Стабильная фармацевтическая композиция, включающая восстановленную композицию легочного сурфактанта

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, а именно к фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) или других заболеваний, связанных с дефицитом или дисфункцией сурфактанта, в форме водной суспензии, включающей: a) 1,02-1,32 мг/мл полипептидного аналога природного поверхностно-активного белка SP-C с последовательностью SEQ. ID:NO.1; b) 0,136-0,176 мг/мл полипептидного аналога природного поверхностно-активного белка SP-B с последовательностью SEQ. ID:NO. 2; c) 33,42-43,25 мг/мл 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC); d) 33,42-43,25 мг/мл натриевой соли 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (POPG Na); e) 0,5-3,5 мг/мл буферного агента, выбранного из группы, состоящей из гидрохлорида трис(гидроксиметил)аминометана или фосфатного буфера; и f) регулятор тоничности в количестве, достаточном для обеспечения осмолярности от около 250 до около 400 мОсм/л; где pH находится в интервале от 6,4 до 7,6; а также к применению указанной композиции для профилактики и/или лечения RDS или других заболеваний, связанных с дефицитом или дисфункцией сурфактанта. Группа изобретений расширяет арсенал средств, используемых для профилактики и/или лечения RDS или других заболеваний, связанных с дефицитом или дисфункцией сурфактанта. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение направлено на стабильную фармацевтическую композицию в форме водной суспензии, включающей восстановленный легочный сурфактант. Указанная композиция является подходящей для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) и других респираторных расстройств.

Предпосылки создания изобретения

Легкое человека состоит из большого количества маленьких воздушных мешочков, называемых альвеолами, в которых газы обмениваются между кровью и воздушным пространством легких. У здоровых людей этот обмен опосредован присутствием белок-содержащего сурфактантного комплекса, который предотвращает коллапс легких в конце выдоха.

Сурфактантный комплекс легких состоит в основном из липидов и содержит незначительные количества различных белков. Отсутствие адекватных уровней этого комплекса приводит к нарушению функции легких. Этот синдром называется респираторным дистресс-синдромом (RDS) и обычно поражает недоношенных детей.

Указанный синдром эффективно лечится коммерчески доступными модифицированными природными препаратами сурфактантов, выделенных из легких животных, такими как эталонный препарат, известный как Curosurf®.

Основными составляющими этих препаратов сурфактантов являются фосфолипиды и поверхностно-активные гидрофобные белки B и C (SP-B и SP-C).

Из-за недостатков, которые имеют препараты сурфактантов из тканей животных, таких как сложности способа получения и возможное вирусное загрязнение и/или индукция иммунных реакций, появились доступные синтетические сурфактанты.

Указанные синтетические сурфактанты могут представлять собой просто смеси синтетических соединений, преимущественно фосфолипидов и других липидов, и известны как ʺискусственныеʺ сурфактанты; хотя они используются в клинической практике много лет, их эффективность несопоставима с эффективностью модифицированного природного сурфактанта.

Искусственные сурфактанты, также содержащие поверхностно-активные белки/пептиды, также находятся в стадии разработки. Они называются либо ʺвосстановленнымиʺ сурфактантами, либо ʺбиомиметическими сурфактантамиʺ.

Восстановленные сурфактанты, включающие как SP-B, так и SP-C аналоги, напоминающие человеческие поверхностно-активные белки, раскрыты, например, в WO 00/76535, WO 2008/011559 и WO 2008/044109.

Специфический восстановленный сурфактант раскрыт в WO 2010/139442, и указывается в литературе как CHF 5633.

CHF 5633 содержит:

a) 1,5% масс. полипептидного аналога природного поверхностно-активного белка SP-C с последовательностью IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (SEQ. ID:NO.1);

b) 0,2% масс. полипептидного аналога природного поверхностно-активного белка SP-B с последовательностью CWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (SEQ. ID:NO. 2);

c) около 49,15% масс. 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC); и

d) около 49,15% масс. натриевой соли 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (POPG);

все количества указаны в расчете на общую массу восстановленного сурфактанта.

CHF 5633 получают путем смешивания полипептидов и фосфолипидов в присутствии смеси этанола и хлороформа, затем удаления органических растворителей путем выпаривания под вакуумом. Указанный способ позволяет получить концентрированную суспензию в водной среде (до 80 мг/мл) с низкой вязкостью (не больше чем 20 мПа⋅с, предпочтительно меньше чем 15 мПа⋅с при 25°C), где сурфактант находится в форме высокодиспергированной смеси липосомальных везикул, т.е. многослойных везикул (MLV), очень крупных однослойных везикул (GUV), крупных однослойных везикул (LUV) и небольших однослойных везикул (SUV), преимущественно MLV.

Возможность получения концентрированной суспензии в небольшом объеме действительно имеет важное значение для клинического применения.

Указанная выше водная суспензия CHF 5633, при однократном интратрахеальном введении при общей концентрации 80 мг/мл недоношенным младенцам, оказалась безопасной и эффективной.

С другой стороны, помимо хорошей эффективности, указанная выше композиция сурфактанта должна также соответствовать требованию соответствующего срока годности, подходящего для коммерческого распространения, хранения и использования.

Поэтому указанная выше композиция должна демонстрировать по меньшей мере такую же химическую и физическую стабильность модифицированных природных сурфактантов, как Curosurf^®, т.е. по меньшей мере 18 месяцев при 5°C.

Пример 2 WO 2010/139442 указывает, что композиция в форме простой водной суспензии является физически и химически стабильной после 6 месяцев хранения при 5°C.

В этом контексте выражение ʺфизически стабильныйʺ означает inter alia, что вязкость по существу не изменяется с течением времени.

Однако было замечено, что в течение периода больше 6 месяцев вязкость обычно повышается до значений около 50 мПа⋅с при 25°C.

В литературе были сообщения, что гидролиз фосфолипидов как минимум достигает примерно нейтральности, и что на него могут влиять буферные вещества.

WO 92/22315 и WO 2010/139442 в общем виде раскрывают, что синтетический легочный сурфактант, сформулированный в виде жидкой суспензии, может содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как регулирующие pH буферные агенты.

Однако, хотя предшествующий уровень техники содержит некоторое общее указание, касающееся химической стабильности сурфактантов на основе фосфолипидов, ни один документ не раскрывает специфические условия для получения композиции легочного сурфактанта, включающей фосфолипиды в комбинации с синтетическими аналогами SP-C и SP-B белков подходящей химической и физической стабильности для фармацевтического применения, т.е. в течение по меньшей мере 18 месяцев при 5°C.

Эта проблема решается настоящим изобретением.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение направлено на не содержащую пропеллентов готовую к применению фармацевтическую композицию в форме водной суспензии, включающую:

a) 1,02-1,32 мг/мл полипептидного аналога природного поверхностно-активного белка SP-C с последовательностью:

IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (SEQ. ID:NO.1);

b) 0,136-0,176 мг/мл полипептидного аналога природного поверхностно-активного белка SP-B с последовательностью:

CWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (SEQ. ID:NO. 2);

c) 33,42-43,25 мг/мл 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC);

d) 33,42-43,25 мг/мл натриевой соли 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (POPG Na);

e) 0,5-3,5 мг/мл буферного агента, выбранного из группы, состоящей из гидрохлорида трис(гидроксиметил)аминометана или фосфатного буфера; и

f) регулятор тоничности в количестве, достаточном для обеспечения осмолярности от около 250 до около 400 мОсм/л;

где pH находится в интервале от 6,4 до 7,6.

Во втором аспекте изобретение направлено на применение заявленной фармацевтической композиции для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) и других респираторных расстройств.

Изобретение также обеспечивает способ для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) и других респираторных расстройств, при этом указанный способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества указанной фармацевтической композиции.

Изобретение также направлено на набор, включающий: a) композицию по изобретению в форме порошка в первой единичной дозированной форме; b) фармацевтически приемлемый носитель во второй единичной дозированной форме; и c) емкости для содержания указанной первой и второй дозированных форм.

Кроме того, изобретение обеспечивает способ, позволяющий избежать повышения вязкости в процессе хранения фармацевтической композиции в форме водной суспензии восстановленной композиции легочного сурфактанта, включающей фосфолипиды в комбинации с синтетическими аналогами SP-C и SP-B белков, при этом указанный способ включает регулирование pH в пределах от 6,4 до 7,6 при помощи подходящего буферного агента.

Определения

ʺАктивность сурфактантаʺ для препарата сурфактанта определяется как способность снижать поверхностное натяжение.

Эффективность препаратов экзогенных сурфактантов in vitro обычно анализируют путем измерения их способности снижать поверхностное натяжение с использованием подходящего устройства, такого как весы Вильгельми и сурфактометр Captive Bubble.

Эффективность препаратов экзогенных сурфактантов in vivo обычно анализируют путем измерения двух параметров: i) дыхательного объема, который является показателем податливости легких, и ii) объема легочного газа, который является показателем расширения альвеолярного воздуха или проходимости в конце выхода, и, следовательно, возможности формирования стабильной фосфолипидной пленки в альвеолах в конце выдоха.

ʺТерапевтически эффективноеʺ количество, в контексте настоящей заявки, относится к количеству восстановленного легочного сурфактанта, способного предотвращать, избегать, уменьшать или устранять респираторное заболевание или расстройства, ассоциированные с недостатком или дисфункцией эндогенного сурфактанта.

Термин ʺфармацевтически приемлемыйʺ или ʺфизиологически переносимыйʺ относится к композициям, среде, растворителям, солям, которые можно вводить человеку, не вызывая при этом нежелательных физиологических эффектов.

ʺПолипептидʺ, ʺпептидʺ и ʺбелокʺ используются взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков.

Аминокислотные последовательности показаны в соответствии с однобуквенным кодом с аминокислотой, которая несет свободную аминогруппу на левом конце (амино-конец), и аминокислотой, которая несет свободную карбоксильную группу на правом конце (карбокси-конец).

Все идентифицированные аминокислотные остатки находятся в природной L-конфигурации. Значение однобуквенного кода для аминокислот указано, например, в WO 2008/044109.

Термин ʺполипептидный аналог природного поверхностно-активного белка SP-Cʺ означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, в которой, по сравнению с природным SP-C белком, аминокислоты отсутствуют и/или были заменены другими аминокислотами, при условии, что полипептид в смеси с фосфолипидами проявляет активность легочного сурфактанта (что можно продемонстрировать анализами эффективности in vitro и in vivo).

Термин ʺполипептидный аналог природного поверхностно-активного белка SP-Bʺ означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, в которой, по сравнению с природным SP-B белком, аминокислоты отсутствуют и/или были заменены другими аминокислотами, при условии, что полипептид в смеси с фосфолипидами проявляет активность легочного сурфактанта (что можно продемонстрировать анализами эффективности in vitro и in vivo).

ʺРекомбинантныйʺ при использовании в отношении, например, клетки или нуклеиновой кислоты, белка или вектора, указывает на то, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменения природной нуклеиновой кислоты или белка.

Термин ʺоколоʺ в применении к значению указывает вариабельность ± 1%.

Термин ʺфосфолипидыʺ означает липиды, в которых одна жирная кислота была заменена фосфатной группой и простой органической молекулой. Наиболее распространенным классом фосфолипидов, которые могут присутствовать в препаратах сурфактантов, являются: фосфатидилхолины (PC), фосфатидилэтаноламин (PE) фосфатидилглицерин (PG), фосфатидилинозит (PI) и фосфатидилсерин (PS).

Глицериновые фрагменты фосфолипидов в основном этерифицированы длинноцепочечными жирными кислотами, которые, в свою очередь, могут быть насыщенными (например, миристиновая, пальмитиновая и стеариновая кислота), мононенасыщенными (например, олеиновая кислота) или полиненасыщенными (например, линолевая и арахидоновая кислота).

В частности, вещества, рассматриваемые в настоящей заявке, являются следующими:

- 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин, также известный как дипальмитоил-фосфатидилхолин (DPPC), который является насыщенным производным, и 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин, также известный как пальмитоил-олеил-фосфатидилглицерин (POPG), который является мононенасыщенным производным.

В настоящей заявке размер частиц везикул выражен как объемный диаметр, в частности, как d(v,50), который соответствует объему 50 массовых процентов частиц.

Указанный размер частиц можно определить известными методами, такими как лазерная дифракция или метод оптического определения размеров отдельных частиц.

Термин ʺфосфатный буферʺ относится к фармацевтически приемлемым буферным агентам, широко используемым в биологических применениях, имеющих, например, одну из следующих композиций: Na₂HPO₄ гептагидрат и NaH₂PO₄ моногидрат, или Na₂HPO₄ дигидрат и NaH₂PO₄ дигидрат, или NaCl, KCl, Na₂HPO₄ и KH₂PO₄ (далее PBS), или NaCl, Na₂HPO₄ гептагидрат и NaH₂PO₄ моногидрат.

Указанные буферы имеют pKa₂ около 7,2 при 25°C, и их наилучшая буферная емкость находится в пределах pH 6,5-8,0.

ʺГидрохлорид трис(гидроксиметил)аминометанаʺ, также известный как 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол гидрохлорид или TRIS, является фармацевтически приемлемым буферным агентом, широко используемым в биологических применениях.

TRIS имеет pKa 8,06 при 25°C, и его наилучшая буферная емкость находится в пределах pH 7,2-8,5.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано частью на неожиданном открытии, что можно избежать повышения вязкости в процессе хранения фармацевтической композиции в форме водной суспензии восстановленной композиции легочного сурфактанта, включающей фосфолипиды в комбинации с синтетическими аналогами SP-C и SP-B белков.

Хотя очень хорошо известно, что рН влияет на кинетику гидролиза фосфолипидов, было обнаружено, что контроль рН также важен для поддержания низкой вязкости указанных восстановленных легочных сурфактантов в процессе хранения. Также известно, что начальная вязкость водных суспензий фосфолипидов зависит от распределения частиц по размерам и формы везикул, что, в свою очередь, зависит от способа, применяемого для изготовления легочного сурфактанта.

Поэтому также было обнаружено, что после образования везикул, чтобы избежать изменения их размеров и формы в процессе хранения, необходимо строго контролировать тип и количество буферного агента.

В частности, количество буфера не должно быть ни слишком высоким, чтобы избежать явления слияния или осаждения везикул, ни слишком низким, чтобы не уменьшалась его буферная емкость.

Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение направлено на не содержащую пропеллентов готовую к применению фармацевтическую композицию в форме водной суспензии, включающую:

a) 1,02-1,32, предпочтительно 1,2 мг/мл, полипептидного аналога природного поверхностно-активного белка SP-C с последовательностью:

IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (SEQ. ID:NO.1);

b) 0,136-0,176 мг/мл, предпочтительно 0,16 мг/мл, полипептидного аналога природного поверхностно-активного белка SP-B с последовательностью:

CWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (SEQ. ID:NO. 2);

c) 33,42-43,25 мг/мл, предпочтительно 39,32 мг/мл, 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC);

d) 33,42-43,25 мг/мл, предпочтительно 39,32 мг/мл, натриевой соли 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (POPG Na);

e) 0,5-3,5 мг/мл буферного агента, выбранного из группы, состоящей из гидрохлорида трис(гидроксиметил)аминометана или фосфатного буфера; и

f) регулятор тоничности в количестве, достаточном для обеспечения осмолярности от около 250 до около 400 мОсм/л;

где pH находится в интервале от 6,4 до 7,6.

Указанная выше композиция оказалась физически и химически стабильной в течение по меньшей мере 18 месяцев при 5°C, и, что неожиданно, не наблюдалось никакого повышения вязкости.

Кроме того, указанная композиция остается легко поддающейся повторному диспергированию в течение продолжительного периода времени, а при повторном диспергировании не флоккулирует так быстро, чтобы препятствовать воспроизводимому дозированию активных ингредиентов.

Полипептид с SEQ ID: NO.1 также был идентифицирован в данной области как SPC-33 (leu), тогда как полипептид с SEQ ID: NO.2 также был идентифицирован как Мини-B(leu).

В предпочтительном варианте осуществления полипептид с SEQ ID: NO2 находится в форме дисульфид-связанной молекулы, где внутримолекулярные дисульфидные связи находятся между двумя цистеиновыми остатками в положениях 1 и 33 и/или между двумя цистеиновыми остатками в положениях 4 и 27.

Указанный полипептид также был идентифицирован в данной области как окисленный Мини-B(leu).

Предпочтительно оба полипептида могут присутствовать в форме фармацевтически приемлемых солей. Указанные соли включают, например, соли хлористоводородной кислоты, уксусной кислоты и трифторуксусной кислоты.

Предпочтительно оба полипептида присутствуют в композиции в форме ацетатов.

Натриевая соль 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (POPG) предпочтительно может присутствовать в форме эквивалентной фармацевтически приемлемой соли, например, калиевой соли. Соответствующее относительное количество может легко определить специалист в данной области.

Вышеуказанная композиция должна иметь осмолярность от около 250 до около 400 мОсм/л, предпочтительно от 280 до 380 мОсм/л, более предпочтительно от 300 мОсм/л до 350 мОсм/л.

Предпочтительно регулятор тоничности выбран из группы, состоящей из декстрозы, маннита, сорбита, хлорида калия и хлорида натрия.

Регулятор тоничности предпочтительно представляет собой хлорид натрия в концентрации 9 мг/мл.

рН композиции находится в пределах от 6,4 до 7,6, предпочтительно от 6,5 до 7,5, более предпочтительно от 6,8 до 7,4, наиболее предпочтительно от 6,9 до 7,2.

pH можно определить в соответствии с хорошо известными методами, и при определении значений следует учитывать экспериментальную ошибку, обычно ± 0,2 единицы.

Буферный агент предпочтительно выбран из гидрохлорида трис(гидроксиметил)аминометана (ТРИС) или фосфатного буфера.

Количество буферного агента предпочтительно находится в интервале от 0,5 мг/мл до 3,5 мг/мл, предпочтительно от 0,6 до 3,0 мг/мл, что соответствует 5-20 ммоль, предпочтительно 10 ммоль.

Предпочтительно фосфатный буферный агент можно использовать в концентрации от 0,6 до 2,8 мг/мл.

В одном варианте осуществления изобретения фосфатный буфер представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)

В более предпочтительном варианте осуществления буферный агент может быть получен из Na₂HPO₄ гептагидрата и NaH₂PO₄ моногидрата или Na₂HPO₄ дигидрата и NaH₂PO₄ дигидрата.

В случае фосфатного буферного агента количество рассчитывают без учета степени гидратации солей, образующих указанный буфер.

Соответствие между концентрацией буферного агента в мг/мл и ммоль может легко определить специалист в данной области.

Специалист в данной области также должен правильно отрегулировать относительные количества двух видов фосфатов для достижения желаемого значения рН в заявленном интервале.

Предпочтительно вязкость композиции по изобретению меньше чем 10 мПа⋅с (1 мПа⋅с соответствует 1 сПз), предпочтительно меньше чем 8 мПа при 37°С. Вязкость составляет менее 15 мПа⋅с, предпочтительно менее 10 мПа⋅с при 25°С. Вязкость существенно не изменяется в процессе хранения.

Вязкость можно определить с использованием обычного вискозиметра, доступного на рынке, в соответствии с известными методами.

Размер частиц везикул составляет от 1 до 25 микрон, предпочтительно с d(v,50) от 8 до 15 микрон, как определено с использованием устройства Accusizer 780 AD (Tee Hai Chem Pte Ltd, Singapore).

Полипептиды с SEQ ID:NO.1 и SEQ ID:NO.2 можно получить в соответствии с известными способами синтетеза или известными рекомбинантными методами.

Отличный обзор существующих методов можно найти в J.M. Steward and J.D. Young, ʺSolid Phase Peptide Synthesisʺ, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, и J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides", Vol.2, p. 46, Academic Press (New York), 1983 для твердофазного пептидного синтеза, и в E. Schroder and K. Kubke, "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 для классического синтеза в растворе.

Полипептиды предпочтительно можно получить с использованием метода твердофазного синтеза, первоначально описанного Merrifield, в J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963). Другие методы полипептидного синтеза можно найти, например, в M. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2^nd Ed., (1976), а также в других известных справочниках.

Подходящие защитные группы для использования в таких методах синтеза можно найти в указанных выше справочниках, а также в J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY (1973).

Например, оба полипептида можно получить, как описано в WO2008044109.

Эффективные дозы композиции восстановленного сурфактанта по изобретению для лечения заболевания, такого как RDS, как описано ниже, варьируются в зависимости от многих различных факторов, включая тип заболевания, способы введения, массу тела и физиологическое состояние пациента, и от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим.

Как правило, доза составляет от 0,01 мг до 10 г на кг массы тела, предпочтительно от 0,1 до 1 г на кг массы тела, и частота введения может варьироваться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Как правило, дозу около 50 мг/кг, 100 мг/кг или 200 мг/кг вводят в виде одной дозы. Для применения для новорожденных обычно достаточно одного или двух введений.

Хотя потребности могут варьироваться в зависимости от тяжести респираторного заболевания и/или других переменных, квалифицированный специалист сможет легко определить оптимальные диапазоны эффективных доз.

Композиции могут быть представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах, например, в запаянных ампулах и флаконах, или могут храниться в замороженном или высушенном замораживанием (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя непосредственно перед использованием.

Предпочтительно, композицию по изобретению поставляют в виде стерильной водной суспензии в одноразовых стеклянных флаконах.

Общая концентрация полипептидов а) и b) и фосфолипидов с) и d) обычно находится в диапазоне от 20 мг/мл до 100 мг/мл. В случае формулирования композиции для одного флакона концентрация предпочтительно составляет 80 мг/мл.

Восстановленный легочный сурфактант, присутствующий в фармацевтической композиции по изобретению, можно получить в соответствии со способами, которые являются общепринятыми в фармацевтической промышленности. Такие способы включают стадию смешивания полипептидов и фосфолипидов в присутствии органического растворителя. Затем растворитель удаляют путем диализа или выпаривания в атмосфере азота и/или в условиях вакуума или другими известными подходящими способами, такими как лиофилизация.

Предпочтительно, когда указанный восстановленный легочный сурфактант смешивают с полипептидами и фосфолипидами в присутствии хлороформа и этанола в соотношении 98:2 (об/об), с последующим удалением обоих растворителей выпариванием в атмосфере азота.

Полученный порошок затем приводят в однородную и тесную ассоциацию с жидким носителем.

Смесь полипептидов и фосфолипидов можно стерилизовать перед удалением растворителя, например, путем стерильного фильтрования. В некоторых других вариантах осуществления композицию восстановленного сурфактанта окончательно стерилизуют в соответствии с известными способами.

Введение композиции по изобретению осуществляют известным способом, например, при помощи устройства для интратрахеального введения (инфузия или болюс или через катетер).

Как раскрыто в настоящей заявке, композицию сурфактанта обычно используют для болюсного типа введения, отдельно или необязательно вместе с другими соединениями или композициями для лечения респираторных заболеваний или расстройств. Например, если субъекта лечат от респираторного расстройства, вызванного бактериальной инфекцией, то восстановленный сурфактант по изобретению можно вводить вместе с другим соединением, используемым для лечения бактериальной инфекции, таким как антибиотик.

Или в некоторых случаях, например, для предотвращения осложнений, таких как бронхолегочная дисплазия, восстановленный сурфактант по настоящему изобретению можно вводить вместе с кортикостероидами, такими как будесонид и беклометазона дипропионат.

Композиция по изобретению и носитель для ресуспендирования могут быть упакованы отдельно в одно и то же время в подходящие контейнеры. Такая отдельная упаковка компонентов в подходящий контейнер также описана как набор.

Поэтому настоящее изобретение также направлено на набор, включающий: a) композицию по изобретению в форме порошка в первой единичной дозированной форме; b) фармацевтически приемлемый носитель во второй единичной дозированной форме; и c) емкости для содержания указанной первой и второй дозированных форм.

Известны различные способы для введения композиций по изобретению.

В зависимости от типа заболевания, например, младенец или взрослый с респираторным дистресс-синдромом, разные способы лечения могут быть подходящими.

Как правило, композицию по изобретению вводят путем эндотрахеальной инстилляции пациентам (например, недоношенным младенцам), которые находятся под постоянной или перемежающейся вентиляцией с положительным давлением (IPPV).

Альтернативно, сурфактант можно вводить с использованием тонкого катетера, вставленного в трахею, и при этом дыхание пациента поддерживают при помощи специально предназначенных для этого назальных устройств, таких как маски, канюли или трубки, в соответствии с методом, известным как положительное непрерывное давление в дыхательных путях (nCPAP).

Последний подход возможен только с сурфактантом, имеющим низкую вязкость, так как высокая вязкость может затруднять прохождение сурфактанта через тонкий катетер.

Композиция по изобретению является подходящей для предотвращения, задержки, облегчения, остановки или ингибирования развития симптомов или состояний, ассоциированных с респираторным заболеванием.

В частности, она полезна для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) у недоношенных детей или других заболеваний, связанных с дефицитом или дисфункцией сурфактанта, включая острое повреждение легких (ALI), RDS у взрослых (ARDS), синдром аспирации мекония (MAS) и бронхолегочную дисплазию (BPD).

Она также может быть полезна для профилактики и/или лечения других респираторных заболеваний, таких как хроническая обструктивная болезнь легких (COPD), астма, респираторная инфекция (например, пневмония, pneumocystits carinii, муковисцидоз и респираторно-синцитиальный вирус), а также для лечения серозного среднего отита (экссудативный отит).

Следующие примеры более подробно иллюстрируют изобретение.

Пример 1 - Получение композиций в соответствии с изобретением

Смесь DPPC:POPG Na в соотношении 1:1, SPC-33(leu) и окисленного Мини-B(leu) растворяли в хлороформе/этаноле 98:2 (об/об).

Растворитель выпаривали и полученный порошок затем гидратировали в водном растворе 0,9% масс/об NaCl при перемешивании и в присутствии 10 ммоль фосфатно-солевого буферного раствора, с получением концентрации сурфактанта 80 мг/мл.

Унитарный состав для композиции 1 представлен в Таблице 1.

Таблица 1 Композиция 1
Ингредиент	%	Конц.
SP-C33(leu)	1,49	1,2 мг/мл
Окисленный Мини-B(leu)	0,2	0,16 мг/мл
DPPC	48,7	39,32 мг/мл
POPG Na	48,7	39,32 мг/мл
Na2HPO4 гептагидрат		0,58 мг/мл
NaH2PO4 моногидрат		1,55 мг/мл
NaCl		9 мг/мл
Вода q.b.

pH, как оказалось, равен 6,9 ± 0,2.

Вязкость указанной композиции была около 9 сПз при 25°C и около 7 сПз при 37°C.

Подобные композиции были получены путем замены PBS на либо 10 ммоль TRIS HCl, либо 10 ммоль фосфатного буфера, полученного из Na₂HPO₄ дигидрата и NaH₂PO₄ дигидрата.

Пример 2 - Исследования стабильности, которые осуществляли на композициях Примера 1

Стабильность композиции, содержащейся в 3-мл флаконах из темного стекла, оценивали при 5°С. Анализ SPC-33(leu), окисленного Мини-B(leu) и двух фосфолипидов определяли методом ВЭЖХ. Общее количество примесей также определяли при помощи ВЭЖХ и выражали в процентах.

Все примеси составляют лизо-формы лизо-PС и лизо-PG, образующиеся в процессе хранения.

Также были проанализированы следующие параметры: pH, вязкость и размер частиц везикул. Для определения вязкости образец оставляли для восстановления при 37°С.

Результаты представлены в Таблице 2.

Композиция по изобретению оказалась физически и химически стабильной в течение по меньшей мере 18 месяцев при 5°С. Фактически не наблюдалось никаких существенных изменений в анализе четырех компонентов в пределах принятой экспериментальной ошибки (±5%).

Общее количество лизо-PС+лизо-PG было значительно ниже 5,0%.

Кроме того, вязкость оставалась практически неизменной в пределах экспериментальной ошибки, и никакого существенного повышения не наблюдалось.

Аналогичные результаты наблюдали с композицией 2

Таблица 2 Стабильность композиции 1
Композиция 1	pH	Вязкость мПа.с	Размер частиц (микрон)	SPC-33(leu) мг/мл % исходн.	Мини-B(leu) мг/мл %исходн.	DPPC мг/мл % исходн.	POPG Na мг/мл % исходн.	Общее количество примесей (%)
Требования	6,5-7,5	<25 мПа.с	1,0-25 d(v,50) 8-15	1,02-1,32	0,136-0,176	33,42-43,25	33,42-43,25
Исходное значение (t=0)	6,9	7,2	-	1,15 100,0	0,158 100,0	39,55 100,0	38,33 100,0	0,50
t=3 месяца	6,9	5,4	-	1,15 100,0	0,160 101,3	39,07 98,8	38,87 101,4	0,61
t=6 месяцев	6,9	6,8	-	1,14 99,1	0,157 99,4	39,15 99,0	39,06 101,9	1,03
t=12 месяцев	6,9	8,1	-	1,15 100,0	0,151 95,6	38,16 96,5	38,64 100,8	0,94
t=18 месяцев	6,9	6,9	соответствует	1,15 100,0	0,151 95,6	38,96 98,5	38,45 100,3	2,60

Пример 3 - in vivo активность композиции 1

Активность композиции 1 Примера 1 in vivo испытывали при t=0 и после 18 месяцев при 5°C.

Ее анализировали на недоношенных новорожденных кроликах, полученных гистерэктомией в гестационном возрасте 27 дней. Эксперименты осуществляли без приложения положительного давления в конце выдоха (PEEP).

Животные, получавшие Curosurf®, служили в качестве положительных контролей, а необработанные однопометные животные в качестве отрицательных контролей.

Все препараты сурфактанта вводили в концентрации 80 мг/мл и при стандартной дозе 2,5 мл/кг.

Недоношенных новорожденных кроликов подвергали вентилированию параллельно со стандартизованной последовательностью пиковых инсуффляционных давлений. Для раскрытия легких давление сначала устанавливали на 35 см H₂O в течение 1 мин. После этого рекрутмент-маневра давление снижали до 25 см H₂O на 15 минут и далее до 20 и 15 см H₂O.

В конце, давление снова увеличивали до 25 см H₂O в течение 5 минут, после чего легкие вентилировали еще в течение 5 минут азотом, а затем вырезали для измерения объема газа.

Измеряли как дыхательные объемы, так и объемы легочного газа, выраженные в мл/кг, и они оказались одинаковыми при t=0 и после 18 месяцев при 5°C.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Chiesi Farmaceutici spa

<120> СТАБИЛЬНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ВОССТАНОВЛЕННУЮ

КОМПОЗИЦИЮ ЛЕГОЧНОГО СУРФАКТАНТА

<130> 1721PCT

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu Leu Gly

20 25 30

Leu

<210> 2

<211> 34

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 2

Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Leu Ile Pro

1 5 10 15

Lys Gly Gly Arg Leu Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg

20 25 30

Cys Ser

<---

1. Не содержащая пропеллентов готовая к применению фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) или других заболеваний, связанных с дефицитом или дисфункцией сурфактанта, в форме водной суспензии, включающая:

a) 1,02-1,32 мг/мл полипептидного аналога природного поверхностно-активного белка SP-C с последовательностью:

IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (SEQ. ID:NO.1);

b) 0,136-0,176 мг/мл полипептидного аналога природного поверхностно-активного белка SP-B с последовательностью:

CWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (SEQ. ID:NO. 2);

c) 33,42-43,25 мг/мл 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC);

d) 33,42-43,25 мг/мл натриевой соли 1-пальмитоил-2-олеил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (POPG Na);

e) 0,5-3,5 мг/мл буферного агента, выбранного из группы, состоящей из гидрохлорида трис(гидроксиметил)аминометана или фосфатного буфера; и

f) регулятор тоничности в количестве, достаточном для обеспечения осмолярности от около 250 до около 400 мОсм/л;

где pH находится в интервале от 6,4 до 7,6.

2. Композиция по п. 1, где концентрация полипептида с SEQ. ID:NO.1 составляет 1,2 мг/мл, концентрация полипептида с SEQ. ID:NO.2 составляет 0,16 мг/мл и концентрации обоих DPPC и POPG Na составляют 39,32 мг/мл.

3. Композиция по п. 1 или 2, где концентрация буферного агента находится в интервале от 0,6 до 3,0 мг/мл.

4. Композиция по любому из пп. 1-3, где pH находится в интервале от 6,5 до 7,5.

5. Композиция по любому из предшествующих пунктов, имеющая осмолярность от около 250 до около 400 мОсм/л.

6. Композиция по п. 5, где осмолярность составляет от 280 мОсм/л до 380 мОсм/л.

7. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где регулятор тоничности выбран из группы, состоящей из декстрозы, маннита, сорбита, хлорида калия и хлорида натрия.

8. Композиция по п. 7, где регулятор тоничности представляет собой хлорид натрия.

9. Композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающая кортикостероид, такой как беклометазон дипропионат или будесонид.

10. Применение композиции по любому из предшествующих пунктов для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (RDS) или других заболеваний, связанных с дефицитом или дисфункцией сурфактанта.

11. Применение по п. 10, где другое заболевание включает RDS у взрослых (ARDS), синдром аспирации мекония (MAS) и бронхолегочную дисплазию (BPD).