Способ получения трехмерных структур клеток млекопитающих с использованием полимеров 2,5-дигидроксибензойной кислоты

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению сфероидов, посредством обработки клеток полимерами 2,5-ДГБК из прикрепленных культур клеток млекопитающих. Способ включает культивирование клеток в стандартной для них ростовой среде до стадии субмонослоя с последующим откреплением от подложки, ресуспендированием и переносом клеток в ростовую среду, содержащую полимеры 2,5-ДГБК (здесь и в дальнейшем молекулярная масса полимеров 40 кДа) в концентрации от 50 мкг/мл до 400 мкг/мл, и инкубированием клеток до образования сфероидов. Может быть осуществлено культивирование клеток в стандартной для них ростовой среде до достижения клетками высокой плотности с последующей заменой ростовой среды на ростовую среду с добавлением полимеров 2,5-ДГБК в концентрации от 50 мкг/мл до 400 мкг/мл и отделением клеток от подложки при помощи механического воздействия и инкубированием полученных клеточных агрегатов без разделения на отдельные клетки в ростовой среде с добавлением полимеров 2,5-ДГБК в концентрации от 50 мкг/мл до 400 мкг/мл до формирования сфероидов. Может быть осуществлено культивирование единичных клеток на многолуночных планшетах с низкоадгезивным покрытием до формирования клонов с последующей заменой ростовой среды на среду, содержащую полимеры 2,5-ДГБК в концентрации от 50 мкг/мл до 400 мкг/мл, и отделением клеток от подложки механическими методами и инкубированнием клонов в суспензии в присутствии полимеров в концентрации от 50 мкг/мл до 400 мкг/мл до образования сфероидов, состоящих из клеток, являющихся потомками единичной клетки и, следовательно, представляющих клон генетически идентичных клеток. Изобретение позволяет получать трехмерные структуры (сфероиды) как из группы клеток, так и посредством клонирования единичной клетки. 9 пр., 4 ил.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения трехмерных клеточных структур. Прикрепленные к подложке клетки, выращенные в двухмерной (2Д) культуре или схожем формате суспезионных культур, имеют меньшую значимость в качестве моделей для исследований по сравнению с клетками, растущими in vivo как трехмерные структуры в составе тканей различных органов [1]. Сфероиды, являясь трехмерными образованиями, более точно воспроизводят структуру органов или новообразований и демонстрируют повышенную по сравнению с 2Д культурами выживаемость, соответствующую морфологию и гипоксическое ядро, которое наблюдается в нативных опухолях in vivo. Сфероиды опухолевых клеток также представляют модели процесса метастазирования. Поэтому, в настоящее время сфероиды широко используют для тестирования новых противоопухолевых препаратов [2]. Данное изобретение обеспечивает простой и быстрый способ получения трехмерных структур клеток млекопитающих путем совместной инкубации клеток с нетоксичными полимерами 2,5-ДГБК.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ.

Клеточные культуры используют для скрининга лекарственных средств, исследований рака, тканевой инженерии, моделирования опухолей, анализа функций генов и анализа межклеточных взаимодействий [3]. 2Д клеточная культура была впервые разработана в 1908 г. [4]. За время использования клеточных культур в лабораторной практике было обнаружено, что клетки, выращенные как трехмерные структуры (сфероиды), обеспечивают более достоверные данные для изучения клеточного гомеостаза и клинических испытаний, чем клетки, культивируемые в монослое. Рост клеток в трехмерной структуре обеспечивает возможность клеток взаимодействовать как между собой, так и с внеклеточным матриксом. Эти взаимодействия более точно имитируют среду in vivo и позволяют получить более точные данные, приближенные к условиям организма, особенно, для проведения тестов для скрининга новых лекарств [5]. Сфероиды используют для изучения механизмов резистентности к лекарственным средствам, которая может быть обусловлена межклеточными взаимодействиями, устойчивостью к индуцированной клеточной гибели (апоптозу), увеличению доли покоящихся клеток, модуляцией экспрессии белков (включая топоизомеразы и репаративные ферменты), снижением проницаемости для препаратов, наличием гипоксического и некротического центра [6]. Таким образом, надо отметить что клеточные ответы на воздействие фармакологических препаратов значительно различаются для одного и того же типа клеток выращенных в 2Д и 3Д культурах. Очевидно, что использование сфероидов в моделировании опухолей для изучения сигнальных путей и межклеточных взаимодействий позволяет оптимизировать лечение и обеспечивает понимание механизмов развития устойчивости к лекарственным препаратам [7-10]. В настоящее время сфероиды интенсивно используют в платформах для скрининга новых препаратов [11-13]. Сфероиды являются альтернативой моделям лабораторных животных в исследованиях рака [14]. Также, сфероиды являются возможным материалом для использования в тканевой инженерии для реконструкции органов и тканей [15, 16].

В настоящее время многие методы создания 3Д-культур клеток являются дорогим и трудоемким процессом. Существует несколько подходов к выращиванию сфероидов. Один из подходов известен как метод предотвращения прикрепления. Поверхность, на которой растут клетки, модифицируется таким образом, что клетки не могут прикрепиться. Поэтому клеточные культуры вынуждены находиться в суспензии, что индуцирует межклеточные взаимодействия, приводящие к образованию сфероидов. [17-19]. Предварительное покрытие культуральной посуды, необходимое для образования сфероидов, является трудоемким и длительным поскольку подразумевает многоступенчатый процесс с использованием таких веществ как поли-N-изопропилакриламид, либо при помощи физических методов, таких как обработка поверхности плазмой [20]. Посуду такого типа для культивирования клеток можно приобрести у поставщиков, таких как Sumitomo Bakelite, EMD Millipore and Happy Cell. Однако покупка предварительно модифицированных покрытий связана с повышением стоимости и приносит дополнительные расходы на исследовательские проекты. Также, следует отметить, что многие типы прикрепленных культур клеток чувствительны к контактным условиям и не жизнеспособны при росте в суспензии. Предложенный нами метод, - способ с первоначальным выращиванием клеток в монослое и последующем откреплении в присутствии полимеров 2,5-ДГБК, может решить данную проблему в формировании сфероидов для подобных культур клеток.

Другой метод получения сфероидов называется методом «висячей капли». Метод основан на создании небольших капель клеточной суспензии в ростовой среде, которые помещают в гидрофобное окружение, например, минеральное масло, затем переворачивают. Гравитационное оседание клеток, межклеточная адгезия и последующий рост приводят к образованию сфероидов однородного размера. [21, 22]. Данный метод позволяет производить однородные сфероиды, однако смена ростовой среды для поддержания роста клеток очень трудна, поскольку объем капли, содержащей клетки, является очень малым (10 мкл) [23]. Также к недостаткам метода относятся значительное время формирование сфероидов (до 288 часов) и трудности, связанные с необходимостью культивирования большого числа капель чтобы получить необходимое для исследований количество сфероидов [24]. Специальные планшеты для метода висячей капли коммерчески доступны от нескольких поставщиков, включая 3D Biomatrix (www.3dbiomatrix.com) и InSphero (www.insphero.com).

Еще один способ получения сфероидов - это процедура, основанная на перемешивании. В этом методе клетки либо перемешивают [25], либо контейнер, в котором находятся клетки, вращают [26]. Вращение клеток предотвращает их прикрепление к поверхности контейнера и способствует межклеточным взаимодействиям, индуцируя рост культур в 3Д формате. Недостатками данного метода являются: большой объем требуемой среды, возможное негативное влияние на физиологию клеток механического воздействия при вращении и ограниченный контроль над размером сфероида [27]. Также необходимо подбирать скорость перемешивания, которая является индивидуальной для каждого типа клеток. Стоит учитывать, что многие типы прикрепленных культур клеток чувствительны к контактным условиям и не жизнеспособны при росте в суспензии в условиях вращения или/и перемешивания. Несколько компаний, такие как Wheaton (www.wheatonsci.com), Corning (www.corning.com) и Synthecon (www.synthecon.com) поставляют коммерческие перемешиватели.

Другой способ получения сфероидов клеток млекопитающих включает использование матрикса для формирования сфероидов. Клетки высевают на поверхность или внутрь матрикса, имитирующего окружение клетки in vivo. Этот матрикс состоит из организованных в трехмерную структуру фибрилл соединительной ткани, полученных из фрагментов тканей [28]. После данной процедуры полученный матрикс сохраняет ростовые факторы источника, из которого был получен (например, Matrigel, который представляет собой секретируемую смесь белков, продуцируемых клетками саркомы мыши Engelbreth-Holm Swarm, содержит такие ростовые факторы, как инсулиноподобный ростовой фактор 1, трансформирующий ростовой фактор бет, и фактор роста нервов) [29]. В случае применения опухолевых тканей для получения матрикса, ростовые факторы, находящиеся в матриксе, могут стимулировать ряд сигнальных путей, которые в норме не являются активированными для того типа клеток, который используют для формирования сфероидов. Это может существенно изменить характер клеточных ответов на лекарственные средства [30, 31]. Дополнительным недостатком являются различия состава матрикса для каждой партии, поскольку это продукт, выделяемый из биологических источников [32, 33]. Несколько вариантов матриксов коммерчески доступны от таких компаний, как BD Biosciences, Amsbio, Sigma - Aldrich, Millipore и Invitrogen. Следует отметить, что стоимость матрикса достаточно высока и может быть неприемлемой для большинства исследователей.

Следующий способ изготовления сфероидов включает использование искусственно сконструированных каркасов. Клетки высевают в каркасы, заранее сконструированные из коллагена, альгината, желатина или фосфата кальция, где они прикрепляются к волокнам каркаса, а затем растут в виде трехмерных структур [34, 35]. Недостатки данного способа включают механическую прочность каркаса, высокую стоимость, невозможность простого удаления клеток из каркаса, а также узкопрофильность получаемых конструкций (метод в основном специализирован для остеологических исследований). Различные типы каркасов коммерчески доступны от таких компаний, как 3D Biomatrix, Sigma - Aldrich, Solohill и Amsbio.

Наиболее близким из существующих методов к предлагаемому нами изобретению, является метод получения сфероидов с использованием производных RGD-пептида (Аминокислотная последовательность ARG-GLY-ASP, узнаваемая в белках интегринами). В данной методике в суспензию клеток, культивируемых в обычной культуральной посуде, добавляют производные RGD-пептида (например, циклический пептид Arg-GlyAsp-D-Phe-Lys (цикло-RGDfK) или цикл RGDfK, модифицированный 4-карбоксибутил-трифенилфосфонийбромидом (цикло-RGDfK (ТРР)), и в течение нескольких дней образуются сфероиды в результате самоагрегации клеток [36]. К недостаткам метода относится тот факт, что растворимые низкомолекулярные RGD-содержащие пептиды являются эффективными индукторами апоптоза [37], что может вносить искажения в результаты тестирования противораковых препаратов. Еще один недостаток данного метода для формирования клеточных сфероидов заключается в том, что RGD-пептид и лиганды интегринов используют как эффективные противораковые препараты [38-40]. Подобного рода биологическая активность этих веществ может существенно искажать результаты тестирования других противораковых препаратов с использованием сфероидов, полученных по данному методу.

Очевидно, что различные способы получения сфероидов имеют многочисленные проблемы, связанные с недостатками методов, описанными выше. Настоящее изобретение устраняет эти проблемы благодаря новой методике выращивания сфероидов с использованием полимеров 2,5-ДГБК. Этот метод прост, недорог и не требует дополнительного оборудования для получения сфероидов.

Техническая задача, на решение которой направлено разработанное нами техническое решение, состоит в разработке способа быстрого получения сфероидов из опухолевых и/или нормальных клеток млекопитающих, которые сохраняют свойства роста в 3Д культурах в течение длительного времени.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является методика получения сфероидов раковых и/или нормальных клеток млекопитающих для применения их в качестве тест-систем для любых исследований связанных с использованием культур клеток в условиях максимально приближенным к условиям in vivo.

Для достижения указанного технического результата в первом варианте получения сфероидов из прикрепленных клеточных культур, клетки культивируют в ростовой среде до стадии 90% монослоя. Затем клетки открепляют от подложки (посредством трипсинирования или любым другим способом, позволяющим получить суспензию клеток) и ресуспендируют в ростовой среде. Суспензию клеток собирают в пробирки и центрифугируют для осаждения клеток (например, 5 мин при скорости 1200 об/мин). Далее супернатант удаляют, а осажденные клетки ресуспендируют в ростовой среде с целью диссоциации клеточных агрегатов. К клеточной суспензии добавляют полимеров 2,5-ДГБК до конечной концентрации не менее 200 мкг/мл и инкубируют в СО₂-инкубаторе до формирования сфероидов. Рост клеточных сфероидов наблюдают визуально посредством микроскопа каждые 48 часов, производя отбор нескольких микролитров суспензии до обнаружения сфероидов, состоящих из 50 и более клеток. После этого среду со сформированными сфероидами собирают и переносят в пробирку и отстаивают 15 минут для осаждения сфероидов. Супернатант удаляют, добавляют ростовую среду, и сфероиды перемешивают плавным покачиванием. Процедуру смены среды повторяют суммарно три раза для удаления следов полимеров 2,5-ДГБК. Для использования в последующих экспериментах, предпочтительно, сфероиды в ростовой среде переносят в культуральную посуду (чашки Петри, планшеты, культуральные флаконы) с неадгезивной поверхностью для предотвращения осаждения и прикрепления клеток сфероидов. Также можно использовать методы перемешивания или вращения для поддержания дальнейшего роста сфероидов в отсутствии полимеров 2,5-ДГБК.

Во втором варианте клетки культивируют в стандартной культуральной посуде (например, 10 см чашке Петри) до стадии монослоя. Далее удаляют ростовую среду и отмывают клетки физиологическим раствором (например, натрий-фосфатным буфером (PBS)) и добавляют раствор полимеров 2,5-ДГБК до конечной концентрации 1 мг/мл в объеме достаточном для равномерного покрытия клеток, после чего клетки инкубируют 5 минут в СО₂ инкубаторе при 37° градусах Цельсия. Далее клетки отделяют от поверхности чашки Петри при помощи шпателя или скребка (или потоком среды в случае слабого прикрепления клеток к подложке) и несколько раз ресуспендируют (оптимально использовать 1 мл пипеточный дозатор), избегая разделения полученных клеточных агрегатов на отдельные клетки. К клеточной суспензии добавляют необходимый объем ростовой среды, чтобы конечная концентрация полимеров 2,5-ДГБК составила не менее 200 мкг/мл и инкубируют в СО₂-инкубаторе до формирования сфероидов (примерно 36 часов). После инкубации среду со сформировавшимися сфероидами переносят в 15 мл пробирку и отстаивают в течение 15 минут. Супернатант удаляют, добавляют ростовую среду, и сфероиды перемешивают плавным покачиванием. Процедуру смены среды повторяют суммарно три раза для удаления следов полимеров 2,5-ДГБК. После сфероиды в ростовой среде переносят на культуральную посуду (чашки Петри, планшеты, культуральные флаконы) с неадгезивной поверхностью для предотвращения осаждения и прикрепления клеток сфероидов. Также можно использовать методы перемешивания или вращения для поддержания дальнейшего роста сфероидов в отсутствии полимеров 2,5-ДГБК.

Третий вариант предусматривает использование заранее подготовленных многолуночных культуральных планшетов (оптимально использовать 96-луночные культуральные планшеты). В стерильных условиях каждую лунку планшета заполняют стерильным минеральным маслом (в случае использование 96-луночных планшетов в каждую лунку вносят 300 микролитров минерального масла) и оставляют на 1 час. После этого минеральное масло удаляют с максимально возможной полнотой. Далее планшет стерилизуют ультрафиолетовым облучением. Клетки выращенные до стадии 90% монослоя, открепляют от подложки (посредством трипсинирования или любым другим способом, позволяющим получить суспензию клеток) и ресуспендируют в ростовой среде. Суспензию клеток собирают в пробирки и центрифугируют для осаждения клеток (например, 5 мин при скорости 1200 об/мин.). Далее супернатант удаляют, а осажденные клетки ресуспендируют в ростовой среде с целью диссоциации клеточных агрегатов. Полученную суспензию клеток разбавляют ростовой средой с таким расчетом, чтобы в объеме среды, равном рабочему объему единичной лунки, находились 10 клеток. Например, в случае использование 96-луночных планшетов, суспензию клеток разбавляют ростовой средой до достижения числа клеток как: 100 клеток в 1 мл ростовой среды. Полученную суспензию наносят на подготовленные культуральные планшеты (в случае использование 96-луночных планшетов - 100 мкл на лунку). Таким образом, 80% лунок содержит 1 клетку (с учетом характера статистического распределения клеток при переносе). Далее планшет инкубируют в СО₂-инкубаторе до образования клонов размером минимум 50-100 клеток. После формирования клонов ростовую среду удаляют и в лунку планшета добавляют 200 мкл ростовой среды содержащей 200 мкг/мл полимеров 2,5-ДГБК. После замены среды планшет несильно ударяют сбоку несколько раз до отделения клеточных клонов от поверхности (сочетание низкоадгезивного покрытия и полимеров 2,5-ДГБК не позволяет отделенным клетками прикрепиться и инициирует процесс образования сфероидов) и инкубируют в СО₂-инкубаторе до формирования сфероидов. После инкубации среду со сформировавшимися сфероидами переносят в 15 мл пробирку и отстаивают в течение 15 минут. Супернатант удаляют, добавляют ростовую среду, и сфероиды перемешивают плавным покачиванием. Процедуру смены среды повторяют суммарно три раза для полного удаления полимеров 2,5-ДГБК. Для использования в последующих экспериментах, сфероиды в ростовой среде переносят в культуральную посуду (чашки Петри, планшеты, культуральные флаконы) с неадгезивной поверхностью для предотвращения осаждения и прикрепления клеток сфероидов к поверхности. Также можно использовать методы перемешивания или вращения для поддержания дальнейшего роста сфероидов в суспензии при отсутствии полимеров 2,5-ДГБК.

В предлагаемом нами техническом решении минимальная концентрация полимеров 2,5-ДГБК, необходимая для формирования сфероидов исследованных клеточных линий, составляла 200 мкг/мл. Хотя, следует отметить, что клетки линии DU145 способны формировать сфероиды (по методике, описанной в варианте 1) в присутствии полимеров 2,5-ДГБК в концентрации 140 мкг/мл. Настоящее техническое решение описывает принципиальную возможность использования полимеров 2,5-ДГБК для индукции образования и дальнейшего роста сфероидов, поэтому концентрации вещества, способные инициировать образование сфероидов, могут варьироваться в зависимости от типа клеточных линий.

Изобретение поясняется следующими рисунками.

Фиг. 1. Сфероиды, сформированные из первичной культуры фибробластов человека полученных из стромы предстательной железы, на разных этапах роста после добавления среды с концентрацией полимеров 2,5-ДГБК 200 мкг/мл. Для формирования сфероидов был использован метод, описанный в варианте 1.

А. Сфероиды фибробластов человека, растущие в присутствии 200 мкг/мл полимеров 2,5-ДГБК.

Б. Сфероид фибробластов человека через 24 часа после удаления полимеров 2,5-ДГБК и переноса в культуральный флакон с адгезивным покрытием. Сфероид при культивировании на адгезивном покрытии прикрепляется к подложке и клетки начинают мигрировать из 3Д структуры. Стрелкой отмечены мигрирующие клетки. Эти данные показывают, что клетки в составе сфероида жизнеспособны и функциональны. Для поддержания клеток в сфероидном состоянии после удаления полимеров 2,5-ДГБК требуется использование условий, предотвращающих осаждения сфероидов и прикрепления клеток (таких как неадгезивные подложки, постоянное перемешивание или ротация).

Фиг. 2. Сфероиды, сформированные в присутствии 200 мкг/мл полимеров 2,5-ДГБК из различных иммортализованных клеточных линий.

A. LNCaP (клетки рака простаты) - сфероиды сформированы с использованием методики, описанной в варианте 1.

Б. DU145 (клетки рака простаты) - сфероиды сформированы с использованием методики, описанной в варианте 1.

B. РС3 (клетки рака простаты) - сфероиды сформированы с использованием методики, описанной в варианте 1.

Г.Т24 (клетки рака мочевого пузыря) - сфероиды сформированы с использованием методики, описанной в варианте 1.

Д. LNCaP (клетки рака простаты) - сфероиды сформированы с использованием методики, описанной в варианте 2.

Е. DU145 (клетки рака простаты) - сфероиды сформированы с использованием методики, описанной в варианте 2.

Фиг. 3. Сфероиды клеток LNCaP, DU145 и Т24 на разных стадиях развития.

A. Сфероиды клеток LNCaP, сформированные в присутствии 200 мкг/мл полимеров 2,5-ДГБК.

Б. Сфероид клеток LNCaP через 340 часов после удаления полимеров 2,5-ДГБК и переноса в культуральный флакон с неадгезивным покрытием (SPL Life Sciences, Республика Корея).

B. Сфероид клеток LNCaP через 24 часа переноса в культуральный флакон с стандартным (адгезивным) покрытием. Сфероид при культивировании в стандартных условиях адгезии при отсутствии полимеров 2,5-ДГБК прикрепляется к подложке и клетки начинают мигрировать из 3Д структуры. Стрелкой отмечены мигрирующие клетки.

Г. Сфероиды клеток DU145, сформированные в присутствии 200 мкг/мл полимеров 2,5-ДГБК.

Д. Сфероид клеток DU145 через 340 часов после удаления полимеров 2,5-ДГБК и переноса в культуральный флакон с неадгезивным покрытием (SPL Life Sciences, Республика Корея).

Е. Сфероид клеток DU145 через 24 часа переноса в культуральный флакон с адгезивным покрытием. Сфероид при культивировании в стандартных условиях адгезии при отсутствии полимеров 2,5-ДГБК прикрепляется к подложке и клетки начинают мигрировать из 3Д структуры. Стрелкой отмечены мигрирующие клетки.

Ж. Сфероид клеток Т24, сформированный в присутствии 200 мкг/мл полимеров 2,5-ДГБК.

З. Сфероид клеток Т24 через 340 часов после удаления полимеров 2,5-ДГБК и переноса культуральный флакон неадгезивным покрытием (SPL Life Sciences, Республика Корея).

И. Сфероиды клеток Т24 через 24 часа переноса в культуральный флакон с адгезивным покрытием. Сфероиды при культивировании в стандартных условиях адгезии при отсутствии полимеров 2,5-ДГБК прикрепляется к подложке и клетки начинают мигрировать из 3Д структуры. Стрелкой отмечены мигрирующие клетки.

Фиг. 4 Результаты вестерн-блот анализа лизатов клеток LnCaP, растущих в монослое и не подвергнутых обработке полимерами 2,5-ДГБК (контроль) и сфероидов, сформированных в присутствии 200 мкг/мл полимеров 2,5-ДГБК. После формирования сфероидов полимеры были удалены и клетки инкубировали в ростовой среде в флаконах с неадгезивным покрытием в течение 0, 24 и 48 часов. Сфероиды были полученных с использованием методики, описанной в варианте 1.

А. Изменения в уровнях фосфорилирования киназы Akt (p-Akt) и общего белка Akt в контрольных клетках 2Д культуре и сфероидах. Интенсивность каждого сигнала соответствует уровню фосфорилирования (для p-Akt) или уровню общего белка в контроле и сфероидах. Актин использовался как контроль равной концентрации белков в каждой пробе.

Б. Денситометрический анализ сигналов, полученных вестерн-блот анализом лизатов контроля и сфероидов, представлен в виде средней плотности пикселей, отражающей изменения уровня белка. Столбики ошибок представляют ±стандартное отклонение.

Как видно из приведенных данных полимеры 2,5-ДГБК способны ингибировать фосфорилирование Akt как наблюдается в лизатах клеток через 0-24 часа после удаления полимеров. Однако, дальнейшее культивирование (48 часов) сформированных сфероидов на неадгезивной поверхности в отсутствии полимера приводит к восстановлению уровня фосфорилированного Akt до уровня сопоставимого с уровнем фосфорилированного Akt в клетках, которые не подвергались обработке полимерами 2,5-ДГБК. Следовательно, через 48 часов после удаления полимеров, сфероиды можно использовать для дальнейших исследований.

Изобретение поясняется примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Клетки первичной культуры фибробластов человека (выделенной из хирургического материала тканей предстательной железы) культивировали в DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), стрептомицина, пенициллина (50 мкг/мл) и L-глютамина (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Культивирование проводили в культуральных флаконах Т25 (Greiner Bio-One GmbH, Германия) в 6,5 мл ростовой среды. После достижения клетками 90% монослоя ростовую среду удаляли и клетки отмывали 5 мл PBS. После удаления PBS использовали 0,05% р-р трипсина с ЭДТА (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) для открепления клеток от подложки. Клетки ресуспендировали в ростовой среде (7,5 мл DMEM/F12 с добавлением 10% FBS) для нейтрализации трипсина и затем центрифугировали 5 минут на скорости 1200 оборотов в минуту. После удаления супернатанта клетки ресуспендировали в 4 мл DMEM/F12 с добавлением 10% FBS. Суспензию переносили в 6 см чашку Петри (Corning, США) с добавлением раствора полимеров 2,5-ДГБК до конечной концентрации 200 мкг/мл. После этого клетки инкубировали 72 часа в СО₂-инкубаторе. Среду со сформированными сфероидами (Фиг. 1А) переносили в пробирку и отстаивали 15 минут для осаждения сфероидов. Супернатант удаляли, добавляли ростовую среду и сфероиды перемешивали плавным покачиванием. Процедуру смены среды повторяли суммарно три раза для полного удаления полимеров 2,5-ДГБК. После сфероиды в ростовой среде переносили в флаконы Т25 с неадгезивным покрытием (SPL LIFESCIENCES, Республика Корея) и использовали в дальнейших исследованиях. Часть ростовой среды со сфероидами отобирали и переносили на 6 см чашку Петри для наблюдения за прикреплением сфероидов к подложке и миграцией клеток из сфероида на поверхность чашки с целью оценки жизнеспособности и функциональности клеток в составе сфероида (Фиг. 1 Б).

Пример 2

Клетки линии LNCap (рак простаты) культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), стрептомицина, пенициллина (50 мкг/мл) и L-глютамина (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Культивирование проводили в культуральных флаконах Т25 (Greiner Bio-One GmbH, Германия) в 6,5 мл ростовой среды. После достижения клетками 90% монослоя ростовую среду удаляли и клетки отмывали 5 мл PBS. После удаления PBS использовали 0,05% р-р трипсина с ЭДТА (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) для открепления клеток от подложки. Клеточную суспензию ресуспендировали в ростовой среде (7,5 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FBS) для нейтрализации трипсина и затем центрифугировали 5 минут на скорости 1200 оборотов в минуту. После удаления супернатанта клетки ресуспендировали в 4 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FBS. Суспензию переносили в 6 см чашку Петри (Corning, США) с добавлением раствора полимеров 2,5-ДГБК до конечной концентрации 200 мкг/мл. После этого клетки инкубировали 72 часа в СО₂-инкубаторе. Среду со сформированными сфероидами (Фиг. 2 А, Фиг. 3 А) переносили в пробирку и отстаивали 15 минут для осаждения сфероидов. Супернатант удаляли, добавляли ростовую среду и сфероиды перемешивали плавным покачиванием. Процедуру смены среды повторяли суммарно три раза для полного удаления полимеров 2,5-ДГБК. Затем сфероиды в ростовой среде переносили в флаконы Т25 с неадгезивным покрытием (SPL LIFESCIENCES, Республика Корея) и использовали в дальнейших исследованиях. Сфероиды в флаконах Т25 с неадгезивным покрытием инкубировали 340 часов в СО₂-инкубаторе с заменой среды каждые три дня на свежую. По истечении данного срока сфероиды сохраняли характерную 3Д структуру, активно росли, увеличиваясь в размерах (Фиг. 3 Б). После 340 часовой инкубации в флаконах Т25 с неадгезивной поверхностью ростовую среду со сфероидами переносили на 6 см чашку Петри для наблюдения за прикреплением сфероидов к подложке и миграцией клеток из сфероида на поверхность чашки с целью оценки жизнеспособности и функциональности в составе сфероида (Фиг. 3 В).

Пример 3

Клетки линии DU145 (рак простаты) культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), стрептомицина, пенициллина (50 мкг/мл) и L-глютамина (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Культивирование проводили в культуральных флаконах Т25 (Greiner Bio-One GmbH, Германия) в 6,5 мл ростовой среды. После достижения клетками 90% монослоя ростовую среду удаляли и клетки отмывали 5 мл PBS. После удаления PBS использовали 0,05% р-р трипсина с ЭДТА (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) для открепления клеток от подложки. Клеточную суспензию ресуспендировали в ростовой среде (7,5 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FBS) для нейтрализации трипсина и затем центрифугировали 5 минут на скорости 1200 оборотов в минуту. После удаления супернатанта клетки ресуспендировали в 4 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FBS. Суспензию переносили в 6 см чашку Петри (Corning, США) с добавлением раствора полимеров 2,5-ДГБК до конечной концентрации 200 мкг/мл. После этого клетки инкубировали 72 часа в СО₂-инкубаторе. Среду со сформированными сфероидами (Фиг. 2 Б, Фиг. 3 Г) переносили в пробирку и отстаивали 15 минут для осаждения сфероидов. Супернатант удаляли, добавляли ростовую среду и сфероиды перемешивали плавным покачиванием. Процедуру смены среды повторяли суммарно три раза для полного удаления полимеров 2,5-ДГБК. Затем сфероиды в ростовой среде переносили в флаконы Т25 с неадгезивным покрытием (SPL LIFESCIENCES, Республика Корея) и использовали в дальнейших исследованиях. Сфероиды в флаконах Т25 с неадгезивным покрытием инкубировали 340 часов в СО₂-инкубаторе с заменой среды каждые три дня на свежую. По истечении данного срока сфероиды сохраняли характерную 3Д структуру, активно росли, увеличиваясь в размерах (Фиг. 3 Д). После 340 часовой инкубации в флаконах Т25 с неадгезивным покрытием ростовую среду со сфероидами переносили на 6 см чашку Петри для наблюдения за прикреплением сфероидов к подложке и миграцией клеток из сфероида на поверхность чашки с целью оценки жизнеспособности и функциональности в составе сфероида (Фиг. 3 Е).

Пример 4

Клетки линии РС3 (рак простаты) культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), стрептомицина, пенициллина (50 мкг/мл) и L-глютамина (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Культивирование проводили в культуральных флаконах Т25 (Greiner Bio-One GmbH, Германия) в 6,5 мл ростовой среды. После достижения клетками 90% монослоя ростовую среду удаляли и клетки отмывали 5 мл PBS. После удаления PBS использовали 0,05% р-р трипсина с ЭДТА (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) для открепления клеток от подложки. Клеточную суспензию ресуспендировали в ростовой среде (7,5 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FBS) для нейтрализации трипсина и затем центрифугировали 5 минут на скорости 1200 оборотов в минуту. После удаления супернатанта клетки ресуспендировали в 4 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FBS. Суспензию переносили в 6 см чашку Петри (Corning, США) с добавлением раствора полимеров 2,5-ДГБК до конечной концентрации 200 мкг/мл. После этого клетки инкубировали 72 часа в СО₂-инкубаторе. Среду со сформированными сфероидами (Фиг. 2 В) переносили в пробирку и отстаивали 15 минут для осаждения сфероидов. Супернатант удаляли, добавляли ростовую среду и сфероиды перемешивали плавным покачиванием. Процедуру смены среды повторяли суммарно три раза для полного удаления полимеров 2,5-ДГБК. Затем сфероиды в ростовой среде переносили в флаконы Т25 с неадгезивным покрытием (SPL LIFESCIENCES, Республика Корея) и использовали в дальнейших исследованиях.

Пример 5

Клетки линии Т24 (рак мочевого пузыря) культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), стрептомицина, пенициллина (50 мкг/мл) и L-глютамина (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Культивирование проводили в культуральных флаконах Т25 (Greiner Bio-One GmbH, Германия) в 6,5 мл ростовой среды. После достижения клетками 90% монослоя ростовую среду удаляли и клетки отмывали 5 мл PBS. После удаления PBS использовали 0,05% р-р трипсина с ЭДТА (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) для открепления клеток от подложки. Клеточную суспензию ресуспендировали в ростовой среде (7.5 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FBS) для нейтрализации трипсина и затем центрифугировали 5 минут на скорости 1200 оборотов в минуту. После удаления супернатанта клетки ресуспендировали в 4 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FBS. Суспензию переносили в 6 см чашку Петри (Corning, США) с добавлением раствора полимеров 2,5-ДГБК до конечной концентрации 200 мкг/мл. После этого клетки инкубировали 72 часа в СО₂-инкубаторе. Среду со сформированными сфероидами (Фиг. 2 Г, Фиг. 3 Ж) переносили в пробирку и отстаивали 15 минут для осаждения сфероидов. Супернатант удаляли, добавляли ростовую среду и сфероиды перемешивали плавным покачиванием. Процедуру смены среды повторяли суммарно три раза для полного удаления полимеров 2,5-ДГБК. Затем сфероиды в ростовой среде переносили в флаконы Т25 с неадгезивным покрытием (SPL LIFESCIENCES, Республика Корея) и использовали в дальнейших исследованиях. Сфероиды в флаконах Т25 с неадгезивным покрытием инкубировали 340 часов в СО₂-инкубаторе с заменой среды каждые три дня на свежую. По истечении данного срока сфероиды сохраняли характерную 3Д структуру, активно росли, увеличиваясь в размерах (Фиг. 3З). После 340 часовой инкубации в флаконах Т25 с неадгезивным покрытием ростовую среду со сфероидами переносили на 6 см чашку Петри для наблюдения за прикреплением сфероидов к подложке и миграцией клеток из сфероида на поверхность чашки с целью оценки жизнеспособности и функциональности в составе сфероида (Фиг. 3 И).

Пример 6

Заранее подготавливали 96-луночные культуральные планшеты (Greiner Bio-One GmbH, Германия): в стерильных условиях в каждую лунку добавили по 200 мкл стерильного минерального масла (MP Biomedicals, Франция) и оставили на 1 час. После этого минеральное масло удаляли с максимально возможной полнотой. Далее планшет повторно стерилизовали облучением ультрафиолетом в течении 1 часа в ламинарном шкафу. Клетки линии LNCap, (рак простаты) культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), стрептомицина, пенициллина (50 мкг/мл) и L-глютамина (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Культивирование проводили в культуральных флаконах Т25 (Greiner Bio-One GmbH, Германия) в 6,5 мл ростовой среды. После достижения клетками 90% монослоя ростовую среду удаляли и клетки отмывали 5 мл PBS. После удаления PBS использовали 0,05% р-р трипсина с ЭДТА (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) для открепления клеток от подложки. Клеточную суспензию ресуспендировали в ростовой среде (7,5 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FBS) для нейтрализации трипсина и затем центрифугировали 5 минут на скорости 1200 оборотов в минуту. После удаления супернатанта клетки ресуспендировали в 4 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FBS. Концентрацию клеток определяли методом подсчета клеток в камере Горяева (итоговая концентрация клеток составила 1,7×10⁶ клеток в мл среды). Далее суспензию клеток методом последовательных разбавлений в полной ростовой среде разбавили до концентрации 100 клеток в 1 мл среды. Полученную суспензию нанесли на подготовленные культуральные планшеты по 100 мкл на лунку. Т.е. большинство лунок содержали 1 клетку. Далее планшет инкубировали 120 часов в СО₂-инкубаторе. После инкубации удалили ростовую среду и заменили ее на ростовую среду с концентрацией полимеров 2,5-ДГБК 200 мкг/мл. После замены среды планшет несильно ударили сбоку несколько раз. Далее клетки инкубировали 48 часов в СО₂-инкубаторе. Среду со сформированными сфероидами переносили в пробирку и отстаивали 15 минут для осаждения сфероидов. Супернатант удаляли, добавляли ростовую среду и сфероиды перемешивали плавным покачиванием. Процедуру смены среды повторяли суммарно три раза для полного удаления полимеров 2,5-ДГБК. Затем сфероиды в ростовой среде переносили в флаконы Т25 с неадгезивным покрытием (SPL LIFESCIENCES, Республика Корея) и использовали в дальнейших исследованиях.

Пример 7

Клетки линии LNCap, (рак простаты) культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, стрептомицина, пенициллина (50 мкг/мл) и L-глютамина (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Культивирование производили на 10 см чашках Петри (Greiner Bio-One GmbH, Германия) в 10 мл ростовой среды. После достижения клетками 100% монослоя ростовую среду удаляли и на клетки наносили 5 мл PBS. PBS удаляли и наносили 2 мл раствора полимеров 2,5-ДГБК с концентрацией 1 мг/мл, после чего инкубировали 5 минут в СО₂-инкубаторе при 37 градусах Цельсия. Далее клетки отделяли от поверхности чашки Петри при помощи клеточного скребка и несколько раз ресуспендировали (не допуская полного разделения клеточных агрегатов на отдельные клетки) при помощи 1 мл пипетки-дозатора. К раствору полимеров 2,5-ДГБК добавляли 8 мл ростовой среды RPMI-1640 (5%FBS) с добавлением антибиотиков и глутамина и инкубировали 48 часов в СО₂ инкубаторе (5% содержание СО₂) при 37 градусах Цельсия. Среду со сформированными сфероидами (Фиг. 2 Д) переносили в пробирку и отстаивали 15 минут для осаждения сфероидов. Супернатант удаляли, добавляли ростовую среду и сфероиды перемешивали плавным покачиванием. Процедуру смены среды повторяли суммарно три раза для полного удаления полимеров 2,5-ДГБК. Затем сфероиды в ростовой среде переносили в флаконы Т25 с неадгезивным покрытием (SPL LIFESCIENCES, Республика Корея) и использовали в дальнейших исследованиях.

Пример 8

Клетки DU145 (рак простаты) культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, стрептомицина, пенициллина (50 мкг/мл) и L-глютамина (РаnЕсо, Москва, Российская Федерация) при 37 0 С в атмосфере 5% СО₂. Культивирование производили на 10 см чашках Петри (Greiner Bio-One GmbH, Германия) в 10 мл ростовой среды. После достижения клетками 100% монослоя ростовую среду удаляли и на клетки наносили 5 мл PBS. PBS удаляли и наносили 2 мл раствора полимеров 2,5-ДГБК с концентрацией 1 мг/мл, после чего инкубировали 5 минут в СО₂-инкубаторе при 37 градусах Цельсия. Далее клетки отделяли от поверхности чашки Петри при помощи клеточного скребка и несколько раз ресуспендировали (не допуская полного разделения клеточных агрегатов на отдельные клетки) при помощи 1 мл пипетки-дозатора. К раствору полимеров 2,5-ДГБК добавляли 8 мл ростовой среды RPMI-1640 (5%FBS) с добавлением антибиотиков и глутамина и инкубировали 48 часов в СО₂ инкубаторе (5% содержание СО₂) при 37 градусах Цельсия. Среду со сформированными сфероидами (Фиг. 2 Е) переносили в пробирку и отстаивали 15 минут для осаждения сфероидов. Супернатант удаляли, добавляли ростовую среду и сфероиды перемешивали плавным покачиванием. Процедуру смены среды повторяли суммарно три раза для полного удаления полимеров 2,5-ДГБК. Затем сфероиды в ростовой среде переносили в флаконы Т25 с неадгезивным покрытием (SPL LIFESCIENCES, Республика Корея) и использовали в дальнейших исследованиях.

Пример 9

Как упоминалось ранее, такие индукторы формирования сфероидов как RGD-пептид и его производные способны влиять на жизнеспособность клеток через интегрин зависимые сигнальные пути, что ограничивает использование полученных таким образом сфероидов для скриннинга лекарственных средств. Мы проверили, способны ли полимеры 2,5-ДГБК влиять на сигнальные пути клеток, регулирующие клеточный гомеостаз. После проведения фосфопротеомного анализа было обнаружено, что обработка полимерами 2,5-ДГБК приводит к ингибированию киназ группы Akt в клетках, растущих в 2Д-культуре. Для изучения влияют ли полимеры на активность киназ при формировании сфероидов, мы исследовали уровень фосфорилирования Akt в сфероидах клеток рака предстательной железы LnCaP. Для этого, полученные как описано в примере 2, сфероиды были перенесены в флаконы с неадгезивным покрытием и культивированы в течении 48 часов в ростовой среде с отбором проб через 0, 24 и 48 часов после удаления полимеров. В качестве контроля были использованы клетки LNCaP, культивированые до стадии монослоя в 2Д культуре. Относительные уровни экспрессии белка определяли методом вестерн блот анализа и денситометрией сигналов с использованием программного обеспечения Studio Image Lite (версия 5.2). Результаты показали, что в 3Д-культурах под воздействием полимеров 2,5-ДГБК происходит ингибирование активности Akt, наблюдаемое как снижение уровня фосфорилирования киназы (Фиг. 4). Однако, инкубация сфероидов в отсутствии полимеров 2,5-ДГБК приводит к постепенному восстановлению фосфорилирования Akt до уровня, сопоставимого с активностью киназы в клетках, не подвергавшихся обработке полимерами (Фиг. 4). Следовательно, через 48 часов после удаления полимеров, клеточные сфероиды можно использовать для последующих экспериментов и скрининга лекарственных препаратов поскольку действие полимеров 2,5-ДГБК является временным и жизнедеятельность клеток сфероидов полностью восстанавливается до нормального уровня после удаления соединения.

Список цитируемой литературы.

1. Egeblad, М., Nakazone, E.S., Werb Z. Tumors as organs: Complex tissues that interface with the entire organism. Dev. Cell 2010, 18, 884-901.

2. Mulholland T, McAllister M, Patek S, et al. Drug screening of biopsy-derived spheroids using a self-generated microfluidic concentration gradient. Sci Rep.2018; 8(1):14672. Published 2018 Oct 2. doi:10.1038/s41598-018-33055-0.

3. Lin RZ, Chang HY. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 2008 Oct; 3(9-10):1 172-84. doi: 10.1002/biot.200700228. Review. Erratum in: Biotechnol J. 2008 Oct; 3(9-10):1285. Lin, Ruei-Zhen [corrected to Lin, Ruei-Zeng]. PubMed PMID: 18566957.

4. Harrison, R.G. et al. "Observations of the living developing nerve fiber". Anat. Rec. i, (1907) p. 16-128.

5. Breslin S, O'Driscoll L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 2013 Mar; 18(5-6):240-9. doi:10.1016/j.drudis.2012.10.003. Epub 2012 Oct 13. Review. PubMed PMID: 23073387.

6. Desoize B, Jardillier J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Crit Rev Oncol Hematol. 2000 Nov-Dec; 36(2-3): 193-207. Review. PubMed PMID: 11033306.

7. Dardousis K, Voolstra C, Roengvoraphoj M, Sekandarzad A, Mesghenna S, Winkler J, Ко Y, Hescheler J, Sachinidis A. Identification of differentially expressed genes involved in the formation of multicellular tumor spheroids by HT-29 colon carcinoma cells. Mol Ther. 2007 Jan; 15(1):94-102. PubMed PMID: 17164780.

8. Ghosh S, Joshi MB, Ivanov D, Feder-Mengus C, Spagnoli GC, Martin I, Erne P, Resink TJ. Use of multicellular tumor spheroids to dissect endothelial cell-tumor cell interactions: a role for T-cadherin in tumor angiogenesis. FEBS Lett. 2007 Sep 18; 581(23):4523-8. Epub 2007 Aug 28. PubMed PMID: 17765896.

9. Feder-Mengus C, Ghosh S, Weber WP, et al. Multiple mechanisms underlie defective recognition of melanoma cells cultured in three-dimensional architectures by antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. Br J Cancer. 2007; 96(7): 1072-1082. doi:10.1038/sj.bjc.6603664.

10. Durand RE. Slow penetration of anthracyclines into spheroids and tumors: a therapeutic advantage? Cancer Chemother Pharmacol. 1990; 26(3): 198-204. PubMed PMID: 2357767.

11. Bartholoma, P., et al., "A more aggressive breast cancer spheroid odel coupled to an electronic capillary sensor system for a high-content screening of cytotoxic agents in cancer therapy: 3-dimensionat in vitro tumor spheroids as a screening model J. Biomol. Screen. 0 (2005), pp. 705-714.

12. Friedrich, J., et al., "Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach." Nature Protoc. 4 (2009), pp. 309-324.

13. Kunz-Schughart LA, et al., "The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model." J Biomol Screen 9 (2004) pp. 273-285.

14. Crit Rev Oncol Hematol. 2000 Nov-Dec; 36(2-3):/179-92. Spheroids in radiobiology and photodynamic therapy. Dubessy C, Merlin JM, Marchal C, Guillemin F.

15. Lin Z, et al., "Magnetic reconstruction of three dimensional tissues from multicellular spheroids." Tissue Eng Part С Methods 14 (2008) pp. 197-205.

16. Steer DL, Nigam SK. Developmental approaches to kidney tissue engineering. Am J Physiol Renal Physiol. 2004 Jan; 286(1):F1-7. Review. PubMed PMID: 14656756.

17. Ivascu, A. and Kubbies, M. " Rapid generation of single - tumor spheroids for high - throughput cell function and toxicity analysis. " J. Biomol. Screen. 11 (2006), pp. 922-932.

18. Friedrich, J. et al. " Spheroid - based drug screen: considerations and practical approach. " Nat. Protoc. 4 (2009), pp. 309-324.

19. Li, Q. et al. " 3D models of epithelial - mesenchymal transition in breast cancer metastasis. " J. Biomol. Screen. 16 (2011), p. 141-154.

20. Klinder A, Markhoff J, Jonitz-Heincke A, Sterna P, Salamon A, Bader R. Comparison of different cell culture plates for the enrichment of non-adherent human mononuclear cells. Exp Ther Med. 2019;17(3):2004-2012. doi:10.3892/etm.2019.7204.

21. Keller G.M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 1995 Dec; 7(6):862-9. Review. PubMed PMID: 8608017.

22. Kelm JM, Timmins NE, Brown CJ, Fussenegger M, Nielsen LK. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 2003 Jul 20;83(2): 173-80. PubMed PMID: 12768623.

23. Kurosawa, H. "Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.".J. Biosci. Bioeng. 03 (2007), pp. 389-398.

24. Timmins NE, Nielsen LK. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 2007; 140:141-51. PubMed PMID: 18085207.

25. Kim, J.B. "Three-dimensional tissue culture models in cancer biology." Semin. Cancer Biol. 5 (2005), pp. 365-377.

26. Barrila J, Radtke AL, A, Sarker SF, Herbst-Kralovetz MM, Ott CM, Nickerson CA. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 2010 No; 8(11):791-801. doi: 10.1038/nrmicro2423. Review. PubMed PMID: 20948552.

27. Lin, R.Z. and Chang, H.Y. "Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research " Biotechnology Journal, 3 (2008), pp. 172-184.

28. WD, Zhang L, Wu CL, et al. Development of an acellular tumor extracellular matrix as a three-dimensional scaffold for tumor engineering. PLoS One. 2014; 9(7):el03672. Published 2014 Jul 29. doi:10.1371/journal.pone.0103672.

29. Hughes CS, Postovit LM, Lajoie GA. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics.2010 May; 10(9):1886-90.doi: 10.1002/pmic.200900758. PubMed PMID: 20162561.

30. Porzionato A, Stocco E, Barbon S, Grandi F, Macchi V, De Caro R. Tissue-Engineered Grafts from Human Decellularized Extracellular Matrices: A Systematic Review and Future Perspectives. Int J Mol Sci. 2018 Dec 18; 19(12). pii: E4117. doi: 10.3390/ijmsl9124117. PubMed PMID: 30567407; PubMed Central PMCID: PMC6321114.

31. Nath S, Devi GR. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacol Ther. 2016;163:94-108.doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.03.013.

32. Sodunke, T. R. et al. "Micropatterns of Matrigel for three-dimensional epithelial cultures." Biomaterials 28 (2007), pp. 4006-4016.

33. Nath S, Devi GR. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacol Ther. 2016;163:94-108.doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.03.013.

34. Sourla, A. et al. "Three-dimensional type I collagen gel system containing MG-63 osteoblasts-like cells as a model for studying local bone reaction caused by metastatic cancer cells." Anticancer Res. 16 (1996), pp. 2773-2780,

35. Directing the Self-assembly of Tumour Spheroids by Bioprinting Cellular Heterogeneous Models within Alginate/Gelatin Hydrogels Tao Jiang, Jose G. Munguia-Lopez, Salvador Flores-Torres, Joel Grant, Sanahan Vijayakumar, Antonio De Leon-Rodriguez & Joseph M. Kinsella Scientific Reports 7, Article number: 4575 (2017).

36. Akasov R., Gileva A., Zaytseva-Zotova D., Burov S., Chevalot I., Guedon E., Markvicheva E., 3D in vitro co-culture models based on normal cells and tumor spheroids formed by cyclic RGD-peptide induced cell self-assembly // Biotechnol Lett. 2017 Jan; 39(1):45-53.

37. Buckley CD, Pilling D, Henriquez NV, Parsonage G, Threlfall K, Scheel-Toellner D, Simmons DL, Akbar AN, Lord JM, Salmon M. RGD peptides induce apoptosis by direct caspase-3 activation. Nature. 1999 Feb 11;397(6719):534-9. PubMed PMID: 10028971.

38. Kang, I.C.; Kim, D.S.; Jang, Y.; Chung, K.H. Suppressive mechanism of salmosin, a novel disintegrin in B16 melanoma cell metastasis. Biochem. Bioph. Res.Comm. 2000. 275, 169-173.

39. Ritchie, C.K.; Giordano, A.; Khalili, K. Integrin involvement in glioblastoma multiforme: Possible regulation by NF-κВ. J. Cell Physiol. 2000, 184, 214-221.

40. Anuradha, C; Kanno, S.; Hirano, S. RGD peptide-induced apoptosis in human leukemia HL-60 cells requires caspase-3 activation. Cell Biol. Toxicol. 2000, 16, 275-283.

Способ получения сфероидов, посредством обработки клеток полимерами 2,5-ДГБК из прикрепленных культур клеток млекопитающих, включающий: культивирование клеток в стандартной для них ростовой среде до стадии субмонослоя с последующим откреплением от подложки, ресуспендированием и переносом клеток в ростовую среду, содержащую полимеры 2,5-ДГБК (здесь и в дальнейшем молекулярная масса полимеров 40 кДа) в концентрации от 50 мкг/мл до 400 мкг/мл, и инкубированием клеток до образования сфероидов, либо культивирование клеток в стандартной для них ростовой среде до достижения клетками высокой плотности с последующей заменой ростовой среды на ростовую среду с добавлением полимеров 2,5-ДГБК в концентрации от 50 мкг/мл до 400 мкг/мл и отделением клеток от подложки при помощи механического воздействия и инкубированием полученных клеточных агрегатов без разделения на отдельные клетки в ростовой среде с добавлением полимеров 2,5-ДГБК в концентрации от 50 мкг/мл до 400 мкг/мл до формирования сфероидов, либо культивирование единичных клеток на многолуночных планшетах с низкоадгезивным покрытием до формирования клонов с последующей заменой ростовой среды на среду, содержащую полимеры 2,5-ДГБК в концентрации от 50 мкг/мл до 400 мкг/мл, и отделением клеток от подложки механическими методами и инкубированнием клонов в суспензии в присутствии полимеров в концентрации от 50 мкг/мл до 400 мкг/мл до образования сфероидов, состоящих из клеток, являющихся потомками единичной клетки и, следовательно, представляющих клон генетически идентичных клеток.