Способ получения ксантановой камеди

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения ксантановой камеди. Способ получения ксантановой камеди включает культивирование бактерий Xanthomonas в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с отделением после завершения ферментации ксантановой камеди. Культивирование проводят в две стадии, на первой стадии выращивают посевной материал, причём для приготовления питательной среды используют воду с пониженным содержанием дейтерия. На второй стадии осуществляют ферментацию с получением культуральной жидкости, содержащей ксантановую камедь. Отделение ксантановой камеди от культуральной жидкости можно проводить двухступенчатой фильтрацией. Сначала фильтрацией на полых волокнах с отделением осадка с молекулярной массой больше или равно 300 кДа. Затем ультрафильтрацией фильтрата, полученного на предыдущей стадии, с концентрированием ксантановой камеди на полых волокнах с пределом отсечения меньше или равно 100 кДа. Изобретение позволяет увеличить продуктивность способа, концентрацию продукта в собранной среде, полученная ксантановая камедь имеет улучшенные физико-химические свойства и определенный интервал по молекулярной массе. 11 з.п. ф-лы, 1 ил.

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения ксантановой камеди. Ксантан (ксантановая камедь) – внеклеточный полисахарид, который представляет собой продукт жизнедеятельности бактерий Xanthomonas.

Ксантановая камедь представляет собой микробиологический полимер, широко применяемый в пищевой, фармацевтической, косметической промышленности, а также при добыче нефти.

Стандартная технология производства ксантановой камеди предусматривает осаждение полисахаридов при помощи низших спиртов – изопропилового или этилового.

Из документа RU 2639557 (опубликован 2017.12.21) известен способ получения ксантановой камеди, включающий культивирование штамма Xanthomonas campestris 2017 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, и перемешивания. Полученную культуральную жидкость центрифугируют. Для осаждения ксантана в супернатант добавляют этиловый спирт или изопропиловый спирт в соотношении 1:2. Общими признаками известного и заявленного способа являются культивирование штамма из вида Xanthomonas на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и последующим отделением ксантана. Однако, известный способ характеризуется невысоким выходом ксантановой камеди.

Известен способ получения раствора ксантановой камеди по патентному документу CN101240308 (МПК C08B37/00; C09K8/60; C12P19/06; опубл. 13.08.2008 г.). Способ получения ксантановой камеди включает культивирование бактерий Xanthomonas в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли в условиях аэрации с отделением после завершения ферментации ксантановой камеди мембранной фильтрацией, причем культивирование проводят в две стадии, на первой стадии выращивают посевной материал, на второй стадии осуществляют ферментацию с получением культуральной жидкости, содержащей ксантановую камедь, при этом используют деионизованную воду. Общими признаками известного и заявленного способов являются культивирование бактерий вида Xanthomonas в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли в условиях аэрации, причем культивирование проводят в две стадии, и отделение ксантановой камеди. Однако в известном способе не обеспечивается оптимальных условий роста бактерий, который обеспечивает повышение выхода продукта. Наиболее близким аналогом изобретения является техническое решение, описанное в патенте США US4299825 (опубликован 1981.11.10). Из прототипа известен способ получения ксантановой камеди, включающий культивирование бактерий Xanthomonas в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с отделением после завершения ферментации ксантановой камеди двухступенчатой фильтрацией на мембранных фильтрах. Целевым продуктом в данном способе является вязкий раствор ксантана. Общими признаками известного и заявленного способов являются культивирование бактерий вида Xanthomonas в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, и отделение ксантановой камеди. Однако, известный способ не обеспечивает оптимальных условий для роста бактерий и, соответственно, высокого выхода продукта.

Исходя из предшествующего уровня техники, техническая проблема состоит в создании оптимального способа получения ксантановой камеди с высокими выходами.

Технический результат заключается в увеличении продуктивности способа, увеличении концентрации продукта в собранной среде, полученная ксантановая камедь имеет улучшенные физико-химические свойства и определенный интервал по молекулярной массе. В предложенном способе увеличена скорость роста бактерий, также увеличено содержание ксантана в культуральной жидкости. Предложенный способ обеспечивает высокую концентрацию клеток с повышенной биосинтетической активностью бактерий и тем самым увеличивает продуктивность способа и концентрацию продукта в собранной среде. Выход продукта увеличивается в связи с оптимизированными условиями для роста клеток.

Для достижения указанного технического результата в способе получения ксантановой камеди, включающем культивирование бактерий Xanthomonas в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с отделением после завершения ферментации ксантановой камеди, при этом культивирование проводят в две стадии, на первой стадии выращивают посевной материал, на второй стадии осуществляют ферментацию с получением культуральной жидкости, содержащей ксантановую камедь, причём на первой стадии для приготовления питательной среды используют воду с пониженным содержанием дейтерия.

Отделение ксантановой камеди от культуральной жидкости можно проводить двухступенчатой фильтрацией, причём сначала фильтрацией на полых волокнах с отделением осадка с молекулярной массой больше или равно 300 кДа, а затем концентрирование ксантановой камеди на полых волокнах с пределом отсечения меньше или равно 100 кДа путём ультрафильтрации фильтрата, полученного на предыдущей стадии. В результате на первой стадии отделяют от культуральной жидкости бактерии, на второй – ксантановую камедь.

Отделение ксантановой камеди от образующейся в результате культивирования культуральной жидкости можно проводить путем осаждения одноатомным спиртом или фильтрацией. В рамках заявленного способа предложено использование фильтрации, в частности, двухступенчатой фильтрации, что позволяет усилить технический результат в части повышения выхода продукта относительно осаждения спиртом. Работа со спиртами имеет ряд трудностей, начиная с вредных и опасных факторов работы и заканчивая экономической неэффективностью, которая заключаются в расходе дополнительных компонентов, прекращении жизнедеятельности культуральной жидкости и дополнительное загрязнение остаточным количеством примесей готовой ксантановой камеди.

Бактерии Xanthomonas выбирают из группы: Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas sp., Xanthomonas cynarae, Xanthomonas citri, Xanthomonas euversicatoria, Xanthomonas perforans, Xanthomonas gardneri, Xanthomonas fuscans и Хanthobacter viscosus.

В частном случае осуществления способа после второй фильтрации дополнительно проводят распылительное высушивание ксантановой камеди.

В предпочтительном варианте способа осадок, образовавшийся после первой ультрафильтрации, подают на вторую стадию культивирования.

В частном случае осуществления способа культивирование на первой стадии проводят от 24 до 44 часов. В качестве источника углерода могут быть использованы глюкоза в количестве, например, от 2,0 до 3,0 % мас и гидролизат рыбокостной муки в количестве от 2,0 до 6,0% мас, в качестве источника азота могут быть использованы меласса в количестве, например, от 2 до 3% мас. и сульфат аммония в количестве от 0,1 до 0,5% мас., а в качестве минеральных солей м,огут быть использованы гидрофосфат калия и гептагидрат сульфата магния в количестве, например, от около 0,005 до около 0,02% мас.

В одном из случаев осуществления способа на второй стадии культивирования используют воду с пониженным содержанием дейтерия.

Для приготовления питательной среды возможно использование воды с содержанием дейтерия в количестве 10-20 ppm.

Технический результат достигается за счёт использования воды с пониженным содержания дейтерия («лёгкой» воды) для питательной среды, при использовании которой происходит повышение роста и выхода посевного материала, что как следствие, приводит к более высокому выходу ксантановой камеди.

Молекула воды состоит из двух атомов водорода и одного атома кислорода. Водород имеет два стабильных изотопа — протий (Н) — ¹H и дейтерий (D) — ²H. У кислорода три устойчивых изотопа: ¹⁶O, ¹⁷O и ¹⁸O. Содержание воды, состоящей из лёгких стабильных изотопов ¹H₂¹⁶O («лёгкой воды», в отличие от содержащей повышенное количество тяжелого изотопа водорода ²H «тяжёлой воды») в природной воде составляет 99,73 — 99,76 мол.%. Лёгкая вода как моноизотопная композиция ¹H₂¹⁶O является предельным случаем изотопной чистоты. Природная вода представляет собой многокомпонентную смесь изотопологов. В природной воде весовая концентрация тяжёлых изотопологов может достигать 2,97 г/кг, что является значимой величиной, сопоставимой, например, с содержанием минеральных солей. Изотопологи отличаются друг от друга по физическим, химическим и биологическим свойствам. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о различии физико-химических свойств легкой воды и деионизированной воды природного изотопного состава [V. Goncharuk, V.B. Lapshin, T.N. Burdeinaya, T.V. Pleteneva, A.S. Chernopyatko et al. Physicochemical Properties and Biological Activity of the Water Depleted of Heavy Isotopes // 2011, published in Khimiya i Tekhnologiya Vody, 2011, Vol. 33, No. 1, pp. 15-25. Journal of Water Chemistry and Technology, 2011, Vol. 33, No. 1, pp. 8-13]. В наибольшей степени эффекты лёгкой воды проявляются на биологических объектах, для которых характерны каскадные реакции. Реакция биосистем при воздействии на них воды может изменяться в зависимости от количественных и качественных изменений её изотопного состава. Лёгкая (обогащенная Н или обедненная D) вода обладает высокой биологической активностью.

Известно, что в лёгкой воде изменяется скорость протекания химических реакций, сольватация ионов, их подвижность и т.д. Лёгкая вода оказывает стимулирующее действие на живые системы, существенно повышает их активность, жизнестойкость к различным негативным факторам, репродуктивную деятельность, улучшает и ускоряет обмен веществ [патент РФ 2438765]. Реакция биосистем при воздействии на них воды может изменяться в зависимости от количественных и качественных изменений изотопного состава воды. На разных объектах зарегистрирована положительная биологическая активность вод, полученных с помощью различных технологических процессов, относящихся к категории изотопно-легких, со сниженной в той или иной мере по сравнению с исходной концентрацией дейтерия. Т.е. количественные и качественные показатели изотопного состава воды существенным образом отражаются на ее эффективности при использовании воды в качестве растворителя или ингредиента.

В рамках заявленного изобретения вода с пониженным содержанием дейтерия используется как основа питательной среды на первой стадии культивирования бактерий и приводит к значительно росту бактерий.

На фиг. 1 приведен график, наглядно показывающий увеличение выхода бактерий Xanthomonas при времени культивирования в течении 24-44 часов на первой стадии с использованием воды, обедненной дейтерием.

Ксантановая камедь (ксантан) — химическое соединение полисахарид (C₃₅H₄₉O₂₉)_n. Свойства ксантана регулируют изменяя условия жизни бактерий. Главная цепь полимера идентична молекуле целлюлозы. Ответвления представляют собой остатки молекул глюкозы, маннозы, глюкуроновой кислоты, а также пировинограднокислые (пируватные) и ацетильные группы. Число пируватных групп определяет вязкость водных растворов ксантана. Поскольку ксантановая камедь является микробиологическим продуктом, его характеристики в большой степени зависят от микроорганизмов-продуцентов. Изменяя условия их жизнедеятельности можно регулировать молекулярную массу и свойства ксантана.

Влияние использования воды с пониженным содержанием дейтерия на технический результат обусловлено высокими скоростями образования и разрыва водородных связей при культивировании бактерий. Влияние легкой воды на жизнедеятельность бактерий оказывает влияние также и на физико-химические свойства ксантана, что позволяет получить повышенный выход ксантана определенной молекулярной массы при отделении методом фильтрации.

Использование лёгкой воды на второй стадии культивирования оказывает дополнительное влияние на процесс культивирования бактерий и образующуюся ксантановую камедь.

Дополнительно при использовании воды с пониженным содержанием дейтерия на второй стадии культивирования совместно с условиями проведения первой стадии культивирования, наблюдается увеличение выхода ксантана с определенной молекулярной массой в пределах от 100 до 300 кДа и изменение физико-химических свойств полученной ксантантановой камеди.

За счёт использования двухступенчатой фильтрации обеспечивается непрерывность процесса производства, т.к. живые бактерии культуры Xanthomonas возвращаются в процесс ферментации – на вторую стадию культивирования. В изобретении использование двухступенчатой фильтрации на полых волокнах разных размеров позволяет не только отделить штамм для последующего использования, но также провести отделение конечного продукта с обеспечением более высокой степени чистоты конечного продукта. В изобретении используется ультрафильтрация ксантановой камеди, отделяя бактерии от полисахарида: по завершении процесса ферментации из культуральной жидкости фильтром на полых волокнах с размером пор 300 кДа в качестве осадка отделяются бактерии, а фильтрат подается на такого же типа фильтр с размером пор 100 кДа. За счёт использования фильтров с размером пор 100 кДа, на котором осадком является концентрат полисахаридов с более высокой молекулярной массой, обеспечивается снижение концентрации низкомолекулярных метаболитов, которые поступают в фильтрат, что позволяет говорить о повышении чистоты конечного готового продукта.

Экспериментальным путём подобраны фильтрационные элементы – полые волокна, которые имеют дополнительное преимущество по обеспечению контролируемости процесса. Использование ультрафильтрации на полых волокнах позволяет выделить полисахарид без применения спиртов и сделать процесс непрерывным.

Изобретение поясняется графиком, представленным на фиг. 1, поясняющий влияние использования воды, обедненной дейтерием, на концентрацию бактерий в культуральной среде, где 1 – рост клеток при использовании обычной воды для питательной среды, 2 – рост клеток при использовании воды с пониженным содержанием дейтерия (10 ppm). Из графика наглядно виден значительный рост количества бактерий при уменьшении содержания дейтерия в воде.

Синтез ксантановой камеди согласно настоящему изобретению описан ниже.

Для культивирования в колбы вносят синтетическую питательную среду в количестве, составляющем 1/5 объёма колбы. Синтетическая питательная среда представляет собой мясо-пептидный бульон (ГОСТ 20730-75. Питательные среды. Мясо-пептидный бульон, включающий Пептон ферментативный, экстракт мясной и натрия хлорид), разбавленный водой с пониженным содержанием дейтерия (20 об. % питательного бульона и 80 об. % воды). При необходимости стандартный синтетический бульон может быть обогащен углеводами, солями. Посевным материалом является штамм Xanthomonas campestris ВКМ-615. Доза на колбу составляет 106 клеток/см³. Микробные культуры штаммов выращивают при температуре (32±1)°С в течение (48±4)ч с постоянным механическим перемешиванием. Питательную среду в количестве 50 см³ вносят в колбы емкостью 250 см³, и 100 см³ - в колбы 750 см³. Засевают колбы, концентрация клеток в начальной стадии культивирования должна составлять не менее 106 клеток/см³. Культивирование ведется при (32+2,0)°С, в режиме 150-160 об/мин, в течение (32±4) ч. По окончании процесса культивирования оценивают прирост биомассы путем определения общего количества микробных клеток, в случае необходимости - количества жизнеспособных клеток методом определения концентрации колониеобразующих единиц (КОЕ). Ориентировочно общее количество (5-7)*10⁹ клеток/мл.

В целях сопоставления были проведены эксперименты, в которых состав обеих питательных сред был идентичен друг другу, за исключением воды, состав оборудования и технологии приготовления посевного бактериального материала также были идентичны.

Концентрация дейтерия в воде определялась методом ядерно-магнитного резонанса (ЯМР). Результаты по подготовке культуры на питательной среде с различной водой: на обычной воде с концентрацией дейтерия 156 ppm (опыт 1) и на воде с концентрацией дейтерия 10 рpm (опыт 2) показаны на фигуре 1, где отображены зависимости концентрации клеток (роста посевного материала (штамм Xanthomonas campestris ВКМ-615) во времени. Показана интенсификация процесса роста клеток при использовании воды, обедненной дейтерием, в качестве основы для питательной среды при подготовке культуры.

Повышение количества клеток в посевном материале приводит также к увеличению выхода продукта – ксантановой камеди.

Полученный на лёгкой воде посевной материал ввели в биореактор, содержащий необходимую питательную среду оптимального состава, в котором поддерживаются заданные условия для аэробного продуцирования бактериями внеклеточной ксантановой камеди.

Ферментёр заполняется водой, обедненной дейтерием, в количестве 75 литров. Далее в него последовательно добавляются следующие компоненты для формирования питательной среды для выращивания культуры ксантановых бактерий: Меласса -500 г, Глюкоза - 700 г. 50% раствора, панкреатический гидролизат рыбы (рыбной муки) - 500 г., K₂HPO₄ – гидрофосфат калия - 100 г., дрожжевой экстракт - 125 г. (0,5 заводской баночной упаковки), пеногаситель (подсолнечное масло) - 5-10 мл., (NH₄)₂SO₄*6H2O (гексагидрат сульфата аммония) - 250 грамм, MgSO₄*7H₂O (гептагидрат сульфата магния) - 15-20 г, NaOH (гидроксид натрия, иное название каустическая сода) - 50 г.

Подготовленный ферментёр с питательной средой закрывается крышкой, посуда с компонентами питательной среды (50% водные растворы NaOH и глюкозы) помещаются в автоклав и обрабатываются в соответствии с требованиями.

Ферментация проводится при следующих условиях. Температура ферментации 30⁰С, рН =7,2-7,5. Число оборотов магнитной мешалки 150 об/мин. Поддержание рН осуществляется 50% раствором NaOH. Углеводная подпитка 50% раствором глюкозы. Проводится контроль оптической плотности и вязкости культивируемого раствора. Время ферментации 72 часа.

При достижении необходимой концентрации клеток подключается фильтр на полых волокнах с порами на 300 кДа МР-2М-300 для отделения ксантановой камеди и возврата бактерий Xanthomonas campestris обратно в ферментёр для продолжения процесса наращивания ксантана. Отделённая ксантановая камедь при вязкости 350 сПз передаётся на второй этап очистки - при давлении 1,5 атм фильтруется через фильтр на полых волокнах с порами 100 кДа УФМ-2М-100. Далее отделённый ксантан при вязкости 1800 сПз высушивают на распылительной сушилке при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определено весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 51,5 г/л.

Полученный ксантан подвергается выходному контролю в соответствии с показателями отрасли, где он планируется к использованию.

В случае использования двухступенчатой фильтрации процесс наработки ксантана может продолжаться неограниченно долго при сохранении и защите среды от контаминации посторонней микрофлорой.

Также возможно отделение полученной культуральной жидкости одноатомным спиртом. Для этого полученную культуральную жидкость обрабатывали на центрифуге в течение 30 минут при 8000 об/мин для отделения бактерий. Для осаждения ксантана в супернатант (надосадочная жидкость) добавляли этиловый спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживали в холодильнике при 4°C в течение 24 часов. Далее осажденный ксантан при вязкости 1560 сПз высушивают при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определено весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 11,6 г/л.

Таким образом, процесс наработки ксантана может продолжаться неограниченно долго при сохранении и защите среды от контаминации посторонней микрофлорой. При сравнении технологий осаждения спиртом и ультрафильтрацией, разница в выходе продукта по сухому ксантану более чем в 4 раза (11,6 г/л со спиртом и 51,5 г/л с применением лёгкой воды и ультрафильтрации).

Представленные примеры иллюстрируют заявленный способ и подтверждают достижение технического результата при реализации способа, который обеспечивается за счет использования воды с пониженным содержанием дейтерия при культивировании, а также отражают усиление технического результата при отделении ксантановой камеди методом фильтрации.

1. Способ получения ксантановой камеди, включающий культивирование бактерий Xanthomonas в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с отделением после завершения ферментации ксантановой камеди, отличающийся тем, что культивирование проводят в две стадии, на первой стадии выращивают посевной материал, на второй стадии осуществляют ферментацию с получением культуральной жидкости, содержащей ксантановую камедь, причём на первой стадии для приготовления питательной среды используют воду с пониженным содержанием дейтерия.

2. Способ получения ксантановой камеди по п. 1, отличающийся тем, что отделение ксантановой камеди проводят двухступенчатой фильтрацией.

3. Способ получения ксантановой камеди по п. 2, отличающийся тем, что отделение ксантановой камеди на первой ступени фильтрации проводят на фильтрах с отделением осадка с молекулярной массой больше или равно 300 кДа, на второй ступени фильтрации на фильтрах с пределом отсечения меньше или равно 100 кДа.

4. Способ получения ксантановой камеди по п. 1, отличающийся тем, что бактерию Xanthomonas выбирают одну из группы, где бактерия представляет собой Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas sp., Xanthomonas cynarae, Xanthomonas citri, Xanthomonas euversicatoria, Xanthomonas perforans, Xanthomonas gardneri, Xanthomonas fuscans и Хanthobacter viscosus.

5. Способ получения ксантановой камеди по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно проводят распылительное высушивание ксантановой камеди.

6. Способ получения ксантановой камеди по п. 2 или 3, отличающийся тем, что осадок, образовавшийся после первой фильтрации, подают на вторую стадию культивирования.

7. Способ получения ксантановой камеди по п. 1, отличающийся тем, что культивирование на первой стадии проводят от 24 до 44 часов.

8. Способ получения ксантановой камеди по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют глюкозу и гидролизат рыбокостной муки.

9. Способ получения ксантановой камеди по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника азота используют мелассу и сульфат аммония.

10. Способ получения ксантановой камеди по п. 1, отличающийся тем, что в качестве минеральных солей используют гидрофосфат калия и гептагидрат сульфата магния.

11. Способ получения ксантановой камеди по п. 1, отличающийся тем, что на второй стадии культивирования используют воду с пониженным содержанием дейтерия.

12. Способ получения ксантановой камеди по п. 1 или 11, отличающийся тем, что для приготовления питательной среды используют воду с содержанием дейтерия в количестве 10-20 ppm.