Способ деацетилирования биополимеров

Изобретение относится к химии биополимеров. Предложенный способ для по меньшей мере частичного деацетилирования гликозаминогликана, содержащего ацетильные группы, включает обеспечение гликозаминогликана, содержащего ацетильные группы и имеющего средневесовую молекулярную массу в диапазоне от 1 до 5 МДа. Затем проводят реакцию гликозаминогликана, содержащего ацетильные группы, с гидроксиламином (NH₂OH) или его солью при температуре 10-90°C в течение 2-200 ч с образованием по меньшей мере частично деацетилированного гликозаминогликана. После чего выделяют по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан. Полученный указанным способом гликозаминогликан характеризуется степенью ацетилирования 99% или менее и средневесовой молекулярной массой 0,5 МДа или более. Также предложены применение гидроксиламина или его соли для по меньшей мере частичного деацетилирования гликозаминогликана и способ получения гидрогелевого продукта. Изобретение направлено на деацетилирование биополимеров, содержащих N-ацетильные группы, в мягких условиях реакции для возможности осуществления последующей реакции сшивания и образования структуры геля. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 2 ил., 12 табл., 17 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области гидрогелей, содержащих сшитые полисахариды и применению таких гидрогелей в медицинских и/или косметических целях. Более конкретно, настоящее изобретение касается гидрогелей, образованных сшитыми гликозаминогликанами, в частности, сшитой гиалуроновой кислотой, хондроитином или хондроитином сульфатом.

Предшествующий уровень техники

Гели, абсорбирующие воду, или гидрогели, широко применяются в области биомедицины. В общем случае их получают химическим сшиванием полимеров с образованием бесконечной пространственной сетки. Несмотря на то что многие полисахариды абсорбируют воду вплоть до их полного растворения, сшитые гели этих же самых полисахаридов обычно могут абсорбировать определенное количество воды до момента их насыщения, т.е. они имеют конечную емкость удерживания жидкости, или степень набухания.

Гиалуроновая кислота, хондроитин и хондроитин сульфат представляют собой хорошо известные биосовместимые полимеры. Это природные полисахариды, принадлежащие к группе гликозаминогликанов (ГАГ). Все ГАГ представляют собой отрицательно заряженные гетерополисахаридные цепи, способные абсорбировать большое количество воды.

Гиалуроновая кислота (ГК) представляет собой один из наиболее широко применяемых биосовместимых полимеров в медицинских и косметических целях. ГК представляет собой природный полисахарид, принадлежащий к группе гликозаминогликанов (ГАГ). Гиалуроновая кислота и продукты, образованные из гиалуроновой кислоты, широко применяются в области биомедицины и косметологии, например в вискохирургии и в качестве дермального филлера.

Хондроитин сульфат (ХС) представляет собой широко распространенный ГАГ, который встречается в соединительных тканях млекопитающих, где он, совместно с другими сульфатированными ГАГ, связан с белками как часть протеогликанов. Ранее было показано, что гидрогели, содержащие ХС, можно с успехом применять в биомедицинских целях, благодаря их сходству с природным внеклеточным матриксом (Lauder, R.M., Complement Ther Med 17: 56-62, 2009).

Хондроитин сульфат также применяется в лечении остеоартрита, например в качестве пищевой добавки.

Сшивание гликозаминогликанов пролонгирует действие деградируемых полимеров, которые образуют сетку, что полезно при многих видах применения. Тем не менее, сшивание может также снижать нативные свойства гликозаминогликанов. Поэтому, как правило, стремятся сохранить низкую степень модификации за счет эффективного сшивания, с тем чтобы сохранить нативные свойства и эффекты самого гликозаминогликана.

Сущность изобретения

Цель настоящего изобретения - предложить гидрогель, содержащий гликозаминогликан (ГАГ) в качестве набухающего полимера.

Еще одна цель настоящего изобретения - предложить способ для сшивания молекул ГАГ, с получением в результате гидрогелевого продукта, полностью на основе структур углеводной природы.

Также цель настоящего изобретения - предложить способ получения гидрогелей молекул ГАГ мягкими и эффективными путями.

Также цель настоящего изобретения - предложить способ по меньшей мере для частичного деацетилирования биополимера, включающего N-ацетильные группы, мягкими и эффективными путями.

Согласно аспектам, подробно изложенным в данном документе, предложен способ по меньшей мере для частичного деацетилирования биополимера, содержащего ацетильные группы, включающий:

а1) обеспечение биополимера, включающего ацетильные группы;

а2) проведение реакции биополимера, включающего ацетильные группы, с гидроксиламином (NH₂OH) или его солью при температуре 100°С или менее в течение 2-200 часов с образованием по меньшей мере частично деацетилированного биополимера; и

а3) выделение по меньшей мере частично деацетилированного биополимера.

Термин "биополимер" в настоящем документе обозначает полимеры, продуцируемые живыми организмами. Биополимеры подразделяются на три основных класса: полинуклеотиды, полипептиды и полисахариды.

Настоящее изобретение основано на изобретательском осознании того, что гидроксиламин (NH₂OH) и его соли можно с преимуществом применять для деацетилирования биополимеров, включающих N-ацетильные группы, в мягких реакционных условиях. Таким образом, в соответствии с воплощениями, указанный биополимер включает N-ацетильные группы, а по меньшей мере частично деацетилированный биополимер, образованный на стадии а2), представляет собой по меньшей мере частично N-деацетилированный биополимер.

Под термином "по меньшей мере частично деацетилированный" по отношению к биополимеру в настоящем документе подразумевают, что по меньшей мере некоторые из N-ацетильных групп биополимера, включающего N-ацетильные группы, отщепляются, что приводит к образованию свободных аминогрупп в биополимере. Под термином "по меньшей мере частично деацетилированный" в настоящем документе подразумевают, что существенная часть N-ацетильных групп биополимера, в частности по меньшей мере 1%, предпочтительно по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5% N-ацетильных групп биополимера, превращена в свободные аминогруппы.

Под термином "по меньшей мере частично деацетилированный" в отношении биополимера в настоящем документе подразумевают биополимер, включающий N-ацетильные группы, в котором по меньшей мере некоторые из N-ацетильных групп были отщеплены, что привело к образованию свободных аминогрупп в биополимере. Под термином "по меньшей мере частично деацетилированный" в настоящем документе подразумевают, что значительная часть N-ацетильных групп биополимера, в частности по меньшей мере 1%, предпочтительно по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5% N-ацетильных групп биополимера, была превращена в свободные аминогруппы.

Деацетилированные биополимеры включают свободные аминогруппы, и эти биополимеры могут быть полезны для различных видов применения, например для реакций сшивания, конъюгирования или привитой сополимеризации, для которых требуется присутствие свободных аминогрупп. В частности, деацетилированные биополимеры, например деацетилированные гликозаминогликаны, могут быть полезны для получения сшитых биополимеров, таких как сшитые гликозаминогликаны, без применения дополнительных сшивающих агентов, которые могу уменьшить нативные свойства гликозаминогликанов. Иными словами, деацетилированные биополимеры можно применять для получения сшитых биополимеров, полностью основанных на структуре биополимера, без дополнительных сшивающих агентов, не являющихся биополимером.

Способ деацетилирования по изобретению включает реакцию гидроксиламинолиза. Было обнаружено, что применение гидроксиламина или его солей для деацетилирования позволяет проводить N-деацетилирование в мягких условиях, что приводит лишь к небольшому разрушению основной полимерной цепи чувствительных полисахаридов, таких как ГК. Таким образом, применение гидроксиламина или его соли для деацетилирования позволяет получить деацетилированный ГК с сохраненным высоким молекулярным весом. В этом состоит отличие от ранее известных способов, таких как деацетилирование с помощью гидразина или NaOH в качестве деацетилирующего агента, при котором высокая степень деацетилирования неизбежно сопровождается серьезным разрушением полимерной основной цепи.

Стадия выделения по меньшей мере частично деацетилированного биополимера может включать просто хранение или применение деацетилированного биополимера в том виде, как он был получен. Стадия выделения по меньшей мере частично деацетилированного биополимера может также включать любую дополнительную обработку деацетилированного биополимера, включая, без ограничения, промывку и очистку.

Указанный биополимер может представлять собой модифицированный, например разветвленный или сшитый биополимер. По некоторым воплощениям, такой биополимер представляет собой сшитый биополимер. По некоторым конкретным воплощениям, такой биополимер представляет собой биополимерный гель. Указанный биополимер может, например, переставлять собой гель гиалуроновой кислоты, сшитой с помощью 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (БДДЭ).

По некоторым воплощениям, биополимер, включающий ацетильные группы, использованный в качестве исходного вещества в способе деацетилирования, представляет собой полисахарид. По некоторым воплощениям, биополимер, включающий ацетильные группы, представляет собой гликозаминогликан. По некоторым воплощениям, биополимер, включающий ацетильные группы, выбран из группы, состоящей из сульфатированных или не-сульфатированных гликозаминогликанов, таких как гиалуронан, хондроитин, хондроитин сульфат, гепаран сульфат, гепаросан, гепарин, дерматан сульфат и кератан сульфат, предпочтительно гиалуроновая кислота, хондроитин и хондроитин сульфат, а также их смесей. По некоторым воплощениям, биополимер, включающий ацетильные группы, представляет собой гиалуроновую кислоту.

Гиалуроновая кислота представляет собой один из наиболее широко применяемых биосовместимых полимеров в медицинских целях. Гиалуроновая кислота и другие ГАГ представляют собой отрицательно заряженные гетерополисахаридные цепи, обладающие способностью абсорбировать большое количество воды. Гиалуроновая кислота и продукты, полученные из гиалуроновой кислоты, широко применяются в области биомедицины и косметологии, например в вискохирургии и в качестве дермального филлера.

Гели, абсорбирующие воду, или гидрогели, широко применяются в области биомедицины. Их обычно получают химическим сшиванием полимеров с образованием бесконечной пространственной сетки. Несмотря на то что нативная гиалуроновая кислота и некоторые сшитые продукты гиалуроновой кислоты абсорбируют воду вплоть до полного растворения, гели сшитой гиалуроновой кислоты обычно абсорбируют определенное количество воды до момента их насыщения, т.е. они имеют конечную емкость удерживания жидкости, или степень набухания.

Поскольку гиалуроновая кислота с идентичной химической структурой, если не принимать во внимание молекулярную массу, присутствует в большинстве живых организмов, она дает минимальные реакции на чужеродные тела и дает возможность расширенного медицинского применения. Сшивание и/или другие модификации молекулы гиалуроновой кислоты обычно необходимы для улучшения ее продолжительности действия in vivo. Кроме того, такие модификации влияют на емкость удерживания жидкости молекулой гиалуроновой кислоты. Как следствие, гиалуроновая кислота являлется объектом для множества попыток осуществления модификаций.

В предпочтительных воплощениях гликозаминогликан представляет собой нативный гликозаминогликан. Гликозаминогликан, применяемый по настоящему изобретению, представляет собой предпочтительно природный гликозаминогликан. Такой гликозаминогликан предпочтительно применяется в своем нативном состоянии, т.е. химическая структура гликозаминогликана предпочтительно не подвергается изменению или модификации при введении функциональных групп и т.п. Применение гликозаминогликана в его нативном состоянии предпочтительно, поскольку это обеспечивает сшитую структуру, более сходную с природной молекулой, которая сохраняет нативные свойства и эффекты самого гликозаминогликана, и может свести к минимуму иммунную реакцию при введении в организм сшитого гликозаминогликана.

Полисахариды, в частности гликозаминогликаны, такие как гиалуроновая кислота, хондроитин и хондроитин сульфат, часто склонны к деградации основной цепи в жестких реакционных условиях (например очень высокий или низкий рН, или высокая температура). Поэтому способ по изобретению особенно полезен для деацетилирования таких полисахаридов.

Способ деацетилирования по изобретению полезен для получения по меньшей мере частично деацетилированных биополимеров, в которых значительная часть молекулярного веса исходного вещества сохранена.

По некоторым воплощениям, средневесовая молекулярная масса выделенного по меньшей мере частично деацетилированного биополимера составляет по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 25% от средневесовой молекулярной массы биополимера, включающего ацетильные группы, на стадии а1). Средневесовая молекулярная масса выделенного по меньшей мере частично деацетилированного биополимера также может быть и больше, например по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от средневесовой молекулярной массы биополимера, включающего ацетильные группы на стадии а1).

По некоторым воплощениям, биополимер, включающий ацетильные группы, имеет средневесовую молекулярную массу по меньшей мере 10 кДа. По некоторым воплощениям, биополимер, включающий ацетильные группы, имеет средневесовую молекулярную массу по меньшей мере 100 кДа, по меньшей мере 500 кДа, по меньшей мере 750 кДа или по меньшей мере 1 МДа. По некоторым воплощениям, биополимер, включающий ацетильные группы, имеет средневесовую молекулярную массу в диапазоне 1-5 МДа, предпочтительно в диапазоне 2-4 МДа.

По некоторым воплощениям, выделенный по меньшей мере частично деацетилированный биополимер имеет средневесовую молекулярную массу по меньшей мере 10 кДа. По некоторым воплощениям, выделенный по меньшей мере частично деацетилированный биополимер имеет средневесовую молекулярную массу по меньшей мере 100 кДа, по меньшей мере 500 кДа, по меньшей мере 750 кДа или по меньшей мере 1 МДа. По некоторым воплощениям, выделенный биополимер, включающий ацетильные группы, имеет средневесовую молекулярную массу в диапазоне 0,1-5 МДа, предпочтительно в диапазоне 0,5-5 МДа или 0,5-3 МДа.

Способ деацетилирования по настоящему изобретению применим также для более коротких биополимеров, или биоолигомеров, таких как димеры, тримеры, тетрамеры и т.п.

По некоторым воплощениям, биополимер, включающий ацетильные группы, представляет собой олигобиополимер, имеющий средневесовую молекулярную массу в диапазоне 0,3-10 кДа.

По некоторым воплощениям, выделенный по меньшей мере частично деацетилированный олигобиополимер имеет средневесовую молекулярную массу в диапазоне 0,3-10 кДа.

Биополимер, включающий ацетильные группы, применяемый в качестве исходного вещества при способе деацетилирования, обычно полностью или почти полностью ацетилирован. Под термином "полностью ацетилированный" по отношению к биополимеру в настоящем документе подразумевают биополимер, в котором все, или по существу все свободные аминогруппы были превращены в N-ацетильные группы. Иными словами, термин "полностью ацетилированный" биополимер не включает или по существу не включает свободные аминогруппы. По некоторым воплощениям, биополимер, включающий ацетильные группы, применяемый в качестве исходного вещества на стадии а1), имеет степень ацетилирования в диапазоне 98-100%.

По некоторым воплощениям, выделенный по меньшей мере частично деацетилированный биополимер имеет степень ацетилирования по меньшей мере на 1% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 2% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 3% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 4% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 5% меньше, по сравнению с биополимером, включающим ацетильные группы, на стадии а1). Иными словами, выделенный по меньшей мере частично деацетилированный биополимер может иметь степень ацетилирования менее чем 99%, предпочтительно менее чем 98%, менее чем 97%, менее чем 97%, менее чем 96%, менее чем 95%, менее чем 94% или менее чем 93%. Выделенный по меньшей мере частично деацетилированный биополимер может также иметь степень ацетилирования по меньшей мере на 10% меньше, по меньшей мере на 15% меньше, по меньшей мере на 20% меньше, по меньшей мере на 30% меньше, по меньшей мере на 40% меньше, или по меньшей мере на 50% меньше, по сравнению с биополимером, включающим ацетильные группы, на стадии а1). В предпочтительном воплощении такой по меньшей мере частично деацетилированный биополимер имеет степень ацетилирования менее чем 97%.

Деацетилирование можно осуществлять с помощью гидроксиламина или его соли. Соль гидроксиламина обозначает соль, образованную гидроксиламином и кислотой. Соль гидроксиламина может, например, представлять собой соль, образованную гидроксиламином и кислотой, выбранной из группы, состоящей из минеральных кислот и органических кислот или их смесей.

В соответствии с воплощениями, соль гидроксиламина представляет собой соль, образованную гидроксиламином и минеральной кислотой. В соответствии с воплощениями, такая кислота выбрана из группы, состоящей из серной кислоты, хлороводородной кислоты, иодоводородной кислоты, бромоводородной кислоты и фосфорной кислоты, а также их комбинаций. Предпочтительные минеральные кислоты включают хлороводородную кислоту, иодоводородную кислоту и бромоводородную кислоту. Особо предпочтительная минеральная кислота представляет собой иодоводородную кислоту.

В соответствии с воплощениями, соль гидроксиламина представляет собой соль, образованную гидроксиламином и органической кислотой. В соответствии с воплощениями, такая кислота выбрана из группы, состоящей из уксусной кислоты, пропионовой кислоты, пивалевой кислоты, лимонной кислоты, щавелевой кислоты, малоновой кислоты, молочной кислоты, бензойной кислоты, и галогенированных карбоновых кислот, таких как трифторуксусная кислота (ТФУ) и трихлоруксусная кислота, а также их комбинаций.

В соответствии с воплощениями, такая кислота выбрана из группы, состоящей из уксусной кислоты, пропионовой кислоты, пивалевой кислоты и галогенированной карбоновой кислоты, предпочтительно трифторуксусной кислоты, а также их комбинаций. В соответствии с воплощениями, такая кислота представляет собой галогенированную карбоновую кислоту, предпочтительно трифторуксусную кислоту.

В соответствии с воплощениями, соль гидроксиламина представляет собой соль, образованную гидроксиламином и кислотой, выбранной из группы, состоящей из хлороводородной кислоты, иодоводородной кислоты и бромоводородной кислоты, пропионовой кислоты, пивалевой кислоты и трифторуксусной кислоты, предпочтительно иодоводородной кислоты или трифторуксусной кислоты.

Реакцию на стадии а2 предпочтительно проводят в растворителе, способном по меньшей мере частично растворить как биополимер, включающий ацетильные группы, так и гидроксиламин или его соль. Такой растворитель может представлять собой, например, воду или органический растворитель или их смесь. Неограничивающие примеры предпочтительных растворителей включают воду или смесь воды и низшего спирта, такого как этанол. Тем не менее, можно использовать и другие растворители, в зависимости от конкретной молекулы, включающей амидные группы, которые нужно расщепить, и выбора гидроксиламина или его соли. Одним примером полезного органического растворителя является тетрагидрофуран (ТГФ).

В соответствии с воплощениями, реакция на стадии а2) включает проведение реакции молекулы, включающей амидную группу, с гидроксиламином в воде.

Процесс деацетилирования можно предпочтительно осуществлять в воде или водном растворе, возможно, дополнительно включающем другой растворитель, такой как этанол. Таким образом, по некоторым воплощениям, стадия а1) включает введение в контакт биополимера, включающего ацетильные группы, с гидроксиламином в воде таким образом, что образуется водная смесь или раствор биополимера и гидроксиламина. В некоторых воплощениях концентрация гидроксиламина составляет по меньшей мере 10 мас. %, предпочтительно по меньшей мере 20 мас. %, предпочтительно по меньшей мере 30 мас. % от массы водной смеси или раствора. Более высокая концентрация гидроксиламина может повысить скорость реакции.

Гидроксиламин часто обеспечивают в форме водного раствора, обычно с концентрацией 50 мас. %. В некоторых воплощениях указанный биополимер можно смешивать и растворять непосредственно в водном растворе гидроксиламина или его соли, возможно, разбавленном. Как вариант, твердую соль гидроксиламина, например гидроксиламин гидрохлорид или гидроксиламин сульфат, можно растворять в водном растворе биополимера. Внесение соли гидроксиламина и превращение этой соли в гидроксиламин можно проводить в качестве альтернативы или дополнения к растворению биополимера, включающего ацетильные группы, в водном растворе гидроксиламина.

Молярная концентрация гидроксиламина в реакционной смеси составляет предпочтительно в диапазоне 5-20 М. Например, концентрация гидроксиламина 50 мас. % приблизительно соответствует молярной концентрации 16 М.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что если использовать соль гидроксиламина вместо самого гидроксиламина, можно достичь той же скорости реакции при значительно более низкой молярной концентрации. Таким образом, молярная концентрация соли гидроксиламина в реакционной смеси находится предпочтительно в диапазоне 0,01-10 М, предпочтительно в диапазоне 0,1-5 М.

По некоторым воплощениям, биополимер, включающий ацетильные группы, растворяют в водном растворе гидроксиламина или его соли на стадии а1). По некоторым воплощениям, соль гидроксиламина растворяют в водном растворе биополимера, включающего ацетильные группы, на стадии а1). По некоторым воплощениям, биополимер, включающий ацетильные группы, растворяют в водном растворе гидроксиламина, и соль гидроксиламина растворяют в водном растворе биополимера, включающего ацетильные группы, в гидроксиламине.

В соответствии с воплощениями, температура реакции на стадии а2) составляет 100°С или менее. Температуру реакции на стадии а2) предпочтительно выбирают таким образом, чтобы не вызвать избыточную деградацию биополимера. По некоторым воплощениям, температура на стадии а2) находится в диапазоне 10-90°С, предпочтительно 20-80°С, предпочтительно 30-70°С, предпочтительно 30-50°С. В соответствии с воплощениями, реакция на стадии а2) включает проведение реакции молекулы, включающей амидную группу, с гидроксиламином или его солью при температуре в диапазоне 10-100°С, предпочтительно 20-90°С, предпочтительно 30-70°С, предпочтительно 30-50°С.Температура может, например, находиться в диапазоне 70-90°С, например около 80°С, или в диапазоне 30-50°С, например около 40°С.

Время реакции на стадии а2) зависит от желаемой степени деацетилирования. Время реакции предпочтительно выбирают таким образом, чтобы не вызвать избыточной деградации биополимера, и оно также зависит от температуры и рН. Время реакции может в общем случае составлять от 5 мин до 200 ч или более. По некоторым воплощениям, реакция на стадии а2) включает проведение реакции молекулы, включающей амидную группу, с гидроксиламином или его солью в течение 2-200 ч. По некоторым воплощениям, реакция на стадии а2) включает проведение реакции молекулы, включающей амидную группу, с гидроксиламином или его солью в течение 2-150 ч, предпочтительно 5-150 ч, предпочтительно 5-100 ч. В других воплощениях, например если используют более высокие температуру или рН, время реакции может быть намного меньше, например в диапазоне от 5 мин до 2 ч, в диапазоне от 30 мин до 2 ч или в диапазоне 1-2 ч.

Значение рН на стадии а2) предпочтительно выбирают таким образом, чтобы не вызвать избыточную деградацию биополимера. По некоторым воплощениям, реакцию на стадии а2) проводят при значении рН в диапазоне 4-12. По некоторым воплощениям реакцию на стадии а2) проводят при значении рН в диапазоне 9-11. По некоторым воплощениям реакцию на стадии а2) проводят при значении рН в диапазоне 4-9, предпочтительно в диапазоне 6-9, предпочтительно в диапазоне 6-8 или 7-8. Более низкое значение рН обычно более предпочтительно во избежание деградации биополимера.

Авторы изобретения в ходе обширных экспериментов обнаружили, что добавление рН-снижающего агента может значительно повысить скорость реакции на стадии а2), в частности если используют гидроксиламин. Этот эффект оказался как неожиданным, так и чрезвычайно полезным. Следует отметить, что соответствующее внесение рН-снижающего агента в реакцию деацетилирования гидразином не приводило к увеличению скорости реакции. Более низкое значение рН в ходе реакции также предпочтительно во избежание избыточной деградации биополимера. Таким образом, по некоторым воплощениям рН реакции снижено до значения в диапазоне 4-9, предпочтительно в диапазоне 6-9 предпочтительно в диапазоне 6-8 или 7-8, добавлением рН-снижающего агента. рН-снижающий агент можно выбирать, например, из группы, состоящей из минеральных кислот, органических кислот и рН-снижающих солей, а также их комбинаций. В предпочтительном воплощении рН-снижающий агент включает гидроксиламин гидрохлорид или гидроксиламин сульфат, предпочтительно гидроксиламин гидрохлорид.

По некоторым воплощениям реакцию на стадии а2) проводят в инертной атмосфере и/или в темноте.

Продукты, полученные способом деацетилирования, описанным выше, могут обладать свойствами, которые значительно отличаются от соответствующих продуктов, полученных другими известными способами деацетилирования. Согласно другим аспектам, подробно представленным в данном документе, предложен по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан, полученный описанным выше способом. Частично деацетилированный гликозаминогликан, полученный вышеописанным способом, характеризуется сочетанием пониженной степени ацетилирования и сохраненной высокой средневесовой молекулярной массой. Такое сочетание значительной степени деацетилирования и сохраненной высокой средневесовой молекулярной массы нельзя было получить способами предшествующего уровня техники для химического деацетилирования.

Согласно другим аспектам, подробно изложенным в настоящем документе, предложен деацетилированный гликозаминогликан со степенью ацетилирования 99% или менее, предпочтительно 98% или менее, предпочтительно 97% или менее, предпочтительно 96% или менее, и средневесовой молекулярной массой 0,1 МДа или более, предпочтительно 0,3 МДа или более, предпочтительно 0,5 МДа или более.

Настоящее изобретение основано на изобретательском осознании того, что гидроксиламин (NH₂OH) или его соли можно эффективно применять для деацетилирования биополимера, включающего N-ацетильные группы, в мягких реакционных условиях. Таким образом, согласно другим аспектам, подробно изложенным в настоящем документе, предложено применение гидроксиламина или его соли по меньшей мере для частичного деацетилирования биополимера, включающего ацетильные группы. Такое применение можно дополнительно охарактеризовать, как описано выше, в отношении способа деацетилирования.

Согласно другим аспектам, подробно изложенным в настоящем документе, предложен способ получения гидрогелевого продукта, включающего сшитые молекулы гликозаминогликана, включающий следующие стадии:

a) обеспечение раствора, включающего по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан и, возможно, второй гликозаминогликан;

b) активация карбоксильных групп на по меньшей мере частично деацетилированном гликозаминогликане и/или, возможно, втором гликозаминогликане с помощью сшивающего агента, с образованием активированных гликозаминогликанов;

c) сшивание активированных гликозаминогликанов посредством их активированных карбоксильных групп с помощью аминогрупп по меньшей мере частично деацетилированных гликозаминогликанов с получением гликозаминогликанов, сшитых амидными связями.

По некоторым воплощениям, указанный по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, представляет собой деацетилированный гликозаминогликан со степенью ацетилирования 99% или менее, предпочтительно 98% или менее, предпочтительно 97% или менее, предпочтительно 96% или менее, и средневесовой молекулярной массой 0,1 МДа или более, предпочтительно 0,3 МДа или более, предпочтительно 0,5 МДа или более. По некоторым воплощениям, указанный по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, получен способами деацетилирования, описанными выше.

По некоторым воплощениям, указанный по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, представляет собой деацетилированный гликозаминогликан, выбранный из группы, состоящей из деацетилированной гиалуроновой кислоты, деацетилированного хондроитина и деацетилированного хондроитина сульфата, а также их смесей. Предпочтительно указанный по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, представляет собой деацетилированную гиалуроновую кислоту.

По некоторым воплощениям возможный второй гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, представляет собой гликозаминогликан, выбранный из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, хондроитина и хондроитина сульфата, а также их смесей. Предпочтительно возможный второй гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, представляет собой гиалуроновую кислоту.

Способ получения гидрогелевого продукта включает сшивание молекул гликозаминогликана ковалентными связями, предпочтительно амидными связями, обычно с помощью активирующего агента для карбоксильных групп на основной цепи молекулы гликозаминогликана и аминогрупп по меньшей мере частично деацетилированного гликозаминогликана. Сшивание согласно способу по изобретению можно осуществлять мягкими и эффективными путями, которые дают высокий выход и вызывают минимальную деградацию молекул гликозаминогликана.

Сшивание гликозаминогликанов непосредственно через образование амидных связей между амино- и карбоксильными группами, присутствующими на гликозаминогликанах, обеспечивает гидрогелевый продукт, полностью на основе структур углеводной природы. Это минимизирует влияние сшивания на нативные свойства гликозаминогликанов.

В некоторых воплощения стадию активации b) и стадию сшивания с) проводят одновременно. В других воплощениях стадию активации b) проводят до и отдельно от стадии сшивания с).

В предпочтительном воплощении данный способ дополнительно включает обеспечение частиц сшитых гликозаминогликанов со средним размером в диапазоне 0,01-5 мм, предпочтительно 0,1-0,8 мм.

В одном предпочтительном воплощении сшивающий агент на стадии b) представляет собой сшивающий агент для пептидного синтеза. Такой сшивающий агент для пептидного синтеза можно выбирать из группы, состоящей из сшивающих агентов на основе триазина, карбодиимидных сшивающих агентов, сшивающих агентов - производных имидазолия, этил(гидроксиимино)цианоацетат (Oxyma, от англ. ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate) и (1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламиноморфолинокарбений гексафторфосфат (COMU, от англ. (1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy)dimethylarninornorpholinocarbenium hexafluorophosphate). Предпочтительный сшивающий агент для пептидного синтеза, представляет собой сшивающий агент на основе триазина, включающий группу, состоящую из 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (DMTMM, от англ. 4-(4,6-dimetoxy-1,3,5-triasin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride) и 2-хлор-4,б-диметокси-1,3,5-триазина (CDMT, от англ. 2-chloro-4,6-dimetoxy-1,3,5-triasine), предпочтительно DMTMM. Другой предпочтительный сшивающий агент для пептидного синтеза представляет собой карбодиимидный сшивающий агент, предпочтительно N-(3-диметиламинопропил-N'-этилкарбодиимид (EDC, от англ. N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide) в комбинации с N-гидроксисукцинимидом (NHS, от англ. N-hydroxysuccinimide). Другой предпочтительный сшивающий агент для пептидного синтеза представляет собой 2-хлор-1-метилпиридиний иодид (CMPI, от англ. 2-chloro-1-methylpyridinium iodide).

Согласно другим аспектам, подробно изложенным в настоящем документе, предложен гидрогелевый продукт, полученный способом по изобретению.

Согласно родственным аспектам, настоящим изобретением также предложено применение гидрогелевого продукта в качестве лекарственного средства, например в лечении расстройств мягких тканей. Предложен способ лечения пациента, страдающего расстройством мягких тканей, путем введения такому пациенту терапевтически эффективного количества указанного гидрогелевого продукта. Предложен также способ проведения корректирующего или эстетического лечения пациента путем введения такому пациенту терапевтически эффективного количества указанного гидрогелевого продукта.

Согласно другим аспектам, подробно изложенным в настоящем документе, предложен гидрогелевый продукт, полученный способом по изобретению, для применения в качестве лекарственного средства.

Согласно другим аспектам, подробно изложенным в настоящем документе, предложен гидрогелевый продукт, полученный способом по изобретению, для применения в лечении расстройств мягких тканей.

Согласно другим аспектам, подробно изложенным в настоящем документе, предложено применение гидрогелевого продукта, полученного способом по изобретению, для изготовления лекарственного средства для лечения расстройств мягких тканей.

Согласно другим аспектам, подробно изложенным в настоящем документе, предложен способ лечения пациента, страдающего расстройством мягких тканей, путем введения такому пациенту терапевтически эффективного количества гидрогелевого продукта, полученного способом по изобретению.

Согласно другим аспектам, подробно изложенным в настоящем документе, предложен способ проведения корректирующего или эстетического лечения пациента путем введения такому пациенту терапевтически эффективного количества гидрогелевого продукта, полученного способом по изобретению.

Согласно другим аспектам, подробно изложенным в настоящем документе, предложен способ косметического лечения кожи, включающий введение в кожу гидрогелевого продукта, полученного способом по изобретению.

Другие аспекты и предпочтительные воплощения настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения и приложенной формулы изобретения.

Краткое описание фигур

На Фиг. 1 представлена схема реакции, показывающая образование сшитой гиалуроновой кислоты, включающая: 1) деацетилирование гиалуроновой кислоты с образованием частично деацетилированной гиалуроновой кислоты; 2) сшивание частично деацетилированной гиалуроновой кислоты за счет образования амидных связей; и 3) повторное ацетилирование свободных аминогрупп и щелочной гидролиз сложноэфирных связей, образовавшихся в ходе сшивания и повторного ацетилирования.

На Фиг. 2 представлена схема реакции, показывающая образование сшитой гиалуроновой кислоты, включающая: 1) деацетилирование гиалуроновой кислоты с образованием частично деацетилированной гиалуроновой кислоты; 2) сшивание частично деацетилированной гиалуроновой кислоты с не-деацетилированной гиалуроновой кислоты за счет образования амидных связей; и 3) повторное ацетилирование свободных аминогрупп и щелочной гидролиз сложноэфирных связей, образовавшихся в ходе сшивания и повторного ацетилирования.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает эффективный способ получения гидрогелей, образованных сшитыми молекулами гликозаминогликана (ГАГ), получаемые таким способом гидрогелевые продукты и способы их применения. ГАГ представляют собой отрицательно заряженные гетерополисахаридные цепи, способные абсорбировать большое количество воды. В гидрогелевых продуктах по настоящему изобретению молекула сшитого ГАГ представляет собой набухающий полимер, обеспечивающий свойства геля. Описанный в данном документе способ получения является мягким по отношению к молекуле ГАГ, но обеспечивает эффективное сшивание.

Предложенный способ получения гидрогелевого продукта, включающего сшитые молекулы гликозаминогликана, включает следующие стадии:

a) обеспечение раствора, включающего по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан, и, возможно, второй гликозаминогликан;

b) активация карбоксильных групп на по меньшей мере частично деацетилированном гликозаминогликане и/или возможном втором гликозаминогликане с помощью сшивающего агента, с образованием активированных гликозаминогликанов;

c) сшивание активированных гликозаминогликанов посредством их активированных карбоксильных групп с помощью аминогрупп по меньшей мере частично деацетилированных гликозаминогликанов с получением гликозаминогликанов, сшитых амидными связями; и, возможно, стадии:

d) ацилирование остаточных аминогрупп сшитых гликозаминогликанов, полученных на стадии с), с образованием ацилированных сшитых гликозаминогликанов;

и/или

e) щелочная обработка сшитых гликозаминогликанов, полученных на стадии с) или d), для гидролиза сложноэфирных перекрестных связей, образовавшихся как побочные продукты в ходе амидного сшивания на стадии с).

Обсуждаемые в настоящем документе гидрогелевые продукты получены амидным сочетанием молекул гликозаминогликана. Амидное сочетание с применением сшивающего агента с двумя или несколькими функциональными аминогруппами совместно со сшивающим агентом представляет собой привлекательный путь получения сшитых молекул гликозаминогликана, полезных для гидрогелевых продуктов. Сшивание можно осуществлять с помощью сшивающего агента не-углеводной природы с двумя или несколькими нуклеофильными центрами, такого как гексаметилендиамин (HMDA, от англ. hexamethylenediamine), или сшивающего агента углеводной природы с двумя или несколькими нуклеофильными центрами, такого как диаминотетралоза (DATH, от англ. diaminotrehalose) совместно с гликозаминогликаном. Сшивание можно также осуществлять с помощью по меньшей мере частично деацетилированного гликозаминогликана, либо его одного, либо в сочетании со вторым гликозаминогликаном, при этом сам деацетилированный гликозаминогликан выступает в качестве сшивающего агента с двумя или несколькими нуклеофильными центрами.

Таким образом, настоящее изобретение предлагает гидрогели молекул ГАГ, полученные сшиванием в водной среде с помощью сшивающего агента, включающего по меньшей мере две нуклеофильные функциональные группы, например аминогруппы, способные образовывать ковалентные связи непосредственно с карбоксильными группами молекул ГАГ в реакции, включающей применение сшивающего агента.

Сшивающий агент, включающий по меньшей мере две нуклеофильные функциональные группы, может представлять собой, например, сшивающий агент не-углеводной природы с двумя или несколькими нуклеофильными центрами или сшивающий агент углеводной природы с двумя или несколькими нуклеофильными центрами.

Сшивающие агенты углеводной природы с двумя или несколькими нуклеофильными центрами предпочтительны, поскольку они обеспечивают гидрогелевый продукт полностью на основе структур углеводной природы или на основе их производных, что минимизирует нарушение нативных свойств гликозаминогликанов из-за сшивания. Сшивающий агент сам по себе также может вносить свой вклад в сохранение или нарастание свойств гидрогеля, например, если проводят сшивание со структурой, которая коррелирует с гиалуроновой кислотой, или если проводят сшивание со структурой, обладающей высокой способностью удерживать воду.

Сшивающий агент углеводной природы с двумя или несколькими нуклеофильными центрами можно выбирать, например из группы, состоящей из ди-, три-, тетра-, олигосахаридов и полисахаридов с двумя или несколькими нуклеофильными функциональными центрами.

В предпочтительном воплощении такой сшивающий агент с двумя или несколькими нуклеофильными центрами представляет собой по меньшей мере частично деацетилированный полисахарид, т.е. ацетилированный полисахарид, который был по меньшей мере частично деацетилирован с получением полисахарида, содержащего свободные аминогруппы. По меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан может быть сшитым либо сам по себе, либо в сочетании со вторым гликозаминогликаном, при этом указанный деацетилированный гликозаминогликан сам выступает сшивающим агентом с двумя или несколькими нуклеофильными центрами.

В предпочтительном воплощении сшитый ГАГ получен путем:

1) сшивания по меньшей мере частично деацетилированного ГАГ с частично деацетилированным ГАГ с помощью свободных аминогрупп и карбоксильных групп, присутствующих в указанных по меньшей мере частично деацетилированных ГАГ, как показано на Фиг. 1; или

2) сшивания по меньшей мере частично деацетилированного ГАГ с не-деацетилированным ГАГ с помощью свободных аминогрупп, присутствующих в указанном по меньшей мере частично деацетилированном ГАГ, и карбоксильных групп, присутствующих в ГАГ, как показано на Фиг. 2.

По некоторым воплощениям такой гликозаминогликан выбран из группы, состоящей из сульфатированных или не-сульфатированных гликозаминогликанов таких как гиалуронан, хондроитин, хондроитин сульфат, гепаран сульфат, гепаросан, гепарин, дерматан сульфат и кератан сульфат. По некоторым воплощениям указанный гликозаминогликан выбран из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, хондроитина и хондроитина сульфата, а также их смесей. По некоторым воплощениям такой гликозаминогликан представляет собой гиалуроновую кислоту.

Гиалуроновая кислота (ГК) представляет собой один из наиболее широко применяемых биосовместимых полимеров для медицинского и косметического применения. ГК представляет собой природный полисахарид, принадлежащий к группе гликозаминогликанов (ГАГ). Гиалуроновая кислота состоит из двух чередующихся моносахаридных единиц, D-N-ацетилглюкозамины и D-глюкуроновой кислоты , соединенных β(1→3) и β(1→4) гликозидными связями, соответственно. Гиалуроновая кислота и продукты-производные гиалуроновой кислоты широко применяются в области биомедицины и косметологии, например при вискохирургии и в качестве дермального филлера.

Если не указано иное, термин "гиалуроновая кислота" охватывает все варианты и комбинации вариантов гиалуроновой кислоты, гиалуронат или гиалуронан, с различными длиной цепи и зарядовыми состояниями, а также с различными химическими модификациями. Иными словами, этот термин также охватывает различные гиалуронатные соли гиалуроновой кислоты с различными противоионами, такие как гиалуронат натрия. Гиалуроновую кислоту можно получать из различных источников животного и не-животного происхождения. Источники не-животного происхождения включают дрожжи и, предпочтительно, бактерии. Молекулярная масса одной молекулы гиалуроновой кислоты обычно находится в диапазоне 0,1-10 МДа, но возможны и другие молекулярные веса.

Термин "хондроитин" обозначает ГАГ, содержащий дисахаридное повторяющееся звено, состоящее из чередующихся фрагментов несульфатированной D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-галактозамина. Во избежание неясности, термин "хондроитин" не включает какую-либо форму хондроитина сульфата.

Термин "хондроитин сульфат" обозначает ГАГ, содержащий дисахаридное повторяющееся звено, состоящее из чередующихся фрагментов D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-галактозамина. Сульфатный фрагмент может присутствовать в различных положениях. Предпочтительная молекула хондроитина сульфата представляет собой хондроитин-4-сульфат и хондроитин-6-сульфат.

Молекулу хондроитина можно получить из различных источников животного и не-животного происхождения. Источники не-животного происхождения включают дрожжи и, предпочтительно, бактерии. Молекулярная масса одной молекулы хондроитина обычно находится в диапазоне 1-500 кДа, но возможны и другие молекулярные массы.

По некоторым воплощениям указанный по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, представляет собой деацетилированный гликозаминогликан со степенью ацетилирования 99% или менее, предпочтительно 98% или менее, предпочтительно 97% или менее, предпочтительно 96% или менее, и средневесовой молекулярной массой 0,1 МДа или более, предпочтительно 0,5 МДа или более. По некоторым воплощениям указанный по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, получен способами деацетилирования, описанными выше.

По некоторым воплощениям указанный по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, представляет собой деацетилированный гликозаминогликан, выбранный из группы, состоящей из деацетилированных сульфатированных или не-сульфатированных гликозаминогликанов, таких как деацетилированный гиалуронан, деацетилированный хондроитин, деацетилированный хондроитин сульфат, деацетилированный гепаран сульфат, деацетилированный гепаросан, деацетилированный гепарин, деацетилированный дерматан сульфат и деацетилированный кератан сульфат. Предпочтительно по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, выбран из группы, состоящей из деацетилированной гиалуроновой кислоты, деацетилированного хондроитина и деацетилированного хондроитина сульфата, а также их смесей. Предпочтительно по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, представляет собой деацетилированную гиалуроновую кислоту.

По некоторым воплощениям возможный второй гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, представляет собой гликозаминогликан, выбранный из группы, состоящей из сульфатированных или не-сульфатированных гликозаминогликанов, таких как гиалуронан, хондроитин, хондроитин сульфат, гепаран сульфат, гепаросан, гепарин, дерматан сульфат и кератан сульфат. Предпочтительно возможный второй гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, выбран из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, хондроитина и хондроитина сульфата, а также их смесей. Предпочтительно возможный второй гликозаминогликан, используемый на стадии а) способа получения гидрогелевого продукта, представляет собой гиалуроновую кислоту.

Сшивание гликозаминогликанов непосредственно через образование амидных связей между аминогруппами и карбоксильными группами, присутствующими на гликозаминогликане, обеспечивает гидрогелевый продукт полностью на основе структур углеводной природы. Это минимизирует нарушение нативных свойств гликозаминогликанов за счет сшивания.

Способ получения гидрогелевого продукта включает сшивание молекул гликозаминогликана ковалентными связями, предпочтительно амидными связями, обычно с помощью активирующего агента для карбоксильных групп в основной цепи молекулы гликозаминогликана и аминогрупп по меньшей мере частично деацетилированного гликозаминогликана. Сшивание согласно способу по изобретению можно осуществлять мягкими и эффективными путями, дающими высокие выходы и минимальную деградацию молекул гликозаминогликана.

По некоторым воплощениям стадию активации b) и стадию сшивания с) проводят одновременно.

По некоторым воплощениям сшивающий агент на стадии b) представляет собой сшивающий агент для пептидного синтеза. Сшивание с помощью сшивающего агента для пептидного синтеза имеет преимущество над многими другими общепринятыми способами сшивания (например сшивание с помощью БДДЭ), поскольку оно позволяет проводить сшивание при нейтральном значении рН с минимальной деградацией молекул гликозаминогликана.

По некоторым воплощениям сшивающий агент для пептидного синтеза, выбирают из группы, состоящей из сшивающих агентов на основе триазина, карбодиимидных сшивающих агентов, сшивающих агентов - производных имидазолия, Oxyma и COMU.

По некоторым воплощениям такой сшивающий агент для пептидного синтеза представляет собой сшивающий агент на основе триазина. По некоторым воплощениям сшивающий агент на основе триазина выбирают из группы, состоящей из 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорида (DMTMM) и 2-хлор-4,6-диметокси-1,3,5-триазина (CDMT). По некоторым воплощениям указанный сшивающий агент на основе триазина представляет собой DMTMM.

По некоторым воплощениям сшивающий агент для пептидного синтеза, представляет собой карбодиимидный сшивающий агент. По некоторым воплощениям карбодиимидный сшивающий агент представляет собой N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид (EDC) в комбинации с N-гидроксисукцинимидом (NHS).

Термин "сшитые гликозаминогликаны" или "сшитые молекулы гликозаминогликана" в настоящем документе относится к гликозаминогликанам, включающим обычно ковалентные перекрестные связи между цепями молекул гликозаминогликана, в результате чего создается непрерывная пространственная сетка молекул гликозаминогликана, скрепленных вместе перекрестными связями.

Продукт сшитых ГАГ предпочтительно является биосовместимым. Это означает, что у индивидуума, которому проводят лечение, не возникает или возникает лишь умеренный иммунный ответ. Иными словами, у пациента, которому проводят лечение, не возникают или возникают лишь умеренные нежелательные местные или системные реакции.

Сшитый продукт по настоящему изобретению представляет собой гель или гидрогель. То есть его можно рассматривать как не растворимую в воде, но по существу разбавленную сшитую систему молекул ГАГ, при ее введении в контакт с жидкостью, обычно водной жидкостью.

Указанная сшитая молекула ГАГ предпочтительно присутствует в форме частиц геля. Частицы геля предпочтительно имеют средний размер в диапазоне 0,01-5 мм, предпочтительно 0,1-0,8 мм, например 0,2-0,5 мм или 0,5-0,8 мм.

По некоторым воплощениям стадия с) дополнительно включает обеспечение частиц сшитых гликозаминогликанов со средним размером в диапазоне 0,01-5 мм, предпочтительно 0,1-0,8 мм, например 0,2-0,5 мм или 0,5-0,8 мм.

Такой гель содержит преимущественно жидкость по массе и может, например, содержать 90-99,9% воды, но имеет свойства твердого вещества благодаря трехмерной пространственной сетке сшитых молекул ГАГ, включенных в жидкость. Благодаря значительному содержанию жидкости, такой гель эластичен по своей структуре и напоминает живую ткань, что делает его очень полезным в качестве скаффолда в тканевой инженерии и для наращивания ткани. Он полезен также для лечения расстройств мягких тканей и для коррекционного или эстетического лечения. Его предпочтительно применяют в виде инъецируемой композиции.

Указанный гидрогелевый продукт может также включать часть молекул ГАГ, которые представляют собой не сшитые, т.е. не связанные с образованием трехмерной пространственной сетки сшитых молекул ГАГ. Однако предпочтительно, чтобы по меньшей мере 50 мас. %, предпочтительно по меньшей мере 60 мас. %, более предпочтительно по меньшей мере 70 мас. % и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80 мас. % молекул ГАГ в гелевой композиции составляли часть пространственной сетки сшитых молекул ГАГ.

Указанный гидрогелевый продукт может быть в виде водного раствора, но он может также быть в высушенной или осажденной форме, например в этаноле. Такой гидрогелевый продукт предпочтительно представляет собой инъецируемый продукт.

В соответствии с воплощениями, указанный по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан получен новым способом по меньшей мере для частичного деацетилированного биополимера, представляющего собой гликозаминогликан, при этом указанный способ включает:

а1) обеспечение биополимера, включающего ацетильные группы;

а2) проведение реакции биополимера, включающего ацетильные группы, с гидроксиламином (NH₂OH) или его солью при температуре 100°С или менее в течение 2-200 ч с образованием по меньшей мере частично деацетилированного биополимера; и

а3) выделение по меньшей мере частично деацетилированного биополимера.

Было обнаружено, что гидроксиламин (NH₂OH) и его соли можно эффективно применять для деацетилирования биополимера, включающего ацетильные группы, в мягких реакционных условиях. Такие деацетилированные биополимеры могут быть полезны для различных видов применения, например для сшивания, конъюгирования или реакций прививки, требующих наличия свободных аминогрупп.

Способ деацетилирования по изобретению включает реакцию гидроксиламинолиза. Было обнаружено, что с помощью гидроксиламина или его соли для деацетилирования можно проводить N-деацетилирование в мягких условиях, что приводит лишь к минимальной деградации полимерной основной цепи чувствительных полисахаридов, таких как ГК. Применение гидроксиламина или его соли для деацетилирования, таким образом, позволяет получить деацетилированную ГК с сохранением высокой молекулярной массы. В этом состоит отличие от известных ранее способов, таких как деацетилирование с помощью гидразина или NaOH в качестве деацетилирующего агента, при которых высокая степень деацетилирования неизбежно сопровождается серьезной деградацией основной полимерной цепи.

В соответствии с воплощениями, биополимер, включающий ацетильные группы, представляет собой гликозаминогликан, предпочтительно, выбранный из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, хондроитина и хондроитина сульфата, а также их смесей. По некоторым воплощениям биополимер, включающий ацетильные группы, представляет собой гиалуроновую кислоту.

Гиалуроновую кислоту можно получить из различных источников животного и не-животного происхождения. Источники не-животного происхождения включают дрожжи и, предпочтительно, бактерии. Молекулярная масса отдельной молекулы гиалуроновой кислоты обычно находится в диапазоне 0,1-10 МДа, но возможные и другие молекулярные массы.

В конкретных воплощениях концентрация указанной гиалуроновой кислоты находится в диапазоне от 1 до 100 мг/мл. В некоторых воплощениях концентрация указанной гиалуроновой кислоты находится в диапазоне от 2 до 50 мг/мл. В некоторых воплощениях концентрация указанной гиалуроновой кислоты находится в диапазоне от 5 до 30 мг/мл или в диапазоне от 10 до 30 мг/мл. В некоторых воплощениях такая гиалуроновая кислота является сшитой. Сшитая гиалуроновая кислота включает перекрестные связи между цепями гиалуроновой кислоты, за счет которых формируется непрерывная пространственная сетка молекул гиалуроновой кислоты, соединенных вместе за счет ковалентных перекрестных связей, физического спутывания цепей гиалуроновой кислоты и различных взаимодействий, таких как электростатические взаимодействия, водородная связь и силы Ван-дер-Ваальса.

Сшивание гиалуроновой кислоты можно осуществлять модификацией с помощью агента химического сшивания. Такой агент химического сшивания можно, например, выбирать из группы, состоящей из дивинилсульфона, мультиэпоксидов и диэпоксидов. Согласно одному воплощению, гиалуроновую кислоту сшивают посредством би- или полифункционального агента для сшивания, включающего две или более глицидилэфирные функциональные группы. В соответствии с воплощениями агент химического сшивания выбирают из группы, состоящей из 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (BDDE, от англ. 1,4-butanediol diglycidyl ether), 1,2-этандиолдиглицидилового эфира (EDDE, от англ. 1,2-etanediol diglycidyl ether) и диэпоксиоктана. Согласно предпочтительному воплощению, агент химического сшивания представляет собой 1,4-бутандиолдиглицидилловый эфир (BDDE).

Полисахариды, в частности гликозаминогликаны, такие как гиалуроновая кислота, хондроитин и хондроитин сульфат, часто подвержены деградации основной цепи в жестких реакционных условиях (например очень высокие или низкие значения рН, или высокая температура). Поэтому способ по изобретению особенно полезен для деацетилирования таких полисахаридов.

Способ деацетилирования по изобретению полезен для получения по меньшей мере частично деацетилированных биополимеров, в которых значительная часть молекулярного веса исходного вещества сохранена.

По некоторым воплощениям средневесовая молекулярная масса выделенного по меньшей мере частично деацетилированного биополимера составляет по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 25% от средневесовой молекулярной массы биополимера, включающего ацетильные группы, на стадии а1). Средневесовая молекулярная масса выделенного по меньшей мере частично деацетилированного биополимер может быть и больше, например по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% от средневесовой молекулярной массы биополимера, включающего ацетильные группы, на стадии а1).

По некоторым воплощениям биополимер, включающий ацетильные группы, имеет средневесовую молекулярную массу по меньшей мере 10 кДа. По некоторым воплощениям биополимер, включающий ацетильные группы, имеет средневесовую молекулярную массу по меньшей мере 100 кДа, по меньшей мере 500 кДа, по меньшей мере 750 кДа, или по меньшей мере 1 МДа. По некоторым воплощениям биополимер, включающий ацетильные группы, имеет средневесовую молекулярную массу в диапазоне 1-5 МДа, предпочтительно в диапазоне 2-4 МДа.

По некоторым воплощениям выделенный по меньшей мере частично деацетилированный биополимер имеет средневесовую молекулярную массу по меньшей мере 10 кДа. По некоторым воплощениям выделенный по меньшей мере частично деацетилированный биополимер имеет средневесовую молекулярную массу по меньшей мере 100 кДа, по меньшей мере 500 кДа, по меньшей мере 750 кДа или по меньшей мере 1 МДа. По некоторым воплощениям выделенный по меньшей мере частично деацетилированный биополимер имеет средневесовую молекулярную массу в диапазоне 0,1-5 МДа, предпочтительно в диапазоне 0,5-5 МДа или 0,5-3 МДа.

Способ деацетилирования по настоящему изобретению также применим к более коротким биополимерам, или биоолигомерам, таким как димеры, тримеры, тетрамеры и т.п.

По некоторым воплощениям биополимер, включающий ацетильные группы, представляет собой олигобиополимер со средневесовой молекулярной массой в диапазоне 0,3-10 кДа.

По некоторым воплощениям выделенный по меньшей мере частично деацетилированный олигобиополимер имеет средневесовую молекулярную массу в диапазоне 0,3-10 кДа.

Биополимер, включающий ацетильные группы, применяемый в качестве исходного вещества при способе деацетилирования, обычно полностью, или почти полностью, ацетилирован. Под термином "полностью ацетилированный" в настоящем документе по отношению к биополимеру подразумевают биополимер, в котором все, или по существу все, свободные аминогруппы были превращены в N-ацетильные группы. Иными словами, термин "полностью ацетилированный" биополимер не включает, или по существу не включает, свободные аминогруппы. По некоторым воплощениям биополимер, включающий ацетильные группы, применяемый в качестве исходного вещества на стадии а1), имеет степень ацетилирования в диапазоне 98-100%.

По некоторым воплощениям выделенный по меньшей мере частично деацетилированный биополимер имеет степень ацетилирования по меньшей мере на 1% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 2% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 3% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 4% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 5% меньше, по сравнению с биополимером, включающим ацетильные группы, на стадии а1). Иными словами, выделенный по меньшей мере частично деацетилированный биополимер может иметь степень ацетилирования менее чем 99%, предпочтительно менее чем 98%, менее чем 97%, менее чем 97%, менее чем 96%, менее чем 95%, менее чем 94% или менее чем 93%. Выделенный по меньшей мере частично деацетилированный биополимер может также иметь степень ацетилирования по меньшей мере на 10% меньше, по меньшей мере на 15% меньше, по меньшей мере на 20% меньше, по меньшей мере на 30% меньше, по меньшей мере на 40% меньше, или по меньшей мере на 50% меньше, по сравнению с биополимером, включающим ацетильные группы, на стадии а1).

Деацетилирование можно осуществлять с помощью гидроксиламина или его соли. Соль гидроксиламина обозначает соль, образованную гидроксиламином и кислотой. Соль гидроксиламина может, например, представлять собой соль, образованную гидроксиламином и кислотой, выбранной из группы, состоящей из минеральной кислоты и органической кислоты или их смесей.

В соответствии с воплощениями, соль гидроксиламина представляет собой соль, образованную гидроксиламином и минеральной кислотой. В соответствии с воплощениями, такую кислоту выбирают из группы, состоящей из серной кислоты, хлороводородной кислоты, иодоводородной кислоты, бромоводородной кислоты и фософорной кислоты, а также их комбинаций. Предпочтительные минеральные кислоты включают хлороводородную кислоту, иодоводородную кислоту и бромоводородную кислоту. Особенно предпочтительной минеральной кислотой является иодоводородная кислота.

В соответствии с воплощениями, соль гидроксиламина представляет собой соль, образованную гидроксиламином и органической кислотой. В соответствии с воплощениями, такую кислоту выбирают из группы, состоящей из уксусной кислоты, пропионовой кислоты, пивалевой кислоты, лимонной кислоты, щавелевой кислоты, малоновой кислоты, молочной кислоты, бензойной кислоты и галогенированой карбоновой кислоты, такой как трифторуксусная кислота (ТФУ) и трихлоруксусная кислота, а также их комбинаций.

В соответствии с воплощениями, указанную кислоту выбирают из группы, состоящей из уксусной кислоты, пропионовой кислоты, пивалевой кислоты и галогенированной карбоновой кислоты, предпочтительно трифторуксусной кислоты, а также их комбинаций. В соответствии с воплощениями, указанная кислота представляет собой галогенированную карбоновую кислоту, предпочтительно трифторуксусную кислоту.

В соответствии с воплощениями, соль гидроксиламина представляет собой соль, образованную гидроксиламином и кислотой, выбранной из группы, состоящей из хлороводородной кислоты, иодоводородной кислоты и бромоводородной кислоты, пропионовой кислоты, пивалевой кислоты и трифторуксусной кислоты.

Реакцию на стадии а2 предпочтительно проводят в растворителе, способном по меньшей мере частично растворять как биополимер, включающий ацетильные группы, так и гидроксиламин или его соль. Такой растворитель может представлять собой, например, воду или органический растворитель или их смесь. Неограничивающие примеры предпочтительных растворителей включают воду или смесь воды и низшего спирта, такого как этанол. Однако могут быть полезны и другие растворители, в зависимости от конкретного биополимера, а также от выбора гидроксиламина или его соли. Одним примером полезного органического растворителя является тетрагидрофуран (ТГФ).

В соответствии с воплощениями, реакция на стадии а2) включает проведение реакции молекулы, включающей амидную группу, с гидроксиламином в воде.

Процесс деацетилирования предпочтительно можно проводить в воде или водном растворе, возможно, дополнительно включающем другой растворитель, такой как этанол. Таким образом, по некоторым воплощениям стадия а1) включает введение в контакт биополимера, включающего ацетильные группы, с гидроксиламином в воде, таким образом, что образуется водная смесь или раствор биополимера и гидроксиламина. В некоторых воплощениях, концентрация гидроксиламина составляет по меньшей мере 10 мас. %, предпочтительно по меньшей мере 20 мас. %, предпочтительно по меньшей мере 30 мас. % от массы водной смеси или раствора. Более высокая концентрация гидроксиламина может повысить скорость реакции.

Гидроксиламин часто поставляют в форме водного раствора, обычно в концентрации 50 мас. %. В некоторых воплощениях указанный биополимер можно смешивать и растворять непосредственно в водном растворе гидроксиламина, возможно, разбавленного. Как вариант, твердую соль гидроксиламина, например гидроксиламин гидрохлорид или гидроксиламин сульфат, можно растворять в водном растворе биополимера. Внесение соли гидроксиламина и превращение соли в гидроксиламин можно осуществлять в качестве альтернативы или дополнения к растворению биополимера, включающему ацетильные группы, в водном растворе гидроксиламина.

Молярная концентрация гидроксиламина в реакционной смеси составляет предпочтительно в диапазоне 5-20 М. Например, концентрация гидроксиламина 50 мас. % приблизительно соответствует молярной концентрации 16 М.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что если применять гидроксиламиновую соль вместо самого гидроксиламина, такую же скорость реакции можно обеспечить при значительно более низкой молярной концентрации. Таким образом, молярная концентрация соли гидроксиламина в реакционной смеси находится предпочтительно в диапазоне 0,01-10 М, предпочтительно в диапазоне 0,1-5 М.

По некоторым воплощениям биополимер, включающий ацетильные группы, растворяют в водном растворе гидроксиламина или его соли на стадии а1). По некоторым воплощениям соль гидроксиламина растворяют в водном растворе биополимера, включающего ацетильные группы, на стадии а1). По некоторым воплощениям биополимер, включающий ацетильные группы, растворяют в водном растворе гидроксиламина, а соль гидроксиламина растворяют в водном растворе биополимера, включающего ацетильные группы, в гидроксиламине.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что если применять гидроксиламиновую соль вместо самого гидроксиламина, такую же скорость реакции можно обеспечить при значительно более низкой молярной концентрации. Таким образом, молярная концентрация соли гидроксиламина в реакционной смеси составляет предпочтительно в диапазоне 0,01-10 М, предпочтительно в диапазоне 0,1-5 М.

По некоторым воплощениям биополимер, включающий ацетильные группы, растворяют в водном растворе гидроксиламина или его соли на стадии а1). По некоторым воплощениям соль гидроксиламина растворяют в водном растворе биополимера, включающего ацетильные группы, на стадии а1). По некоторым воплощениям биополимер, включающий ацетильные группы, растворяют в водном растворе гидроксиламина, а соль гидроксиламина растворяют в водном растворе биополимера, включающего ацетильные группы, в гидроксиламине.

Температура реакции на стадии а2) составляет предпочтительно 100°С или менее. Температуру реакции на стадии а2) выбирают таким образом, чтобы не вызвать избыточную деградацию биополимера. По некоторым воплощениям температура на стадии а2) находится в диапазоне 10-90°С, предпочтительно 20-80°С, предпочтительно 30-70°С, предпочтительно 30-50°С. В соответствии с воплощениями, реакция на стадии а2) включает проведение реакции молекулы, включающей амидную группу, с гидроксиламином или его солью при температуре в диапазоне 10-100°С, предпочтительно 20-90°С, предпочтительно 30-70°С, предпочтительно 30-50°С. Эта температура может быть, например, в диапазоне 70-90°С, например около 80°С, или в диапазоне 30-50°С, например около 40°С.

Время реакции на стадии а2) зависит от желаемой степени деацетилирования. Время реакции предпочтительно выбирают таким образом, чтобы не вызвать избыточную деградацию биополимера, и оно зависит также от температуры и рН. Время реакции в общем случае может составлять примерно от 5 мин до 200 ч или более. По некоторым воплощениям реакция на стадии а2) включает проведение реакции молекулы, включающей амидную группу, с гидроксиламином или его солью в течение 2-200 ч. По некоторым воплощениям реакция на стадии а2) включает проведение реакции молекулы, включающей амидную группу, с гидроксиламином или его солью в течение 2-150 ч, предпочтительно 5-150 ч, предпочтительно 5-100 ч. В других воплощениях, например, когда используют более высокие температуру или рН, время реакции может быть намного меньше, например в диапазоне от 5 мин до 2 ч, в диапазоне от 30 мин до 2 ч, или в диапазоне 1-2 ч.

Значение рН на стадии а2) предпочтительно выбирают таким образом, чтобы не вызвать избыточной деградации биополимера. По некоторым воплощениям реакцию на стадии а2) проводят при значении рН в диапазоне 4-12. По некоторым воплощениям реакцию на стадии а2) проводят при значении рН в диапазоне 9-11. По некоторым воплощениям реакцию на стадии а2) проводят при значении рН в диапазоне 4-9, предпочтительно в диапазоне 6-9, предпочтительно в диапазоне 6-8 или 7-8. Более низкие значения рН (например в районе нейтрального рН), такие как в диапазоне 6-8 или 7-8, обычно предпочтительны во избежание деградации биополимера.

Авторы изобретения обнаружили в ходе большого числа экспериментов, что добавление рН-снижающего агента может также значительно повысить скорость реакции на стадии а2), в частности, если используют гидроксиламин. Этот эффект является как неожиданным, так и чрезвычайно полезным. Следует заметить, что соответствующее внесение рН-снижающего агента в реакцию деацетилирования гидразином не приводило к какому-либо повышению скорости реакции. Более низкое значение рН в ходе реакции также предпочтительно во избежание избыточной деградации биополимера. Таким образом, по некоторым воплощениям рН реакции снижено до величины в диапазоне 4-9, предпочтительно в диапазоне 6-9, предпочтительно в диапазоне 6-8 или 7-8, за счет добавления рН-снижающего агента. Такой рН-снижающий агент можно выбирать, например, из группы, состоящей из минеральных кислот, органических кислот и рН-снижающих солей, а также их смесей или их комбинаций. Примеры полезных минеральных кислот включают, без ограничения, серную кислоту, хлороводородную кислоту и иодоводородную кислоту, бромоводородную кислоту и фософорную кислоту. Примеры полезных органических кислот включают, без ограничения, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, пивалевую кислоту, лимонную кислоту, щавелевую кислоту, малоновую кислоту, молочную кислоту, бензойную кислоту и галогенированные карбоновые кислоты, такие как трифторуксусная кислота и трихлоруксусная кислота. Примеры полезных рН-снижающих солей включают, без ограничения, хлорид аммония, бромид аммония, иодид аммония, гидроксиламин гидрохлорид и гидроксиламин сульфат. В предпочтительном воплощении рН-снижающий агент включает гидроксиламин гидрохлорид или гидроксиламин сульфат, наиболее предпочтительно гидроксиламин гидрохлорид. В некоторых воплощениях рН-снижающий агент представляет собой иодоводородную кислоту (HI). В некоторых воплощениях рН-снижающий агент представляет собой трифторуксусную кислоту (ТФУ).

По некоторым воплощениям реакцию на стадии а2) проводят в инертной атмосфере и/или в темноте.

Продукты, полученные способом деацетилирования, описанным выше, могут иметь свойства, которые значительно отличаются от соответствующих продуктов, полученных другими известными способами деацетилирования.

Гидрогелевый продукт, полученный способом по изобретению, можно при необходимости подвергать стадии d) ацилирования остаточных аминогрупп сшитых гликозаминогликанов, полученных на стадии с), с образованием ацилированных сшитых гликозаминогликанов. Этот процесс также называется в данном документе как повторное ацилирование, или повторное ацетилирование.

Было обнаружено, что ацилирование, например ацетилирование, остаточных свободных аминогрупп в гидрогелевом продукте, включающем сшитые амидными связями молекулы гликозаминогликана, можно применять для модификации механических свойств указанного гидрогелевого продукта. Не привязываясь к конкретному научному объяснению, полагают, что ацилирование свободных аминогрупп может снижать возникновение цвиттер-ионных комплексов, действующих как дополнительные перекрестные связи в гидрогелевом продукте, что приводит к образованию более мягкого геля.

По некоторым воплощениям стадия d) включает ацетилирование остаточных аминогрупп сшитых гликозаминогликанов, полученных на стадии с), с образованием ацетилированных сшитых гликозаминогликанов. Гликозаминогликаны в своей нативной форме являются N-ацетилированными. Поэтому можно ожидать, что ацетилирование свободных аминогрупп в гидрогелевом продукте может давать гидрогелевый продукт, более сходный с нативными гликозаминогликанами.

По некоторым воплощениям стадия d) включает приведение сшитых гликозаминогликанов, полученных на стадии с), в реакцию с ацетилирующим агентом в реакционных условиях, подходящих для образования ацетилированных сшитых гликозаминогликанов.

По некоторым воплощениям такой ацетилирующий агент выбирают из группы, состоящей из уксусного ангидрида, изопропенилацетата и предварительно активированного эфира уксусной кислоты.

Повторное ацетилирование можно проводить по стандартным протоколам, например с помощью уксусного ангидрида, изопропенилацетата или предварительно активированного эфира уксусной кислоты, обычно в водном или спиртовом растворе, или их смесях, или в чистых условиях. Предпочтительно процесс повторного ацетилирования можно проводить твердофазной реакцией с помощью спирта, предпочтительно метанола или этанола, ацетилирующего агента и, по желанию, органического или неорганического основания.

Потенциальную проблему пере-ацетилирования, О-ацетилирования, образования сложных эфиров и/или образования ангидрида, можно решить включением стадии щелочной обработки после проведения сшивания. Стадию повторного ацетилирования можно исключить из данного процесса, в целях получения цвиттер-ионных гидрогелей, по желанию.

Гидрогелевый продукт, полученный способом по изобретению, возможно, вводят в стадию е) щелочной обработки сшитых гликозаминогликанов, полученных на стадии с) или d), в целях гидролиза сложноэфирных перекрестных связей, образовавшихся как побочные продукты в ходе амидного сшивания на стадии с).

Амидное сшивание с помощью сшивающего агента, содержащего две или несколько функциональных аминогрупп, совместно с сшивающим агентом представляет собой привлекательный путь для получения сшитых молекул гликозаминогликана, полезных для гидрогелевых продуктов. Сшивание можно осуществлять с использованием сшивающего агента не-углеводной природы с двумя или несколькими нуклеофильными центрами, такого как гексаметилендиамин (HMDA, от англ. hexamethylenediamine), или сшивающего агента углеводной природы с двумя или несколькими нуклеофильными центрами, например диаминотетралозы (DATH, от англ. diaminotrehalose) совместно с гликозаминогликаном. Сшивание можно также осуществлять с использованием по меньшей мере частично деацетилированного гликозаминогликана, либо его одного, либо в сочетании со вторым гликозаминогликаном, при этом деацетилированный гликозаминогликан сам по себе действует как сшивающий агент с двумя или несколькими нуклеофильными центрами.

Было обнаружено, что реакции сшивания или сшивания гликозаминогликанов с помощью сшивающих агентов с образованием амидных связей часто связаны с сопутствующим образованием фракции сложноэфирных связей. Размер фракции со сложноэфирными связями может меняться в зависимости от реакционных условий, концентрации и применяемого сшивающего агента. Сложноэфирные связи более подвержены деградации в ходе манипуляций и хранения гидрогелевых продуктов, например при высокотемпературной стерилизации (автоклавирование), по сравнению с амидными связями. Это означает, что свойства гидрогелевых продуктов, включающих сложноэфирные связи, или комбинации сложноэфирных и амидных связей, будет иметь тенденцию к изменению с течением времени, по мере деградации сложноэфирных связей. В целях получения гидрогелей, которые сохраняют свои изначальные свойства в течение длительного периода времени, предпочтительно, чтобы гликозаминогликаны были сшиты амидными связями.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что щелочной обработкой сшитых гликозаминогликанов, содержащих как амидные, так и сложноэфирные перекрестные связи, можно гидролизовать сложноэфирные перекрестные связи, образовавшиеся как побочные продукты в ходе амидного сшивания, без сопутствующего разрушения амидных связей. Кроме того, было обнаружено, что подбирая подходящие реакционные условия, гидролиз сложноэфирных связей можно осуществлять без нежелательной деградации основной цепи гликозаминогликана.

Способ получения гидрогелевого продукта, возможно, включает стадию d) ацилирования остаточных аминогрупп сшитых гликозаминогликанов, полученных на стадии с), с образованием ацилированных сшитых гликозаминогликанов.

Ацилирование, например ацетилирование остаточных свободных аминогрупп в гидрогелевом продукте, включающем сшитые амидными связями молекулы гликозаминогликана, можно применять для модификации механических свойств указанного гидрогелевого продукта. Не привязываясь к конкретной научной трактовке, полагают, что ацилирование свободных аминогрупп может снижать образование цвиттер-ионных комплексов, действующих как дополнительные перекрестные связи в гидрогелевом продукте, что приводит к получению более мягкого геля.

По некоторым воплощениям стадия d) включает ацетилирование остаточных аминогрупп сшитых гликозаминогликанов, полученных на стадии с), с образованием ацетилированных сшитых гликозаминогликанов. Гликозаминогликаны в их нативной форме являются N-ацетилированными. Поэтому можно ожидать, что ацетилирование свободных аминогрупп в гидрогелевом продукте будет давать гидрогелевый продукт, более сходный с нативными гликозаминогликанами.

Ацилирование гликозаминогликанов с помощью ацилирующего агента с образованием амидных связей часто связано с сопутствующим образованием фракции сложноэфирных связей. Размер фракции со сложноэфирными связями может изменяться в зависимости от реакционных условий, концентрации и применяемого ацилирующего агента. Сложноэфирные связи более подвержены деградации в ходе манипуляций и хранении указанных гидрогелевых продуктов, например при высокотемпературной стерилизации (автоклавирование), по сравнению с амидными связями. Это означает, что свойства гидрогелевых продуктов, включающих сложноэфирные связи, или комбинация сложноэфирных и амидных связей, имеет тенденцию к изменению с течением времени, по мере деградации сложноэфирных связей. В целях получения гидрогелей, которые сохраняют свои исходные свойства в течение более длительного периода времени, предпочтительно, чтобы гликозаминогликаны были ацилированы за счет образования амидных связей.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что щелочной обработкой ацилированных сшитых гликозаминогликанов, содержащих как амидные, так и сложноэфирные перекрестные связи, можно гидролизовать сложноэфирные связи, образованные в ходе ацилирования, без сопутствующей деградации амидных связей. Кроме того, было обнаружено, что подбирая подходящие реакционные условия, гидролиз сложноэфирных связей можно осуществлять без нежелательной деградации основной цепи гликозаминогликана.

Щелочная обработка селективно гидролизует менее стабильные сложноэфирные связи, образованные в процессе сшивания, или О-ацетилирования и образования ангидрида в процессе повторного ацетилирования, и повышает соотношение между амидными и сложноэфирными связями в веществе.

Стандартное применение получаемого гидрогелевого продукта включает изготовление инъецируемых композиций для лечения расстройств мягких тканей, включая, без ограничения, коррекционное и эстетическое лечение.

Термин "молекулярная масса" в настоящем документе в отношении различных полимеров, например полисахаридов, обозначает средневесовую молекулярную массу, Mw, полимеров, которая хорошо определена в научной литературе. Средневесовую молекулярную массу можно определить, например, путем статистического светорассеяния, рассеяния нейтронов на малые углы, рентгеновского рассеяния и скорости седиментации. Единицей молекулярной массы является Да или г/моль.

Специалисту в данной области техники понятно, что настоящее изобретение никаким образом не ограничено предпочтительными воплощениями, описанными в настоящем документе. Напротив, возможно множество модификаций и вариаций в рамках объема приложенной формулы изобретения. Кроме того, опытный специалист может понять и осуществить вариации раскрытых воплощений при реализации заявленного изобретения, изучив фигуры, описание и приложенную формулу изобретения. В формуле изобретения слово "включающий" не исключает другие элементы или стадии, форма единственного числа не исключает форму множественного числа. Простой факт того, что конкретные величины изложены во взаимно различных зависимых пунктах формулы, не указывает на то, что комбинацию этих величин нельзя использовать в целях преимущества.

Примеры

Настоящее изобретение далее будет подробно описано посредством примеров, без намерения ограничить ими данное изобретение.

Определения и анализ

Mw - средневесовая молекулярная масса

ФН - Анализ фактора набухания (ФН) в солевом растворе, объем для 1 г геля, который набух до своего максимума (мл/г)

СН - способность к набуханию в солевом растворе, общий захват жидкости на грамм полисахарида (ПС) (мл/г).

КСН_ПС - корректированная степень набухания, общий захват жидкости одним граммом полисахарида (ПС), скорректированный на ДГел (мл/г).

[ПС] - концентрация полисахарида (мг/г).

ДГел - доля геля - представляет собой характеристику процентной доли ПС, которая составляет часть геля пространственной сетки. Число 90% означает, что 10% полисахарида не является частью геля пространственной сетки.

СС_амид - степень сшивания амидными связями (%) анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии - масс-спектрометрии (ЭХ-МС) и определяли следующим образом:

СтА - Степень ацетилирования. Степень ацетилирования (СтА) представляет собой молярное соотношение ацетильных групп, по сравнению с дисахаридами гиалуроновой кислоты. СтА можно рассчитать из спектров ЯМР (ядерно-магнитного резонанса) путем сравнения интеграла сигнала от ацетильных групп дисахаридных остатков гиалуронана с интегралом сигнала С2-Н деацетилированных остатков глюкозамина согласно уравнению:

ЯМР - спектры ¹Н ЯМР записывали на спектрометре BRUKER Biospin AVANCE 400. Химические сдвиги представлены как величина δ в сторону слабого поля от внутреннего стандарта ТМС (тетраметилсилан) в подходящих органических растворах. Чистоту и структуру продуктов подтверждали с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии, ЖХ-МС (254 нм) на системе с матричным фотодиодном детектором Waters 2690 в следующих условиях: Колонка: Symmetry С-18; Растворитель А: 0,1% муравьиная кислота в воде; Растворитель В: CH₃CN; скорость потока: 2,5 мл/мин; время прогона: 4,5 мин; градиент: от 0 до 100% растворителя В; детектор масс: micro mass ZMD. Очистку проводили непосредственно с помощью синхронизированной по массе препаративной ЖХ-МС, с обращенно-фазной колонкой Waters X-Terra (С-18, 5 микрон силикагель, диаметр 19 мм, длина 100 мм, скорость потока 40 мл/мин) и водых смесей с понижающейся полярностью (содержащими 0,1% муравьиную кислоту) и ацетонитрилом в качестве элюента. Фракции, содержащие нужное соединение, выпаривали досуха с получением конечных соединений, как правило, в виде твердых веществ

Пример 1 - Деацетилирование гиалуроновой кислоты путем гидроксиламинолиза

Растворяли 0,2 г или 20 г ГК (Mw 2 500 кДа, СтА 100%) в гидроксиламине (Sigma-Aldrich, раствор 50% об.) или в смеси гидроксиламина/вода, как указано в Табл. 1. Этот раствор инкубировали в темноте и в атмосфере аргона при 30-70°С в течение 5-353 ч. После инкубации смесь осаждали этанолом. Полученный осадок фильтровали, промывали этанолом и затем повторно растворяли в воде. Этот раствор очищали ультрафильтрацией и затем лиофилизировали с получением деацетилированной ГК (де-Ац ГК) в виде белого твердого вещества. Примеры с 1-1 по 1-14 осуществляли с использованием примерно 0,2 г ГК, а примеры с 1-15 по 1-16 осуществляли с использованием 20 г ГК.

Деацетилирование гидроксиламинолизом более эффективно, и сохраняет Mw основной цепи ГК лучше, по сравнению со способами путем гидразинолиза (пример 2) и с помощью щелочи (пример 3 и 4).

(ЭХ - эксклюзионная хроматография; УФ - ультрафиолетовая детекция; МРЛС - многоугловое рассеяние лазерного света).

Пример 2 - Деацетилирование гиалуроновой кислоты путем гидразинолиза -

Сравнительный пример

Растворяли 0,2 г ГК (Mw 2 500 кДа, СтА 100%) в 10 мл 1% раствора гидразина сульфата в гидразине моногидрате, как указано в Табл. 2. Реакция протекала в темноте и в атмосфере аргона при 30-55°С в течение 24-120 ч. Смесь осаждали этанолом. Полученный осадок фильтровали, промывали этанолом и затем повторно растворяли в воде. Конечный деацетилированный продукт ГК, полученный после ультрафильтрации, лиофилизировали. Деацетилирование гидразинолизом вызывает в большей мере деградацию основной цепи ГК, т.е. дает более низкую Mw деацетилированного продукта, по сравнению с гидроксиламинолизом (Пример 1).

Пример 3 - Деацетилирование гиалуроновой кислоты гомогенным щелочным гидролизом - Сравнительный пример

ГК (1000 кДа) взвешивали и помещали в реакционный сосуд, вносили раствор NaOH и перемешивали реакционную смесь до получения гомогенного раствора. Смесь инкубировали, как указано в Табл. 3 без перемешивания и затем разбавляли водой и этиловым спиртом. Смесь нейтрализовали добавлением 1,2 М HCl, осаждали добавлением этанола. Этот осадок промывали этанолом (70 масс. %), затем этанолом, и высушивали в вакууме в течение ночи с получением твердого вещества. Деацетилирование гомогенным щелочным гидролизом вызывает в большей мере деградацию основной цепи ГК, т.е. дает более низкую Mw деацетилированного продукта, по сравнению с гидроксиламинолизом (Пример 1).

Пример 4 - Деацетилирование гиалуроновой кислоты гетерогенным щелочным гидролизом - Сравнительный пример

ГК (1000 кДа) взвешивали и помещали в реакционный сосуд, вносили NaOH в этаноле (70% масс. %), как указано в Табл. 4. Эту гетерогенную смесь инкубировали и затем нейтрализовали внесением 1,2 М HCl. Осадок промывали этанолом (75 масс. %), затем этанолом, и высушивали в вакууме в течение ночи с получением твердого вещества.

Деацетилирование гетерогенным щелочным гидролизом дает более высокую степень деградации основной цепи ГК, т.е. более низкую Mw деацетилированного продукта, по сравнению с гидроксиламинолизом (Пример 1).

Пример 5 -Сшивание деацетилированной ГК

Сшивающий агент DMTMM растворяли в натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), при необходимости рН доводили в смеси DMTMM, и этот раствор затем добавляли к деацетилированной ГК. Реакционную смесь гомогенизировали встряхиванием в течение 3,5 мин и перемешиванием с помощью шпателя или продавливанием смеси сквозь фильтр. Реакционную смесь помещали на водяную баню при 35°С в течение 24 ч. Реакцию останавливали извлечением из водяной бани и разрезали гель на мелкие кусочки шпателем или продавливали через фильтр. Реакционную смесь доводили до рН более 13 с помощью 0,25 М NaOH, перемешивали в течение примерно 60 мин и затем нейтрализовали с помощью 1,2 М HCl. После нейтрализации гели осаждали в этаноле, промывали этанолом (70 масс. %) и высушивали в вакууме в течение ночи. Высушенные гели оставляли для набухания в фосфатном буфер в 0,7% NaCl по меньшей мере на два часа. Производили контроль рН и доводили при необходимости до 7,4. Размер частиц геля уменьшали с помощью тонкого фильтра. Заполняли гелем шприцы и эти шприцы стерилизовали автоклавированием. Результаты, представленные в Табл. 5, показывают образование гидрогелей путем сшивания деацетилированной ГК с различными Mw и СтА, с использованием DMTMM.

Пример 6 -Сшивание смеси деацетилированной ГК и ГК

ГК и деацетилированную ГК растворяли в 40 мл воды (Milli-Q) в пробирке фирмы Falcon на 50 мл путем перемешивания с переворачиванием в течение 24 ч. После полного растворения образцы лиофилизировали. Сшивающий агент DMTMM растворяли в натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), измеряли рН в DMTMM-смеси и затем вносили ее в лиофилизованную смесь. Эту реакционную смесь гомогенизировали и помещали на водяную баню при 35°С на 24 ч. Реакцию останавливали извлечением из водяной бани и полученный гель разрезали на мелкие кусочки шпателем. Реакционную смесь доводили до рН более 13 с помощью 0,25 М NaOH в течение примерно 60 мин. Гели нейтрализовали с помощью 1,2 М HCl. После нейтрализации гели осаждали этанолом, промывали этанолом (70%) и высушивали в вакууме в течение ночи. Высушенные гели оставляли для набухания в фосфатном буфере в 0,7% NaCl по меньшей мере на два часа. Производили контроль рН и доводили при необходимости до 7,4. Размер частиц геля уменьшали с помощью тонкого фильтра. Заполняли гелем шприцы и шприцы стерилизовали автоклавированием. Результаты, представленные в Табл. 6, показывают образование гидрогелей сшиванием деацетилированной ГК с ГК, с помощью DMTMM.

Пример 7 -Сшивание смеси ВМ (высокомолекулярной) деацетилированной ГК и НМ (низкомолекулярной) деацетилированной ГК

Деацетилированную ГК с двумя различными Mw смешивали вместе. Сшивающий агент DMTMM растворяли в натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), при необходимости доводили рН DMTMM-смеси и этот раствор затем добавляли к деацетилированной ГК. Реакционную смесь гомогенизировали перемешиванием с помощью шпателя или продавливанием смеси через фильтр. Реакционную смесь помещали в инкубатор при 23°С на 24 ч. Реакцию останавливали извлечением из инкубатора и полученный гель разрезали на мелкие кусочки шпателем или продавливали через фильтр. Реакционную смесь доводили до рН более 13 с помощью 0,25 М NaOH, перемешивали в течение примерно 60 мин и затем нейтрализовали до рН 7,4 с помощью 1,2 М HCl.

Пример 8 - Гетерогенное повторное ацетилирование гидрогеля

Сшивающий агент DMTMM растворяли в натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), при необходимости рН доводили в DMTMM-смеси и этот раствор затем добавляли к деацетилированной ГК. Реакционную смесь гомогенизировали встряхиванием в течение 3,5 мин и перемешиванием с помощью шпателя или продавливанием смеси через фильтр. Реакционную смесь помещали на водяную баню при 35°С на 24 ч. Реакцию останавливали извлечением из водяной бани и полученный гель разрезали на мелкие кусочки шпателем или продавливали через фильтр. Реакционную смесь доводили до рН более 13 с помощью 0,25 М NaOH, перемешивали в течение 60 мин и затем нейтрализовали с помощью 1,2 М HCl. После нейтрализации гели осаждали в этаноле, промывали этанолом (70 масс. %) и высушивали в вакууме в течение ночи.

Осажденный гель суспендировали в метаноле и вносили уксусный ангидрид (20 экв./дисахарид ГК). Эту суспензию инкубировали при 40°С в течение 24 ч, затем фильтровали, и полученное твердое вещество промывали этанолом (70 масс. %), этанолом и затем высушивали в вакууме в течение ночи. Ацетилированный гель растворяли в 0,25 М NaOH, перемешивали в течение 60 мин и затем нейтрализовали с помощью 1,2 М HCl. После нейтрализации гели осаждали в этаноле, промывали этанолом (70 масс. %) и высушивали в вакууме в течение ночи. Высушенные гели оставляли для набухания в фосфатном буфере в 0,7% NaCl по меньшей мере на два часа.

В качестве контрольного эксперимента (пример 8-3), ГК (310 кДа) суспендировали в метаноле и вносили уксусный ангидрид (20 экв./дисахарид ГК). Эту суспензию инкубировали при 40°С в течение 24 ч, затем полученное после фильтрации твердое вещество промывали этанолом (70 масс. %), этанолом и затем высушивали в вакууме в течение ночи. Этот продукт растворяли в 0,25 М NaOH, перемешивали в течение 60 мин и затем нейтрализовали с помощью 1,2 М HCl. После нейтрализации гели осаждали в этаноле, промывали этанолом (70 масс. %) и высушивали в вакууме в течение ночи. Определяли Mw полученного продукта. Результаты сведены в Табл. 8.

Пример 9 - Гомогенное повторное ацетилирование гидрогеля Сшивающий агент DMTMM растворяли в натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), производили контроль рН и доводили при необходимости. Затем раствор DMTMM добавляли к деацетилированной ГК. Эту суспензию гомогенизировали встряхиванием в течение 3,5 мин и перемешиванием с помощью шпателя или продавливанием смеси через фильтр. Реакционную смесь помещали в инкубатор при 23°С на 24 ч. Реакцию останавливали извлечением из инкубатора и полученный гель смешивали шпателем или продавливали два раза через сетку из стальной проволоки с величиной отверстий 1 мм. Затем вносили 0,25 М NaOH к полученному веществу (рН более 13), перемешивали в течение 60 мин и затем нейтрализовали с помощью 1,2 М HCl. После нейтрализации размер частиц геля уменьшали продавливанием через тонкий фильтр. Затем гели осаждали в этаноле и промывали 70 масс. % этанолом и этанолом. Полученное вещество высушивали в вакууме в течение ночи.

Порошок осажденного геля вносили в деионизованную воду и оставляли перемешиваться в течение 60 мин. К полученной суспензии геля добавляли триэтаноламин (1,5 экв./дисахарид ГК) и уксусный ангидрид (1 экв./дисахарид ГК). Реакционную смесь перемешивали при 23°С в течение 60 мин. После внесения 0,25 М NaOH к ацетилированному гелю (рН более 13) перемешивали в течение 45 мин и затем нейтрализовали с помощью 1,2 М HCl. После нейтрализации полученный гель осаждали в этаноле и промывали смесью этанол (70 масс. %) плюс 100 мм NaCl, этанолом (70 масс. %), затем этанолом и высушивали в вакууме в течение ночи. Высушенный гель оставляли для набухания в натрий-фосфатном буфере при комнатной температуре по меньшей мере на два часа и затем размер частиц уменьшали продавливанием через тонкий фильтр.

В качестве контрольного эксперимента (пример 9-3), деацетилированную ГК (1 700 кДа) вносили в деионизованную воду и оставляли перемешиваться в течение 60 мин. К смеси ГК добавляли триэтаноламин (1,2 экв./дисахарид ГК) и уксусный ангидрид (1 экв./дисахарид ГК). Реакционную смесь перемешивали при 23°С в течение 60 мин, затем вносили 0,25 М NaOH (рН более 13), перемешивали в течение 40 мин и после этого нейтрализовали с помощью 1,2 М HCl. После нейтрализации смесь осаждали в этаноле и промывали смесью этанола (70 масс. %) плюс 100 мм NaCl, этанолом (70 масс. %), затем этанолом и высушивали в вакууме в течение ночи. Определяли Mw и СтА полученного продукта. Результаты сведены в Табл. 9.

Пример 10 - Щелочной гидролиз геля сшитого ГК

Сшивающий агент DMTMM растворяли в натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), при необходимости рН доводили в DMTMM-смеси и этот раствор затем добавляли к деацетилированной ГК. Реакционную смесь гомогенизировали встряхиванием в течение 3,5 мин и перемешиванием с помощью шпателя или продавливанием смеси через фильтр. Реакционную смесь помещали на водяную баню при 35°С на 24 ч. Реакцию останавливали извлечением из водяной бани и полученный гель разрезали на мелкие кусочки шпателем или продавливали через фильтр.

Полученный гель делили на две части, в одной части полученного геля рН доводили до рН более 13 с помощью 0,25 М NaOH и перемешивали около 60 мин и затем нейтрализовали с помощью 1,2 М HCl. После нейтрализации гели осаждали в этаноле и промывали этанолом (70 масс. %), затем этанолом, и высушивали в вакууме в течение ночи. При необходимости, высушенный гель оставляли для набухания в фосфатном буфере в 0,7% NaCl при комнатной температуре по меньшей мере на два часа и затем размер частиц уменьшали продавливанием через тонкий фильтр. В полученном геле производили контроль рН и доводили до 7,2-7,5 при необходимости.

Вторую часть полученного геля разбавляли водой и рН доводили до 6,5-7,5. После нейтрализации гели осаждали этанолом и промывали этанолом (70 масс. %), затем этанолом и высушивали в вакууме в течение ночи. При необходимости, высушенный гель оставляли для набухания в фосфатном буфере в 0,7% NaCl при комнатной температуре по меньшей мере на два часа, и затем размер частиц уменьшали продавливанием через тонкий фильтр. Производили контроль рН полученного геля и доводили до 7,2-7,5 при необходимости.

Проводили щелочную обработку для гидролиза меж- и внутримолекулярных сложноэфирных связей, образовавшихся между цепями ГК на стадии сшивания, и гидролиза потенциальных О-ацетатов и ангидридов, образовавшихся на стадии повторного ацетилирования, а также остаточных активных сложноэфирных связей, образованных сшивающим агентом. Щелочной гидролиз дает исключительно только амидные связи в веществе.

В качестве контрольного эксперимента (примеры с 10-13 по 10-15, Табл. 10.3), ГК вносили в натрий-фосфатный буфер (рН 7,4). Реакционную смесь гомогенизировали встряхиванием в течение 3,5 мин и продавливанием смеси через фильтр. Реакционную смесь помещали на водяную баню при 5, 35 или 50°С на 24 ч. Реакцию останавливали извлечением из водяной бани и эту смесь продавливали через фильтр. Смесь доводили до рН более 13 с помощью 0,25 М NaOH в течение 60-100 мин. Смесь нейтрализовали с помощью 1,2 М HCl. После нейтрализации ГК осаждали этанолом и промывали этанолом (70%), промывали этанолом и высушивали в вакууме в течение ночи. Определяли Mw полученного продукта. Результаты, сведенные в Табл. 10.1-10.3, показывают, что щелочная обработка после сшивания дает гель с повышенной способностью к набуханию и пониженной степенью сшивания (СС).

Пример 11 - Получение N-((2R,3R,4S)-1,3,4,5-тетрагидрокси-6-(тритилокси)-гексан-2-ил)ацетамида

Раствор N-((2R,3S,5S)-2,4,5-тригидрокси-6-тритилоксиметилтетрагидро-пиран-3-ил)-ацетамида (556 мг; 1,20 моль; 1,00 экв.) в смеси ТГФ-Н₂О (20 мл, 4:1) при КТ (комнатной температуре), обрабатывали твердым борогидридом натрия (49,92 мг; 1,32 моль; 1,10 экв.) [выделяется газ]. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч, концентрировали досуха с получением N-((2R,3R,4S)-1,3,4,5-тетрагидрокси-6-(тритилокси)гексан-2-ил)ацетамида (500 мг; 89,54%) в виде белого твердого вещества, которое использовали без дополнительной очистки.

ЖХ-МС: t_R=1,01 мин., чистота равна 100%; ES+, 464,26 (М-Н)^-.

Пример 12 - Деацетилирование N-((2R,3R,4S)-1,3,4,5-тетрагидрокси-6-(тритилокси)гексан-2-ил)ацетамида

Суспензию N-((2R,3R,4S)-1,3,4,5-тетрагидрокси-6-(тритилокси)гексан-2-ил)ацетамида (1 экв.) в гидроксиламине (10 объемов) либо обрабатывали кислотными добавками для снижения рН до 7, либо нет, как указано в Табл. 11, Примеры с 12-1 по 12-9. Эту смесь нагревали при 80°С до достижения полной конверсии деацетилирования. Деацетилирование N-((2R,3R,4S)-1,3,4,5-тетрагидрокси-6-(тритилокси)гексан-2-ил)ацетамида гидразином (рН 13) в тех же условиях, как и в Примере 2, также включено как Пример 13-10.

Результаты представлены в Табл. 11. Эти результаты показывают, что процедура деацетилирования протекает значительно быстрее с гидроксиламином, чем с гидразином, и особенно при добавлении рН-снижающего агента.

Реакционные смеси очищали непосредственно с помощью препаративной ЖХ-МС с получением (2R,3R,4S)-2-амино-6-(тритилокси)гексан-1,3,4,5-тетраола в виде белого твердого вещества.

ЖХ-МС: t_R=0,88 мин., чистота равна 99%; ES+, 422,11 (М-Н)^-.

¹Н ЯМР (ДМСО*-d₆) δ: 7,47-7,37 (m, 6Н), 7,30 (dd, J=8,3, 6,7 Гц, 6Н), 7,26-7,15 (m, 3Н), 3,92 (m, 1Н), 3,83-3,74 (m, 1Н), 3,62-3,53 (m, 1Н), 3,52-3,41 (m, 1Н), 3,34-3,27 (m, 1Н), 3,22-3,16 (m, 1Н), 3,13-3,04 (m, 1Н), 3,01-2,91 (m, 1Н)

* ДМСО - диметилсульфоксид

Пример 13 - Получение N-(4-аминофенэтил)ацетамида

К 4-(2-аминоэтил)анилину (1,50 г; 11,01 ммоль; 1,00 экв.) добавляли чистый лара-крезилацетат (1,65 г; 11,0 ммоль, 1,00 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 ч. Полученный оранжевый раствор абсорбировали непосредственно на силикагеле и очищали флэш-хроматографией (силикагель, дихлорметан/метанол 0-5%) с получением N-(4-аминофенэтил)ацетамида (1,76 г; выход 89,7%). ЖХ-МС: t_R=0,58 мин., чистота равна 99,5%; ES+, 179,5 (М+Н)⁺. ¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 1,78 (s, 3Н), 2,50 (m, 2Н сигнал, скрытый за счет ДМСО) 3,14 (m, 2Н), 4,83 (s, 2Н), 6,49 (d, J=7,5 Гц, 2Н), 6,84 (d, J=7,5 Гц, 2Н), 7,82 (s, 1Н).

Пример 14 - Получение трет-бутил-(4-(2-ацетамидоэтил)фенил)карбамата

К раствору N-[2-(4-амино-фенил)-этил]-ацетамида (500 мг; 2,81 ммоль, 1,00 экв.) в ДХМ (дихлорметан) (20 мл) при КТ, при перемешивании вносили триэтиламин (0,51 мл, 3,65 ммоль, 1,30 экв.), а затем ди-трет-бутил дикарбонат (673,48 мг; 3,09 ммоль; 1,10 экв.). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч, промывали водой (5 мл), насыщенным водным раствором NaHSO₄ (5 мл) и водой (35 мл), высушивали над MgSO₄ и концентрировали досуха с получением трет-бутил-(4-(2-ацетамидоэтил)фенил)карбамата (496 мг; выход 63%)

в виде светло-оранжевого твердого вещества.

ЖХ-МС: t_R=1,11 мин., чистота равна 100%; ES+, 279,5 (М+Н).

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 1,57 (s, 9Н), 1,87 (s, 3Н), 2,75-2,64 (m, 2Н), 3,36-3,20 (m, 2Н), 7,27-7,07 (m, 2Н), 7,45 (d, J=8,3 Гц, 2Н), 7,94 (t, J=5,6 Гц, 1Н), 9,31 (s, 1Н).

Пример 15 - Получение NH₂OH⋅HI

К раствору 50% NH₂OH (водн.) (9,28 мл, 0,15 моль; 1,00 экв.) при 0°С при перемешивании вносили осторожно, по каплям 57% HI (водн.) в течение 5 мин до достижения рН 7. Образовавшееся плотное белое кристаллическое твердое вещество, которое собрали путем фильтрации, осторожно промывали ледяной водой с получением гидроксиламина гидроиодида (6,80 г; 28%).

Пример 16 - Получение NH₂OH⋅ТФУ

К раствору 50% NH₂OH (водн.) (9,28 мл, 0,15 моль; 1,00 экв.) при 0°С при перемешивании вносили осторожно, по каплям ТФУ в течение 5 мин до достижения рН 7. Реакционную смесь концентрировали при барботировании азотом с получением гидроксиламина трифторацетата (11,0 г; 98%) в виде прозрачного бесцветного масла.

Пример 17 - Сравнительное исследование NH₂OH и его солей, в сравнении со стандартно применяемыми трансамидирующими агентами, такими как NH₂NH₂⋅H₂O и NaOH

К раствору/суспензии трет-бутил-(4-(2-ацетамидоэтил)фенил)-карбамата (50 мг; 0,18 ммоль) в выбранном растворителе (5 объемов) при перемешивании вносили соль (5 экв.) и полученную смесь нагревали при 80°С в течение времени, необходимого для завершения реакции. Результаты сведены в Табл. 12.

ЖХ-МС: t_R=0,81 мин., чистота равна 100%; ES+, 237,51 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 9,26 (s, 1Н), 8,40 (s, 1Н), 7,38 (d, J=8,0 Гц, 2Н), 7,11 (d, J=8,0 Гц, 2Н), 2,89 (m, 2Н), 2,80-2,63 (m, 2Н), 1,47 (s, 9Н) (выделен как формиатная соль).

1. Способ по меньшей мере для частичного деацетилирования гликозаминогликана, содержащего ацетильные группы, включающий:

a1) обеспечение гликозаминогликана, содержащего ацетильные группы и имеющего средневесовую молекулярную массу в диапазоне от 1 до 5 МДа;

a2) проведение реакции гликозаминогликана, содержащего ацетильные группы, с гидроксиламином (NH2OH) или его солью при температуре 10-90°C в течение 2-200 ч с образованием по меньшей мере частично деацетилированного гликозаминогликана; и

a3) выделение по меньшей мере частично деацетилированного гликозаминогликана.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гликозаминогликан выбран из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, хондроитина и хондроитина сульфата, а также их смесей.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что средневесовая молекулярная масса выделенного по меньшей мере частично деацетилированного гликозаминогликана составляет по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 25% от средневесовой молекулярной массы гликозаминогликана, содержащего ацетильные группы, на стадии a1).

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что гликозаминогликан, содержащий ацетильные группы, на стадии a1) имеет степень ацетилирования в диапазоне 98-100%.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что выделенный по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан имеет степень ацетилирования по меньшей мере на 1% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 2% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 3% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 4% меньше, предпочтительно по меньшей мере на 5% меньше, по сравнению с гликозаминогликаном, содержащим ацетильные группы, на стадии a1).

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что стадия a2) включает приведение в реакцию гликозаминогликана, включающего ацетильные группы, с гидроксиламином в воде.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что молярная концентрация гидроксиламина на стадии a2) находится в диапазоне 5-20 M.

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что стадия a2) включает приведение в реакцию гликозаминогликана, включающего ацетильные группы, с солью гидроксиламина.

9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что концентрация соли гидроксиламина на стадии a2) находится в диапазоне 0,1-5 M.

10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что реакцию на стадии a2) проводят при значении pH в диапазоне 4-12.

11. По меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан, полученный способом по любому из пп. 1-10, при этом указанный гликозаминогликан имеет степень ацетилирования 99% или менее и средневесовую молекулярную массу 0,5 МДа или более.

12. Применение гидроксиламина или его соли для по меньшей мере частичного деацетилирования гликозаминогликана, содержащего ацетильные группы, с получением по меньшей мере частично деацетилированного гликозаминогликана по п. 11.

13. Применение по п. 12, отличающееся тем, что гликозаминогликан выбран из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, хондроитина и хондроитина сульфата, а также их смесей.

14. Способ получения гидрогелевого продукта, содержащего сшитые молекулы гликозаминогликана, включающий следующие стадии:

a) обеспечение раствора, включающего по меньшей мере частично деацетилированный гликозаминогликан по п. 11 и, возможно, второй гликозаминогликан;

b) активация карбоксильных групп на по меньшей мере частично деацетилированном гликозаминогликане и/или возможном втором гликозаминогликане с помощью сшивающего агента, с образованием активированных гликозаминогликанов;

c) сшивание активированных гликозаминогликанов посредством их активированных карбоксильных групп с помощью аминогрупп по меньшей мере частично деацетилированных гликозаминогликанов, с получением гликозаминогликанов, сшитых амидными связями.