Новый вариант о-сукцинилгомосеринтрансферазы и способ получения о-сукцинилгомосерина с использованием этого варианта
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к мутанту О-сукцинилгомосеринтрансферазы, полинуклеотиду, кодирующему этот мутант, микроорганизму, содержащему мутант, и способу получения О-сукцинилгомосерина и L-метионина с использованием микроорганизма. Представлен полипептид, имеющий активность O-сукцинилгомосеринтрансферазы, содержащий замену аминокислоты в положении 313 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 аминокислотой, отличной от лейцина. Изобретение позволяет получать L-метионин с высокой степенью эффективности. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 8 табл., 4 пр.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к варианту О-сукцинилгомосеринтрансферазы, полинуклеотиду, кодирующему вариант, микроорганизму, содержащему вариант, и способу получения O-сукцинилгомосерина с использованием микроорганизма.
Предшествующий уровень техники
O-сукцинилгомосерин действует как предшественник метионина, который представляет собой тип незаменимой аминокислоты в живом организме. Метионин используют в качестве добавок для кормов и пищевых продуктов, а также используют в качестве синтетического сырья для лекарственных растворов и медицинских препаратов.
Метионин получают путем химического синтеза и биологического синтеза. Между тем, раскрыт двухстадийный способ (WO/2008/013432), в котором предшественник L-метионина получают путем ферментации и затем превращают в L-метионин с помощью реакции ферментативного превращения.
В двухстадийном процессе в качестве предшественника метионина используют О-сукцинилгомосерин или О-ацетилгомосерин, и для экономически выгодного крупномасштабного производства метионина очень важно получать О-сукцинилгомосерин с высоким выходом.
Ген metA представляет собой ген, кодирующий О-сукцинилгомосеринтрансферазу (MetA), которая представляет собой фермент, который конъюгирует сукцинильную группу сукцинил-СоА с гомосерином с получением О-сукцинилгомосерина, и ген metA представляет собой один из наиболее важных генов в создании продуцирующего (9-сукцинилгомосерин штамма.
Штамм, накапливающий О-сукцинилгомосерин, может быть получен посредством делеции гена metB, кодирующего цистатионин-гамма-синтазу в пути биосинтеза метионина. Однако продуцирующий О-сукцинилгомосерин штамм нуждается в L-метионине. По этой причине активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы ингибируется по принципу обратной связи метионином, который добавляют в среду, и в итоге трудно получать О-сукцинилгомосерин в высокой концентрации.
Таким образом, многие выданные ранее патенты сосредотачивали свои исследования на исключении ингибирования конечным продуктом metA по принципу обратной связи из системы регулирования с обратной связью. Однако О-сукцинилгомосеринтрансфераза, кодированная metA, имеет проблемы в том, что белок дикого типа сам по себе имеет низкую стабильность и введение мутации для исключения ингибирования конечным продуктом по принципу обратной связи усугубляет нестабильность. Таким образом, для создания продуцирующего О-сукцинилгомосерин штамма с высокой продуктивностью необходимо исключать ингибирование по принципу обратной связи конечным продуктом гена metA и обеспечивать стабильность фермента.
Большинство микроорганизмов, присутствующих в природе, как известно, используют О-сукцинилгомосерин или О-ацетилгомосерин в качестве промежуточного соединения для биосинтеза метионина. В общем, MetA продуцирует О-сукцинилгомосерин, и О-ацетилгомосеринтрансфераза (MetX) продуцирует О-ацетилгомосерин. В отличие от MetA, MetX не ингибируется конечным продуктом и имеет высокую стабильность фермента.
Описание
Техническая задача
Авторы настоящего изобретения приложили интенсивные усилия для увеличения продуцирования О-сукцинилгомосерина, и в результате они обнаружили белок, имеющий активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы, тем самым создав настоящее изобретение.
Техническое решение
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить полипептид, имеющий активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы, содержащий замену аминокислоты в положении 313 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. на аминокислоту, отличную от лейцина.
Другая задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить полинуклеотид, кодирующий полипептид.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить продуцирующий О-сукцинилгомосерин микроорганизм рода Corynebacterium, содержащий полипептид, имеющий активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения О-сукцинилгомосерина, включающий стадии культивирования микроорганизма в среде и выделения или сбора О-сукцинилгомосерина из культивированного микроорганизма или из среды.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения L-метионина, включающий стадии культивирования микроорганизма в среде и взаимодействия О-сукцинилгомосерина с сульфидом.
Полезные эффекты изобретения
Вариант белка О-сукцинилгомосеринтрансферазы по настоящему изобретению может иметь увеличенную активность превращения О-сукцинилгомосерина по сравнению с его природной формой и таким образом широко применяться для более эффективного крупномасштабного производства О-сукцинилгомосерина в качестве альтернативы существующим путям химического синтеза.
Наилучшее воплощение изобретения
Ниже настоящее изобретение будет описано более подробно.
Между тем каждое описание и воплощение, раскрытые в данном описании изобретения, также могут применяться к другим описаниям и воплощениям. То есть все комбинации различных элементов, раскрытых в данном описании изобретения, попадают в объем настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не ограничивается конкретным описанием, описанным ниже.
Кроме того, специалист в данной области техники может определить или идентифицировать многие эквиваленты конкретных аспектов настоящего изобретения, описанные в этом описании, с использованием только обычных экспериментов. Также, такие эквиваленты предназначены к включению в это описание.
Для успешного выполнения задач в одном аспекте настоящего изобретения предложен новый полипептид, имеющий активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы. Вариант нового полипептида может представлять собой полипептид, имеющий активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы, содержащий замену аминокислоты в положении 313 в аминокислотной последовательности, имеющей происхождение из Corynebacterium glutamicum, например, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, на аминокислоту, отличную от лейцина. Кроме того, полипептид может содержать замену аминокислоты в положении 313 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, на отличную от лейцина, и может иметь активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы. Более конкретно, полипептид может представлять собой полипептид, имеющий активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы, при этом полипептид содержит замену аминокислоты в положении 313 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 на аргинин, цистеин, изолейцин или лизин, но без ограничения ими.
Такой полипептидный вариант отличается наличием увеличенной активности О-сукцинилгомосеринтрансферазы по сравнению с полипептидом SEQ ID NO: 1, имеющим активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы.
В контексте настоящего изобретения, термин «активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы» относится к активности превращения гомосерина в О-сукцинилгомосерин. О-сукцинилгомосеринтрансфераза в совокупности относится к ферменту, способному превращать сукцинил СоА и L-гомосерин в качестве субстратов в СоА и О-сукцинилгомосерин.
Схема реакции:
Сукцинил СоА + L-гомосерин ↔ СоА + О-сукцинилгомосерин В настоящем изобретении О-сукцинилгомосеринтрансфераза относится к ферменту, имеющему активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы, который получают путем замещения другой аминокислоты части аминокислотной последовательности белка MetX, который представляет собой О-ацетилгомосеринтрансферазу. Белок MetX может представлять собой MetX, полученный из рода Corynebacterium, и, более конкретно, MetX, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, который получают из Corynebacterium glutamicum, но без ограничения этим. Последовательность белка MetX доступна из NCBI GenBank, который представляет собой известную базу данных.
В настоящем изобретении различные способы, известные в данной области техники, применимы к способу получения О-сукцинилгомосеринтрансферазы. Например, О-сукцинилгомосеринтрансфераза может быть получена из микроорганизма рода Corynebacterium, который широко применяется для экспрессии ферментов, с использованием методик синтеза генов на основе оптимизации кодона, посредством которых могут быть получены ферменты с высоким выходом, или с использованием способов скрининга полезных источников фермента, на основе биоинформатики огромных количеств генетической информации о микроорганизмах, но без ограничения этим.
В настоящем изобретении вариант О-сукцинилгомосеринтрансферазы можно использовать взаимозаменяемо с «мутированной О-сукцинилгомосеринтрансферазой» или «вариантом О-сукцинилгомосеринтрансферазы». Между тем, вариант может представлять собой не встречающийся в природе вариант.
Например, мутированная О-сукцинилгомосеринтрансфераза по настоящему изобретению может иметь замену аминокислоты в положении 313 N-конца MetX, полученного из рода Corynebacterium (Corynebacterium sp.), имеющего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, на аминокислотный остаток, отличный от лейцина. Например, остаток аминокислоты лейцин в положении 313 может быть заменен аргинином, цистеином, изолейцином или лизином, но без ограничения этим. Мутированная О-сукцинилгомосеринтрансфераза по настоящему изобретению может включать полипептид, содержащий вариацию в положении 313 N-конца аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, где вариация включает замену аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аргинина, цистеина, изолейцина и лизина, и полипептид может иметь по меньшей мере 85% гомологию или идентичность с SEQ ID NO: 1, но без ограничения этим.
Кроме того, полипептид, имеющий активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы по настоящему изобретению, может представлять собой любой полипептид, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 81, которые, конкретно, представляют собой аминокислотные последовательности полипептидов, имеющих активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы, в которых аминокислоту в положении 313 из N-конца SEQ ID NO: 1 заменяют на аргинин, цистеин, изолейцин или лизин, соответственно, но без ограничения этим. Полипептид может содержать любой полипептид, имеющий 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% или большую гомологию или идентичность с вышеуказанными последовательностями без ограничения, при условии, что полипептид содержит вышеуказанную вариацию и имеет увеличенную активность превращения О-сукцинилгомосерина по сравнению с диким типом.
Кроме того, MetX по настоящему изобретению может представлять собой белок MetX, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или большую гомологию или идентичность с ней, но без ограничения этим. Конкретно, белок MetX по настоящему изобретению может включать белок SEQ ID NO: 1 и белок, имеющий гомологию или идентичность с SEQ ID NO: 1 по меньшей мере 80% или более, 85% или более, конкретно 90% или более, более конкретно 95% или более, или еще более конкретно 99% или более.
В контексте настоящего изобретения, термин «полипептидный вариант» относится к полипептиду, одна или более аминокислот которого отличается от изложенной последовательности консервативными заменами и/или модификациями, но который сохраняет функции или свойства полипептида. Вариантные полипептиды отличаются от идентифицированной последовательности вследствие замены, делеции или добавления нескольких аминокислот.Такие варианты обычно могут быть идентифицированы путем модификации одной из вышеуказанных полипептидных последовательностей и оценки свойств модифицированного полипептида. Другими словами, способность варианта может быть увеличена, оставлена без изменений или уменьшена по сравнению со способностью нативного белка. Такие варианты обычно можно идентифицировать путем модификации одной из вышеуказанных полипептидных последовательностей и оценки реакционной способности модифицированного полипептида. Кроме того, некоторые варианты могут включать варианты, в которых одна или более частей, таких как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен, были исключены. Другие варианты могут включать варианты, в которых была исключена часть N- и/или С-конца зрелого белка. Термин «вариант» также можно использовать в отношении модификации, модифицированного белка, модифицированного полипептида, мутанта, мутеина, дивергента, и так далее, и любой термин не ограничен, при условии, что его используют в смысле происходящей мутации. Конкретно, вариант включает вариант, в котором активность полученной из Corynebacterium glutamicum (9-сукцинилгомосерин трансферазы эффективно повышается в результате вариации его аминокислот по сравнению с диким типом.
В контексте настоящего изобретения, термин «консервативная замена» означает замену одной аминокислоты на другую аминокислоту, которая имеет подобные структурные и/или химические свойства. Вариант может иметь, например, одну или более консервативных замен, сохраняя при этом одну или более биологических активностей. Такие замены аминокислот обычно могут быть выполнены на основе подобия полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Например, положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту; ароматические аминокислоты включают фенилаланин, триптофан и тирозин; и гидрофобные аминокислоты включают аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, тирозин и триптофан. Обычно консервативная замена оказывает небольшое влияние или не оказывает влияния на активность полученного полипептида.
Кроме того, варианты могут включать другую модификацию, включая делецию или добавление аминокислот, которая имеет минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, полипептид можно конъюгировать с сигнальной (или лидерной) последовательностью на N-конце белка, которая котрансляционно или посттрансляционно направляет перенос белка. Полипептид также можно конъюгировать с другой последовательностью или линкером для идентификации, очистки или синтеза полипептида. Другими словами, если здесь описывается «белок или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность конкретной SEQ ID NO», очевидно, что белок, имеющий аминокислотную последовательность, часть которой делетируют, модифицируют, заменяют, консервативно заменяют или добавляют, можно использовать в настоящем изобретении, при условии что он имеет активность, идентичную или соответствующую таковой у полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO. Например, при условии, что белок имеет активность, идентичную или соответствующую таковой вариантного полипептида, не исключается добавление последовательности, которая не изменяет функцию белка, до и после аминокислотной последовательности, встречающихся в природе мутаций, молчащих мутаций или их консервативных замен. Очевидно, что даже если полипептид имеет такую добавку или мутацию последовательности, он попадает в объем настоящего изобретения.
Кроме того очевидно, что, вследствие вырожденности кодона, также может быть включен полинуклеотид, который может быть транслирован в белок, содержащий любую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 81, или белок, имеющий гомологию или идентичность с этим белком. Альтернативно, зонд, который может быть получен из известной нуклеотидной последовательности, например, последовательности, которая гибридизуется с комплементарной последовательностью со всей полинуклеотидной последовательностью или ее с частью, в жестких условиях для кодирования белка, имеющего активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы, также может быть включен без ограничения. Термин «жесткие условия» обозначает условия, при которых обеспечивается специфическая гибридизация между полинуклеотидами. Такие условия описаны подробно в литературе (например, J. Sambrook et al., выше). Например, жесткие условия могут включать, например, условия, при которых гены, имеющие высокую гомологию или идентичность, 80% или выше, 85% или выше, конкретно 90% или выше, более конкретно 95% или выше, еще более конкретно 97% или выше, еще более конкретно 99%, или более высокую гомологию или идентичность, гибридизуются друг с другом, и гены, имеющие гомологию или идентичность ниже вышеуказанной гомологии или идентичности, не гибридизуются друг с другом, или стандартные условия отмывки Саузерн-гибридизации, то есть отмывки один раз, конкретно, два или три раза при концентрации солей и температуре, соответствующие 60°С, 1xSSC (хлорид натрия/цитрат натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), конкретно 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS и более конкретно 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS.
Хотя может иметь место ошибка спаривания между нуклеотидами вследствие жесткости гибридизации, требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарную последовательность. Термин «комплементарный» используют для описания взаимоотношения между нуклеотидными основаниями, которые могут гибрид изо ваться друг с другом. Например, что касается ДНК, аденозин комплементарен тимину и цитозин комплементарен гуанину. Таким образом, настоящее изобретение может включать не только по существу подобные последовательности нуклеиновых кислот, но также выделенные фрагменты нуклеиновых кислот, которые комплементарны целой последовательности.
Конкретно, полинуклеотид, имеющий гомологию или идентичность, может быть обнаружен с использованием условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении Tm (температура плавления) 55°С и условий, описанных выше. Дополнительно, значение Tm может представлять собой 60°С, 63°С или 65°С, но без ограничения этим, и его может подходящим образом регулировать специалист в данной области техники согласно целям.
Подходящая жесткость для гибридизации полинуклеотидов зависит от длины и степени комплементарности полинуклеотидов и параметры хорошо известны в данной области техники (см. Sambrook et al., выше, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
«Гомология» или «идентичность» относится к степени релевантности между двумя данными аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями и может быть выражена в процентах.
Термины «гомология» и «идентичность» часто могут быть использованы взаимозаменяемо.
Гомологию или идентичность последовательности консервативного полинуклеотида или полипептида можно определять с помощью стандартных алгоритмов выравнивания и можно использовать со штрафами за гэп, установленными по умолчанию в используемой программе. По существу, гомологичные или идентичные последовательности могут гибрид изо ваться в умеренных или очень жестких условиях, так, чтобы полная длина последовательности или по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80% или 90% или более полной длины могло гибридизоваться. Кроме того, рассматриваются полинуклеотиды, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизации.
Имеют или нет любые две полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологию, подобие или идентичность, можно определять с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа «FASTA», используя, например, параметры по умолчанию, такие как в Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444, или определять с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который задействован в программе Нидлмана пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включая пакет программ GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994 и [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, BLAST базы данных Национального центра биотехнологической информации или ClustalW можно использовать для определения гомологии, подобия или идентичности.
Гомологию, подобие или идентичность полинуклеотидов или полипептидов можно определять, например, посредством сравнения информации о последовательностях с использованием компьютерной программы GAP, такой как Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443, которая раскрыта в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Кратко, программа GAP определяет подобие в виде количества выровненных символов (то есть нуклеотидов или аминокислот), которые являются подобными, разделенное на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для отсутствия идентичности) и взвешенную матрицу сравнения из Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, которая раскрыта в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979) (или подстановочную матрицу EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4)); (2) штраф 3,0 для каждого гэпа и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом гэпе (или штраф за открытие гэпа 10, штраф за продление гэпа 0,5); и (3) отсутствие штрафа для концевых гэпов. Таким образом, в контексте настоящего изобретения, термин «гомология» или «идентичность» представляет релевантность между последовательностями.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы.
В контексте настоящего изобретения, термин «полинуклеотид» относится к нити ДНК или РНК, имеющей заранее установленную длину или более, которая представляет собой длинноцепочечный полимер нуклеотидов, образованный путем соединения нуклеотидных мономеров посредством ковалентных связей. Более конкретно, полинуклеотид относится к фрагменту полинуклеотида, кодирующему вариантный полипептид.
В настоящем изобретении ген, кодирующий аминокислотную последовательность (9-сукцинилгомосеринтрансферазы, может представлять собой ген варианта (9-сукцинилгомосеринтрансферазы, например, полученного из Corynebacterium glutamicum. На основании вырожденности генетического кода, нуклеотидные последовательности, кодирующие одну и ту же аминокислотную последовательность и ее варианты, также включаются в настоящее изобретение, например, представленные SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76 или SEQ ID NO: 82, но без ограничения этим.
Дополнительно, что касается вариантного полинуклеотида, на основании вырожденности генетического кода, нуклеотидные последовательности, кодирующие одну и ту же аминокислотную последовательность и ее варианты, также включаются в настоящее изобретение.
В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения в настоящем изобретении предлагается клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид, кодирующий вариантный полипептид, или микроорганизм, трансформированный вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий вариантный полипептид. Конкретно, перенос может быть выполнен путем трансформации, но без ограничения этим.
Конкретно, микроорганизм, содержащий полипептидный вариант О-сукцинилгомосеринтрансферазы, может иметь увеличенную продуктивность по О-сукцинилгомосерину без ингибирования роста клетки-хозяина по сравнению с микроорганизмом, содержащим полипептид О-сукцинилгомосеринтрансферазы дикого типа, и таким образом O-сукцинилгомосерин может быть получен из микроорганизма с высоким выходом.
В контексте настоящего изобретения, термин «вектор» представляет собой ДНК-конструкцию, которая включает нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой белок, функционально связанный с подходящей регуляторной последовательностью для обеспечения экспрессии целевого белка в подходящей клетке-хозяине. Регуляторная последовательность может включать промотор, способный к инициации транскрипции, любую операторную последовательность для регуляции такой транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий домен связывания рибосомы мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. После того как вектор трансформируют в подходящую клетку-хозяина, он может реплицироваться или действовать независимо от генома хозяина и может самостоятельно интегрироваться в геном.
Вектор, используемый в настоящем изобретении конкретно не ограничен, при условии, что он способен реплицироваться в клетке-хозяине, и можно использовать любой вектор, известный в данной области техники. Примеры обычно используемых векторов могут включать естественную или рекомбинантную плазмиду, космиду, вирус и бактериофаг.Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon 4А, Charon 21А и так далее. В качестве плазмидного вектора можно использовать тип pBR, тип pUC, тип pBluescriptII, тип pGEM, тип pTZ, тип pCL, тип pET и так далее. Конкретно, можно использовать вектор pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и так далее, но без ограничения этим.
Вектор, применяемый в настоящем изобретении, не ограничивается конкретно, и можно использовать известный вектор экспрессии. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может быть вставлен в хромосому с использованием вектора для внутриклеточной хромосомной вставки. Хромосомная вставка полинуклеотида может быть выполнена посредством любого способа, известного в данной области техники, например, гомологичной рекомбинацией, но без ограничения этим. Кроме того может быть включен селективный маркер для подтверждения хромосомной вставки. Селективный маркер предназначен для отбора клеток, трансформированных вектором, то есть для подтверждения вставки целевого полинуклеотида, и селективный маркер может включать маркеры, обеспечивающие селектируемые фенотипы, такие как устойчивость к лекарственным препаратам, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностных белков. Так как только клетки, экспрессирующие селективный маркер, способны выживать или показывать различные фенотипы в условиях окружающей среды, обработанной селективным агентом, можно отбирать трансформированные клетки.
В контексте настоящего изобретения, термин «трансформация» обозначает перенос вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина таким образом, чтобы белок, кодированный полинуклеотидом, экспрессировался в клетке-хозяине. При условии, что трансформированный полинуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине, он может интегрироваться и располагаться в хромосоме клетки-хозяина, или он может находиться вне хромосомы или независимо от нее. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующие целевой белок. Полинуклеотид может быть представлен в любой форме при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессироваться в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме кассеты экспрессии, которая представляет собой генетическую конструкцию, включающую все элементы, необходимые для ее автономной экспрессии. Обычно кассета экспрессии включает промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигналы терминации транскрипции, сайты связывания рибосом и сигналы терминации трансляции. Кассета экспрессии может быть в форме самореплицирующегося вектора экспрессии. Также, полинуклеотид как таковой может быть внесен в клетку-хозяина и функционально связан с последовательностями, необходимыми для экспрессии в клетке-хозяине, но без ограничения этим. Способ выполнения трансформации может включать любой способ внесения нуклеиновых кислот в клетку, и трансформация может быть выполнена путем выбора подходящей стандартной методики, которая известна в данной области техники, в зависимости от клетки-хозяина. Например, способ может включать электропорацию, осаждение фосфатом кальция (Са(H2PO4)2, CaHPO4 или Са3(PO4)2), осаждение хлоридом кальция (CaCl2), микроинъекцию, способ с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ), способ с ДЭАЭ-декстраном (диэтиламиноэтилдекстраном), способ с катионными липосомами и способ с ацетатом лития-DMSO (диметилсульфоксид) и так далее, но без ограничения этим.
В контексте настоящего изобретения, термин «функционально связанный» обозначает функциональную связь между полинуклеотидной последовательностью, кодирующей целевой белок по настоящему изобретению, и последовательностью промотора, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида. Функциональная связь может быть получена с использованием технологии генетической рекомбинации, известной в данной области техники, и сайт-специфическое расщепление ДНК и связь можно получать с использованием ферментов расщепления и связывания, и так далее, известных в данной области техники, но без ограничения этим.
В контексте настоящего изобретения, термин «продуцирующий О-сукцинилгомосерин микроорганизм» относится к микроорганизму, который по природе имеет способность продуцирования О-сукцинилгомосерина или микроорганизм, который получен посредством обеспечения материнского штамма, не имеющего способности продуцировать О-сукцинилгомосерин, способностью продуцировать О-сукцинилгомосерин.
Продуцирующий О-сукцинилгомосерин микроорганизм может представлять собой клетку или микроорганизм, который может включать полинуклеотид, кодирующий вариантный полипептид, или который может экспрессировать вариантный полипептид после трансформации вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий вариантный полипептид. Что касается задач настоящего изобретения, клетка-хозяин или микроорганизм может представлять собой любой микроорганизм при условии, что он способен продуцировать О-сукцинилгомосерин в результате включения вариантного полипептида MetX. Конкретные их примеры могут включать микроорганизмы рода Escherichia, рода Serratia, рода Erwinia, рода Enterobacteria, рода Salmonella, рода Streptomyces, рода Pseudomonas, рода Brevibacterium и рода Corynebacterium, например, микроорганизм рода Corynebacterium и более конкретно, Corynebacterium glutamicum, но без ограничения этим.
В контексте настоящего изобретения, термин «продуцирующий О-сукцинилгомосерин микроорганизм рода Cory neb acterium» относится к микроорганизму рода Corynebacterium, обладающему способностью продуцировать О-сукцинилгомосерин по природе или посредством мутации. Было известно, что культура микроорганизма рода Corynebacterium включает О-сукцинилгомосерин. Однако его способность продуцировать О-сукцинилгомосерин является поразительно низкой, и гены, вовлеченные в механизм продуцирования или его механизмы, не были обнаружены. Таким образом, в настоящем изобретении микроорганизм рода Corynebacterium, имеющий способность продуцировать О-сукцинилгомосерин, относится к естественной форме микроорганизма как такового или микроорганизму рода Corynebacterium, имеющему способность продуцировать О-сукцинилгомосерин, которая увеличена посредством вставки чужеродного гена, связанного с механизмом продуцирования О-сукцинилгомосерина, или путем усиления или инактивации активности эндогенного гена.
В настоящем изобретении «микроорганизм рода Cory neb acterium» может представлять собой конкретно Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens и так далее, но без ограничения этим. Более конкретно, в настоящем изобретении микроорганизм рода Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium glutamicum, клеточный рост и выживаемость которого менее подвержена влиянию, даже несмотря на воздействие высоких уровней О-сукцинилгомосерина.
У микроорганизма активность по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из цистатионинсинтазы, 0-ацетилгомосерин-(тиол)-лиазы и гомосеринкиназы, можно инактивировать. Другими словами, можно инактивировать активность одного белка, выбранного из них, активности двух белков, выбранных из них, или активности всех трех белков.
В контексте настоящего изобретения, термин «инактивация» активности белка представляет собой концепцию, включающую ослабление активности по сравнению со свойственной ему активностью, или отсутствие активности.
Инактивация активности белка может быть достигнута посредством различных способов, хорошо известных в данной области техники. Примеры способов могут включать способ делеции полностью или части кодирующего белок гена на хромосоме, включающий случай, когда активность белка устраняется; способ замены кодирующего белок гена на хромосоме геном, который подвергают мутации для снижения активности фермента; способ внесения вариации в последовательность контроля экспрессии кодирующего белок гена на хромосоме; способ замены последовательности контроля экспрессии кодирующего белок гена последовательностью, имеющей слабую активность или не обладающей активностью (например, способ замены промотора гена промотором более слабым, чем собственный промотор); способ делеции полностью или части кодирующего белок гена на хромосоме; способ внесения антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который ингибирует трансляцию с мРНК на белок посредством комплементарного связывания с транскрипта гена на хромосоме; способ сделать невозможным прикрепление рибосомы путем формирования вторичной структуры посредством искусственного добавления комплементарной последовательности к последовательности SD (Шайна-Дальгарно) на переднем конце последовательности SD кодирующего белок гена; добавление, посредством способа инженерии обратной транскрипции (RTE), подлежащего обратной транскрипции промотора на 3'-конец открытой рамки считывания (ОРС) соответствующей последовательности; или их комбинацию, но без конкретного ограничения этим.
Конкретно, способ делеции части или полностью кодирующего белок гена может быть выполнен путем замены полинуклеотида, кодирующего эндогенный целевой белок в хромосоме, полинуклеотидом или маркерным геном, имеющим частично делетированную нуклеотидную последовательность, с помощью вектора для хромосомной вставки в микроорганизм. Например, можно использовать способ делеции гена посредством гомологичной рекомбинации, но без ограничения этим. Дополнительно, «часть», хотя она может варьироваться в зависимости от видов полинуклеотидов, может быть подходящим образом определена специалистом в данной области техники, и она может представлять собой, например, от 1 нуклеотида до 300 нуклеотидов, более конкретно от 1 нуклеотида до 100 нуклеотидов и еще более конкретно от 1 нуклеотида до 50 нуклеотидов, но не ограничивается конкретно этим.
Кроме того, способ модификации последовательности контроля экспрессии можно выполнять посредством индукции модификации в последовательности контроля экспрессии посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации таким образом, чтобы дополнительно инактивировать активность последовательности контроля экспрессии, или посредством замены последовательности нуклеотидной последовательностью, имеющей более слабую активность. Последовательность контроля экспрессии может включать промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую домен связывания рибосомы, и последовательность для регуляции транскрипции и трансляции, но без ограничения этим.
Кроме того, способ модификации нуклеотидной последовательности на хромосоме можно выполнять посредством индукции модификации в последовательности с помощью делеции, вставки, консервативной или неконсервативной замены или их комбинации таким образом, чтобы дополнительно инактивировать активность белка, или посредством замены последовательности нуклеотидной последовательностью, которую улучшают для придания более слабой активности, или нуклеотидной последовательностью, которую улучшают так, чтобы она не имела активности, но без ограничения этим. Конкретно, в микроорганизме по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из гена metB, кодирующего цистатионин-гамма-синтазу, гена metY, кодирующего O-ацетилгомосерин-(тиол)-лиазу, которая представляет собой путь деградации О-сукцинилгомосерина, и гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу, может быть дополнительно делетирован или ослаблен.
В контексте настоящего изобретения, термин «делеция» относится к типу удаления в хромосоме части или полностью участка нуклеотидной последовательности целевого гена от нуклеотидной последовательности, соответствующей инициирующему кодону, до таковой терминирующего кодона, или части или полностью нуклеотидной последовательности ее регуляторного участка.
В контексте настоящего изобретения, термин «ослабление» относится к удалению или снижению внутриклеточной активности одного или более ферментов, которые кодируются соответствующей ДНК в штамме микроорганизма. Например, экспрессия белка может быть ослаблена посредством модификации нуклеотидной последовательности участка промотора или 5'-UTR (нетранслируемая область) гена, или активность белка может быть ослаблена посредством внесения мутации в участок ОРС соответствующего гена.
Кроме того, микроорганизм рода Corynebacterium может представлять собой продуцирующий O-сукцинилгомосерин микроорганизм рода Corynebacterium, в котором активность аспартокиназы дополнительно увеличена по сравнению с невариантным микроорганизмом.
В контексте настоящего изобретения, термин «усиление активности белка» относится к введению активности белка, или повышению активности белка по сравнению со свойственной ему активностью. «Введение» активности означает возникновение у конкретного полипептида активности, которой микроорганизм по природе или искусственно не обладает.
В контексте настоящего изобретения, термин «повышение» активности белка по сравнению со свойственной ему активностью означает, что активность микроорганизма повышается по сравнению со свойственной активностью белка или активностью до модификации. Термин «свойственная активность» относится к активности конкретного белка, которой первоначально обладает родительский штамм или немодифицированный микроорганизм до изменения его признака, когда признак микроорганизма изменяется в результате генетической вариации, вызванной естественными или искусственными факторами. Термин можно использовать взаимозаменяемо с «активностью до модификации».
Конкретно, в настоящем изобретении усиление активности может быть выполнено посредством:
1) увеличения числа копий полинуклеотида, кодирующего белок,
2) модификации последовательности контроля экспрессии для увеличения экспрессии полинуклеотида,
3) модификации полинуклеотидной последовательности на хромосоме для усиления активности белка,
4) внесения чужеродного полинуклеотида, проявляющего активность белка, или вариантного полинуклеотида, у которого полинуклеотид является кодон-оптимизированным, или
5) модификации для усиления посредством комбинации всего вышеупомянутого, но без ограничения этим.
1) Увеличение числа копий полинуклеотида может быть выполнено, но без конкретного ограничения, в форме, в которой полинуклеотид функционально связан с вектором, или путем вставки полинуклеотида в хромосому клетки-хозяина. Конкретно, повышение числа копий полинуклеотида в хромосоме клетки-хозяина может быть выполнено внесением вектора в клетку-хозяина, где вектор может реплицироваться и действовать независимо от клетки-хозяина и с которым полинуклеотид, кодирующий белок по настоящему изобретению, связан функционально, или может быть выполнено внесением вектора в клетку-хозяина, где вектор может вставлять полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина и с которым полинуклеотид связан функционально.
Далее, 2) модификация последовательности контроля экспрессии для увеличения экспрессии полинуклеотида может быть выполнена, но без конкретного ограничения, посредством индукции модификации в последовательности посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены нуклеотидной последовательности или их комбинации для дополнительного усиления активности последовательности контроля экспрессии, или путем замены полинуклеотидной последовательности нуклеотидной последовательностью, имеющей более сильную активность. Последовательность контроля экспрессии включает, но без конкретного ограничения, промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции.
Сильный экзогенный промотор вместо первоначального промотора может быть соединен с участком слева от единицы экспрессии полинуклеотида. Примеры сильного промотора могут включать промотор CJ7 (патент Кореи №0620092 и WO 2006/065095), промотор lysCP1 (WO 2009/096689), промотор EF-Tu, промотор groEL, промотор асе А или асеВ и так далее, но без ограничения этим. Кроме того, 3) модификация полинуклеотидной последовательности на хромосоме может быть выполнена, но без конкретного ограничения, путем индукции модификации на последовательности контроля экспрессии посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены полинуклеотидной последовательности или их комбинации для дополнительного усиления активности полинуклеотидной последовательности, или путем замены полинуклеотидной последовательности полинуклеотидной последовательностью, которая улучшена для придания более сильной активности.
Кроме того, 4) введение чужеродной полинуклеотидной последовательности может быть выполнено путем внесения чужеродной полинуклеотидной последовательности, кодирующей белок, демонстрирующий активность идентичную/подобную таковой у вышеуказанного белка, или путем внесения его кодон-оптимизированного вариантного полинуклеотида в клетку-хозяина. Любую чужеродную полинуклеотидную последовательность можно использовать без ограничения по происхождению или ее последовательности при условии, что она демонстрирует активность, идентичную/подобную таковой у вышеуказанного белка. Кроме того, чужеродный полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина после оптимизации его кодонов таким образом, чтобы в клетке-хозяине могли происходить оптимизированные транскрипция и трансляция. Введение может быть выполнено посредством известного способа трансформации, который подходящим образом выбирает специалист в данной области техники, и белок может быть получен в результате экспрессии введенного полинуклеотида в клетку-хозяина и, в результате, его активность может быть увеличена.
Наконец, 5) способ модификации для усиления посредством комбинации (1)-(4) может быть выполнен путем применения одного или более способов увеличения числа копий полинуклеотида, кодирующего белок, модификации последовательности контроля экспрессии для увеличения экспрессии полинуклеотида, модификации полинуклеотидной последовательности на хромосоме и модификации чужеродного полинуклеотида, проявляющего активность белка или вариантного полинуклеотида, в котором его кодоны кодон-оптимизированы.
В настоящем изобретении последовательности генов или полинуклеотидов доступны из базы данных, такой как Национальный центр биотехнологической информации (NCBI).
В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения, в настоящем изобретении предложен способ получения О-сукцинилгомосерина, включающий стадии культивирования описанного выше микроорганизма; и сбор О-сукцинилгомосерина из культивированного микроорганизма или из культуральной среды.
В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения, в настоящем изобретении предложен способ получения L-метионина, включающий стадии культивирования описанного выше микроорганизма; и взаимодействия культивированного микроорганизма или О-сукцинилгомосерина с сульфидом.
Конкретно, стадия взаимодействия с сульфидом предполагает получение L-метионина из О-сукцинилгомосерина с использованием любого известного способа. Например, L-метионин может быть получен посредством взаимодействия О-сукцинилгомосерина с метилмеркаптаном в виде сульфида, или метионин может быть получен путем многостадийной реакции через продуцирование цистатионина посредством взаимодействия О-сукцинилгомосерина с цистеином в виде сульфида. Кроме того, для улучшения скорости реакции и выхода может быть добавлен катализатор или фермент, или реакция может допускаться в микроорганизме, включающем ферменты.
«О-сукцинилгомосерин» может представлять собой ферментационный бульон, содержащий О-сукцинилгомосерин, продуцированный описанным выше микроорганизмом по настоящему изобретению, или его очищенную форму. Кроме того, «сульфид» может представлять собой, например, метилмеркаптан. Метилмеркаптан относится ко всем производным метилмеркаптана, способным предоставлять атомы серы, таким как ожиженная форма метилмеркаптида натрия (CH3S-Na) и газообразная или ожиженная форма метилмеркаптана (CH3SH), а также метилмеркаптан, включающий диметилсульфид (DMS), который раскрыт в патентной публикации WO 2010/098629, и так далее.
Способ получения L-метионина может быть быстро определен специалистом в данной области техники по оптимизированным условиям культивирования и условиям активации фермента, известным в данной области техники. Конкретный способ культивирования и среда такие же, как описано выше.
Кроме того, способ получения L-метионина может дополнительно включать стадию выделения или сбора О-сукцинилгомосерина из микроорганизма, культивированного на стадии культивирования, или из среды.
Специалисту в данной области техники совершенно очевидно, что «О-сукцинилгомосерин» по настоящему изобретению может включать всего лишь сам О-сукцинилгомосерин и его соли.
В вышеуказанном способе стадия культивирования микроорганизма может быть выполнена путем известного способа периодического культивирования, непрерывного культивирования или культивирования с периодической подпиткой, но без конкретного ограничения этим. Рассматривая условия культивирования, подходящий рН (то есть рН от 5 до 9, конкретно рН от 6 до 8 и наиболее конкретно рН 6,8) можно регулировать, используя основное соединение (например, гидроксид натрия, гидроксид калия или аммиак) или кислотное соединение (например, фосфорную кислоту или серную кислоту), а аэробные условия можно поддерживать, добавляя в культуру кислород или кислородсодержащую газовую смесь, но без конкретного ограничения этим. Температуру культивирования можно поддерживать от 20°С до 45°С и конкретно от 25°С до 40°С, и микроорганизм можно культивировать в течение от примерно 10 часов до примерно 160 часов, но без ограничения этим. О-сукцинилгомосерин, полученный посредством вышеуказанного культивирования, может секретироваться в среду или оставаться внутри клеток.
Дополнительно, в используемой культуральной среде можно по отдельности или в виде их смеси использовать источники углерода, такие как сахара и углеводы (например, глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, мелассу, крахмал и целлюлозу), масла и жиры (например, соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло), жирные кислоты (например, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту и линолевую кислоту), спирты (например, глицерин и этанол) и органические кислоты (например, уксусную кислоту), но без ограничения этим. Источники азота, такие как азотсодержащие органические соединения (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевая мука и мочевина) или неорганические соединения (например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, аммония карбонат и нитрат аммония), можно использовать по отдельности или в виде их смеси, но без ограничения этим. Источники калия, такие как дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, или соответствующие им натрийсодержащие соли, можно использовать по отдельности или в виде их смеси, но без ограничения этим. Дополнительно, в среду могут быть включены другие необходимые стимулирующие рост вещества, включающие соли металлов (например, сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты и витамины.
Способ сбора О-сукцинилгомосерина или L-метионина, который продуцируется на стадии культивирования по настоящему изобретению, может заключаться в сборе целевой аминокислоты из культуральной жидкости с использованием подходящего способа, известного в данной области техники, согласно способу культивирования. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрацию, анионообменную хроматографию, кристаллизацию, ВЭЖХ (высокоэффективную жидкостную хроматографию) и так далее, и целевой О-сукцинилгомосерин или L-метионин может быть собран из среды или из микроорганизма с использованием подходящего способа, известного в данной области техники.
Осуществление изобретения
Ниже настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры. Однако эти Примеры приведены только для иллюстративных целей, и не предназначены ограничивать объем настоящего изобретения.
Пример 1: Конструирование плазмиды metX, имеющей активность О-ацетилгомосеринтрансферазы
Для амплификации гена, кодирующего О-ацетилгомосеринтрансферазу (MetX), сайты рестрикции BamHI вставляли в оба конца праймеров (SEQ ID NOS: 5 и 6) для амплификации от области промотора (примерно 300 п.н. (пар нуклеотидов) слева от инициирующих кодонов) до терминаторной области (примерно 100 п.н. справа от терминирующих кодонов), основываясь на описанной последовательности, полученной из WT (дикого типа).
После денатурации при 95°С в течение 5 минут, выполняли ПЦР в течение в общей сложности 30 циклов в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 90 секунд. После этого выполняли реакцию полимеризации при 72°С в течение 7 минут. В результате был получен фрагмент ДНК из 1546 п.н. кодирующего участка гена metX. Вектор pECCG117 (патент Кореи №10-0057684) и фрагмент ДНК metX обрабатывали ферментом рестрикции BamHI и лигировали друг с другом с использованием ДНК-лигазы, и клонировали, получая таким образом плазмиду, которую обозначали как PECCG117-metX WT.
Пример 2: Конструирование вариантной плазмиды metX, имеющей активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы
Отбирали новые сайты изменчивости metX и аминокислоту в положении 313 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменяли аминокислотой, отличной от лейцина.
Более конкретно, для получения вариантного вектора, в котором аминокислота в положении 313 О-ацетилгомосеринтрансферазы была заменена на другую аминокислоту, с использованием в качестве матрицы плазмиды pECCG117-metX WT, сконструированной в Примере 1, конструировали пару праймеров (SEQ ID NOS: 7 и 8).
Праймеры и набор для сайт-направленного мутагенеза (Stratagene, USA) использовали для получения вариантного metX гена. Вариантную плазмиду L313R на основе плазмиды WT дикого типа обозначали как WT L313R.
Пример 3: Сравнительный эксперимент на субстратную специфичность и активность вариантного metX, имеющего активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы
Для сравнения активности вариантного metX, продуцирующего большое количество О-сукцинилгомосерина, получали штамм, в котором накапливался гомосерин, а доступность продуцированного О-сукцинилгомосерина была делетирована. Получали штамм, в котором ген metB, кодирующий цистатионин-гамма-синтазу, которая вовлечена в путь деградации О-сукцинилгомосерина, и ген metY, кодирующий O-ацетилгомосерин-(тиол)-лиазу которая вовлечена в путь деградации О-сукцинилгомосерина, были делетированы. Для делеции гена metB сначала конструировали пару праймеров (SEQ ID NOS: 9 и 10) для амплификации слева от 5'-участка гена metB и пару праймеров (SEQ ID NOS: 11 и 12) для амплификации справа от 3'-участка гена metB на основе нуклеотидной последовательности гена metB, полученного из WT. Сайты рестрикции XbaI (подчеркнуты) вставляли в каждый конец праймеров SEQ ID NOS: 9 и 12.
ПЦР выполняли с использованием хромосомы WT в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12. После денатурации при 95°C в течение 5 минут выполняли ПЦР в течение в общей сложности 30 циклов в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 90 секунд. После этого выполняли реакцию полимеризации при 72°С в течение 7 минут. В результате был получен фрагмент ДНК из 450 п.н. слева от 5'-участка гена metB и фрагмент ДНК из 467 п.н. справа от 3'-участка гена metB.
ПЦР выполняли с использованием амплифицированных двух видов фрагментов ДНК в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12. После денатурации при 95°С в течение 5 минут выполняли ПЦР в течение в общей сложности 30 циклов в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 3 минут. После этого выполняли реакцию полимеризации при 72°С в течение 7 минут. В результате был амплифицирован фрагмент ДНК из 917 п.н., включающий только фрагменты слева и справа вследствие делеции средней части гена metB.
Вектор pDZ и фрагмент ДНК из 917 п.н. обрабатывали ферментом рестрикции XbaI и затем лигировали друг с другом с использованием ДНК-лигазы, и клонировали, получая таким образом плазмиду которую обозначали как pDZ-ΔmetB.
Вектор pDZ-ΔmetB вводили в штамм WT посредством электроимпульсного способа, и затем штамм-транс формант отбирали на селективной среде содержащей 25 мг/л канамицина. Получали штамм WTΔmetB, у которого ген metB был делетирован посредством фрагмента ДНК, вставленного в хромосому путем процесса вторичной рекомбинации (кроссинговер).
Для делеции гена metY, который представляет собой другой путь деградации О-сукцинилгомосерина, конструировали пару праймеров (SEQ ID NOS: 13 и 14) для амплификации слева от 5'-участка гена metY и пару праймеров (SEQ ID NOS: 15 и 16) для амплификации справа 3'-участка гена metY, на основе нуклеотидной последовательности гена metY, полученного из WT. Сайты рестрикции XbaI (подчеркнуты) вставляли в каждый конец праймеров SEQ ID NOS: 13 и 16.
ПЦР выполняли с использованием хромосомы WT в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16. После денатурации при 95°C в течение 5 минут выполняли ПЦР в течение в общей сложности 30 циклов в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 90 секунд. После этого выполняли реакцию полимеризации при 72°С в течение 7 минут. В результате был получен фрагмент ДНК из 512 п.н. слева от 5'-участка гена metY и фрагмент ДНК из 520 п.н. справа от 3'-участка гена metY.
ПЦР выполняли с использованием амплифицированных двух видов фрагментов ДНК в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 16. После денатурации при 95°С в течение 5 минут выполняли ПЦР в течение в общей сложности 30 циклов в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 3 минут. После этого выполняли реакцию полимеризации при 72°С в течение 7 минут. В результате, вследствие делеции средней части гена metY, был амплифицирован фрагмент ДНК из 1032 п.н., включающий только фрагменты слева и справа.
Вектор pDZ и фрагмент ДНК из 1032 п.н. обрабатывали ферментом рестрикции XbaI и затем лигировали друг с другом с использованием ДНК-лигазы, и клонировали, получая таким образом плазмиду которую обозначали как pDZ-ΔmetY.
Вектор pDZ-ΔmetY вводили в полученный штамм WTΔmetB посредством электроимпульсного способа, и затем штамм-трансформант отбирали на селективной среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Был получен штамм WTΔmetBΔmetY, у которого ген metY был делетирован посредством фрагмента ДНК, вставленного в хромосому путем процесса вторичной рекомбинации (кроссинговер).
Для максимального увеличения продуцирования O-сукцинилгомосерина конструировали пару праймеров (SEQ ID NOS: 19 и 20) для амплификации слева от 3'-участка и пару праймеров (SEQ ID NOS: 21 и 22) для амплификации справа от 3'-участка вокруг сайта изменчивости для конструкции вводящего вариант вектора для гена lysC (SEQ ID NO: 18), кодирующего аспартокиназу полученную из WT (SEQ ID NO: 17). Праймеры SEQ ID NOS: 19 и 22 вставляли в сайты рестрикции XbaI (подчеркнуты) на каждом конце и праймерам SEQ ID NOS: 20 и 21 давали возможность размещать вариацию замены нуклеотидов (подчеркнуты) на участке, который конструировали для кроссинговера друг с другом.
ПЦР выполняли с использованием хромосомы WT в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22. После денатурации при 95°C в течение 5 минут выполняли ПЦР в течение в общей сложности 30 циклов в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 30 секунд. После этого выполняли реакцию полимеризации при 72°С в течение 7 минут. В результате был получен фрагмент ДНК из 509 п.н. слева от 5'-участка и фрагмент ДНК из 520 п.н. справа от 3'-участка вокруг вариации гена lysC.
ПЦР выполняли с использованием амплифицированных двух видов фрагментов ДНК в качестве матрицы и праймеров SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 22. После денатурации при 95°С в течение 5 минут выполняли ПЦР в течение в общей сложности 30 циклов в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд; отжиг при 55°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 60 секунд. После этого выполняли реакцию полимеризации при 72°С в течение 7 минут. В результате был амплифицирован фрагмент ДНК из 1011 п.н., включающий вариацию гена lysC (SEQ ID NO: 24), кодирующую вариант аспартокиназы (SEQ ID NO: 23), в котором треонин в положении 311 был заменен изолейцином.
Вектор pDZ (патент Кореи №0924065), который не реплицируется в Corynebacterium glutamicum, и фрагмент ДНК из 1011 п.н. обрабатывали ферментом рестрикции XbaI и лигировали друг с другом, используя ДНК-лигазу, и клонировали, таким образом получая плазмиду которая была названа pDZ-lysC(T311I).
Вектор pDZ-lysC(T311I) вводили в WTΔmetBΔmetY посредством электроимпульсного способа (Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999) 52:541-545) и затем штамм-трансформант отбирали на селективной среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Был получен штамм WTΔmetBΔmetY, lysC(T311I), у которого нуклеотидная вариация была введена в ген lysC посредством фрагмента ДНК, вставленного в хромосому путем процесса вторичной рекомбинации (кроссинговер), и штамм обозначали как Corynebacterium glutamicum WTΔmetBAmetY, lysC(T311I).
Векторы pECCG117-metX WT и pECCG117-metX WT L313R, полученные в Примерах 1 и 2, вводили в WTΔmetBΔmetY, полученный, как указано выше, посредством электроимпульсного способа, и затем каждый штамм-трансформант отбирали на селективной среде, содержащей 25 мг/л канамицина.
Для сравнения способностей полученных штаммов к продуцированию О-ацетилгомосерина (О-АН) и О-сукцинилгомосерина (O-SH) их культивировали посредством следующего способа и анализировали концентрации О-ацетилгомосерина и О-сукцинилгомосерина в культуральной среде.
Каждую платиновую петлю штаммов инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 25 мл следующей среды, и затем культивировали при 37°С и 200 об/мин при встряхивании в течение 20 часов. Концентрации О-ацетилгомосерина и О-сукцинилгомосерина анализировали путем ВЭЖХ и анализированные концентрации показаны в Таблице 6.
Состав среды (рН 7,0)
100 г глюкозы, 40 г (NH4)2SO4, 2,5 г соевого белка, 5 г твердой фазы кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г KH2PO4, 0,5 г MgSO4⋅7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО3, 0,3 г L-метионина (на 1 литр дистиллированной воды).
Как показано в Таблице 6, было подтверждено, что штамм с введенной контрольной плазмидой metX WT продуцировал О-ацетилгомосерин, в то время как штамм с введенной вариантной плазмидой metX продуцировал О-сукцинилгомосерин. Другими словами, субстратная специфичность трансферазы была изменена у штамма с введенным вариантом, и в результате продуцировался О-сукцинилгомосерин.
Кроме того, полученный штамм WTΔmetBΔmetY, lysC(T311I)/pECCG117-metX WT_L313R был обозначен как СА05-5132 и затем депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ), который представляет собой международный депозитарный орган в соответствии с Будапештским договором, 11 мая 2017 с номером доступа № КССМ12023Р.
Пример 4: Получение варианта MetX посредством насыщающего мутагенеза и оценка способности продуцировать О-ацетилгомосерин
Для получения вариантов, у которых другая аминокислота была заменена в вариативном сайте metX, показывающих высокую способность продуцировать О-сукцинилгомосерин, использовали насыщающий мутагенез. Было получено 18 видов вариантов, у которых аминокислота в положении 313 metX была заменена другой аминокислотой, и плазмиду, полученную в Примере 1, использовали в качестве матрицы. Каждый из вариантов, замененные аминокислоты и SEQ ID NOs. праймеров, использованных в каждом варианте, показаны в следующей Таблице 7.
Конкретно, праймеры, предлагаемые в Таблице, 2 и набор для сайт-направленного мутагенеза (Stratagene, USA) использовали для получения вариантных генов metX. Каждую из полученных вариантных плазмид вводили в штамм WTΔmetBΔmetY, lysC(T311I) и выполняли тест в колбе таким же образом, как в Примере 4. Результаты показаны в следующей Таблице 8.
Как показано в Таблице 3, было подтверждено, что большая часть вариантов не продуцировала О-сукцинилгомосерин, в то время как вариант (L313R), (L313C), (L313I) или (L313K), имеющий аминокислотную вариацию в положении 313 metX продуцировал О-сукцинилгомосерин на более высоких уровнях, чем дикий тип, соответственно. Другими словами, когда аминокислота в положении 313 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 замещена аргинином, цистеином, изолейцином или лизином, может быть обеспечена субстратная специфичность в отношении сукцинил-СоА, и в результате может быть получен О-сукцинилгомосерин.
Взятые вместе результаты приводят к выводу, что варианты по настоящему изобретению могут повышать продуцирование О-сукцинилгомосерина.
На основе указанного выше описания специалисту в данной области техники будет понятно, что настоящее изобретение может быть осуществлено в другой специальной форме без изменения технического характера или его необходимых характеристик. Таким образом, следует понимать, что указанное выше воплощение является не ограничивающим, а иллюстративным во всех аспектах. Объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не описанием, предваряющим ее, и, таким образом, все изменения и модификации, которые попадают в границы и пределы формулы изобретения, или эквиваленты таких границ и пределов, таким образом, предназначены быть охваченными формулой изобретения.
Номер депонирования
Орган депонирования: Корейский центр культур микроорганизмов
Номер доступа: КССМ12023Р
Дата депонирования: 11 мая 2017
--->
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> NOVEL O-SUCCINYL HOMOSERINE TRANSFERASE VARIANT AND METHOD OF
PRODUCING O-SUCCINYL HOMOSERINE USING THE SAME
<130> OPA18185
<150> KR 10-2017-0083438
<151> 2017-06-30
<160> 94
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 377
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(377)
<223> metX
<400> 1
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Leu Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 2
<211> 1134
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1134)
<223> metX
<400> 2
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattttgt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 3
<211> 379
<212> PRT
<213> Pseudomonas aeruginosa
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(379)
<223> metX1
<400> 3
Met Pro Thr Val Phe Pro Asp Asp Ser Val Gly Leu Val Ser Pro Gln
1 5 10 15
Thr Leu His Phe Asn Glu Pro Leu Glu Leu Thr Ser Gly Lys Ser Leu
20 25 30
Ala Glu Tyr Asp Leu Val Ile Glu Thr Tyr Gly Glu Leu Asn Ala Thr
35 40 45
Gln Ser Asn Ala Val Leu Ile Cys His Ala Leu Ser Gly His His His
50 55 60
Ala Ala Gly Tyr His Ser Val Asp Glu Arg Lys Pro Gly Trp Trp Asp
65 70 75 80
Ser Cys Ile Gly Pro Gly Lys Pro Ile Asp Thr Arg Lys Phe Phe Val
85 90 95
Val Ala Leu Asn Asn Leu Gly Gly Cys Asn Gly Ser Ser Gly Pro Ala
100 105 110
Ser Ile Asn Pro Ala Thr Gly Lys Val Tyr Gly Ala Asp Phe Pro Met
115 120 125
Val Thr Val Glu Asp Trp Val His Ser Gln Ala Arg Leu Ala Asp Arg
130 135 140
Leu Gly Ile Arg Gln Trp Ala Ala Val Val Gly Gly Ser Leu Gly Gly
145 150 155 160
Met Gln Ala Leu Gln Trp Thr Ile Ser Tyr Pro Glu Arg Val Arg His
165 170 175
Cys Leu Cys Ile Ala Ser Ala Pro Lys Leu Ser Ala Gln Asn Ile Ala
180 185 190
Phe Asn Glu Val Ala Arg Gln Ala Ile Leu Ser Asp Pro Glu Phe Leu
195 200 205
Gly Gly Tyr Phe Gln Glu Gln Gly Val Ile Pro Lys Arg Gly Leu Lys
210 215 220
Leu Ala Arg Met Val Gly His Ile Thr Tyr Leu Ser Asp Asp Ala Met
225 230 235 240
Gly Ala Lys Phe Gly Arg Val Leu Lys Thr Glu Lys Leu Asn Tyr Asp
245 250 255
Leu His Ser Val Glu Phe Gln Val Glu Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly
260 265 270
Glu Glu Phe Ser Thr Arg Phe Asp Ala Asn Thr Tyr Leu Leu Met Thr
275 280 285
Lys Ala Leu Asp Tyr Phe Asp Pro Ala Ala Ala His Gly Asp Asp Leu
290 295 300
Val Arg Thr Leu Glu Gly Val Glu Ala Asp Phe Cys Leu Met Ser Phe
305 310 315 320
Thr Thr Asp Trp Arg Phe Ser Pro Ala Arg Ser Arg Glu Ile Val Asp
325 330 335
Ala Leu Ile Ala Ala Lys Lys Asn Val Ser Tyr Leu Glu Ile Asp Ala
340 345 350
Pro Gln Gly His Asp Ala Phe Leu Met Pro Ile Pro Arg Tyr Leu Gln
355 360 365
Ala Phe Ser Gly Tyr Met Asn Arg Ile Ser Val
370 375
<210> 4
<211> 1140
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1140)
<223> metX1
<400> 4
atgcccacag tcttccccga cgactccgtc ggtctggtct ccccccagac gctgcacttc 60
aacgaaccgc tcgagctgac cagcggcaag tccctggccg agtacgacct ggtgatcgaa 120
acctacggcg agctgaatgc cacgcagagc aacgcggtgc tgatctgcca cgccctctcc 180
ggccaccacc acgccgccgg ctaccacagc gtcgacgagc gcaagccggg ctggtgggac 240
agctgcatcg gtccgggcaa gccgatcgac acccgcaagt tcttcgtcgt cgccctcaac 300
aacctcggcg gttgcaacgg atccagcggc cccgccagca tcaatccggc gaccggcaag 360
gtctacggcg cggacttccc gatggttacg gtggaagact gggtgcatag ccaggcgcgc 420
ctggcagacc gcctcggcat ccgccagtgg gccgcggtgg tcggcggcag cctcggcggc 480
atgcaggcgc tgcaatggac catcagctat cccgagcgcg tccgtcactg cctgtgcatc 540
gccagcgcgc cgaagctgtc ggcgcagaac atcgccttca acgaagtcgc ccggcaggcg 600
attctttccg accctgagtt cctcggcggc tacttccagg agcagggcgt gattcccaag 660
cgcggcctca agctggcgcg gatggtcggc catatcacct acctgtccga cgacgccatg 720
ggcgccaagt tcggccgtgt actgaagacc gagaagctca actacgacct gcacagcgtc 780
gagttccagg tcgagagtta cctgcgctac cagggcgagg agttctccac ccgcttcgac 840
gccaatacct acctgctgat gaccaaggcg ctggactact tcgaccccgc cgccgcccac 900
ggcgacgacc tggtgcgcac cctggagggc gtcgaggcgg acttctgcct gatgtccttc 960
accaccgact ggcgtttctc gccggcccgc tcgcgggaaa tcgtcgacgc cctgatcgcg 1020
gcgaaaaaga acgtcagcta cctggagatc gacgccccgc aaggccacga cgccttcctc 1080
atgccgatcc cccggtacct gcaagccttc agcggttaca tgaaccgcat cagcgtgtga 1140
1140
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 1
<400> 5
ggatcccctc gttgttcacc cagcaacc 28
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 2
<400> 6
ggatcccaaa gtcacaacta cttatgttag 30
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 5
<400> 7
gtagataccg atattcggta cccctaccac cag 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 6
<400> 8
ctggtggtag gggtaccgaa tatcggtatc tac 33
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 7
<400> 9
tctagatgcg ctgattatct cacc 24
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 8
<400> 10
actggtgggt catggttgca tatgagatca actcctgtaa 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 9
<400> 11
ttacaggagt tgatctcata tgcaaccatg acccaccagt 40
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 10
<400> 12
tctagacctt gaagttcttg actg 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 11
<400> 13
tctagaagta gcgttgctgt acac 24
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 12
<400> 14
atcaatggtc tcgatgccca tatggcattt ggaggtcctt aag 43
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 13
<400> 15
cttaaggacc tccaaatgcc atatgggcat cgagaccatt gat 43
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 14
<400> 16
tctagatgga accgttgcaa ccac 24
<210> 17
<211> 421
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(421)
<223> lysC
<400> 17
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 18
<211> 1266
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1266)
<223> lysC
<400> 18
atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 15
<400> 19
tcctctagag ctgcgcagtg ttgaatacg 29
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 16
<400> 20
caccgacatc atcttcacct gcc 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 17
<400> 21
ggcaggtgaa gatgatgtcg gtg 23
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер 18
<400> 22
gactctagag ttcacctcag agacgatta 29
<210> 23
<211> 421
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(421)
<223> вариант lysC (T311I)
<400> 23
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 24
<211> 1266
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1266)
<223> вариант lysC (T311I)
<400> 24
atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc atcttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313F
<400> 25
gtagataccg atatttttta cccctaccac cag 33
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313F
<400> 26
ctggtggtag gggtaaaaaa tatcggtatc tac 33
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313S
<400> 27
gtagataccg atatttctta cccctaccac cag 33
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313S
<400> 28
gtagataccg atatttctta cccctaccac cag 33
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313Y
<400> 29
gtagataccg atatttatta cccctaccac cag 33
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313Y
<400> 30
ctggtggtag gggtaataaa tatcggtatc tac 33
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313C
<400> 31
gtagataccg atatttgtta cccctaccac cag 33
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313C
<400> 32
ctggtggtag gggtaacaaa tatcggtatc tac 33
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313P
<400> 33
gtagataccg atattcctta cccctaccac cag 33
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313P
<400> 34
ctggtggtag gggtaaggaa tatcggtatc tac 33
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313H
<400> 35
gtagataccg atattcatta cccctaccac cag 33
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313H
<400> 36
ctggtggtag gggtaatgaa tatcggtatc tac 33
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313Q
<400> 37
gtagataccg atattcaata cccctaccac cag 33
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313Q
<400> 38
ctggtggtag gggtattgaa tatcggtatc tac 33
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313I
<400> 39
gtagataccg atattatcta cccctaccac cag 33
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313I
<400> 40
ctggtggtag gggtagataa tatcggtatc tac 33
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313T
<400> 41
gtagataccg atattaccta cccctaccac cag 33
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313T
<400> 42
ctggtggtag gggtaggtaa tatcggtatc tac 33
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313N
<400> 43
gtagataccg atattaacta cccctaccac cag 33
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313N
<400> 44
ctggtggtag gggtagttaa tatcggtatc tac 33
<210> 45
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313K
<400> 45
gtagataccg atattaaata cccctaccac cag 33
<210> 46
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313K
<400> 46
ctggtggtag gggtatttaa tatcggtatc tac 33
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313V
<400> 47
gtagataccg atattgttta cccctaccac cag 33
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313V
<400> 48
ctggtggtag gggtaaacaa tatcggtatc tac 33
<210> 49
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313A
<400> 49
gtagataccg atattgcata cccctaccac cag 33
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313A
<400> 50
ctggtggtag gggtatgcaa tatcggtatc tac 33
<210> 51
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313D
<400> 51
gtagataccg atattgacta cccctaccac cag 33
<210> 52
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313D
<400> 52
ctggtggtag gggtagtcaa tatcggtatc tac 33
<210> 53
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313E
<400> 53
gtagataccg atattgaata cccctaccac cag 33
<210> 54
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313E
<400> 54
ctggtggtag gggtattcaa tatcggtatc tac 33
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313G
<400> 55
gtagataccg atattggata cccctaccac cag 33
<210> 56
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313G
<400> 56
ctggtggtag gggtatccaa tatcggtatc tac 33
<210> 57
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для L313W
<400> 57
gtagataccg atatttggta cccctaccac cag 33
<210> 58
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для L313W
<400> 58
ctggtggtag gggtaccaaa tatcggtatc tac 33
<210> 59
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> metX L313R
<400> 59
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Arg Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 60
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> metX L313R
<400> 60
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattcggt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 61
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313F
<400> 61
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Phe Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 62
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313F
<400> 62
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatatttttt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 63
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313S
<400> 63
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Ser Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 64
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313S
<400> 64
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatatttctt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 65
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313Y
<400> 65
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Tyr Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 66
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313Y
<400> 66
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatatttatt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 67
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313C
<400> 67
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Cys Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 68
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313C
<400> 68
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatatttgtt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 69
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313P
<400> 69
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Pro Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 70
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313P
<400> 70
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattcctt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 71
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313H
<400> 71
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile His Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 72
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313H
<400> 72
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattcatt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 73
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313Q
<400> 73
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Gln Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 74
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313Q
<400> 74
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattcaat acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 75
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313I
<400> 75
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Ile Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 76
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313I
<400> 76
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattatct acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 77
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313T
<400> 77
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Thr Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 78
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313T
<400> 78
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattacct acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 79
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313N
<400> 79
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Asn Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 80
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313N
<400> 80
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattaact acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 81
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313K
<400> 81
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Lys Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 82
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313K
<400> 82
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattcatt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 83
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313V
<400> 83
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Val Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 84
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313V
<400> 84
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattgttt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 85
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313A
<400> 85
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Ala Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 86
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313A
<400> 86
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattgcat acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 87
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313D
<400> 87
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Asp Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 88
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313D
<400> 88
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattgact acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 89
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313E
<400> 89
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Glu Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 90
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313E
<400> 90
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattgaat acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 91
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313G
<400> 91
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Gly Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 92
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313G
<400> 92
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatattggat acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<210> 93
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313W
<400> 93
Met Pro Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gln Leu Glu Ile Gln Ala Ile Gly
1 5 10 15
Asp Val Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ile Ile Thr Asn Ala Glu Ile Ala
20 25 30
Tyr His Arg Trp Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Glu Gly Arg Ser Asn
35 40 45
Val Val Leu Ile Glu His Ala Leu Thr Gly Asp Ser Asn Ala Ala Asp
50 55 60
Trp Trp Ala Asp Leu Leu Gly Pro Gly Lys Ala Ile Asn Thr Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Cys Val Ile Cys Thr Asn Val Ile Gly Gly Cys Asn Gly Ser Thr
85 90 95
Gly Pro Gly Ser Met His Pro Asp Gly Asn Phe Trp Gly Asn Arg Phe
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Ile Arg Asp Gln Val Asn Ala Glu Lys Gln Phe Leu
115 120 125
Asp Ala Leu Gly Ile Thr Thr Val Ala Ala Val Leu Gly Gly Ser Met
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Pro Glu Thr Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Arg Ala Ser Ala Trp Gln
165 170 175
Ile Gly Ile Gln Ser Ala Gln Ile Lys Ala Ile Glu Asn Asp His His
180 185 190
Trp His Glu Gly Asn Tyr Tyr Glu Ser Gly Cys Asn Pro Ala Thr Gly
195 200 205
Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Ala His Leu Thr Tyr Arg Gly Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Arg Phe Gly Thr Lys Ala Gln Lys Asn Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Pro Asp Gln Arg Phe Ala Val Glu Ser Tyr
245 250 255
Leu Asp Tyr Gln Ala Asp Lys Leu Val Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Tyr Val Leu Leu Thr Asp Ala Leu Asn Arg His Asp Ile Gly Arg Asp
275 280 285
Arg Gly Gly Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ser Ile Lys Val Pro Val Leu
290 295 300
Val Ala Gly Val Asp Thr Asp Ile Trp Tyr Pro Tyr His Gln Gln Glu
305 310 315 320
His Leu Ser Arg Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ala Met Ala Lys Ile Val
325 330 335
Ser Pro Val Gly His Asp Ala Phe Leu Thr Glu Ser Arg Gln Met Asp
340 345 350
Arg Ile Val Arg Asn Phe Phe Ser Leu Ile Ser Pro Asp Glu Asp Asn
355 360 365
Pro Ser Thr Tyr Ile Glu Phe Tyr Ile
370 375
<210> 94
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 313W
<400> 94
atgcccaccc tcgcgccttc aggtcaactt gaaatccaag cgatcggtga tgtctccacc 60
gaagccggag caatcattac aaacgctgaa atcgcctatc accgctgggg tgaataccgc 120
gtagataaag aaggacgcag caatgtcgtt ctcatcgaac acgccctcac tggagattcc 180
aacgcagccg attggtgggc tgacttgctc ggtcccggca aagccatcaa cactgatatt 240
tactgcgtga tctgtaccaa cgtcatcggt ggttgcaacg gttccaccgg acctggctcc 300
atgcatccag atggaaattt ctggggtaat cgcttccccg ccacgtccat tcgtgatcag 360
gtaaacgccg aaaaacaatt cctcgacgca ctcggcatca ccacggtcgc cgcagtactt 420
ggtggttcca tgggtggtgc ccgcacccta gagtgggccg caatgtaccc agaaactgtt 480
ggcgcagctg ctgttcttgc agtttctgca cgcgccagcg cctggcaaat cggcattcaa 540
tccgcccaaa ttaaggcgat tgaaaacgac caccactggc acgaaggcaa ctactacgaa 600
tccggctgca acccagccac cggactcggc gccgcccgac gcatcgccca cctcacctac 660
cgtggcgaac tagaaatcga cgaacgcttc ggcaccaaag cccaaaagaa cgaaaaccca 720
ctcggtccct accgcaagcc cgaccagcgc ttcgccgtgg aatcctactt ggactaccaa 780
gcagacaagc tagtacagcg tttcgacgcc ggctcctacg tcttgctcac cgacgccctc 840
aaccgccacg acattggtcg cgaccgcgga ggcctcaaca aggcactcga atccatcaaa 900
gttccagtcc ttgtcgcagg cgtagatacc gatatttggt acccctacca ccagcaagaa 960
cacctctcca gaaacctggg aaatctactg gcaatggcaa aaatcgtatc ccctgtcggc 1020
cacgatgctt tcctcaccga aagccgccaa atggatcgca tcgtgaggaa cttcttcagc 1080
ctcatctccc cagacgaaga caacccttcg acctacatcg agttctacat ctaa 1134
<---
1. Полипептид, имеющий активность O-сукцинилгомосеринтрансферазы, содержащий замену аминокислоты в положении 313 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 аминокислотой, отличной от лейцина.
2. Полипептид по п. 1, имеющий активность O-сукцинилгомосеринтрансферазы, где аминокислота в положении 313 представляет собой аргинин, цистеин, изолейцин или лизин.
3. Полипептид по п. 1, имеющий активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы, содержащий любую одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 81.
4. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по п. 1, имеющий активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы.
5. Полинуклеотид по п. 4, содержащий любую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76 и SEQ ID NO: 82.
6. Продуцирующий О-сукцинилгомосерин микроорганизм рода Corynebacterium, содержащий или сверхэкспрессирующий полипептид по п. 1, имеющий активность О-сукцинилгомосеринтрансферазы, или полинуклеотид, кодирующий полипептид по п. 1, имеющий активность O-сукцинилгомосеринтрансферазы.
7. Продуцирующий О-сукцинилгомосерин микроорганизм рода Corynebacterium по п. 6, где активность аспартокиназы дополнительно увеличена по сравнению с невариантным микроорганизмом.
8. Продуцирующий О-сукцинилгомосерин микроорганизм рода Corynebacterium по п. 6, который представляет собой Corynebacterium glutamicum.
9. Продуцирующий О-сукцинилгомосерин микроорганизм рода Corynebacterium по п. 6, где активность одного или более выбранного из группы, состоящей из цистатионинсинтазы, O-ацетилгомосерин-(тиол)-лиазы и гомосеринкиназы, инактивирована.
10. Продуцирующий О-сукцинилгомосерин микроорганизм рода Corynebacterium по п. 6, где активность аспартокиназы дополнительно увеличена по сравнению с невариантным микроорганизмом и активность одного или более выбранных из группы, состоящей из цистатионинсинтазы, О-ацетилгомосерин-(тиол)-лиазы и гомосеринкиназы, инактивирована.
11. Способ получения О-сукцинилгомосерина, включающий стадии:
культивирования продуцирующего О-сукцинилгомосерин микроорганизма рода Corynebacterium по любому из пп. 6-10 в среде; и
выделения или сбора О-сукцинилгомосерина из микроорганизма, культивированного на стадии культивирования, или из среды.
12. Способ получения L-метионина, включающий стадии:
а) культивирования продуцирующего О-сукцинилгомосерин микроорганизма рода Corynebacterium по любому из пп. 6-10 в среде; и
б) взаимодействия О-сукцинилгомосерина с сульфидом.
13. Способ получения L-метионина по п. 12, дополнительно включающий стадию выделения или сбора О-сукцинилгомосерина из микроорганизма, культивированного на стадии (а), или из среды.
14. Способ получения L-метионина по п. 12, дополнительно включающий стадию выделения или сбора L-метионина, который получен посредством взаимодействия О-сукцинилгомосерина с сульфидом на стадии (б).
