Иммуномодулятор

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению композиции в качестве нейроиммуномодулятора. Применение нутрицевтической композиции, представляющей собой гомогенизированную смесь сухих порошков, в которой процентное содержание по массе сухого порошка каждого ингредиента от общей массы композиции составляет, %: экстракт корня куркумы 1-50, экстракт черного перца 0,2-1, экстракт сои 1-50, экстракт листьев зеленого чая 1-50, экстракт красного корня 1-50, экстракт солодки 1-50, экстракт листьев облепихи 10-60, арабиногалактан 1-50 и цинк 0,1-0,5 в качестве нейроиммуномодулятора. Вышеописанная композиция эффективна в качестве нейроиммуномодулятора. 1 ил., 5 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к нейроиммуномодуляторам на основе фитонутриентов преимущественно класса флавоноидов и может быть использовано для снижения алкогольной мотивации и стимуляции иммунного ответа при хроническом алкоголизме.

Хроническая интоксикация этанолом, оказывающая как прямое, так и опосредованное токсическое воздействие продуктами его метаболизма на организм человека, приводит к повреждению большинства его органов и систем - нервной, иммунной, сердечно - сосудистой, костно - мышечной, эндокринной, гепатобилиарной, а также желудочно - кишечного тракта, индуцируя оксидативный стресс, системное воспаление, а также нейровоспаление и нейродегенерацию. Воздействие этанола на клетки нервной ткани создает нейроанатомический субстрат патофизиологии алкоголизма. Этанол оказывает выраженный эффект на пластичность синапсов и формирование дендритов нейронов в определенных регионах мозга. Так, хроническое воздействие этанола сопровождается изменением структуры гиппокампа и фронтальной коры, что ассоциируется с нарушением пространственного мышления, памяти и способности к обучению. Хроническое воздействие этанола приводит к активации ядерного фактора NFκB, гетеродимеризацией его субъединиц р50-р65, с] последующей транслокацией в ядро, что приводит к продукции провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α (Crews F.T., Lawrimore C.J., Walter T.J., Coleman L.G.Jr. The role of neuroimmune sig-naling in alcoholism //Neuropharmacology. - 2017.-. Т. - 122. - С. 56-73). При этом показано также снижение уровня мозгового нейротрофического фактора BDNF и фактора роста нервов β (β-NGF) в префронтальнй коре и гиппокампе, что сопровождается нейродегенерацией, снижением способности к обучению, формированием депрессивно-подобного паттерна поведения у животных (Fernandez GM, Stewart WN, Savage LM. Chronic drinking during adolescence predisposes the adult rat for continued heavy drinking neurotrophin and behavioral adaptation after long-term, continous ethanol exposure // PLoS One. - 2016. - T. 11. - №.3. - C. e019987; Перегуд Д.И., Панченко Л.Ф., Гуляева Н.В. Дисбаланс нейротрофического фактора мозга (BDNF) как фактор патогенеза алкогольной зависимости //Вопросы наркологии. - 2016 - Т. 9. - 10. - С. 29-41). Доклинические исследования в значительной степени подтверждают, что употребление алкоголя вызывает развитие нейровоспаления, которое, в свою очередь, способствует употреблению алкоголя, преимущественно через механизмы, связанные с Толл-подобными рецепторами и липополисахаридом (Pang М., Bala S., Kodys K. et al. Inhibition of TLR8- and TLR4-induced Type I IFN induction by alcohol is different from its effects on inflammatory cytokine production in monocytes. //BMC Immunol. - 2011. - T. 12. - C. 55; Airapetov M.I., Eresko S.O., Bychkov E.R., Lebedev A.A., Shabanov P.D. Expression of Toll-like receptors in emotiogenic structures of rat brain is changed under long-term alcohol consumption and ethanol withdrawal //Medical immunology. - 2020. - T. 22. - №.1. - C. 77-86/). Нейровоспаление происходит от прямого взаимодействия этанола с нейрональными и иммунными клетками мозга, а также от возникновения воспаления на периферии. Хроническое системное воспаление и окислительный стресс вовлечены в патогенез алкогольной зависимости (Maraslioglu М., Oppermann Е., Blattner С. et al. Chronic ethanol feeding modulates iflammatory mediators, activation of nuclear factor-kappaB, and responsiveness to endo-toxin in murine Kupffer cells and circulating leukocytes. // Mediators Inflamm. - 2014. - C. 808695; Zhang J., He Sh., Zhou W., Yuan B. Ethanol induces oxidative stress and apoptosis in human umbilical vein endothelial cells. // Int. J. Clin. Exp.Med. - 2016. - T. 9. - №2. - C. 4125-4130).

Длительное употребление алкоголя также влияет на иммунитет, подавляя иммунный ответ и изменяя функциональную активность иммунокомпетентных клеток (Zhang Н., Meadows G.G. Chronic alcohol consumption in mice increases the proportion of peripheral memory T cells by homeostatic proliferation // J. Leukoc. Biol. - 2005. - T. 78. - №5. - C. 1070-1080; Lau A., Abe M., Thomson A. Ethanol affects the generation, cosignaling molecule expression, and function of plasmacytoid and myeloid dendritic cell subsets in vitro and in vivo. //J. Leukoc. Biol. - 2006. - T. 79. - №5. - C. 941-994; Freeman W.M., Vanguilder H.D., Guidone E. et al. Plasma proteomic alterations in non-human primates and humans after chronic alcohol self-administration // Int. J. Neuropsychopharmacol. - 2011. - T. 14. - №7. - C. 899-911; Asquith M., Pasala S., Engelmann F. et al. Chronic Ethanol Consumption Modulates Growth Factor Release, Mucosal Cytokine Production, and MicroRNA Expression in Nonhuman Primates. //Alcohol Clin. Exp.Res. - 2013. - T. 38. - №4. - C. 980-993;). Механизмы воздействия этанола на иммунную систему могут быть реализованы через регуляцию активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы., которая, в свою очередь, находится под регулирующим влиянием цитокинов как периферического, так и центрального происхождения (Boyd K.N., Kumar S., O'Buckley Т.K. et al. Ethanol induction of steroidogenesis in rat adrenal and brain is dependent upon pituitary ACTH release and de novo adrenal StAR synthesis//J. Neurochem. - 2010. - T. 112. - №3. - C. 784-796; Blaine S.K., Sinha R. Alcohol, stress, and glucocorticoids: From risk to dependence and relapse in alcohol use disorders. //Neuropharmacology. - 2017. - 122. - C. 136-147).

Известно лекарственное средство растительного происхождения, модифицирующее токсическое действие алкоголя. Средство представляет собой экстракт гребней винограда, содержащий в расчете на минимальную дозу средства не менее 6 мг ароматических альдегидов и не менее 370 мг неокисленных соединений фенольной природы (флавоноидов). Средство может быть в виде водного, сухого и водно-спиртового экстракта. Полученное средство стандартизовано по содержанию основных биологически активных компонентов, что обеспечивает стабильное, статистически значимое биологическое действие (RU 2229302, А61Р 25/30, 27.05.2004).

Данное изобретение относится к области наркологии, и касается средств, способных модифицировать в благоприятную сторону токсическое действие алкоголя и, в частности, повышать качество главным образом крепких алкогольных напитков, но не снижает алкогольную мотивацию.

Известен способ профилактики и/или лечения зависимости от психоактивных веществ, в частности наркомании и/или алкоголизма и/или коморбидных расстройств с использованием биологически активной добавки, направленный на коррекцию нарушения баланса нейромедиаторов (RU 2402974, А61Р 25/30, 10.07.2010). Способ включает генотипирование по генам дофаминовой, серотониновой, норадреналиновой и гамма-аминомасляной кислоты систем нейромедиаторного обмена, психодиагностическое тестирование с последующим формированием психологических типов в соответствии с полиморфизмами в указанных генах, психодиагностическое тестирование с последующим формированием психологических типов в соответствии с полиморфизмами указанных генов. Затем назначают биологически активную добавку и/или фармакотерапию с учетом результатов генотипирования и выявленных психологических типов с нарушением нейромедиаторного обмена. Использование изобретения позволяет повысить эффективность лечения за счет коррекции нарушения баланса нейромедиаторов, предрасполагающего к формированию зависимости.

Известно, что фитонутриенты, в частности, флавоноиды, обладают способностью к регуляции физиологических процессов, защитных реакций организма, а также к коррекции патологических нарушений при широком спектре хронических заболеваний с нейроиммунными механизмами в патогенезе путем взаимодействия со специфическими рецепторами на поверхности клеток иммунной системы, нейронов и клеток микроглии, защищая клетки нервной ткани от окислительного стресса и купируя воспалительные процессы на периферии и в центральной нервной системе (Tarique Hussain, Bie Tan, Yulong Yin, Francois Blachier, Myrlene С.B. Tossou, and Najma Rahu. Oxidative Stress and Inflammation: What Polyphenols Can Do for Us? // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. - 2016. - ID 7432797. - 9 c; Маркова E.B., Гольдина И.А., Савкин И.В. Биофлавоноиды при нейроиммунной патологии: механизмы действия и терапевтические эффекты / Красноярск: Научно-инновационный центр. - 2019. - 158 с). В частности, флавоноид куркумин, согласно данным литературы, взаимодействует с целым рядом молекул - мишеней: факторами транскрипции, цитокинами, ферментами, молекулами адгезии, клеточными рецепторами, ростовыми факторами и киназами, вызывая изменение функционального состояния клеток, что обусловливает широкий спектр его биологических свойств. Так, куркумин модулирует воспалительный ответ через подавление активности ряда ферментов - циклооксигеназы 2, липоксигеназы и индуцибельной синтазы оксида азота, а также ингибирование факторов транскрипции, например, NF-κВ, выполняющего важную роль в регуляции иммунного и воспалительного ответа, что сопровождается снижением синтеза ряда провоспалительных цитокинов (ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИФН-γ, ИЛ-12), рецепторов ИЛ-2, -6, -8, -12, простагландина Е2. (Zhou Н., Beevers C.S., Huang S. Singh U. The targets of curcumin //Curr Drug Targets. - 2011. - T. 12. - №3. - C. 332-347; Meiyanto E., Putri D.D., Susidarti R.A., Murwanti R., Sardjiman, Fitriasari A., Husnaa U., Purnomo H., Kawaichi M. Curcumin and its analogues (PGV-0 and PGV-1) enhance sensitivity of resistant MCF-7 cells to doxorubicin through inhibition of HER2 and NF-kB activation// Asian Рас J Cancer Prev. - 2014. - T. 15. - №1. - C. 179-184; Cianciulli A., Calvello R., Porro C, Trotta Т., Salvatore R., Panaro M.A. PI3k/Akt signal-ling pathway plays a crucial role in the anti-inflammatory effects of curcumin in LPS-activated microglia // Int. Immunopharmacol. - 2016. - T. 36. - C. 282-290).

Другой флавоноид, эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG) - один из самых активных флавоноидов зеленого чая, обладает способностью нормализовать многие клеточные процессы благодаря нейтрализации повреждающего действия высоких концентраций цитокинов, возникающих в процессе воспаления. EGCG в присутствии IL-1β ингибирует MAPKs, деградацию IRAK-1 и, следовательно, снижает активность нижестоящих эффекторов NF-kB, р38 и JNK, которые играют ключевую роль в транскрипции генов воспалительного ответа в клетках (Danesi, F., Philpott, М., Huebner, С, Bordoni, А., Ferguson, L.R. Food-derived bioactives as polyphenol epigallocatechin-3-gallate inhibits advanced glycation end product induced potential regulators of the IL-12/IL-23 pathway implicated in inflammatory bowel diseases. // Mutat Res. - 2010. - T. 690. - C. 139-144; Akhtar N., Haqqi T.M. Epigallocatechin-3-gallate suppresses the global interleukin-1beta-induced inflammatory response in human chondrocytes. // Arthritis Res Ther. - 2011. - T. 13. - C. R93).

Указанные флавоноиды обладают также нейропротекторной активностью, показаны их эффекты в отношении улучшения когнитивных функций, улучшения внимания, памяти, способности к обучению, а также транквилизация, анксиолитическое действие, защита от окислительного стресса (Alagawany М., Ashour Е.А., Reda F.M. Effect of dietary supplementation of garlic (Allium Sativum) and turmeric (Curcuma Longa) on growth performance, carcass traits, blood profile and oxidative status in growing rabbits //Ann. Anim. Sci. - 2016. - T. 16. - C. 489-505; Маркова E.B., Гольдина И.А., Савкин И.В. Биофлавоноиды при нейроиммунной патологии: механизмы действия и терапевтические эффекты / Красноярск: Научно-инновационный центр, 2019. - 158 с.). Противовоспалительные, антиоксидантные и нейропротекторные свойства указанных флавоноидов, равно как и их способность влиять на эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов, могут обеспечить позитивный терапевтический эффект при алкоголизме, путем воздействия на патогенетические механизмы данной патологии. Немаловажным доводом в пользу флавоноидов является их способность проникать через гематоэнцефалический барьер, оказывая в том числе, и прямое модулирующее влияние на клетки нервной ткани. В этой связи исследование эффектов оригинальных композиций, на основе указанных флавоноидов при алкоголизме является актуальным и теоретически обоснованным.

Нами было показано позитивное влияние флавоноида куркумина у животных в состоянии экспериментального алкоголизма, проявляющееся в стимуляции ориентировочно-исследовательского поведения и клеточного иммунного ответа (Гольдина И.А., Маркова Е.В., Гольдин Б.Г., Княжева М.А. М.А., Гайдуль К.В. Протекторные свойства экстракта куркумы при этанолиндуцированных нарушениях поведения //Саратовский научно-медицинский журнал. - 2017. - Т. 13. - №1. - С. 131-135; E.V. Markova, I.A. Goldina, В.G. Goldin, М.А. Knyazheva, I.V. Savkin. Turmeric extract in correction of nervous and immune systems functional activity parameters in experimental alcoholism// Медицинский академический журнал. - 2019. - Т. 19. - №S. - С. 215-217; Гольдина И.А., Маркова Е.В., Савкин И.В. Эффективность биофлавоноидов при экспериментальном алкоголизме// Российский иммунологический журнал. - 2019. - Т. 13(22). - №2. - С. 212-214).

Применение композиции фитонутриентов класса флавоноидов, включающей куркумин при хроническом алкоголизме является теоретически обоснованным и подкреплено полученными ранее результатами экспериментальных исследований.

Известна нутрицевтическая композиция, представляющая собой гомогенизированную смесь сухих порошков экстракта куркумы, экстракта черного перца, экстракта сои, экстракта листьев зеленого чая, экстракта красного корня, экстракта солодки, экстракта листьев облепихи, арабиногалактана и цинка. В одном из вариантов композиции процентное содержание по массе сухого порошка каждого ингредиента составляет от общей массы композиции: экстракт корня куркумы - 1-50%, экстракт черного перца - 0,2-1%, экстракт сои - 1-50%, экстракт листьев зеленого чая - 1-50%, экстракт красного корня - 1-50%, экстракт солодки - 1-50%, экстракт листьев облепихи - 10-60%, арабиногалактан - 1-50%, цинк - 0,1-0,5% (RU 2654868, A23L 33/105, 10.03.2017).

В состав композиции входят:

а) куркумин, обладающий, как указано выше, антиоксидантными, противовоспалительными, нейропротекторными, эпигеноммодулирующими свойствами,

б) зеленый чай, обладающий, как указано выше, антиоксидантными, противовоспалительными, нейропротекторными свойствами;

в) облепиха, обладающая антиоксидантным и, цитопротекторными свойствами (Upadhyay N.K., Kumar M.S., Gupta A. Antioxidant, cytoprotective and antibacterial effects of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) leaves // Food Chem. Toxicol. - 2010. - T. 48. - №12. - С 3443-3448);

г) черный перец (пиперин), обладающий антиоксидантными, антитоксическими антиканцерогенными свойствами, увеличивающий биодоступность куркумина, ингибируя глюкуронирование куркумина и увеличивая транспортирование его в плазму (Berginc K, Trontelj J., Basnet N.S., Kristl A. Physiological barriers to the oral delivery of curcumin// Pharmazie.. -2012. - T. 67. - №6. - C. 518-24; Manayi A., Nabavi S.M., Setzer W.N., Jafari S. Piperine as a Potential Anti-cancer Agent: A Review on Preclinical Studies //Curr Med Chem. - 2018. - T. 25. - №37. - C. 4918-4928);

д) красный корень (Копеечник), обладающий антиоксидантными, вазопротекторными (укрепляет стенки сосудов), антитоксическими и иммуномодулирующими свойствами (; Shao-Yin Wei, Pei-Xun Zhang, Na Han Yu Dang, Hong-Bo Zhang, Dian-Ying Zhang, Zhong-Guo Fu, Bao-Guo Jiang. Effects of Hedysari Polysaccharides on Regeneration and Function Recovery Following Peripheral Nerve Injury in Rats //The American Journal of Chinese Medicine. - 2009. - 37. - №01. - C. 57-67; Liang-Gong Zhao L.G, Tong-Qiang Chen T-Q, De-Mei Feng D-M., Ti-Gan XiaoT.G., Zi-Long DangZ-L., Shi-Lan Feng S.L., Ya-Yi Xia Y.Y. Structural characterization and antioxidant activity of a heteropolysaccharide isolated from Hedysarum polybotrys //J. of Asian Natural Products Research. - 2014. - T.16. - №6. - C. 677-684; Yang X, Xue Z, Fang Y, Liu X, Yang Y, Shi G, Feng S, Zhao. Structure-immunomodulatory activity relationships of Hedysarum polysaccharides extracted by a method involving a complex enzyme combined with ultrasonication III. Food Fund. - 2019. -Т.Ю.-№2.-0.1146-1158);

е) соя, обладающая антиоксидантными и противовоспалительными свойствами (Kim М.А., Kim M.J. Isoflavone profiles and antioxidant properties in different parts of soybean sprout //J.FoodSci.- 2020. - T.85. - №3. - C. 689-695; Hiramatsu E.Y., de Avila ARA, de Macedo G.A., Martins I.M, Macedo J.A. Biotransformation processes in soymilk isoflavones to enhance anti-inflammatory potential in intestinal cellular model // J. Food Biochem - 2020. - T.44. - №3. - C. e13149);

ж) солодка, обладающая антиоксидантными, противовоспалительными, противоаллергическими свойствами; глицерризиновая кислота в ее составе значительно увеличивает биодоступность куркумина, катехинов и полифенолов при совместном применении, приводя к усилению их противовирусных, противовоспалительных, антиоксидантных, антитоксических и гепатопротекторных свойств (Selyutina O.Y., Polyakov N.E. Glycyrrhizic acid as a multifunctional drug carrier -From physicochemical properties to biomedical applications: A modern insight on the ancient drug //Int. J.Pharm. - 2019. - T. 559. - C. 271-279; Kim S.H., Hong J.H., Yang W.K., Geum J.H., Kim H.R., Choi S.Y., Kang Y.M,. An H.J., Lee Y.C. Herbal Combinational Medication of Glycyrrhiza glabra, Agastache rugosa Containing Glycyrrhizic Acid, Tilianin Inhibits Neutrophilic Lung Inflammation by Affecting CXCL2, lnterleukin-17/STAT3 Signal Pathways in a Murine Model of COPD //Nutrients. - 2020. - T. 12. - №4. - C. E926; Jin N., Lin J., Yang C, Wu C, He J., Chen Z., Yang Q., Chen J., Zheng G., Lv L., Liang H., Chen J., Ruan Z. Enhanced penetration and anti-psoriatic efficacy of curcumin by improved smart Pearls technology with the addition of glycyrrhizic acid // Int. J. Pharm. - 2020. - T. 578. - C. 119101);

з) арабиногалактан, обладающий иммуномодулирующимип, антитоксическими, гепатопротекторными и мембранотропными свойствами, повышая всасываемость лекарственных средств с низкой биодоступностью (Dion С, Chappuis Е, Ripoll С.Does larch arabinogalactan enhance immune function. A review of mechanistic and clinical trials // Nutr Metab (Lond). - 2016. - T. 13. - C. 28);

и) цинк - минерал, обладающий антиоксидантными, противовоспалительными и иммуномодулирующими свойствами (Jarosz М., Olbert М,. Wyszogrodzka G., Mtyniec K., Librowski Т. Antioxidant and anti-inflammatory effects of zinc. Zinc-dependent NF-κВ signaling // Inflammopharmacology - 2017. - T. 25. - №1. - C. 11-24).

С целью расширения арсенала средств, обладающих нейроиммуномодулирующими свойствами, предлагается применять описанную нутрицевтическую композицию в качестве нейроиммуномодулятора, в том числе для снижения алкогольной мотивации (при хроническом алкоголизме).

Сущность изобретения заключается в том, что при оценке эффектов нутрицевтической композиции у длительно алкоголизированных млекопитающих на паттерны поведения (компульсивное влечение к алкоголю, ориентировочно-исследовательское поведение), уровень ряда патогенетически значимых регуляторных цитокинов в центральной нервной системе, иммунный ответ и пролиферативную активность клеток иммунной системы показан позитивный нейроиммуномодулирующий эффект.

Предложенное изобретение, на наш взгляд, является новым.

Для моделирования патологии в виде хронического алкоголизма у млекопитающих мыши-гибриды (СБА х C57BI/6)F1, самцы, были подвергнуты длительной алкоголизации методом принудительного спаивания 10% раствора этанола в течении 6 месяцев (алкоголизированные млекопитающие). В популяции самцов мышей (CBA*C57BI/6)F1 показано наличие особей с активным и пассивным типами поведения, представители которых характеризуются определенными структурно-функциональными характеристиками нервной и иммунной систем и различной психофизиологической реакцией на прием психоактивных веществ, в том числе и алкоголя (Маркова Е.В. Иммунная система и высшая нервная деятельность. Механизмы нейроиммунных взаимодействий в реализации и регуляции поведенческих реакций. Saarbruken. - 2012; Маркова Е.В., Княжева М.А., Рюмина Т.В., Козлов В.А. Особенности функционирования клеток иммунной системы у особей с агрессивно- и депрессивноподобным типами поведения //В мире научных открытий. - 2014. - №8 (56). - С. 131-147; Чухрова М.Г., Дресвянников В.Л., Маркова Е.В. Наркотическая зависимость: современные стратегии исследования /Saint-Louis, Missouri, USA: Publishing House Science and Innovation Center. - 2015; Гольдина И.А., Маркова E.B., Гольдин Б.Г., Княжева М.А., Гайдуль К.В. Протекторные свойства экстракта куркумы при этанол-индуцированных нарушениях поведения //Саратовский научно-медицинский журнал. 2017. - Т. 13. - №. -1. - С. 131-135; Маркова Е.В., Савкин И.В., Княжева М.А., Шушпанова Т.В., Новожеева Т.П. Психонейроиммуномодулирующее влияние оригинального антиконвульсанта при экспериментальном алкоголизме //Российский иммунологический журнал. - 2019. - Т. 13 (22). - №3. - С. 1217-1223; Markova Е., Savkin I., Anikeeva О., Shushpanova Т. Immunomodulatory effect of original anticonvulsant meta-chloro-benzhydryl-urea in mice with experimental alcoholism //European Psychiatry. - 2019. - T. 56. - №S1. - C. S662-S663). С целью формирования однородных экспериментальных групп животных мыши-самцы (СВА х C57BI/6)F1 были предварительно протестированы в «открытом поле» и в исследование были включены только особи со средним уровнем поведения, которые в дальнейшем были подвергнуты длительной принудительной алкоголизации (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 6 месяцев). Длительно алкоголизированные мыши были разделены на 2 группы: мыши первой группы продолжали потреблять 10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца и составили контрольную группу алкоголизированных млекопитающих; мыши второй группы в аналогичных условиях потребляли в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца нутрицевтическую композицию, растворенную в 10% растворе этанола (экспериментальная группа).

Оценка эффективности способа осуществлялась путем сравнения у контрольной и экспериментальной групп млекопитающих паттернов поведения (алкогольная мотивация, ориентировочно-исследовательское поведение), продукции цитокинов клетками ЦНС, интенсивности гуморального и клеточного иммунного ответа, пролиферативной активности иммунокомпетентных клеток.

Пример 1. Определение влияния нутрицевтической композиции на алкогольную мотивацию у алкоголизированных млекопитающих.

Для моделирования патологии в виде хронического алкоголизма проводилась длительная алкоголизация млекопитающих. Алкоголизация млекопитающих (в данном 1 случае мыши-гибриды (СВА х C57BI/6)F1) достигалась путем длительного I принудительного спаивания (10% раствор этанола в качестве единственного источника I жидкости в течение 6 месяцев). Алкоголизированные млекопитающие потребляли в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца нутрицевтическую композицию, растворенную в 10% растворе этанола. Алкогольная мотивация алкоголизированных млекопитающих после приема на фоне этанола нутрицевтической композиции, а также алкогольная мотивация алкоголизированных млекопитающих, продолжавших потреблять в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца 10% раствор этанола, оценивалась по потреблению 10% раствор этанола в условиях свободного выбора с водой (двух-бутылочный тест) индивидуально, каждым млекопитающим в течение 10 дней.

На прилагаемом рисунке показано накопительное потребление этанола алкоголизированными млекопитающими после приема в течение 1 месяца нутрицевтической композиции. Представлено среднесуточное потребление этанола (мл/мышь) в течение 10 дней в условиях свободного выбора 10% раствора этанола с водой (двух-бутылочный тест) двумя группами млекопитающих: алкоголизированными млекопитающими (контрольная группа) и алкоголизированными млекопитающими, получавшими нутрицевтическую композицию (экспериментальная группа). n=20 в каждой группе; р<0,05 между количеством потребляемого 10% раствора этанола в контрольной и экспериментальной группах.

Как видно из прилагаемого рисунка, после приема нутрицевтической композиции у алкоголизированных млекопитающих существенно снижается потребление этанола и, следовательно, снижается алкогольная мотивация.

Пример 2. Определение влияния нутрицевтической композиции на параметры ориентировочно - исследовательского поведения у алкоголизированных млекопитающих.

Для моделирования патологии в виде хронического алкоголизма проводилась длительная алкоголизация млекопитающих. Алкоголизация млекопитающих (в данном случае мыши-гибриды (СВА х C57BI/6)F1) достигалась путем длительного принудительного спаивания (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 6 месяцев). Алкоголизированные млекопитающие, которые потребляли в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца нутрицевтическую композицию, растворенную в 10% растворе этанола, составили экспериментальную группу. Алкоголизированные млекопитающие, продолжавшие потреблять в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца 10% раствор этанола, составили контрольную группу.

Поведение экспериментальной и контрольной групп млекопитающих, в тесте «открытое поле» свидетельствуют о стимуляции ориентировочно-исследовательского поведения, выражающейся в повышении показателей моторного (горизонтальная двигательная активность) и исследовательского (вертикальная двигательная активность) компонентов поведения (табл. 1).

Продемонстрированная в настоящем примере стимуляция поведенческой активности у алкоголизированных млекопитающих после приема нутрицевтической композиции свидетельствует о коррекции депрессивно-подобного поведения, характерного, как известно, для хронического алкоголизма (Татиева Р.Ж. Депрессивные расстройства при алкоголизме //Вестник КазНМУ. - 2014. - №2(2). - С.73 - 74; Balanza-Martinez V, Crespo-Facorro В, Gonzalez-Pinto A, et al. Bipolar disorder comorbid with alcohol use disorder: focus on neurocognitive correlates //Front Physiol. - 2015. - T. 6. - C. 108).

Пример 3. Определение влияния нутрицевтической композиции на уровень ряда патогенетически значимых цитокинов в головном мозге у алкоголизированных млекопитающих.

Для моделирования патологии в виде хронического алкоголизма проводилась длительная алкоголизация млекопитающих. Алкоголизация млекопитающих (в данном случае мыши-гибриды (СВА х C57BI/6)F1) достигалась путем длительного принудительного спаивания (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 6 месяцев). Алкоголизированные млекопитающие, которые потребляли в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца нутрицевтическую композицию, растворенную в 10% растворе этанола, составили экспериментальную группу. Алкоголизированные млекопитающие, продолжавшие потреблять в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца 10% раствор этанола, составили контрольную группу.

У экспериментальной и контрольной групп млекопитающих, регистрировали количественное содержание цитокинов в образцах структур головного мозга, патогенетически значимых для реализации поведенческих реакций, характерных для хронического алкоголизма, в том числе алкогольной мотивации и депрессивно-подобного поведения.

Лизаты отдельных структур головного мозга млекопитающих получали путем гомогенизирования тканей в среде RPMI-1640 с добавлением 0,1% Triton X - 100 (GERBU Biotechnik GmbH), с последующим центрифугированием в течение 3 минут при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали для исследования. Содержание цитокинов в исследуемых образцах оценивали методом ИФА (ELISA) с использованием соответствующих тест - систем ("R&D Systems", Великобритания) в соответсвии с инструкцией фирмы-производителя.

В данном примере у алкоголизированных млекопитающих после приема нутрицевтической композиции демонстрируется модуляция ряда цитокинов в структурах головного мозга, патогенетически значимых для реализации поведенческих реакций, характерных для хронического алкоголизма:

- в префронтальной коре: снижение ИЛ-1β, ИНФγ, ФНОα;

- в гипоталамусе: повышение ИЛ-10;

- в гиппокампе: снижение ИЛ-6, ИНФγ и повышение ИЛ-10;

- в стриатуме: снижение ИЛ-1β.

Указанная выше модуляция продукции ряда регуляторных цитокинов в сторону снижения провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИНФγ, ФНОα) и повышения противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в патогенетически значимых для хронического алкоголизма структурах головного мозга у алкоголизированных млекопитающих после приема нутрицевтической композиции представлена в таблице 2.

Повышенная продукция провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНОα, ИНФγ) клетками головного мозга у алкоголизированных млекопитающих ассоциирована с проявлением депрессивно - подобного поведения (Miller А.Н., Maletic V., Raison C.L. Inflammation and Its Discontents: The Role of Cytokines in the Pathophysiology of Major Depression //J. Biological Psychiatry - 2009 - №9(65). - C. 732-741). Снижение содержания указанных цитокинов в патогенетически значимых структурах головного мозга (гипоталамусе, стриатуме, префронтальной коре), равно как и повышение противовоспалительного цитокина ИЛ-10 у алкоголизированных млекопитающих после приема нутрицевтической композиции, может быть существенным звеном в механизмах модулирования представленных в вышеприведенных примерах поведенческих паттернов, характерных для хронического алкоголизма.

Пример 4. Определение влияния нутрицевтической композиции на интенсивность гуморального иммунного ответа у алкоголизированных млекопитающих. Для моделирования патологии в виде хронического алкоголизма проводилась длительная алкоголизация млекопитающих. Алкоголизация млекопитающих (в данном случае мыши-гибриды (СВА х C57BI/6)F1) достигалась путем длительного принудительного спаивания (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 6 месяцев). Алкоголизированные млекопитающие, которые потребляли в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца нутрицевтическую композицию, растворенную в 10% растворе этанола, составили экспериментальную группу. Алкоголизированные млекопитающие, продолжавшие потреблять в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца 10% раствор этанола, составили контрольную группу.

У экспериментальной и контрольной групп млекопитающих оценивалась интенсивность гуморального иммунного ответа по количеству антителообразующих клеток (АОК) селезенки. Определение количества АОК проводилось модифицированным методом A.J. Cunningham (Cunningham A.J. A method of increased sensitivity for detecting single antibody-forming cells //Nature. - 1965. - №207. - C. 1106-1107) на 5-е сутки после внутрибрюшинной иммунизации Т-зависимым антигеном (эритроцитами барана) по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде. Для этого селезенку измельчали ножницами в бюксе со средой 199, взвесь кусочков ткани несколько раз пропускали с помощью шприца через стальную иглу. Полученную суспензию клеток фильтровали. Конечный объем суспензии доводили до 5 мл. Работы проводили при температуре +4°С. Равные объемы клеточной суспензии, 10% суспензии эритроцитов барана и раствора комплемента смешивали в бюксе и заливали в стеклянные камеры. Камеры были изготовлены следующим образом: между двумя предметными стеклами прокладывали полоску бумаги, а верхние и нижние края склеивали между собой горячим парафином. Когда парафин остывал, полоску бумаги вынимали и в щель между стеклами шприцем заливали смесь из 0,5 мл клеточной суспензии, 0,5 мл эритроцитов барана (10% суспензии) и 0,5 мл комплемента. Комплемент готовили непосредственно перед заливкой камеры. Учитывали объем суспензии, залитой в камеры. Заполненные камеры инкубировали в течение 45 минут в термостате при температуре 37°С. После инкубации подсчитывали количество локальных зон гемолиза в камере под бинокулярной лупой (увеличение в 20 раз). Зона гемолиза (бляшка) представляет собой округлый участок, почти полностью свободный от эритроцитов. Учитывая число бляшек в камере, количество ядросодержащих клеток в 1 мл клеточной суспензии, объем заполненной камеры и клеточность селезенки. Подсчет ядросодержащих клеток селезенки производили в камере Горяева. Оценивали относительное (на 10⁶ ядросодержащих клеток селезенки) количество АОК. В качестве группы сравнения использовали также здоровых млекопитающих аналогичного возраста.

Результаты, демонстрирующие повышение уровня гуморального иммунного ответа, оцененного по относительному количеству АОК, после курсового (1 месяц) приема нутрицевтической композиции у млекопитающих в состоянии экспериментального хронического алкоголизма, представлены в таблице 3.

Пример 5. Определение влияния нутрицевтической композиции на интенсивность клеточного иммунного ответа у алкоголизированных млекопитающих. Для моделирования патологии в виде хронического алкоголизма проводилась длительная алкоголизация млекопитающих. Алкоголизация млекопитающих (в данном случае мыши-гибриды (СВА х C57BI/6)F1) достигалась путем длительного принудительного спаивания (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 6 месяцев). Алкоголизированные млекопитающие, которые потребляли в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца нутрицевтическую композицию, растворенную в 10% растворе этанола, составили экспериментальную группу. Алкоголизированные млекопитающие, продолжавшие потреблять в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца 10% раствор этанола, составили контрольную группу.

У экспериментальной и контрольной групп млекопитающих оценивалась интенсивность клеточного иммунного ответа по уровню развиваемой реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в ответ на введение Т-зависимого антигена (эритроцитов барана). Для этого мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (0,5% - 0,5 мл.). Разрешающую дозу указанного антигена (50% - 0,05 мл.) вводили под апоневроз задней стопы через 96 часов. Формирование реакции ГЗТ оценивали через 24 часа после разрешающей инъекции по степени опухания лапы (изменения ее толщины по сравнению с позитивно-контрольной задней лапой того же животного, в которую была введена среда RPMI-1640). Индекс реакции (ИР) определяли для каждой мыши по формуле ИР=(Ро - Рк) / Рк и выражали в процентах (Yoshikai Y., Miake S., Matsumoto Т., et al. Effect of stimulation and blockade of mononuclear phagocyte system on the delayed footpad reaction to SRBC in mice // lmmunol. - 1979. - T. 38. - №3. - C. 577-583).

В качестве группы сравнения использовали также здоровых млекопитающих аналогичного возраста.

Результаты, демонстрирующие повышение клеточного иммунного ответа, оцененного по уровню реакции ГЗТ, после курсового (1 месяц) приема нутрицевтической композиции у млекопитающих в состоянии экспериментального хронического алкоголизма, представлены в таблице 4.

Пример 6. Определение влияния нутрицевтической композиции на пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток у алкоголизированных млекопитающих.

Для моделирования патологии в виде хронического алкоголизма проводилась длительная алкоголизация млекопитающих. Алкоголизация млекопитающих (в данном случае мыши-гибриды (СВА х C57BI/6)F1) достигалась путем длительного принудительного спаивания (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 6 месяцев). Алкоголизированные млекопитающие, которые потребляли в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца нутрицевтическую композицию, растворенную в 10% растворе этанола, составили экспериментальную группу. Алкоголизированные млекопитающие, продолжавшие потреблять в качестве единственного источника жидкости в течение 1 месяца 10% раствор этанола, составили контрольную группу.

Исследование влияния нутрицевтической композиции на пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток проводили in vitro путем тестирования спонтанной и митоген-индуцированной пролиферативной активности лимфоидных клеток селезенки, взятых от мышей экспериментальной и контрольной групп. Животных забивали путем цервикальной дислокации; в стерильных условиях вскрывали брюшную, полость, извлекали селезенки, очищали их от соединительной ткани и помещали во флаконы с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640 (5 мл на селезенку). Выделенные селезенки измельчали на мельчайшие кусочки при помощи ножниц. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали с помощью шприца, для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 мин при 150 g. После удаления надосадочной жидкости, находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI - 1640. Жизнеспособность клеток определяли при помощи окраски трипановым синим.

Пролиферативный ответ лимфоцитов селезенки оценивали общепринятым методом реакции бластной трансформации лимфоцитов. Суспензию клеток в полной культуральной среде, содержащей RPMI-1640, 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES-буфера (Sigma), 5х10-5М 2-меркаптоэтанола (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина вносили в объеме 50 мкл в 96-луночные круглодонные планшеты (Linbro) в концентрации 10⁵ спленоцитов на лунку. К суспензии добавляли: субоптимальные концентрации ЛПС E.coli 055:В5 (Sigma) и конкавалина A (Pharmacia), которые составляли соответственно 20 мкг/мл и 3 мкг/мл и/или культуральную среду до полного объема 150 мкл на лунку. Клетки культивировались в течение 72 часов при 37°С и 5% содержании СO2 в атмосфере. За 16 часов до окончания инкубационного периода вводили Н3-тимидин (1 мкКю на лунку). По окончании инкубационного периода клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры (Flow Lab) с помощью аппарата «Harvester» (TITERTEK). Фильтры помещали во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывали в сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола и 0,1 г дифенил-оксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике «Delta» (США). Пролиферативный ответ лимфоцитов оценивали по включению в нуклеопротеидные фракции клеток радиоактивной метки. Оценка данных проводилась как в абсолютных значениях (имп/мин), так и относительных индексах пролиферации (стимуляции): (Имп(Образец)/Имп(спонтанная пролиферация)). Результаты представлены в таблице 5.

Результаты, представленные в таблице 5, демонстрируют модулирующий эффект нутрицевтической композиции на пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток селезенки алкоголизированных млекопитающих, наиболее выраженный в повышении чувствительности лимфоцитов к стимулирующему действию Т-клеточного митогена (КонА). Повышение митоген-индуцированной пролиферативной активности лимфоцитов селезенки может быть одним из механизмов, представленных в вышеприведенных примерах стимулирующих эффектов нутрицевтической композиции на гуморальный и клеточный иммунный ответ.

Таким образом, в результате приема нутрицевтической композиции на фоне длительного употребления алкоголя достигается положительный эффект, направленный на коррекцию вызванных хроническим токсическим влиянием этанола изменений функциональной активности нервной системы (снижение алкогольной мотивации, стимуляция ориентировочно-исследовательского поведения, модуляция уровня цитокинов в ЦНС, свидетельствующая о снижении нейровоспаления), а также функциональной активности иммунной системы (стимуляция гуморального и клеточного иммунного ответа, пролиферативной активности лимфоцитов), что служит экспериментальным обоснованием перспективности применения композиции в качестве адьювантного средства при лечении хронического алкоголизма. Оценивая в целом результаты, можно утверждать, что при хроническом алкоголизме нутрицевтическая композиция оказывает позитивный нейроиммуномодулирующий эффект.

Применение нутрицевтической композиции, представляющей собой гомогенизированную смесь сухих порошков, в которой процентное содержание по массе сухого порошка каждого ингредиента от общей массы композиции составляет, %: экстракт корня куркумы 1-50, экстракт черного перца 0,2-1, экстракт сои 1-50, экстракт листьев зеленого чая 1-50, экстракт красного корня 1-50, экстракт солодки 1-50, экстракт листьев облепихи 10-60, арабиногалактан 1-50 и цинк 0,1-0,5 в качестве нейроиммуномодулятора.