Способ диагностики рецепторного профиля эндометрия в абортном материале беременности раннего срока

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии. Способ диагностики рецепторного профиля эндометрия абортного материала раннего срока беременности заключается в том, что выполняют иммуногистохимическое исследование образцов ткани гравидарного эндометрия с использованием антител соответственно к эстрогенам ER - клон 1D5, разведение 1:40 и прогестерону PR - клон PgR 636, разведение 1:50, с демаскировкой путем высокотемпературной обработки образца ткани эндометрия и при выявлении неравномерного распределения экспрессии и значениий экспрессии эстрогенов в железах и строме эндометрия в компактном и спонгиозном слоях менее 100 баллов H-Score до 0 баллов, экспрессии рецепторов прогестерона в железах эндометрия в компактном и спонгиозном слоях 0 баллов H-Score и значениях экспрессии рецепторов прогестерона в строме компактного и спонгиозного слоев от 250 до 100 баллов H-Score диагностируют нормальное гормональное состояние гравидарного эндометрия, соответствующее референсным значениям, в остальных случаях диагностируют гормональную патологию гравидарного эндометрия. Изобретение обеспечивает диагностику состояния рецепторного профиля гравидарного эндометрия I триместра беременности, что будет способствовать снижению репродуктивных потерь ранних сроков беременности. 4 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии, и может быть использовано для диагностики рецепторного профиля эндометрия в абортном материале беременности раннего срока.

Проблема репродуктивных потерь ранних сроков остается значимой и актуальной в акушерско-гинекологической практике, поскольку каждая 5-я беременность раннего срока (от 5 до 12 недель беременности) прерывается, определяя тем самым медико-соцальную озабоченность (Айламазян Э.К., 2002, 2007; Тетруашвили Н.К, 2008; Воропаева Е.Е., 2011; Траль Т.Г. и соавт. 2013, Подзолкова Н.М., 2013; Forbes K. et al., 2010; Benirschke K. et al., 2006).

Факторы прерывания беременности I триместра (хромосомные, эндокринные, аутоиммунные и инфекционно-воспалительные) изучены достаточно подробно иностранными и отечественными исследователями (Воропаева Е.Е. 2011; Толибова Г.Х и соавт. 2016, Vojvodic S et al., 2001; Vitzthum V J. et al., 2006; Salazar E.L. et al., 2007).

Прерывание беременности в I триместре по причине гормонального дисбаланса в женском организме выявляется почти в половине случаев потерь беременностей, однако есть мнение, что субклинические гормональные нарушения выявляются у 2/3 пациенток.

Значимым составляющим наступления и развития беременности является гормональный статус эндометрия, в частности состояние рецепторов к эстрогенам и прогестерону. Необходимо отметить, что ключевым звеном циклической трансформации и имплантационной восприимчивости эндометрия является ни столько количественные, сколько качественные характеристики рецепторов эстрогенов и прогестерона.

При функциональном дисбалансе рецепторов в эндометрии происходят нарушения гравидарной перестройки, слабая трофобластическая инвазия в зоне нидации. При этом клетки трофобласта не достигают необходимой глубины инвазии, и беременность прекращает свое развитие. Если беременность прогрессирует, выявляется недостаточный физиологический некроз стенок спиральных артерий, что неизбежно служит причиной формирования первичной плацентарной недостаточности.

Нарушение маточно-плацентарного кровотока приводит к недостаточному поступлению питательных веществ, гормонов и дисбалансу дыхательной функции, развивающемуся виллезному Дереву и растущему эмбриону.

Несмотря на актуальность проблемы, в настоящее время отсутствуют нормативные показатели состояния рецепторного профиля гравидарного эндометрия беременности раннего срока.

Техническим результатом изобретения является определение референсных значений экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона в гравидарном эндометрии I триместра беременности и использование этих значений для диагностики состояния рецепторного профиля гравидарного эндометрия I триместра беременности, что будет способствовать снижению репродуктивных потерь ранних сроков беременности.

Указанный технический результат достигается в способе диагностики рецепторного профиля эндометрия абортного материала раннего срока беременности, в котором выполняют иммуногистохимическое исследование образцов ткани гравидарного эндометрия с использованием антител соответственно к эстрогенам ER - клон 1D5, разведение 1:40 и прогестерону PR - клон PgR 636, разведение 1:50, с демаскировкой путем высокотемпературной обработки образца ткани эндометрия и при выявлении неравномерного распределения экспрессии и значений экспрессии эстрогенов в железах и строме эндометрия в компактном и спонгиозном слоях менее 100 баллов H-Score до 0 баллов, экспрессии рецепторов прогестерона в железах эндометрия в компактном и спонгиозном слоях 0 баллов H-Score и значениях экспрессии рецепторов прогестерона в строме компактного и спонгиозного слоев от 250 до 100 баллов H-Score диагностируют нормальное гормональное состояние гравидарного эндометрия, соответствующее референсным значениям, в остальных случаях диагностируют гормональную патологию гравидарного эндометрия.

Авторами изобретения разработан высокотехнологичный способ диагностики оценки состояния рецепторного профиля гравидарного эндометрия.

Были определены референсные значения экспрессии эстрогенов и прогестерона в эндометрии при нормально протекающей беременности, наступившей естественным путем и прерванной по желанию женщины хирургическим способом.

Способ иллюстрируется фиг. 1-4, где:

на фиг. 1 - завершенная гравидарная перестройка эндометрия, а - эндометрий с децидуоцитами эпителиоидного типа, пузырьковидным ядром. Г-Э, ×400; б - гиперсекреторная перестройка желез спонгиозного слоя с характерными звездчатыми очертаниями. Г-Э, ×100.

на фиг. 2 - завершенная гравидарная перестройка эндометрия, а - неравномерная экспрессия рецепторов ER в железистом и стромальном компонентах компактного эндометрия. ИГХ ×200; б - неравномерная экспрессия рецепторов ER в железистом и стромальном компонентах спонгиозного эндометрия. ИГХ ×200;

на фиг. 3 - завершенная гравидарная перестройка эндометрия, а - неравномерная экспрессия рецепторов PR в компактном слое эндометрия. ИГХ ×400; б - равномерное распределение экспрессии рецепторов PR в спонгиозном слое эндометрия, отрицательная экспрессия рецепторов PR в железах эндометрия. ИГХ ×200;

на фиг. 4 - завершенная гравидарная перестройка эндометрия, а -неравномерное распределение экспрессии ER в строме эндометрия и отсутствие экспрессии в железах (желтая флюоресценция), синяя флуоресценция - Hoechst, ×100; б - равномерная экспрессия PR в строме спонгиозного слоя эндометрия (зеленая флюоресценция) и отрицательная экспрессия в железах, красная флюоресценция - Hoechst, ×100.

В исследований использовали 40 образцов абортивного материала, полученного после хирургического опорожнения полости матки на сроке от 5 до 11 недель по желанию женщины.

Для проведения гистологического исследования абортивный материал фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина 24-48 часов. Далее с помощью автоматического гистопроцессора осуществляли проводку тканей, при помощи заливочной станции готовили парафиновые блоки. С использованием микротома готовили гистологические срезы толщиной 3-4 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином. Готовые микропрепараты исследовали при помощи светового микроскопа Olympus СХ31 (Япония) при увеличении ×100, ×400. При световой микроскопии оценивали полноценность (завершенность) гравидарной перестройки компактного и спонгиозного слоев эндометрия, а также перестройку желез в каждом слое. Оценивали инвазию клеток трофобласта в зоне нидации, а также формирование клубков спиральных артерий и фибриноидный некроз стенок сосудов, эмбриогистологический срок прекращения развития беременности.

Иммуногистохимическое исследование выполняли на ступенчатых срезах парафиновых блоков толщиной 4-6 мкм с использованием предметных стекол, покрытых адгезивным покрытием. Для выявления иммуногистохймичской реакции использовали набор Dako Cytomation LSAB2 System-HRP (Dako). Далее для оценки рецепторного профиля эндометрия (рецепторов к эстрогену и прогестерону) в гравидарном эндометрии использовали антитела к рецепторам эстрогена ER [клон 1D5, разведение 1:40] и рецепторам прогестерона PR [клон PgR 636, разведение 1:50] производства (Dako) Cytomation. Иммуногистохимическая постановка проведена стандартным способом.

Количественную оценку результатов иммуногистохимической реакции проводили на микроскопе Olympus ВХ46 с помощью программного обеспечения "CellSens 47 Entry" Nikon Eclipse E400.

Рецепторный профиль рецепторов половых гормонов проводили осуществляли полу количественным методом:

Histochemical Score = ΣP(i)×I (2), где:

i - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3: 0 - нет окрашивания, 1 - слабое окрашивание, 2 - умеренное окрашивание, 3 - сильное окрашивание;

P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.

Максимальное значение счета должно соответствовать 300 единицам.

Применяли модификацию подсчета экспрессии с максимальными и минимальными (равномерное или неравномерное распределение) значениями по методике Толибовой Г.Х. и соавт, 2016 г. (Толибова Г.Х. и соавт., 2016).

Иммунофлюоресцентный анализ проводили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma, Япония). Для иммунофлюоресцентного анализа использовали стандартный одноэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в цитратном буфере с кислой рН. Применяли первичные антитела в разведениях: ER [клон 1D5] (1:60), PR [клон PR 636] (1:50). Инкубацию с вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor 647 и Alexa Fluor 488 (1:1000, Abeam, Англия), проводили во влажной камере в течение 30 мин. при комнатной температуре в темноте. Ядра клеток маркировали Hoechst 33258 (Sigma, США). Полученные препараты заключали под покровные стекла с помощью Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako, США). Реакцию визуализировали с помощью конфокального лазерного микроскопа FlueView 1000 (Olympus, Япония) и программного обеспечения "FV10-ASW" при увеличении ×100, ×200, ×400. Для выявления экспрессии эстрогенов (ER) и прогестерона (PR) применяли лазеры с длинами волн 650 нм и 500 нм, для визуализации ядер клеток - 405 нм. Для определения ER использовали желтый и синий цветовые каналы, а для PR - зеленый и красный. Трехмерное построение срезов делали с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа Olympus Flue View 1000 (Olympus, Япония).

Данные гистологического исследования образцов абортного материала (n-40) показали, что полноценная гравидарная перестройка компактного и спонгиозного слоев отмечена в 100% случаев. Полноценная перестройка характеризовалась наличием плотно лежащих, образующих единый пласт, крупных децидуальных клеток эпителиоидного типа с четкими границами, наличием округлого или овального ядра с мелкозернистым хроматином, а также тонким ободком цитоплазмы (фиг. 1а).

Полноценная трансформация желез была представлена сужением просвета до щелевидного и уплощением эпителия. Спонгиозный слой представлен железами с чертами гиперсекреции, выраженными псевдососочковыми разрастаниями и оптически пустой цитоплазмой при наличии пузырьковидного ядра и щелевидного просвета, разделенные тонкими прослойками стромы (фиг. 1б).

Результаты иммуногистохимического (ИГХ) исследования экспрессии эстрогенов (ER) в железах и строме гравидарного эндометрия выявили неравномерное распределение и слабо окрашивание (менее 100 по H-Score (фиг. 2).

Исследование экспрессии рецепторов прогестерона в железах и строме гравидарного эндометрия показало несколько иные результаты: во всех железах эндометрия экспрессии рецепторов прогестерона была снижена до нулевых значений, тогда как в строме экспрессия имела неравномерное распределение и составила 250-100 по H-Score (фиг. 3).

При проведении конфокальной лазерной сканирующей микроскопии получены аналогичные результаты (фиг. 4).

Данные гистологической диагностики выявили полноценную гравидарную трансформацию в стромальном и железистом компонентах компактного й спонгиозного слоев эндометрия во всех образцах абортного материала на сроке от 5 до 11 недель. Иммуногистохимическое и иммунофлюоресцентное исследование выявили разные характеристики экспрессии эстрогенов и Прогестерона в обоих компонентах эндометрия при беременности.

Экспрессия рецепторов эстрогена в железистом и стромальном компонентах эндометрия в компактном и спонгиозном слоях распределена неравномерно и характеризовалась низким уровнем экспрессии от 100 до 0 баллов H-Score.

Экспрессия прогестерона в железах компактного и спонгиозного слоев снижена до нулевых значений, что является нормой. Экспрессия рецепторов прогестерона в строме компактного и спонгиозного слоев распределена неравномерно и характеризуется умеренным и высоким уровнем экспрессии от 250 до 100 баллов H-Score.

Полученные результаты могут быть применены в рутинной патологоанатомической практике и служить базовой основой для диагностики рецепторного дисбаланса эстрогенов и прогестерона с целью выявления эндокринной недостаточности эндометрия, в том числе скрытой, как этиологического фактора ранних репродуктивных потерь I триместра.

Заявляемый способ позволяет диагностировать состояние рецепторного профиля гравидарного эндометрия I триместра беременности на основании референсных значений экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона в гравидарном эндометрии и способствовать снижению репродуктивных потерь ранних сроков.

Способ диагностики рецепторного профиля эндометрия абортного материала раннего срока беременности, заключающийся в том, что выполняют иммуногистохимическое исследование образцов ткани гравидарного эндометрия с использованием антител соответственно к эстрогенам ER - клон 1D5, разведение 1:40 и прогестерону PR - клон PgR 636, разведение 1:50, с демаскировкой путем высокотемпературной обработки образца ткани эндометрия и при выявлении неравномерного распределения экспрессии и значениий экспрессии эстрогенов в железах и строме эндометрия в компактном и спонгиозном слоях менее 100 баллов Н-Score до 0 баллов, экспрессии рецепторов прогестерона в железах эндометрия в компактном и спонгиозном слоях 0 баллов H-Score и значениях экспрессии рецепторов прогестерона в строме компактного и спонгиозного слоев от 250 до 100 баллов H-Score диагностируют нормальное гормональное состояние гравидарного эндометрия, соответствующее референсным значениям, в остальных случаях диагностируют гормональную патологию гравидарного эндометрия.