Способ терапии болезни тея-сакса и болезни сандхоффа с помощью генетически модифицированных мезенхимных стволовых клеток человека со сверхэкспрессией β-гексозаминидазы a

Изобретение относится к медицине и касается способа терапии болезни Тея-Сакса и болезни Сандхоффа (БТС и БС) с помощью генетически модифицированных мезенхимных стволовых клеток человека со сверхэкспрессией β-гексозаминидазы A, заключающегося в том, что внутривенно вводят мезенхимные стволовые клетки, предварительно трансдуцированные рекомбинантными лентивирусами LV-HEXA и LV-HEXB или аденоассоциированными вирусами AAV-HEXA и AAV-HEXB, кодирующими гены фермента β-гексозаминидазы А. Изобретение обеспечивает восстановление дефицита фермента HexA и его ферментативной активности, тем самым способствуя замедлению прогрессии БТС и БС. 1 пр., 6 ил.

 

Изобретение относится к области медицины в целом, более точно к терапии болезни Тея-Сакса (БТС) и болезни Сандхоффа (БС), которые представляют собой тяжелые наследственные нейродегенеративные заболевания, обусловленные дефицитом фермента β-гексозаминидазы А (HexA), вследствие которого происходит накопление GM2-ганглиозидов в клетках нервной системы. Предложен способ генно-клеточной терапии БТС и БС, заключающийся в трансплантации мезенхимных стволовых клеток (МСК) человека, генетически модифицированных рекомбинантными лентивирусами LV-HEXA и LV-HEXB или адено-ассоциированными вирусами AAV-HEXA и AAV-HEXB. Гены HEXA и HEXB кодируют α- и β-субъединицы фермента HexA, соответственно. Способ позволяет восстановить дефицит фермента HexA и восстановить его ферментативную активность, тем самым способствуя замедлению прогрессии БТС и БС.

Далее в целях исключения неоднозначного понимания текста заявителем приведены использованные в заявочных материалах термины и их расшифровка.

БТС — болезнь Тея-Сакса;

БС — болезнь Сандхоффа;

ГЭБ — гемато-энцефалический барьер;

кДНК — комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота;

мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота

МСК — мезенхимные стволовые клетки;

МСК LV-HEXA + LV-HEXB — мезенхимные стволовые клетки, трансдуцированные рекомбинантными лентивирусами LV-HEXA и LV-HEXB;

МСК AAV-HEXA + AAV-HEXB — мезенхимные стволовые клетки, трансдуцированные рекомбинантными адено-ассоциированными вирусами AAV-HEXA и AAV-HEXB;

ЦНС — центральная нервная система;

HEXA — ген, кодирующий α-субъединицу фермента β-гексозаминидазы А;

HEXB — ген, кодирующий β-субъединицу фермента β-гексозаминидазы А;

HexA — β-гексозаминидаза А.

Краткая суть данных заболеваний (БТС и БС) сводится к нарушениям метаболизма GM2-ганглиозидов из-за дефицита лизосомного фермента HexA. Нарушения в функционировании или недостаточность фермента HexA возникает из-за мутаций генов HEXA и HEXB. БТС обусловлена мутациями гена HEXA, БС обусловлена мутациями гена HEXB.

Ганглиозиды являются основными гликолипидами плазматических мембран нейронов, которые обеспечивают их нормальную жизнедеятельность. Дефицит фермента HexА обуславливает накопление GM2-ганглиозидов в различных клетках и тканях организма, преимущественно в ЦНС, что ведет к гибели нейронов и прогрессированию нейродегенерации и нейровоспаления. Оба заболевания (БТС и БС) имеют схожий фенотип, а именно нарушения в когнитивных и двигательных функциях ЦНС и наследуются аутосомно-рецессивным путем. БТС и БС имеют три формы: детскую (инфантильную), ювенильную и взрослую. Наиболее тяжелой является детская форма, при которой наблюдается острое поражение головного мозга, вследствие чего продолжительность жизни пациентов с данной формой не превышает 4 лет. Характерными особенностями инфантильной формы являются задержка и регрессия развития, нарушение зрения, наличие типичного вишнево-красного пятна на сетчатке глаза, подчеркивающее нормальный цвет собственно сосудистой оболочки глаза, который контрастирует с бледностью набухших ганглиозных клеток в пораженной части сетчатки. Ювенильная и взрослая формы встречаются значительно реже и прогрессируют медленнее. Для ювенильной формы характерна дисфункция мозжечка и, как следствие, нарушение походки, проблемы с равновесием, часто наблюдается регрессия двигательных и когнитивных функций. Взрослая форма встречается крайне редко. Часто возникают проблемы с диагностикой, поскольку взрослая форма имеет широкий диапазон клинических симптомов, которые включает мышечную атрофию позвоночника, моторные аксональные невропатии, дисфункцию мозжечка и психические отклонения [Solovyeva, V. V., et al., New Approaches to Tay-Sachs Disease Therapy, Frontiers in physiology, 2018. 9 (1663)].

Заявленное техническое решение основывается на идее того, что после генетической модификации, а именно после трансдукции рекомбинантными лентивирусами или адено-ассоциированными вирусами, кодирующими гены HEXA и HEXB, МСК начинают секретировать недостающий у пациентов фермент HexA. МСК способны мигрировать в ЦНС (в области нейровоспаления и нейродегенерации), поэтому после внутривенного введения генетически модифицированных МСК, клетки доставляют фермент HexA в ЦНС, после чего концентрация фермента доводится до нормального физиологического уровня и нейродегенерация замедляется, таким образом, становится возможным восстановление ферментативной активности HexA и улучшение качества жизни пациентов. Указанный технический результат становится возможным вследствие использования неочевидного для специалистов подхода, использованного заявителем. Способ обеспечивает доставку терапевтического фермента в ЦНС, поскольку МСК способны преодолевать гемато-энцефалический барьер (ГЭБ), в то время как сам фермент на это не способен, из-за чего ранее таргетная терапия данных неизлечимых заболеваний (БТС и БС) не представлялась возможной.

Заявленное техническое решение предоставляет возможность решения технически неразрешимого препятствия, а именно преодоления ГЭБ, и представляет возможность восстановления ферментативной активность HexA в организме и улучшение качества жизни пациентов с БТС и БС, что позволяет сделать логически обоснованный вывод о соответствии заявленного технического решения не только критерию мировая новизна, но и критерию изобретательский уровень, а именно - способом генно-клеточной терапии БТС и БС, который представляет собой внутривенное введение МСК, предварительно трансдуцированных рекомбинантными лентивирусами LV-HEXA и LV-HEXB или рекомбинантными адено-ассоциированными вирусами AAV-HEXA и AAV-HEXB, содержащими гены HEXA и HEXB, которые вместе экспрессируют фермент HexA.

Полученные генетически модифицированные МСК обеспечивают возможность доставки недостающего фермента HexA в ЦНС, вследствие чего, по мнению заявителя, обеспечивается возможность остановки нейродегенерации и улучшения качества жизни пациентов.

В результате реализации заявленного технического решения становится возможным решать нереализуемые на дату подачи заявки проблему, такую, как доставка HexA в ЦНС малоинвазивным путем, а именно клеточно-опосредованно.

Таким образом, краткая сущность заявленного технического решения заключается в способе клеточно-опосредованной генной терапии БТС и БС, который подразумевает внутривенное введение МСК, генетически модифицированных путем ко-трансдукции рекомбинантными лентивирусами LV-HEXA и LV-HEXB или рекомбинантными адено-ассоциированными вирусами AAV-HEXA и AAV-HEXB. Генетические векторы LV-HEXA, LV-HEXB, AAV-HEXA и AAV-HEX содержат кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов HEXA и HEXB. Ген HEXA кодирует α-субъединицу и ген HEXB кодирует β-субъединицу фермента HexA. Использование этих двух генов по отдельности не представляется целесообразным, так как целый фермент HexA образуется только после соединения двух субъединиц, поэтому для синтеза целого фермента необходимо наличие в клетке обоих генов, для этого заявитель предлагает ко-трансдуцировать (одновременно трансдуцировать (инфицировать)) МСК рекомбинантными лентивирусами LV-HEXA и LV-HEXB или рекомбинантными адено-ассоциированными вирусами AAV-HEXA AAV-HEXB. Таким образом достигается совместная доставка и совместный синтез двух субъединиц одного фермента. После доставки этих генов (HEXA и HEXB) в МСК, внутри клетки происходит синтез полноценного фермента и его секреция в межклеточное вещество. Полученные генетически модифицированные МСК внутривенно вводят пациенту. Благодаря способности МСК мигрировать в ЦНС, обеспечивается секреция фермента в ЦНС пациента. Таким образом восстанавливается нарушенная экспрессия и функционирование фермента HexA в ЦНС и достигается излечение пациентов с БТС и БС.

На дату подачи заявленного технического решения в мире существует проблема терапии БТС и БС, входящих в группу лизосомных болезней накопления, которые на дату представления заявочных материалов являются неизлечимыми.

Из исследованного заявителем уровня техники известно, что БТС и БС представляют собой тяжелые наследственные нейродегенеративные заболевания, обусловленные дефицитом фермента HexA, вследствие которого происходит накопление GM2-ганглиозидов в лизосомах преимущественно нервных клеток, в результате развивается тяжелая нейродегенерация и нейровоспаление. Болезнь приводит к неизбежной инвалидизации пациентов.

Решение указанной проблемы представляется актуальным ввиду отсутствия на дату представления настоящей заявки эффективных и безопасных способов терапии БТС и БС. На сегодняшний день в качестве лечения предлагается только симптоматическая терапия, однако активно исследуются новые подходы к терапии этих заболеваний. На стадии разработки находятся перспективные терапевтические стратегии, которые активно исследуется в настоящее время, а именно субстрат-редуцирующая терапия, трансплантация костного мозга или гемопоэтических стволовых клеток, фермент-заместительная терапия и восстановление экспрессии функционального фермента с использованием генной терапии. Однако эти методы терапии GM2-ганглиозидозов не показывают необходимого уровня эффективности. Слабая эффективность таких подходов как терапия снижения субстрата и фермент-заместительная терапия связана с тем, что при внутривенном введении вещества плохо преодолевают ГЭБ. С этой точки зрения интратекальное или интрацеребральное введение имеют преимущество, например, интрацеребральное введение очищенного фермента модельным мышам БС привело к дозозависимому восстановлению активности фермента в нервных клетках [K. Itoh et al., Highly phosphomannosylated enzyme replacement therapy for GM2 gangliosidosis. Ann Neurol, 2011. 69(4): p. 691-701.], однако применение на пациентах ограничивается высокой инвазивностью процедуры, а также плохим распределением препарата по ЦНС. Клеточная терапия, подразумевающая введение клеток здорового донора, при менее агрессивных формах заболевания помогает увеличить активность фермента и смягчить симптомы [Клинические испытания NCT00383448, NCT00176904, NCT01626092]. Однако экспрессия недостающего фермента на физиологическом уровне часто недостаточна для предотвращения накопления GM2 ганглиозидов и предотвращения развития заболевания.

Генная терапия с использованием вирусных векторов, способных пересекать ГЭБ, может быть эффективна. Однако, есть клиническое исследование пациентов с одной из ЛБН, которое показало, что даже при интрацеребральном введении AAV9, кодирующего недостающий фермент, вирусный вектор плохо распределяется в ЦНС и не приводит к улучшению [M. Zerah et al., Intracerebral gene therapy in children with metachromatic leukodystrophy: Results of a phase I/II trial. Molecular Genetics and Metabolism, 2018. 23(2): p. S129]. Плохое биораспределение и высокая инвазивность являются ограничивающими факторами прямого введения вирусных векторов в клинической практике, поскольку доставка функционального фермента во все поврежденные клетки имеет решающее значение для успешного лечения.

Трансплантация стволовых клеток часто используется для терапии БТС, БС и других ЛБН, поскольку клетки здорового донора синтезируют нормальный фермент на физиологическом уровне и в некоторых случаях, как правило при менее агрессивных формах заболевания, данная процедура помогает увеличить активность фермента и смягчить симптомы заболевания. Однако трансплантация ГСК без дополнительной генетической модификации не всегда имеет достаточный терапевтический эффект при лечении ЛБН. Клеточно-опосредованная генная терапия может повысить эффективность восстановления активности дефицитного фермента и его биораспределения по ЦНС.

Таким образом, вышеописанные методы лечения БТС и БС являются неэффективными и актуален поиск новых препаратов и методов лечения. Единственным зарегистрированным лекарственным средством для терапии БТС и БС является препарат Zavesca®, однако его применение не предотвращает усугубление неврологических нарушений [Jacobs, J.F., et al., Allogeneic BMT followed by substrate reduction therapy in a child with subacute Tay-Sachs disease. Bone Marrow Transplant, 2005. 36 (10): p. 925-6].

Заявителем проведен анализ существующего уровня техники по научной и патентной информации в области терапии БТС и БС и выявлен ряд аналогов, которые используются в настоящее время для облегчения симптомов и для остановки усугубления нейродегенерации.

Из исследованного уровня техники выявлен ряд функциональных аналогов (по назначению), применяющихся для лечения практически неизлечимых на дату представления заявочных материалов известных в мире лизосомных болезней накопления.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту РФ №2723187 «Генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов HEXA и HEXВ, и фармацевтическая композиция для лечения болезни Тея-Сакса». Сущностью известного технического решения является генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов HEXA и HEXВ, разделенные нуклеотидной последовательностью IRES или кодирующей P2А, E2А, F2А или T2А пептид, для экспрессии β-гексозаминидазы А в клетке млекопитающего. Генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов HEXA и HEXВ, представленные SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 соответственно, разделенные нуклеотидной последовательностью IRES или кодирующей P2А, E2А, F2А или T2А пептид, для экспрессии β-гексозаминидазы А в клетке млекопитающего. Фармацевтическая композиция для лечения болезни Тея-Сакса, содержащая рекомбинантный лентивирусный вектор с генетической кассетой по п. 1 в эффективном количестве, предназначенный для экспрессии в клетках млекопитающих, и фармацевтически допустимые вспомогательные вещества.

Таким образом, в известном изобретении в целом описывается генетическая кассета, кодирующая гены фермента HexA, которая может быть использована для создания генных препаратов для лечения БТС и БС. Часто генная терапия БТС и БС показывает эффективность лишь на животных моделях. При внутривенном введении генного препарата вирусные векторы не достигают ЦНС, поскольку плохо преодолевают ГЭБ. При прямом введении таких векторов в ЦНС, во-первых, терапевтическое вещество плохо распространяется по ЦНС, во-вторых, ограничивается клиническое применение из-за высокой инвазивности, поскольку доставка фермента во все клетки ЦНС является критичным моментом для успешного лечения пациентов.

Для предотвращения такого существенного недостатка насущной необходимостью является разработка способа равномерной доставки генных векторов в ЦНС.

Использование способа клеточно-опосредованной генной терапии, описанной в настоящем техническом решении, позволяет добиться наилучшего биораспределения фермента HexA, а значит обеспечивает эффективность лечения пациентов. При этом обеспечивается наименьшая инвазивность, так как генетически модифицированные клетки будут вводится в организм пациента внутривенно. Далее благодаря способности мезенхимных стволовых клеток мигрировать в ЦНС и секретировать в межклеточное пространство фермент, обеспечивается доставка фермента в нервные клетки путем эндоцитоза.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту WO2019200286A1 «Бицистронные векторы AAV, кодирующие альфа- и бета-субъединицы гексозаминидазы и их использование». Сущностью известного технического решения является изолированная конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая первую экспрессионную кассету, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую альфа-субъединицу гексозаминидазы (HEXA) под контролем первого промотора, и вторая кассета экспрессии, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую бета-субъединицу гексозаминидазы (HEXB) под контролем второго промотора, где первая кассета экспрессии и вторая кассета экспрессии фланкированы инвертированными концевыми повторами (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV). Выделенная конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3, где HexA содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Выделенная конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-4, в которой HexB содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Изолированная конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5, в которой первый интрон расположен между первым промотором и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей HexA, причем первый интрон необязательно представляет собой химерный интрон. Выделенная конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-6, где первый промотор расположен проксимально к ITR AAV, причем первый промотор необязательно расположен между ITR AAV и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей HexA. Способ введения AAV путем внутричерепной, интрацеребральной, внутрижелудочковой, интратекальной инъекции.

Применение векторов, описанных в известном техническом решении, имеет некоторые недостатки, например, есть существенные ограничения введения AAV путем внутричерепной, интрацеребральной, внутрижелудочковой, интратекальной инъекции. Согласно литературным данным, AAV плохо распределяется в ЦНС и не приводит к терапевтическому эффекту при лизосомных болезнях накопления. Плохое биораспределение и высокая инвазивность являются ограничивающими факторами прямого введения вирусных векторов в клинической практике, поскольку доставка функционального фермента во все поврежденные клетки имеет решающее значение для успешного лечения.

Клеточно-опосредованная генная терапия решает многие существующие проблемы, например, благодаря способности стволовых клеток мигрировать в различные ткани и органы (в том числе преодолевать ГЭБ), такой способ обеспечивает хорошее биораспределение и наименьшую инвазивность.

Заявленное техническое решение подразумевает доставку генетического материала, кодирующего фермент HexA, с помощью мезенхимных стволовых клеток и поэтому позволяет повысить эффективность восстановления активности дефицитного фермента и его биораспределения по ЦНС.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту US10265412B2 «Фермент-заместительная терапия для лечения лизосомных болезней накопления». Сущностью известного технического решения является химерный белок для доставки терапевтического фермента через гематоэнцефалический барьер. Химерный белок содержит белковый гормон, который представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) или его предшественник или активный фрагмент, имеющий любую аминокислотную последовательность, из указанных в SEQ ID NO: 5-6 и 9-10, который ковалентно связан с терапевтическим ферментом, который представляет собой β-гексозаминидазу A (HEXA), или ее предшественник, или активный фрагмент, который имеет любую аминокислотную последовательность, из представленных в SEQ ID NO: 13-16, где G-CSF способен преодолевать гематоэнцефалический барьер; и где β-гексозаминидаза A представляет собой фермент, дефицит которого связан с GM2-ганглиозидозом типа I/болезнью Тея-Сакса. Фармацевтическая композиция для местного, интраназального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутриартериального, внутрисуставного, внутриочагового, парентерального введения.

Фермент-заместительная терапия позволяет снижать многие соматические симптомы заболевания, однако несмотря на использование химерного белка, предназначенного для преодоления ГЭБ, отмечаются низкая эффективность для предотвращения нейродегенерации в ЦНС. Местное, интраназальное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрисуставное, парентеральное введения не позволяют достигнуть лучшего распространения фермента по ЦНС.

Доказано, что МСК мигрируют в область воспаления и переодевают ГЭБ. Нейровоспаление характерно для БТС и БС, после внутривенного введения, большая часть МСК мигрируют в очаг воспаления и достигают пораженных участков ЦНС. Клеточно-опосредованная доставка увеличивает вероятность максимального распространения терапевтического фермента по ЦНС.

Заявленное техническое решение позволяет решить такую проблему, как плохое биораспределение, поскольку подразумевает использование именно МСК, генетически модифицированных для сверхэкспрессии и секреции недостающего фермента.

Целью и техническим результатом заявленного технического решения является разработка способа генно-клеточной терапии БТС и БС с применением МСК, генетически модифицированных рекомбинантными лентивирусами или аденоассоциированными вирусами, кодирующими кДНК генов HEXA и HEXB человека, полученные генетически модифицированные МСК позволяют достичь равномерного распределения терапевтического фермента и остановки нейродегенерации у пациентов, обусловленной дефицитом HexA. Указанный технический результат в виде равномерного распределения терапевтического фермента в места нейродегенерации и нейровосполения достигается из-за способности МСК мигрировать в места воспаления и их способности преодолевать гематоэнцефалический барьер.

Сущностью заявленного технического решения является способ терапии болезни Тея-Сакса и болезни Сандхоффа с помощью генетически модифицированных мезенхимных стволовых клеток человека со сверхэкспрессией β-гексозаминидазы A, заключающийся в том, что внутривенно вводят мезенхимные стволовые клетки, предварительно трансдуцированные рекомбинантными лентивирусами LV-HEXA и LV-HEXB или аденоассоциированными вирусами AAV-HEXA и AAV-HEXB, кодирующими гены фермента β-гексозаминидазы А.

Генетически модифицированные мезенхимные стволовые клетки сверхэкспрессируют и секретируют фермент HexA, благодаря их способности мигрировать в ЦНС обеспечивается доставка и равномерное распределение недостающего фермента по всей ЦНС пациентов с БТС и БС.

Заявленное техническое решение поясняется графическими материалами, представленными на Фиг.1 – Фиг.6.

На Фиг. 1 показана ферментативная активность HexA в кондиционированной среде генетически модифицированных (трансфицированных) клетках HEK293T. По оси X указаны образцы кондиционированной среды, где Контроль — нативные клетки HEK293T, pAAV-GFP — клетки, трансфицированные pAAV-GFP, pLX303-HEXA — клетки, трансфицированные pLX303-HEXA, pLX303-HEXB — клетки, трансфицированные pLX303-HEXA, pAAV-HEXA — клетки, трансфицированные pAAV-HEXA, pAAV-HEXB — клетки, трансфицированные pAAV-HEXB, pAAV-GFP — клетки, трансфицированные pAAV-GFP, Контроль — нативные клетки HEK293T.

На Фиг.2 показан результат вестерн-блот анализа экспресии α- и β-субъединиц HexА в генетически модифицированных (трансфицированных) клетках HEK293T, где pLX303-HEXA — клетки, трансфицированные pLX303-HEXA, pLX303-HEXB — клетки, трансфицированные pLX303-HEXA, pAAV-HEXA — клетки, трансфицированные pAAV-HEXA, pAAV-HEXB — клетки, трансфицированные pAAV-HEXB, Нормализация результатов проведена по количеству белка β-актина.

На Фиг. 3 показана ферментативная активность HexA в кондиционированной среде МСК. По оси X указаны образцы кондиционированной среды, где МСК контроль —нативные МСК, МСК AAV-HEXA+AAV-HEXB — МСК, ко-трансдуцированные адено-ассоциированными вирусами AAV-HEXA и AAV-HEXB, МСК LV-HEXA+LV-HEXB —МСК, ко-трансдуцированные лентивирусами LV-HEXA и LV-HEXB, а по оси Y показана относительная ферментативная активность HexA.

На Фиг. 4 показан результат вестерн-блот анализа экспресии α- и β-субъединиц HexА в генетически модифицированных (трансдуцированных) МСК, где нативные МСК — нетрансдуцированные МСК; МСК AAV-HEXA+AAV-HEXB — МСК, ко-трансдуцированные адено-ассоциированными вирусами AAV-HEXA и AAV-HEXB; МСК LV-HEXA+LV-HEXB — МСК, ко-трансдуцированные лентивирусами LV-HEXA и LV-HEXB. Нормализация результатов проведена по количеству белка β-актина.

На Фиг. 5 показаны результаты анализа активности HexA в плазме крови крыс после внутривенного введения генетически модифицированных МСК. По оси X указаны образцы плазмы крыс, где PBS — образцы плазмы крыс, которым внутривенно вводили физиологический раствор; МСК AAV-HEXA+AAV-HEXB — образцы плазмы крыс, которым внутривенно вводили МСК, ко-трансдуцированные адено-ассоциированными вирусами AAV-HEXA и AAV-HEXB; МСК LV-HEXA+LV-HEXB — образцы плазмы крыс, которым внутривенно вводили МСК, ко-трансдуцированные лентивирусами LV-HEXA и LV-HEXB, а по оси Y показана относительная ферментативная активность HexA.

На Фиг. 6 показаны результаты оценки лейкоформулы и клеточности в органах иммунной системы испытуемых крыс на 21 сутки после введения генно-клеточных препаратов. По оси Х указаны образцы цельной крови или гомогенатов органов крыс, где PBS — крысы, которым внутривенно вводили физиологический раствор; МСК AAV-HEXA+AAV-HEXB — крысы, которым внутривенно вводили МСК, ко-трансдуцированные адено-ассоциированными вирусами AAV-HEXA и AAV-HEXB; МСК LV-HEXA+LV-HEXB — крысы, которым внутривенно вводили МСК, ко-трансдуцированные лентивирусами LV-HEXA и LV-HEXB.

Таким образом, графические материалы, иллюстрирующие примеры конкретного выполнения заявленного технического решения, доказывают возможность достижения заявленных технических результатов, а именно:

- ферментативная активность HexA в кондиционированной среде HEK293T, трансфицированных плазмидами pLX303-HEXA, pLX303-HEXB, pAAV-HEXA, pAAV-HEXB, увеличивается в 18-23 раза, сравнительно с образцом кондиционированной среды клеток, трансфицированных плазмидой, кодирующей ген зеленого флуоресцентного белка, и нативных клеток.

- вестерн-блот анализ показывает наличие сверхэкспрессии α- и β-субъединиц в HEK293T, трансфицированных плазмидами pLX303-HEXA, pLX303-HEXB, pAAV-HEXA, pAAV-HEXB. молекулярная масса α- и β-субъединиц соответствуют 70 кДа и 30 кДа соответсвенно.

- ферментативная активность HexA в кондиционированной среде МСК, трансдуцированных AAV-HEXA+AAV-HEXB или LV-HEXA+LV-HEXB, увеличивается в 5 или 7 раз, соответственно, сравнительно с нативными клетками.

- вестерн-блот анализ показывает наличие сверхэкспрессии α- и β-субъединиц в МСК, трансдуцированных AAV-HEXA+AAV-HEXB или LV-HEXA+LV-HEXB, молекулярная масса α- и β-субъединиц соответствуют 70 кДа и 30 кДа соответсвенно.

- ферментативная активности HexA в плазме лабораторных крыс увеличивается после введения генетически модифицированных для сверхэкспрессии HexA МСК. На 7 сутки после введения МСК AAV-HEXA+AAV-HEXB активность HexA в плазме выше в 1,7 раз сравнительно с контрольной группой крыс, которым вводили физиологический раствор. На 21 сутки после введения МСК LV-HEXA+LV-HEXB активность HexA в плазме выше в 2 раза сравнительно с контрольной группой крыс, которым вводили физиологический раствор.

- исследование клеточности органов иммунной системы (селезенка, тимус, костный мозг, лимфоузлы) и лейкоформулы лабораторных крыс показывает, что нет статистической разницы в лейкоформуле и клеточности органов крыс, которым вводили генетически модифицированные МСК, по сравнению с контрольными животными, которым вводили физиологический раствор. Это указывает на безопасность внутривенного введения генетически модифицированных МСК.

Поставленная цель и заявленный технический результат достигается путем генетической модификации мезенхимных стволовых клеток рекомбинантными лентивирусами (LV-HEXA и LV-HEXB) или аденоассоциированными вирусами (AAV-HEXA и AAV-HEXB), кодирующими кДНК генов HEXA и HEXB человека, и их внутривенным введением.

Далее заявителем приведено описание осуществления заявленного технического решения.

Заявленное изобретение осуществляется в 3 этапа в нижеприведённой последовательности, а именно:

1 этап: Получение и анализ функциональности векторных плазмидных конструкций pLX303-HEXA, pLX303-HEXB, pAAV-HEXA, pAAV-HEXB;

2 этап: Получение и анализ функциональности вирусных векторов LV-HEXA, LV-HEXB, AAV-HEXA и AAV-HEXB;

3 этап: Анализ эффективности и безопасности способа на лабораторных крысах дикого типа.

Далее заявителем приведено подробное описание этапов осуществления заявленного технического решения.

1 этап: Получение и анализ функциональности векторных плазмидных конструкций pLX303-HEXA, pLX303-HEXB, pAAV-HEXA, pAAV-HEXB

Субклонирование оптимизированных по кодонному составу кДНК генов HEXA и HEXB в плазмидный вектор pLX303 (Addgene, США) осуществляет компания GenScript (США). Правильность сборки генных конструкций pLX303-HEXA, pLX303-HEXB, pAAV-HEXA, pAAV-HEXB подтверждают рестрикционным анализом.

Для подтверждения функциональности генных конструкций, полученными плазмидами трансфицируют (генетически модифицируют) иммортализированую линию первичных человеческих эмбриональных клеток почки HEK293T. Для этого используют трансфекционный агент TurboFect (Thermo Fisher Scientific Inc., США) в соответствии с методикой, рекомендуемой производителем. Для оценки эффективности трансфекции в качестве положительного контроля используют плазмидный вектор pAAV-GFP, кодирующий зеленый флуоресцентный белок.

Эффективность генетической модификации полученными плазмидными векторами проверяют путем вестрн-блот анализа и теста на активность фермента.

Вестерн-блот анализа проводят с использованием первичных поликлональных антител кролика к HEXA (Кат. №PAA195Hu22, Cloud-Clone Corp., США) разведение 1:300 в блокирующем буфере и HEXB (Кат. №PAA637Hu22, Cloud-Clone Corp., США) разведение 1:250 в блокирующем буфере. По результатам анализа заявителем в образцах лизатов клеток НЕК293Т, трансфицированных pLX303-HEXA, pLX303-HEXB, pAAV-HEXA, pAAV-HEXB, получены ожидаемые размеры α- и β-субъединиц β-гексозаминидазы А примерно по 70 кДа и 30 кДа, соответственно.

Активность фермента HexA определяют в кондиционированной среде HEK293T. Образцы нормализовывают относительно концентрации общего белка. Сбор кондиционированной среды из лунок с клетками НЕК293Т, трансфицированных pLX303-HEXA, pLX303-HEXB, pAAV-HEXA, pAAV-HEXB, проводят через 24 часа после трансфекции. Среду из лунок в объеме, например, 1 мл переносят в 1,5 мл пробирки и центрифугируют в течение, например, 1 минуты при максимальных оборотах для удаления клеточных обломков (дебриса). Супернатант переносят в чистые 1,5 мл пробирки и используют для определения ферментативной активности белка. Образцы переносят в 96-луночный планшет по 60 мкл на лунку. Субстраты добавляют по 25 мкл на лунку. Для анализа общей активности гексозаминидаз (Hex) используют флуоресцентный субстрат 3,2 мM MUG (Lot #SLBN3957B SIGMA), для анализа активности HexA 3.2 мM MUGS (Lot #7-EQJ-32-3 TRC Canada). Субстраты заранее растворяют в цитратно-фосфатном буфере pH = 4,2. Инкубируют 1 час при 37 °С. Реакцию останавливают добавлением 200 мкл глицин-карбонатного буфера (0,17 М глицин, 0,17 М карбонат натрия) в каждую лунку. Уровень флуоресценции измеряют с помощью спектрофотометра TECAN (возбуждение 365 нм, эмиссия 450 нм).

2 этап: Получение и анализ функциональности вирусных векторов LV-HEXA, LV-HEXB, AAV-HEXA, AAV-HEXB in vitro

На основе плазмид получают рекомбинантные вирусы LV-HEXA, LV-HEXB, AAV-HEXA, AAV-HEXB.

Для получения LV-HEXA и LV-HEXB проводят ко-трансфекцию с использованием кальций-фосфатного метода тремя плазмидами (векторная, pCMV-VSV-G (addgene #8454), pCMVR8.74 (addgene #22036)) пакующей линии клеток HEK293T. Сбор вирусного супернатанта проводят 3 раза через каждые 12 часов. Супернатанты объединяют и хранят при 4°С. По завершению сбора супернатанты центрифугируют в течение, например, 5 минут при 1500 об/мин и фильтруют через нейлоновый фильтр с размером пор 0,22 мкм. Концентрирование рекомбинантных лентивирусных частиц проводили методом ультрацентрифугирования в ультрацентрифуге OptimaTM L-90K (Beckman Coulter, США) с ускорением 26000 об/мин в течение 2 часов при температуре 4 °C. Осадок рекомбинантного лентивируса ресуспендируют в 500 мкл культуральной среды, содержимое переносят в криопробирку и хранят при минус 80°C.

Для получения рекомбинантных адено-ассоциированных вирусов используют AAV Helper free system. Клетки AAV293 сеют в количестве 1,5 млн., монослой должен составлять 70-80%. На следующий день проводят ко-трансфекцию с использованием кальций-фосфатного метода тремя плазмидами (векторная плазмида, pAAV-RC и pHelper). Вирус собирают через 72 часа после трансфекции. Клетки собрают скребком, проводят криолиз, центрифугируют при 10 000 × g в течение 10 минут для избавления от клеточного дебриса. Вирусный сток хранят при -80 °C. Вирус концентрируют с использованием AAV Purification Mega Kit (Cell Biolabs, Inc., США) в соответствии с методикой, рекомендуемой производителем.

Полученным рекомбинантным вирусами попарно ко-трансдуцируют (одновременно генетически модифицируют) МСК. Эффективность генетической модификации полученными вирусными векторами проверяют путем вестрн-блот анализа и теста на активность фермента.

3 этап: Анализ эффективности и безопасности трансплантации генетически модифицированных МСК на лабораторных крысах линии Вистар

Для того, чтобы показать эффективность и безопасность применения генетически модифицированных клеток на лабораторных крысах дикого типа, генетически модифицированные крысиные МСК (ко-трансдуцированные LV-HEXA и LV-HEXB или ко-трансдуцированные AAV-HEXA и AAV-HEXB) внутривенно вводят лабораторным крысам, после чего анализируют активность HexA в плазме крови испытуемых крыс.

В работе используют, например, молодых самцов крыс линии Вистар, которые случайным образом распределяют на группы, которым внутривенно вводят:

1) первой группе внутривенно вводили генетически модифицированные МСК LV-HEXA + LV-HEXB в количестве 2 млн клеток в 1 мл физиологического раствора;

2) второй группе внутривенно вводили генетически модифицированные МСК AAV-HEXA + AAV-HEXB в количестве 2 млн клеток в 1 мл физиологического раствора;

3) третьей группе внутривенно вводили 1 мл физиологического раствора.

В каждой группе по 5 особей. Животных содержат в прозрачных пластиковых клетках, цикл свет/темнота – 12:12 часов, при температуре от 21 до 25 °C, с относительной влажностью от 40 до 70% с пищей и водой, доступными ad libitum. Все эксперименты проводятся в соответствии с этическими стандартами и действующим законодательством (протокол утвержден Локальным этическим комитетом Казанского (Приволжского) федерального университета (№23, 30.06.2020)).

До введения у крыс забирают образцы цельной крови в пробирки, содержащие антикоагулянт NaC; плазму из цельной крови выделяют с помощью центрифугирования в течение 20 минут при 1900 об/мин и хранят при минус 80 °С. Также цельную кровь для выделения плазмы забирают через 7, 14, 21 суток после введения клеток. Образцы плазмы используют для определения ферментативной активности HexA.

На 21 сутки после введения генетически модифицированных клеток крыс подвергают СО2-эвтаназии, извлекают тимус, селезенку, лимфатические узлы и трубчатые кости. Лимфоидные органы гомогенизируют и ресуспендируют в охлажденном растворе Хенкса (рН=7,2-7,4) (ПанЭко, Россия) в объеме 5 мл для тимуса, селезенки, в объеме 1 мл для подколенных лимфоузлов и костного мозга. Полученную суспензию фильтруют через два слоя капрона, дважды отмывают путем центрифугирования при 200 g в течение 5 минут. Далее к 0,4 мл 3 % раствора уксусной кислоты с трипановым синим добавляют 10 мкл суспензии и в камере Горяева подсчитывают концентрацию ядросодержащих клеток в органе и определяют соотношение живых и мертвых клеток. Лейкоформулу определяют на автоматическом ветеринарном гематологическом анализаторе Abacus Junior 5 Vet (Diatron, Венгрия).

Результаты, описанные на Этапах 1-3, приведены на Фиг. 1 – Фиг.6.

Из данных, приведенных на Фиг. 1, видно, что ферментативная активность HexA в кондиционированной среде HEK293T, трансфицированных плазмидами pLX303-HEXA, pLX303-HEXB, pAAV-HEXA, pAAV-HEXB, увеличивается в 18-23 раза, сравнительно с образцом кондиционированной среды клеток, трансфицированных плазмидой, кодирующей ген зеленого флуоресцентного белка, и нативных клеток. Такие результаты доказывают функциональность плазмидных конструкций pLX303-HEXA, pLX303-HEXB, pAAV-HEXA, pAAV-HEXB и секрецию генетически модифицированными клетками активного фермента HexA.

Из данных, приведенных на Фиг. 2, видно наличие выраженных специфичных полос иммунопреципитатов, соответствующих ожидаемым молекулярным массам α- и β-субъединиц белка HexA. Плазмиды pLX303-HEXA и pAAV-HEXA экспрессируют ген α- субъединицы белка HexA, размер которой равен 70 кДа. Плазмиды pLX303-HEXB и pAAV-HEXB экспрессируют ген β-субъединицы белка HexA, размер которой равен 30 кДа. Таким образом, показана экспрессия α- и β-субъединиц белка HexA в НЕК293T, генетически модифицированных плазмидами pLX303-HEXA, pLX303-HEXB, pAAV-HEXA, pAAV-HEXB, что доказывает функциональность полученных плазмидных конструкций.

Из данных, приведенных на Фиг. 3, видно, что ферментативная активность HexA в кондиционированной среде МСК, трансдуцированных AAV-HEXA+AAV-HEXB или LV-HEXA+LV-HEXB, увеличивается в 5 или 7 раз, соответственно, сравнительно с нативными клетками. Такие результаты доказывают функциональность вирусных конструкций и успешную экспрессию полноценного активного фермента и его секрецию после ко-трансдукции вирусными векторами AAV-HEXA+AAV-HEXB или LV-HEXA+LV-HEXB.

Из данных, приведенных на Фиг. 4, видно наличие выраженных специфичных полос иммунопреципитатов, соответствующих ожидаемым молекулярным массам α- и β-субъединиц белка HexA. После ко-трансдукции вирусными векторами AAV-HEXA+AAV-HEXB или LV-HEXA+LV-HEXB, МСК экспрессируют обе субъединицы (α и β) белка HexA. Молекулярная масса α- и β-субъединиц соответствуют 70 кДа и 30 кДа соответсвенно.

Из данных, приведенных на Фиг. 5, видно, что после введения генетически модифицированных МСК в плазме крови крыс увеличивается активность фермента HexA. На 7 сутки после введения МСК AAV-HEXA+AAV-HEXB активность HexA в плазме выше в 1,7 раз сравнительно с контрольной группой крыс, которым вводили физиологический раствор. На 21 сутки после введения МСК LV-HEXA+LV-HEXB активность HexA в плазме выше в 2 раза сравнительно с контрольной группой крыс, которым вводили физиологический раствор. Таким образом, эксперименты на лабораторных крысах показали способность МСК, секретирующих фермент HexA, увеличивать уровень активности в плазме крыс.

Из данных, приведенных на Фиг. 6, видно, что клеточность органов иммунной системы (селезенка, тимус, костный мозг, лимфоузлы) и лейкоформула лабораторных крыс не меняется после введения генетически модифицированных МСК, по сравнению с контрольными животными, которым вводили физиологический раствор. Это указывает на то, что внутривенное введение генетически модифицированных МСК не приводит к иммунологическим изменениям в организме испытуемых животных, что в свою очередь подтверждает потенциальную безопасность клеточно-опосредованной доставки генетического материала, кодирующего фермент HexA.

Таким образом, из вышеизложенного можно сделать общий вывод, что заявителем достигнута поставленная цель и заявленный технический результат, а именно - разработан способ лечения БТС и БС.

При этом в примерах конкретного выполнения экспериментально доказано, что путем разработанного способа достигается увеличение активности фермента HexA, недостающего у пациентов с БТС и БС, в плазме крови крыс.

При этом известен уровень технологии преодоления мезенхимными стволовыми клетками гемато-энцефалического барьера и доставки недостающего фермента в ЦНС при лизосомных болезнях накопления. Применение такой технологии было показано для других лизосомных болезней накопления на животных дикого типа. Учитывая этот факт можно утверждать, что такой способ позволяет восстановить активность фермента в ЦНС и, следовательно, метаболизм GM2 ганглиозидов, таким образом достигается остановка нейродегенерации и излечение пациентов.

Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены источники, в которых описаны признаки, совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков, перечисленные в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку из исследованного уровня техники заявителем не выявлены технические решения, характеризующиеся использованием способа терапии БТС и БС, подразумевающего внутривенное введение генетически модифицированных стволовых клеток, сверхэкспрессирующих гены HEXA и HEXB, для восстановления активности фермента в ЦНС и остановки нейродегенерации. Кроме того, заявленное техническое решение, по мнению заявителя, не является очевидным для специалиста, так как обеспечивает реализацию задачи по остановке нейродегенерации и значительному облегчению симптомов практически неизлечимых на дату представления заявочных материалов БТС и БС.

Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как оно может быть использовано в промышленных масштабах для создания препаратов, предназначенных для лечения БТС и БС.

Способ терапии болезни Тея-Сакса и болезни Сандхоффа с помощью генетически модифицированных мезенхимных стволовых клеток человека со сверхэкспрессией β-гексозаминидазы A, заключающийся в том, что внутривенно вводят мезенхимные стволовые клетки, предварительно трансдуцированные рекомбинантными лентивирусами LV-HEXA и LV-HEXB или аденоассоциированными вирусами AAV-HEXA и AAV-HEXB, кодирующими гены фермента β-гексозаминидазы А.