конкретно, настоящее изобретение относится к масштабируемым, гибким, надежным и воспроизводимым способам производства терапевтических композиций на основе иммунных эффекторных клеток, содержащих Т-клетки.

Описание предшествующего уровня техники

Адоптивная иммунотерапия или адоптивная клеточная терапия (ACT) представляет собой перенос генетически модифицированных T-лимфоцитов в субъекта для терапии заболевания. Потенциал адоптивной иммунотерапии для лечения широкого спектра заболеваний, таких как рак, инфекционное заболевание, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание и иммунодефицит, еще предстоит реализовать. Однако, для большинства, если не для всех, стратегий адоптивной иммунотерапии необходимы стадии активации и размножения T-клеток для получения клинически эффективной терапевтической дозы Т-клеток. Вследствие врожденной сложности культуры живых клеток и изменчивости между пациентами современные технологии получения терапевтических доз Т-клеток, в том числе сконструированных Т-клеток, остаются ограничены затруднительными производственными процессами для получения T-клеток. Существующие производственные процессы для получения T-клеток не являются легко масштабируемыми, воспроизводимыми, надежными или эффективными и зачастую приводят к образованию низкокачественного T-клеточного продукта, который может быть подвержен истощению и потере функций эффекторных иммунных клеток.

На сегодняшний день средства адоптивной терапии на основе разработанных T-клеток имеют ограниченный успех и обычно проявляют непостоянную клиническую активность. Таким образом, такие средства терапии не подходят для широко распространенного клинического применения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

В настоящем изобретении в целом предусмотрены способы адоптивной клеточной терапии.

В различных вариантах осуществления предусмотрен способ производства терапевтического средства на основе T-клеток, включающий: получение популяции клеток, которая содержит Т-клетки и антиген-презентирующие клетки (APC); культивирование популяции клеток в среде для культивирования клеток, содержащей i) один или более цитокинов, ii) антитело к CD3 или его CD3-связывающий фрагмент и iii) антитело к CD28 или его CD28-связывающий фрагмент, B7-1 или его CD28-связывающий фрагмент, или B7-2 или его CD28-связывающий фрагмент, при этом культивирование активирует и стимулирует Т-клетки; трансдукцию популяции активированных клеток с помощью вирусного вектора; и культивирование популяции клеток в ростовой среде для клеток для размножения трансдуцированных Т-клеток; с производством тем самым терапевтического средства на основе T-клеток.

В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток получают из периферической крови, мононуклеарных клеток периферической крови, костного мозга, ткани лимфатического узла, пуповинной крови, ткани тимуса, ткани из очага инфекции, асцитов, плеврального выпота, ткани селезенки или опухолей.

В определенных вариантах осуществления Т-клетки получают из периферической крови, мононуклеарных клеток периферической крови, костного мозга, ткани лимфатического узла, пуповинной крови, ткани тимуса, ткани из очага инфекции, асцитов, плеврального выпота, ткани селезенки, опухолей или линии T-клеток.

В дополнительных вариантах осуществления APC получают из периферической крови, мононуклеарных клеток периферической крови, костного мозга, ткани лимфатического узла, пуповинной крови, ткани тимуса, ткани из очага инфекции, асцитов, плеврального выпота, ткани селезенки или опухолей.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток содержит мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC).

В дополнительных вариантах осуществления сбор или получение популяции клеток включает лейкаферез.

В конкретных вариантах осуществления выделение популяции клеток включает осаждение.

В дополнительных вариантах осуществления осаждение включает градиент FICOLL™ или PERCOLL™.

В определенных вариантах осуществления осаждение выполняют с помощью полуавтоматической проточной центрифуги.

В дополнительных вариантах осуществления полуавтоматическая проточная центрифуга представляет собой Cobe 2991 Cell Processor, Cell Saver 5+ или Teruma Elutra.

В конкретных вариантах осуществления способы дополнительно включают промывку популяции клеток в буфере или среде для культивирования клеток.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток промывают в ростовой среде для T-клеток (TCGM), содержащей один или более цитокинов.

В некоторых вариантах осуществления один или более цитокинов в TCGM выбраны из группы, включающей IL-2, IL7, IL-15, IL-9 и IL-21.

В конкретных вариантах осуществления цитокин представляет собой IL-2.

В определенных вариантах осуществления концентрация IL-2 составляет приблизительно 250 МЕ/мл.

В определенных вариантах осуществления концентрация IL-2 составляет от приблизительно 100 МЕ/мл до приблизительно 300 МЕ/мл.

В некоторых вариантах осуществления выделенная популяция клеток содержит PBMC.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток подвергают криоконсервации с помощью программируемого аппарата для криозамораживания.

В дополнительных вариантах осуществления криоконсервированную популяцию клеток подвергают оттаиванию.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток высевают для культивирования на стадии (b) в TCGM при плотности, составляющей приблизительно 1x10⁸ клеток/мл.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток высевают для культивирования на стадии (b) в TCGM при плотности, составляющей приблизительно 1x10⁷ клеток/мл.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток высевают для культивирования на стадии (b) в TCGM при плотности, составляющей приблизительно 1x10⁶ клеток/мл.

В дополнительных вариантах осуществления приблизительно 1x10⁸ клеток высевают для культивирования на стадии (b) в TCGM при плотности, составляющей приблизительно 1x10⁶ клеток/мл.

В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток культивируют в пакете для культивирования клеток или в биореакторе.

В определенных вариантах осуществления TCGM содержит один или более цитокинов, выбранных из группы, включающей IL-2, IL7, IL-15, IL-9 и IL-21.

В дополнительных вариантах осуществления один или более цитокинов выбраны из группы, включающей IL-2, IL-7 и IL-15.

В дополнительных вариантах осуществления один или более цитокинов включают IL-2.

В дополнительных вариантах осуществления концентрация одного или более цитокинов составляет приблизительно 250 МЕ/мл.

В дополнительных вариантах осуществления концентрация одного или более цитокинов составляет от приблизительно 25 МЕ/мл до приблизительно 500 МЕ/мл.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток культивируют с растворимым антителом к CD3 и растворимым антителом к CD28.

В определенных вариантах осуществления концентрация антитела к CD3 составляет приблизительно 50 нг/мл.

В конкретных вариантах осуществления концентрация антитела к CD28 составляет приблизительно 50 нг/мл.

В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток на стадии b) культивируют в течение от приблизительно 12 часов до приблизительно 48 часов перед трансдукцией.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток на стадии b) культивируют в течение от приблизительно 16 часов до приблизительно 32 часов перед трансдукцией.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток на стадии b) культивируют в течение по меньшей мере 18 часов перед трансдукцией.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток на стадии b) культивируют в течение по меньшей мере 24 часов перед трансдукцией.

В определенных вариантах осуществления популяцию клеток на стадии d) трансдуцируют с помощью ретровирусного вектора.

В определенных вариантах осуществления популяцию клеток на стадии d) трансдуцируют с помощью лентивирусного вектора.

В дополнительных вариантах осуществления для трансдукции 1x10⁸ высеянных клеток применяют от приблизительно 1x10⁹ TU до приблизительно 2x10⁹ TU вирусного вектора.

В дополнительных вариантах осуществления для трансдукции 1x10⁸ высеянных клеток применяют от приблизительно 1x10⁹ TU до приблизительно 4x10⁹ TU вирусного вектора.

В конкретных вариантах осуществления вирусный вектор разводят до 20% объем/объем от общего объема культуры.

В конкретных вариантах осуществления вирусный вектор разводят до приблизительно 20% - приблизительно 40% объем/объем от общего объема культуры.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток подвергают трансдукции в течение от приблизительно 18 до приблизительно 48 часов.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток подвергают трансдукции в течение от приблизительно 18 до приблизительно 36 часов.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток подвергают трансдукции в течение приблизительно 24 часов.

В дополнительных вариантах осуществления вирусный вектор содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор.

В определенных вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный домен, который связывает антиген, выбранный из группы, включающей фолатный рецептор альфа, 5T4, αvβ6-интегрин, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, семейство EGFR, в том числе ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, фетальный AchR, FRα, GD2, GD3, 'глипикан-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, лямбда-цепь, Lewis-Y, каппа-цепь, мезотелин, Muc1, Muc16, NCAM, лиганды NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, сурвивин, TAG72, TEM и VEGFR2; трансмембранный домен, полученный из полипептида, выбранного из группы, включающей CD8α; CD4, CD28, CD45, PD1 и CD152; один или более внутриклеточных доменов передачи костимулирующего сигнала, выбранных из группы, включающей CD28, CD54 (ICAM), CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA4), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1) и CD278 (ICOS); и домен передачи сигнала CD3ζ.

В конкретных вариантах осуществления внеклеточный домен содержит антитело или антиген-связывающий фрагмент, которые связывают антиген.

В дополнительных вариантах осуществления трансмембранный домен получен из CD8α или CD28.

В определенных вариантах осуществления один или более доменов передачи костимулирующего сигнала выбраны из группы, включающей CD28, CD134 и CD137.

В дополнительных вариантах осуществления предусмотрен полипептид шарнирной области.

В дополнительных вариантах осуществления полипептид шарнирной области содержит шарнирную область IgG1 или CD8α.

В конкретных вариантах осуществления CAR дополнительно содержит сигнальный пептид.

В конкретных вариантах осуществления сигнальный пептид содержит сигнальный полипептид тяжелой цепи IgG1, сигнальный полипептид CD8α или сигнальный полипептид альфа-субъединицы рецептора GM-CSF человека.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток на стадии d) культивируют для размножения в течение от приблизительно 5 до приблизительно 8 дней.

В определенных вариантах осуществления популяцию клеток на стадии d) культивируют для размножения в течение от приблизительно 5 дней до приблизительно 8 дней в пакете для культивирования клеток.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток на стадии d) культивируют для размножения в течение приблизительно 5 дней в пакете для культивирования клеток, а затем культивируют в течение приблизительно 3 дней в биореакторе.

В дополнительных вариантах осуществления популяцию клеток на стадии d) культивируют для размножения в течение от приблизительно 5 дней до приблизительно 8 дней в биореакторе.

В дополнительных вариантах осуществления биореактор представляет собой биореактор WAVE или биореактор GREX.

В конкретных вариантах осуществления количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 50 раз в ходе культивирования на стадии d).

В определенных вариантах осуществления количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 100 раз в ходе культивирования на стадии d).

В конкретных вариантах осуществления количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 200 раз в ходе культивирования на стадии d).

В дополнительных вариантах осуществления количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 300 раз в ходе культивирования на стадии d).

В дополнительных вариантах осуществления количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 400 раз в ходе культивирования на стадии d).

В дополнительных вариантах осуществления количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 500 раз в ходе культивирования на стадии d).

В дополнительных вариантах осуществления количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 600 раз в ходе культивирования на стадии d).

В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает извлечение произведенного терапевтического средства на основе Т-клеток.

В определенных вариантах осуществления извлечение терапевтического средства на основе Т-клеток включает концентрирование и промывку клеток, размноженных на стадии d).

В конкретных вариантах осуществления терапевтическое средство на основе Т-клеток концентрируют и промывают с помощью полуавтоматической проточной центрифуги.

В дополнительных вариантах осуществления полуавтоматическая проточная центрифуга представляет собой Cell Saver 5+ или LOVO.

В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает криоконсервирование терапевтического средства на основе Т-клеток.

В дополнительных вариантах осуществления криоконсервированные Т-клетки оттаивают для применения в способе адоптивной клеточной терапии.

В различных вариантах осуществления предусмотрена композиция, содержащая Т-клетки, произведенные по любому из предыдущих вариантов осуществления, описанных выше и в других частях данного документа, а также физиологически приемлемый наполнитель.

В различных других вариантах осуществления предусмотрен способ лечения новообразования у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтического средства на основе T-клеток по любому из предыдущих вариантов осуществления, описанных выше и в других частях данного документа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НЕСКОЛЬКИХ АСПЕКТОВ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фигуре 1 показана эффективность трансдукции и VCN трансдуцированных клеток, которые трансдуцировали в различные моменты времени на протяжении производственного процесса получения T-клеток. Клетки трансдуцировали с помощью GFP-экспрессирующего лентивируса из расчета 1-2 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC в D0, D1 и D2. С помощью FACS-анализа GFP-экспрессирующих клеток, которые экспрессируют CD3, CD8 или CD4, определили, что эффективность трансдукции и VCN были самыми высокими у клеток, трансдуцированных через 20-24 часов (D1) после активации.

На фигуре 2 показана эффективность трансдукции клеток, активированных в применением различных способов. PBMC активировали с применением (i) связанных на планшете антитела к CD3 и антитела к CD28; (ii) растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28; и (iii) связанных с гранулами антитела к CD3 и антитела к CD28. Активированные клетки трансдуцировали с помощью лентивируса, экспрессирующего CAR к CD19, из расчета 1-2 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC. Эффективность трансдукции и VCN были выше у GFP-экпрессирующих T-клеток с маркерами CD3, CD8 или CD4, активированных с помощью растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28, в сравнении с другими способами.

На фигуре 3 показано, что активация и трансдукция в пакетах для культивирования клеток была сравнимой с трансдукцией во флаконах. PBMC активировали в D0 с применением растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28 при концентрации 50 нг/мл. Активированные клетки трансдуцировали с помощью лентивируса, экспрессирующего каппаLC, из расчета 3 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC в D1. Эффективность трансдукции была сравнимой при активации и трансдукции клеток либо в пакетах для культивирования клеток, либо во флаконах. VCN было немного выше у клеток, которые активировали и трансдуцировали в пакетах для культивирования клеток.

На фигуре 4 показано, что размножение T-клеток из PBMC, активированных с применением различных способов, было сравнимым. PBMC активировали с применением (i) связанных на планшете антитела к CD3 и антитела к CD28; и (ii) растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28; или очищенные лимфоциты активировали с помощью (iii) связанных с гранулами антитела к CD3 и антитела к CD28. PBMC и лимфоциты были из одного источника. Активированные клетки трансдуцировали с помощью лентивируса, экспрессирующего CAR к CD19, из расчета 1-2 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC. Размножение клеток из PBMC, активированных с помощью трех способов, было сравнимым на протяжении десятидневного периода размножения культуры.

На фигуре 5 показано, что для PBMC от многочисленных доноров отмечается сравнимое и надежное размножение. PBMC активировали с применением растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28. Активированные клетки трансдуцировали с помощью лентивируса, экспрессирующего CAR к CD19, из расчета 1-2 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC. Для активированных и трансдуцированных клеток от множественных доноров, которые культивировали в течение 10 дней, показаны сравнимые скорости роста между собой и c нетрансдуцированным контролем (UTD). Также показано количество лимфоцитов, присутствующих в день 10 в каждой размноженной культуре.

На фигуре 6 представлен типичный FACS-анализ, с помощью которого показано, что экспрессия антитела к CD19 была сравнимой у клеточных продуктов, полученных от различных пациентов, со средним значением приблизительно 61% меток и диапазоном от 29% до 80% (n=5). С помощью qPCR также показано, что VCN клеточных продуктов было сравнимым для клеточных продуктов, полученных от различных пациентов.

На фигуре 7 показано, что антиген-специфический клиренс опухоли под действием T-клеток, активированных путем применения растворимых антител, был таким же или лучшим, чем в случае T-клеток, активированных с применением других способов. PBMC активировали с применением (i) связанных на планшете антитела к CD3 и антитела к CD28; (ii) растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28; и (iii) связанных с гранулами антитела к CD3 и антитела к CD28. Активированные клетки трансдуцировали с помощью лентивируса, экспрессирующего CAR к CD19, из расчета 1-2 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC. Размноженные T-клетки с CAR к CD19 совместно культивировали с клетками Дауди, экспрессирующими CD19, или клетками K562, не экспрессирующими CD19. T-клетки с CAR к CD19, активированные с применением растворимых антител, цитолизировали клетки Дауди с применением антиген-специфического механизма, но не клетки K562, так же или лучше чем T-клетки с CAR к CD19, активированные с помощью других способов.

На фигуре 8 показан типичный эксперимент по антиген-специфическому клиренсу опухоли с помощью CAR-T-клеток, произведенных с применением способов, рассмотренных в данном документе. PBMC, активированные с применением растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28, трансдуцировали с помощью лентивируса, экспрессирующего CAR к CD19, из расчета 1-2 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC. T-клетки с CAR к CD19 цитолизировали клетки Дауди, экспрессирующие CD19, но не клетки K562, не экспрессирующие CD19.

На фигуре 9 показано сравнение в виде блок-схемы исследовательской платформы для мелкомасштабного производства T-клеток и платформы увеличенного масштаба для производства лекарственных средств в соответствии с клинической cGMP. Мелкомасштабный способ обеспечил возможность высокопроизводительной оценки CAR-конструкций с гарантией того, что сравнимые данные будут получены на платформе для крупномасштабного производства в соответствии с cGMP.

На фигуре 10 показана блок-схема платформы для производства T-клеток с применением свежесобранных PBMC, пакетов для культивирования клеток и необязательно биореактора WAVE.

На фигуре 11 показана блок-схема платформы для производства T-клеток с применением замороженных PBMC, пакетов для культивирования клеток и необязательно биореактора WAVE.

На фигуре 12 показана блок-схема платформы для производства T-клеток с применением свежесобранных PBMC и биореактора GREX.

На фигуре 13 показан типичный эксперимент, сравнивающий фенотипы произведенных конечных CAR-T-клеточных продуктов из способов мелкомасштабного и крупномасштабного производства. С помощью FACS-анализа в отношении экспрессии маркеров клеточной поверхности CD4, CD8, CAR-конструкций для T-клеток, CD56 и CD62L не идентифицировали каких-либо значительных отличий в фенотипе конечных CAR-T-клеточных продуктов, полученных с помощью различных платформ. p≥ 0,20 для всех поверхностных маркеров при сравнении двух платформ. (n=3).

На фигуре 14 показан клеточный состав PBMC от 18 доноров, которые были получены с применением выделения с FICOLL™ и промывки, проводимой на системе для извлечения аутологичной крови Cell Saver® 5+ (Haemonetics). Полученные популяции клеток анализировали с помощью FACS в отношении CD45⁺ клеток, T-клеток, CD4⁺ T-клеток, CD8⁺ T-клеток, B-клеток, NK-клеток, а также моноцитов и дендритных клеток. Клеточные профили были постоянными у 18 доноров.

На фигуре 15 показано, что при производстве CAR-T-клеток с применением различных способов получали сравнимые конечные клеточные продукты. CAR-T-клетки производили с применением мелкомасштабных (T25 флакон) и крупномасштабных (GREX100, пакеты для стационарного культивирования клеток и биореактор WAVE) устройств. Скорость роста клеток и количество размноженных клеток за 10-дневный период культивирования были сравнимыми для различных способов. (A). С помощью FACS-анализа показано, что количество CD3⁺ клеток было постоянным при разных способах производства. (B). С помощью qPCR показано, что VCN у CD3⁺ клеток было сравнимым для различных протестированных способов производства.

На фигуре 16 показана карта-рисунок нескольких лентивирусных CAR-конструкций. Конструкции варьировали с точки зрения промоторной, scFV, +/- линкерной, шарнирной, трансмембранной областей и доменов передачи сигнала.

На фигуре 17 показаны различные CAR-T-клеточные продукты, для которых показаны (A) сравнимая скорость роста; (B) VCN и (C) экспрессия различных CAR-конструкций на поверхности клетки.

На фигуре 18 показан антиген-специфический клиренс опухоли при помощи Т-клеток, экспрессирующих CAR. (A). Т-клетки, экспрессирующие CAR к BCMA, приводили к цитолизу опухолевых клеток, экспрессирующих BCMA, меченных при помощи сложного сукцинимидилового эфира карбоксифлуоресцеина (CFSE); причем флуоресценцию измеряли при помощи FACS. (B). Т-клетки, экспрессирующие CAR к BCMA, совместно культивировали с клетками K562 или клетками K562, модифицированными для экспрессии BCMA, и супернатанты собирали через 24 часа и анализировали высвобождение IFN-γ при помощи ELISA. (n=3).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

A. Обзор

Существующие способы производства средств адоптивной клеточной терапии являются затруднительными и дорогостоящими и создают труднопреодолимые препятствия для применения ACT в качестве широко распространенного лечения в медицинских учреждениях. Композиции и способы предлагают решение этих и других проблем, связанных с производством терапевтических средств на основе клеток. Настоящее изобретение в целом относится к улучшенным способам производства терапевтических средств на основе Т-клеток. Не желая быть связанным какой-либо конкретной теорией, способы по настоящему изобретению, рассмотренные в данном документе, дают воспроизводимую, надежную и устойчивую к нарушениям платформу для получения ACT по сравнению с существующими композициями на основе T-клеток из уровня техники.

В различных вариантах осуществления предусмотрены способы производства средств адоптивной клеточной терапии, композиции или терапевтические средства на основе иммунных эффекторных клеток, способы для размножения иммунных эффекторных клеток и платформы для производства иммунных эффекторных клеток. В конкретных предпочтительных вариантах осуществления Произведенные композиции на основе клеток, рассмотренные в данном документе, применимы для лечения или предупреждения множества состояний, в том числе без ограничения рака, инфекционного заболевания, аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания и иммунодефицита.

В различных вариантах осуществления способ производства терапевтической композиции, содержащей иммунные эффекторные клетки, включает получение популяции клеток, содержащей иммунные эффекторные клетки, активацию популяции клеток и культивирование популяции клеток для размножения иммунных эффекторных клеток. В конкретных вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки включают Т-клетки и необязательно NK-клетки и/или NKT-клетки.

В различных вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки производят в пакетах для культивирования клеток и/или в биореакторах.

В других различных вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки производят в биореакторах.

В одном варианте осуществления способ производства терапевтической композиции, содержащей Т-клетки, включает сбор клеток от субъекта и выделение популяции клеток с применением процесса в закрытой системе. В конкретных вариантах осуществления клетки можно выделять из любого подходящего свежего или замороженного источника. В определенных вариантах осуществления выделенная популяция клеток содержит мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC). Выделенную популяцию клеток высевают для инициации культур и Т-клетки активируют и стимулируют посредством приведения клеток в контакт с первичными и костимулирующими лигандами. В конкретных вариантах осуществления популяции клеток, содержащие активированные Т-клетки, трансдуцируют с помощью вирусного вектора, чтобы перенаправить трансдуцированные клетки на конкретный целевой антиген. В определенных вариантах осуществления клетки трансдуцируют посредством вирусного вектора, кодирующего CAR или разработанный TCR. Затем трансдуцированные клетки или нетрансдуцированные клетки можно культивировать в ростовой среде для размножения иммунных эффекторных клеток, например, Т-клеток. Произведенные композиции на основе иммунных эффекторных клеток затем можно применять для лечения субъектов, нуждающихся в этом, или замораживать для дальнейшего применения.

Средства адоптивной клеточной терапии, произведенные с применением способов, рассмотренных в данном документе, являются эффективными для получения клеточных лекарственных препаратов с воспроизводимыми уровнями размножения, клеточными профилями, VCN, и которые эффективны в опосредовании антиген-специфического клиренса опухоли. Способы предлагают снижение изменчивости между пациентами при получении средств адоптивной клеточной терапии и являются воспроизводимыми, надежными, масштабируемыми и переносимыми на производственные процессы в соответствии с cGMP. Соответственно, способы и композиции, рассмотренные в данном документе, представляют значительное улучшение по сравнению с существующими средствами адоптивной клеточной иммунотерапии.

При осуществлении настоящего изобретения на практике будут использоваться, если не указано иное, традиционные методы химии, биохимии, органической химии, молекулярной биологии, микробиологии, методики рекомбинантной ДНК, генетики, иммунологии и клеточной биологии, находящиеся в пределах компетенции специалистов в данной области, многие из которых описаны ниже с целью иллюстрации. Такие методики в полном объеме объясняются в литературе. См., например, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, дополнено в июле 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; а также монографии в журналах, таких как Advances in Immunology.

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в данном документе, тем самым включены посредством ссылки во всей своей полноте.

B. Определения

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое общеизвестно обычным специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при осуществлении настоящего изобретения на практике или при его тестировании могут быть использованы любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, предпочтительные варианты осуществления композиций, способов и материалов описаны в данном документе. Для целей настоящего изобретения ниже определены следующие термины.

Формы единственного и множественного числа, используемые в данном документе, обозначают один или несколько (т.е. по меньшей мере один) грамматических объектов предмета. В качестве примера, «элемент» означает один элемент или несколько элементов.

Используемый в данном документе термин «приблизительно» или «примерно» относится к количеству, уровню, значению, числу, частоте, процентной доле, измерению, размеру, величине, весу или длине, которые варьируют вплоть до 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% относительно эталонного количества, уровня, значения, числа, частоты, процентной доли, измерения, размера, величины, веса или длины. В конкретных вариантах осуществления термины «приблизительно» или «примерно», когда употребляются перед числовым значением, указывают на значение плюс или минус диапазон, составляющий 15%, 10%, 5% или 1%.

Используемый в данном документе термин «значительно» относится к количеству, уровню, значению, числу, частоте, процентной доле, измерению, размеру, величине, весу или длине, которые составляют 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более от эталонного количества, уровня, значения, числа, частоты, процентной доли, измерения, размера, величины, веса или длины. В одном варианте осуществления «практически такой же» относится к количеству, уровню, значению, числу, частоте, процентной доле, измерению, размеру, величине, весу или длине, которые оказывают действие, например, физиологическое действие, которое является примерно таким же как у эталонного количества, уровня, значения, числа, частоты, процентной доли, измерения, размера, величины, веса или длины.

На протяжении настоящего описания, если контекст не требует иного, слова «содержат», «содержит» и «содержащий» следует понимать как подразумевающий включение указанной стадии, или элемента, или группы стадий или элементов, но не исключение любой другой стадии, или элемента, или группы стадий или элементов. Под «состоящий из» подразумевают включение и ограничение тем, что следует за фразой «состоящий из». Таким образом, фраза «состоящий из» указывает на то, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, и что никакие другие элементы не могут присутствовать. Под «по существу состоящий из» подразумевают включение любых элементов, перечисленные после данной фразы, и ограничение другими элементами, которые не препятствуют активности или действиям, указанным в настоящем раскрытии в отношении перечисленных элементов, или способствуют им. Таким образом, фраза «по существу состоящий из» указывает на то, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, но другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или отсутствовать в зависимости от того, влияют ли они на активность или действие перечисленных элементов

Ссылка на протяжении настоящего описания на «один вариант осуществления», «вариант осуществления», «конкретный вариант осуществления», «сходный вариант осуществления», «определенный вариант осуществления», «дополнительный вариант осуществления» или «еще один вариант осуществления» или их комбинации означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с данным вариантом осуществления, включены по меньшей мере в один из вариантов осуществления настоящего изобретения. Таким образом, появление всех вышеприведенных фраз в различных местах на протяжении настоящего описания не обязательно относится к одному варианту осуществления. Более того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом в одном или более вариантах осуществления.

Используемые в данном документе термины «производство T-клеток», или «способы производства Т-клеток», или аналогичные термины относятся к процессу получения терапевтической композиции на основе Т-клеток, при этом способы производства могут включать одну или более, или все из следующих стадий, выполняемых один или более раз, в отношении популяции клеток, содержащей Т-клетки, или популяции очищенных Т-клеток: сбор, выделение, промывка, стимуляция, активация, модификация, размножение, криоконсервация и оттаивание, или любая подходящая их комбинация.

Термины «Т-клетка» или «T-лимфоцит» приняты в данной области техники и подразумевают включение тимоцитов, наивных Т-лимфоцитов, незрелых T-лимфоцитов, зрелых T-лимфоцитов, покоящихся T-лимфоцитов или активированных T-лимфоцитов Иллюстративные популяции Т-клеток, пригодные для применения в конкретных вариантах осуществления, включают без ограничения хелперные Т-клетки (HTL; CD4⁺ T-клетка), цитотоксическую Т-клетку (CTL; CD8⁺ T-клетка), CD4⁺CD8⁺ T-клетку, CD4^-CD8^- T-клетку или любую другую субпопуляцию Т-клеток. Другие иллюстративные популяции Т-клеток, пригодные для применения в конкретных вариантах осуществления, включают без ограничения Т-клетки, экспрессирующие один или более следующих маркеров: CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD197 и HLA-DR и, при необходимости, их можно в дальнейшем выделять при помощи методик позитивной или негативной селекции.

Мононуклеарную клетку периферической крови (PBMC) определяют как любую клетку крови с круглым ядром (т.е. лимфоцит, моноцит или макрофаг). Такие клетки крови являются важнейшим компонентом иммунной системы для борьбы с инфекцией и приспособления к вторжениям. Популяция лимфоцитов состоит из CD4+ и CD8+ Т-клеток, B-клеток и естественных клеток-киллеров, CD14+ моноцитов и базофилов/нейтрофилов/эозинофилов/дендритных клеток. Такие клетки зачастую выделяют из цельной крови или из лейкоцитарной массы с применением FICOLL™, гидрофильного полисахарида, который разделяет слои крови, при этом моноциты и лимфоциты образуют лейкоцитарную пленку под слоем плазмы. В одном варианте осуществления «PBMC» относится к популяции клеток, содержащей по меньшей мере Т-клетки и необязательно NK-клетки, а также антиген-презентирующие клетки.

«Антиген-презентирующими клетками» называют гетерогенную группу иммунокомпетентных клеток, которые опосредуют клеточный иммунный ответ посредством процессинга и презентации антигенов T-клеткам. Антиген-презентирующие клетки включают без ограничений макрофаги, дендритные клетки, клетки Лангерганса, B-лимфоциты, тромбоциты или искусственные антиген-презентирующие клетки (aAPC).

aAPC можно получать путем разработки клеток K562, U937, 721.221, T2 и C1R, которые предназначены для стабильной экспрессии и секреции целого ряда костимулирующих молекул и цитокинов. В конкретном варианте осуществления применяют aAPC в виде K32 или U32, предназначенные для выставления одной или более стимулирующих молекул на основе антитела на клеточной поверхности AAPC. Популяции Т-клеток можно размножать при помощи aAPC, экспрессирующих различные костимулирующие молекулы, в том числе без ограничений CD137L (4-1BBL), CD134L (OX40L) и/или CD80 или CD86. Наконец, aAPC обеспечивают эффективную платформу для размножения генетически модифицированных Т-клеток и для поддержания экспрессии CD28 на CD8 Т-клетках. aAPC, предусмотренные в WO 03/057171 и US2003/0147869, включены тем самым посредством ссылки во всей своей полноте.

Используемый в данном документе термин «пролиферация» относится к увеличению деления клеток, как симметричного, так и ассиметричного деления клеток. В конкретных вариантах осуществления «пролиферация» относится к симметричному или ассиметричному делению Т-клеток. «Увеличенную пролиферацию» наблюдают, когда происходит увеличение количества клеток в обработанном образце по сравнению с количеством клеток в необработанном образце.

«Иммунная эффекторная клетка» представляет собой любую клетку иммунной системы, которая характеризуется одной или более эффекторными функциями (например, цитолитической активностью цитотоксической клетки, секрецией цитокинов, индукцией ADCC и/или CDC). Иллюстративные иммунные эффекторные клетки, рассмотренные в данном документе, представляют собой T-лимфоциты, в частности, цитотоксические Т-клетки (CTL; CD8⁺ Т-клетки) и хелперные Т-клетки (HTL; CD4⁺ Т-клетки). Как будет понятно специалисту в данной области, другие клетки также можно использовать в качестве иммунных эффекторных клеток с CAR, описанными в данном документе. В частности, иммунные эффекторные клетки также включают NK-клетки, NKТ-клетки, нейтрофилы и макрофаги. В конкретных вариантах осуществления Т-клетки и один или более других типов клеток, таких как NK-клетки, NKT-клетки, нейтрофилы и/или макрофаги, являются генетически модифицированными и размноженными с применением производственных процессов, рассмотренных в данном документе.

«Модифицированными Т-клетками» называют Т-клетки, которые были модифицированы посредством введения полинуклеотида, кодирующего разработанный TCR или CAR, рассмотренный в данном документе. Модифицированные Т-клетки включают как генетические, так и негенетические модификации (например, эписомные или внехромосомные).

Используемый в данном документе термин «полученный методами генной инженерии» или «генетически модифицированный» относится к добавлению дополнительного генетического материала в форме ДНК или РНК в общий генетический материал клетки.

Термины «генетически модифицированные клетки», «модифицированные клетки» и «перенаправленные клетки» используют взаимозаменяемо.

Используемый в данном документе термин «генная терапия» относится к введению дополнительного генетического материала в форме ДНК или РНК в общий генетический материал клетки, что восстанавливает, корректирует или модифицирует экспрессию гена или служит для экспрессии терапевтического полипептида, например, TCR или CAR, и/или одного или более цитокинов. В конкретных вариантах осуществления Т-клетки модифицируют для экспрессии разработанного TCR или CAR без модификации генома клеток, например, посредством введения эписомного вектора, который экспрессирует TCR или CAR в клетке.

Термин «ex vivo» обычно относится к совершению действий за пределами организма, таким как исследование и измерения, производимым в или на живой ткани в искусственных условиях вне организма, предпочтительно с минимальными отличиями от естественных условий. В конкретных вариантах осуществления в процедурах «ex vivo» задействованы живые клетки или ткани, взятые из организма и культивируемые или модулируемые при помощи лабораторного оборудования, как правило, в стерильных условиях и обычно в течение нескольких часов или до приблизительно 24 часов, но в том числе до 48 или 72 часов, в зависимости от обстоятельств. В определенных вариантах осуществления такие ткани или клетки можно собирать и замораживать, а позднее оттаивать для обработки ex vivo. Эксперименты с культурой ткани или процедуры, длящиеся дольше нескольких дней с применением живых клеток или тканей, как правило, считаются «in vitro», хотя в определенных вариантах осуществления данный термин можно использовать взаимозаменяемо с ex vivo.

Термин «in vivo» относится, как правило, к совершению действий в пределах организма, таким как самообновление клеток и размножение клеток. В одном варианте осуществления термин «размножение in vivo» относится к способности популяции клеток увеличиваться в количестве in vivo.

Термин «стимуляция» относится к первичному ответу, индуцируемому связыванием стимулирующей молекулы (например, комплекса TCR/CD3) с ее когнатным лигандом, с опосредованием тем самым события передачи сигнала, в том числе без ограничений передачи сигнала посредством комплекса TCR/CD3.

«Стимулирующая молекула» относится к молекуле на T-клетке, которая специфически связывается с когнатным стимулирующим лигандом.

Используемый в данном документе «стимулирующий лиганд» означает лиганд, который в случае присутствуя на антиген-презентирующей клетке (например, на aAPC, дендритной клетке, B-клетке и т.п.) может специфически связываться с когнатным партнером по связыванию (называемым в данном документе «стимулирующая молекула») на T-клетке, с опосредованием тем самым первичного ответа T-клетки, в том числе без ограничений активации, инициации иммунного ответа, пролиферации и т.п. Стимулирующие лиганды включают без ограничения лиганды или связывающие агенты CD3, например, антитело к CD3, и лиганды или связывающие агенты CD2, например, антитело к CD2.

Термин «активация» относится к состоянию T-клетки, которую в достаточной степени простимулировали для индукции обнаруживаемой клеточной пролиферации. В конкретных вариантах осуществления активация также может быть ассоциирована с индуцированной выработкой цитокинов и обнаруживаемыми эффекторными функциями. Термин «активированные Т-клетки» относится, помимо прочего, к Т-клеткам, которые пролиферируют. Сигналы, генерируемые посредством только TCR, являются недостаточными для полной активации Т-клетки, и необходимы один или более вторичных или костимулирующих сигналов. Таким образом, активация T-клетки предусматривает первичный стимулирующий сигнал посредством комплекса TCR/CD3 и один или более вторичных костимулирующих сигналов. О костимуляции может свидетельствовать пролиферация и/или выработка цитокинов Т-клетками, которые получили сигнал первичной активации, такой как стимуляция посредством комплекса CD3/TCR и посредством CD2.

«Костимулирующий сигнал» относится к сигналу, который в комбинации с первичным сигналом, таким как связывание с TCR/CD3, приводит к пролиферации T-клеток, выработке цитокинов и/или повышению экспрессии или понижению экспрессии определенных молекул.

«Костимулирующий лиганд» относится к молекуле, которая связывает костимулирующую молекулу. Костимулирующий лиганд может быть растворимым или находиться на поверхности. Костимулирующий лиганд может включать без ограничений CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцируемый костимулирующий лиганд (ICOS-L), молекулу межклеточной адгезии (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, бета-рецептор лимфотоксина, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, агонист или антитело, которые связывают Toll-подобный рецептор, и лиганд, который специфически связывается с B7-H3. Костимулирующий лиганд также охватывает, среди прочего, антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые специфически связываются с костимулирующей молекулой, присутствующей на T-клетке, такой как без ограничений CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, лимфоцитарный функционально-связанный антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 и лиганд, который специфически связывается с CD83.

«Костимулирующая молекула» относится к когнатному партнеру по связыванию на T-клетке, например, CD28, который специфически связывается с костимулирующим лигандом, с опосредованием тем самым костимулирующего ответа T-клетки, в том числе без ограничений пролиферации.

«Аутологичные», как используется в данном документе, относится к клеткам от того же субъекта.

«Аллогенные», как используется в данном документе, относится к клеткам того же вида, которые генетически отличны при сравнении с данной клеткой.

«Сингенные», как используется в данном документе, относится к клеткам другого субъекта, которые генетически идентичны при сравнении с данной клеткой.

«Ксеногенные», как используется в данном документе, относится к клеткам другого вида при сравнении с данной клеткой.

Используемые в данном документе термины «индивидуум» и «субъект» часто используются взаимозаменяемо и относятся к любому животному, у которого обнаружен симптом рака, инфекционного заболевания, иммунодефицита, воспалительного заболевания или аутоиммунного нарушения, который можно подвергать лечению с помощью векторов для генной терапии, терапевтических средств на основе клеток и способов, раскрытых в других частях данного документа. Подходящие субъекты (например, пациенты) включают лабораторных животных (таких как мышь, крыса, кролик или морская свинка), сельскохозяйственных животных и домашних животных или питомцев (таких как кошка или собака). Включены отличные от человека приматы и, предпочтительно, люди. Типичные субъекты включают людей, у которых есть рак, инфекционное заболевание, иммунодефицит, воспалительное заболевание или аутоиммунное нарушение, у которых был диагностирован рак, инфекционное заболевание, иммунодефицит, воспалительное заболевание или аутоиммунное нарушение, или которые подвержены риску развития рака, инфекционного заболевания, иммунодефицита, воспалительного заболевания или аутоиммунного нарушения.

Используемый в данном документе термин «пациент» относится к субъекту, у которого было диагностировано конкретное показание, которое можно лечить с помощью векторов для генной терапии, терапевтических средств на основе клеток и способов, раскрытых в других частях данного документа.

Используемое в данном документе «лечение» или «осуществление лечения» включает любой положительный или необходимый эффект в отношении симптомов или патологических признаков заболевания или патологического состояния, и может включать даже небольшое уменьшение одного или более измеряемых маркеров заболевания или состояния, подлежащего лечению, например, рака. Лечение может необязательно подразумевать либо ослабление или полное прекращение одного или более симптомов заболевания или состояния, либо отсрочку прогрессирования заболевания или состояния. «Лечение» необязательно означает полное устранение или излечение заболевания или состояния, или связанных с ними симптомов.

Используемые в данном описании «предупреждать» и аналогичные слова, такие как «предупрежденный», «предупреждение» и т.д., обозначают подход для предупреждения, ингибирования или снижения вероятности возникновения или рецидива заболевания или состояния, например, рака. Он также относится к отсрочке манифестации или рецидива заболевания или состояния или к отсрочке появления или рецидива симптомов заболевания или состояния. Используемые в данном документе «предупреждение» и аналогичные слова также включают снижение интенсивности, эффекта, симптомов и/или бремени заболевания или состояния до манифестации или рецидива заболевания или состояния.

Используемый в данном описании термин «количество» относится к «количеству, эффективному для» или «эффективному количеству» генетически модифицированной терапевтической клетки, например, Т-клетки, для достижения полезного или требуемого профилактического или терапевтического результата, в том числе клинических результатов.

«Профилактически эффективное количество» относится к количеству генетически модифицированной терапевтической клетки, эффективному для достижения требуемого профилактического результата. Обычно, но не обязательно, поскольку профилактическую дозу применяют у субъектов до появления заболевания или на его ранней стадии, профилактически эффективное количество меньше терапевтически эффективного количества.

«Терапевтически эффективное количество» генетически модифицированной терапевтической клетки может меняться в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, а также от способности Т-клеток вызывать требуемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором любые токсические или вредные эффекты вируса или трансдуцированных терапевтических клеток перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами. Термин «терапевтически эффективное количество» включает количество, которое является эффективным для «лечения» субъекта (например, пациента). Если указано терапевтическое количество, точное количество композиций по настоящему изобретению, которое следует ввести, может определить лечащий врач с учетом индивидуальных различий в возрасте, весе, размере опухоли, степени инфекции или метастазов и состоянии пациента (субъекта).

Используемый в данном документе термин «рак» относится, в целом, к классу заболеваний или состояний, при которых аномальные клетки бесконтрольно делятся и способны инвазировать в близлежащие ткани.

Используемый в данном документе термин «злокачественный» относится к раку, при котором группа опухолевых клеток проявляет одно или более из неконтролируемого роста (т.е. деления сверх пределов нормы), инвазии (т.е. внедрения в прилегающие ткани и их разрушения) и метастазирования (т.е. распространения в другие участки организма посредством лимфы или крови). Используемый в данном документе термин «метастазировать» относится к распространению рака из одной части организма в другую. Опухоль, образованная распространившимися клетками, называется «метастатическая опухоль» или «метастаз». Метастатическая опухоль состоит из клеток, аналогичных клеткам исходной (первичной) опухоли.

Используемый в данном документе термин «доброкачественный» или «незлокачественный» относится к опухолям, которые могут увеличиваться в размере, но не распространяются в другие части организма. Доброкачественные опухоли являются самоограничивающимися и обычно не склонны к инвазии или метастазированию.

«Раковая клетка» или «опухолевая клетка» относится к отдельной клетке раковой опухоли или ткани. Опухолью, в целом, называют вздутие или патологическое изменение, образованное вследствие аномального роста клеток, которое может быть доброкачественным, предраковым или злокачественным. Большинство форм рака образуют опухоли, но некоторые, например, лейкозы, не обязательно образуют опухоли. Для тех форм рака, которые образуют опухоли, термины раковая (клетка) и опухолевая (клетка) используются взаимозаменяемо. Количество опухоли у индивидуума представляет собой «опухолевую нагрузку», которую можно измерить как число, объем или вес опухоли.

«Инфекционное заболевание» относится к заболеванию, которое может передаваться от человека к человеку или от организма к организму, и которое вызывает микробный агент (например, возбудитель инфекции верхних дыхательных путей). Инфекционные заболевания известны из уровня техники и включают, например, гепатит, заболевания, передающиеся половым путем (например, хламидиоз, гонорея), туберкулез, HIV/AIDS, дифтерию, гепатит B, гепатит C, холеру и грипп.

«Аутоиммунное заболевание» относится к заболеванию, при котором в организме развивается иммуногенная реакция (т. е., реакция иммунной системы) в отношении некоторых составляющих его собственной ткани. Другими словами, иммунная система теряет свою способность распознавать какую-то ткань или систему в пределах организма как «свои» и нацеливается и атакует их, как если бы они были чужеродными. Аутоиммунные заболевания можно классифицировать на те, которые воздействуют преимущественно на один орган (например, гемолитическая анемия и аутоиммунный тиреоидит), и на те, при которых патологический процесс аутоиммунного заболевания затрагивает множество тканей (например, системная красная волчанка). Например, рассеянный склероз предположительно вызывают Т-клетки, атакующие оболочки нервных волокон головного мозга и спинного мозга. Это приводит к потере координации, слабости и нечеткости зрения. Аутоиммунные заболевания известны из уровня техники и включают, например, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, волчанку, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, гемолитическую анемию, аутоиммунный тиреоидит, системную красную волчанку, целиакию, болезнь Крона, колит, диабет, склеродермию, псориаз и т.п.

«Иммунодефицит» означает состояние пациента, иммунная система которого была ослаблена вследствие заболевания или вследствие введения химических веществ. Такое состояние создает системный дефицит количества и типов клеток крови, необходимых для защиты от чужеродных веществ. Иммунодефицитные состояния или заболевания известны из уровня техники и включают, например, AIDS (синдром приобретенного иммунодефицита), SCID (тяжелый комбинированный иммунодефицит), изолированную недостаточность IgA-типа, вариабельный неклассифицируемый иммунодефицит, агаммаглобулинемию, сцепленную с Х-хромосомой, хронический гранулематоз, гипер-IgМ-синдром и диабет.

Используемый в данном документе термин «воспалительное заболевание» относится либо к острому, либо к хроническому воспалительному состоянию, которое может возникнуть в результате инфекций или неинфекционных причин. Различные инфекционные причины включают менингит, энцефалит, увеит, колит, туберкулез, дерматит и синдром расстройства дыхания у взрослых. Неинфекционные причины включают травмы (ожоги, порезы, ушибы, размозжения), аутоиммунные заболевания и случаи отторжения органов.

«Усиливать», или «содействовать», или «увеличивать», или «повышать» в целом называют способность композиции, рассмотренной в данном документе, приводить к, способствовать или вызывать более сильную физиологическую реакцию (т.е. последующие эффекты) по сравнению с реакцией, вызванной либо носителем, либо контрольной молекулой/композицией. Измеряемая физиологическая реакция может включать повышение размножения, активации, пролиферации Т-клеток и/или повышение их способности вызывать цитолиз раковых клеток, наряду с прочим, очевидным из понимания в уровне техники и описания в данном документе. «Повышенное» или «увеличенное» количество, как правило, представляет собой «статистически значимое» количество, и может включать повышение, которое в 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 или более раз (например, 500, 1000 раз) (включая все целые числа и десятичные знаки между ними, превышающие 1, например, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 и т.д.) превышает реакцию, обусловленную носителем или контрольной композицией.

«Уменьшать», или «понижать», или «облегчать», или «снижать», или «ослаблять» в целом называют способность композиции, рассмотренной в данном документе, продуцировать, способствовать или вызывать более слабую физиологическую реакцию (т.е. последующие эффекты) по сравнению с реакцией, вызванной либо носителем, либо контрольной молекулой/композицией. «Пониженное» или «уменьшенное» количество, как правило, представляет собой «статистически значимое» количество, и может включать уменьшение, которое в 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 или более раз (например, 500, 1000 раз) (включая все целые числа и десятичные знаки между ними, превышающие 1, например, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 и т.д.) меньше по сравнению с реакцией (эталонной реакцией), обусловленной носителем, контрольной композицией, или реакцией в конкретной клеточной линии.

«Поддерживать», или «сохранять», или «поддержание», или «без изменений», или «без существенных изменений», или «без существенного снижения» в целом называют способность композиции, рассмотренной в данном документе, продуцировать, способствовать или вызывать более слабую физиологическую реакцию (т. е. последующие эффекты) в клетке по сравнению с реакцией, обусловленной либо носителем, либо контрольной молекулой/композицией, или реакцией в конкретной клеточной линии. Соизмеримая реакция представляет собой реакцию, которая существенно не отличается или измеримо отличается от эталонной реакции.

Термины «аффинность специфического связывания», или «специфически связывает», или «специфически связанный», или «специфическое связывание», или «специфически нацеливает», используемые в данном документе, описывают связывание одной молекулы с другой с большей аффинностью связывания, чем фоновое связывание. Связывающий домен (или CAR, содержащий связывающий домен, или белок слияния, содержащий связывающий домен) «специфически связывается» с целевой молекулой, если он связывается или ассоциирует с целевой молекулой с аффинностью или K_a (т.е. равновесной константой ассоциации конкретного взаимодействия связывания в единицах 1/M), например, большей или равной приблизительно 10⁵ M^-1. В определенных вариантах осуществления связывающий домен (или белок слияния на его основе) связывается с мишенью с K_a, большей или равной приблизительно 10⁶ M^-1, 10⁷ M^-1, 10⁸ M^-1, 10⁹ M^-1, 10¹⁰ M^-1, 10¹¹ M^-1, 10¹² M^-1 или 10¹³ M^-1. Связывающими доменами (или одноцепочечными белками слияния на их основе) с «высокой аффинностью» называют связывающие домены с K_a, составляющей по меньшей мере 10⁷ M^-1, по меньшей мере 10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M^-1, по меньшей мере 10¹³ M^-1 или более.

В качестве альтернативы аффинность можно определить как равновесную константу диссоциации (K_d) конкретного взаимодействия связывания в единицах M (например, от 10^-5 M до 10^-13 M или менее). Аффинность полипептидов связывающего домена и CAR-белков согласно настоящему раскрытию можно легко определить с применением традиционных методик, например, с помощью конкурентного ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа), или анализов ассоциации связывания или замещения с применением меченых лигандов, или с применением устройства для поверхностного плазмонного резонанса, такого как Biacore T100, доступного от компании Biacore, Inc., Писктавей, Нью-Джерси, или технологии оптического биосенсора, такой как система EPIC или EnSpire, доступных от компании Corning и Perkin Elmer, соответственно (см. также, например, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; патенты США №№ 5283173; 5468614 или аналогичные).

В одном варианте осуществления аффинность специфического связывания приблизительно в 2 раза превышает аффинность фонового связывания, приблизительно в 5 раз превышает аффинность фонового связывания, приблизительно в 10 раз превышает аффинность фонового связывания, приблизительно в 20 раз превышает аффинность фонового связывания, приблизительно в 50 раз превышает аффинность фонового связывания, приблизительно в 100 раз превышает аффинность фонового связывания или приблизительно в 1000 раз превышает аффинность фонового связывания или больше.

«Антиген (Ag)» относится к соединению, композиции или веществу, которое может стимулировать выработку антител или Т-клеточный ответ у животного, в том числе к композициям (таким как композиция, содержащая опухолеспецифический белок), которые инъецируют животному или поглощаются животным. Антиген реагирует с продуктами специфического гуморального или клеточного иммунитета, в том числе с теми, которые были индуцированы под действием гетерологичных антигенов, таких как раскрытые антигены. «Целевой антиген» или «целевой антиген, представляющий интерес» представляет собой антиген, для связывания которого предназначен связывающий домен CAR или разработанного TCR, рассмотренных в данном документе.

«Эпитоп» или «антигенная детерминанта» относится к области антигена, с которой связывается связывающий агент.

«Выделенный пептид» или «выделенный полипептид» и т.п., используемые в данном документе, относятся к in vitro выделению, синтезу и/или очистке рекомбинантного или синтетического пептида или полипептидной молекулы или не встречающегося в природе пептида или полипептида из клеточного окружения, а также от связи с другими компонентами клетки, т.е. он не является в значительной степени связанным с in vivo веществами.

Используемый в данном документе «выделенный полинуклеотид» относится к in vitro выделению, синтезу и/или очистке рекомбинантного, синтетического или не встречающегося в природе полинуклеотида, например, к выделенной комплементарной ДНК (кДНК) или другому полинуклеотиду, который не существует в природе и который был создан руками человека. В конкретных вариантах осуществления выделенный полинуклеотид относится к рекомбинантному, синтетическому или не встречающему в природе полинуклеотиду, который был очищен от последовательностей, которые фланкируют его во встречающемся в природе состоянии, например, к ДНК-фрагменту, который был освобожден от последовательностей, которые в норме расположены рядом с фрагментом.

Предпочтительно клеточные терапевтические средства, произведенные с применением способов, рассмотренных в данном документе, не содержат эндотоксины и произведены в соответствии практикой cGMP. Используемый в данном документе термин «не содержащий эндотоксинов» относится к сосудам и/или композициям, которые содержат главным образом следовые количества (т.е. количества, которые не оказывают неблагоприятных физиологических эффектов на субъекта) эндотоксинов и предпочтительно не обнаруживаемые количества эндотоксинов. В одном варианте осуществления термин «не содержащий эндотоксинов» относится к композициям, у которых по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% композиции не содержит эндотоксины. Эндотоксины представляют собой токсины, ассоциированные с определенными бактериями, как правило, грамотрицательными бактериями, хотя эндотоксины могут встречаться и в грамположительных бактериях, таких как Listeria monocytogenes. Наиболее распространенными эндотоксинами являются липополисахариды (LPS) или липоолигосахариды (LOS), встречающиеся во внешней мембране различных грамотрицательных бактерий, и которые представляют собой главный патогенный признак в способности этих бактерий вызывать заболевание. Небольшие количества эндотоксина у человека могут вызывать повышение температуры, понижение кровяного давления, а также активацию воспаления и свертывания, среди других нежелательных физиологических эффектов. Поэтому зачастую необходимо удалять большую часть или все следы эндотоксина из контейнеров с лекарственным препаратом, так как даже небольшие количества могут вызывать нежелательные эффекты у человека. Эндотоксины можно удалять из сосудов при помощи способов, известных из уровня техники, например, сосуды можно очищать в снабженном HEPA-фильтром промывочном оборудовании с помощью воды, не содержащей эндотоксины, апирогенизированной при 250°C, и упаковывать в чистых условиях на снабженной HEPA-фильтром рабочей станции, расположенной в чистом помещении с классом чистоты 100/10 (например, чистое помещение с классом чистоты 100, содержит не более 100 частиц, размером больше половины микрона, на кубический фут воздуха).

Используемый в данном документе термин «современная надлежащая производственная практика (cGMP)» относится к контролю и управлению производством, а также к контролю качества пищевых продуктов, фармацевтических препаратов и медицинских устройств. cGMP не обязательно базируется на отборе проб, а вместо этого базируется на документировании каждого аспекта процесса, действий и операций, связанных с производством лекарственных средств и медицинского оборудования. Если документация, отображающая получение и испытание продукта (которая обеспечивает отслеживаемость и, в случае возникновения проблем в будущем, отзыв товара с рынка), не является правильной и не оформлена надлежащим образом, тогда продукт не соответствует требуемым техническим условиям и, считается, что он загрязнен (т.е. является некачественным согласно законодательству США). Кроме того, cGMP, как правило, требует, чтобы все оборудование для производства и испытаний было квалифицировано как подходящее для применения, и чтобы все операционные методики и процедуры (например, производство, очистка и аналитическое тестирование), используемые в производственном процессе получения лекарственного средства, были валидированы в соответствии с предварительно заданными техническими условиями, чтобы продемонстрировать, что они могут выполнять свою подразумеваемую функцию(и). В США фраза «современная надлежащая производственная практика» представлена в разделе 501(B) Закона о пищевых продуктах, медикаментах и косметике, принятого в 1938 году (§ 351 раздела 21 Свода федеральных законов США).

C. Способы производства Т-клеток

Существующие в настоящее время способы производства T-клеток включают различные сложные стадии для выделения, активации, трансдукции и размножения CAR-T-клеток. В отличие от этого авторы настоящего изобретения использовали мелкомасштабную исследовательскую модель для разработки простой, надежной, хорошо охарактеризованной, гибкой платформы для производства T-клеток в закрытой системе, которая была преобразована в крупномасштабный производственный процесс в соответствии с клинической cGMP для получения T-клеток с разработанным CAR.

В различных вариантах осуществления клетки производят с помощью закрытой системы обработки или в комбинации с закрытой системой обработки клеток. В закрытых системах обработки клеток автоматизированы процессы, включающие обработку, центрифугирование, инкубацию, добавление среды, селекцию клеток, промывку клеток, а также конечное заполнение и последующие операции внутри «закрытых» или герметизируемых сосудов. Закрытые системы обработки клеток интегрируют и автоматизируют процессы и воспроизводят множество ручных работ с контролем качества для обеспечения постоянного и независимого от оператора качества.

Преимущества, связанные с автоматизированной закрытой системой обработки клеток, будут включать значительное снижение стоимости средств терапии (обычно на 25-90%) и количества требуемых операторов (обычно на >70%); уменьшенную зависимость от квалифицированной рабочей силы; значительную экономию капиталовложений за счет лучшего использования оборудования (обычно на 30-50%); улучшенное качество и меньшее количество нарушений качества и возможность более быстрого вертикального и горизонтального масштабирования, чтобы соответствовать требованиям рынка.

В различных вариантах осуществления способ производства терапевтических композиций на основе T-клеток включает получение популяции клеток, содержащей иммунные эффекторные клетки и антиген-презентирующие клетки, с применением процесса в закрытой системе. В определенных вариантах осуществления выделенную популяцию клеток высевают при определенной плотности для инициации культур, и Т-клетки активируют и стимулируют посредством приведения клеток в контакт с первичными и костимулирующими лигандами. В конкретных вариантах осуществления популяции клеток, содержащие активированные Т-клетки, трансдуцируют с помощью вирусного вектора, кодирующего CAR или разработанный TCR, и культивируют для размножения Т-клеток. Произведенные композиции на основе иммунных эффекторных клеток, содержащие терапевтические Т-клетки, затем можно применять для лечения субъектов, нуждающихся в этом, или замораживать для дальнейшего применения.

1. Источник Т-клеток

В конкретных вариантах осуществления Т-клетки можно получать из целого ряда источников, в том числе без ограничений из периферической крови, мононуклеарных клеток периферической крови, костного мозга, ткани лимфатического узла, пуповинной крови, ткани тимуса, ткани из очага инфекции, асцитов, плеврального выпота, ткани селезенки и опухолей. В одном варианте осуществления Т-клетки можно также получать из культивируемой линии Т-клеток, например, Jurkat, SupT1 и т.д. В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток, содержащую Т-клетки, например PBMC, применяют в способах производства, рассмотренных в данном документе. В других вариантах осуществления в способах производства, рассмотренных в данном документе, применяют выделенную или очищенную популяцию Т-клеток.

В одном варианте осуществления источники Т-клеток также можно получать коммерчески, например, от Sanguine Biosciences.

2. Сбор клеток

В настоящем изобретении рассматривается производство улучшенных композиций на основе Т-клеток. Клетки могут быть аутологичными/аутогенными («своими») или неаутологичными («не своими», например, аллогенными, сингенными или ксеногенными). В одном варианте осуществления клетки получают из субъекта-млекопитающего. В другом варианте осуществления клетки получают из субъекта-примата. В конкретном варианте осуществления клетки получают из субъекта-человека.

В различных вариантах осуществления популяции клеток, содержащие Т-клетки, получают из индивидуума и подвергают способам производства, рассмотренным в данном документе. В одном варианте осуществления клетки из циркулирующей крови индивидуума получают посредством способа афереза, например, лейкафереза. Продукт афереза может содержать лимфоциты, в том числе Т-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие ядерные белые кровяные клетки, красные кровяные клетки и тромбоциты, или может быть продуктом лейкафереза, содержащим лимфоциты, в том числе Т-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки и другие ядерные белые кровяные клетки. В одном варианте осуществления клетки, собранные посредством афереза, можно промывать для удаления фракции плазмы и для помещения клеток в подходящий буфер или среду для последующей обработки. Клетки можно промывать при помощи PBS или другого подходящего раствора, не содержащего кальций, магний и большинство, если не все прочие, двухвалентных катионов.

После получения популяции клеток, содержащей Т-клетки, можно проводить подсчет клеток и определять жизнеспособность клеток в пределах популяции клеток, популяцию или ее части можно криоконсервировать для будущего применения или анализов, и клетки в популяции, например, PBMC, можно анализировать с применением целого ряда панелей клеточных маркеров, например, CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD28, CD45RA, CD45RO, CD61, CD62L, CD66b, CD127 и HLA-DR.

В конкретных вариантах осуществления объем клеток, полученных посредством афереза, применяемых в способах производства, рассмотренных в данном документе, составляет от приблизительно 50 мл до приблизительно 500 мл, от приблизительно 50 мл до приблизительно 250 мл, от приблизительно 50 мл до приблизительно 200 мл, от приблизительно 100 мл до приблизительно 500 мл, от приблизительно 100 мл до приблизительно 250 мл или от приблизительно 100 мл до приблизительно 200 мл или любое промежуточное значение из вышеуказанных.

В определенных вариантах осуществления объем клеток, полученных посредством афереза, применяемых в способах производства, рассмотренных в данном документе, составляет приблизительно 25 мл, приблизительно 50 мл, приблизительно 75 мл, приблизительно 100 мл, приблизительно 125 мл, приблизительно 150 мл, приблизительно 175 мл, приблизительно 200 мл, приблизительно 225 мл, приблизительно 250 мл, приблизительно 275 мл, приблизительно 300 мл, приблизительно 325 мл, приблизительно 350 мл, приблизительно 375 мл, приблизительно 400 мл, приблизительно 425 мл, приблизительно 450 мл, приблизительно 475 мл или приблизительно 500 мл или любое промежуточное значение объема из вышеуказанных.

3. Выделение PBMC

В конкретных вариантах осуществления популяцию PBMC применяют в способах производства T-клеток, рассмотренных в данном документе. В определенных вариантах осуществления PBMC, содержащие Т-клетки, можно получать из дозы крови или фракции, полученной посредством афереза, собранной у субъекта с применением любой из целого ряда методик, известных специалисту в данной области, например, с помощью центрифугирования и осаждения, например, разделения с помощью FICOLL™, разделения с помощью PERCOLL™ и т.д.

В определенных вариантах осуществления PBMC, собранные посредством афереза, выделяют при помощи градиента FICOLL™ или PERCOLL™ с применением полуавтоматической проточной центрифуги, например, Cobe 2991 Cell Processor, Cell Saver 5 и т.п. В некоторых вариантах осуществления PBMC, собранные посредством афереза, выделяют без применения градиента FICOLL™ или PERCOLL™ при помощи устройства для противоточного элютриационного центрифугирования, например, Terumo BCT ELUTRA® и т.п. Применение Cell Saver 5 обеспечивает обработку исходного материала PBMC в закрытой системе при помощи Ficoll, а также конечное концентрирование и промывку произведенных композиций на основе T-клеток на одном устройстве. Использование закрытой системы упрощает производство за счет сведения к минимуму оборудования, необходимого для обработки в соответствии с cGMP, и дает постоянные и воспроизводимо чистые PBMC или конечные композиции на основе Т-клеток.

В одном варианте осуществления PBMC выделяют с применением устройства для противоточного элютриационного центрифугирования ELUTRA® и промывают в Cell Saver 5+ или LOVO.

В некоторых вариантах осуществления после выделения PBMC как цитотоксические, так и хелперные Т-лимфоциты можно сортировать на субпопуляции наивных Т-клеток, Т-клеток памяти и эффекторных Т-клеток либо перед, либо после активации, размножения и/или генетической модификации с применением устройства с закрытой системой и реагентов в соответствии с cGMP, например, CliniMACS.

После выделения можно выполнять подсчет клеток PBMC и определять их жизнеспособность, PBMC или их часть можно криоконсервировать для будущего применения или анализов и PBMC можно анализировать с применением целого ряда панелей клеточных маркеров, например, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD45RA, CD45RO, CD61 и CD66b.

В конкретных вариантах осуществления после выделения PBMC, их подвергают одной или более стадиям промывки, например, для удаления Ficoll. В определенных вариантах осуществления клетки можно промывать один или более раз перед, в ходе или после любого количества стадий производства, рассмотренных в данном документе. Промывку можно выполнять с помощью любого подходящего буфера или среды для культивирования, например, буфера CliniMACS, дополненного HABS или HSA, PlasmaLyte,TCGM, PBS, раствора Рингера, физиологического раствора, 0,9% NaCl или другого подходящего раствора, не содержащего кальций, магний и большинство, если не все прочие, двухвалентных катионов, или любой подходящей среды для культивирования, или любой их подходящей комбинации. В одном варианте осуществления после выделения PBMC их промывают с помощью полуавтоматической проточной центрифуги, например, Cobe 2991 Cell Processor, Cell Saver 5, Baxter CytoMate, LOVO и т.п. В другом варианте осуществления после выделения PBMC их переносят в другой стерильный сосуд, например, в сосуд для транспортировки или сосуд для культивирования. Используемый в данном документе термин «сосуд» относится, в целом, к любому контейнеру, который можно использовать для целей культивирования, обработки, манипулирования, хранения, анализа, инкубирования, введения и иного получения культуры, поддержания, роста, сбора, обработки и применения клеток и их побочных продуктов ex vivo или in vitro, или, иначе, для целого ряда целей, излагаемых и рассматриваемых в данном документе.

«Сосудами для транспортировки» в целом называют сосуды, которые не являются проницаемыми для газов. В одном варианте осуществления промывку выполняют в сосудах для транспортировки, а последующие манипуляции с клетками выполняют в одном или более типах сосудов для культивирования клеток.

Иллюстративные примеры сосудов для культивирования клеток включают без ограничения пакеты для культивирования клеток, биореакторы (например, биореактор в виде газопроницаемого флакона для быстрого размножения (G-Rex), производства Wilson-Wolf; биореакторы WAVE от GE Healthcare Life Sciences), устройства для культивирования клеток и тканей, мешки, капсулы, флаконы для культивирования, аппараты, клеточные фабрики, контейнеры, пробирки для культивирования (например, микроцентрифужные пробирки, EPPENDORF TUBES®, конические пробирки FALCON® и т.д.), чашки для культивирования (например, чашки Петри), колбы для культивирования, флаконы с перемешиванием, роллерные флаконы, многолуночные планшеты (например, 2-луночные, 4-луночные, 6-луночные, 12-луночные, 24-луночные, 48-луночные, 96-луночные и 384-луночные планшеты), микроинкубаторы, микроносители, микропланшеты, предметные стекла и предметные стекла с лунками.

В других вариантах осуществления PBMC можно промывать один или более раз в полуавтоматической проточной центрифуге и переносить и промывать один или более раз в подходящем сосуде.

Иллюстративные примеры пакетов для культивирования включают без ограничения GMP-пакеты для размножения клеток MACS®, GMP-пакеты для дифференцировки клеток MACS®, биоконтейнеры для размножения клеток EXP-Pak™, пакеты VueLife™, пакеты KryoSure™, пакеты KryoVue™, пакеты Lifecell®, пакеты PermaLife™, пакеты X-Fold™, пакеты Si-Culture™, биомедицинские криопакеты Origen и пакеты VectraCell™. В конкретных вариантах осуществления пакеты для культивирования клеток обладают одной или более из следующих характеристик: газопроницаемость (материалы имеют подходящие уровни переноса газов: кислорода, двуокиси углерода и азота); ничтожно малые уровни потери воды (материалы практически непроницаемы для воды); химическая и биологическая инертность (материалы не вступают в реакцию с содержимым сосуда) и сохранение гибкости и прочности при различных условиях (материалы обеспечивают сосуду возможность выдерживать микроволновое облучение, обработку УФ-облучением, центрифугирование или применение в широком диапазоне температур, например, от -100°C до +100°C).

Примеры объемов сосудов для культивирования клеток, рассмотренных в данном документе, включают без ограничения объемы приблизительно 10 мл, приблизительно 25 мл, приблизительно 50 мл, приблизительно 75 мл, приблизительно 100 мл, приблизительно 150 мл, приблизительно 250 мл, приблизительно 500 мл, приблизительно 750 мл, приблизительно 1000 мл, приблизительно 1250 мл, приблизительно 1500 мл, приблизительно 1750 мл, приблизительно 2000 мл или более, в том числе любой промежуточный объем. Например, промежуточные объемы между 10 мл и 25 мл включают 11 мл, 12 мл, 13 мл, 14 мл, 15 мл, 16 мл, 17 мл, 18 мл, 19 мл, 20 мл, 21 мл, 22 мл, 23 мл и 24 мл. В одном варианте осуществления объем сосуда для культивирования составляет от приблизительно 100 мл до приблизительно 10 л.

После промывки выделенных клеток можно осуществлять подсчет клеток и определение их жизнеспособности после промывки, клетки можно криоконсервировать для будущего применения или анализов и/или их можно анализировать посредством анализа с сортировкой флуоресцентно-активированных клеток (FACS) с применением широкого спектра клеточных маркеров, например, CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD197, CD279 и HLA-DR.

4. Криоконсервация

В конкретных вариантах осуществления способы производства T-клеток, рассмотренные в данном документе, осуществляют на практике с применением свежевыделенных популяций клеток, содержащих Т-клетки. В других конкретных вариантах осуществления способы, рассмотренные в данном документе, осуществляют на практике с применением криоконсервированных популяций клеток, содержащих Т-клетки. Клетки можно криоконсервировать после сбора или выделения PBMC, после инициирования культуры и активации, после трансдукции или после размножения, или после любой стадии процесса. Произведенные композиции на основе T-клеток можно также криоконсервировать после производственного процесса получения T-клеток. Цикл замораживания-оттаивания может обеспечить более однородную композицию на основе T-клеток посредством удаления популяций, не относящихся к Т-клеткам.

Популяции клеток можно криоконсервировать в подходящем сосуде для культивирования клеток, рассматриваемом в данном документе, см. выше, в разделе Выделение PBMC и в других частях данного документа. Популяции клеток можно замораживать в подходящей среде для культивирования клеток и/или среде для замораживания, например, 50% Plasmalyte и 50% Cryostor 10; 50/40/10 (XVIVO/HABS/DMSO); Cryostor 10; PBS, содержащем 20% DMSO и 8% человеческого сывороточного альбумина, или среде для культивирования, содержащей 10% декстрана 40 и 5% декстрозы, 20% человеческого сывороточного альбумина и 7,5% DMSO, или 31,25% Plasmalyte-A, 31,25% декстрозы 5%, 0,45% NaCl, 10% декстрана 40 и 5% декстрозы, 20% человеческого сывороточного альбумина и 7,5% DMSO, или другой подходящей среде для замораживания клеток, содержащей, например, Hespan и PlasmaLyte A. Затем клетки замораживают при температуре от приблизительно -80°C до приблизительно -135°C при скорости, составляющей 1° в минуту, с помощью программируемого аппарата для криозамораживания и хранят в резервуаре в газообразной фазе жидкого азота. Можно применять другие иллюстративные способы программируемого замораживания, а также неконтролируемое замораживание сразу при -20°C или в жидком азоте.

После криоконсервации клетки оттаивают на водяной бане при 37°C и промывают в подходящей среде для культивирования клеток или буфере, например, TCGM. Клетки после оттаивания можно применять в дальнейшем либо в способах производства, рассмотренных в данном документе, либо для введения субъекту. Стадии промывки можно осуществлять способами, рассматриваемыми в других частях данного документа.

В определенных вариантах осуществления популяции клеток, содержащие Т-клетки, выделяют из индивидуума и активируют и стимулируют для пролиферации in vitro без дополнительных манипуляций ex vivo или in vitro. Такие клетки затем можно напрямую повторно вводить индивидууму. В дополнительных вариантах осуществления после выделения популяции клеток, содержащей Т-клетки, клетки сначала активируют и стимулируют для пролиферации in vitro перед тем, как подвергнуть их генетической модификации для экспрессии разработанного TCR или CAR. В связи с этим Т-клетки можно культивировать до и/или после того как их подвергают генетической модификации (т.е. трансдуцируют или трансфицируют для экспрессии разработанного TCR или CAR, рассмотренного в данном документе).

5. Инициирование культуры и активация

Для достижения достаточных терапевтических доз композиций на основе T-клеток в существующих способах производства T-клеток зачастую проводятся один или более циклов стимуляции, активации и/или размножения, тем самым создается больше возможностей для контаминации, возрастают затраты и время производственного процесса, и это обычно приводит к низкокачественному продукту для клеточной терапии.

Способы производства T-клеток, рассмотренные в данном документе, предусматривают простые и надежные стадии инициирования культуры и активации, которые способствуют тому, что полученная композиция на основе T-клеток представляет собой терапевтический продукт превосходного качества. В одном варианте осуществления инициирование культуры и активация предусматривают высевание популяций клеток в сосуд для культивирования клеток, например, пакет для культивирования клеток, биореактор GREX, биореактор WAVE и т.д., и активацию T-клеток через T-клеточные пути передачи первичного и костимулирующего сигнала. Далее клеточные композиции можно культивировать в присутствии одного или более дополнительные факторов роста или цитокинов, например, IL-2, IL7 и/или IL-15, или любой их подходящей комбинации.

В конкретных вариантах осуществления инициирование культуры включает высевание популяции клеток, содержащей T-клетки, например PBMC, в сосуд для культивирования клеток при необходимой плотности, например 1-5 x 10⁶ клеток/мл, в подходящую среду для культивирования клеток, содержащую один или более цитокинов, первичных стимулирующих лигандов и костимулирующих лигандов. В другом варианте осуществления цитокины, стимулирующие и костимулирующие лиганды можно затем добавлять к PBMC в среду для культивирования клеток.

В одном варианте осуществления сосуд для культивирования клеток представляет собой пакет для культивирования клеток, в том числе без ограничений GMP-пакеты для размножения клеток MACS®, GMP-пакеты для дифференциации клеток MACS®, биоконтейнеры для размножения клеток EXP-Pak™, пакеты VueLife™, пакеты KryoSure™, пакеты KryoVue™, пакеты Lifecell®, пакеты PermaLife™, пакеты X-Fold™, пакеты Si-Culture™ и пакеты VectraCell™, рассматриваемые в других частях данного документа.

В конкретных вариантах осуществления в сосуд для культивирования клеток высевают общее количество, составляющее приблизительно 1 x 10⁹ клеток, приблизительно 5 x 10⁸ клеток, приблизительно 1 x 10⁸ клеток, приблизительно 5 x 10⁷ клеток, приблизительно 1 x 10⁷ клеток, приблизительно 5 x 10⁶ клеток или приблизительно 1 x 10⁶ клеток, или любое другое промежуточное количество клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки представляют собой PBMC и их высевают при общем количестве, составляющем приблизительно 1 x 10⁸ клеток.

В определенных вариантах осуществления популяции клеток, например PBMC, высевают в сосуд для культивирования клеток при плотности, составляющей приблизительно 1 x 10⁷ клеток/мл, приблизительно 9 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 8 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 7 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 6 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 5 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 4 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 3 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 2 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 1 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 9 x 10⁵ клеток/мл, приблизительно 8 x 10⁵ клеток/мл, приблизительно 7 x 10⁵ клеток/мл, приблизительно 6 x 10⁵ клеток/мл, приблизительно 5 x 10⁵ клеток/мл, приблизительно 4 x 10⁵ клеток/мл, приблизительно 3 x 10⁵ клеток/мл, приблизительно 2 x 10⁵ клеток/мл или приблизительно 1 x 10⁵ клеток/мл, или любой промежуточной плотности клеток. В конкретных вариантах осуществления PBMC высевают при плотности, составляющей приблизительно 1 x 10⁶ клеток/мл.

В конкретных вариантах осуществления клетки высевают в сосуд для культивирования клеток, содержащий подходящую среду для культивирования клеток. Иллюстративные примеры подходящих сред для культивирования клеток включают без ограничений ростовую среду для T-клеток (TCGM; X-VIVO™15, дополненную 2 мМ GlutaMAX™-I, 10 мМ HEPES и 5% человеческой AB-сыворотки), SFM для размножения T-клеток CTS™ OpTmizer™ (Life Technologies), среду CTS™ AIM V® (Life Technologies), RPMI 1640, среду Клика, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 (Lonza), бессывороточную среду CellGro® (CellGenix) и X-Vivo 20 (Lonza) с добавленными аминокислотами, пируватом натрия и витаминами, либо бессывороточные, либо дополненные соответствующим количеством сыворотки (или плазмы) или определенным набором гормонов, и/или количеством цитокина(-ов), достаточным для роста и размножения T-клеток. В конкретном варианте осуществления среда для культивирования клеток представляет собой TCGM.

Среды для культивирования клеток, рассмотренные в данном документе, могут дополнительно содержать один или более факторов, в том числе без ограничений сыворотку (например, фетальную бычью или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ и TNF-α.

В одном варианте осуществления среда для культивирования клеток может содержать один или более цитокинов, например, таких как IL-2, IL-7 и/или IL-15, или любую их подходящую комбинацию. Иллюстративные примеры подходящих концентраций каждого цитокина или общей концентрации цитокинов включают приблизительно 25 МЕ/мл, приблизительно 50 МЕ/мл, приблизительно 75 МЕ/мл, приблизительно 100 МЕ/мл, приблизительно 125 МЕ/мл, приблизительно 150 МЕ/мл, приблизительно 175 МЕ/мл, приблизительно 200 МЕ/мл, приблизительно 250 МЕ/мл, приблизительно 300 МЕ/мл, приблизительно 350 МЕ/мл, приблизительно 400 МЕ/мл, приблизительно 450 МЕ/мл или приблизительно 500 МЕ/мл, или любое промежуточное количество цитокинов из вышеуказанных. В конкретных вариантах осуществления среда для культивирования клеток содержит приблизительно 100 МЕ/мл каждого из IL-2, IL-1 и/или IL-15, или их общего количества, или любой их комбинации.

В конкретных вариантах осуществления среда для культивирования клеток содержит приблизительно 250 МЕ/мл каждого из IL-2, IL-1 и/или IL-15, или их общего количества, или любой их комбинации.

В конкретных вариантах осуществления PBMC или выделенные T-клетки приводят в контакт с одним или более стимулирующими средствами и костимулирующими средствами, такими как антитело к CD3 и антитело к CD28, и одним или более цитокинами, такими как IL-2, IL-7 и/или IL-15.

Активацию T-клеток можно осуществлять путем обеспечения первичного стимулирующего сигнала через T-клеточный комплекс TCR/CD3 или путем стимуляции поверхностного белка CD2 и путем обеспечения вторичного костимулирующего сигнала через вспомогательную молекулу, например, CD28 или 4-1BBL.

Комплекс TCR/CD3 можно стимулировать путем приведения T-клетки в контакт с подходящим CD3-связывающим средством, например, лигандом CD3 или моноклональным антителом к CD3. Иллюстративные примеры антител к CD3 включают без ограничений OKT3, G19-4, BC3 и 64.1. Также можно использовать другие антитела, которые связываются с теми же эпитопами, что и любое из вышеописанных антител. Дополнительные антитела или комбинации антител можно подготовить и идентифицировать с помощью стандартных методик, раскрываемых в других частях данного документа. В одном варианте осуществления антитело к CD3 представляет собой OKT3.

В другом варианте осуществления можно использовать CD2-связывающее средство для обеспечения первичного стимулирующего сигнала для T-клеток. Иллюстративные примеры CD2-связывающих средств включают без ограничений лиганды CD2 и антитела к CD2, например, антитело T11.3 в комбинации с антителом T11.1 или T11.2 (Meuer, S. C. et al. (1984) Cell 36:897-906) и антитело 9.6 (которое распознает тот же эпитоп, что и TI 1.1) в комбинации с антителом 9-1 (Yang, S. Y. et al. (1986) J. Immunol. 137:1097-1100).

В дополнение к первичному стимулирующему сигналу, обеспечиваемому через комплекс TCR/CD3 или посредством CD2, для индукции T-клеточных ответов требуется вторичный, костимулирующий сигнал. В конкретных вариантах осуществления для обеспечения костимулирующего сигнала можно использовать CD28-связывающий агент. Подходящие костимулирующие лиганды включают без ограничений CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L 1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцируемый костимулирующий лиганд (ICOS-L), молекулу межклеточной адгезии (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, бета-рецептор лимфотоксина, ILT3, ILT4, агонист или антитело, которые связывают Toll-подобный рецептор, и лиганд, который специфически связывается с B7-H3.

В конкретном варианте костимулирующий лиганд включает антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые специфически связываются с костимулирующей молекулой, присутствующей на T-клетке, в том числе без ограничений CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, 1COS, лимфоцитарным функциональным антигеном-1 (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, и лиганд, который специфически связывается с CD83.

Иллюстративные примеры CD28-связывающих средств включают без ограничений: природные лиганды CD 28, например, природный лиганд для CD28 (например, представитель семейства белков B7, такой как B7-1(CD80) и B7-2 (CD86); и моноклональное антитело к CD28 или его фрагмент, способные к перекрестной реакции с молекулой CD28, например, моноклональные антитела 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2 и EX5.3D10. В одном варианте осуществления антитело к CD28 представляет собой 15E8.

В одном варианте осуществления молекула, обеспечивающая первичный стимулирующий сигнал, например, молекула, которая обеспечивает стимуляцию через комплекс TCR/CD3 и CD2, и костимулирующая молекула присоединены к одной и той же поверхности.

В определенных вариантах осуществления связывающие средства, которые обеспечивают стимулирующий и костимулирующий сигналы, локализованы на поверхности клетки. Это можно осуществить посредством трансфекции или трансдукции клетки с помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающее средство, в форме, подходящей для их экспрессии на клеточной поверхности, или в качестве альтернативы посредством присоединения связывающего средства к клеточной поверхности.

В другом варианте осуществления молекула, обеспечивающая первичный стимулирующий сигнал, например, молекула, которая обеспечивает стимуляцию через комплекс TCR/CD3 и CD2, и костимулирующая молекула представлены на антиген-презентирующих клетках.

В одном варианте осуществления молекула, обеспечивающая первичный стимулирующий сигнал, например, молекула, которая обеспечивает стимуляцию через комплекс TCR/CD3 и CD2, и костимулирующая молекула находятся на отдельных поверхностях.

В определенном варианте осуществления одно из связывающих средств, которые обеспечивают стимулирующий и костимулирующий сигналы, является растворимым (обеспечивается в виде раствора), а другое средство(а) находится на одной или более поверхностях.

В конкретном варианте осуществления оба связывающие средства, которые обеспечивают стимулирующий и костимулирующий сигналы, находятся в растворимой форме (обеспечивается в виде раствора).

В различных вариантах осуществления способы производства T-клеток, рассмотренные в данном документе, включают активацию T-клеток путем приведения T-клеток в контакт с растворимыми антителом к CD3 и антителом к CD28.

В конкретных вариантах осуществления среда для культивирования клеток, используемая для активации T-клеток, содержит концентрацию антитела к CD3 или CD3-связывающего средства, составляющую приблизительно 10 нг/мл, приблизительно 20 нг/мл, приблизительно 30 нг/мл, приблизительно 40 нг/мл, приблизительно 50 нг/мл, приблизительно 60 нг/мл, приблизительно 70 нг/мл, приблизительно 80 нг/мл, приблизительно 90 нг/мл, приблизительно 100 нг/мл или приблизительно 200 нг/мл, или любую промежуточную концентрацию.

В определенных вариантах осуществления среда для культивирования клеток, используемая для активации T-клеток, содержит концентрацию антитела к CD28 или CD28-связывающего средства, составляющую приблизительно 10 нг/мл, приблизительно 20 нг/мл, приблизительно 30 нг/мл, приблизительно 40 нг/мл, приблизительно 50 нг/мл, приблизительно 60 нг/мл, приблизительно 70 нг/мл, приблизительно 80 нг/мл, приблизительно 90 нг/мл, приблизительно 100 нг/мл или приблизительно 200 нг/мл, или любую промежуточную концентрацию.

В различных вариантах осуществления среда для культивирования клеток, используемая для активации T-клеток, содержит приблизительно 50 нг/мл антитела к CD3 и 50 нг/мл антитела к CD28.

Популяции клеток, высеянные в сосуд для культивирования клеток, активируют в течение по меньшей мере 30 минут, по меньшей мере 1 часа, по меньшей мере 2 часов, по меньшей мере 3 часов, по меньшей мере 4 часов, по меньшей мере 5 часов, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 7 часов, по меньшей мере 9 часов, по меньшей мере 10 часов, по меньшей мере 11 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 13 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 17 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 19 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 21 часов, по меньшей мере 22 часов, по меньшей мере 23 часов или по меньшей мере 24 часов, или любого промежуточного периода времени.

В определенных вариантах осуществления клетки собирают, выделяют и промывают, проводят инициирование клеточных культур и активацию T-клеток всего в пределах периода, составляющего от приблизительно 18 часов до приблизительно 36 часов, или в пределах периода, составляющего приблизительно 24 часа, или любого промежуточного периода времени.

6. Трансдукция

Способы производства T-клеток, рассмотренные в данном документе, включают модификацию иммунных эффекторных клеток и/или T-клеток для экспрессии разработанного T-клеточного рецептора (TCR) или химерного антигенного рецептора (CAR). В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток, содержащую T-клетки, активируют, модифицируют для экспрессии разработанного TCR или CAR и затем культивируют для размножения. Эти стадии можно проводить в одном сосуде для культивирования клеток или в различных сосудах. «Трансдукция» относится к доставке гена(ов) или другой полинуклеотидной последовательности, например, разработанного TCR или CAR, в иммунные эффекторные клетки, в том числе T-клетки, с применением ретровирусного или лентивирусного вектора посредством инфицирования вирусом. В одном варианте осуществления ретровирусные векторы трансдуцируют в клетку посредством инфекции и интеграции провируса. В определенных вариантах осуществления целевая клетка, например, PBMC или Т-клетка, является «трансдуцированной», если она содержит ген или другую полинуклеотидную последовательность, доставленную в клетку посредством инфекции с помощью вирусного или ретровирусного вектора. В конкретных вариантах осуществления трансдуцированная клетка содержит один или более генов или других полинуклеотидных последовательностей, доставленных в клеточный геном с помощью ретровирусного или лентивирусного вектора.

Продукцию инфекционных вирусных частиц и исходных растворов вируса можно осуществлять с применением традиционных методик. Способы получения исходных растворов вируса известны из уровня техники и проиллюстрированы, например, в Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, и N. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113. С помощью известных методик можно получать рекомбинантные вирусы с титрами, составляющими несколько миллионов единиц трансдукции на миллилитр (TU/мл). После ультрацентрифугирования можно получать концентрированные исходные растворы с титром, составляющим приблизительно 10⁸ TU/мл, 10⁹ TU/мл, 10¹⁰ TU/мл, 10¹¹ TU/мл или 10¹² TU/мл, или любым промежуточным титром.

Вирусы можно доставлять согласно вирусному титру (TU/мл), который можно измерять, например, с применением коммерчески доступного анализа титра p24, который представляет собой ELISA в отношении белка вирусной оболочки p24. Следующую формулу можно применять для расчета концентрации p24 (пг/мл): приблизительно 2000 молекул p24 приходится на физическую частицу (PP) лентивируса: (2 x 10³) x (24 x 10³ Да p24 на PP), 48 x 10⁶/число Авогадро = (48 x 10⁶) I (6 x 10²³) = 8 x 10^-17г p24 на PP, приблизительно 1 PP на 1 x 10^-16 г p24, 1 x 10⁴ PP на пг p24. Сравнительно хорошо упакованный, псевдотипированный VSV-G лентивирусный вектор будет иметь индекс инфекционности в диапазоне от 1 TU на 1000 физических частиц (PP) до 1 TU на 100 PP (или менее). Таким образом, диапазон составляет от приблизительно 10 до 100 TU/пг p24. Посредством данного преобразования получают концентрацию в TU/мл.

Инфекционные титры также можно определять с применением анализа трансдуцированных клеток остеосаркомы человека (HOS) (Kutner et al., 2009, Nature Protocols 4: 495-505). Кратко, трансдуцированные клетки HOS культивируют в течение семи дней в DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), после чего геномную ДНК экстрагируют с помощью DNeasy (Qiagen, Венло, Нидерланды, № по кат. 69506) и оценивают с помощью количественной ПЦР (qPCR). С помощью наборов праймеров/зондов для протокола qPCR измеряют число копий вектора (VCN) в трансдуцированных клетках посредством определения количества копий лентивирусной области psi-gag в пересчета на количество копий эндогенной человеческой RNaseP. Целостность провируса оценивают посредством секвенирования индивидуальных провирусных вставок.

В одном варианте осуществления титр вируса определяют с применением анализа на линии клеток HOS.

В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток, содержащую активированные T-клетки, трансдуцируют в сосуде для культивирования клеток приблизительно во время активации, приблизительно через 1 час после активации, приблизительно через 2 часа после активации, приблизительно через 3 часа после активации, приблизительно через 4 часа после активации, приблизительно через 5 часов после активации, приблизительно через 6 часов после активации, приблизительно через 7 часов после активации, приблизительно через 8 часов после активации, приблизительно через 9 часов после активации, приблизительно через 10 часов после активации, приблизительно через 11 часов после активации, приблизительно через 12 часов после активации, приблизительно через 13 часов после активации, приблизительно через 14 часов после активации, приблизительно через 15 часов после активации, приблизительно через 16 часов после активации, приблизительно через 17 часов после активации, приблизительно через 18 часов после активации, приблизительно через 19 часов после активации, приблизительно через 20 часов после активации, приблизительно через 21 час после активации, приблизительно через 22 часа после активации, приблизительно через 23 часа после активации, приблизительно через 24 часа после активации, приблизительно через 25 часов после активации, приблизительно через 26 часов после активации, приблизительно через 27 часов после активации, приблизительно через 28 часов после активации, приблизительно через 29 часов после активации или приблизительно через 30 часов после активации, или через любой промежуточный период времени после активации.

В одном варианте осуществления популяцию клеток трансдуцируют через приблизительно 20 - приблизительно 24 часа после активации.

Способы получения, рассмотренные в данном документе, включают трансдукцию PBMC, содержащих активированные T-клетки, в сосуде для культивирования клеток с помощью вектора из расчета от приблизительно 1 x 10⁸ до приблизительно 1 x 10¹⁰ TU/10⁸ PBMC, от приблизительно 5 x 10⁸ до приблизительно 5 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC, от приблизительно 1 x 10⁹ до приблизительно 5 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC, от приблизительно 1 x 10⁹ до приблизительно 4 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC, от приблизительно 1 x 10⁹ до приблизительно 3 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC, от приблизительно 1 x 10⁹ до приблизительно 2 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC или при любом промежуточном TU из вышеуказанных.

В одном варианте осуществления способы получения, рассмотренные в данном документе, включают трансдукцию PBMC, содержащих активированные T-клетки, в сосуде для культивирования клеток с помощью вектора из расчета приблизительно 1 x 10⁸ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 5 x 10⁸ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 6 x 10⁸ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 7 x 10⁸ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 8 x 10⁸ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 9 x 10⁸ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 1 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 2 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 3 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 4 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 5 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 6 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 7 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 8 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC, приблизительно 9 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC или приблизительно 1 x 10¹⁰ TU/10⁸ PBMC, или при любом промежуточном TU.

В конкретном варианте осуществления клетки трансдуцируют с помощью вектора из расчета от приблизительно 1 x 10⁷ до приблизительно 2 x 10⁹ TU/10⁸ PBMC.

В одном варианте осуществления способы производства, рассмотренные в данном документе, включают трансдукцию PBMC, содержащих активированные T-клетки, в сосуде для культивирования клеток с помощью вектора при MOI, составляющей приблизительно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100, или любое промежуточное целое значение. В одном варианте осуществления PBMC трансдуцируют с помощью вектора при MOI, составляющей приблизительно 20.

В определенных вариантах вектор может быть разведен в среде для культивирования клеток до приблизительно 10% объема клеточной культуры, приблизительно 15% объема клеточной культуры, приблизительно 16% объема клеточной культуры, приблизительно 17% объема клеточной культуры, приблизительно 18% объема клеточной культуры, приблизительно 19% объема клеточной культуры, приблизительно 20% объема клеточной культуры, приблизительно 21% объема клеточной культуры, приблизительно 22% объема клеточной культуры, приблизительно 23% объема клеточной культуры, приблизительно 24% объема клеточной культуры, приблизительно 25% объема клеточной культуры, приблизительно 30% объема клеточной культуры, приблизительно 35% объема клеточной культуры, приблизительно 40% объема клеточной культуры, приблизительно 45% объема клеточной культуры или приблизительно 50% объема клеточной культуры, или любого промежуточного процента из вышеуказанных.

В конкретном варианте вектор разводят в среде для культивирования клеток, например, TCGM, до приблизительно 20% объема клеточной культуры.

Популяции клеток, высеянных в сосуд для культивирования клеток, трансдуцируют в течение приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 24 часов, приблизительно 30 часов, приблизительно 36 часов, приблизительно 42 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 54 часов или приблизительно 60 часов, или любого промежуточного периода времени.

В конкретном варианте осуществления клетки трансдуцируют в течение приблизительно 48 часов.

После трансдукции клетки можно подвергнуть одной или более стадиям промывки, рассмотренным в данном документе, и впоследствии высеять в подходящий сосуд для культивирования клеток для проведения размножения.

7. Размножение

Платформы для производства T-клеток, рассмотренные в данном документе, могут включать один или более циклов размножения T-клеток. В конкретных вариантах осуществления популяции клеток, содержащие T-клетки, которые были активированы и/или трансдуцированы, высевают в подходящие сосуды для культивирования клеток, содержащие среду для культивирования клеток, подходящую для размножения. В конкретных вариантах осуществления клетки высевают в биореактор и периодически собирают без пересева.

В определенных вариантах осуществления клетки пересевают при плотности, требуемой для поддержания фазы логарифмического роста клеток.

В конкретных вариантах осуществления клетки высевают в клеточную культуру при плотности, составляющей от приблизительно 0,1 x 10⁶ до приблизительно 1 x 10⁷ клеток/мл, от приблизительно 0,1 x 10⁶ до приблизительно 0,9 x 10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,1 x 10⁶ до приблизительно 0,8 x 10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,1 x 10⁶ до приблизительно 0,7 x 10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,1 x 10⁶ до приблизительно 0,6 x 10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,1 x 10⁶ до приблизительно 0,5 x 10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,2 x 10⁶ до приблизительно 0,5 x 10⁶ клеток/мл или от приблизительно 0,3 x 10⁶ до приблизительно 0,5 x 10⁶ клеток/мл, или при любой промежуточной плотности клеток, при условии что сохраняется фаза логарифмического роста клеток.

В определенных вариантах осуществления клетки высевают в клеточную культуру при плотности, составляющей приблизительно 0,1 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 0,2 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 0,3 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 0,4 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 0,5 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 0,6 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 0,7 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 0,8 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 0,9 x 10⁶ клеток/мл или приблизительно 1 x 10⁷ клеток/мл, или при любой промежуточной плотности клеток, при условии что сохраняется фаза логарифмического роста клеток.

В некоторых вариантах осуществления клетки высевают в биореактор, например, биореактор WAVE, при плотности, составляющей приблизительно 0,1 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 0,5 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 1 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 2 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 3 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 4 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 5 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 6 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 7 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 8 x 10⁶ клеток/мл, приблизительно 9 x 10⁶клеток/мл или приблизительно 1 x 10⁷ клеток/мл, или при любой промежуточной плотности, при условии что сохраняется фаза логарифмического роста клеток.

В конкретных вариантах осуществления клетки высевают в сосуд для культивирования клеток, содержащий среду для культивирования клеток, подходящую для размножения T-клеток. Иллюстративные примеры сред для культивирования клеток, подходящих для размножения T-клеток, включают без ограничений ростовую среду для T-клеток (TCGM), SFM для размножения T-клеток CTS™ OpTmizer™(Life Technologies), среду CTS™ AIM V® (Life Technologies), RPMI 1640, среду Клика, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 (Lonza) и X-Vivo 20 (Lonza) и/или дополнительные гормоны, факторы роста и цитокин(-ы), достаточные для роста и размножения T-клеток. В конкретном варианте осуществления среда для культивирования клеток представляет собой TCGM. В определенном варианте осуществления среды для культивирования клеток дополнительно включают один или более факторов, в том числе без ограничений сыворотку (например, фетальную бычью или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL- 10, IL- 12, IL-15, TGFβ и TNF-α или любую их комбинацию.

В одном варианте осуществления среда для культивирования клеток может содержать один или более цитокинов, например, таких как IL-2, IL-7 и/или IL-15, или любую их подходящую комбинацию. Иллюстративные примеры подходящих концентраций каждого цитокина или общей концентрации цитокинов включают приблизительно 25 МЕ/мл, приблизительно 50 МЕ/мл, приблизительно 75 МЕ/мл, приблизительно 100 МЕ/мл, приблизительно 125 МЕ/мл, приблизительно 150 МЕ/мл, приблизительно 175 МЕ/мл, приблизительно 200 МЕ/мл, приблизительно 250 МЕ/мл, приблизительно 300 МЕ/мл, приблизительно 350 МЕ/мл, приблизительно 400 МЕ/мл, приблизительно 450 МЕ/мл или приблизительно 500 МЕ/мл, или любое промежуточное количество цитокинов из вышеуказанных. В конкретных вариантах осуществления среда для культивирования клеток содержит приблизительно 100 МЕ/мл каждого из IL-2, IL-1 и/или IL-15, или их общего количества, или любой их комбинации.

В конкретных вариантах осуществления среда для культивирования клеток содержит приблизительно 250 МЕ/мл каждого из IL-2, IL-1 и/или IL-15, или их общего количества, или любой их комбинации.

В конкретных вариантах осуществления способы производства T-клеток, рассмотренные в данном документе, включают размножение T-клеток в течение от приблизительно 3 дней до приблизительно 14 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 13 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 12 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 11 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 10 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 9 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 8 дней, или от приблизительно 3 до приблизительно 7 дней, или от приблизительно 5 до приблизительно 8 дней, или любого промежуточного количества дней. В определенных вариантах осуществления способы производства T-клеток, рассмотренные в данном документе, включают размножение T-клеток в течение приблизительно 3 дней, приблизительно 4 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 7 дней, приблизительно 8 дней, приблизительно 9 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 11 дней или приблизительно 12 дней. Размножение можно проводить в одном и том же сосуде и/или типе сосуда в течение всего периода размножения или в различных сосудах и/или типах сосудов в течение периода размножения.

В одном варианте осуществления размножение T-клеток проводят в течение от приблизительно 5 дней до приблизительно 8 дней в пакете для культивирования клеток.

В одном варианте осуществления размножение T-клеток проводят в течение от приблизительно 5 дней до приблизительно 8 дней в пакете для культивирования клеток, а затем размножение продолжается в биореакторе, в том числе без ограничений биореакторе WAVE или G-REX. В конкретном варианте осуществления размножение может быть продолжено в биореакторе в течение приблизительно 1 дня, приблизительно 2 дней, приблизительно 3 дней, приблизительно 4 дней или приблизительно 5 дней или более.

В другом варианте осуществления размножение T-клеток проводят в течение от приблизительно 5 дней до приблизительно 8 дней в биореакторе, в том числе в биореакторе WAVE или биореакторе G-REX.

Биореактор WAVE обеспечивает качание c различной скоростью и при множестве различных углов качания. Иллюстративные скорости качания включают без ограничений 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 колебаний в минуту. В определенных вариантах осуществления в способах стимуляции и размножения по настоящему изобретению предусмотрено, что угол качающейся платформы можно установить на 1,5°, 2°, 2,5°, 3°, 3,5°, 4°, 4,5°, 5°, 5,5°, 6°, 6,5°, 7°, 7,5°, 8°, 8,5° или 9,0°.

В одном варианте осуществления объем биореактора WAVE составляет 2500 мл, скорость качания составляет приблизительно 6 или приблизительно 7 об./мин., а угол составляет от приблизительно 7 до приблизительно 8.

В одном варианте осуществления клетки изначально высевают в приблизительно 100 мл в биореактор GREX и приблизительно 200 мл свежей ростовой среды добавляют в культуру в дни 3, 4 и 5. В определенных вариантах осуществления в биореактор GREX добавляют дополнительные среды, чтобы довести объем культуры до приблизительно 1 л в день 7.

Подсчет клеток и оценку жизнеспособности производят ежедневно или в любой из ряда дней, клетки или порцию клеток можно подвергать криоконсервации и/или клетки можно анализировать с помощью FACS-анализа в отношении экспрессии маркеров, например, CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD27, CD197 или HLA-DR, трансгена.

В одном варианте осуществления популяция T-клеток, в отношении которой применили способы производства, рассмотренные в данном документе, увеличена по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз, по меньшей мере в 400 раз, по меньшей мере в 500 раз, по меньшей мере в 600 раз, по меньшей мере в 700 раз, по меньшей мере в 800 раз, по меньшей мере в 900 раз или по меньшей мере в 1000 раз или более по сравнению с исходной популяцией T-клеток.

8. Извлечение произведенных композиций на основе T-клеток

В конкретных вариантах осуществления способы производства T-клеток, рассмотренные в данном документе, включают стадию извлечения произведенных композиций на основе T-клеток, включающую сбор и промывку размноженных клеток с помощью полуавтоматической проточной центрифуги, например, Cobe 2991 Cell Processor, Cell Saver 5, Baxter CytoMate, LOVO и т.п.

Перед сбором размноженных клеток могут отбираться аликвоты досборовых образцов для осуществления подсчета клеток, оценки жизнеспособности, анализа клеток, например, посредством FACS-анализа, определения чистоты и/или других критериев массового производства для клеток. В дополнение, могут отбираться аликвоты послесборовых образцов для осуществления подсчетов клеток и/или оценки жизнеспособности.

Извлеченные композиции на основе T-клеток затем переносят в один или более пакетов для внутривенного вливания или других подходящих емкостей, например, GMP-пакетов для размножения клеток MACS®, GMP-пакетов для дифференцировки клеток MACS®, биоконтейнеров для размножения клеток EXP-Pak™, пакетов VueLife™, пакетов KryoSure™, пакетов KryoVue™, пакетов Lifecell®, пакетов PermaLife™, пакетов X-Fold™, пакетов Si-Culture™, криопакетов Origen Biomedical и пакетов VectraCell™, и подвергают криоконсервации с помощью программируемого аппарата для криозамораживания, как обсуждается выше и в других частях данного документа, до тех пор пока клетки не станут готовы к применению. В конкретных вариантах осуществления клетки замораживают в 50% Plasmalyte и 50% Cryostor 10; 50/40/10 (XVIVO/HABS/DMSO) или Cryostor 10.

Пакеты (вместимостью 10-250 мл), содержащие терапевтические композиции на основе T-клеток, хранят в контролируемых условиях банка крови при температуре от -80°C до -135°C. Пакеты для инфузий хранят в морозильной камере до тех пор, пока они понадобятся.

D. Разработанные T-клеточные рецепторы и химерные антигенные рецепторы

Рассмотренные способы производства T-клеток особенно применимы для размножения T-клеток, модифицированных для экспрессии высокоаффинных T-клеточных рецепторов (разработанных TCR) или химерных антигенных рецепторов (CAR) надежным и воспроизводимым образом. В одном варианте осуществления T-клетка является генетически модифицированной для экспрессии одного или более разработанных TCR или CAR. Используемые в данном документе T-клетки, модифицированные для экспрессии разработанных TCR или CAR, рассмотренные в данном документе, могут называться «антиген-специфическими перенаправленными T-клетками».

1. Разработанные TCR

Встречающиеся в природе T-клеточные рецепторы содержат две субъединицы, α-субъединицу и β-субъединицу, каждая из которых представляет собой уникальный белок, образованный за счет акта рекомбинации в геноме каждой T-клетки. Библиотеки TCR можно подвергать скринингу на их селективность в отношении конкретных целевых антигенов. Таким образом, природные TCR, которые характеризуются высокой авидностью и реактивностью в отношении целевых антигенов, можно отбирать, клонировать и затем вводить в популяцию T-клеток, применяемых для адоптивной иммунотерапии.

В одном варианте осуществления T-клетки модифицируют путем введения полинуклеотида, кодирующего субъединицу TCR, которая способна формировать TCR, которые придают T-клеткам специфичность в отношении опухолевых клеток, экспрессирующих целевой антиген. В конкретных вариантах осуществления субъединицы характеризуются одной или более аминокислотными заменами, делециями, вставками или модификациями относительно встречающихся в природе субъединиц, при условии что субъединицы сохраняют способность формировать TCR, придающие трансфицированным T-клеткам способность наводиться на целевые клетки и принимать участие в иммуногенной передаче цитокиновых сигналов. Разработанные TCR предпочтительно также связывают целевые клетки, на которых находится соответствующий опухолеассоциированный пептид, с высокой авидностью и необязательно опосредуют эффективный цитолиз целевых клеток, на которых присутствует соответствующий пептид in vivo.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие разработанные TCR, предпочтительно выделены из их природного контекста в (встречающейся в природе) хромосоме T-клетки и могут быть вставлены в подходящие векторы, как описано в других частях данного документа. Как нуклеиновые кислоты, так и содержащие их векторы можно эффективно переносить в клетку, которая предпочтительно представляет собой T-клетку. Модифицированные T-клетки тогда приобретают способность экспрессировать обе цепи TCR, кодируемые трансдуцированной нуклеиновой кислотой или нуклеиновыми кислотами. В предпочтительных вариантах осуществления разработанный TCR представляет собой экзогенный TCR, ввиду того, что его вводят в T-клетки, которые в норме не экспрессируют конкретный TCR. Существенным аспектом разработанных TCR является то, что они характеризуются высокой авидностью в отношении опухолевого антигена, презентируемого молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) или аналогичным иммунологическим компонентом. В отличие от разработанных TCR CAR разрабатывают для связывания целевых антигенов независимым от MHC способом.

Белок, кодируемый нуклеиновыми кислотами по настоящему изобретению, можно экспрессировать с дополнительными полипептидами, прикрепленными к амино-концевой или карбокси-концевой части α-цепи или β-цепи TCR по настоящему изобретению, при условии что прикрепленный дополнительный полипептид не препятствует способности α-цепи или β-цепи формировать функциональный T-клеточный рецептор и обеспечивать MHC-зависимое распознавание антигена.

Антигены, которые распознаются разработанными TCR, рассмотренными в данном документе, включают без ограничений раковые антигены, в том числе антигены как форм рака системы кроветворения, так и солидных опухолей. Иллюстративные антигены включают без ограничений фолатный рецептор альфа, 5T4, α_vβ₆-интегрин, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, семейство EGFR, в том числе ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, фетальный AchR, FRα, GD2, GD3, 'глипикан-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, лямбда-цепь, Lewis-Y, каппа-цепь, мезотелин, Muc1, Muc16, NCAM, лиганды NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, сурвивин, TAG72, TEM и VEGFR2.

2. Химерные антигенные рецепторы (CAR)

Способы производства T-клеток, рассмотренные в данном документе, включают модификацию T-клеток для экспрессии одного или более CAR, рассматриваемых в данном документе. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены T-клетки, полученные методами генной инженерии с помощью векторов, разработанных для экспрессии CAR, которые перенаправляют цитотоксичность на опухолевые клетки. CAR представляют собой молекулы, в которых объединена специфичность антитела к целевому антигену (например, опухолевому антигену) с внутриклеточным активирующим доменом Т-клеточного рецептора с получением химерного белка, который проявляет специфическую противоопухолевую клеточную иммунную активность. Используемый в данном документе термин «химерный» обозначает составленный из частей различных белков или ДНК из различных источников.

CAR, рассмотренные в данном документе, содержат внеклеточный домен, который связывается со специфическим целевым антигеном (также называемый связывающий домен или антиген-специфический связывающий домен), трансмембранный домен и внутриклеточный домен передачи сигнала. Основной характеристикой CAR является их способность перенаправлять специфичность иммунной эффекторной клетки, запуская тем самым пролиферацию, продукцию цитокинов, фагоцитоз или продукцию молекул, которые могут опосредовать клеточную гибель клетки, экспрессирующей целевой антиген, независимым от главного комплекса гистосовместимости (MHC) способом, с использованием специфических в отношении клетки нацеливающих способностей моноклональных антител, растворимых лигандов или специфических в отношении клетки корецепторов.

В конкретных вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный связывающий домен, включающий без ограничения антитело или его антиген-связывающий фрагмент, связанный лиганд или внеклеточный домен корецептора, который специфически связывает целевой антиген, который представляет собой опухолеассоциированный антиген (TAA) или опухолеспецифический антиген(TSA). В определенных вариантах осуществления TAA или TSA экспрессируются на клетке рака крови. В другом варианте осуществления TAA или TSA экспрессируются на клетке солидной опухоли. В конкретных вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой глиобластому, немелкоклеточный рак легкого, рак легкого, отличный от немелкоклеточного рака легкого, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак печени, рак толстой кишки, рак желудка, рак селезенки, рак кожи, рак головного мозга, отличный от глиобластомы, рак почки, рак щитовидной железы и т. п.

В конкретных вариантах осуществления TAA или TSA выбраны из группы, включающей фолатный рецептор альфа, 5T4, α_vβ₆-интегрин, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, семейство EGFR, в том числе ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, фетальный AchR, FRα, GD2, GD3, 'глипикан-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, лямбда-цепь, Lewis-Y, каппа-цепь, мезотелин, Muc1, Muc16, NCAM, лиганды NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, сурвивин, TAG72, TEM или VEGFR2.

a. Связывающий домен

В конкретных вариантах осуществления CAR, рассмотренные в данном документе, содержат внеклеточный связывающий домен, который специфически связывается с целевым полипептидом, например, целевым антигеном, экспрессируемым на опухолевой клетке. Используемые в данном документе термины «связывающий домен», «внеклеточный домен», «внеклеточный связывающий домен», «антиген-специфический связывающий домен» и «внеклеточный антиген-специфический связывающий домен» являются взаимозаменяемыми и предусматривают CAR с возможностью специфично связываться с целевым антигеном, представляющим интерес. Связывающий домен может содержать любой белок, полипептид, олигопептид или пептид, который обладает способностью специфически распознавать и связываться с биологической молекулой (например, рецептором клеточной поверхности или опухолевым белком, липидом, полисахаридом или другой целевой молекулой клеточной поверхности или их компонентом). Связывающий домен включает любого встречающегося в природе, синтетического, полусинтетического или полученного рекомбинантным путем партнера по связыванию для биологической молекулы, представляющей интерес.

В конкретных вариантах осуществления внеклеточный связывающий домен CAR содержит антитело или его антиген-связывающий фрагмент. Термин «антитело» относится к связывающему агенту, который представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи иммуноглобулина, которая специфически распознает и связывает эпитоп целевого антигена, такого как пептид, липид, полисахарид или нуклеиновая кислота, содержащий антигенную детерминанту, распознаваемую иммунной клеткой. Антитела включают их антиген-связывающие фрагменты. Термин также включает полученные методами генной инженерии формы, такие как химерные антитела (например, гуманизированные мышиные антитела), гетероконъюгатные антитела (такие как, биспецифические антитела) и их антиген-связывающие фрагменты. См. также Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Рокфорд, Иллинойс); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997.

В конкретных вариантах осуществления целевой антиген представляет собой эпитоп полипептида фолатного рецептора альфа, 5T4, α_vβ₆-интегрина, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, семейства EGFR, в том числе ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, фетального AchR, FRα, GD2, GD3, 'глипикана-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, лямбда-цепи, Lewis-Y, каппа-цепи, мезотелина, Muc1, Muc16, NCAM, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, сурвивина, TAG72, TEM или VEGFR2.

Вариабельные области легкой и тяжелой цепей содержат «каркасную область», прерываемую гипервариабельными участками, также называемыми «определяющими комплементарность участками» или «CDR». CDR можно определять или идентифицировать с помощью традиционных способов, например, с помощью последовательности по Kabat и др. (Wu, TT and Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. and Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987); (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, которая тем самым включена посредством ссылки), или с помощью структуры согласно Chothia и др. (Choithia, C. and Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917 (1987), Choithia, C. et al, Nature, 342: 877 - 883 (1989)).

Последовательности каркасных участков различных легких или тяжелых цепей относительно консервативны в пределах вида, такого как человек. Каркасный участок антитела, который представляет собой объединенные каркасные участки составляющих антитело легкой и тяжелой цепей, служит для регуляции положения и выравнивания CDR в трехмерном пространстве. Прежде всего CDR ответственны за связывание с эпитопом антигена. CDR каждой цепи, как правило, называются CDR1, CDR2 и CDR3, нумеруются последовательно, начиная с N-конца, а также, как правило, идентифицируются с помощью цепи, в которой конкретный CDR находится. Таким образом, CDR, расположенные в вариабельном домене тяжелой цепи антитела, называются CDRH1, CDRH2 и CDRH3, тогда как CDR, расположенные в вариабельном домене легкой цепи антитела, называются CDRL1, CDRL2 и CDRL3. Антитела с различной специфичностью (т. е. различными паратопами для различных антигенов) имеют разные CDR. Несмотря на то, что CDR варьируют от антитела к антителу, только ограниченное количество аминокислотных положений в пределах CDR непосредственно вовлечено в связывание антигена. Такие положения в пределах CDR называют определяющими специфичность остатками (SDR).

Ссылки на «V_H» или «VH» относятся к вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, в том числе таковой антитела, Fv, ScFv, dsFv, Fab или другого фрагмента антитела, раскрываемого в данном документе. Ссылки на «V_L» или «VL» относятся к вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, в том числе таковой антитела, Fv, ScFv, dsFv, Fab или другого фрагмента антитела, раскрываемого в данном документе.

«Моноклональное антитело» представляет собой антитело, вырабатываемое одним клоном В-лимфоцитов или клеткой, в которую были трансфицированы гены легкой и тяжелой цепи одного антитела. Моноклональные антитела получают с помощью способов, известных специалистам в данной области, например, посредством создания образующих антитела гибридных клеток путем слияния клеток миеломы с иммунными клетками селезенки. Моноклональные антитела включают гуманизированные моноклональные антитела.

«Химерное антитело» содержит каркасные остатки от одного вида, такого как человек, и CDR (которые в целом обуславливают связывание антигена) от другого вида, такого как мышь. В конкретных предпочтительных вариантах осуществления CAR, рассмотренные в данном документе, содержит антиген-специфический связывающий домен, который представляет собой химерное антитело или его антиген-связывающий фрагмент.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело (такое как гуманизированное моноклональное антитело), которое специфически связывается с поверхностным белком опухолевой клетки. «Гуманизированное» антитело представляет собой иммуноглобулин, включающий человеческий каркасный участок и один или более CDR из не являющегося человеческим иммуноглобулина (например, мышиного, крысиного или синтетического). Гуманизированные антитела могут быть сконструированы при помощи методов генной инженерии (см., например, патент США № 5585089).

В конкретных вариантах осуществления внеклеточный связывающий домен CAR содержит антитело или его антиген-связывающий фрагмент, в том числе без ограничения верблюжий Ig (антитело верблюдовых (VHH)), IgNAR, Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab)'2-фрагменты, F(ab)'3-фрагменты, Fv, одноцепочечное Fv-антитело («scFv»), бис-scFv, (scFv)2, минитело, диатело, триатело, тетратело, стабилизированный дисульфидными связями Fv-белок («dsFv») и однодоменное антитело (sdAb, нанотело).

«Верблюжий Ig» или «VHH-антитело верблюдовых», используемые в данном документе, относятся к наименьшей известной антиген-связывающей единице из антитела, состоящего только из тяжелых цепей (Koch-Nolte, et al., FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)). Термины «антитело, состоящее только из тяжелых цепей» или «антитело верблюдовых» относится к антителу, которое содержит два VH-домена и не содержит легких цепей (Riechmann L. et al., J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999); WO94/04678; WO94/25591; патент США № 6005079).

«IgNAR» или «новый иммуноглобулиновый антигенный рецептор» относится к классу антител из иммунного спектра акул, которые состоят из гомодимеров из одного вариабельного домена нового антигенного рецептора (VNAR) и пяти константных доменов нового антигенного рецептора (CNAR).

Расщепление антител папаином дает два идентичных антиген-связывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагменты, каждый с одним антиген-связывающим сайтом, и оставшийся «Fc»-фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Fab-фрагмент содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, а также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбокси-конце СН1-домена тяжелой цепи, включающими один или более цистеиновых остатков из шарнирной области антитела. Fab'-SH в данном документе обозначает Fab', в котором цистеиновый остаток(и) константных доменов имеет свободную тиольную группу. F(аb')2-фрагменты антитела первоначально были получены как пары из Fab'-фрагментов, которые имеют общие цистеиновые остатки шарнирной области. Также известны другие средства для химического связывания фрагментов антител.

«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антиген-связывающий сайт. В молекуле одноцепочечного Fv (scFv) один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи могут быть ковалентно связаны посредством гибкого пептидного линкера, так что легкая и тяжелая цепи могут объединяться в «димерную» структуру, аналогичную таковой у молекулы двуцепочечного Fv.

Термин «диатела» относится к фрагментам антитела с двумя антиген-связывающими сайтами, при этом фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одну полипептидную цепь (VH-VL). Путем использования линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить образование пары между двумя доменами одной цепи, домены вынуждены образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антиген-связывающих сайта. Диатела могут быть бивалентными или биспецифическими. Более полно диатела описаны, например, в EP 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); и Hollinger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993). Триатела и тетратела также описаны в Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

«Однодоменное антитело», или «sdAb», или «нанотело» относится к фрагменту антитела, который состоит из вариабельной области тяжелой цепи антитела (VH-домен) или вариабельной области легкой цепи антитела (VL-домен) (Holt, L., et al., Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).

«Одноцепочечные Fv» или «scFv»-фрагменты антитела содержат VH- и VL-домены антитела, где указанные домены присутствуют в одной полипептидной цепи и в любой ориентации (например, VL-VH или VH-VL). Как правило, полипептид scFv дополнительно содержит полипептидный линкер между VH- и VL-доменами, который обеспечивает возможность scFv образовать требуемую структуру для связывания антигена. Обзор scFv см., например, Pluckthün, в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315.

В определенном варианте осуществления scFv связывает полипептид фолатного рецептора альфа, 5T4, α_vβ₆-интегрина, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, семейство EGFR, в том числе ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, фетального AchR, FRα, GD2, GD3, 'глипикана-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, лямбда-цепи, Lewis-Y, каппа-цепи, мезотелина, Muc1, Muc16, NCAM, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, сурвивина, TAG72, TEM или VEGFR2.

b. Линкеры

В определенных вариантах осуществления CAR, рассмотренные в данном документе, могут содержать линкерные остатки между различными доменами, например, между V_H- и V_L-доменами, добавленные для соответствующего разделения их в пространстве и обеспечения конформации молекулы. CAR, рассмотренные в данном документе, могут содержать один, два, три, четыре или пять или более линкеров. В конкретных вариантах осуществления длина линкера составляет от приблизительно 1 до приблизительно 25 аминокислот, от приблизительно 5 до приблизительно 20 аминокислот или от приблизительно 10 до приблизительно 20 аминокислот, или любой другой промежуточный отрезок из аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет длину 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более аминокислот.

Иллюстративные примеры линкеров включают глициновые полимеры (G)_n; глицин-сериновые полимеры (G_1-5S_1-5)_n, где n равняется целому числу, составляющему по меньшей мере один, два, три, четыре или пять; глицин-аланиновые полимеры; аланин-сериновые полимеры и другие гибкие линкеры, известные из уровня техники. Глициновые и глицин-сериновые полимеры являются относительно неструктурированными и, следовательно, могут служить нейтральным связующим между доменами белков слияния, таких как CAR, описанных в данном документе. Глицин обеспечивает значительно большее фи-пси пространство, чем аланин, и является намного менее ограниченным, чем остатки с более длинными цепями (см. Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Специалисту в данной области будет понятно, что структура CAR в конкретных вариантах осуществления может включать линкеры, которые являются полностью или частично гибкими, так что линкер может включать гибкий линкер, а также одну или более частей, обуславливающих менее гибкую структуру с обеспечением требуемой структуры CAR.

Другие примеры линкеров включают без ограничений следующие аминокислотные последовательности: GGG; DGGGS (SEQ ID NO: 1); TGEKP (SEQ ID NO: 2) (см., например, Liu et al., PNAS 5525-5530 (1997)); GGRR (SEQ ID NO: 3) (Pomerantz et al. 1995, выше); (GGGGS)_n где = 1, 2, 3, 4 или 5 (SEQ ID NO: 4) (Kim et al., PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO:5) (Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO:6) (Bird et al., 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (SEQ ID NO:7); LRQRDGERP (SEQ ID NO:8); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO:9); LRQKd(GGGS)₂ ERP (SEQ ID NO:10). В качестве альтернативы гибкие линкеры могут быть разработаны методами рационального дизайна с использованием компьютерной программы, способной моделировать как ДНК-связывающие сайты, так и пептиды сами по себе (Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994), или с помощью способов фагового дисплея.

В конкретных вариантах осуществления CAR содержит scFV, который дополнительно содержит линкерную последовательность вариабельной области. «Линкерная последовательность вариабельной области» представляет собой аминокислотную последовательность, которая соединяет вариабельную область тяжелой цепи с вариабельной областью легкой цепи и обеспечивает спейсерную функцию, совместимую с взаимодействием двух связывающих субдоменов, так что полученный полипептид сохраняет специфическую аффинность связывания с той же целевой молекулой что и антитело, которое содержит такие же вариабельные области легкой и тяжелой цепей. В одном варианте осуществления линкерная последовательность вариабельной области имеет дину 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более аминокислот. В конкретном варианте осуществления линкерная последовательность вариабельной области содержит глицин-сериновый полимер (G_1-5S_1-5)_n, где n равняется целому числу, составляющему по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5. В другом варианте осуществления линкерная последовательность вариабельной области содержит аминокислотный линкер (G₄S)₃.

c. Спейсерный домен

В конкретных вариантах осуществления за связывающим доменом CAR следует один или более «спейсерных доменов», которыми называют область, отодвигающую антиген-связывающий домен от поверхности эффекторной клетки для обеспечения надлежащего контакта клетка/клетка, связывания антигена и активации (Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). Спейсерный домен может быть получен из природного, синтетического, полусинтетического или рекомбинантного источника. В определенных вариантах осуществления спейсерный домен представляет собой часть иммуноглобулина, включающую без ограничения одну или более константных областей тяжелой цепи, например, CH2 и CH3. Спейсерный домен может включать аминокислотную последовательность из встречающейся в природе шарнирной области иммуноглобулина или измененной шарнирной области иммуноглобулина.

В одном варианте осуществления спейсерный домен содержит CH2 и CH3 из IgG1.

d. Шарнирный домен

За связывающим доменом CAR, как правило, следует один или более «шарнирных доменов», которые играют роль в регуляции положения антиген-связывающего домена, отодвигая его от поверхности эффекторной клетки для обеспечения надлежащего контакта клетка/клетка, связывания антигена и активации. CAR, как правило, содержит один или более шарнирных доменов между связывающим доменом и трансмембранным доменом (TM). Шарнирный домен может быть получен из природного, синтетического, полусинтетического или рекомбинантного источника. Шарнирный домен может включать аминокислотную последовательность из встречающейся в природе шарнирной области иммуноглобулина или измененной шарнирной области иммуноглобулина.

Иллюстративные шарнирные домены, пригодные для применения в CAR, описанных в данном документе, включают шарнирную область, полученную из внеклеточных областей мембранных белков 1 типа, таких как CD8α, CD4, CD28 и CD7, которые могут представлять собой шарнирные области дикого типа из этих молекул или могут быть измененными. В другом варианте осуществления шарнирный домен содержит шарнирную область CD8α.

e. Трансмембранный домен (TM)

«Трансмембранный домен» представляет собой часть CAR, которая объединяет внеклеточную связывающую часть и внутриклеточный домен передачи сигнала, а также заякоривает CAR в плазматической мембране иммунной эффекторной клетки. TM-домен может быть получен из природного, синтетического, полусинтетического или рекомбинантного источника.

Иллюстративные TM-домены могут быть получены из (т. е. содержат по меньшей мере трансмембранную область(-и)) альфа, бета или зета цепи T-клеточного рецептора, эпсилон-CD3, зета-CD3, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137 и CD154.

В одном варианте осуществления CAR, рассмотренный в данном документе, содержит TM-домен, полученный из CD8α. В другом варианте осуществления CAR, рассмотренный в данном документе, содержит TM-домен, полученный из CD8α, и короткий олиго- или полипептидный линкер длиной предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, который связывает TM-домен и внутриклеточный домен передачи сигнала у CAR. Глицин-сериновый линкер является особенно подходящим линкером.

f. Внутриклеточный домен передачи сигнала

В конкретных вариантах осуществления CAR, рассмотренные в данном документе, содержат внутриклеточный домен передачи сигнала. «Внутриклеточным доменом передачи сигнала» называют часть CAR, которая участвует в передаче сообщения об эффективном связывании CAR с целевым антигеном во внутреннюю часть иммунной эффекторной клетки для запуска эффекторной функции клетки, например, активации, выработки цитокина, пролиферации и цитотоксической активности, в том числе высвобождения цитотоксических факторов в CAR-связанную целевую клетку, или других клеточных ответов, вызываемых связыванием антигена с внеклеточным доменом CAR.

Термин «эффекторная функция» относится к специализированной функции клетки. Эффекторная функция Т-клетки, например, может представлять собой цитолитическую активность, или вспомогательную, или активность, включающую секрецию цитокина. Таким образом, термин «внутриклеточный домен передачи сигнала» относится к части белка, который передает сигнал для запуска эффекторной функции и который обуславливает выполнение клеткой специализированной функции. Несмотря на то, что обычно можно использовать целый внутриклеточный домен передачи сигнала, во многих случаях не является необходимым применение целого домена. В тех случаях, когда применяют усеченную часть внутриклеточного домена передачи сигнала, такую усеченную часть можно применять вместо целого домена, при условии что он передает сигнал для запуска эффекторной функции. Термин внутриклеточный домен передачи сигнала подразумевает включение любой усеченной части внутриклеточного домена передачи сигнала, достаточный для передачи сигнала для запуска эффекторной функции.

Известно, что сигналы, генерируемые посредством только TCR, являются недостаточными для полной активации Т-клетки, и что также требуется повторный или костимулирующий сигнал. Таким образом можно сказать, что активация Т-клетки опосредуется двумя различными классами внутриклеточных доменов передачи сигнала: доменами передачи первичного сигнала, которые инициируют антиген-зависимую первичную активацию посредством TCR (например, комплекса TCR/CD3), и доменами передачи костимулирующего сигнала, которые действуют независимым от антигена образом с обеспечением вторичного или костимулирующего сигнала. В предпочтительных вариантах осуществления CAR, рассмотренный в данном документе, содержит внутриклеточный домен передачи сигнала, который содержит один или более «доменов передачи костимулирующего сигнала» и «домен передачи первичного сигнала».

Домены передачи первичного сигнала реагируют на первичную активацию комплекса TCR либо путем стимуляции, либо путем ингибирования. Домены передачи первичного сигнала, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать мотивы передачи сигнала, которые известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы или ITAM.

Иллюстративные примеры ITAM-содержащих доменов передачи первичного сигнала, которые являются особенно применимыми в настоящем изобретении, включают таковые, полученные из TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В конкретных предпочтительных вариантах осуществления CAR содержит домен передачи первичного сигнала CD3ζ и один или более доменов передачи костимулирующего сигнала. Внутриклеточные домены передачи первичного сигнала и передачи костимулирующего сигнала могут быть присоединены в любом порядке последовательно к карбоксильному концу трансмембранного домена.

CAR, рассмотренные в данном документе, содержат один или более доменов передачи костимулирующего сигнала для повышения эффективности и размножения Т-клеток, экспрессирующих CAR-рецепторы. Используемый в данном документе термин «домен передачи костимулирующего сигнала» или «домен костимуляции» относится к внутриклеточному домену передачи сигнала от костимулирующей молекулы.

Иллюстративные примеры таких костимулирующих молекул включают CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD30, CD40, PD-1, ICOS (CD278), CTLA4, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, TRIM, LCK3, SLAM, DAP10, LAG3, HVEM и NKD2C, а также CD83. В одном варианте осуществления CAR содержит один или более доменов передачи костимулирующего сигнала, выбранных из группы, включающей CD28, CD137 и CD134, а также домен передачи первичного сигнала CD3ζ.

В одном варианте осуществления CAR содержит scFv, который связывает полипептид фолатного рецептора альфа, 5T4, α_vβ₆-интегрина, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, семейства EGFR, в том числе ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, фетального AchR, FRα, GD2, GD3, 'глипикана-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, лямбда-цепи, Lewis-Y, каппа-цепи, мезотелина, Muc1, Muc16, NCAM, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, сурвивина, TAG72, TEM или VEGFR2; трансмембранный домен, полученный из полипептида, выбранного из группы, включающей CD8α; CD4, CD45, PD1 и CD152; один или более внутриклеточных доменов передачи костимулирующего сигнала, выбранных из группы, включающей CD28, CD54, CD134, CD137, CD152, CD273, CD274 и CD278; и домен передачи первичного сигнала CD3ζ.

В другом варианте осуществления CAR содержит scFv, который связывает полипептид фолатного рецептора альфа, 5T4, α_vβ₆-интегрина, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, семейства EGFR, в том числе ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, фетального AchR, FRα, GD2, GD3, 'глипикана-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, лямбда-цепи, Lewis-Y, каппа-цепи, мезотелина, Muc1, Muc16, NCAM, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, сурвивина, TAG72, TEM или VEGFR2; шарнирный домен, выбранный из группы, включающей шарнир/CH2/CH3 IgG1 и CD8α, а также CD8α; трансмембранный домен, полученный из полипептида, выбранного из группы, включающей CD8α; CD4, CD45, PD1 и CD152; один или более внутриклеточных доменов передачи костимулирующего сигнала, выбранных из группы, включающей CD28, CD134 и CD137; а также домен передачи первичного сигнала CD3ζ.

В еще одном варианте осуществления CAR содержит scFv, дополнительно содержащий линкер, который связывает полипептид фолатного рецептора альфа, 5T4, α_vβ₆-интегрина, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, семейства EGFR, в том числе ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, фетального AchR, FRα, GD2, GD3, 'глипикана-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, лямбда-цепи, Lewis-Y, каппа-цепи, мезотелина, Muc1, Muc16, NCAM, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, сурвивина, TAG72, TEM или VEGFR2; шарнирный домен, выбранный из группы, включающей шарнир/CH2/CH3 IgG1 и CD8α, а также CD8α; трансмембранный домен, содержащий TM-домен, полученный из полипептида, выбранного из группы, включающей CD8α; CD4, CD45, PD1 и CD152, а также короткий олиго- или полипептидный линкер длиной предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, который связывает TM-домен с внутриклеточным доменом передачи сигнала CAR; и один или более внутриклеточных доменов передачи костимулирующего сигнала, выбранных из группы, включающей CD28, CD134 и CD137; а также домен передачи первичного сигнала CD3ζ.

В конкретном варианте осуществления CAR содержит scFv, который связывает полипептид фолатного рецептора альфа, 5T4, α_vβ₆-интегрина, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, семейства EGFR, в том числе ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, фетальный AchR, FRα, GD2, GD3, 'глипикана-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, лямбда-цепи, Lewis-Y, каппа-цепи, мезотелина, Muc1, Muc16, NCAM, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, сурвивина, TAG72, TEM или VEGFR2; шарнирный домен, содержащий полипептид CD8α; трансмембранный домен CD8α, содержащий полипептидный линкер, состоящий из приблизительно 3 аминокислот; один или более внутриклеточных доменов передачи костимулирующего сигнала, выбранных из группы, включающей CD28, CD134 и CD137; а также домен передачи первичного сигнала CD3ζ.

E. Полипептиды

В настоящем изобретении рассмотрены, в частности, полипептиды разработанных TCR и CAR или их фрагменты, клетки и композиции, содержащие таковые, а также векторы, которые экспрессируют полипептиды. «Полипептид», «фрагмент полипептида», «пептид» и «белок» применяются взаимозаменяемо, и относятся к рекомбинантному полимеру, синтетическому полимеру или полимеру из неприродных аминокислот. Полипептиды не ограничены определенной длиной, например, они могут содержать последовательность белка полной длины или фрагмент белка полной длины, и могут включать посттрансляционные модификации полипептида, например, гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и т.п., а также другие модификации, известные из уровня техники, как встречающиеся, так и не встречающиеся в природе. В различных вариантах осуществления полипептиды, рассмотренные в данном документе, содержат сигнальную (или лидерную) последовательность на N-терминальном конце белка, которая котрансляционно или посттрансляционно управляет переносом белка. Иллюстративные примеры подходящих сигнальных последовательностей, применимых в раскрытом данном документе, включают без ограничения сигнальный полипептид тяжелой цепи IgG1, сигнальный полипептид CD8α или сигнальный полипептид альфа-субъединицы рецептора GM-CSF человека. Полипептиды могут быть получены с помощью любой из множества хорошо известных методик рекомбинации и/или синтеза. Полипептиды, рассмотренные в данном документе, в частности, охватывают CAR по настоящему раскрытию или последовательности, которые имеют делеции, добавления, и/или замены одной или более аминокислот относительно полипептида, рассматриваемого в данном документе.

Полипептиды включают «варианты полипептида». Варианты полипептида могут отличаться от встречающегося в природе полипептида одной или более заменами, делециями, добавлениями и/или вставками. Такие варианты могут быть встречающимися в природе или могут быть получены синтетическим путем, например, посредством модификации одной или более упомянутых выше полипептидных последовательностей. Например, в конкретных вариантах осуществления может быть необходимо улучшать аффинность связывания и/или другие биологические свойства разработанных TCR или CAR посредством введения одной или более замен, делеций, добавлений и/или вставок. Предпочтительно полипептиды по настоящему изобретению включают полипептиды, характеризующиеся по меньшей мере приблизительно 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% аминокислотной идентичностью с ними.

Полипептиды включают «фрагменты полипептида». Фрагментами полипептида называют полипептид, который может быть мономерным или мультимерным, характеризующийся амино-концевой делецией, карбокси-концевой делецией и/или внутренней делецией или заменой относительно встречающегося в природе или полученного рекомбинантным способом полипептида. В определенных вариантах осуществления фрагмент полипептида может содержать аминокислотную цепь, имеющую длину по меньшей мере от 5 до приблизительно 500 аминокислот. Следует иметь в виду, что в определенных вариантах осуществления фрагменты имеют длину по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 аминокислот.

Полипептид также может быть слит в рамке считывания или конъюгирован с линкерной или другой последовательностью для облегчения синтеза, очистки или идентификации полипептида (например, поли-His), или для улучшения связывания полипептида с твердым носителем.

Как уже отмечалось выше, полипептиды, рассмотренные в данном документе, могут быть изменены различными путями, в том числе характеризоваться аминокислотными заменами, делециями, усечениями и вставками. Способы таких манипуляций общеизвестны из уровня техники. Например, варианты аминокислотной последовательности эталонного полипептида могут быть получены посредством мутаций ДНК. Способы мутагенеза и изменений нуклеотидной последовательности хорошо известны из уровня техники. См., например, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), патент США № 4873192, Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987) и ссылочные документы, процитированные в них. Рекомендации, касающиеся подходящих аминокислотных замен, которые не влияют на биологическую активность представляющего интерес белка, можно найти в модели Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).

В определенных вариантах осуществления вариант будет содержать консервативные замены. «Консервативной заменой» является та, при которой аминокислота замещена на другую аминокислоту, которая характеризуется аналогичными свойствами, вследствие чего специалист в области техники, связанной с химией пептидов, может ожидать, что вторичная структура и гидропатичная природа полипептида практически не изменятся. В структуре полинуклеотидов и полипептидов по настоящему изобретению можно выполнять модификации и тем не менее получать функциональную молекулу, которая кодирует вариантный или производный полипептид с необходимыми характеристиками.

Варианты полипептида дополнительно включают гликозилированные формы, конъюгаты, образованные путем агрегации с другими молекулами, а также конъюгаты с образованием ковалентной связи с неродственными химическими фрагментами (например, пегилированные молекулы). Варианты с ковалентной связью можно получать путем связывания функциональных групп с группами, которые находятся в аминокислотной цепи, или с N- или C-концевым остатком, как известно из уровня техники. Варианты также включают аллельные варианты, видовые варианты и мутеины. Усечения или делеции областей, которые не влияют на функциональную активность белков, также приводят к образованию вариантов.

В одном варианте осуществления, в котором требуется экспрессия одного или более полипептидов, полинуклеотидные последовательности, кодирующие их, можно разделять с помощью последовательности IRES, как обсуждается в других частях данного документа. В другом варианте осуществления два или более полипептидов могут экспрессироваться как белок слияния, который содержит одну или более саморасщепляющихся полипептидных последовательностей.

Полипептиды по настоящему изобретению включают слитые полипептиды. В предпочтительных вариантах осуществления предусмотрены слитые полипептиды и полинуклеотиды, кодирующие слитые полипептиды. Слитыми полипептидами и белками слияния называют полипептид, который имеет по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять, или большее количество полипептидных сегментов. Слитые полипептиды, как правило, присоединены C-концом к N-концу, хотя они также могут быть присоединены C-концом к C-концу, N-концом к N-концу или N-концом к C-концу. Полипептиды в белке слияния могут находиться в любом порядке или в определенном порядке. Слитые полипептиды или белки слияния могут также включать консервативно модифицированные варианты, полиморфные варианты, аллели, мутанты, подпоследовательности и межвидовые гомологи, при условии сохранения требуемой транскрипционной активности слитого полипептида. Слитые полипептиды можно получать с помощью способов химического синтеза или с помощью химического связывания двух фрагментов или, как правило, можно получать с помощью других стандартных методик. Лигированные последовательности ДНК, кодирующие полипептид слияния, функционально связаны с подходящими элементами контроля транскрипции или трансляции, как обсуждается в других частях данного документа.

В одном варианте осуществления партнер по слиянию содержит последовательность, которая способствует экспрессии белка (энхансер экспрессии), приводя к более высоким выходам по сравнению с нативным рекомбинантным белком. Другие партнеры по слиянию могут быть выбраны таким образом, чтобы увеличить растворимость белка, или чтобы обеспечить возможность направления белка в требуемые внутриклеточные компартменты, или чтобы облегчить транспорт белка слияния через клеточную мембрану.

Слитые полипептиды могут дополнительно содержать сигнал расщепления полипептида между каждым из полипептидных доменов, описанных в данном документе. Кроме того, сайт расщепления полипептида может быть помещен в последовательность любого линкерного пептида. Примеры сигналов расщепления пептида включают сайты распознавания для расщепления полипептида, такие как сайты расщепления для протеазы, сайты расщепления для нуклеазы (например, сайты распознавания для редкощепящего фермента, сайты распознавания для саморасщепляющихся рибозимов) и саморасщепляющиеся вирусные олигопептиды (см. deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26).

Подходящие сайты расщепления для протеазы и саморасщепляющиеся пептиды хорошо известны специалисту в данной области (см., например, в Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594). Примеры сайтов расщепления для протеазы включают без ограничения сайты расщепления для NIa-протеаз потивируса (например, протеаз вируса гравировки табака), HC-протеаз потивируса, P1 (P35)-протеаз потивируса, NIa-протеаз бимовируса, RNA-2-кодируемых протеаз бимовируса, L-протеаз афтовируса, 2A-протеаз энтеровируса, 2A-протеаз риновируса, 3C-протеаз пикорнавируса, 24K-протеаз комовируса, 24K-протеаз неповируса, 3C-подобной протеазы RTSV (сферический вирус тунгро риса), 3C-подобной протеазы PYVF (вирус желтой пятнистости пастернака), гепарина, тромбина, фактора Xa и энтерокиназы. В одном варианте осуществления вследствие высокой точности расщепления предпочтительными являются сайты расщепления для протеазы TEV (вирус гравировки табака), например, EXXYXQ(G/S) (SEQ ID NO:11), например, ENLYFQG (SEQ ID NO:12) и ENLYFQS (SEQ ID NO:13), где X представляет собой любую аминокислоту (расщепление посредством TEV происходит между Q и G или Q и S).

В конкретном варианте осуществления саморасщепляющиеся пептиды включают полипептидные последовательности, полученные из 2A-пептидов потивируса и кардиовируса, FMDV (вируса ящура), вируса ринита лошадей типа A, вируса Thosea asigna и тешовируса свиней.

В определенных вариантах осуществления сайт саморасщепляющегося полипептида включает последовательность или домен 2A-сайта или 2A-подобного сайта (Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041).

F. Полинуклеотиды

В конкретных вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие один или более полипептидов разработанных TCR или CAR, рассмотренных в данном документе. Используемые в данном документе термины «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» относятся к матричной РНК (мРНК), РНК, геномной РНК (gRNA), плюс-нити РНК (РНК(+)), минус-нити РНК (РНК(-)), геномной ДНК (gDNA), комплементарной ДНК (кДНК), рекомбинантной РНК, синтетической ДНК или не встречающейся в природе ДНК. Полинуклеотиды включают одно- и двухнитевые полинуклеотиды. Предпочтительно полинуклеотиды по настоящему изобретению включают полинуклеотиды или варианты, характеризующиеся по меньшей мере приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с любой из эталонных последовательностей, описанных в данном документе (см., например, Перечень последовательностей), при этом, как правило, вариант сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность эталонной последовательности. В различных иллюстративных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены, в частности, полинуклеотиды, содержащие векторы экспрессии, вирусные векторы и плазмиды-переносчики, а также композиции и клетки, содержащие их.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены полинуклеотиды, которые кодируют по меньшей мере приблизительно 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750 или 2000 или более смежных аминокислотных остатков полипептида по настоящему изобретению, а также все полипептиды промежуточной длины. Нетрудно понять, что «промежуточной длины» в данном контексте означает любую длину между приведенными значениями, например, 6, 7, 8, 9 и т.д., 101, 102, 103 и т.д.; 151, 152, 153 и т. д.; 201, 202, 203 и т.д.

Используемые в данном документе термины «вариант полинуклеотида» и «вариант» и т.п. относятся к полинуклеотидам, проявляющим существенную идентичность последовательности с эталонной полинуклеотидной последовательностью, или к полинуклеотидам, которые гибридизуются с эталонной последовательностью в жестких условиях, которые определены ниже в данном документе. Данные термины включают полинуклеотиды, в которых один или более нуклеотидов были добавлены или удалены, или замещены другими нуклеотидами по сравнению с эталонным полинуклеотидом. При этом из уровня техники хорошо известно, что определенные изменения, в том числе мутации, добавления, делеции и замены, можно выполнять относительно эталонного полинуклеотида, при условии что измененный полинуклеотид сохраняет биологическую функцию или активность эталонного полинуклеотида.

Перечисления «идентичности последовательности» или содержащие, например, «последовательность на 50% идентичная», используемые в данном документе, относятся к степени, в которой данные последовательности являются идентичными при попарном сравнении нуклеотидов или попарном сравнении аминокислот в окне сравнения. Таким образом, «процентное значение идентичности последовательности» можно рассчитать путем сравнения двух последовательностей, подвергнутых оптимальному выравниванию в окне сравнения, определения числа положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты (например, A, T, C, G, I) или идентичный аминокислотный остаток (например, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys и Met) встречаются в обеих последовательностях, чтобы получить число совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения (т.е. размер окна) и умножения результата на 100 с получением процентного значения идентичности последовательностей. Предусмотрены нуклеотиды и полинуклеотиды, характеризующиеся по меньшей мере приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с любой из эталонных последовательностей, описанных в данном документе, как правило, при условии что вариант полипептида сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность эталонного полипептида.

Термины, используемые для описания взаимосвязи последовательностей двух или более полинуклеотидов или полипептидов, включают следующие: «эталонная последовательность», «окно сравнения», «идентичность последовательности», «процентное значение идентичности последовательности» и «существенная идентичность». Длина «эталонной последовательности» составляет по меньшей мере 12, но чаще 15-18 и зачастую по меньшей мере 25 мономерных единиц, в том числе нуклеотидов и аминокислотных остатков. Поскольку каждый из двух полинуклеотидов может содержать (1) последовательность (т.е. только часть полной полинуклеотидной последовательности), которая сходна в двух полинуклеотидах, и (2) последовательность, которая отлична в двух полинуклеотидах, сравнение последовательности двух (или более) полинуклеотидов, как правило, выполняют путем сравнения последовательностей двух полинуклеотидов в «окне сравнения» для выявления и сравнения локальных областей сходства последовательностей. «Окно сравнения» относится к умозрительному сегменту по меньшей мере из 6 смежных положений, обычно от приблизительно 50 до приблизительно 100, чаще от приблизительно 100 до приблизительно 150, в котором последовательность сравнивают с эталонной последовательностью из того же количества смежных положений после того, как две последовательности подвергли оптимальному выравниванию. Окно сравнения может содержать приблизительно 20% или меньше добавлений или делеций (т.е. гэпов) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания в окне сравнения можно проводить с помощью компьютеризированной реализации алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics версия 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мэдисон, Висконсин, США) или посредством просмотра наилучшего выравнивания (т.е. приводящего к наиболее высокому процентному значению гомологии в окне сравнения), полученному с помощью любого из различных выбранных способов. Также можно упомянуть семейство программ BLAST, например, раскрытое в Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Подробное обсуждение анализа последовательностей можно найти в разделе 19.3 в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению, независимо от длины кодирующей последовательности как таковой, можно объединять с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы и/или энхансеры, нетранслируемые области (UTR), последовательности Козак, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты для ферментов рестрикции, множественные сайты клонирования, сайты внутренней посадки рибосомы (IRES), сайты распознавания рекомбиназ (например, сайты LoxP, FRT и Att), стоп-кодоны, сигналы терминации транскрипции и полинуклеотиды, кодирующие саморасщепляющиеся полипептиды, эпитопные метки, как описано в других частях данного документа или как известно из уровня техники, так что их общая длина может значительно изменяться. В связи с этим предполагается, что может быть использован полинуклеотидный фрагмент практически любой длины, при этом общая длина предпочтительно ограничивается простотой получения и применения в предполагаемом протоколе рекомбинантной ДНК.

Полинуклеотиды могут быть получены, подвергнуты манипуляциям и/или экспрессированы с помощью любой из множества хорошо отработанных методик, известных и доступных из уровня техники. Чтобы экспрессировать требуемый полипептид, нуклеотидная последовательность, кодирующая данный полипептид, может быть встроена в соответствующий вектор. Примерами векторов являются плазмиды, автономно реплицирующиеся последовательности и мобильные генетические элементы. Дополнительные примеры векторов включают без ограничений плазмиды, фагмиды, космиды, искусственные хромосомы, такие как дрожжевая искусственная хромосома (YAC), бактериальная искусственная хромосома (BAC) или искусственная хромосома, полученная из P1 (PAC), бактериофаги, такие как фаг лямбда или фаг M13, а также вирусы животных. Примеры категорий вирусов животных, применимых в качестве векторов, включают без ограничений ретровирус (в том числе лентивирус), аденовирус, аденоассоциированный вирус, герпесвирус (например, вирус простого герпеса), поксвирус, бакуловирус, папилломавирус и паповавирус (например, SV40). Примерами векторов экспрессии являются векторы pClneo (Promega) для экспрессии в клетках млекопитающих; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ и pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) для опосредованного лентивирусами переноса генов и экспрессии в клетках млекопитающих. В конкретных вариантах осуществления кодирующие последовательности химерных белков, раскрытые в данном документе, могут быть лигированы в такие векторы экспрессии для экспрессии химерного белка в клетках млекопитающих.

«Элементы контроля» или «регуляторные последовательности», присутствующие в векторе экспрессии, представляют собой такие нетранслируемые области вектора - точку начала репликации, кассеты для отбора, промоторы, энхансеры, сигналы инициации трансляции (последовательность Shine Dalgarno или последовательность Козак), интроны, последовательность полиаденилирования, 5' и 3'-нетранслируемые области-которые взаимодействуют с клеточными белками хозяина для осуществления транскрипции и трансляции. Такие элементы могут различаться по своей силе и специфичности. В зависимости от используемых векторной системы и хозяина можно использовать любое число подходящих элементов транскрипции и трансляции, в том числе универсальные промоторы и индуцируемые промоторы.

В конкретных вариантах осуществления вектор для применения при осуществлении настоящего изобретения на практике, в том числе без ограничения векторы экспрессии и вирусные векторы, будет включать экзогенные, эндогенные или гетерологичные последовательности контроля, такие как промоторы и/или энхансеры. «Эндогенная» последовательность контроля представляет собой последовательность, которая в природных условиях связана с данным геном в геноме. «Экзогенная» последовательность контроля представляет собой последовательность, которая помещена в непосредственное соседство с геном при помощи манипуляции с генами (т.е. методик молекулярной биологии), так что транскрипция данного гена обусловлена связанным энхансером/промотором. «Гетерологичная» последовательность контроля представляет собой экзогенную последовательность, которая происходит от иного вида, чем клетка, подвергаемая генетическим манипуляциям.

Термин «промотор», используемый в данном документе, относится к сайту распознавания полинуклеотида (ДНК или РНК), с которым связывается РНК-полимераза. РНК-полимераза инициирует и транскрибирует полинуклеотиды, функционально связанные с промотором. В конкретных вариантах осуществления промоторы, активные в клетках млекопитающих, содержат AT-богатую область, расположенную примерно на 25-30 оснований выше сайта инициации транскрипции, и/или другую последовательность, расположенную на 70-80 оснований выше начала транскрипции, область CNCAAT, где N может представлять собой любой нуклеотид.

Термин «энхансер» относится к сегменту ДНК, который содержит последовательности, способные обеспечивать усиленную транскрипцию и, в некоторых случаях, способные функционировать независимо от их ориентации относительно другой последовательности контроля. Энхансер может функционировать совместно или аддитивно с промоторами и/или другими энхансерными элементами. Термин «промотор/энхансер» относится к сегменту ДНК, который содержит последовательности, способные обеспечивать как промоторные, так и энхансерные функции.

Термин «функционально связанный» относится к непосредственному соседству, при котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать надлежащим им образом. В одном варианте осуществления термин относится к функциональной связи между последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты (такой как промотор и/или энхансер) и второй полинуклеотидной последовательностью, например, полинуклеотидом, представляющим интерес, где последовательность контроля экспрессии обеспечивает транскрипцию нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности.

Используемый в данном документе термин «последовательность контроля конститутивной экспрессии» относится к промотору, энхансеру или промотору/энхансеру, который непрерывно или постоянно обеспечивает возможность транскрипции функционально связанной последовательности. Последовательность контроля конститутивной экспрессии может представлять собой «универсальный» промотор, энхансер или промотор/энхансер, который обеспечивает возможность экспрессии в самых различных типах клеток и тканей, или «специфический в отношении клетки», «специфический в отношении типа клеток», «специфический в отношении линии клеток» или «специфический в отношении ткани» промотор, энхансер или промотор/энхансер, который обеспечивает возможность экспрессии в ограниченном количестве типов клеток и тканей, соответственно.

Иллюстративные универсальные последовательности контроля экспрессии, подходящие для применения в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, включают без ограничений немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV), вирусный промотор вируса обезьян 40 (SV40) (например, ранний или поздний), LTR-промотор вируса мышиного лейкоза Молони (MoMLV), LTR вирус саркомы Рауса (RSV), промотор вируса простого герпеса (HSV) (тимидинкиназа), H5, P7.5, а также P11-промоторы вируса коровьей оспы, промотор фактора элонгации 1-альфа (EF1a), фактор раннего ростового ответа 1 (EGR1), ферритин H (FerH), ферритин L (FerL), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH), фактор инициации трансляции эукариот 4A1 (EIF4A1), 70 кДа белок теплового шока 5 (HSPA5), 90 кДа белок теплового шока бета, представитель 1 (HSP90B1), 70 кДа белок теплового шока (HSP70), β-кинезин (β-KIN), локус ROSA 26 человека (Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), промотор убиквитина C (UBC), промотор фосфоглицераткиназы-1 (PGK), промотор из энхансера цитомегаловируса/промотора куриного β-актина (CAG), промотор β-актина и промотор (MND) с энхансером вируса миелопролиферативной саркомы мышей, с удаленным участком отрицательного контроля, с замещенным сайтом связывания праймера на последовательность из dl587rev (Challita et al., J Virol. 69(2):748-55 (1995)).

В конкретном варианте осуществления может быть необходима экспрессия полинуклеотида, содержащего разработанный TCR или CAR, за счет промотора, который обеспечивает стабильную и долгосрочную экспрессию в Т-клетках и на уровне, достаточном для перенаправления Т-клеток на клетки, экспрессирующие целевой антиген. В предпочтительном варианте осуществления промотор представляет собой промотор EF1α или MND-промотор.

Используемая в данном документе «условная экспрессия» может относиться к любому типу условной экспрессии, в том числе без ограничений индуцируемой экспрессии; репрессируемой экспрессии; экспрессии в клетках или тканях, характеризующихся конкретным физиологическим, биологическим или болезненным состоянием и т.д. Данное определение не предназначено для исключения специфической в отношении типа клеток или ткани экспрессии. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрена условная экспрессия полинуклеотида, представляющего интерес, например, экспрессия контролируется путем воздействия на клетку, ткань, организм и т.., с помощью средства обработки или условия, которые вызывают экспрессию полинуклеотида или которые вызывают повышение или понижение уровня экспрессии полинуклеотида, кодируемого полинуклеотидом, представляющим интерес.

Иллюстративные примеры индуцируемых промоторов/систем включают без ограничений промоторы, индуцируемые стероидами, такие как промоторы генов, кодирующих глюкокортикоидные или эстрогеновые рецепторы (индуцируемые путем обработки соответствующим гормоном), металлотиониновый промотор (индуцируемый путем обработки различными тяжелыми металлами), MX-1-промотор (индуцируемый интерфероном), мифепристон-регулируемая система «GeneSwitch» (Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), кумат-индуцируемый генный переключатель (WO 2002/088346), тетрациклин-зависимые регуляторные системы и т.д.

Условную экспрессию также можно обеспечить с помощью сайт-специфической ДНК-рекомбиназы. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения вектор содержит по меньшей мере один (как правило, два) сайт(-а) для рекомбинации, опосредованной сайт-специфической рекомбиназой. Используемые в данном документе термины «рекомбиназа» или «сайт-специфическая рекомбиназа» включают вырезающие или интегративные белки, ферменты, кофакторы или ассоциированные белки, которые вовлекаются в реакции рекомбинации с участием одного или более сайтов рекомбинации (например, двух, трех, четырех, пяти, семи, десяти, двенадцати, пятнадцати, двадцати, тридцати, пятидесяти и т.д.), которые могут быть белками дикого типа (см. Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)) или их мутантами, производными (например, белками слияния, содержащими последовательности белка рекомбинации или их фрагменты), фрагментами и вариантами. Иллюстративные примеры рекомбиназ, подходящих для применения в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, включают без ограничения Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ФC31, Cin, Tn3-резольвазу, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 и ParA.

G. Вирусные векторы

В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток, содержащую T-клетки, например, PBMC, или очищенную популяцию T-клеток трансдуцируют с помощью ретровирусного вектора, например, лентивирусного вектора, кодирующего разработанный TCR или CAR, рассматриваемый в данном документе. Трансдуцированные T-клетки вызывают стабильный, долгосрочный и стойкий T-клеточный ответ.

Используемый в данном документе термин «ретровирус» относится к РНК-вирусу, который обратно транскрибирует свою геномную РНК в линейную двухнитевую ДНК-копию, а затем ковалентно интегрирует свою геномную ДНК в геном хозяина. Иллюстративные ретровирусы, подходящие для применения в конкретных вариантах осуществления, включают без ограничений: вирус мышиного лейкоза Молони (M-MuLV), вирус саркомы мышей Молони (MoMSV), вирус саркомы мышей Харви (HaMuSV), вирус опухоли молочной железы мышей (MuMTV), вирус лейкоза гиббонов (GaLV), вирус лейкоза кошек (FLV), спумавирус, вирус лейкоза мышей Френда, вирус стволовых клеток мышей (MSCV), вирус саркомы Рауса (RSV) и лентивирус.

Используемый в данном документе термин «лентивирус» относится к группе (или роду) сложных ретровирусов. Иллюстративные лентивирусы включают без ограничений: HIV (вирус иммунодефицита человека; в том числе HIV 1 типа и HIV 2 типа); вирус висна-маэди (VMV); вирус артроэнцефалита козлов (CAEV); вирус инфекционной анемии у лошадей (EIAV); вирус иммунодефицита кошек (FIV); вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV) и вирус иммунодефицита обезьян (SIV). В одном варианте осуществления предпочтительными являются векторные остовы на основе HIV (т. е. цис-действующие элементы последовательности HIV).

Используемый в данном документе термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить или транспортировать другую молекулу нуклеиновой кислоты. Переносимая нуклеиновая кислота обычно связана с векторной молекулой нуклеиновой кислоты, например, вставлена в нее. Вектор может содержать последовательности, которые управляют автономной репликацией в клетке, или может содержать последовательности, достаточные для обеспечения интеграции в ДНК клетки-хозяина. Применимые векторы включают, например, плазмиды (например, ДНК-плазмиды или РНК-плазмиды), транспозоны, космиды, бактериальные искусственные хромосомы и вирусные векторы. Применимые вирусные векторы включают, например, ретровирусы с дефектной системой репликации и лентивирусы.

Как будет очевидно специалисту в данной области, термин «вирусный вектор» широко используется для обозначения либо молекулы нуклеиновой кислоты (например, плазмиды-переносчика), которая включает элементы, происходящие из нуклеиновой кислоты вируса, которые, как правило, облегчают перенос молекулы нуклеиновой кислоты или ее интеграцию в геном клетки, либо вирусной частицы, которая опосредует перенос нуклеиновой кислоты. Вирусные частицы, как правило, будут включать различные вирусные компоненты и иногда также компоненты клетки-хозяина в дополнение к нуклеиновой кислоте(-ам).

Термин «вирусный вектор» может относиться либо к вирусу или вирусной частице, способным переносить нуклеиновую кислоту в клетку, либо к самой переносимой нуклеиновой кислоте. Вирусные векторы и плазмиды-переносчики содержат структурные и/или функциональные генетические элементы, которые происходят преимущественно из вируса. Термин «ретровирусный вектор» относится к вирусному вектору или плазмиде, содержащим структурные или функциональные генетические элементы или их части, которые происходят преимущественно из ретровируса. Термин «лентивирусный вектор» относится к вирусному вектору или плазмиде, содержащим структурные или функциональные генетические элементы или их части, в том числе LTR, которые происходят преимущественно из лентивируса. Термин «гибридный вектор» относится к вектору, LTR или другой нуклеиновой кислоте, содержащим как ретровирусные например, лентивирусные, последовательности, так и вирусные последовательности, не являющиеся лентивирусными. В одном варианте осуществления гибридный вектор относится к вектору или плазмиде-переносчику, содержащим ретровирусные, например, лентивирусные, последовательности для обратной транскрипции, репликации, интеграции и/или упаковки.

В конкретных вариантах осуществления термины «лентивирусный вектор», «лентивирусный вектор экспрессии» могут использоваться в отношении лентивирусных плазмид-переносчиков и/или инфекционных лентивирусных частиц. Если в данном документе ссылаются на элементы, такие как сайты клонирования, промоторы, регуляторные элементы, гетерологичные нуклеиновые кислоты и т.д., следует понимать, что последовательности таких элементов представлены в форме РНК в лентивирусных частицах по настоящему изобретению и представлены в форме ДНК в ДНК-плазмидах по настоящему изобретению.

На каждом конце провируса находятся структуры, называемые «длинными концевыми повторами» или «LTR». Термин «длинный концевой повтор (LTR)» относится к доменам из пар оснований, расположенных на концах ретровирусных ДНК, которые в контексте их природных последовательностей представляют собой прямые повторы и содержат области U3, R и U5. LTR, как правило, обеспечивают функции, существенные для экспрессии ретровирусных генов (например, индукции, инициации и полиаденилирования генных транскриптов) и для репликации вируса. LTR содержит множество регуляторных сигналов, в том числе элементы контроля транскрипции, сигналы полиаденилирования и последовательности, необходимые для репликации и интеграции вирусного генома. Вирусный LTR разделен на три области, называемые U3, R и U5. U3-область содержит энхансерные и промоторные элементы. U5-область представляет собой последовательность между сайтом связывания праймера и R-областью и содержит последовательность полиаденилирования. R (повтор)-область фланкирована U3- и U5-областями. LTR состоит из U3-, R- и U5-областей и встречается на обоих 5'- и 3'-концах вирусного генома. Рядом с 5' LTR находятся последовательности, необходимые для обратной транскрипции генома (сайт связывания праймера тРНК) и для эффективной упаковки вирусной РНК в частицы (Psi-сайт).

Используемый в данном документе термин «сигнал упаковки» или «последовательность упаковки» относится к последовательностям, расположенным в пределах ретровирусного генома, которые необходимы для вставки вирусной РНК в вирусный капсид или частицу, см., например, Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109. В некоторых ретровирусных векторах используется минимальный сигнал упаковки (также называемый psi [ψ]-последовательность), необходимый для заключения вирусного генома в капсид. Таким образом, используемые в данном документе термины «последовательность упаковки», «сигнал упаковки», «psi» и символ «ψ» применяются в отношении некодирующей последовательности, необходимой для заключения ретровирусных нитей РНК в капсид во время сборки вирусной частицы.

В различных вариантах осуществления векторы содержат модифицированные 5' LTR и/или 3' LTR. Каждый или оба LTR могут содержать одну или более модификаций, в том числе без ограничений одну или более делеций, вставок или замен. Зачастую модификации в 3' LTR осуществляют для повышения безопасности лентивирусных или ретровирусных систем, путем придания вирусам дефектности по репликации. Используемый в данном документе термин «дефектный по репликации» относится к вирусу, который не способен к полноценной, эффективной репликации, так что не происходит образования инфекционных вирионов (например, дефектное по репликации лентивирусное потомство). Термин «компетентный по репликации» относится к вирусу дикого типа или мутантному вирусу, который способен к репликации, так что вирусная репликация вируса приводит к образованию инфекционных вирионов (например, компетентное по репликации лентивирусное потомство).

Термин «самоинактивирующиеся» (SIN) векторы относится к дефектным по репликации векторам, например, ретровирусным или лентивирусным векторам, в которых область энхансер-промотор правого (3') LTR, известная как U3-область, была модифицирована (например, посредством делеции или замены) для предотвращения вирусной транскрипции после первого цикла вирусной репликации. Это происходит потому, что во время вирусной репликации U3-область правого (3') LTR используется как шаблон для U3-области левого (5') LTR, и, таким образом, вирусный транскрипт не может быть получен без энхансера-промотора в U3. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения модифицируют 3' LTR, так что U5-область замещена, например, идеальной последовательностью поли-(A). Следует отметить, что модификации LTR, такие как модификации 3' LTR, 5' LTR, или как 3', так и 5' LTR, также включены в объем настоящего изобретения.

Дополнительное усиление безопасности обеспечивают замещением U3-области 5' LTR на гетерологичный промотор для управления транскрипцией вирусного генома во время образования вирусных частиц. Примеры гетерологичных промоторов, которые могут быть использованы, включают, например, вирусный промотор вируса обезьян 40 (SV40) (например, ранний или поздний), промотор цитомегаловируса (CMV) (например, немедленно-ранний), промотор вируса мышиного лейкоза Молони (MoMLV), промотор вируса саркомы Рауса (RSV) и промотор вируса простого герпеса (HSV) (тимидинкиназа). Типичные промоторы способны обеспечивать высокие уровни транскрипции Tat-независимым образом. Такое замещение снижает возможность рекомбинации с получением компетентных по репликации вирусов, поскольку в системе продукции вируса отсутствует полная последовательность U3. В определенных вариантах осуществления гетерологичный промотор имеет дополнительные преимущества в контроле способа, посредством которого транскрибируется вирусный геном. Например, гетерологичный промотор может быть индуцируемым, так что транскрипция всего или части вирусного генома будет происходить только в присутствии индуцирующих факторов. Индуцирующие факторы включают без ограничений одно или более химических соединений или физиологических условий, таких как температура или pH, при которых культивируются клетки-хозяева.

В некоторых вариантах осуществления вирусные векторы содержат элемент TAR. Термин «TAR» относится к генетическому элементу «трансактивационного ответа», расположенному в R-области лентивирусных (например, HIV) LTR. Данный элемент взаимодействует с лентивирусным трансактиваторным (tat) генетическим элементом для усиления вирусной репликации. Однако данный элемент не является необходимым в вариантах осуществления, где U3-область 5' LTR замещена на гетерологичный промотор.

«R-область» относится к области в пределах ретровирусных LTR, начинающейся от начала кэпирующей группы (т.е. точки начала транскрипции) и заканчивающейся непосредственно перед началом поли-А-тракта. R-область также определяют как фланкированную U3- и U5-областями. R-область играет важную роль во время обратной транскрипции, обеспечивая перенос растущей нити ДНК от одного конца генома к другому.

Используемый в данном документе термин «FLAP-элемент» относится к нуклеиновой кислоте, последовательность которой содержит центральный полипуриновый тракт и центральные последовательности терминации (cPPT и CTS) ретровируса, например, HIV-1 или HIV-2. Подходящие FLAP-элементы описаны в патенте США № 6682907 и в Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173. Во время обратной транскрипции HIV-1 центральная инициация плюс-нити ДНК в центральном полипуриновом тракте (cPPT) и центральная терминация в центральной последовательности терминации (CTS) приводит к образованию трехнитевой ДНК-структуры: центрального ДНК-флэпа HIV-1. Без желания быть связанными какой-либо теорией, ДНК-флэп может действовать как цис-активная детерминанта ядерного импорта лентивирусного генома и/или может повышать титр вируса. В конкретных вариантах осуществления ретровирусный или лентивирусный векторные остовы содержат один или более FLAP-элементов, расположенных в векторах выше или ниже гетерологичных генов, представляющих интерес. Например, в конкретных вариантах осуществления плазмида-переносчик содержит FLAP-элемент. В одном варианте осуществления вектор по настоящему изобретению содержит FLAP-элемент, выделенный из HIV-1.

В одном варианте осуществления ретровирусные или лентивирусные векторы-переносчики содержат один или более экспортных элементов. Термин «экспортный элемент» относится к цис-действующему посттранскрипционному регуляторному элементу, который регулирует транспорт РНК-транскрипта из ядра в цитоплазму клетки. Примеры РНК-экспортных элементов включают без ограничений элемент rev-ответа (RRE) вируса иммунодефицита человека (HIV) (см., например, Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; и Cullen et al., 1991. Cell 58: 423) и посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита В (HPRE). Как правило, РНК-экспортный элемент расположен в пределах 3' UTR гена и может быть встроен в виде одной или множественных копий.

В конкретных вариантах осуществления экспрессию гетерологичных последовательностей в вирусных векторах повышают посредством внедрения в векторы посттранскрипционных регуляторных элементов, эффективных сайтов полиаденилирования и, необязательно, сигналов терминации транскрипции. Разнообразные посттранскрипционные регуляторные элементы могут увеличивать экспрессию гетерологичной нуклеиновой кислоты в белок, например, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886); посттранскрипционный регуляторный элемент, присутствующий в вирусе гепатита В (HPRE) (Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864); и подобные (Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766). В конкретных вариантах осуществления векторы по настоящему изобретению содержат посттранскрипционный регуляторный элемент, такой как WPRE или HPRE.

В конкретных вариантах осуществления векторы по настоящему изобретению лишены или не содержат посттранскрипционный регуляторный элемент, такой как WPRE или HPRE, поскольку в некоторых случаях такие элементы повышают риск клеточной трансформации и/или не увеличивают в существенной или значительной степени количество мРНК-транскрипта или не повышают стабильность мРНК. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления векторы по настоящему изобретению лишены или не содержат WPRE или HPRE в качестве дополнительной меры безопасности.

Элементы, управляющие эффективной терминацией или полиаденилированием транскриптов гетерологичных нуклеиновых кислот, увеличивают экспрессию гетерологичных генов. Сигналы терминации транскрипции, как правило, находятся ниже сигнала полиаденилирования. В конкретных вариантах осуществления векторы содержат последовательность полиаденилирования за 3′-концом полинуклеотида, кодирующего полипептид, подлежащий экспрессии. Используемый в данном документе термин «сайт поли(А)» или «поли(А)-последовательность» описывает последовательность ДНК, которая управляет как терминацией, так и полиаденилированием растущей нити РНК-транскрипта с помощью РНК-полимеразы II. Последовательности полиаденилирования могут повышать стабильность мРНК путем добавления поли(А)-хвоста к 3'-концу кодирующей последовательности, и тем самым содействуя увеличению эффективности трансляции. Эффективное полиаденилирование рекомбинантного транскрипта необходимо, поскольку транскрипты, лишенные поли(А)-хвоста, являются нестабильными и легко подвергаются деградации. Иллюстративные примеры поли(А)-сигналов, которые могут быть использованы в векторе по настоящему изобретению, включают идеальную поли(A)-последовательность (например, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), поли(A)-последовательность бычьего гормона роста (BGHpA), поли(А)-последовательность β-глобина кролика (rβgpA) или другую подходящую гетерологичную или эндогенную поли(А)-последовательность, известную из уровня техники.

В различных вариантах осуществления векторы по настоящему изобретению содержат промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим полипептид разработанного TCR или CAR. Векторы могут содержать один или более LTR, при этом каждый LTR содержит одну или более модификаций, таких как одна или более нуклеотидных замен, добавлений или делеций. Векторы могут дополнительно содержать один или более вспомогательных элементов для увеличения эффективности трансдукции (например, cPPT/FLAP), упаковки вируса (например, Psi (ψ) сигнал упаковки, RRE) и/или другие элементы, которые повышают экспрессию терапевтического гена (например, поли(A)-последовательности), и могут необязательно содержать WPRE или HPRE. Специалисту в данной области будет понятно, что многие другие различные варианты осуществления могут быть смоделированы на основе существующих вариантов осуществления настоящего изобретения.

«Клетка-хозяин» включает клетки, подвергнутые трансфекции, инфицированию или трансдукции in vivo, ex vivo или in vitro с помощью рекомбинантного вектора или полинуклеотида по настоящему изобретению. Клетки-хозяева могут включать упаковывающие клетки, продуцирующие клетки и клетки, инфицированные вирусными векторами. В конкретных вариантах осуществления клетки-хозяева, инфицированные вирусным вектором по настоящему изобретению, вводят субъекту, нуждающемуся в терапии. В определенных вариантах осуществления термин «целевая клетка» используется взаимозаменяемо с термином «клетка-хозяин» и относится к клеткам требуемого типа, подвергнутым трансфекции, инфицированию или трансдукции. В предпочтительных вариантах осуществления целевая клетка представляет собой Т-клетку.

Для получения приемлемого титра вируса зачастую необходимо крупномасштабное получение вирусных частиц. Вирусные частицы получают посредством трансфекции вектора-переносчика в упаковывающую клеточную линию, которая содержит вирусные структурные и/или вспомогательные гены, например, гены gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx или nef или другие ретровирусные гены.

Используемый в данном документе термин «упаковочный вектор» относится к вектору экспрессии или вирусному вектору, который лишен сигнала упаковки, и содержит полинуклеотид, кодирующий один, два, три, четыре или более вирусных структурных и/или вспомогательных генов. Обычно упаковочные векторы включены в упаковывающую клетку, и их вводят в клетку посредством трансфекции, трансдукции и инфекции. Способы трансфекции, трансдукции и инфекции хорошо известны специалистам в данной области. Ретровирусный/лентивирусный вектор-переносчик по настоящему изобретению может быть введен в упаковывающую клеточную линию посредством трансфекции, трансдукции и инфекции с получением продуцирующей клетки или клеточной линии. Упаковочные векторы по настоящему изобретению могут быть введены в человеческие клетки или клеточные линии с помощью стандартных способов, в том числе, например, трансфекции с использованием фосфата кальция, липофекции или электропорации. В некоторых вариантах осуществления упаковочные векторы вводят в клетки совместно с доминантным селектируемым маркером, таким как неомицин, гигромицин, пуромицин, бластоцидин, зеоцин, тимидинкиназа, DHFR, глутаминсинтетаза или ADA, с последующей селекцией в присутствии соответствующего лекарственного средства и выделением клонов. Ген селектируемого маркера может быть физически связан с генами, закодированными в упаковочном векторе, например, посредством IRES или саморасщепляющихся вирусных пептидов.

Белки вирусной оболочки (env) определяют диапазон клеток-хозяев, которые в конечном итоге могут быть инфицированы и трансформированы посредством рекомбинантных ретровирусов, полученных из клеточных линий. В случае лентивирусов, таких как HIV-1, HIV-2, SIV, FIV и EIV, белки env включают gp41 и gp120. Предпочтительно вирусные белки env, экспрессируемые упаковывающими клетками по настоящему изобретению, закодированы в отдельном векторе из вирусных генов gag и pol, как было ранее описано.

Иллюстративные примеры происходящих из ретровирусов генов env, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают без ограничений гены оболочек MLV, оболочки 10A1, оболочек BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, вируса Эбола, вируса Сэндай, FPV (вируса чумы домашней птицы) и вируса гриппа. Аналогично могут быть использованы гены, кодирующие оболочки РНК-вирусов (например, РНК-вирусов из семейств Picornaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae), а также ДНК-вирусов (семейства Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae и Iridoviridae). Типичные примеры включают FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, вирус бешенства, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 и EIAV.

В других вариантах осуществления белки оболочки для псевдотипирования вируса по настоящему изобретению включают без ограничений белки из любого из следующих вирусов: вируса гриппа A, такого как H1N1, H1N2, H3N2 и H5N1 (птичий грипп), вируса гриппа B, вируса гриппа C, вируса гепатита A, вируса гепатита B, вируса гепатита C, вируса гепатита D, вируса гепатита E, ротавируса, любого вируса из группы норовирусов, кишечных аденовирусов, парвовируса, вируса лихорадки Денге, вируса оспы обезьян, вирусов порядка Mononegavirales, лиссавируса, такого как вирус бешенства, вирус летучих мышей острова Лагос, вирус Мокола, вирус Дювенхага, вирус европейских летучих мышей 1 и 2 типа и вирус австралийских летучих мышей, эфемеровируса, везикуловируса, вируса везикулярного стоматита (VSV), герпесвирусов, таких как вирус простого герпеса 1 и 2 типов, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирус герпеса человека (HHV), вирус герпеса человека 6 и 8 типа, вируса иммунодефицита человека (HIV), вируса папилломы, мышиного гаммагерпесвируса, аренавирусов, таких как вирус аргентинской геморрагической лихорадки, вирус боливийской геморрагической лихорадки, вирус Сабиа, ассоциированный с геморрагической лихорадкой, вирус венесуэльской геморрагической лихорадки, вирус лихорадки Ласса, вирус Мачупо, вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), Bunyaviridiae, таких как вирус конго-крымской геморрагической лихорадки, хантивирус, вирус, вызывающий геморрагическую лихорадку с почечным синдромом, вирус лихорадки Рифт-Валли, Filoviridae (филовирус), в том числе вируса геморрагической лихорадки Эбола и геморрагической лихорадки Марбург, Flaviviridae, в том числе вирус киасанурской лесной болезни, вирус омской геморрагической лихорадки, вирус, вызывающий клещевой энцефалит, и Paramyxoviridae, таких как вирус Хендра и вирус Нипах, вирусы Variola major и Variola minor (вирусы натуральной оспы), альфавирусов, таких как вирус венесуэльского энцефалита лошадей, вирус восточного энцефалита лошадей, вирус западного энцефалита лошадей, SARS-ассоциированного коронавируса (SARS-CoV), вируса Западного Нила и любого вируса, вызывающего энцефалит.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены упаковывающие клетки, которые продуцируют рекомбинантный ретровирус, например, лентивирус, псевдотипированный с помощью гликопротеина VSV-G.

Используемые в данном документе термины «псевдотипировать» или «псевдотипирование» относятся к вирусу, белки оболочки которого были замещены на белки другого вируса, обладающего предпочтительными характеристиками. Например, HIV может быть псевдотипирован с помощью белков оболочки, представляющих собой G-белок вируса везикулярного стоматита (VSV-G), который обеспечивает возможность HIV инфицировать более широкий спектр клеток, поскольку белки оболочки HIV (кодируемые геном env) в норме нацеливают вирус на CD4+ клетки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения белки оболочки лентивируса псевдотипированы с помощью VSV-G. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены упаковывающие клетки, которые продуцируют рекомбинантный ретровирус, например, лентивирус, псевдотипированный с помощью гликопротеина оболочки VSV-G.

Используемый в данном документе термин «упаковывающие клеточные линии» применяют при ссылке на клеточные линии, которые не содержат сигнал упаковки, но при этом стабильно или транзиентно экспрессируют вирусные структурные белки и ферменты репликации (например, gag, pol и env), которые необходимы для правильной упаковки вирусных частиц. Для получения упаковывающих клеток по настоящему изобретению можно использовать любую подходящую клеточную линию. Как правило, указанные клетки являются клетками млекопитающих. В конкретном варианте осуществления клетки, используемые для получения упаковывающей клеточной линии, являются человеческими клетками. Подходящие клеточные линии, которые можно использовать, включают, например, клетки CHO, клетки BHK, клетки MDCK, клетки C3H 10T1/2, клетки FLY, клетки Psi-2, клетки BOSC 23, клетки PA317, клетки WEHI, клетки COS, клетки BSC 1, клетки BSC 40, клетки BMT 10, клетки VERO, клетки W138, клетки MRC5, клетки A549, клетки HT1080, клетки 293, клетки 293Т, клетки B-50, клетки 3T3, клетки NIH3T3, клетки HepG2, клетки Saos-2, клетки Huh7, клетки HeLa, клетки W163, клетки 211 и клетки 211A. В предпочтительных вариантах осуществления упаковывающие клетки представляют собой клетки 293, клетки 293Т или клетки A549.

Используемый в данном документе термин «продуцирующая клеточная линия» относится к клеточной линии, которая способна продуцировать рекомбинантные ретровирусные частицы, содержащая упаковывающую клеточную линию и конструкцию вектора-переносчика, содержащую сигнал упаковки. Продукцию инфекционных вирусных частиц и исходных растворов вируса можно выполнять с применением традиционных методик. Способы получения исходных растворов вируса известны из уровня техники и проиллюстрированы, например, в Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, и N. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113. Инфекционные вирусные частицы можно собирать из упаковывающих клеток с применением традиционных методик. Например, инфекционные частицы можно собирать при помощи лизиса клеток и сбора супернатанта культуры клеток, как известно из уровня техники. В случае необходимости собранные вирусные частицы необязательно могут быть очищены. Подходящие методики очистки хорошо известны специалистам в данной области.

Доставка гена(ов) или другой полинуклеотидной последовательности с применением ретровирусного или лентивирусного вектора посредством вирусной инфекции, а не трансфекции, называется «трансдукцией». В одном варианте осуществления ретровирусные векторы трансдуцируют в клетку посредством инфекции и интеграции провируса. В определенных вариантах осуществления целевая клетка, например, Т-клетка, является «трансдуцированной», если она содержит ген или другую полинуклеотидную последовательность, доставленную в клетку посредством инфекции с помощью вирусного или ретровирусного вектора. В конкретных вариантах осуществления трансдуцированная клетка содержит один или более генов или других полинуклеотидных последовательностей, доставленных в клеточный геном с помощью ретровирусного или лентивирусного вектора.

В конкретных вариантах осуществления клетки-хозяева, трансдуцированные вирусным вектором по настоящему изобретению, который экспрессирует один или более полипептидов, вводят субъекту для лечения и/или предупреждения B-клеточного новообразования. Другие способы, связанные с применением вирусных векторов в генной терапии, которые могут быть использованы в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, описаны, например, в Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; и Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8.

H. Композиции и составы

Композиции, рассмотренные в данном документе, могут содержать один или более полипептидов, полинуклеотидов, содержащих их векторов и композиций на основе T-клеток, рассматриваемых в данном документе. Композиции включают без ограничений фармацевтические композиции. «Фармацевтической композицией» называют композицию, составленную в фармацевтически приемлемых или физиологически приемлемых растворах для введения в клетку или животному либо отдельно, либо в комбинации с одним или более иными видами терапии. Следует также иметь в виду, что, при желании, композиции по настоящему изобретению можно также вводить в комбинации с другими средствами, такими как, например, цитокины, факторы роста, гормоны, малые молекулы, химиотерапевтические средства, пролекарства, лекарственные средства, антитела или другие различные фармацевтически активные средства. Для других компонентов, которые также можно включать в композиции, практически не существует ограничений, при условии, что дополнительные средства не оказывают отрицательного влияния на способность композиции доставлять предусмотренное терапевтическое средство.

Фраза «фармацевтически приемлемый» используется в данном документе для обозначения тех соединений, материалов, композиций и/или готовых лекарственных форм, которые, в рамках медицинских показаний, пригодны для применения в контакте с тканями человека и животных, при этом не вызывают чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, соизмеримых с приемлемым соотношением польза/риск.

Используемый в настоящем документе «фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель» включает без ограничений адъювант, носитель, наполнитель, скользящее средство, подсластитель, разбавитель, консервант, краситель/окрашивающее средство, усилитель вкуса и запаха, поверхностно-активное вещество, смачивающее средство, диспергирующее средство, суспендирующее средство, стабилизатор, изотоническое средство, растворитель, поверхностно-активное вещество или эмульгатор, который был одобрен Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США как пригодный для применения у человека или домашних животных. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают без ограничений сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; трагакант; солод; желатин; тальк; масло какао, воски, животные и растительные жиры, парафины, силиконы, бентониты, кремниевую кислоту, окись цинка; масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; многоатомные спирты, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные средства, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновую кислоту; апирогенную воду; изотонический солевой раствор; раствор Рингера; этиловый спирт; фосфатные буферные растворы и любые другие совместимые вещества, используемые в фармацевтических составах.

В конкретных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат некоторое количество модифицированных T-клеток, полученных с помощью способов, рассмотренных в данном документе. В целом можно указать, что фармацевтическую композицию, содержащую Т-клетки, полученные с помощью способов, рассмотренных в данном документе, можно вводить в дозе 10²-10¹⁰ клеток/кг массы тела, предпочтительно 10⁵-10⁶ клеток/кг массы тела, включая все целые значения в пределах этих диапазонов. Количество клеток будет зависеть от способа конечного применения, для которого предназначена данная композиция, а также от типа клеток, включенных в нее. Для способов применений, предусмотренных в данном документе, количество клеток на литр объема или менее, может составлять 500 мл или менее, даже 250 мл или 100 мл или менее. Следовательно, плотность требуемых клеток, как правило, превышает 10⁶ клеток/мл и обычно превышает 10⁷ клеток/мл, как правило, составляет 10⁸ клеток/мл или больше. Клинически значимое количество иммунных клеток можно распределить на несколько инфузий, которые совокупно равны или превышают 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² клеток. Клетки могут быть аллогенными, сингенными, ксеногенными или аутологичными относительно пациента, проходящего лечение. При необходимости для усиления приживления и функции инфузированных T-клеток лечение может также включать введение митогенов (например, PHA) или лимфокинов, цитокинов и/или хемокинов (например, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, TNF-альфа, IL-18 и TNF-бета, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α и т.д.), описываемых в данном документе.

Как правило, композиции, содержащие клетки, активированные и размноженные, как описано в данном документе, можно использовать в лечении и предупреждении заболеваний, которые возникают у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. В частности, композиции, содержащие модифицированные Т-клетки, полученные с помощью способов, рассмотренных в данном документе, применяют в лечении рака. Модифицированные Т-клетки по настоящему изобретению можно вводить либо отдельно, либо в виде фармацевтической композиции в комбинации с носителями, разбавителями, наполнителями и/или с другими компонентами, такими как IL-2, IL-7 и/или IL-15, или другие цитокины или популяции клеток. В конкретных вариантах осуществления фармацевтические композиции, рассмотренные в данном документе, содержат некоторое количество генетически модифицированных Т-клеток в комбинации с одним или более фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями.

Фармацевтические композиции, содержащие модифицированные Т-клетки, рассмотренные в данном документе, могут дополнительно содержать буферы, такие как нейтральный забуференный солевой раствор, фосфатный буферный солевой раствор и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатирующие средства, такие как ЭДТА или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия) и консерванты. Композиции по настоящему изобретению предпочтительно составлены для парентерального введения, например, внутрисосудистого (внутривенного или внутриартериального), внутрибрюшинного или внутримышечного введения.

В одном варианте осуществления композиции вводят внутривенно.

Жидкие фармацевтические композиции, будь-то растворы, суспензии или другие аналогичные формы, могут включать одно или более из следующего: DMSO, стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, солевой раствор, предпочтительно физиологический раствор, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия, нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить в качестве растворителя или суспендирующей среды, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза.

В конкретных вариантах осуществления клетки замораживают в инфузируемой криогенной среде, 50% Plasmalyte и 50% Cryostor 10; 50/40/10 (XVIVO/HABS/DMSO) или Cryostor 10.

Препарат для парентерального введения может быть заключен в стеклянных или пластиковых пакетах, ампулах, одноразовых шприцах или флаконах с многократными дозами. Инъецируемая фармацевтическая композиция предпочтительно является стерильной.

В конкретном варианте осуществления композиции, рассмотренные в данном документе, содержат эффективное количество композиции на основе размноженных модифицированных T-клеток отдельно или в комбинации с одним или более терапевтическими средствами. Таким образом, композиции на основе T-клеток можно вводить отдельно или в комбинации с другими известными способами лечения рака, такими как лучевая терапия, химиотерапия, трансплантация, иммунотерапия, гормональная терапия, фотодинамическая терапия и т.д. Композиции также можно вводить в комбинации с антибиотиками. Такие терапевтические средства могут быть приняты в данной области техники в качестве стандартного лечения конкретного болезненного состояния, описанного в данном документе, такого как конкретная форма рака. Примеры предусмотренных терапевтических средств включают цитокины, факторы роста, стероиды, NSAID, DMARD, противовоспалительные средства, химиотерапевтические средства, радиотерапевтические средства, терапевтические антитела или другие активные и вспомогательные средства.

В определенных вариантах осуществления композиции, содержащие T-клетки, рассмотренные в данном документе, можно вводить в сочетании с любым количеством химиотерапевтических средств. Иллюстративные примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN™); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, в том числе алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламиновую смолу; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамин оксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, антрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихемицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции коры надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; добавку для восполнения фолиевой кислоты, такую как фолиниевая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновую кислоту; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатрексат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элформитин; эллиптиниума ацетат; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2, 2',2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-C»); циклофосфамид; тиотепу; таксоиды, например, паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, Нью-Джерси) и доксетаксел (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Антони, Франция); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид; ифосфамид; митомицин C; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навельбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; CPT-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметиломитин (DMFO); производные ретиноевой кислоты, такие как Targretin™ (бексаротен), Panretin™ (алитретиноин); ONTAK™ (денилейкин дифтитокс); эсперамицины; капецитабин; а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеуказанного. Также в это определение включены антигормональные средства, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, включающие, например, тамоксифен, ралоксифен, 4(5)-имидазолы, ингибирующие ароматазу, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (Фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеуказанного.

Целый ряд других терапевтических средств можно использовать в сочетании с композициями, описанными в данном документе. В одном варианте осуществления композицию, содержащую T-клетки, вводят с противовоспалительным средством. Противовоспалительные средства или препараты включают без ограничений стероиды и глюкокортикоиды (в том числе бетаметазон, будесонид, дексаметазон, гидрокортизона ацетат, гидрокортизон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон, триамцинолон), нестероидные противовоспалительные средства (NSAIDS), в том числе аспирин, ибупрофен, напроксен, метотрексат, сульфасалазин, лефлуномид, лекарственные препараты против TNF, циклофосфамид и микофенолат.

Другие примеры NSAID выбраны из группы, включающей ибупрофен, напроксен, напроксен-натрий, ингибиторы Cox-2, такие как VIOXX® (рофекоксиб) и CELEBREX® (целекоксиб) и сиалилаты. Примеры обезболивающих средств выбраны из группы, включающей ацетаминофен, оксикодон, трамадол или пропоксифена гидрохлорид. Примеры глюкокортикоидов выбраны из группы, включающей кортизон, дексаметазон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон или преднизон. Примеры модификаторов биологического ответа включают молекулы, направленные против маркеров клеточной поверхности (например, CD4, CD5 и т.д.), ингибиторы цитокинов, такие как антагонисты TNF (например, этанерцепт (ENBREL®), адалимумаб (HUMIRA®) и инфликсимаб (REMICADE®)), ингибиторы хемокинов и ингибиторы молекул адгезии. Модификаторы биологического ответа включают моноклональные антитела, а также рекомбинантные формы молекул. Примеры DMARD включают азатиоприн, циклофосфамид, циклоспорин, метотрексат, пеницилламин, лефлуномид, сульфасалазин, гидроксихлорохин, препарат золота (пероральный (ауранофин) и внутримышечный) и миноциклин.

Иллюстративные примеры терапевтических антител, пригодных для комбинации с CAR-модифицированными Т-клетками, рассмотренными в данном документе, включают без ограничений абаговомаб, адекатумумаб, афутузумаб, алемтузумаб, альтумомаб, аматуксимаб, анатумомаб, арцитумомаб, бавитуксимаб, бектумомаб, бевацизумаб, биватузумаб, блинатумомаб, брентуксимаб, кантузумаб, катумаксомаб, цетуксимаб, цитатузумаб, циксутумумаб, кливатузумаб, конатумумаб, даратумумаб, дрозитумаб, дулиготумаб, дусигитумаб, детумомаб, дацетузумаб, далотузумаб, эркомексимаб, элотузумаб, энситуксимаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, фариетузумаб, фиклатузумаб, фигитумумаб, фланвотумаб, футуксимаб, ганитумаб, гемтузумаб, гирентуксимаб, глембатумумаб, ибритумомаб, иговомаб, имгатузумаб, индатуксимаб, инотузумаб, интетумумаб, ипилимумаб, иратумумаб, лабетузумаб, лексатумумаб, линтузумаб, лорвотузумаб, лукатумумаб, мапатумумаб, матузумаб, милатузумаб, минретумомаб, митумомаб, моксетумомаб, нарнатумаб, наптумомаб, нецитумумаб, нимотузумаб, нофетумомаб, окаратузумаб, офатумумаб, оларатумаб, онартузумаб, опортузумаб, ореговомаб, панитумумаб, парсатузумаб, партитумаб, пемтумомаб, пертузумаб, пинтумомаб, притумумаб, ракотумомаб, радретумаб, рилотумумаб, ритуксимаб, робатумумаб, сатумомаб, сибротузумаб, силтуксимаб, симтузумаб, солитомаб, такатузумаб, таплитумомаб, тенатумомаб, тепротумумаб, тигатузумаб, тозитумомаб, трастузумаб, тукотузумаб, ублитуксимаб, велтузумаб, ворсетузумаб, вотумумаб, залутумумаб, CC49 и 3F8.

В определенных вариантах осуществления композиции, описанные в данном документе, вводят в сочетании с цитокином. Под используемым в данном документе «цитокином» подразумевают общий термин, обозначающий белки, высвобождаемые одной популяцией клеток, которые действуют на другую клетку как межклеточные медиаторы. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины, хемокины, например, RANTES, MIP1a и традиционные полипептидные гормоны. В число цитокинов включены гормоны роста, такие как человеческий гормон роста, N-метионил человеческий гормон роста и гормон роста крупного рогатого скота; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреостимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста гепатоцитов; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухолей-альфа и -бета; мюллерова ингибирующая субстанция; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (TPO); факторы роста нервов, такие как NGF-бета; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-альфа и TGF-бета; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуцирующие факторы; интерфероны, такие как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), такие как макрофагальный-CSF (M-CSF); гранулоцитарно-макрофагальный-CSF (GM-CSF) и гранулоцитарный-CSF (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1 альфа, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, IL-21, фактор некроза опухолей, такой как TNF-альфа или TNF-бета; и другие полипептидные факторы, в том числе LIF и kit-лиганд (KL). Используемый в данном документе термин «цитокин» включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток, а также биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.

I. Целевые клетки и антигены

В настоящем изобретении предусмотрены, в частности, платформы для производства клеток с получением генетически модифицированных иммунных эффекторных клеток, перенаправленных на целевую клетку, например, на опухолевую или раковую клетку, и которые содержат разработанные T-клеточные рецепторы или CAR со связывающим доменом, который связывается с целевыми антигенами на клетках. Раковые клетки также могут распространяться в другие части организма через кровеносную и лимфатическую системы. Существует несколько основных типов рака. Карцинома представляет собой рак, который начинается в коже или в тканях, выстилающих или покрывающих внутренние органы. Саркома представляет собой рак, который начинается в кости, хряще, жировой ткани, мышечной ткани, кровеносных сосудах или другой соединительной или поддерживающей ткани. Лейкоз представляет собой рак, который начинается в кроветворной ткани, такой как костный мозг, и вызывает появление большого количества аномальных клеток крови и поступление их в кровь. Лимфома и множественная миелома представляют собой формы рака, которые начинаются в клетках иммунной системы. Формы рака центральной нервной системы представляют собой формы рака, которые начинаются в тканях головного и спинного мозга.

В одном варианте осуществления целевая клетка экспрессирует антиген, например, целевой антиген, который практически не встречается на поверхности других нормальных (требуемых) клеток. В одном варианте осуществления целевая клетка представляет собой клетку паренхимы поджелудочной железы, клетку протока поджелудочной железы, клетку печени, клетку миокарда, клетку скелетной мышцы, остеобласт, скелетный миобласт, нейрон, клетку эндотелия сосудов, пигментную клетку, гладкомышечную клетку, глиальную клетку, жировую клетку, остеоцит, хондроцит, клетку панкреатического островка, клетку ЦНС, клетку ПНС, клетку печени, липоцит, клетку почки, клетку легкого, клетку кожи, клетку яичника, фолликулярную клетку, эпителиальную клетку, иммунную клетку или эндотелиальную клетку.

В определенных вариантах осуществления целевая клетка представляет собой часть ткани поджелудочной железы, нервной ткани, ткани сердца, костного мозга, мышечной ткани, костной ткани, кожной ткани, ткани печени, волосяного фолликула, ткани сосудов, жировой ткани, легочной ткани и почечной ткани.

В конкретном варианте осуществления целевая клетка представляет собой опухолевую клетку. В другом конкретном варианте осуществления целевая клетка представляет собой раковую клетку, такую как клетка у пациента с раком. Примеры клеток, которые можно уничтожить при помощи раскрытых способов, включают клетки следующих опухолей: гемобластоза, такого как лейкоз, в том числе острый лейкоз (такой как острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, а также миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный и эритролейкоз), хронические лейкозы (такие как хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз), истинная полицитемия, лимфома, болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома, множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей).

В другом варианте осуществления клетка представляет собой клетку солидной опухоли, такой как формы саркомы или карциномы, фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома и другие саркомы, синовиома, мезотелиома, саркома Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, печеночно-клеточный рак, рак легкого, колоректальный рак, плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак, аденокарцинома (например аденокарцинома поджелудочной железы, толстой кишки, яичника, легкого, молочной железы, желудка, предстательной железы, шейки матки или пищевода), карцинома потовых желез, карцинома сальной железы, папиллярная карцинома, папиллярные аденокарциномы, медуллярная карцинома, бронхогенный рак, почечно-клеточный рак, гепатома, карцинома желчного протока, хориокарцинома, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, карцинома мочевого пузыря, опухоли ЦНС (такие как глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, невринома слухового нерва, олигодендроглиома, менангиома, меланома, нейробластома и ретинобластома).

В одном варианте осуществления рак выбран из группы, включающей опухоль Вильмса, саркому Юинга, нейроэндокринную опухоль, глиобластому, нейробластому, меланому, рака кожи, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак предстательной железы, рак печени, рак почки, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак желчевыводящей системы, рак шейки матки, рак эндометрия, рак пищевода, рак желудка, рак головы и шеи, медуллярный рак щитовидной железы, рак яичника, глиому, лимфому, лейкоз, миелому, острый лимфобластный лейкоз, острый миеологенный лейкоз, хронический лимфолейкоз, хронический миелогенный лейкоз, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому и рак мочевого пузыря.

В одном варианте осуществления целевая клетка представляет собой злокачественную клетку печени, поджелудочной железы, легкого, молочной железы, мочевого пузыря, головной мозга, кости, щитовидной железы, почки, кожи и системы кроветворения. В другом варианте осуществления целевая клетка представляет собой клетку в раке печени, раке поджелудочной железы, раке легкого, раке молочной железы, раке мочевого пузыря, раке головного мозга, раке кости, раке щитовидной железы, раке почки, раке кожи или раке системы кроветворения.

В одном варианте осуществления целевой антиген представляет собой эпитоп фолатного рецептора альфа, 5T4, α_vβ₆-интегрина, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, семейства EGFR, в том числе ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, фетального AchR, FRα, GD2, GD3, 'глипикана-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, лямбда-цепи, Lewis-Y, каппа-цепи, мезотелина, Muc1, Muc16, NCAM, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, сурвивина, TAG72, TEM или VEGFR2.

J. Способы терапии

Модифицированные T-клетки, полученные с помощью способов, рассмотренных в данном документе, обеспечивают улучшенную адоптивную иммунотерапию для применения в лечении различных состояний, в том числе без ограничений рака, инфекционного заболевания, аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания и иммунодефицита. В конкретных вариантах осуществления специфичность первичной Т-клетки перенаправлена на опухолевые или раковые клетки при помощи генетической модификации первичной Т-клетки с помощью разработанного TCR или CAR, рассмотренного в данном документе. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен тип клеточной терапии, при которой Т-клетки модифицируют для экспрессии разработанного TCR или CAR, который нацеливается на раковые клетки, экспрессирующие целевой антиген, и модифицированные Т-клетки вводят реципиенту, нуждающемуся в этом. Введенные клетки способны уничтожить опухолевые клетки в реципиенте. В отличие от терапии на основе антител Т-клетки, модифицированные разработанным TCR или CAR, способны реплицироваться in vivo, что приводит к долгосрочной персистенции, которая может обеспечить длительную терапию рака.

В одном варианте осуществления Т-клетки с разработанным TCR и CAR по настоящему изобретению могут подвергаться активному in vivo размножению Т-клеток и могут персистировать в течение длительного периода времени. В другом варианте осуществления Т-клетки с разработанным TCR или CAR по настоящему изобретению превращаются в специфические Т-клетки памяти, которые могут реактивироваться для ингибирования любого дополнительного образования или роста опухоли.

В конкретных вариантах осуществления композиции, содержащие иммунную эффекторную клетку, генетически модифицированную с помощью вектора, содержащего промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим CAR, применяют при лечении солидных опухолей или форм рака, в том числе без ограничений рака печени, рака поджелудочной железы, рака легкого, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака головного мозга, рака кости, рака щитовидной железы, рака почки или рака кожи.

В конкретных вариантах осуществления композиции, содержащие иммунную эффекторную клетку, генетически модифицированную с помощью вектора, содержащего промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим разработанный TCR или CAR, который содержит антиген-специфический связывающий домен, который связывает эпитоп PSCA или MUC1, применяют при лечении различных форм рака, в том числе без ограничений поджелудочной железы, мочевого пузыря и легкого.

В конкретных вариантах осуществления композиции, содержащие иммунную эффекторную клетку, генетически модифицированную с помощью вектора, содержащего промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим разработанный TCR или CAR, применяют при лечении гемобластозов, в том числе без ограничений лейкоза, в том числе острого лейкоза (например, ALL, AML и миелобластного, промиелоцитарного, миеломоноцитарного, моноцитарного и эритролейкоза), хронических лейкозов (например,CLL, SLL, CML, HCL), истинной полицитемии, лимфомы, болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы, множественной миеломы, макроглобулинемии Вальденстрема и болезни тяжелых цепей.

В конкретных вариантах осуществления композиции, содержащие иммунную эффекторную клетку, генетически модифицированную с помощью вектора, содержащего промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим разработанный TCR или CAR, применяют для лечения В-клеточных новообразований, в том числе без ограничений множественной миеломы (MM), неходжкинской лимфомы (NHL) и хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL).

Множественная миелома представляет собой B-клеточное новообразование с морфологией зрелых плазматических клеток, характеризующееся злокачественным перерождением одного клона этих типов клеток. Эти плазматические клетки пролиферируют в BM и могут инвазировать в прилегающую кость и иногда кровь. Вариантные формы множественной миеломы включают клинически выраженную множественную миелому, вялотекущую множественную миелому, плазмоцитарный лейкоз, несекреторную миелому, IgD-миелому, остеосклеротическую миелому, солитарную плазмацитому кости и экстрамедуллярную плазмацитому (см., например, Braunwald, et al. (eds), Harrison's Principles of Internal Medicine, 15th Edition (McGraw-Hill 2001)).

Неходжкинская лимфома охватывает большую группу форм рака лимфоцитов (белых кровяных клеток). Неходжкинские лимфомы могут возникать в любом возрасте и часто характеризуются увеличенными размерами лимфатических узлов, лихорадкой и потерей веса. Существует множество типов неходжкинской лимфомы. Например, неходжкинскую лимфому можно подразделять на агрессивные (быстрорастущие) и вялотекущие (медленнорастущие) типы. Несмотря на то, что неходжкинские лимфомы могут происходить из В-клеток и Т-клеток, используемые в данном документе термины «неходжкинская лимфома» и «В-клеточная неходжкинская лимфома» используются взаимозаменяемо. В-клеточные неходжкинские лимфомы (NHL) включают лимфому Беркитта, хронический лимфолейкоз/мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (CLL/SLL), диффузную В-крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому, иммунобластную крупноклеточную лимфому, лимфобластную лимфому из B-клеток-предшественников и лимфому из клеток мантийной зоны. Лимфомы, возникающие после трансплантации костного мозга или стволовых клеток, как правило, представляют собой В-клеточные неходжкинские лимфомы.

Хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) представляет собой вялотекущий (медленнорастущий) рак, который вызывает медленное увеличение количества незрелых белых кровяных клеток, называемых B-лимфоциты или B-клетки. Раковые клетки распространяются через кровь и костный мозг, а также могут поражать лимфатические узлы или другие органы, такие как печень и селезенка. В конечном итоге CLL вызывает поражение костного мозга. Иногда на более поздних стадиях заболевания, данное заболевание называют мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома.

В конкретных вариантах осуществления предусмотрены способы, включающие введение терапевтически эффективного количества модифицированных T-клеток, рассмотренных в данном документе, или содержащей их композиции пациенту, нуждающемуся в этом, отдельно или в комбинации с одним или более терапевтическими средствами. В определенных вариантах осуществления клетки по настоящему изобретению применяют при лечении пациентов с риском развития рака. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены способы лечения или предупреждения рака, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества модифицированных Т-клеток по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включает введение эффективного количества, например терапевтически эффективного количества, композиции, содержащей генетически модифицированные иммунные эффекторные клетки, рассмотренные в данном документе. Количество и частоту введения будут определять в зависимости от таких факторов, как состояние пациента, а также тип и тяжесть заболевания пациента, хотя соответствующие дозировки можно определить при помощи клинических испытаний.

В одном варианте осуществления количество модифицированных T-клеток в композиции, вводимой субъекту, составляет по меньшей мере 0,1 x 10⁷ модифицированных T-клеток/м², по меньшей мере 0,5 x 10⁷ модифицированных T-клеток/м², по меньшей мере 1 x 10⁷ модифицированных T-клеток/м², по меньшей мере 5 x 10⁷ модифицированных T-клеток/м², по меньшей мере 0,1 x 10⁸ модифицированных T-клеток/м², по меньшей мере 0,5 x 10⁸ модифицированных T-клеток/м², по меньшей мере 1 x 10⁸ модифицированных T-клеток/м², по меньшей мере 5 x 10⁸ модифицированных T-клеток/м² или по меньшей мере 1 x 10⁹ модифицированных T-клеток/м², или любое другое промежуточное количество модифицированных T-клеток.

Количество модифицированных T-клеток, вводимых субъекту, зачастую представляют собой субпопуляцию из общего количества клеток, вводимых субъекту. В конкретном варианте осуществления субъекту вводят по меньшей мере 0,1 x 10⁷ общих T-клеток, по меньшей мере 0,5 x 10⁷ общих T-клеток, по меньшей мере 1 x 10⁷ общих T-клеток, по меньшей мере 5 x 10⁷ общих T-клеток, по меньшей мере 0,1 x 10⁸ общих T-клеток, по меньшей мере 0,5 x 10⁸ общих T-клеток, по меньшей мере 1 x 10⁸ общих T-клеток, по меньшей мере 5 x 10⁸ общих T-клеток, по меньшей мере 0,1 x 10⁹ общих T-клеток, по меньшей мере 0,5 x 10⁹ общих T-клеток, по меньшей мере 1 x 10⁹ общих T-клеток, по меньшей мере 5 x 10⁹ общих T-клеток или по меньшей мере 0,1 x 10¹⁰ общих T-клеток или любое другое промежуточное количество T-клеток.

Рядовому специалисту в данной области будет понятно, что для осуществления необходимой терапии могут потребоваться множественные введения композиций по настоящему изобретению. Например, композиция может быть введена 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более раз на протяжении 1 недели, 2 недель, 3 недель, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 1 года, 2 лет, 5 лет, 10 лет или более.

В определенных вариантах осуществления может быть необходимо вводить субъекту активированные Т-клетки, а затем последовательно осуществлять забор крови (или выполнять аферез), активировать полученные из нее Т-клетки в соответствии с настоящим изобретением, и осуществлять реинфузию этих активированных и размноженных Т-клеток пациенту. Этот процесс можно осуществлять множество раз через каждые несколько недель. В определенных вариантах осуществления Т-клетки можно активировать из крови, взятой в количестве от 10 см³ до 400 см³. В определенных вариантах осуществления Т-клетки активируют из крови, взятой в количестве 20 см³, 30 см³, 40 см³, 50 см³, 60 см³, 70 см³, 80 см³, 90 см³, 100 см³, 150 см³, 200 см³, 250 см³, 300 см³, 350 см³ или 400 см³ или более. Не привязываясь к какой-либо теории, применение такого протокола множественного взятия крови/множественной реинфузии может служить для отбора определенных популяций Т-клеток.

Введение композиций, рассмотренных в данном документе, можно осуществлять любым удобным способом, в том числе путем аэрозольной ингаляции, инъекции, приема внутрь, переливания, имплантации или трансплантации. В предпочтительном варианте осуществления композиции вводят парентерально. Используемые в данном документе фразы «парентеральное введение» и «введенный парентерально» относятся к способам введения, отличным от энтерального и местного введения, которые обычно осуществляют путем инъекции и которые включают без ограничений внутрисосудистую, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсульную, внутриглазничную, внутриопухолевую, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную и внутригрудинную инъекцию и инфузию. В одном варианте осуществления композиции, рассмотренные в данном документе, вводят субъекту путем непосредственной инъекции в опухоль, лимфатический узел или очаг инфекции.

В одном варианте осуществления субъекту, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество композиции для усиления клеточного иммунного ответа на рак у субъекта. Иммунный ответ может включать клеточные иммунные ответы, опосредованные цитотоксическими Т-клетками, способными приводить к цитолизу инфицированных клеток, регуляторными Т-клетками, а также реакции с хелперными Т-клетками. Также могут быть индуцированы гуморальные иммунные ответы, опосредованные в первую очередь хелперными Т-клетками, способными активировать B-клетки, что приводит к выработке антител. Можно использовать целый ряд методик для анализа типа иммунных ответов, индуцируемых композициями по настоящему изобретению, которые хорошо описаны в уровне техники; например, Current Protocols in Immunology, под ред. John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y.

В случае опосредованного T-клетками цитолиза клеток связывание CAR-лиганда инициирует передачу сигнала с помощью CAR в Т-клетку, что приводит к активации целого ряда путей передачи сигнала в Т-клетке, что индуцирует Т-клетку к выработке или высвобождению белков, способных индуцировать апоптоз целевой клетки посредством различных механизмов. Такие опосредованные Т-клетками механизмы включают (без ограничений) перенос внутриклеточных цитотоксических гранул из Т-клетки в целевую клетку, Т-клеточную секрецию противовоспалительных цитокинов, которые могут индуцировать цитолиз клеток непосредственно (или опосредованно путем рекрутинга киллерных эффекторных клеток), и усиление экспрессии лигандов рецепторов смерти (например, FasL) на поверхности Т-клеток, которые индуцируют апоптоз целевой клетки после связывания со своим когнатным рецептором смерти (например, Fas) на целевой клетке.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, у которого был диагностирован рак, включающий извлечение иммунных эффекторных клеток из субъекта, генетическую модификацию указанных иммунных эффекторных клеток с помощью вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую разработанный TCR или CAR, рассматриваемый в данном документе, с получением тем самым популяции модифицированных иммунных эффекторных клеток, и введение модифицированных иммунных эффекторных клеток тому же субъекту. В предпочтительном варианте осуществления иммунные эффекторные клетки включают Т-клетки.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения также предусмотрены способы стимуляции иммуномодулирующего ответа, опосредованного иммунными эффекторными клетками, в отношении популяции целевых клеток у субъекта, включающие стадии введения субъекту популяции иммунных эффекторных клеток, экспрессирующих конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулу разработанного TCR или CAR.

Способы введения композиций клеток, описанных в данном документе, включают любой способ, который является эффективным либо для повторного введения ex vivo генетически модифицированных иммунных эффекторных клеток, которые непосредственно экспрессируют разработанный TCR или CAR в субъекте, либо для повторного введения генетически модифицированных предшественников иммунных эффекторных клеток, которые при введении в субъекта дифференцируются в зрелые иммунные эффекторные клетки, которые экспрессируют разработанный TCR или CAR. Один способ включает трансдукцию Т-клеток периферической крови ex vivo с помощью конструкции нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением и возврат трансдуцированных клеток в субъекта.

Все публикации, патентные заявки и выданные патенты, цитируемые в настоящем описании, включены в данный документ посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация, патентная заявка или выданный патент были конкретно и индивидуально указаны как включенные посредством ссылки.

Хотя вышеизложенное изобретение было довольно подробно описано для иллюстрации и примера в целях ясности понимания, среднему специалисту в данной области будет очевидно в свете идей настоящего изобретения, что в него могут быть внесены определенные изменения и модификации без отступления от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения. Следующие примеры предусмотрены только в качестве иллюстрации, но не в качестве ограничения. Специалисты в данной области без труда смогут выявить целый ряд второстепенных параметров, которые можно было бы изменить или модифицировать, чтобы получить по существу такие же результаты.

Примеры

Адоптивная клеточная терапия (ACT) с применением аутологичных T-клеток с разработанными химерными антигенными рецепторами (CAR) все еще обладает ограниченными возможностями из-за отсутствия простого и надежного производственного процесса. Вследствие врожденной сложности культуры живых клеток и изменчивости между пациентами важно разработать способы, которые являются эффективными, воспроизводимыми и масштабируемыми. Более того, разработка технологического способа с закрытой системой для ACT будет важной для превращения ACT в стандартный способ лечения для большого числа пациентов.

Существующие в настоящее время способы производства T-клеток включают различные сложные стадии для выделения, активации, трансдукции и размножения CAR-T-клеток. В отличие от этого авторы настоящего изобретения использовали мелкомасштабную исследовательскую модель для разработки простой, надежной, хорошо охарактеризованной, гибкой платформы для производства T-клеток в закрытой системе, которая была преобразована в крупномасштабный производственный процесс в соответствии с клинической cGMP для получения T-клеток с разработанным CAR.

При производстве стабильно достигались уровни удвоения популяции за 10 дней, составляющие в среднем 6,75 (+/- 1,5). Средняя эффективность трансдукции составляла 65,3% (+/- 12,4%). Чистота культуры стабильно составляла > 98% CD3 клеток. Фенотипически, T-клетки экспрессировали поверхностные маркеры, которые были ассоциированы с регрессом опухоли на животных моделях и в клинических исследованиях. Кроме того, T-клетки с разработанным CAR проявляли цитотоксичность в отношении мишеней, экспрессирующих антиген как in vitro, так и in vivo.

Пример 1

Платформа для мелкомасштабного производства

Создали новую платформу для мелкомасштабного производства, которая была простой, надежной и воспроизводимой. Платформа для производства была менее сложной и более надежной, чем существующие способы, и в ней реализованы минимальные манипуляции для активации, трансдукции и размножения CAR-T-клеток. Кроме того, из CAR-T-клеток, произведенных с помощью способов, рассмотренных в данном документе, получали сравнимые, если не лучшие, терапевтические средства на основе T-клеток с разработанным CAR, чем получаемые с помощью существующих способов.

1. Сбор PBMC

PBMC использовали как источник T-клеток в исследовательской платформе для мелкомасштабного производства. PBMC из взятого образца цельной крови можно отделять вручную с применением градиента FICOLL™ и промывки. В данном эксперименте использовали замороженные PBMC. Замороженные флаконы с PBMC оттаивали в водяной бане при 37°C. После оттаивания PBMC переносили в 50 мл коническую пробирку, содержащую ~20-30 мл теплой среды TCGM, затем центрифугировали при 175 x g в течение 10 минут. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в небольшом объеме TCGM, содержащей 250 МЕ/мл IL-2. Аликвоту ресуспендированных клеток подсчитывали посредством Multisizer или гемоцитометра и определяли количество жизнеспособных клеток.

2. Инициирование культуры и активация

В день 0 (D0) PBMC высевали в T25 культуральные флаконы из расчета 1 x 10⁶ клеток/мл в общем объеме 10 мл TCGM с 250 МЕ/мл IL-2. T-клетки активировали путем добавления к культуре 5 мкл антитела к CD3 при концентрации 100 нг/мкл и 5 мкл антитела к CD28 при концентрации 100 нг/мкл. После образования культур PBMC их инкубировали в лежачем положении в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C до дня 1 (D1) в случае клеток, подвергаемых дальнейшей трансдукции, или до дня 3 (D3), если клетки в дальнейшем не подвергали трансдукции.

3. Трансдукция

Определяли титр CAR-лентивирусных векторов для T-клеток. Клетки трансдуцировали из расчета 1-2 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC (количество PBMC, высеянных в D0). Вирус разводили в TCGM + IL-2 до объема, составлявшего 2 мл или 20% объем/объем от объема культуры. Клетки трансдуцировали с помощью вируса в течение приблизительно 48 часов, до дня 3 (D3).

В нескольких экспериментах определили, что наиболее эффективно трансдукция происходила через приблизительно 20-24 часа после активации клеток. Клетки трансдуцировали с помощью GFP-экспрессирующего лентивируса из расчета 1-2 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC в D0, D1 и D2. После трансдукции GFP-экспрессирующие клетки выделяли с помощью FACS-анализа, чтобы определить процентную долю различных типов трансдуцированных T-клеток и число копий вектора (VCN) в трансдуцированных клетках. GFP-экспрессирующие клетки анализировали, исходя из экспрессии T-клеточных маркеров. Большее число трансдуцированных клеток, экспрессирующих GFP и T-клеточные маркеры CD3, CD8 или CD4, идентифицировали, если клетки трансдуцировали через 20-24 часа (D1) после активации. Фигура 1. Кроме того, VCN было выше в клетках, трансдуцированных через 20-24 часов (D1) после активации. Фигура 1.

В дополнительных экспериментах определили, что эффективность трансдукции T-клеток, активированных с применением растворимых лигандов CD3 и CD28, была сравнима с эффективностью трансдукции T-клеток, активированных с помощью других способов. PBMC активировали с применением (i) связанных на планшете антитела к CD3 и антитела к CD28 при концентрации 1 мкг/мл в течение 20-24 часов; (ii) растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28 при концентрации 50 нг/мл в течение 20-24 часов; и обогащенные лимфоциты из того же источника, что и PBMC активировали с применением (iii) связанных с гранулами антитела к CD3 и антитела к CD28, при этом Dynabeads с CD3/CD28 применяли при соотношении 3 гранулы на 1 T-клетку в течение 20-24 часов. После активации клетки трансдуцировали с помощью лентивируса, экспрессирующего CAR к CD19, из расчета 1-2 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC. Большее число трансдуцированных клеток, экспрессирующих CAR к CD19 и T-клеточные маркеры CD3, CD8 или CD4, идентифицировали, если клетки активировали с помощью растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28 по сравнению с другими способами. Фигура 2. В дополнение, VCN также было выше в клетках, активированных с помощью растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28. Фигура 2.

С помощью экспериментов также определили, что активация и трансдукция в пакетах для культивирования клеток была сравнимой с трансдукцией во флаконах. PBMC активировали в D0 с применением растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28 при концентрации 50 нг/мл в течение 20-24 часов. После активации клетки трансдуцировали с помощью лентивируса, экспрессирующего каппа_LC, из расчета 3 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC в D1. Количество клеток, экспрессирующих каппа_LC и T-клеточные маркеры CD3, CD8 или CD4 было сравнимым в случаях, когда клетки активировали и трансдуцировали как в пакетах для культивирования клеток, так и во флаконах. Фигура 3.

4. Размножение

Также определяли размножение T-клеток из PBMC, активированных с помощью различных способов. PBMC активировали с применением (i) связанных на планшете антитела к CD3 и антитела к CD28 при концентрации 1 мкг/мл в течение 20-24 часов; (ii) растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28 при концентрации 50 нг/мл в течение 20-24 часов; и (iii) связанных с гранулами антитела к CD3 и антитела к CD28, при этом Dynabeads применяли при соотношении 3:1 гранулы : T-клетки в течение 20-24 часов. После активации клетки трансдуцировали с помощью лентивируса, экспрессирующего CAR к CD19, из расчета 1-2 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC. Активированные и трансдуцированные клетки культивировали для размножения вплоть до 10 дней. Размножение клеток из PBMC, активированных с помощью трех способов, было сравнимым на протяжении периода размножения культуры. Фигура 4.

Для PBMC от множественных доноров, в отношении которых применяли способы производства T-клеток, рассмотренные в данном документе, показаны воспроизводимое и надежное размножение, экспрессия CAR на клеточной поверхности и VCN. PBMC активировали с применением растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28 при концентрации 50 нг/мл в течение 20-24 часов. Активированные клетки трансдуцировали с помощью лентивируса, экспрессирующего CAR к CD19, из расчета 1-2 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC. Для активированных и трансдуцированных клеток от множественных доноров, которые культивировали в течение 10 дней, показаны сравнимые скорости роста между собой и c нетрансдуцированным контролем (UTD). Фигура 5. На фигуре 5 также показано количество лимфоцитов, присутствующих в день 10 в каждой размноженной культуре. С помощью FACS-анализа определили, что экспрессия антитела к CD19 была сравнимой у клеточных продуктов, полученных от различных пациентов, со средним значением приблизительно 61% меток и диапазоном от 29% до 80% (n=5). Фигура 6. В qPCR также показано, что VCN у клеточных продуктов было сравнимым. Фигура 6.

5. Антиген-специфический клиренс опухоли

Антиген-специфический клиренс опухоли под действием T-клеток, активированных путем применения растворимых антител, был таким же или лучшим, чем в случае T-клеток, активированных с применением других способов. PBMC активировали с применением (i) связанных на планшете антитела к CD3 и антитела к CD28 при концентрации 1 мкг/мл в течение 20-24 часов; (ii) растворимых антитела к CD3 и антитела к CD28 при концентрации 50 нг/мл в течение 20-24 часов; и (iii) связанных с гранулами антитела к CD3 и антитела к CD28, при этом Dynabeads применяли при соотношении 3:1 гранулы : T-клетки в течение 20-24 часов. После активации клетки трансдуцировали с помощью лентивируса, экспрессирующего CAR к CD19, из расчета 1-2 x 10⁸ TU/10⁶ PBMC. Активированные и трансдуцированные клетки культивировали для размножения вплоть до 10 дней. Терапевтические T-клетки с CAR к CD19 совместно культивировали с клетками Дауди, экспрессирующими CD19, или клетками K562, не экспрессирующими CD19. После 10 дней совместного культивирования T-клетки с CAR к CD19, активированные с применением растворимых антител, цитолизировали клетки Дауди так же или лучше, чем T-клетки с CAR к CD19, активированные с применением других способов. Фигура 7 и фигура 8.

6. Платформа для мелкомасштабного производства

В целом платформу для мелкомасштабного производства применяли для разработки способа 10-дневного размножения T-клеток: в D0 PBMC высевали при плотности 1 x 10⁶ клеток/мл и активировали с применением 50 нг/мл антитела к CD3 и антитела к CD28 в течение приблизительно 24 часов; в D1 активированные PBMC трансдуцировали с помощью 2 x 10⁸ TU/10⁶ клеток в течение от приблизительно 24 часов до 48 часов; D3 - D9 трансдуцированные клетки размножали и пересевали для поддержания фазы логарифмического роста. Производственный процесс получения T-клеток, как правило, приводил к 100-600-кратному увеличению количества T-клеток, в зависимости от донора.

В вышеприведенных экспериментах идентифицировали элементы, важные для преобразования мелкомасштабного исследовательского процесса в крупномасштабный производственный процесс в соответствии с клинической cGMP. Данные элементы показаны в таблице 1

Таблица 1.

Элементы для мелкомасштабного получения, которые переносятся в платформу для крупномасштабного производства
Исходный материал	PBMC
Состав среды	TCGM: XVIVO-15, дополненная 5% HABS, 2 мМ Glutamax, 10 мМ HEPES и 250 МЕ/мл IL-2 (и необязательно IL7 и/или IL-15)
Способ активации	50 нг/мл растворимого антитела к CD3 и 50 нг/мл растворимого антитела к CD28
Трансдукция	Трансдукция через 20-24 часа после активации
Размножение	Поддерживали фазу логарифмического роста клеток путем пересева при концентрации от 0,3 x 106 клеток/мл до 0,5 x 106 клеток/мл

7. Надежность платформы

Надежность платформы производства была показана путем разработки, производства и оценки множественных лентивирусных CAR-конструкций. Конструкции варьировали с точки зрения используемых промоторной, scFV, +/- линкерной, шарнирной, трансмембранной областей и доменов передачи сигнала. Фигура 16.

Супернатанты с лентивирусным вектором (LV), кодирующим CAR, получали в клетках HEK 293T, как описано в другом документе (например, Naldini et al., 1996, Dull et al., 1998 и Zufferey et al., 1998). Клетки 293 подвергали транзиентной трансфекции с помощью 4 плазмид: плазмиды, кодирующей gag-pol HIV, плазмиды, кодирующей белок оболочки VSV-G, плазмиды, кодирующей белок rev HIV, и лентивирусного вектора-переносчика, кодирующего CAR, например, фигура 16.

CAR-T-клетки получали, как описано в примере 1, выше. Для различных CAR-T-клеточных продуктов показаны сравнимые скорости роста, как определено по удвоению популяции (фигура 17A); с помощью qPCR показано, что VCN было сравнимым у различных CAR-T-клеток, при этом оно составляло приблизительно 1-4 копии на клетку (фигура 17B); и сравнимая экспрессия на клеточной поверхности различных конструкций с CAR была показана с помощью FACS; процент меток находился в диапазоне от приблизительно 40% до 60% в зависимости от конструкции (фигура 17C).

8. Получение функционального лекарственного препарата, содержащего CAR-T-клетки

Т-клетки, экспрессирующие CAR к BCMA, получали как описано в примере 1, выше. Такие CAR-Т-клетки демонстрировали антиген-специфический клиренс опухоли. Т-клетки, экспрессирующие CAR к BCMA, совместно культивировали в течение 4 часов с клетками K562 или клетками K562, модифицированными для экспрессии BCMA. Опухолевые клетки, экспрессирующие антиген, метили при помощи сложного сукцинимидилового эфира карбоксифлуоресцеина (CFSE) и флуоресценцию измеряли при помощи FACS. Т-клетки, экспрессирующие CAR к BCMA, приводили к цитолизу клеток K562, экспрессирующих BCMA (фигура 18A), и высвобождали IFN-γ (фигура 18B). (n=3).

Пример 2

Преобразование мелкомасштабной исследовательской платформы в платформу для крупномасштабного производства лекарственных препаратов в соответствии с клинической cGMP

Мелкомасштабный исследовательский процесс обеспечил возможность высокопроизводительной оценки CAR-конструкций с гарантией того, что сравнимые данные будут получены на платформе для крупномасштабного производства лекарственных средств в соответствии с cGMP. В данном примере приведены данные типичных экспериментов, проводимых с применением платформы для крупномасштабного производства лекарственных средств в соответствии с клинической cGMP.

1. Сравнение способов мелкомасштабного и крупномасштабного производства

На фигуре 9 показано сравнение в виде блок-схемы исследовательской платформы для мелкомасштабного производства T-клеток и платформы увеличенного масштаба для производства лекарственных средств в соответствии с клинической cGMP. CAR-T-клетки получали с применением процедур, кратко изложенных в примере 1. В случае крупномасштабного производства, например, фигуры 10-12, CAR-T-клетки получали следующим образом.

Сбор. Клетки собирали с помощью лейкафереза с применением системы для афереза Spectra Optia® или аналогичного устройства. Исходные объемы продуктов лейкафереза, которые применяли в производственном процессе, составляли от приблизительно 100 мл до приблизительно 200 мл. Аликвоты клеток подсчитывали, определяли жизнеспособность, криоконсервировали и анализировали в отношении PBMC с применением FACS-анализа.

Выделение. PBMC выделяли с применением градиента FICOLL™ в закрытой системе на системе для извлечения аутологичной крови Cell Saver® 5+ (Haemonetics). После обработки FICOLL™ лейкоцитарную пленку промывали буфером CliniMACS с 2% HABS и затем ресуспендировали в TCGM с 250 МЕ/мл IL-2. Осуществляли подсчет клеток, оценку жизнеспособности и FACS-анализ на PBMC перед промывкой и после промывки.

Криоконсервация. Конкретные варианты осуществления способа крупномасштабного производства включают криоконсервацию PBMC после выделения и перед какой-либо дальнейшей стадией производства. PBMC криоконсервировали в TCFM и замораживали с помощью программируемого аппарата для криозамораживания при температуре от приблизительно -80°C до приблизительно -135°C при скорости, составляющей 1° в минуту, с помощью программируемого аппарата для криозамораживания и хранили в резервуаре в газообразной фазе жидкого азота.

ДЕНЬ 0: Инициирование культуры/активация - пакеты, свежесобранные клетки. 1 x 10⁸ PBMC при плотности 1 x 10⁶ PBMC/мл в TCGM с 250 МЕ/мл IL-2 высевали в 100 мл GMP-пакеты для дифференцировки клеток MACS®. PBMC активировали добавлением в культуру 50 нг/мл антитела к CD3 и 50 нг/мл антитела к CD28 и культивировали в течение приблизительно 24 часов.

ДЕНЬ 0: Инициирование культуры/активация - пакеты, замороженные клетки. Конкретные варианты осуществления крупномасштабного производственного процесса включают использование замороженных PBMC. Замороженные PBMC оттаивали в водяной бане при 37°C и промывали в TCGM с 250 МЕ/мл IL-2. 1 x 10⁸ оттаявших PBMC в TCGM с 250 МЕ/мл IL-2 высевали в 100 мл GMP-пакеты для дифференцировки клеток MACS®. Оттаявшие PBMC активировали добавлением в культуру 50 нг/мл антитела к CD3 и 50 нг/мл антитела к CD28 и культивировали в течение приблизительно 24 часов.

ДЕНЬ 0: Инициирование культуры/активация - биореактор GREX. Конкретные варианты осуществления крупномасштабного производственного процесса включают производство T-клеток в биореакторе GREX. 1 x 10⁸ PBMC в TCGM с 250 МЕ/мл IL-2 высевали в 100 мл TCGM в GREX-100. PBMC активировали добавлением в культуру 50 нг/мл антитела к CD3 и 50 нг/мл антитела к CD28 и культивировали в течение приблизительно 24 часов.

День 1: Трансдукция. Активированные клетки трансдуцировали с помощью 1-2 x 10⁹ TU лентивируса/10⁸ PBMC. Лентивирус разводили в TCGM до 20% объема культуры. Например, если объем культуры составлял 100 мл TCGM, вирус разводили в TCGM с получением максимального объема 20 мл, который добавляли в культуру. Клетки трансдуцировали в течение приблизительно 48 часов.

День 3 - день 10: Размножение. Трансдуцированные клетки размножали в TCGM, содержащей 250 МЕ/мл IL-2, в течение 5-8 дней. В каждый один или более дней размножения необязательно отбирали аликвоты с клетками и проводили подсчет клеток, оценку их жизнеспособности, криоконсервирование и анализ в отношении PBMC с применением FACS-анализа. При необходимости культуры пересевали при плотности от 0,3 x 10⁶ PBMC/мл до 0,5 x 10⁶ PBMC/мл, чтобы поддержать рост клеток в логарифмической фазе. В случае производства в пакетах для культивирования клеток в день 7 клетки необязательно переносили в биореактор WAVE до дня 10, чтобы обеспечить возможность дополнительного размножения. В одном варианте осуществления подсчет клеток проводили в дни 3, 4, 5, 6, 7, 8, и/или 9, и/или 10. В одном варианте осуществления если клетки не достигали необходимых уровней размножения в день 7, тогда их можно было перенести в биореактор WAVE с перфузией среды из расчета 2 л/день в течение дней 8 и 9 для обеспечения усиленного размножения.

В случае производства на основе GREX клетки постоянно культивировали в биореакторе GREX в течение всего периода размножения.

День 10: Извлечение и криоконсервация. Размноженные клетки извлекали и промывали на системе для извлечения аутологичной крови Cell Saver® 5+. Клетки промывали с помощью 2 л 0,9% NaCl и затем конечную промывку проводили с помощью PlasmaLyte. Подсчеты клеток, оценку жизнеспособности и FACS-анализ осуществляли перед извлечением и после него для определения чистоты и идентичности CAR-T-клеток. Извлеченные клетки необязательно криоконсервировали в 50% Plasmalyte и 50% Cryostor 10; 50/40/10 (XVIVO/HABS/DMSO) или Cryostor 10 и замораживали с помощью программируемого аппарата для криозамораживания при температуре от приблизительно -80°C до приблизительно -135°C при скорости 1° в минуту с помощью программируемого аппарата для криозамораживания и хранили в резервуаре в газообразной фазе жидкого азота.

2. Фенотипы клеток являются сравнимыми у конечных клеточных продуктов, полученных с помощью способов мелкомасштабного и крупномасштабного производства

CAR-T-клетки получали с применением мелкомасштабных способов, описанных в примере 1, и крупномасштабных способов, описанных в примере 2, выше. Конечные клеточные продукты подвергали FACS-анализу в отношении экспрессии маркеров клеточной поверхности CD4, CD8, CAR-конструкций для T-клеток, CD56 и CD62L, чтобы определить любые отличия в составе клеток в конечном продукте. Значительных отличий фенотипа конечных CAR-T-клеточных продуктов между исследовательской платформой и платформой клинического масштаба не обнаружили. p≥ 0,20 для всех поверхностных маркеров при сравнении двух платформ. (n=3). Фигура 13.

3. Упрощенная обработка клеток при выделении PBMC и сборе T-клеток

Одним из главных преимуществ способов производства, рассмотренных в данном документе, является внедрение стадий обработки в закрытой системе. PBMC собирали с помощью лейкафереза, и выделяли и промывали с применением системы для извлечения аутологичной крови Cell Saver® 5+ (Haemonetics). Cell Saver® 5+ также применяли для извлечения и промывки произведенных конечных CAR-T-клеточных продуктов.

Конечные PBMC и CAR-T-клеточные продукты анализировали в многочисленных экспериментах (n = 18), чтобы продемонстрировать поразительно стабильную гомогенность клеточных составов у исходного материала и конечных продуктов. Фигура 14. Использование подхода с закрытой системой упростило производство и свело к минимуму оборудование, необходимое для обработки в соответствии с cGMP

4. Гибкость производственного процесса

Для преодоления изменчивости между пациентами и уверенности в том, что можно будет достигать необходимых уровней доз CAR-T-клеточных продуктов, сравнивали многочисленные устройства для размножения CAR-T-клеток, чтобы показать гибкость, обеспечиваемую рассмотренным производственным процессом. Мелкомасштабные (T25-флакон) и крупномасштабные (GREX100, пакеты для стационарного культивирования клеток и биореактор WAVE) производственные процессы выполняли, как описано выше. Для клеток, полученных посредством различных способов производства, показаны сравнимые скорости роста и количество размноженных клеток за 10-дневный период культивирования. Фигура 15A. С помощью FACS-анализа показано, что количество CD3^+/CAR + клеток было постоянным при разных способах производства. Фигура 15B. Кроме того, VCN у CD3⁺/CAR+ клеток было сравнимым для различных протестированных способов производства. Фигура 15B. Эти результаты демонстрируют, что рассмотренные способы производства T-клеток были гибкими и давали сравнимые конечные клеточные продукты.

В целом в нижеследующей формуле изобретения используемые термины не должны толковаться как ограничивающие формулу изобретения конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в настоящем описании и формуле изобретения, но должны быть истолкованы как включающие все возможные варианты осуществления вместе с полным объемом эквивалентов, которые такая формула изобретения охватывает. Соответственно, формула изобретения не ограничивается настоящим раскрытием.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> БЛУБЁРД БИО, ИНК.

<120> УЛУЧШЕННЫЕ СПОСОБЫ ПРОИЗВОДСТВА СРЕДСТВ АДОПТИВНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ

<130> BLBD-028/01WO

<150> US 61/984558

<151> 2014-04-25

<160> 13

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 1

Asp Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 2

Thr Gly Glu Lys Pro

1 5

<210> 3

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 3

Gly Gly Arg Arg

1

<210> 4

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 5

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 5

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp

1 5 10

<210> 6

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 6

Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser

1 5 10 15

Leu Asp

<210> 7

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 7

Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 8

Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro

1 5

<210> 9

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 9

Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro

1 5 10

<210> 10

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибкий пептидный линкер

<400> 10

Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro

1 5 10 15

<210> 11

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательности расщепления полипептида

<220>

<221> ИНОЙ_ПРИЗНАК

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = любая аминокислота

<220>

<221> ИНОЙ_ПРИЗНАК

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = любая аминокислота

<220>

<221> ИНОЙ_ПРИЗНАК

<222> (7)..(7)

<223> Xaa представляет собой Gly или Ser

<400> 11

Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательности расщепления полипептида

<400> 12

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательности расщепления полипептида

<400> 13

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser

1 5

<---

1. Способ производства Т-клеток, включающий

a) получение популяции мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), которая содержит Т-клетки и антиген-презентирующие клетки (APC);

b) культивирование популяции PBMC в течение от 20 часов до 24 часов перед трансдукцией в среде для культивирования клеток, содержащей i) экзогенный интерлейкин-2 (IL-2), ii) антитело к CD3 или его CD3-связывающий фрагмент и iii) антитело к CD28 или его CD28-связывающий фрагмент, B7-1 или его CD28-связывающий фрагмент, или B7-2 или его CD28-связывающий фрагмент, при этом культивирование активирует и стимулирует Т-клетки;

c) трансдукцию популяции PBMC, активированных на стадии b), с помощью лентивирусного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор (CAR) к B-клеточному антигену созревания (BCMA), и

d) культивирование популяции PBMC в ростовой среде для клеток для размножения трансдуцированных Т-клеток;

с производством тем самым T-клеток.

2. Способ по п. 1, где CAR содержит

a) внеклеточный домен, который связывает BCMA;

b) трансмембранный домен, полученный из полипептида, выбранного из группы, включающей CD8α; CD4, CD28, CD45, PD1 и CD152;

c) один или более внутриклеточных доменов передачи костимулирующего сигнала, выбранных из группы, включающей CD28, CD54 (ICAM), CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA4), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1) и CD278 (ICOS); и

d) домен передачи сигнала CD3ζ.

3. Способ по п. 2, где:

(a) внеклеточный домен содержит антиген-связывающий фрагмент, который связывает BCMA;

(b) трансмембранный домен получен из CD8α или CD28;

(c) один или более доменов передачи костимулирующего сигнала выбраны из группы, включающей CD28, CD134 и CD137;

(d) CAR дополнительно содержит полипептид шарнирной области;

(e) CAR дополнительно содержит полипептид шарнирной области IgG1 или CD8α;

(f) CAR дополнительно содержит сигнальный пептид; или

(g) CAR дополнительно содержит сигнальный полипептид тяжелой цепи IgG1, сигнальный полипептид CD8α или сигнальный полипептид альфа-субъединицы рецептора GM-CSF человека.

4. Способ по п. 1, где CAR к BCMA содержит: внеклеточный домен, содержащий антитело к BCMA или его антиген-связывающий фрагмент; трансмембранный домен CD8α или CD28; один или более внутриклеточных доменов передачи костимулирующего сигнала, выбранных из группы, включающей CD28, CD134 (OX40) и CD137 (41BB); и домен передачи первичного сигнала CD3ζ.

5. Способ производства терапевтического средства на основе Т-клеток человека, включающий

a) получение популяции PBMC, которая содержит Т-клетки и APC;

b) культивирование популяции PBMC в течение от 20 часов до 24 часов перед трансдукцией в среде для культивирования клеток, содержащей:

i) экзогенный IL-2;

ii) антитело к CD3 или его CD3-связывающий фрагмент; и

iii) антитело к CD28 или его CD28-связывающий фрагмент, B7-1 или его CD28-связывающий фрагмент, или B7-2 или его CD28-связывающий фрагмент, при этом культивирование активирует и стимулирует Т-клетки;

c) трансдукцию популяции PBMC, активированных на стадии b), с помощью лентивирусного вектора, кодирующего CAR к BCMA, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который связывает BCMA, трансмембранный домен CD8α, внутриклеточный домен передачи костимулирующего сигнала CD137 и домен передачи первичного сигнала CD3ζ; и

d) культивирование популяции PBMC на стадии c) в ростовой среде для клеток для размножения трансдуцированных Т-клеток;

с производством тем самым терапевтического средства на основе T-клеток.

6. Способ по п. 5, где:

(a) получение популяции PBMC включает лейкаферез;

(b) получение популяции PBMC включает осаждение;

(c) получение популяции PBMC включает осаждение, которое включает градиент FICOLL™ или PERCOLL™;

(d) получение популяции PBMC включает осаждение, которое выполняют с помощью полуавтоматической проточной центрифуги; или

(e) получение популяции PBMC включает осаждение, которое выполняют с помощью Cobe 2991 Cell Processor, Cell Saver 5+ или полуавтоматической проточной центрифуги Elutra.

7. Способ по п. 5, где способ дополнительно включает:

(a) промывку популяции PBMC на стадии a) в буфере или среде для культивирования клеток;

(b) промывку популяции PBMC на стадии a) в ростовой среде для T-клеток (TCGM), содержащей один или более цитокинов;

(c) промывку популяции PBMC на стадии a) в ростовой среде для T-клеток (TCGM), содержащей один или более цитокинов, выбранных из группы, включающей: IL-2, IL-7, IL-15, IL-9 и IL-21;

(d) промывку популяции PBMC на стадии a) в ростовой среде для T-клеток (TCGM), содержащей IL-2; или

(e) промывку популяции PBMC на стадии a) в ростовой среде для T-клеток (TCGM), содержащей 250 МЕ/мл IL-2.

8. Способ по п. 5, где:

(a) популяцию PBMC на стадии b) культивируют с растворимым антителом к CD3 и растворимым антителом к CD28;

(b) популяцию PBMC на стадии b) культивируют с растворимым антителом к CD3 при концентрации приблизительно 50 нг/мл и растворимым антителом к CD28; или

(c) популяцию PBMC на стадии b) культивируют с растворимым антителом к CD3 и растворимым антителом к CD28 при концентрации приблизительно 50 нг/мл.

9. Способ по п. 5, где

(a) популяцию PBMC на стадии b) культивируют в течение 20 часов перед трансдукцией; или

(b) популяцию PBMC на стадии b) культивируют в течение 24 часов перед трансдукцией.

10. Способ по любому из пп. 5-9, где для трансдукции 1 × 10⁸ высеянных клеток применяют от приблизительно 1 × 10⁹ TU до приблизительно 2 × 10⁹ TU лентивирусного вектора.

11. Способ по любому из пп. 5-10, где:

(a) лентивирусный вектор разводят до 20% объем/объем от общего объема культуры;

(b) лентивирусный вектор разводят до 40% - 50% объем/объем от общего объема культуры;

(c) популяцию PBMC подвергают трансдукции в течение от 18 до 48 часов;

(d) популяцию PBMC подвергают трансдукции в течение от 18 до 36 часов; или

(e) популяцию PBMC подвергают трансдукции в течение 24 часов.

12. Способ по любому из пп. 5-11, где популяцию PBMC, полученную на стадии a), подвергают криоконсервации перед культивированием на стадии b).

13. Способ по любому из пп. 5-11, где популяцию PBMC, полученную на стадии a), подвергают криоконсервации с помощью программируемого аппарата для криозамораживания перед культивированием на стадии b).

14. Способ по п. 12 или 13, где криоконсервированную популяцию PBMC подвергают оттаиванию перед культивированием на стадии b).

15. Способ по любому из пп. 5-14, где:

(a) популяцию PBMC на стадии d) культивируют для размножения в течение от 5 до 8 дней;

(b) популяцию PBMC на стадии d) культивируют для размножения в течение от 5 дней до 8 дней в пакете для культивирования клеток;

(c) популяцию PBMC на стадии d) культивируют для размножения в течение 5 дней в пакете для культивирования клеток, а затем культивируют в течение 3 дней в биореакторе; или

(d) популяцию PBMC на стадии d) культивируют для размножения в течение от 5 дней до 8 дней в биореакторе.

16. Способ по п. 15, где биореактор представляет собой биореактор WAVE или биореактор GREX.

17. Способ по п. 15, где:

(a) количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 50 раз в ходе культивирования на стадии d);

(b) количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 100 раз в ходе культивирования на стадии d);

(c) количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 300 раз в ходе культивирования на стадии d);

(d) количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 400 раз в ходе культивирования на стадии d);

(e) количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 500 раз в ходе культивирования на стадии d); или

(f) количество Т-клеток возрастает по меньшей мере в 600 раз в ходе культивирования на стадии d).