Антитела против cxcr4

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к моноспецифическому антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое связывается с CXCR4, а также к содержащей его фармацевтической композиции и диагностическому набору. Также раскрыт полинуклеотид, кодирующий вышеуказанное антитело или его фрагмент. Изобретение также относится к способу обнаружения CXCR4-экспрессирующих злокачественных клеток у индивида-млекопитающего с использованием вышеуказанного антитела или его фрагмента. Изобретение также может быть эффективно в лечении злокачественного новообразования, экспрессирующего CXCR4. 7 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 9 табл., 12 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к моноспецифическим антителам против CXCR4 и связывающим фрагментам, к применению таких антител против CXCR4 и связывающих фрагментов в лечении заболеваний, патогенез которых связан с активацией CXCR4, а также к фармацевтическим композициям и наборам, содержащим такие антитела против CXCR4 и связывающие фрагменты.

Уровень техники

Связанные с G-белками рецепторы (GPCR), также известные как рецепторы с семью трансмембранными доменами, образуют суперсемейство белков, которые в общем играют важную роль во многих биологических и патологических процессах. Хемокиновые рецепторы представляют подсемейство GPCR, которые названы по способности их лигандов (т.е. хемокинов) индуцировать направленный хемотаксис в соседних чувствительных клетках. Среди этих хемокиновых рецепторов CXCR4 (также известный в данной области как, например, LESTR, Fusin или CD 184) играет важную роль в иммунных и воспалительных ответах за счет опосредования направленной миграции и активации лейкоцитов. Также было показано, что CXCR4 экспрессируется или сверхэкспрессируется во многих злокачественных клеточных линиях и тканях. Важным лигандом CXCR4 является полученный из стромальных клеток фактор-1 (SDF-1, также известный как CXCL12). Взаимодействие CXCR4 и SDF-1, по-видимому, играет важную роль во многих фазах онкогенеза, включая рост опухоли, инвазию, ангиогенез и метастазирование. Еще одним известным лигандом CXCR4 является убиквитин.

Было идентифицировано и/или разработано несколько антагонистов CXCR4 с точки зрения лечения заболеваний, связанных с активацией CXCR4. Например, плериксафор или AMD3100, бицикламный антагонист CXCR4, одобрен FDA для применения в комбинации с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором для мобилизации гематопоэтических стволовых клеток в кровоток для сбора и последующей аутологичной трансплантации пациентам с множественной миеломой и неходжкинской лимфомой. LY2510924, пептид-антагонист CXCR4, в настоящее время проходит II фазу клинических испытаний при раке.

Примером известного антитела против CXCR4 является 12G5, мышиное антитело, обычно используемое в качестве реагента/положительного контроля в лабораторных экспериментах.

Хотя существует несколько средств, либо доступных, либо разрабатываемых, которые нацелены на CXCR4, все еще остается потребность в эффективных терапевтических средствах, нацеленных на CXCR4.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к моноспецифическому антителу или его связывающему фрагменту, содержащему вариабельную область легкой цепи, имеющую CDR1L, CDR2L и CDR3L, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую CDR1H, CDR2H и CDR3H, при этом указанная CDR1L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, указанная CDR2L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, указанная CDR3L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или 4, указанная CDR1H содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или 6, указанная CDR2H содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, 8, 9 или 10, а указанная CDR3H содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 12. Также охвачены варианты последовательностей SEQ ID NO: 1-12, которые содержат одну или более консервативных модификаций. Антитело или связывающий фрагмент специфически связывается с CXCR4 человека.

Кроме того, настоящее изобретение относится к моноспецифическому антителу или его связывающему фрагменту, содержащему вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 или 14. Также охвачены варианты последних последовательностей, которые содержат консервативные модификации. Моноспецифическое антитело или связывающий фрагмент дополнительно содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18 или 19. Также охвачены варианты последних последовательностей, которые содержат одну или более консервативных модификаций. Антитело или связывающий фрагмент специфически связывается с CXCR4 человека.

В конкретном варианте осуществления вышеупомянутое моноспецифическое антитело или связывающий фрагмент согласно изобретению представляет собой человеческое сконструированное антитело или связывающий фрагмент, соответственно.

В более конкретном варианте осуществления вышеупомянутое моноспецифическое антитело согласно изобретению относится к изотипу IgG.

Настоящее изобретение дополнительно охватывает терапевтические, а также диагностические варианты применения моноспецифических антител и связывающих фрагментов согласно изобретению.

В диагностическом анализе in vitro для обнаружения экспрессирующих CXCR4 злокачественных клеток у индивида-человека или другого млекопитающего содержащий злокачественные клетки образец биопсии или текучей среды, взятый у индивида, можно проанализировать в иммунохимическом или иммуногистохимическом анализе, в котором для обнаружения CXCR4 используют моноспецифические антитела или связывающие фрагменты согласно изобретению. В диагностическом анализе in vivo для обнаружения экспрессирующих CXCR4 злокачественных клеток и ткани у индивида-человека или другого млекопитающего можно использовать моноспецифические антитела или связывающие фрагменты согласно изобретению, которые имеют радиоактивную метку. В анализе индивиду вводят, обычно парентерально, радиомеченные антитела или связывающие фрагменты, а затем распределение антител или связывающих фрагментов оценивают с помощью иммуносцинтиграфии.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественного новообразования, экспрессирующего CXCR4, включая лимфому Беркитта и рак молочной железы, включающим введение больному-человеку или другому млекопитающему терапевтически эффективного количества моноспецифических антител или связывающих фрагментов согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению моноспецифических антител или связывающих фрагментов согласно изобретению для лечения злокачественного новообразования, экспрессирующего CXCR4, включая лимфому Беркитта и рак молочной железы.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам предотвращения метастазирования злокачественного новообразования молочной железы или другого злокачественного новообразования, экспрессирующего CXCR4, включающим введение терапевтически эффективного количества моноспецифических антител или связывающих фрагментов согласно изобретению больному-млекопитающему, человеку или не человеку. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению моноспецифических антител или связывающих фрагментов согласно изобретению для предотвращения метастазирования злокачественного новообразования молочной железы или другого злокачественного новообразования, экспрессирующего CXCR4.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество моноспецифических антител или связывающих фрагментов согласно изобретению и к фармацевтически приемлемому вспомогательному средству. Обычно такие фармацевтические композиции предназначены для парентерального введения индивиду и, следовательно, содержат терапевтически эффективное количество моноспецифических антител или связывающих фрагментов согласно изобретению, парентерально приемлемый разбавитель и, необязательно, фармацевтически приемлемое вспомогательное средство. Также охвачены диагностические наборы, содержащие моноспецифические антитела или связывающие фрагменты согласно изобретению.

Изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим моноспецифические антитела или связывающие фрагменты согласно изобретению. Таким образом, оно также относится к полинуклеотидам (или выделенным полинуклеотидам), кодирующим моноспецифические антитела или их связывающие фрагменты, содержащие вариабельную область легкой цепи, имеющую CDR1L, CDR2L и CDR3L, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую CDR1H, CDR2H и CDR3H, при этом указанная CDR1L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, указанная CDR2L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, указанная CDR3L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или 4, указанная CDR1H содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или 6, указанная CDR2H содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, 8, 9 или 10, а указанная CDR3H содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 12. Также охвачены варианты последовательностей SEQ ID NO: 1-12, которые содержат одну или более консервативных модификаций. Антитела или связывающие фрагменты, экспрессируемые из последних полинуклеотидов, специфически связываются с CXCR4 человека. Например, полинуклеотид может содержать кодирующий CDR1L полинуклеотид SEQ ID NO: 20, кодирующий CDR2L полинуклеотид SEQ ID NO: 21, кодирующий CDR3L полинуклеотид SEQ ID NO: 22 или 23, кодирующий CDR1H полинуклеотид SEQ ID NO: 24 или 25, кодирующий CDR2H полинуклеотид SEQ ID NO: 26, 27, 28 или 29 и кодирующий CDR3H полинуклеотид SEQ ID NO: 30 или 31.

Более конкретно, полинуклеотид (или выделенный полинуклеотид), кодирующий моноспецифическое антитело или его связывающий фрагмент, может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 или 14. Также охвачены варианты последних последовательностей, которые содержат консервативные модификации. Моноспецифические антитела или связывающие фрагменты дополнительно содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18 или 19. Также охвачены варианты последних последовательностей, которые содержат одну или более консервативных модификаций. Антитело или связывающий фрагмент, экспрессируемый из последнего полинуклеотида, специфически связывается с CXCR4 человека. Например, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид SEQ ID NO: 32 или 33, кодирующий вариабельную область легкой цепи, и полинуклеотид SEQ ID NO: 34, 35, 36, 37 или 38, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи.

Краткое описание фигур

На Фиг.1 представлены кривые зависимости связывания CXCR4 от дозы для антител согласно настоящему изобретению в формате IgG1, полученных как описано в примере 4. На Фиг. 1a-1e представлены кривые зависимости от дозы для V62.1, V62.1-R108H, V62.1-H-m80, V62.1-H-m43-m38 и V62.1-H-m47-m38, соответственно.

На Фиг. 2 представлена активность люциферазы in vivo в области молочной железы мышей, которую измеряют в антиметастатической модели примера 12.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам против CXCR4 и их применению, а также к фармацевтическим композициям, содержащим антитела против CXCR4.

Чтобы изобретение можно было легче понять, некоторые термины конкретно определены ниже. Если явно не определено где-либо еще в этом документе, все другие технические и научные термины, используемые в этом документе, имеют значение, которое обычно понимают рядовые специалисты в соответствующей области техники.

В рамках настоящего изобретения, в том числе в приложенной формуле изобретения, множественное число и единственное используются взаимозаменяемо.

Термин «CXCR4 человека» относится к белку, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 96%, 97%, 98% или 99% идентична полной аминокислотной последовательности CXCR4 человека, имеющей инвентарный номер P61073 базы генетических данных, или к белку, который имеет по существу такую же биологическую функцию, как CXCR4, но последовательность которого отличается от полной аминокислотной последовательности CXCR4 человека за счет замены, вставки или делеции одной или более аминокислот.

Общая структура «антитела» хорошо известна в данной области. Для антитела типа IgG существуют четыре аминокислотные цепи (две «тяжелые» цепи и две «легкие» цепи), которые поперечно сшиты посредством дисульфидных связей внутри цепи. Каждая из тяжелых и легких цепей имеет вариабельную N-терминальную область и константную область. Константные области иммуноглобулинового антитела называются Fc участок и у людей являются очень консервативными. Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь образуют вариабельный домен, который содержит антигенсвязывающий сайт антитела.

Каждую из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые определяющие комплементарность области (CDR), которые перемежаются с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасные области (FR). Каждая вариабельная область состоит из трех CDR и четырех FR, которые расположены от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В настоящем документе три CDR тяжелой цепи обозначены CDR1H, CDR2H и CDR3H, а три CDR легкой цепи обозначены CDR1L, CDR2L и CDR3L. CDR содержат большинство остатков, которые образуют специфические взаимодействия с антигеном. Далее вариабельные области тяжелой и легкой цепи могут называться, соответственно, HCVR и LCVR.

В рамках настоящего изобретения термин «консервативные модификации» данной аминокислотной последовательности антитела или связывающего фрагмента или их частей, относится к аминокислотным модификациям, которые не оказывают существенного влияния или не изменяют характеристики связывания антитела, связывающего фрагмента или их частей, содержащих аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают замены, добавления и делеции аминокислот. Модификации можно вводить в антитело согласно настоящему раскрытию с помощью стандартных методик, известных в данной области, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные замены аминокислот представляют собой замены, в которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь с родственной химической характеристикой. В данной области определили семейства аминокислотных остатков, имеющих боковые цепи с родственной химической характеристикой. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан). Таким образом, один или более аминокислотных остатков внутри CDR областей антитела согласно настоящему раскрытию можно заменить другими аминокислотными остатками из того же семейства боковых цепей, а измененное антитело можно протестировать на сохраненные антигенсвязывающие свойства, используя описанные в данном документе функциональные анализы.

Используемая в данном документе нумерация последовательностей следует Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda. Используемые в данном документе определения CDR следуют способу, описанному в MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol. 626:732-745.

Антитело по настоящему изобретению может быть интактным, содержащим полные или полноразмерные константные области, включая Fc область, или участком или фрагментом такого антитела («связывающего фрагмента»), который содержит антигенсвязывающий участок и сохраняет антигенсвязывающую способность. Такой участок или фрагмент может содержать, например, Fab фрагмент («антигенсвязывающий фрагмент»; т.е. область антитела, которая связывается с антигенами), которая состоит из пары фрагментов тяжелой и легкой цепи, каждый из которых содержит константную и вариабельную область, или Fab' или F(ab')2 фрагмент, который содержит CDR или вариабельные области раскрытых в данном документе антител против CXCR4. Кроме того, такой участок или фрагмент может представлять собой одноцепочечный Fv фрагмент, который можно получить из полинуклеотида, содержащего нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепи, в результате чего последние нуклеотидные последовательности разделены линкерной последовательностью (например, Pluckthun, Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp 269-315, 1994). Независимо от того, указаны ли фрагменты или участки, термин «связывающий фрагмент» в рамках настоящего изобретения, если не указано иное, включает в себя такие фрагменты или участки, а также одноцепочечные формы. При условии, что белок сохраняет способность специфически или предпочтительно связывать CXCR4 и содержит раскрытую в данном документе последовательность (последовательности) CDR, он включен в термины «антитело» и «связывающий фрагмент», соответственно. Понятно, что только полноразмерные антитела могут выполнять некоторые эффекторные функции, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC).

Антитела согласно настоящему изобретению могут иметь константную область тяжелой цепи, выбранную из любого из классов иммуноглобулина (IgA, IgD, IgG, IgM и IgE). Предпочтительно, антитела согласно настоящему изобретению относятся к типу IgG, более предпочтительно изотипу IgG1. Должно быть понятно, что, если не указано противоположное, термин «IgG1» в настоящем тексте относится к IgG1 человека.

Термин «сконструированное человеческое антитело» относится к антителу, имеющему каркасы, шарнирные области и константные области человеческого происхождения, которые идентичны или по существу идентичны (по существу человеческим) каркасам, шарнирным областям и константным областям, полученным из человеческих геномных последовательностей. Полностью человеческие каркасы, шарнирные области и константные области охватывают последовательности, экспрессируемые в зародышевой линии человека, а также последовательности, содержащие спонтанные соматические мутации. Сконструированное человеческое антитело может содержать каркасные, шарнирные или константные области, полученные из полностью человеческих каркасных, шарнирных или константных областей, содержащих одну или более замен, делеций или добавлений аминокислот в них, и/или гликозилированные модификации. «Человеческий сконструированный связывающий фрагмент» относится к участку или фрагменту человеческого сконструированного антитела. Часто сконструированное человеческое антитело является по существу неиммуногенным для людей. Множество различных человеческих каркасных последовательностей можно использовать отдельно или в комбинации в качестве основы для сконструированных человеческих антител согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, каркасные области антител согласно изобретению имеют человеческое или по существу человеческое происхождение (человеческое происхождение по меньшей мере на 95%, 97% или 99%). Последовательности каркасных областей человеческого происхождения можно получить из Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing by Shire et al. ISBN 978-0-387-76643-0. Предпочтительно в антителах согласно настоящему изобретению каркасная область тяжелой цепи соответствует консенсусной последовательности зародышевой линии III подгруппы. Предпочтительно также в антителах согласно настоящему изобретению каркасная область легкой цепи соответствует консенсусной последовательности зародышевой линии каппа III.

В рамках настоящего изобретения термины «моноспецифическое антитело» или «композиция моноспецифических антител» относятся к препарату молекул антител, имеющих идентичные белковые последовательности (причем включены ионные или окислительные микроварианты). Композиция моноспецифических антител отображает единую специфичность и аффинность связывания для конкретного эпитопа.

В рамках настоящего изобретения антитело, которое «специфически связывается с CXCR4 человека», относится к антителу, которое связывается с CXCR4 человека (и возможно с CXCR4 от одного или более нечеловеческих видов) с EC50 50 нМ или менее, которую измеряют в анализе на основе флуоресцентной проточной цитометрии, как описано в примере 4 в данном документе ниже, но по существу не связывается с другими GPCR, такими как, например, CXCR7.

В рамках настоящего изобретения при ссылке на антитело фраза «по существу не связывается» с не являющимися CXCR4 белками означает, что антитело не связывается совсем или демонстрирует только слабое связывание с не являющимися CXCR4 белками. Значение EC50 для такого слабого связывания может быть равно или больше, чем 100 нМ, что измеряют в анализе на основе флуоресцентной проточной цитометрии, как описано в примере 4.

В рамках настоящего изобретения ADCC относится к антителозависимой клеточной цитотоксичности, т.е. к опосредованной антителами гибели клеток, которая является эффекторной функцией антител, в основном стимулируемой Fc-областью. Известно, что антитела изотипов IgG, конкретно IgG1, обладают хорошими ADCC свойствами.

При ссылке в настоящем документе на SDF-1 или CXCL12, если иное не указано или не приведено в качестве примера, подразумевается обозначение любых и всех вариантов SDF-1 человека, включая например, SDF-1альфа или CXCL12a и SDF-1бета или CXCL12b.

При ссылке на свойства связывания, полумаксимальной Эффективной Концентрацией 50 (EC50) является концентрация, которая индуцирует ответ посередине между базовым и максимальным связыванием данного антитела. ЕЕ рассчитывают с помощью кривой зависимости от дозы, как объяснено в настоящем документе в примере 4.

«Индивидом» является млекопитающее, предпочтительно человек.

Термин «лечебный» (или «лечить» или «лечение») означает замедление, прекращение, уменьшение или обращение прогрессирования или тяжести симптома, расстройства, состояния или заболевания.

Термин «предотвращающий» (или «предотвратить» или «предотвращение») означает запрещение, ограничение, или подавление возникновения, распространения или рецидива симптома, расстройства, состояния или заболевания.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству или дозе антитела согласно настоящему изобретению, которая при введении пациенту одной или нескольких доз, обеспечивает требуемое лечение.

Конкретные антитела согласно настоящему изобретению происходят из библиотеки фаговых дисплеев и из процессов созревания аффинности, как описано в данном документе.

Библиотеки фаговых дисплеев представляют собой широко используемые технологии отбора фрагментов антител, которые обеспечивают начальную точку для генерирования и оптимизации сконструированных человеческих антител. См. например, Hoogenboom (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1105-1116; Bradbury & Marks (2004) J. Immunol. Methods 290: 29-49; and Fredericks et al. (2004) Protein Eng. Des. SeI. 17: 95-106. Другие типы технологий дисплея, подходящих для генерирования и созревания (оптимизации) аффинности, включая библиотеки дрожжевого, мРНК и рибосомного дисплея, становятся все более популярными для отбора и оптимизации антител (см. Hoogenboom, Bradbury & Marks, and Fredericks et al.).

Библиотеки дисплея могут отображать одноцепочечные фрагменты вариабельного домена антитела (scFv) или Fab-фрагменты и содержат кодирующую ДНК или РНК. Они имеют большое генетическое разнообразие или размер репертуара (обычно 10^9-10^13). Генетическое разнообразие в этих библиотеках обычно создают путем клонирования репертуара сегментов вариабельных генов тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина от наивных или иммунизированных индивидуумов. Альтернативно, этого разнообразия можно достигнуть путем рандомизации последовательностей CDR, включая использование химически синтезированных фрагментов CDR, или путем комбинирования двух этих подходов. Затем можно провести стадию связывания (для отбора из такой библиотеки) с мишенью (рецептором) в растворе, иммобилизованной на поверхности, на липосомах (таких как протеолипосомы, описанные в патенте США 6,761,902), на клетках и т.д. После обширного промывания связанные клоны извлекают и амплифицируют для дополнительного раунда отбора.

Затем можно выполнить процессы созревания аффинности на исходных лучших кандидатах на связывающее антитело, чтобы попытаться получить кандидаты-производные с улучшенными свойствами, такими как лучшая стабильность и/или улучшенное связывание и т.д. Специалистам в данной области доступно несколько стратегий созревания аффинности, таких как, но без ограничения, направленный комплексный мутагенез, перестановка CDR или легкой/тяжелой цепи, точечная вставка (вставки) или делеция (делеции) в CDR или любая комбинация этих подходов.

Конкретные антитела согласно настоящему изобретению включают антитела, раскрытые в настоящем документе в примерах 1 и 2. Должно быть понятно, что настоящее изобретение также охватывает все и каждый возможный обмен CDR между представленными в настоящем документе вариабельными областями. Предпочтительно, CDR тяжелой цепи можно заменить другой CDR вариабельной области тяжелой цепи, а также, CDR легкой цепи можно заменить другой CDR вариабельной области легкой цепи.

Синтез Антител

Антитела согласно изобретению можно получать, используя хорошо известные в данной области технологии, например, рекомбинантные технологии, технологии экспрессии белка in vitro или комбинации таких технологий или других хорошо известных в данной области технологий.

Например, Fab-фрагменты, полученные в результате скрининга библиотеки Fab-дисплея, непосредственно или после созревания аффинности можно преобразовать в IgG с помощью обычно используемых технологий, таких как клонирование в подходящие векторы экспрессии с кодированием требуемой константной области.

Для прямого продуцирования IgG антитела подходящую клетку-хозяин, такую как клетки HEK 293 или CHO, можно либо временно, либо постоянно трансдуцировать системой экспрессии, подходящей для продуцирования и секреции IgG антител. Система экспрессии будет представлять собой экспрессионные конструкты тяжелой цепи и легкой цепи, которые трансдуцированы в оптимизированном соотношении, или одновекторную систему, содержащую экспрессируемые гены легкой цепи, а также тяжелой цепи. Секретируемое антитело можно очистить, используя любую из множества обычно используемых технологий. Например, культуральную среду, содержащую антитела, можно удобно наносить на колонку с белком А или G сефарозой FF, которую уравновесили совместимым буфером, например, забуференным фосфатом солевым раствором (pH 7,4). Затем колонку промывают для удаления неспецифически связывающих компонентов. Связанные антитела элюируют, например, путем применения градиента pH. Содержащие антитела фракции обнаруживают, например, с помощью SDS-PAGE и объединяют. В зависимости от предполагаемого использования антитела можно дополнительно очищать. Антитела можно концентрировать и/или стерильно фильтровать, используя обычные технологии. Растворимые агрегаты и мультимеры можно эффективно удалять с помощью обычных технологий, включая гель-фильтрационную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия, ионообменную хроматографию или хроматографию на гидроксиапатите. Очищенные антитела обычно можно хранить охлажденном, замороженном или лиофилизированном виде.

Специалисту в данной области должно быть известно, что Fab-антитела можно аналогично получать, используя клетки, например, клетки бактерий, грибов (дрожжей) или насекомых.

Свойства антител согласно изобретению

Антитела согласно настоящему изобретению, в формате Fab и/или в формате IgG, характеризовали в отношении некоторых необходимых биологических свойств.

Связывание с CXCR4 является первым критерием эффективности антител согласно настоящему изобретению. Антитела согласно настоящему изобретению специфически связываются с CXCR4 с EC50 ниже 50 нМ, предпочтительно ниже 10 нМ, как выявлено в экспериментах с использованием клеток, экспрессирующий CXCR4 из трансфицированного, экспрессированного гена и/или опухолевых клеточных линий, экспрессирующих CXCR4.

Преобразование Fab-фрагментов в IgG антитела в общем улучшает связывание рецептора (EC50). Это также было подтверждено с помощью антител согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, когда в формате IgG1, антитела согласно настоящему изобретению специфически связывают CXCR4 с EC50 ниже 5 нМ.

Антитела согласно настоящему изобретению ингибируют связывание SDF-1 с рецептором CXCR4 и предотвращают активацию рецептора. Последствия связывания SDF-1 с его рецептором включают, например, индуцирование переноса кальция и миграцию клеток, которые являются важными параметрами для инвазии злокачественных клеток. Антитела согласно настоящему изобретению ингибируют индуцирование переноса кальция и/или миграцию экспрессирующих CXCR4 клеток.

Как было продемонстрировано для таких антител, как трастузумаб и ритуксимаб, ADCC может быть важным механизмом действия терапевтических антител против опухолей. Было показано, что антитела согласно настоящему изобретению способны к ADCC. Исследования на моделях ксенотрансплантата опухоли продемонстрировали противоопухолевую активность антител согласно изобретению.

Фармацевтические композиции и их введение

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитела согласно настоящему изобретению. Последние композиции предпочтительно следует вводить парентерально, но также предусмотрена трансназальная, транспульмональная или трансдермальная доставка. Фармацевтические композиции могут содержать любое обычное нетоксичное фармацевтически приемлемое вспомогательное средство, а в случае жидкой готовой формы, разбавитель. В некоторых случаях pH готовой формы можно регулировать с помощью фармацевтически приемлемых кислот, оснований или буферов для повышения стабильности составленного средства или его формы для доставки. Термин парентеральное в рамках настоящего изобретения включает в себя подкожную, внутрикожную, внутривенную, внутримышечную, внутрисуставную, внутриартериальную, интрасиновиальную, внутригрудинную, интратекальную, внутриочаговую и внутричерепную инъекцию или инфузию.

Антитела согласно изобретению можно хранить в виде лиофилизированной готовой формы или в виде раствора. Инъецируемые препараты, например, стерильные инъецируемые водные или масляные суспензии, можно получать согласно известному уровню техники, используя подходящие диспергирующие или смачивающие средства и суспендирующие средства. Стерильный инъецируемый препарат также может представлять собой стерильный инъецируемый раствор, суспензию или эмульсию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе. Среди приемлемых разбавителей, которые можно использовать, имеется вода, раствор Рингера, U.S.P. И изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные, жирные масла. Композиции могут дополнительно содержать «фармацевтически приемлемые» вспомогательные средства или стабилизаторы, обычно используемые в данной области (которые все называются «вспомогательные средства»). Вспомогательные средства содержат, например, буферные средства, стабилизирующие средства, консерванты, регулирующие тоничность средства, неионные детергенты, антиоксиданты и другие различные добавки. (См. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed. (1980)). Такие добавки должны быть нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях.

Буферные средства предпочтительно присутствуют в концентрации в диапазоне от приблизительно 2 мМ до приблизительно 50 мМ. Подходящие буферные средства включают как органические, так и неорганические кислоты и их соли, такие как цитратные буферы (например, смесь мононатрия цитрат-динатрия цитрат, смесь лимонная кислота-тринатрия цитрат, смесь лимонная кислота-мононатрия цитрат и т.д.), сукцинатные буферы (например, смесь янтарная кислота-мононатрия сукцинат, смесь янтарная кислота-натрия гидроксид, смесь янтарная кислота-динатрия сукцинат и т.д.), тартратные буферы (например, смесь винная кислота-натрия тартрат, смесь винная кислота-калия тартрат, смесь винная кислота-натрия гидроксид и т.д.), фумаратные буферы (например, смесь фумаровая кислота-мононатрия фумарат и т.д.), фумаратные буферы (например, смесь фумаровая кислота-мононатрия фумарат, смесь фумаровая кислота-динатрия фумарат, смесь мононатрия фумарат-динатрия фумарат и т.д.), глюконатные буферы (например, смесь глюконовая кислота-натрия глюконат, смесь глюконовая кислота-натрия гидроксид, смесь глюконовая кислота-калия глюконат и т.д.), оксалатный буфер (например, смесь щавелевая кислота-натрия оксалат, смесь щавелевая кислота-натрия гидроксид, смесь щавелевая кислота-калия оксалат и т.д.), лактатные буферы (например, смесь молочная кислота-натрия лактат, смесь молочная кислота-натрия гидроксид, смесь молочная кислота-калия лактат и т.д.) и ацетатные буферы (например, смесь уксусная кислота-натрия ацетат, смесь уксусная кислота-натрия гидроксид и т.д.). Кроме того, можно упомянуть фосфатные буферы, гистидиновые буферы и триметиламиновые соли, такие как Tris.

Для замедления роста микробов можно добавлять консерванты, и их можно добавлять в количествах в диапазоне от 0,2%-1% (м/о). Подходящие консерванты для применения согласно настоящему изобретению включают фенол, бензиловый спирт, метакрезол, метилпарабен, пропилпарабен, октадецилдиметилбензиламмонийхлорид, бензалкония галиды (например, хлорид, бромид, иодид), гексаметонийхлорид, алкилпарабены, такие как метил или пропил парабен, катехол, резорцин, циклогексанол и 3-пентанол.

Осмолярность фармацевтических композиций можно регулировать с помощью регулирующих тоничность средств до значения, которое совместимо с предполагаемым применением композиций. Например, осмоляльность инъецируемых растворов можно регулировать приблизительно до осмотического давления крови, которое эквивалентно приблизительно 0,9 м/о% хлорида натрия в воде. Примеры подходящих регулирующих тоничность средств включают хлористые соли натрия, калия, кальция и магния, декстрозы, глицерин, пропиленгликоль, маннитол, сорбитол, эритритол, арабитол, ксилитол и тому подобное и их смеси. Регулирующие тоничность средства обычно используют в количествах в диапазоне от приблизительно 0,001 до приблизительно 1% м/о. было обнаружено, что эти количества подходят для обеспечения физиологически приемлемой тоничности. Предпочтительно, регулирующее тоничность средство (средства) необходимо использовать в количестве, обеспечивающем итоговое осмотическое значение композиции от 150 до 450 мОсм/кг, более предпочтительно между приблизительно 220 и приблизительно 350 мОсм/кг, и наиболее предпочтительно между приблизительно 270 и приблизительно 300 мОсм/кг.

Композиции могут дополнительно содержать стабилизатор. Типичными стабилизаторами могут быть многоатомные сахарные спирты (перечисленные выше); аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, L-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т.д. органические сахара или сахарные спирты, такие как лактоза, трегалоза, стахиоза, маннитол, сорбитол, ксилитол, рибитол, мионизитол, галактитол, глицерин и тому подобное, включая циклитолы, такие как инозитол; полиэтиленгликоль; аминокислотные полимеры; серосодержащие восстанавливающие средства, такие как мочевина, глютатион, тиоктовая кислота, натрия тиогликолят, тиоглицерин, альфа-монотиоглицерин и натрия тиосульфат; низкомолекулярные полипептиды (т.е. <10 остатков); белки, такие как человеческий сывороточный алюбумин, бычий сывороточный алюбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза, глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза и трисахариды, такие как раффиноза; полисахариды, такие как декстран. Стабилизаторы могут присутствовать в диапазоне массы от 0,1 до 10000 раз от массы антител согласно изобретению.

Смачивающие средства можно добавлять для содействия растворения антител согласно изобретению, а также для защиты их от вызванной взбалтыванием агрегации. Подходящие смачивающие средства включают неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (20, 80 и т.д.), полиоксамеры (184, 188 и т.д.), Pluronic.RTM, полиолы, моноэфиры полиоксиэтиленсорбитана (Tween.RTM.-20, Tween.RTM.-80 и т.д.). Неионные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в диапазоне от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 1,0 мг/мл, предпочтительно приблизительно 0,07 мг/мл до приблизительно 0,2 мг/мл.

Фармацевтические композиции также могут содержать дополнительное активное соединение, которое необходимо для конкретного показания, подвергаемого лечению, предпочтительно соединение с активностью, которая не оказывает вредного влияния на активность антител согласно изобретению. Например, при лечении злокачественного новообразования может быть необходимо дополнительно обеспечить одно или более химиотерапевтических средств. Такие соединения должным образом присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемой цели.

Фармацевтические композиции можно стерилизовать, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

Антитела согласно изобретению также могут быть захвачены в микрокапсулы, полученные, например, с помощью технологии коацервации или с помощью межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозы, или желатиновую микрокапсулу и поли-(метилметацилатовые) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, алюбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие технологии раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980).

Можно получить препараты замедленного высвобождения. Подходящие примеры препаратов замедленного высвобождения, которые можно адаптировать для доставки антител согласно изобретению, включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитела, причем матрицы представлены в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц замедленного высвобождения включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат), или поли(винилспирт)), полилактиды (Патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамат, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолиевой кислоты и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота. Хотя такие полимеры, как этиленвинилацетат и молочная кислота-гликолиевая кислота обеспечивают высвобождение молекул в течение свыше 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Когда капсулированные антитела остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°C, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям иммуногенности. Для стабилизации можно разработать рациональные стратегии в зависимости от используемого механизма. Например, если обнаружено, что механизм агрегации заключается в образовании межмолекулярной S--S связи посредством тиол-дисульфидного обмена, стабилизацию можно достигнуть за счет модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислых растворов, регулирования содержания влаги, использованияя подходящих добавок и разработки композиций со специфическими полимерными матрицами.

Способы введения можно выбирать соответствующим образом с учетом возраста и симптомов индивида. Доза в фармацевтической композиции антител или связывающих фрагментов согласно изобретению может составлять, например, от приблизительно 0,0005 до приблизительно 100 мг/кг для каждого введения. Более предпочтительно, доза может составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг для каждого введения. Вводить можно несколько раз в сутки, ежедневно, раз в два дня, два раза в неделю или еженедельно. Однако, настоящее изобретение не ограничено описанными выше числовыми значениями. Дозы и способы введения варьируют в зависимости от массы, возраста, симптомов индивида и тому подобное Специалисты в данной области могут устанавливать подходящие дозы и способы введения с учетом описанных выше факторов.

Диагностическое применение антител согласно изобретению

Антитела и связывающие фрагменты согласно настоящему изобретению могут быть полезны при диагностических анализах, например, анализах для обнаружения экспрессии CXCR4 в специфических клетках, тканях или сыворотке. Для диагностических вариантов применения антитело обычно необходимо пометить детектируемым фрагментом. Доступно множество меток. Примеры ферментных меток включают люциферазы (например, люциферазу светлячков и бактериальную люциферазу; Патент США № 4737456), малатдегидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (HRPO), щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы (например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и тому подобное. Технологии конъюгирования ферментов с антителами описаны в O'Sullivan et al. Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (Ed. Langone & Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147-166 (1981).

Иногда, метку непрямо конъюгируют с антителом. Специалисту должны быть известны различные технологии достижения этого. Например, антитело может конъюгировать с биотоном, а любая из упомянутых выше меток может конъюгировать с авидином или наоборот. Биотон выборочно связывается с авидином, и, таким образом, метка может конъюгировать с вариантом антитела таким непрямым образом. Альтернативно, для достижения непрямой конъюгации метки с антителом, антитело конъюгирует с небольшим гаптеном (например, дигоксином), а один из различных типов упомянутых выше меток конъюгирует с антителом против гаптена (например, антителом против дигоксина). Таким образом, можно добиться непрямой конъюгации метки с антителом. В еще одним варианте осуществления изобретения антитела согласно изобретению нет необходимости метить, и его присутствие можно обнаружить, используя меченое антитело, которое связано с антителом.

Антитела или связывающий фрагмент согласно настоящему изобретению можно использовать в любом известном способе иммунохимического анализа, таком как анализы конкурентного связывания, прямой и непрямой сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Их также можно использовать для иммуногистохимического обнаружения CXCR4 в клетках и тканях. В иммуногистохимии образец ткани, например, образец опухолевой ткани, может быть свежим или замороженным или может быть погружен в парафин и зафиксирован с помощью такого консерванта, как, например, формалин. Антитела также можно использовать для диагностических анализов in vivo. В общем, антитела или связывающие фрагменты метят радионуклеотидом (таким как ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ³H, ³²P или ³⁵S), так чтобы сверхэкспрессирующие CXCR4 клетки можно было локализовать, используя иммуносцинтиографию.

Антитела или связывающие фрагменты согласно настоящему изобретению могут быть представлены в наборе, т.е. В упакованной комбинации реагентов в заданных количествах с инструкциями по проведению диагностического анализа. Когда антитело мечено ферментом, набор может содержать субстраты и кофакторы, требуемые ферментом (например, прекурсор субстрата, который обеспечивает детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, можно включать другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и тому подобное. относительные количества различных реагентов могут широко варьировать, чтобы обеспечить концентрации в растворе реагентов, которые существенно оптимизируют чувствительность анализа. В частности, реагенты можно представить в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, содержащих вспомогательные средства, которые при растворении будут обеспечивать раствор реагентов, имеющих подходящую концентрацию.

Терапевтическое применение антител и связывающих фрагментов согласно изобретению для человека

Антитела согласно изобретению можно использовать в стволовых клетках и регенеративной медицине. Взаимодействие CXCR4 с SDF-1альфа важно для удержания гематопоэтических стволовых клеток в костном мозге. Антитела против CXCR4 могут служить в качестве антагонистов, которые способны мобилизовать гематопоэтические стволовые клетки в кровоток в качестве стволовых клеток периферической крови. Мобилизация стволовых клеток периферической крови может быть важна при трансплантации гематопоэтических стволовых клеток (в качестве альтернативы трансплантации костного мозга полученного хирургическим путем), и ее в настоящее время проводят, используя такие лекарственные средства как G-CSF. Антитела и связывающие фрагменты согласно настоящему изобретению также можно использовать для предотвращения взаимодействия ВИЧ-инфекции на поздней стадии (вирусы X4) с рецептором CXCR4 и проникновения в T-клетки.

Антитела и связывающие фрагменты согласно изобретению дополнительно можно использовать при лечении множества различных видов злокачественного новообразования, которые экспрессируют CXCR4. CXCR4 может представлять собой хемокиновый рецептор, который чаще всего обнаруживается в опухолевых клетках, как у человека, так и при раке экспериментальных мышей. Рецептор был обнаружен по меньшей мере в следующих типах опухоли: B-CLL, AML, B-lineage ALL (включая лимфому Беркитта), миелома из фолликулярного центра, CML, множественная миелома, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак щитовидной железы, колоректальный рак, плоскоклеточный рак полости рта, рак шейки матки, нейробластома, рак почки, глиома, рабдомиосаркома, мелкоклеточный рак легкого и меланома. Balkwill (2004) Seminars in Cancer Biology 14: 171-9. Лечение будет включать введение больным раком фармацевтической композиции, содержащей антитела или связывающие фрагменты согласно изобретению. Композицию можно вводить с помощью любого подходящего средства, включая парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное, интраназальное и внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, антитела или связывающие фрагменты должным образом вводят путем импульсной инфузии, в частности с уменьшающимися дозами антител или связывающих фрагментов. Предпочтительно, дозу вводят путем инъекций, наиболее предпочтительно внутривенных или подкожных инъекций, частично в зависимости от того, является ли введение кратким или хроническим. В зависимости от типа и тяжести заболевания начальная кандидатная доза для введения индивиду составляет от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг антител или связывающих фрагментов, например, путем одного или более отдельных введений или путем непрерывной инфузии. типичная суточная доза может быть в диапазоне приблизительно от 1 мг/кг до 100 мг/кг или более.

Фармацевтическую композицию, содержащую антитела или связывающие фрагменты согласно изобретению, следует составлять, дозировать и вводить способом, согласованным с надлежащей медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в этом контексте включают тип и стадию злокачественного новообразования, клиническое состояние отдельного индивида, место доставки средства, способ введения, график введения и другие факторы, известные практикующим врачам. «терапевтически эффективное количество» вводимого антитела будет зависеть от таких соображений и представляет собой минимальное количество необходимое для лечения заболевания. Антитело не является обязательным, но его необязательно включают в состав с одним или более средствами, используемыми в настоящее время для лечения заболевания, например, с одним или более химиотерапевтическими средствами. Эффективное количество таких других средств зависит от количества антител или связывающих фрагментов, присутствующих в готовой форме, от типа и стадии злокачественного новообразования и других обсуждавшихся выше факторов. Их в общем используют в таких же дозировках и с помощью путей введения, которые они используют в настоящее время (без антител согласно изобретению) или приблизительно от 1 до 99% используемых в настоящее время дозировок.

Примеры

Пример 1: Получение Fab-фаговой библиотеки и скрининг фаговых антител

Сначала антитела согласно настоящему изобретению с размером 10^11 получили из Fab-библиотеки, состоящей из фагмид pSF1, несущих кодон-оптимизированные синтетические гены Fab E. coli, кодирующие тяжелую цепь Fab человека и легкую цепь Fab человека с рандомизированными CDR. Для тяжелой цепи использовали каркас DP47, а для легкой цепи использовали каркас DPK22.

Фаговую библиотеку создали, используя протоколы и схемы рандомизации CDR, как описано в Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86; Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340:1073-93; Hoet et al. (2005) 23:344-8.

Более конкретно, в библиотеке Fab CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR3 легкой цепи подвергали рандомизации. Для рандомизации CDR3 тяжелой цепи использовали олигонуклеотиды на основе тринуклеотидов, как описано у Knappik et al. тогда как для других CDR для создания олигонуклеотидов CDR использовали смеси стандартных нуклеотидов.

Обычные CDR легкой цепи библиотеки Fab были следующие (MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol. 626:732-745):

CDR1L--SSYLAWY-- (SEQ ID No.1)

CDR2L--LLIYGASSRA-- (SEQ ID No.2)

Для скрининга библиотеки Fab использовали технологию Магнитных Протеолипосом для отображения CXCR4 в липосомной мембране в конформации, очень похожей на ее нативную конформацию. См. Mirzabekov et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:649-54 и Патент США № 6761902.

Скрининг библиотеки Fab проводили, используя Способы, описанные Mirzabekov et al. И получили следующий кандидат Fab:

	SEQ ID NO
Антитело	CDR3L	CDR1H	CDR2H	CDR3H	LCVR	HCVR
V62.1	3	5	7	11	13	15

Пример 2: созревание аффинности

Затем описанный выше исходный кандидат представляли для созревания аффинности. Две Библиотеки Созревания Аффинности создали путем рандомизации CDR2H или CDR3L, соответственно. Каждую из этих библиотек представляли для двух раундов отбора в строгих условиях. Выбранные Fab отдельно экспрессировали, и сохраняли клоны с улучшенными свойствами связывания. Лучшие клоны переформатировали в виде IgG, которые характеризовали на лучшую аффинность и селективность связывания CXCR4, а также на лучшую способность предотвращать индуцирование лигандом Ca-переноса. В виде последней стадии рекомбинировали тяжелую и легкую цепи наиболее перспективных IgG, а полученные в результате IgG снова характеризовали, как и ранее.

Кроме того, проводили созревание CDR3H за счет введения точечных мутаций. Полученные в результате мутировавшие Fab-фрагменты характеризовали для идентификации лучших связывающих CXCR4.

Далее рассмотрены следующие зрелые антитела-кандидаты:

	SEQ ID NO
Антитело*	CDR3L	CDR1H	CDR2H	CDR3H	LCVR	HCVR
V62.1-R108H	3	5	7	12	13	16
V62.1-R108H-m43-m38	4	5	8	12	14	17
V62.1-R108H-m47-m38	4	5	9	12	14	18
V62.1-R108H-m80	3	6	10	12	13	19

*R108H относится к точечной мутация в CDR3H (сравнение SEQ ID NO: 11 и 12), а m38, m43, m47 и m80 относятся к конкретным, выбранным последовательностям CDR2H или CDR3L, соответственно.

Как упоминалось ранее, все антитела согласно настоящему изобретению имеют одинаковые CDR1L (SEQ ID NO.1) и CDR2L (SEQ ID NO.2).

Пример 3: синтез IgG антител

Систему транзиторной трансфекции CHO/pTT от Научно-исследовательского института биотехнологии Национального исследовательского совета Канады (NRC-BRI) использовали в соответствии с протоколами, предоставленными NRC-BRI. См. Международную публикацию патентной заявки WO2009/137911 A1. Более конкретно, каждый представляющий интерес IgG продуцировали в клетках CHO-3E7, совместно трансфицированных векторами pTT, экспрессирующими легкую цепь и тяжелую цепь IgG, соответственно, с использованием полиэтиленимина (PEI) в качестве реагента для трансфекции.

Клеточную среду, содержащую IgG, собирали, и IgG очищали на белке А плюс агароза (Pierce) с использованием стандартной методики. Все процедуры очистки выполняли с использованием стерильных растворов, не содержащих эндотоксинов.

В следующих примерах интересующий фрагмент Fab или представляющее интерес антитело IgG в зависимости от ситуации обозначено как «тестируемый Fab», «тестируемое антитело» или «тестируемый IgG».

Пример 4: связывание с экспрессирующими CXCR4 клетками

Связывание Fab или IgG с экспрессирующими CXCR4 клетками измеряли с помощью анализа на основе флуоресцентной проточной цитометрии. Клетки окрашивали:

(A) для Fab - мышиное антитело против C-Myc 9E10 Mab, которое связывается с меткой, присутствующей в тестируемом Fab, а затем со вторичным антителом против мышиного IgG, конъюгированным с фикоэритрином (PE), или

(B) для IgG - с антителом против человеческого Fc, конъюгированного с PE.

В качестве контроля использовали клетки, которые не экспрессируют CXCR4, или клетки, экспрессирующие другой GPCR.

Типовой протокол для анализа на основе флуоресцентной проточной цитометрии был следующим. Десять микролитров очищенного раствора тестируемого IgG или буфера в качестве контроля добавляли к 10 микролитрам суспензии, содержащей приблизительно 30000 клеток Cf2-Th, трансфицированных для экспрессии человеческого CXCR4. После инкубации на льду в течение 40 минут клетки промывали буфером FACS (забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), pH 7,4; 2% фетальной телячьей сыворотки, 0,1% азида натрия) для удаления несвязанных антител. Затем к клеткам добавляли десять микролитров раствора конъюгированного с фикоэритрином (РЕ) мышиного моноклонального антитела против человеческого Fc (разведение 1/20; номер по каталогу 12-4998-82, eBioscience Inc., San Diego, CA) и после 30-минутной инкубации на льду клетки дважды промывали и затем фиксировали формалином (буфер FIX: PBS, pH 7,4; 0,5% формальдегид). Фиксированные образцы анализировали с помощью флуоресцентной проточной цитометрии с использованием прибора Guava-PCA96 (EMD Millipore Chemicals, Merck KGaA, Darmstadt, Germany).

Чтобы определить значение EC50, связывание с экспрессирующими CXCR4 клетками измеряли в различных концентрациях тестируемого антитела. Для каждой концентрации образцы анализировали в двух или трех повторениях. Кривые титрования строили на основе средних значений интенсивности флуоресценции (MFI), предоставленных прибором с использованием программы SoftMaxPro5 (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA).

В некоторых экспериментах в качестве отрицательных контролей использовали нетрансфицированные родительские клетки Cf2-Th (atcc® crl-1430™), тем самым устанавливая специфичность антител к CXCR4. В некоторых других экспериментах несколько партий одного и того же антитела-кандидата тестировали параллельно. Кривые доза-ответ и результаты EC50, полученные с тестируемыми антителами в формате IgG1, представлены на фиг. С 1а по е. Все тестируемые антитела IgG1 показали EC50 значительно ниже 10 нМ.

Пример 5: связывание с экспрессирующими cxcr4 клетками лимфомы человека

Связывание тестируемых IgG с экспрессирующими CXCR4 клетками лимфомы человека (Ramos; RA1, ATCC® CRL-1596™) измеряли в анализе на основе флуоресцентной проточной цитометрии. Окрашивание опухолевых клеток проводили следующим образом: человеческие Fcγ-рецепторы клеток RA1 насыщали путем инкубации при 4°С в течение 30 минут в pbs, содержащем 2% человеческую сыворотку и 0,5 мм EDTA. Затем клетки инкубировали при 4°С в течение одного часа с тестируемыми IgG или контрольным изотипическим IgG1каппа человека (Coger Sarl, Paris, France) (оба типа антител при 10 мкг/мл). Клетки промывали PBS и дополнительно инкубировали в течение одного часа при 4°C с козьим F(ab')2-фрагментом анти-человеческого IgG (H + L)-PE (Beckman Coulter). Клетки дважды промывали PBS и фиксировали 0,5% формальдегидом в PBS для анализа методом проточной цитометрии. Данные получали с использованием одиннадцатицветного проточного цитометра (LSRII, BD Biosciences), а анализы выполняли с помощью программного обеспечения для анализа проточной цитометрии FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR). Живые клетки отбирали с использованием бокового рассеяния (SSC) и прямого рассеяния (FSC); для каждого анализа получали 10000 событий. Значения MFI регистрировали с использованием pe канала.

Антитело	MFI
V62.1	595
V62.1-R108H	429
V62.1-R108H-m80	440
V62.1-R108H-m43-m38	488
V62.1-R108H-m47-m38	549
IgG1k изотипический контроль	42

Значения MFI, значительно превышающие значения изотипического контроля, указывают на положительное окрашивание клеток RA1, которое наблюдалось для всех тестируемых IgG.

Пример 6: специфичность для CXCR4

Сравнивали клетки, сверхэкспрессирующие разные GPCR, отличные от CXCR4, и несколько линий, трансфицированных для сверхэкспрессии CXCR4 (R1610-hCXCR4, Cf2Th-hCXCR4 и CHO-hCXCR4). Культуры инкубировали с тестируемым IgG при 100 нМ в буфере FACS в течение 40 мин при 4°C. После этого клетки дважды промывали, окрашивали конъюгатом антитело против человеческого Fc-РЕ (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA), дважды промывали в буфере FACS и затем переносили в буфер FIX. Интенсивности флуоресценции измеряли с помощью GUAVA PCA-96 при 425 В (в трех повторениях).

Экспрессию GPCR, отличную от CXCR4, подтверждали с использованием коммерчески доступных антител (положительный контроль). Например, коммерческое антитело против CXCR1 использовали в качестве положительного контроля для подтверждения экспрессии CXCR1 на CXCR1-трансфицированных клетках CHO.

Сводка полученных данных MFI представлена в таблице ниже.

Клеточная линия с Антителом	V62.1	V62.1-R108H	V62.1-R108H- m47-m38	V62.1 R108H m80	Положительный контроль
CHO-hCXCR1	4	4	N/A	N/A	1325
hCXCR2	3	4	N/A	N/A	1830
hCXCR3	3	3	2	2	500
R1610-hCXCR4	812	513	N/A	N/A	447
Cf2Th-hCXCR4	1267	861	2350	3870	1006
CHO-hCXCR4	2053	1850	N/A	N/A	994
hCXCR5	4	3	2	2	510
hCXCR6	3	3	2	7	1050
hCXCR7	3	4	2	2	300
hCCR3	4	4	40	2	213
hCCR4	3	3	2	2	506
hCCR5	4	3	2	8	724
hCCR6	3	3	2	10	1481
hCCR7	3	4	2	25	465
hCCR9	4	3	2	8	260
hCCR10	4	3	2	10	3000
Cf2Th	3	3	2	8	1
R1610	3	3	2	2	1
CHO	3	3	2	7	1

Пример 7: ингибирование связывания лиганда с CXCR4

Ингибирование связывания лиганда SDF-1альфа анализировали с помощью флуоресцентной проточной цитометрии с использованием бактериально экспрессированной SDF-1альфа, содержащей N-концевую метку FLAG.

Клетки Cf2-Th, трансфицированные для экспрессии CXCR4, инкубировали с тестируемым антителом IgG (100 нМ) в течение 30 минут на льду. После этого добавляли меченный FLAG лиганд до конечной концентрации 100 нМ, и клетки инкубировали в течение еще 20 минут. Затем клетки промывали, окрашивали соответствующим конъюгированным с PE антителом против FLAG-метки и фиксировали буфером FIX. В контроле не добавляли ни одно антитело. Затем регистрировали флуоресценцию. Пониженное значение MFI для клеток, которые подвергались воздействию тестируемого антитела (MFI_WithAb), по сравнению с MFI для клеток, которые не подвергались воздействию тестируемого антитела IgG (MFI_NoAb), указывало на конкуренцию между антителом и лигандом. Процент ингибирования определяли как (MFI_WithAb/MFI_NoAb) х 100%. Аналогичные значения MFI_WithAb и MFI_NoAb указывали, что предварительно связанное тестируемое антитело не могло предотвратить связывание меченого лиганда с CXCR4 на клеточной поверхности. Тестируемые антитела V62.1 и V62.1R108H были способны ингибировать связывание лиганда до 96%.

Пример 8: ингибирование индуцированного SDF-1 переноса кальция

Значения IC50 оценивали на основе данных, полученных из анализов кальция FLIPR (набор Calcium-5, Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA), для клеток Chem-1, трансфицированных CXCR4 (номер по каталогу HTS004C, EMD Millipore Chemicals). Клетки выращивали в течение ночи при 37°С и 5% СО₂. Перед измерением переноса Ca клетки выдерживали без питания в бессывороточной среде в течение 3 часов при 37°С и 5% CO₂. К клеткам добавляли краситель, который затем инкубировали в течение 30 минут при 37°С и 5% CO₂ в присутствии разных концентраций тестируемого антитела IgG1. Контрольные образцы получали аналогичным образом, но антитела не добавляли. После этого SDF-1альфа (R & D Systems) в TBS добавляли в нагруженные красителем клетки до конечной концентрации 30 нМ. Ингибирование вызванного хемокином увеличения внутриклеточной концентрации кальция (перенос Ca) рассчитывали следующим образом:

где [I] - означает пиковую флуоресценцию красителя (n=4) в ингибированных образцах, [C] - означает пиковую флуоресценцию красителя (n=18) в контрольных образцах.

Построили кривые зависимости от дозы и рассчитали значения IC50. IC50 представляет собой концентрацию тестируемого IgG, при которой наблюдается 50% ингибирование индуцированного SDF-1-альфа переноса кальция. Сводка значений IC50, определенных для разных тестовых IgG, представлена в таблице ниже:

Тестируемое антитело	IC50 (нМ):
V62.1	7,4
V62.1-R108H	6,8
V62.1-R108H-m43-m38	3,8
V62.1-R108H-m47-m38	5
V62.1-R108H-m80-Wt	7,5

Все тестируемые антитела значительно ингибировали индуцированный SDF-1-альфа перенос кальция в экспрессирующих CXCR4 клетках.

Пример 9: ингибирование хемотаксиса/клеточной миграции

Клетки U937 человека выращивали в среде RPMI-1640 с 10% FCS, затем дважды промывали и инкубировали в бессывороточном RPMI-1640 при 37°C в течение 3 часов (5% CO₂). Клетки U937 без питания ресуспендировали в среде для хемотаксиса (RPMI-1640 с 0,3% BSA) при 3*10^5 клеток на мл и

инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре (предварительно не обработанный положительный контроль для анализа);

предварительно обрабатывали AMD 3100 в концентрации 1 мкМ (положительный контроль для ингибирования хемотаксиса) в течение 30 минут при комнатной температуре; или

предварительно обрабатывали тестируемым IgG в концентрации 100 нМ в течение 30 мин при комнатной температуре.

Соответствующие предварительно не обработанные или предварительно обработанные клетки U937 затем помещали в верхние лунки камеры микрохемотаксиса (15000 клеток на лунку). Нижние лунки дополняли, как схематически представлено в таблице ниже.

	(a)	(a1)	(b)	(c)
Верхняя камера	Предварительно не обработанные клетки	Предварительно не обработанные клетки	Предварительно обработанные AMD 3100 клетки	предварительно обработанные тестируемым IgG клетки
Нижняя камера	среда без дополнения	SDF-1α (3 нМ)	SDF-1α (3 нМ) + ADM 3100 (1 мкМ)	SDF-1α (3 нМ) + тестируемый IgG (100 нМ)
	Отрицательный контроль для хемотаксиса	Положительный контроль для хемотаксиса	Положительный контроль для ингибирования хемотаксиса

Поликарбонатный фильтр с диаметром пор 8 мкм, разделенный на верхнюю и нижнюю камеры.

После инкубации в течение одного часа при 37°С (5% СО₂) суспензии клеток удаляли из верхних лунок, и лунки промывали один раз PBS. Затем камеру центрифугировали в течение 4 минут при 500 об/мин, и мигрировавшие клетки из нижних лунок переносили в лунки V-образного 96-луночного планшета, содержащие 50 мкл PBS. Количество мигрировавших клеток в каждой лунке определяли с использованием цитометра Guava PCA-96. Все измерения проводили в трех экземплярах.

Максимальную индуцированную SDF-1 миграцию рассчитывали как разницу в количестве мигрировавших клеток между условиями (a1) и (a) в приведенной выше таблице. Затем исходя из этой максимальной миграции рассчитывали процент ингибирования миграции для тестируемого антитела.

Результаты ингибирования индуцированного SDF-1-альфа хемотаксиса с помощью различных тестируемых IgG представлены в таблице ниже.

Тестируемые условия (все IgGs при 100 нМ)	% Ингибирования
SDF-1альфа, 3 нМ + AMD3100, 1 мкМ	98
SDF-1альфа, 3 нМ + V62.1	76
SDF-1альфа, 3 нМ + V62.1-R108H	69
SDF-1альфа, 3 нМ + V62.1-R108H-m43-m38	77
SDF-1альфа, 3 нМ + V62.1-R108H-m47-m38	78
SDF-1альфа, 3 нМ + V62.1-R108H-m80	75

Все тестируемые антитела ингибировали индуцированный SDF-1-альфа хемотаксис по меньшей мере приблизительно на 70%.

Пример 10. Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC)

ADCC измеряли с использованием клеток RA1 в качестве клеток-мишеней (t) и с использованием анализа нерадиоактивной цитотоксичности CytoTox 96® (Promega Corp., Fitchburg, WI), в котором измеряют высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH). 96-луночный культуральный планшет с круглым дном обеспечили следующими контрольными и экспериментальными лунками (итоговые объемы 100 микролитров):

а. Клетки RA1 (для регулирования спонтанного высвобождения LDH клеток-мишеней)

b. Клетки RA1 (для регулирования максимального высвобождения LDH клеток-мишеней)

c. Культуральная среда (среда RPMI 1640 (1X) без фенолового красного), используемая для регулирования коррекции объема

d. Культуральная среда (для регулирования фоновой среды)

e. RA1 плюс эффекторные клетки (е) (для регулирования спонтанного высвобождения LDH клетками-мишенями плюс эффекторными клетками)

f. Экспериментальные лунки с эффекторными клетками и клетками-мишенями (10⁵) с серийными разведениями каждого тестируемого IgG или без тестируемого IgG.

Планшеты центрифугировали при 1600 об/мин в течение 2 минут и инкубировали при 37°С в течение 4 часов. За один час до сбора супернатанта к условиям b) и c) добавляли 20 микролитров раствора для лизиса (10х). Планшеты центрифугировали при 1600 об/мин в течение 2 минут, и 50 микролитров супернатанта из каждой лунки аналитических планшетов переносили в соответствующие лунки 96-луночного ферментативного аналитического планшета с плоским дном. В каждую лунку последнего планшета добавляли смесь субстратов (50 микролитров), и планшет (защищенный от света) инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Наконец, в каждую лунку добавляли 50 микролитров останавливающего раствора, и измеряли оптическую плотность (значения OD) при 490 нм. Каждое условие проверяли в трех повторах.

Предварительные эксперименты были проведены с целью определения оптимального отношения E:T. Данные, показанные ниже, были получены при соотношении E:T 20:1 с 10⁵ клеток-мишеней RA1. Эффекторные клетки, использованные в этом исследовании, получали следующим образом: мононуклеарные клетки периферической крови человека (pbmcs), полученные от здорового донора, выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности с использованием среды для разделения лимфоцитов (ссылка J15-004, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). PBMCS в количестве 2×10⁶ на мл культивировали в течение двух дней в RPMI 1640 с 10% FCS, пенициллином/стрептомицином и 100 единицами на мл человеческого рекомбинантного il-2 (полученного от roussel-uclaf) в увлажненном инкубаторе при 37°С (5% CO²).

Процентные значения ADCC, полученные при разных концентрациях тестируемых igg, рассчитывали по формуле % ADCC = (f-e)/(b-a)x100, то есть % ADCC = (od клеток-мишеней + эффекторных клеток +/- тестируемые Mab - OD клеток-мишеней + эффекторных клеток спонтанного высвобождения)/(OD клеток-мишеней с максимальным высвобождением - OD клеток-мишеней спонтанного высвобождения) x 100.

Данные, приведенные в таблице ниже, демонстрируют, что все тестируемые антитела индуцировали значительную клеточно-опосредованную цитотоксичность.

IgG	Процентное значение ADCC
1 мкг/мл	0,1 мкг/мл	0,01 мкг/мл	0,001 мкг/мл	0,0001 мкг/мл
Ритуксимаб	60	46	27	8	3
IgG1 V62.1 R108H	59	57	23	15	8
IgG1 62,1 - R108H - m80	55	59	45	16	9
IgG1 62,1 - R108H - m47-m38	55	51	50	36	14
IgG1 62,1 - R108H - m43-m38	54	42	40	19	8
IgG V62.1	45	44	45	28	8
IgG1k	5	0	-4	-5	-7

Пример 11: противоопухолевая активность в ксенотрансплантатной модели SCID/RA1

Терапевтический эффект тестируемых антител оценивали на животной модели лимфомы Беркитта. В используемой модели системный рак у мышей SCID вызывает паралич задних конечностей и инфильтрирует во все основные органы.

За сорок восемь часов до инъекции опухолевых клеток самок мышей SCID (7-9 недель, весом 17-22 г) облучали γ-источником (1,8 Гр, ⁶⁰Co). При D0 один миллион клеток RA1 (клеточная линия В-лимфоцитов, полученных у пациента с лимфомой Беркитта американского типа), суспендированных в 200 мкл RPMI 1640, внутривенно инъецировали в хвостовую вену мышей. Мышей опухоленосителей распределяли по D4 на 10 групп по 10 мышей в каждой в зависимости от массы тела с использованием программного обеспечения Vivo manager® (Biosystemes, Dijon, France). Средняя масса тела статистически не отличалась от одной группы к другой (средняя масса тела: 19,3 ± 1,4 г). Лечение начинали на D4: мышам внутривенно вводили дозу тестируемого антитела 5 мг/кг или 10 мг/кг на 4, 8, 12, 16, 20 и 24 день. В качестве носителя для инъекции использовали 10 мМ Na-цитрат, 150 мМ NaCl, 50 мМ аргинин (рН 5,5). Массу тела измеряли и регистрировали дважды в неделю. Среднее время выживания рассчитывали для каждой группы как среднее значение дня смерти, а медиану времени выживания рассчитывали для каждой группы как медиану дня смерти. Эффективность каждого тестируемого антитела оценивали по увеличению значения продолжительности жизни (ILS). ILS% выражали следующим образом: ILS%=[(T-C)/C] x 100. T был медианой времени выживания животных, обработанных каждым тестируемым антителом, а C был медианным временем выживания контрольных животных, получавших носитель. Эксперимент прекратили через 81 день после инъекции опухоли.

Все контрольные мыши, получавшие носитель или Xolair® (изотипический контроль), умерли от диссеминированного заболевания с тяжелой потерей массы или были умерщвлены, потому что они агонировали в течение четырех недель после инокуляции опухолевых клеток.

Повторное лечение антителами V62.1 или V62.1-R108H приводило к увеличению выживаемости в 2 раза по сравнению с контрольными мышами (р <0,001). Кроме того, мыши, получавшие антитело против CD20 Mabthera®, используемое в качестве положительного контроля, жили значительно дольше, чем контрольные мыши (р <0,001). Эти данные показали, что тестируемые антитела V62.1 и V62.1-R108H могут эффективно выделять и подавлять пролиферацию клеток RA1 в этой высокоагрессивной ксенотрансплантатной модели. Подробные результаты приведены в таблице ниже.

Группы	Живые мыши в конце исследования = 81 день	Медиана выживаемости (дней)	Средняя выживаемость (дней)	% Увеличенный жизненный цикл
Носитель (в/в, Q4Dx6)	0/10	27	28	-
V62.1 (10 мг/кг, в/в, Q4Dx6)	0/10	61	61	126
V62.1-R108H (10 мг/кг, в/в, Q4Dx6)	1/10	59	60	119
Mabthera (10 мг/кг, в/в, Q4Dx6)	0/10	62	63	130
Xolair (10 мг/кг, в/в, Q4Dx6)	0/10	27	29	0

Пример 12: Антиметастатическая активность в ксенотрансплантатной модели злокачественного новообразования молочной железы человека

Целью этого эксперимента было оценить эффективность четырех тестируемых антител в модели метастазирования злокачественного новообразования молочной железы, в которой клетки MDA-MB-231/Luc (номер по каталогу AKR-231, Cell Biolabs, Inc, San Diego, CA) имплантировали внутривенно голым мышам BALB/c. Клеточная линия MDA-MB-231/Luc представляет собой сублинию, экспрессирующую люциферазу, полученную из клеточной линии злокачественного новообразования молочной железы человека MDA-MB-231. Клетки MDA-MB-231/Luc вызывают экспериментальный метастаз в легком. Известно, что трансэндотелиальная миграция злокачественных клеток MDA-MB-231, а также проницаемость сосудов зависит от передачи сигналов SDF1/CXCR4 (Lee et al. (2004) Mol. Cancer Res. 2: 327).

Исследование состояло из 7 экспериментальных групп, каждая из которых содержала 12 самок голых мышей BALB/c. В -1 день животных рандомизировали на основе массы тела. В дисперсионном анализе средняя масса тела каждой группы статистически не отличалась от других. В 0 день всем участвующим животным внутривенно имплантировали 2×10⁶ клеток MDA-MB-231/Luc в 100 мкл 0,9% NaCl. Рост метастазирования оценивали на 2, 9, 15, 24, 28, 31, 35 и 38 день с использованием биолюминесцентной визуализации in vivo. Массу животных измеряли через день (понедельник, среда и пятница). Животным групп 2-5 внутривенно вводили 10 мг/кг тестируемого антитела в 1, 3, 7, 11, 15 и 19 дни (Q4Dx6), а 1 группа получала носитель (10 мМ Na-цитрат, 150 мМ NaCl, 50 мМ аргинина, рН 5,5). Дозы антител рассчитывали на основе последних измерений массы тела.

Общая активность люциферазы в области грудной клетки в конце исследования (на 38 день) показана на фиг.2. Все тестируемые антитела значительно ингибировали рост опухолевых клеток в области грудной клетки.

Указание диапазонов значений в данном документе предназначено просто для того, чтобы служить сокращенным способом индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если в данном документе не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было отдельно указано в настоящем документе. Если не указано иное, все точные значения, представленные в настоящем документе, представляют соответствующие приблизительные значения (например, все точные иллюстративные значения, предоставленные в отношении конкретного фактора или измерения, можно рассматривать также, как обеспечивающие соответствующее приблизительное измерение, модифицированное, где это целесообразно, словом «приблизительно»).

Использование любого и всех примеров или иллюстративных формулировок (например, «такой как»), представленных в настоящем документе, предназначено просто для лучшего освещения изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если не указано иное.

Цитирование и включение в данный документ патентных документов сделано только для удобства и не отражает какого-либо представления о действительности, патентоспособности и/или возможности применения таких патентных документов. Описание в данном документе любого аспекта или варианта осуществления изобретения с использованием терминов, например, ссылка на элемент или элементы, предназначено для обеспечения поддержки аналогичного аспекта или варианта осуществления изобретения, который «состоит из», «состоит по существу из» или «содержит по существу» этого конкретного элемента или элементов, если не указано иное или явно не противоречит контексту (например, описанную в данном документе композицию, как содержащую конкретный элемент, следует понимать как также описывающую композицию, состоящую из этого элемента, если иное не указано или явно не противоречит контексту).

Настоящее изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты предмета, изложенного в аспектах или формуле изобретения, представленных в данном документе, в максимальной степени, допускаемой применимым законодательством.

Все публикации и патентные заявки, процитированные в этом описании, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки, как если бы было специально и отдельно указано, что каждая отдельная публикация или патентная заявка включена посредством ссылки.

Хотя вышеизложенное изобретение было описано более подробно с помощью иллюстрации и примера в целях ясности понимания, специалисту в данной области техники в свете идей этого изобретения будет легко понять, что определенные изменения и модификации могут быть сделаны без отступления от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> МСМ ПРОТЕИН ТЕКНОЛОДЖИЗ ИНК.

<120> Aнтитела против CXCR4

<130> MSM-001WO01

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1L легкой цепи

<400> 1

Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2L легкой цепи

<400> 2

Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3L легкой цепи, вариант 1

<400> 3

Gln Gln Ser Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3L легкой цепи, вариант 2

<400> 4

Gln Gln Trp Ser Ser Asp Ser Val

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1H тяжелой цепи, вариант 1

<400> 5

Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1H тяжелой цепи, вариант 2

<400> 6

Ser Pro Tyr Ser Ile Thr

1 5

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2H тяжелой цепи, вариант 1

<400> 7

Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2H тяжелой цепи, вариант 2

<400> 8

Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Thr Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2H тяжелой цепи, вариант 3

<400> 9

Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Arg

1 5 10

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2H тяжелой цепи, вариант 4

<400> 10

Trp Val Ser Gln Ile Asn Ser Tyr Asn Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3H тяжелой цепи, вариант 1

<400> 11

Ala Arg Gln Gly Lys Thr Arg Val Tyr Gly Tyr Arg Trp His Gly Tyr

1 5 10 15

Gly Ser Thr His Ala Leu Asp

20

<210> 12

<211> 23

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3H тяжелой цепи, вариант 2

<400> 12

Ala Arg Gln Gly Lys Thr Arg Val Tyr Gly Tyr His Trp His Gly Tyr

1 5 10 15

Gly Ser Thr His Ala Leu Asp

20

<210> 13

<211> 111

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная область легкой цепи LCVR, вариант 1

<400> 13

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Tyr Ser Tyr

85 90 95

Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

<210> 14

<211> 110

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная область легкой цепи LCVR, вариант 2

<400> 14

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asp Ser

85 90 95

Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

<210> 15

<211> 131

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная область тяжелой цепи HCVR, вариант 1

<400> 15

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Lys Thr Arg Val Tyr Gly Tyr Arg Trp His Gly Tyr

100 105 110

Gly Ser Thr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 16

<211> 131

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная область тяжелой цепи HCVR, вариант 2

<400> 16

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Lys Thr Arg Val Tyr Gly Tyr His Trp His Gly Tyr

100 105 110

Gly Ser Thr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 17

<211> 132

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная область тяжелой цепи HCVR, вариант 3

<400> 17

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gln Gly Lys Thr Arg Val Tyr Gly Tyr His Trp His Gly

100 105 110

Tyr Gly Ser Thr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser

130

<210> 18

<211> 130

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная область тяжелой цепи HCVR, вариант 4

<400> 18

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gln Gly Lys Thr Arg Val Tyr Gly Tyr His Trp His Gly Tyr Gly

100 105 110

Ser Thr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 19

<211> 131

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная область тяжелой цепи HCVR, вариант 5

<400> 19

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Pro Tyr

20 25 30

Ser Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gln Ile Asn Ser Tyr Asn Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Lys Thr Arg Val Tyr Gly Tyr His Trp His Gly Tyr

100 105 110

Gly Ser Thr His Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 20

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1L

<400> 20

tcctcttacc tggcctggta t 21

<210> 21

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2L

<400> 21

ctgctgatct atggcgcctc ttctagagcc 30

<210> 22

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3L, вариант 1

<400> 22

cagcagtccg actactccta ccccttc 27

<210> 23

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3L, вариант 2

<400> 23

cagcagtggt cctccgactc cgtg 24

<210> 24

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1H, вариант 1

<400> 24

tccagctacg ccatgtcc 18

<210> 25

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1H, вариант 2

<400> 25

tccccctact ctatcacc 18

<210> 26

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2H, вариант 1

<400> 26

tgggtgtccg ccatctctgg ctctggcggc tctacctac 39

<210> 27

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CRD2H, вариант 2

<400> 27

tgggtgtccg ccatcagtgg ctctggcgga ggctctacca ga 42

<210> 28

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2H, вариант 3

<400> 28

tgggtgtccg ccatctccgg ctccggcggc accaga 36

<210> 29

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2H, вариант 4

<400> 29

tgggtgtccc agatcaactc ctacaacggc aagacctac 39

<210> 30

<211> 69

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3H, вариант 1

<400> 30

gctagacagg gcaagacccg ggtgtacggc taccgttggc acggctatgg ctctacccac 60

gccctggat 69

<210> 31

<211> 69

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3H, вариант 2

<400> 31

gctagacagg gcaagacccg ggtgtacggc taccactggc acggctatgg ctctacccac 60

gccctggat 69

<210> 32

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCVR, вариант 1

<400> 32

gagatcgtgc tgacccagtc tcctggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagctacc 60

ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgtcc tcctcttacc tggcctggta tcagcagaag 120

cccggccagg ctccccggct gctgatctat ggcgcctctt ctagagccac cggcatcccc 180

gacagattct ccggctctgg ctctggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa 240

cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtccgact actcctaccc cttcaccttc 300

ggccagggca ccaaggtgga aatcaagcgg acc 333

<210> 33

<211> 330

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCVR, вариант 2

<400> 33

gagatcgtgc tgacccagtc ccccggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60

ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgtcc tcctcctacc tggcctggta tcagcagaag 120

cccggccagg cccctcggct gctgatctac ggcgcctctt ccagagccac cggcatccct 180

gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa 240

cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtggtcct ccgactccgt gaccttcggc 300

cagggcacca aggtggaaat caagcggacc 330

<210> 34

<211> 393

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR, вариант 1

<400> 34

gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc agctacgcca tgtcctgggt gcgacaggct 120

cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgcc atctctggct ctggcggctc tacctactac 180

gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc tagacagggc 300

aagacccggg tgtacggcta ccgttggcac ggctatggct ctacccacgc cctggattat 360

tggggccagg gcaccctcgt gaccgtgtcc tct 393

<210> 35

<211> 393

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR, вариант 2

<400> 35

gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc agctacgcca tgtcctgggt gcgacaggct 120

cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgcc atctctggct ctggcggctc tacctactac 180

gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc tagacagggc 300

aagacccggg tgtacggcta ccactggcac ggctatggct ctacccacgc cctggattat 360

tggggccagg gcaccctcgt gaccgtgtcc tct 393

<210> 36

<211> 396

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR, вариант 3

<400> 36

gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc agctacgcca tgtcctgggt gcgacaggct 120

cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgcc atcagtggct ctggcggagg ctctaccaga 180

tacgccgact ctgtgaaggg ccggttcacc atctcccggg acaactccaa gaacaccctg 240

tacctgcaga tgaactccct gcgggccgag gacaccgccg tgtactactg tgctagacag 300

ggcaagaccc gggtgtacgg ctaccactgg cacggctacg gctctaccca cgccctggat 360

tattggggcc agggcaccct cgtgaccgtg tcctct 396

<210> 37

<211> 390

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR, вариант 4

<400> 37

gaggtgcagc tgctggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60

tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacgcca tgtcctgggt gcgacaggcc 120

cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgcc atctccggct ccggcggcac cagatacgcc 180

gactctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag acagggcaag 300

acccgggtgt acggctacca ctggcacggc tacggctcca cccacgccct ggattattgg 360

ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 390

<210> 38

<211> 393

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HCVR, вариант 5

<400> 38

gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc agctacgcca tgtcctgggt gcgacaggct 120

cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgcc atctctggct ctggcggctc tacctactac 180

gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc tagacagggc 300

aagacccggg tgtacggcta ccactggcac ggctatggct ctacccacgc cctggattat 360

tggggccagg gcaccctcgt gaccgtgtcc tct 393

<---

1. Моноспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с CXCR4, содержащее:

(i) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, 16 или 19, или аминокислотную последовательность, которая отличается от указанных аминокислотных последовательностей одной или более консервативными модификациями; или

(ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17 или 18, или аминокислотную последовательность, которая отличается от указанных аминокислотных последовательностей одной или более консервативными модификациями.

2. Моноспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с CXCR4, содержащее:

(i) каркасную область вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:1, 2 и 3, и каркасную область вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 и одну из SEQ ID NO:11 или 12, или аминокислотную последовательность, которая отличается от указанных аминокислотных последовательностей одной или более консервативными модификациями; или

(ii) каркасную область вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:1, 2 и 4, и каркасную область вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:12 и одну из SEQ ID NO:8 или 9, или аминокислотную последовательность, которая отличается от указанных аминокислотных последовательностей одной или более консервативными модификациями.

3. Моноспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, где моноспецифическое антитело представляет собой сконструированное антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой сконструированный связывающий фрагмент человека.

4. Моноспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, где моноспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к изотипу IgG1.

5. Применение моноспецифического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-4 для лечения злокачественного новообразования, экспрессирующего CXCR4.

6. Способ обнаружения CXCR4-экспрессирующих злокачественных клеток у индивида-млекопитающего, где способ включает:

(i) взятие у индивида образца биопсии или текучей среды, содержащей злокачественные клетки, и использование моноспецифического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п. 3 в иммунохимическом или иммуногистохимическом анализе, которые обнаруживают экспрессию CXCR4 в злокачественных клетках, или

(ii) парентеральное введение индивиду моноспецифического антитела или его антигенсвязывающих фрагментов по п. 3, где моноспецифическое антитело или его антигенсвязывающие фрагменты дополнительно содержит радиометку, и обнаружение у индивида меченного радиометкой моноспецифического антитела или его меченного радиометкой антигенсвязывающего фрагмента с помощью иммуносцинтиграфии.

7. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественного новообразования, экспрессирующего CXCR4, содержащая терапевтически эффективное количество моноспецифического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п. 3, которое связывается с CXCR4 человека, и фармацевтически приемлемый вспомогательный агент.

8. Диагностический набор для диагностики злокачественного новообразования, экспрессирующего CXCR4, отличающийся тем, что содержит моноспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3.

9. Полинуклеотид, кодирующий моноспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3.