Новый бактериофаг clo-pep-2 clostridium perfringens и его применение для ингибирования пролиферации clostridium perfringens



Владельцы патента RU 2748805:

ИНТРОН БАЙОТЕКНОЛОДЖИ, ИНК. (KR)

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к бактериофагу Clo-PEP-2 семейства Siphoviridae (номер доступа: KCTC 13185BP), имеющему природное происхождение, который обладает способностью уничтожать Clostridium perfringens и имеет геном, представленный SEQ ID NO: 1, и к способу предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением композиции, содержащей бактериофаг Siphoviridae Clo-PEP-2 в качестве активного ингредиента. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к бактериофагу, имеющему природное происхождение, который заражает Clostridium perfringens и, таким образом, уничтожает Clostridium perfringens, и к способу предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением композиции, содержащей вышеуказанный бактериофаг в качестве активного ингредиента. Более конкретно, настоящее изобретение относится к бактериофагу Clo-PEP-2 семейства Siphoviridae (учетный номер: KCTC 13185BP), имеющему природное происхождение, который обладает способностью уничтожать Clostridium perfringens и имеет геном, представленный SEQ ID NO: 1, и к способу предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением композиции, содержащей вышеуказанный бактериофаг в качестве активного ингредиента.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Clostridium perfringens, представляющий собой аэрофобный анаэроб (бактерия, которая растет с трудом или не растет вообще в присутствии кислорода), является причиной серьезных заболеваний у людей или животных, таких как крупный рогатый скот, свиньи, козы и тому подобное, и, в частности, является основной причиной некротического энтероколита и пищевого отравления. Основные экзотоксины, продуцируемые Clostridium perfringens, представлены в четырех формах, а именно α, β, ε и i. В зависимости от наличия или отсутствия этих токсинов, бактерии Clostridium perfringens подразделяются на шесть типов от A до F. Среди них Clostridium perfringens типа A представляет собой типичную причину пищевого отравления и выделяет только α-токсин, и Clostridium perfringens типа C, который, как известно, вызывает некротический энтерит, выделяет α-токсин и β-токсин.

В последнее время частота заражений Clostridium perfringens увеличивается в птицеводческой промышленности и, таким образом, наносит серьезный ущерб фермам. В частности, ущерб, вызванный заражением Clostridium perfringens у цыплят-бройлеров, является очень серьезным. В последнее время частота заражений Clostridium perfringens, также возрастает в промышленном свиноводстве, и ущерб, связанный с этим, увеличивается. Таким образом, крайне необходимо разработать способы, позволяющие эффективно справляться с заражением Clostridium perfringens.

Несмотря на применение различных антибиотиков для предупреждения или лечения заболеваний, вызванных Clostridium perfringens, в наши дни увеличивается число бактерий, устойчивых к этим антибиотикам, и, следовательно, актуальна разработка других способов, помимо антибиотиков.

В последнее время применение бактериофагов в качестве противодействия инфекционным бактериальным заболеваниям привлекает значительное внимание. В частности, этим бактериофагам уделяется большое внимание из-за сильной антибактериальной активности против устойчивых к антибиотикам бактерий. Бактериофаги представляют собой очень маленькие микроорганизмы, заражающие бактерии, и их обычно называют просто "фагами". Как только бактериофаг заражает бактерию, бактериофаг размножается внутри бактериальной клетки. После пролиферации потомство бактериофага разрушает бактериальную клеточную стенку и покидает бактерию-хозяина, подтверждая, что бактериофаг обладает способностью уничтожать бактерии. Способ, которым бактериофаг заражает бактерии, характеризуется их очень высокой специфичностью, и, таким образом, диапазон типов бактериофагов, заражающих конкретную бактерию, ограничен. То есть определенный бактериофаг может заражать только конкретную бактерию, что позволяет предположить, что определенный бактериофаг способен обеспечить антибактериальное действие только в отношении конкретной бактерии. Вследствие этой бактериальной специфичности бактериофагов, бактериофаг оказывает антибактериальное действие только на бактерии-мишени, но не воздействует на комменсальные бактерии в окружающей среде или в кишечнике животных. Типичные антибиотики, широко применяемые для антибактериального лечения, случайно влияют на многие другие виды бактерий. Это вызывает такие проблемы, как загрязнение окружающей среды и нарушение нормальной флоры у животных. Напротив, применение бактериофагов не нарушает нормальную флору животных, потому что происходит избирательное уничтожение бактерии-мишени. Следовательно, бактериофаги можно безопасно применять, что, таким образом, значительно снижает вероятность побочных эффектов их применения по сравнению с антибиотиками.

Бактериофаги были впервые обнаружены английским бактериологом Туортом в 1915 году, когда он заметил, что микрококковые колонии размягчаются и становятся прозрачными вследствие чего-то неизвестного. В 1917 году французский бактериолог д'Эрелль обнаружил, что Shigella dysenteriae в фильтрате фекалий больных дизентерией были чем-то убиты, и продолжил изучение этого явления. В результате он независимо идентифицировал бактериофаги и назвал их бактериофагами, что означает "пожиратель бактерий". С тех пор постоянно продолжают выявлять бактериофаги, действующие против таких патогенных бактерий, как Shigella, Salmonella Typhi и Vibrio cholerae.

Благодаря уникальной способности бактериофагов уничтожать бактерии, бактериофаги привлекают внимание в качестве потенциально эффективной меры противодействия бактериальной инфекции с момента их открытия, и было проведено множество исследований, связанных с ними. Однако, так как Флемингом был обнаружен пенициллин, исследования бактериофагов продолжались только в некоторых странах Восточной Европы и бывшем Советском Союзе, вследствие распространения антибиотиков. С 2000 года ограничения типичных антибиотиков стали очевидными из-за увеличения количества устойчивых к антибиотикам бактерий, и была отмечена возможность развития бактериофагов в качестве замены типичных антибиотиков, и, таким образом, бактериофаги снова привлекают внимание в качестве антибактериальных агентов.

Как показано выше, бактериофаги имеют тенденцию быть высокоспецифичными для бактерий-мишеней. Из-за высокой специфичности бактериофагов к бактериям, бактериофаги часто проявляют антибактериальный эффект только в отношении определенных штаммов бактерий, даже в пределах одного и того же вида. Кроме того, антибактериальная сила бактериофагов может варьироваться в зависимости от целевого бактериального штамма. Следовательно, необходимо собрать много видов бактериофагов, которые полезны для эффективного контроля конкретных бактерий. Следовательно, чтобы разработать эффективный способ применения бактериофагов для борьбы с Clostridium perfringens, необходимо получить много видов бактериофагов, проявляющих антибактериальное действие в отношении Clostridium perfringens. Кроме того, полученные бактериофаги необходимо подвергнуть скринингу на предмет того, превосходят ли они другие по антибактериальной силе и спектру.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Таким образом, авторами настоящего изобретения сделана попытка разработки композиции, применимой для предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением бактериофага, имеющего природное происхождение, и способного к уничтожению Clostridium perfringens, и, кроме того, разработки способа предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением композиции. В результате авторами настоящего изобретения выделен бактериофаг, имеющий природное происхождение и подходящий для указанной цели, и определена последовательность генома, которая отличает выделенный бактериофаг от других бактериофагов. Затем, авторами настоящего изобретения разработана композиция, содержащая бактериофаг в качестве активного ингредиента, и установлено, что данную композицию можно применять для эффективной предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, обеспечивая, таким образом, настоящее изобретение.

Соответственно, целью настоящего изобретения является обеспечение бактериофага Clo-PEP-2 семейства Siphoviridae (учетный номер: KCTC 13185BP), имеющего природное происхождение, который обладает способностью специфически уничтожать Clostridium perfringens и имеет геном, представленный SEQ ID NO: 1.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение композиции, применимой для предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, которая содержит в качестве активного ингредиента выделенный бактериофаг Clo-PEP-2 (учетный номер: KCTC 13185BP), заражающий Clostridium perfringens, и, таким образом, уничтожающий Clostridium perfringens.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением композиции, применимой для предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, содержащей в качестве активного ингредиента выделенный бактериофаг Clo-PEP-2 (учетный номер: KCTC 13185BP), заражающий Clostridium perfringens, и, таким образом, уничтожающий Clostridium perfringens.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в обеспечении дезинфицирующего средства для предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением вышеописанной композиции.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в обеспечении добавки для питьевой воды для предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением вышеописанной композиции.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в обеспечении кормовой добавки, дающей эффект при кормлении путем предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением вышеописанной композиции.

Техническое решение

Настоящее изобретение обеспечивает бактериофаг Clo-PEP-2 семейства Siphoviridae, имеющий природное происхождение (учетный номер: KCTC 13185BP), который обладает способностью специфически уничтожать Clostridium perfringens и имеет геном, представленный SEQ ID NO: 1, и способ предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением композиции, содержащей бактериофаг Clo-PEP-2 семейства Siphoviridae в качестве активного ингредиента.

Авторами настоящего изобретения выделен бактериофаг Clo-PEP-2 и затем депонирован в Корейской коллекции типовых культур, Корейский научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологии 11 января 2017 г. (учетный номер: KCTC 13185BP).

Настоящее изобретение также обеспечивает дезинфицирующее средство, добавку для питьевой воды и кормовую добавку, применимые для предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, которые содержат бактериофаг Clo-PEP-2 в качестве активного ингредиента.

Поскольку бактериофаг Clo-PEP-2, содержащийся в композиции по настоящему изобретению, эффективно уничтожает Clostridium perfringens, он эффективен для предупреждения (предупреждения инфекции) или лечения (лечения инфекции) заболевания, вызванного Clostridium perfringens. Следовательно, композицию по настоящему изобретению можно применять для предупреждения и лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens.

В контексте настоящего документа термины "предупреждение" и "предупреждать" относятся к (i) предупреждению инфекции Clostridium perfringens и (ii) ингибированию развития заболевания, вызванного инфекцией Clostridium perfringens.

В контексте настоящего документа термины "лечение" и "лечить" относятся ко всем действиям, которые (i) подавляют заболевание, вызванное Clostridium perfringens, и (ii) облегчают патологическое состояние заболевания, вызванного Clostridium perfringens.

В контексте настоящего документа термины "выделять", "выделение" и "выделенный" относятся к действиям, которые обеспечивают выделение бактериофагов из природной среды с применением разнообразных экспериментальных подходов, и которые обеспечивают характеристики, отличающие бактериофаг по настоящему изобретению от других, и дополнительно включают пролиферацию бактериофага по настоящему изобретению с применением биоинженерных технологий, таким образом бактериофаг является промышленно применимым.

Фармацевтически приемлемый носитель, включенный в композицию по настоящему изобретению, представляет собой носитель, который обычно применяют для получения фармацевтической композиции, и его примеры включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло, но не ограничиваются ими. Композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать смазывающие вещества, смачивающие агенты, подсластители, ароматизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты и консерванты, в дополнение к вышеуказанным ингредиентам.

Композиция по настоящему изобретению содержит бактериофаг Clo-PEP-2 в качестве активного ингредиента. Концентрация бактериофага Clo-PEP-2 составляет от 1×101 до 1×1030 БОЕ/мл или от 1×101 БОЕ/г до 1×1030 БОЕ/г и предпочтительно от 1×104 БОЕ/мл до 1×1015 БОЕ/мл или от 1×104 БОЕ/г до 1×1015 БОЕ/г.

Композиция по настоящему изобретению может быть получена с применением фармацевтически приемлемого носителя и/или наполнителя в соответствии со способом, который может быть легко осуществлен специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, для того, чтобы получить ту же самую композицию в стандартной лекарственной форме или поместить ту же самую композицию в многодозный контейнер. Здесь композиция может быть обеспечена в форме раствора, суспензии или эмульсии в масляной или водной среде, или в форме экстракта, порошка, гранулы, таблетки или капсулы, и может дополнительно содержать диспергирующее вещество или стабилизатор.

Композиция по настоящему изобретению может быть получена в виде дезинфицирующего средства, добавки для питьевой воды или кормовой добавки в зависимости от цели ее применения, без ограничения ими. Чтобы повысить их эффективность, бактериофаги, которые обеспечивают антибактериальную активность в отношении других видов бактерий, могут быть дополнительно включены в композицию по настоящему изобретению. Кроме того, другие виды бактериофагов, которые обладают антибактериальной активностью в отношении Clostridium perfringens, могут быть дополнительно включены в композицию по настоящему изобретению. Такие бактериофаги могут быть соответствующим образом объединены, чтобы максимизировать их антибактериальные эффекты, поскольку их антибактериальная активность в отношении Clostridium perfringens может варьироваться в зависимости от аспектов антибактериальной силы и спектра.

Преимущественные эффекты изобретения

Согласно настоящему изобретению, способ предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением композиции, содержащей бактериофаг Clo-PEP-2 в качестве активного ингредиента, может обладать преимуществом очень высокой специфичности к Clostridium perfringens по сравнению с общепринятыми способами, основанными на существующих антибиотиках. Это означает, что композицию можно применять для предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, не воздействуя на другие бактерии, а именно полезные комменсальные бактерии, и композиция имеет меньше побочных эффектов, связанных с ее применением. Как правило, при применении антибиотиков, они также поражают комменсальные бактерии, что в конечном итоге снижает иммунитет животных и, таким образом, приводит к различным побочным эффектам вследствие их применения. Между тем, в случае различных бактериофагов, проявляющих антибактериальную активность в отношении одного и того же вида бактерий, антибактериальная активность бактериофагов различается по антибактериальной силе и спектру (по спектру антибактериальной активности бактериофагов в отношении отдельных штаммов бактерий, имеются ввиду штаммы различных бактерий, принадлежащих к Clostridium perfringens, бактериофаги, как правило, эффективны только в отношении некоторых бактериальных штаммов, даже в пределах одного и того же вида, и антибактериальная активность бактериофагов, таким образом, зависит от штамма бактерий даже для одного и того же вида бактерий). Соответственно, настоящее изобретение может обеспечить антибактериальную активность в отношении Clostridium perfringens, отличающуюся от активности других бактериофагов, действующих на Clostridium perfringens. Это обеспечивает большое разнообразие эффектов в применимости к промышленным областям.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 представлена электронная микрофотография, показывающая морфологию бактериофага Clo-PEP-2.

Фиг. 2 представляет собой фотографию, на которой показаны результаты эксперимента по способности бактериофага Clo-PEP-2 уничтожать Clostridium perfringens, где чистая зона представляет собой стерильное пятно, образованное в результате лизиса бактерий.

Варианты осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Однако примеры представляют собой просто примеры настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения ими не ограничен.

Пример 1. Выделение бактериофага, способного к уничтожению Clostridium perfringens.

Образцы собирают из природной среды для выделения бактериофага, способного уничтожать Clostridium perfringens. В контексте настоящего документа, штаммы Clostridium perfringens, применяемые для выделения бактериофага, были ранее выделены и идентифицированы авторами настоящего изобретения как Clostridium perfringens.

Способ выделения бактериофага подробно описан далее. Собранный образец добавляют в культуральную среду ТСБ (триптический соевый бульон) (казеиновый бульон 17 г/л; соевый бульон 3 г/л; декстроза 2,5 г/л; NaCl 5 г/л; дикалийфосфат 2,5 г/л), инокулированную Clostridium perfringens в соотношении 1/1000, а затем культивируют при 37°С в течение от 3 до 4 часов в анаэробных условиях. После завершения культивирования, проводят центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут и извлекают супернатант. Извлеченный супернатант инокулируют Clostridium perfringens в соотношении 1/1000, а затем культивируют при 37°С в течение от 3 до 4 часов в анаэробных условиях. Когда образец содержал бактериофаг, вышеуказанный способ повторяют в общей сложности 5 раз, чтобы достаточно увеличить количество (титр) бактериофагов. После повторения способа 5 раз, культуральный бульон центрифугируют при 8000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования извлеченный супернатант фильтруют с применением фильтра 0,45 мкм. Полученный фильтрат применяют в типичном точечном анализе для проверки того, был ли в него включен бактериофаг, способный уничтожать Clostridium perfringens.

Капельную пробу проводят следующим образом: культуральную среду ТСБ инокулируют Clostridium perfringens в соотношении 1/1000, а затем культивируют при 37°С в течение ночи в анаэробных условиях. 3 мл (OD600 1,5) культурального бульона Clostridium perfringens, полученного выше, распределяют на чашку Петри с ТСА (триптический соевый агар: казеиновый бульон 15 г/л; соевый бульон 5 г/л; NaCl 5 г/л; агар 15 г/л) в анаэробном инкубаторе. Чашку Петри с культуральной средой оставляют в анаэробном инкубаторе примерно на 30 минут, чтобы таким образом высушить распределенный раствор. После сушки 10 мкл полученного фильтрата наносят на культуральную среду на чашке Петри, на которую наносят Clostridium perfringens, и затем оставляют для сушки в течение приблизительно 30 мин в анаэробном инкубаторе. После сушки культуральную среду на чашке Петри, которую подвергают точечному нанесению, культивируют без встряхивания при 37°С в течение одного дня в анаэробных условиях, а затем исследуют на предмет образования чистых зон в местах, где капали фильтрат. В случае, когда фильтрат образовывал чистую зону, было установлено, что в него включен бактериофаг, способный уничтожать Clostridium perfringens. Посредством вышеуказанного способа было возможно получить фильтрат, содержащий бактериофаг, обладающий способностью уничтожать Clostridium perfringens.

Чистый бактериофаг выделяют из фильтрата, подтвержденного выше, для получения бактериофага, способного уничтожать Clostridium perfringens. Для выделения чистого бактериофага применяют обычный анализ стерильных пятен. Подробно, бляшку, образованную в ходе анализа стерильных пятен, извлекают с применением стерилизованного наконечника, и затем добавляют в культуральный бульон Clostridium perfringens с последующим культивированием при 37°C в течение от 4 до 5 часов в анаэробных условиях. После культивирования проводят центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут для получения супернатанта. К полученному супернатанту добавляют культуральный бульон Clostridium perfringens в объемном соотношении 1/50 с последующим культивированием при 37°С в течение от 4 до 5 часов в анаэробных условиях. Чтобы увеличить количество бактериофагов, вышеуказанный способ повторяют не менее 5 раз. Затем проводят центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут, чтобы получить конечный супернатант. Анализ стерильных пятен дополнительно проводят с применением полученного супернатанта. Как правило, выделение чистого бактериофага не завершается за одну итерацию способа, поэтому вышеописанный способ повторяют с применением бляшки, полученной выше. По меньшей мере после 5 повторений способа получают раствор, содержащий чистый бактериофаг. Способ выделения чистого бактериофага повторяют полностью до тех пор, пока сформированные бляшки не становились похожими друг на друга по размеру и морфологии. Кроме того, окончательное выделение чистого бактериофага подтверждают с помощью электронной микроскопии. Вышеуказанный способ повторяют до тех пор, пока выделение чистого бактериофага не было подтверждено с помощью электронной микроскопии. Электронную микроскопию проводят в соответствии с общепринятыми способами. Кратко, раствор, содержащий чистый бактериофаг, загружают на медную сетку с последующим отрицательным окрашиванием 2 % уранилацетатом и сушкой. Их морфологию затем наблюдают с применением просвечивающего электронного микроскопа. Электронная микрофотография чистого бактериофага, который был выделен, показана на фиг. 1. На основании их морфологических характеристик был подтвержден новый бактериофаг, который был выделен выше, как бактериофаг семейства Siphoviridae.

Раствор, содержащий чистый бактериофаг, подтвержденный выше, подвергают последующей очистке. Культуральный бульон Clostridium perfringens добавляют к раствору, содержащему чистый бактериофаг, в объемном соотношении 1/50 от общего объема раствора бактериофага с последующим дополнительным культивированием в течение от 4 до 5 часов в анаэробных условиях. После культивирования проводят центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут для получения супернатанта. Этот способ повторяют в общей сложности 5 раз, чтобы получить раствор, содержащий достаточное количество бактериофагов. Супернатант, полученный в результате конечного центрифугирования, фильтруют с применением фильтра 0,45 мкм с последующим обычным осаждением полиэтиленгликолем (ПЭГ). В частности, ПЭГ и NaCl добавляют к 100 мл фильтрата, с достижением 10 % ПЭГ 8000/0,5 М NaCl, и затем оставляют при 4°С на 2-3 часа. После этого проводят центрифугирование при 8000 об/мин в течение 30 минут для получения осадка бактериофага. Полученный осадок бактериофага суспендируют в 5 мл буфера (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgSO4, 0,1 % желатин, рН 8,0). Полученный материал можно характеризовать как суспензию бактериофага или раствор бактериофага.

В результате чистый бактериофаг, очищенный выше, собирали, дали название бактериофаг Clo-PEP-2 и депонировали в Корейской коллекции типовых культур, Корейский научно-исследовательский институт биологии и биотехнологии 11 января 2017 года (учетный номер: KCTC 13185BP).

Пример 2: Отделение и анализ последовательности генома бактериофага Clo-PEP-2

Геном бактериофага Clo-PEP-2 выделяют следующим образом. Геном выделяют от суспензии бактериофага, полученной способом в соответствии с примером 1. Во-первых, для удаления ДНК и РНК Clostridium perfringens, включенных в суспензию, добавляют 200 ед. каждой из ДНКазы I и РНКазы A к 10 мл суспензии бактериофага и затем оставляют при 37°С на 30 мин. После выдерживания 30 мин, для прекращения активности ДНКазы I и РНКазы А, к суспензии добавляют 500 мкл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и полученную смесь затем оставляют на 10 мин. Кроме того, полученную смесь дополнительно выдерживают при 65°С в течение 10 мин и затем добавляют 100 мкл протеиназы К (20 мг/мл), чтобы разрушить внешнюю стенку бактериофага, с последующей реакцией при 37°С в течение 20 мин. После этого добавляют 500 мкл 10 % додецилсульфата натрия (SDS) с последующей реакцией при 65°C в течение 1 часа. После реакции в течение 1 часа к реакционному раствору добавляют 10 мл раствора фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, смешанного в соотношении компонентов 25:24:1, с последующим тщательным перемешиванием. Кроме того, полученную смесь подвергают центрифугированию при 13000 об/мин в течение 15 минут для разделения слоев. Среди разделенных слоев отбирают верхний слой, и к нему добавляют изопропиловый спирт в объемном соотношении 1,5, с последующим центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 минут для осаждения генома. После извлечения осадка, к осадку добавляют 70 % этанол с последующим центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 минут для промывки осадка. Промытый осадок извлекают, сушат в вакууме и затем растворяют в 100 мкл воды. Этот способ повторяют, с получением большого количества генома бактериофага Clo-PEP-2.

Информацию о последовательности генома бактериофага Clo-PEP-2, полученную выше, получают путем проведения секвенирования нового поколения с применением устройства Illumina Mi-Seq, предоставленного Национальным центром инструментов для менеджмента окружающей среды в Сеульском национальном университете. Окончательно проанализированный геном бактериофага Clo-PEP-2 имел размер 39456 п.н., и вся последовательность генома представлена SEQ ID NO: 1.

Гомологию (сходство) полученной выше геномной последовательности бактериофага Clo-PEP-2 с ранее описанными геномными последовательностями бактериофага, исследовали с применением программы BLAST в сети Интернет. На основании результатов исследования BLAST было обнаружено, что геномная последовательность бактериофага Clo-PEP-2 имеет гомологию с последовательностью бактериофага Clostridium perfringens phi13O (учетный номер GenBank: JF767208.1), но их идентичность была низкой, а именно приблизительно 69 %. Кроме того, бактериофаг Clo-PEP-2 имеет кольцевой геном, а бактериофаг Clostridium perfringens phi13O имеет линейный геном, и, таким образом, существует значительная разница между геномами этих двух бактериофагов по геномной форме в дополнение к последовательности. Кроме того, число открытых рамок считывания (ORF) в геноме бактериофага Clo-PEP-2 составляет 64, тогда как бактериофаг Clostridium perfringens phi13O имеет 55 открытых рамок считывания, по данной характеристике эти два бактериофага также отличаются.

Таким образом, можно сделать вывод, что бактериофаг Clo-PEP-2 является новым бактериофагом, отличающимся от уже описанных бактериофагов. Кроме того, поскольку антибактериальная сила и спектр бактериофагов обычно зависят от типа бактериофага, полагают, что бактериофаг Clo-PEP-2 может обеспечивать антибактериальную активность, отличающуюся от активности любых других бактериофагов, о которых сообщалось ранее.

Пример 3: Исследование уничтожающей способности бактериофага Clo-PEP-2 в отношении Clostridium perfringens

Изучают способность выделенного бактериофага Clo-PEP-2 уничтожать Clostridium perfringens. Для оценки способности к уничтожению, наблюдают образование чистых зон с применением точечного анализа таким же образом, как описано в примере 1. Всего авторами настоящего изобретения было выделено и идентифицировано 10 штаммов Clostridium perfringens, применяемых в качестве Clostridium perfringens для исследования уничтожающей способности. Бактериофаг Clo-PEP-2 обладал способностью уничтожать в общей сложности 9 штаммов из 10 штаммов Clostridium perfringens, применяемых в качестве экспериментальной мишени. Их типичные экспериментальные результаты показаны на фиг. 2. Также измеряют способность бактериофага Clo-PEP-2 уничтожать Bordetella bronchiseptica, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus mitis, Streptococcus uberis и Pseudomonas aeruginosa. Следовательно, обнаруживают, что бактериофаг Clo-PEP-2 не обладает способностью уничтожать эти микроорганизмы.

Таким образом, можно сделать вывод, что бактериофаг Clo-PEP-2 обладает высокой способностью к уничтожению Clostridium perfringens и обладает антибактериальным действием в отношении многих штаммов Clostridium perfringens, что указывает на то, что бактериофаг Clo-PEP-2 можно применять в качестве активного ингредиента композиции для предупреждения или лечения заболеваний, вызванных Clostridium perfringens.

Пример 4: Эксперимент по предупреждению инфекции Clostridium perfringens с применением бактериофага Clo-PEP-2

100 мкл раствора бактериофага Clo-PEP-2 на уровне 1×108 БОЕ/мл добавляют в пробирку, содержащую 9 мл культуральной среды ТСБ. В другую пробирку, содержащую 9 мл культуральной среды ТСБ, дополнительно добавляют только такое же количество культуральной среды ТСБ. Культуральный бульон Clostridium perfringens затем добавляют в каждую пробирку в анаэробных условиях, чтобы поглощение достигало приблизительно 0,5 при 600 нм. После добавления Clostridium perfringens, пробирки культивируют при 37°C в анаэробных условиях, в течение которых наблюдают рост Clostridium perfringens. Как показано в приведенной ниже таблице 1, было отмечено, что рост Clostridium perfringens ингибируют в пробирке, в которую добавляют раствор бактериофага Clo-PEP-2, тогда как рост Clostridium perfringens не ингибируют в пробирке, в которую раствор бактериофага не добавляют.

Таблица 1

Ингибирование роста Clostridium perfringens

Классификация OD600 поглощение
0 мин после культивирования 60 мин после культивирования 120 мин после культивирования
Не добавлен раствор бактериофага 0,5 0,7 1,3
Добавлен раствор бактериофага 0,5 0,3 0,2

Приведенные выше результаты показывают, что бактериофаг Clo-PEP-2 по настоящему изобретению не только ингибирует рост Clostridium perfringens, но также обладает способностью уничтожать Clostridium perfringens. Следовательно, можно сделать вывод, что бактериофаг Clo-PEP-2 можно применять в качестве активного ингредиента композиции для предупреждения заболеваний, вызываемых Clostridium perfringens.

Пример 5. Испытание на животных для предупреждения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением бактериофага Clo-PEP-2.

Предупредительный эффект бактериофага Clo-PEP-2 на заболевания, вызываемые Clostridium perfringens, оценивают с применением поросят-отъемышей. 20 поросят-отъемышей возрастом 25 дней разделяют на 2 группы по 10 поросят в группе и выращивают отдельно в экспериментальных выкормочных помещениях для разведения свиней (1,1 м на 1,0 м), и испытание проводят в течение 14 дней. Окружающую среду контролируют с помощью нагревателя, а температуру и влажность в помещениях для поросят поддерживают постоянными, в помещениях для поросят полы моют каждый день. Корм, содержащий 1×108 БОЕ/г бактериофага Clo-PEP-2, подают свиньям экспериментальной группы (которым вводят корм, содержащий бактериофаг) обычным способом кормления, с начала до окончания испытания. Напротив, корм, имеющий тот же состав, но не содержащий бактериофаг Clo-PEP-2, подают свиньям контрольной группы (которым вводят корм, не содержащий бактериофаг) тем же способом кормления, с начала до окончания испытания. В течение 2 дней, начиная с седьмого дня после начала испытания, в корм дополнительно добавляют 1×108 БОЕ/г Clostridium perfringens, а затем подавали всем свиньям экспериментальной группы (которым вводят корм, содержащий бактериофаг) и контрольной группы (которым вводят корм, не содержащий бактериофаг) два раза в день, вызывая тем самым инфицирование Clostridium perfringens. Обнаруженный уровень Clostridium perfringens в кале всех подопытных животных проверяют ежедневно с даты кормления кормом, содержащим Clostridium perfringens (с седьмого дня после начала испытания), и также оценивают степень диареи у свиней.

Обнаружение Clostridium perfringens в кале осуществляют следующим образом. Образец фекалий распределяют на селективной среде для Clostridium perfringens (чашка с агаром TSC; OXOID) и затем культивируют при 37°C в течение от 18 до 24 часов в анаэробных условиях. Среди полученных колоний выделяют колонии, предположительно являющиеся Clostridium perfringens. Полученные таким образом колонии применяют в качестве образцов и подвергают полимеразной цепной реакции (ПЦР), специфичной для Clostridium perfringens, и, таким образом, было окончательно подтверждено, представляют ли собой соответствующие колонии Clostridium perfringens или нет.

Степень диареи определяют путем измерения по индексу диареи. Индекс диареи измеряют с применением обычной шкалы фекальной консистенции (FC) (в норме: 0, мягкий стул: 1, жидкая диарея: 2, тяжелая диарея: 3).

Результаты показаны в таблицах 2 и 3 ниже.

Таблица 2

Результаты обнаружения Clostridium perfringens (среднее значение)

Классификация Количество колоний бактерий Clostridium perfringens, обнаруженных на чашку со средой
D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14
Контрольная группа (введен корм, не содержащий бактериофаг) 20 18 15 14 16 15 14 13
Экспериментальная группа (введен корм, содержащий бактериофаг) 10 7 4 3 1 0 0 0

Таблица 3

Индекс диареи

Классификация D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14
Контрольная группа (введен корм, не содержащий бактериофаг) 1,1 1,4 2,0 1,5 1,4 1,5 1,4 1,4
Экспериментальная группа (вводен корм, содержащий бактериофаг) 0,5 0,3 0,2 0 0 0 0 0

Как видно из приведенных выше результатов, можно сделать вывод, что бактериофаг Clo-PEP-2 по настоящему изобретению очень эффективен в предупреждении заболеваний, вызываемых Clostridium perfringens.

Пример 6. Лечение заболевания, вызванного Clostridium perfringens, с применением бактериофага Clo-PEP-2.

Терапевтическое действие бактериофага Clo-PEP-2 на заболевания, вызываемые Clostridium perfringens, оценивают следующим образом. Получают 2 группы по сорок цыплят возрастом 2 дня и выращивают отдельно, и испытание проводят в течение 14 дней. В течение 3 дней, начиная с пятого дня после начала испытания, подают корм, содержащий 1×107 КОЕ/г Clostridium perfringens, обычным способом кормления. С последнего дня кормления кормом, содержащим Clostridium perfringens, Clostridium perfringens был обнаружен в кале обеих групп. На следующий день (восьмой день после начала испытания) после кормления кормом, содержащим Clostridium perfringens в течение 3 дней, цыплятам экспериментальной группы (которым вводили корм, содержащий бактериофаг) подают корм, содержащий 1×108 КОЕ/г бактериофага Clo-PEP-2, типичным способом кормления. Напротив, корм, имеющий тот же состав, но не содержащий бактериофаг Clo-PEP-2, подают цыплятам контрольной группы (которым вводят корм, не содержащий бактериофаг) тем же способом. На девятый день после начала испытания измеряют количество бактерий Clostridium perfringens в кале тестируемых животных. Селективную среду для Clostridium-perfringens (чашка с агаром TSC) применяют для предотвращения появления других загрязняющих бактерий при измерении количества бактерий Clostridium perfringens в этом примере. Образец распределяют на селективной среде в анаэробных условиях и затем культивируют при 37°С в течение от 18 до 24 часов в анаэробных условиях. Колонии, предположительно являющиеся Clostridium perfringens, выделяют из селективной среды, после чего Clostridium perfringens идентифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (случай, когда количество колоний, идентифицированных как Clostridium perfringens посредством ПЦР, составляет 102 КОЕ/мл или более (2), случай, когда количество колоний, идентифицированных как Clostridium perfringens посредством ПЦР, составляет от 101 до приблизительно 102 КОЕ/мл (1), и случай, когда количество колоний, идентифицированных как Clostridium perfringens посредством ПЦР, составляет от 100 до приблизительно 101 КОЕ/мл (0). Результаты показаны в Таблице 4 ниже.

Таблица 4

Результаты измерения количества бактерий Clostridium perfringens (среднее значение)

День D9 D10 D11 D12 D13 D14
Контрольная группа (введен корм, не содержащий бактериофаг) 1,0 1,1 1,0 1,1 1,1 1,2
Экспериментальная группа (введен корм, содержащий бактериофаг) 0,2 0,1 0 0 0 0

Как видно из приведенных выше результатов, можно сделать вывод, что бактериофаг Clo-PEP-2 по настоящему изобретению очень эффективен при лечении заболеваний, вызываемых Clostridium perfringens.

Пример 7: Получение кормовой добавки и корма

Кормовую добавку получают с применением раствора бактериофага Clo-PEP-2 так, чтобы количество бактериофага Clo-PEP-2 составляло 1×109 БОЕ на 1 г кормовой добавки. Способ получения кормовой добавки был следующим: мальтодекстрин (50 мас./об.%) добавляютли к раствору бактериофага, и полученную смесь затем сушати вымораживанием. Наконец, высушенную смесь измельчают в мелкий порошок. В вышеописанном способе получения сушка может быть заменена сушкой при пониженном давлении, сушкой при нагревании или сушкой при комнатной температуре. Чтобы подготовить контроль для сравнения, получают кормовую добавку, которая не содержала бактериофаг, но содержала буфер (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgSO4, 0,1 % желатин, рН 8,0), который применяют для получения раствора бактериофага.

Каждый из двух видов кормовых добавок, полученных таким образом, смешивают с кормом для птицы в массовом соотношении 1000, таким образом, в конечном итоге получают два вида корма.

Пример 8: Получение добавки для питьевой воды и дезинфицирующего средства

Добавку для питьевой воды и дезинфицирующее средство получают одинаково, поскольку они различаются только по степени применения и одинаковы по лекарственной форме. Добавку для питьевой воды (или дезинфицирующее средство) получают с применением раствора бактериофага Clo-PEP-2 так, чтобы количество бактериофага Clo-PEP-2 составляло 1×109 БОЕ на 1 мл добавки для питьевой воды (или дезинфицирующего средства). В способе получения добавки для питьевой воды (или дезинфицирующего средства) добавляют раствор бактериофага Clo-PEP-2 так, чтобы количество бактериофага Clo-PEP-2 составляло 1×109 БОЕ на 1 мл буфера, применяемого для получения раствора бактериофага, и перемешивают в достаточной степени. Чтобы получить контрольный образец для сравнения, буфер, применяемый для получения раствора бактериофага, применяют без изменений в качестве добавки для питьевой воды (или дезинфицирующего средства), которая не содержала бактериофаг.

Два полученных вида добавок для питьевой воды (или дезинфицирующих средств) разбавляют водой в объемном соотношении 1000, таким образом, в конечном итоге получают питьевую воду или дезинфицирующие средства.

Пример 9: Подтверждение эффекта кормления при выращивании кур

Улучшение в выращивании цыплят в результате кормления изучают с применением корма, питьевой воды или дезинфицирующего средства, полученных в примерах 7 и 8. В частности, исследование было сосредоточено на смертности. 120 цыплят возрастом 2 дня разделяют на три группы, каждая из которых включала 40 цыплят (группа A: получала корм, группа B: получала питьевую воду и группа C: обработана дезинфицирующим средством), и испытание выполняют в течение четырех недель. Каждую группу разделяют на подгруппы, каждая из которых включала 20 цыплят, и подгруппы разделяют на подгруппу, к которой применяют бактериофаг Clo-PEP-2 (подгруппа-1), и подгруппу, к которой не применяют бактериофаг (подгруппа-2). В настоящем испытании цыплят выращивают отдельно в отдельных подгруппах. Подгруппы были классифицированы и названы, как показано в таблице 5 ниже.

Таблица 5

Классификация подгрупп и выражение в испытании на кормление цыплят

Применение Классификация подгруппы и выражение
Применяли бактериофаг Clo-PEP-2 Бактериофаг не применяли
Группа, получающая корм A-1 A-2
Группа, получающая питьевую воду B-1 B-2
Группа, обработанная дезинфицирующим C-1 C-2

В случае обеспечения кормом, корм, полученный в Примере 7, подают в соответствии с типичным способом кормления, классифицированным в Таблице 5, и питьевую воду, полученную в Примере 8, подают в соответствии с типичным способом подачи питьевой воды, классифицированным в таблице 5. В случае дезинфекции, дезинфекцию проводят попеременно с существующей дезинфекцией 3 раза в неделю. Дезинфекцию с применением типичного дезинфицирующего средства не проводят в день распыления дезинфицирующего средства по настоящему изобретению. Результаты испытаний приведены в Таблице 6 ниже.

Таблица 6

Смертность в испытании на кормление цыплят

Группа Смертность (%)
A-1 0
A-2 40
B-1 5
B-2 40
C-1 0
C-2 40

Приведенные выше результаты показывают, что обеспечение корма и питьевой воды, полученных в соответствии с настоящим изобретением, и дезинфекция в соответствии с настоящим изобретением были эффективными в снижении смертности при выращивании цыплят. Поэтому можно сделать вывод, что композицию по настоящему изобретению можно эффективно применять для улучшения результатов кормления цыплят.

Хотя настоящее изобретение конкретно показано и описано со ссылкой на иллюстративные варианты осуществления, специалистам в данной области техники будет понятно, что конкретное описание является только предпочтительным вариантом осуществления и что объем настоящего изобретения им не ограничивается. Таким образом объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ИНТРОН БАЙОТЕКНОЛОДЖИ, КО. ЛТД.

<120> НОВЫЙ БАКТЕРИОФАГ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS CLO-PEP-2 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

<130> KP090510

<160> 1

<170> PatentIn версии 3.2

<210> 1

<211> 39456

<212> ДНК

<213> бактериофаг Clo-PEP-2

<400> 1

tatccttctc gctatctaaa aataaagttt caaagattat attaggcgcg tttatatttc 60

tcatttcata atatttatca ctatatttaa cacctctatt tttaaaccct aaactagaaa 120

agtttttgca cattctttca gcataaggct tagctcttga attgttagca atccaagctt 180

cacaaccttg tccaccacca atattaccat gccaagatat aaataaatcc aaaatttgtg 240

catttgcttt ccttgcacct tctgacaact ctccgttttg agtgttagcg ttggagcaac 300

aatcaattat agtatgtcca tattgttcca ttattttttt gaattcaaaa tgaagaggtt 360

tcatagcgtc cacttcatct cttaatcctt tagcccctct gcaattttca gaatgaccat 420

atctacttcc aattatcaca ttatcacctt cctttatcta tattttacca ctttaattac 480

aattattgca acgatataac tcccaaaatt cattaatcgg ctttttatgg ataatttctt 540

tctctctttt ttgtatcgat ggtgtttcag tttcttgaga aggtttttga actgtagctt 600

tttgcataaa attattttct ttattttcat gctcaaaccc ttttcttttc ccttctaatt 660

tatatttaaa tttcatttct ctatcagatt caactataaa ataatccttt tctctaattt 720

caactttata atctccccaa cttaatttat ctatataaat gttataaggt aacattgtgt 780

tgatacactc ttgaattatt tcatctattt caattctaca aatatatttc ccctcaacta 840

actctgttgt ataaatatta tctgtgtctg tttcagttaa taaagagttt atatcctcat 900

ttgcatagaa tggaacatct ccaaacttag tttgttgaat acagttttta tttcctataa 960

cagataaatc accgcctatt ataactttgt tataaaaatt agccacatcc ctatctaatg 1020

taagtaaatg attaccacta ccatcgtttg accaaaatcc aaaattattg gtatataaag 1080

ctactgaacc tctgtcccta ctatctaaat aaccaaacat tctactttct tgattctttt 1140

tatcgaaata catatttaat ccattcatgt taaattcttc ataaaccgtt ataggtgtcg 1200

gttgtgtaag tccttcttta tcaaaacgca tataattgta ataattagaa ccatcacctc 1260

tataagcaat ttgcgcatac gccccttttt cgtttgtcaa tccaacgaca tcatcaccag 1320

taacaacatt tctcaacgct tgtaatgaac cgtttatttg attttctctt aaaaaagaat 1380

atacatgcac accattgtta tttaatctta ctgacaattt acctctgtta agttgagaaa 1440

atccgttttc atctaaaatt gtactcgcaa cacttatagc tccaccttct gtaagacctt 1500

tgtttacact atttataatt gaatcaggtg ttaatttttg aaaaacttcg ctataacttg 1560

cttctttaga tatataaggt aattcctttt caccttttat aatcataatt tcagtaaaac 1620

caagtgagtt tgaattatct ccaccatatt caaatgttat atatgcactt tttgcattag 1680

gtggcacata aattttattt gttacttttt taaaggattc atcttctgaa tatccactgt 1740

aaattgattg ttcagaatca aaacttccat tctcttcttt attattagaa cctattatcg 1800

aattagaaaa cttgattttg atttctaaaa aaatatttgg atttgtatag accaatccgc 1860

taaaaaaata atattttcca ccttcaacct cgaatctgtt gctccaagtt gaagagcctc 1920

cgattggagg ggttaaattt atataattga atttcctttg atttaaataa ttgtaatcaa 1980

ttataacttc gttacttcct ccaacattcc aaccaaaagc atcatcactc tcgaacgctc 2040

cattaataat taaattgcca tctgcaacac tctcaactct ttgtaagata ttatcactct 2100

ctatttgtat ttttgcgttt gttctttctt ctaaccctgt tatatctttc tcaactttac 2160

ctatcccagc tacaaattta tcagctaata attcgaattt accagttaaa ttaactattt 2220

tgctgttgta ttcttcggtg ctttctgaat acggtaataa caactctcct tcttgcagtg 2280

cgatttctct tacatcaagt aatatatcat ctaaaacaaa gccttgccct tctattccta 2340

tagccaatct agtttttata ttgatttcac tcgtgaattt tgcaacacat aaatattcat 2400

tcgttccact atatgagttt ataatggtac tctcttctag ttttataacc tttattaatt 2460

caagcgtttc gtttttttga tatttaattg ttatatcttt atttttatgt gaaatacatt 2520

tgaattgtaa aatatattta gaaccttctt ttagttcaat aacatcgctt aaaattgcac 2580

aataaccact cgtttcttta gcagtcaacc ttatataatt ttgtgttaag ttattaaggg 2640

tttttacata ttccgttttc atcaaactca tataatttac ctcctatatc aatactttca 2700

ttttgtgctt tttctccatc agctttgaaa tacacccatt cctcaaaacc attctgtaaa 2760

gtagattttt tccaccaacg ttctttcatt ttgtattctt tggttgttcc tattatatca 2820

taacctttag aattagaatt tataacaaat gttccgttgt tacctgtatc aaacattttg 2880

attttatgcc attgtagtac tcctaaagcg tctgttctat gattgtgatt tatatctatt 2940

gttgttatta atgcagtttt tggcattgtt tcttcaataa attcaaaaga agtagagcca 3000

cctagaccgt gatgtccaac ttttaaaaca tcaactttcc ctatttctcc cttacaatct 3060

ttttcactag caatcgtcat atctccagct agtaaaaatt tgtttttgta atgagtgtaa 3120

acaactccta agcttctagt attgtaattg tcgtaaatct ctatagttgt atttataatc 3180

tgcaacttac tgtttttagt tatattataa agttctataa ctccaacttc tctacttttt 3240

atatttttat ttttaacaac ttctagcatt tttctatgtg ctgcacttgt tccccattca 3300

atttcttcta tgctatcaac tttattccaa tcagcctctc tataaaccaa ttcttttatc 3360

tcaaaattgt tagcaatctc ctcaaacgct cctatatggt cggtgtgtgc gtgagttgct 3420

ataaataaat caatactatc aacaccttgc tcttttaaat aattcacaac aatatcagaa 3480

gtttctttat aaccacaatc aaccattata tttttgttag cttcttgtat taatatcgca 3540

tcagcttgtc ttttagtatc tattatgtgt attttcaagt tagtttcatc attaaatagt 3600

gttaatgtcc cgttgtaagc actccaacca tccaaagaat taggcagtgt attttttaat 3660

aaatttaaag cgtagttatt gtttaaagtt tctatagttt tacttacttc tcctcttatt 3720

tgtcctaaag aaacttcgaa ttctgtttta gttacaaagg tatcacctat agcgtttttt 3780

atctcttcaa taacatcaat agaaagttta tcagtggtta tagttcccgc ttgtatatac 3840

tgtccactca tagccccgaa cgttattaaa ctagcattta tctttccgtc tatagtgaaa 3900

ccatattcat attttccata atagccagtt gtagaaaaac ctaagccatt tttattataa 3960

cgggtaacat taaccgcttt atttatatct ttattatcca ttataagtag ttcattcggt 4020

tttaaaacaa cataagaatc tttcaaccct gcgtttatca tgctatttat atagtcgctt 4080

aaatttgcat taggcttagt ttgtaattcc ttttctaatt ctgcgattat atcattaact 4140

gaaataggtc tactttcttt tttaacgtta gacaattctg tatttaatct ttttttcata 4200

gttacagaat aaactctctt aatacatcta gcttttattt tagttccata agtatcttct 4260

ataacttcga ctgtatcacc tatctcaaca gattcagttt gactataatc tttatattgt 4320

tctgttttag ataattctat gaaatttatg ttataagttg cttgtaattt atctatatta 4380

aataaagtaa attgagttct agctctttct tgtaaagcct gttgagcttg tgctaaagtg 4440

tcaaaacctt catcgggatt attttcattt ttaaccttta tatctgaaaa ttccataact 4500

ttggtgtaaa cactactata attattaatt aattcacttt ctacaatagg agcttctatg 4560

ccatcaaaac ctctcggaac tatcctagtg caaaggtcat caacattcga tttaatttca 4620

aaccctgtta aattttttct tgatttaatc tgaacacctt tatcttgccc aaccctagta 4680

ttaattttgc agttgtattg ccttctgtag acctctccgc cccacctaac tataaaagca 4740

ttatctgcac cgaataaagc attatgaagg ctcatatttt gataataagc ggtactcgtg 4800

tcagatatat cagaagttaa gaaaaactcc ttgttacgtc ctgtagcatc attcaaaagc 4860

ttacttaaag ttgcttgacc attcatattt tccggtctgc aatcttttaa gaacaacgtt 4920

aattggtcag ctattgtaat ttgccttgcg aatatagtga ttgttctttt atcttttctt 4980

atattgctta ttctaaagaa ctcatctccg tattcatcat ctagcgtgat gatagcttct 5040

tctattaagt tatcataaat gtattttaaa ctttcatctt ttttaactgc taggactatt 5100

tcagcataaa agtcatcttc tgtttgtgtt atagtcgcat ttataagaat ttcatctaaa 5160

aaagcaattc cgttagtaga aataacttct gctcttgtcg cagttcttga atgtaatttt 5220

gttcccataa ttaccccctg tatctgtttc tagtattaat tttaagagta gtaaaaccgc 5280

taccgctaag agtgttttta cctcttttta taataggtaa atctcctgtg cttgttatca 5340

cttgcatatt ttctttatta aaaatatttc tcatactatc tatgatcaca tctccagtat 5400

gtgtaaaact taaagtttca tcatttatgg tgatttgtgt ttctccctgt gtatttaatt 5460

ctataattgg taaagtatca atatcagaat cgcacatcaa aggagtgtta atatcccatt 5520

cttgaattat atcgtttgta tcaaaataga acggttcgca tagaaaagta atttcaaact 5580

ctatggcaac attcccattt ctactataat tgcctatgct taccttttta actttagagc 5640

aaatactatc attgttagaa agtatcaatc tattatcttc aatattagat aaccaattct 5700

ctattaatct tcttttaacc tcccaccctt ctctcttaac tctaactggt atagtgtgtt 5760

ttaaatcttt ataactccca gttttaacta taagagttcc gaatggattt ccttcaactt 5820

cttgttcttc ttctatttcc tcaactcttc ccatttctaa attattcatt gttaagagtt 5880

caaaatcatc ataacttgct ttattattaa aataaaattg tatcatttca tcacctcttt 5940

tatattataa catagaaaaa agcacccttt cgagtgctta aatttataaa tgttttatta 6000

tatcccaaac tgttatttgg ttcttatcct caaaatatct agtatcattt tgcatgctaa 6060

ttgctaacct cttgtagttt tcaacatctt catcagtaag tttagttaat ttatttaaat 6120

tttcatactt accaaataga gatttgatta tcttctgatg tactaaattc tttttaacat 6180

ctaaaactcc taacttttct aagatagggt agaatagttc ttttgtaagt tgaagcttct 6240

ctctatgtgt taatagcata gaacctaatt taagatttgt ttccatttgt ttgtagtata 6300

gttgttcaca ttcaaagaag tagtctctag cttcatgccc ttttttacat ttgcttatca 6360

tagctaaatg acttgctatt cttaaggata attcataatc tgtaaaaagt tgattttctt 6420

ttatactccc tttgttattt gcaagtttaa ttttcacctc tttcacttct ctgaaagtga 6480

cctcaaagtc actttcgaca accatgcggg tttgagtggt attaggcaaa aactcaatga 6540

attttataaa gtcataactt gcagatagaa ggttttgact attccatcta tcgaatgttt 6600

tcttactccc taaccactta tgcaaatctc tagcactaac aaatttactc ccatcttctc 6660

ttacttttat taattcttgt aataacatat tttattcctc ctttattcaa caaactttgg 6720

attcatataa aattctaatc cttgtggttg aaaaccttct ccaacttcta tataattcaa 6780

ttcatttaat aatttaacta tttttgctag tcctttaatt tcttctccct ctttaattct 6840

tatccaatca aaagcgtggg tttcacctgt taaattttct cttaaaaacc aatcatctat 6900

ttctttcatt ctttcaaaat ctttctcttt ttgttttgta ctttcatgat atttttcatc 6960

gtactctatc gctattaacc ctatgagaaa atcaattcta tacttaccat tacataccga 7020

aacttgacta tcaaaagata aaccaaactc ttttaaaaaa cactttaaca tttcaccgaa 7080

ttcatattct ttccgatcag aattaaatac aacaacctct ttttctgttt caccttttat 7140

ttttttcaga tactccaaag cttctttatt tcctaaaacc cctttggtat tctcaattac 7200

tttacttgct aaacttaatg ggatattgta ataaaaacga gtggaaaagc cattgttatt 7260

taatttataa ctttcattta ttttttctaa tcctaacttt tcaaattttc tttttgccca 7320

atcattatgt ctagttttta tttttaacat tttatgaaga tggtcgctcc taacaacaac 7380

ttcattttca caagtatttt ttgtaaattc tttcatacat ctcacctcct ttaattaaat 7440

tataacactc tttttgagta ttgtaaatag ttttgtgcgt aaaaaaagag aggaaaaccc 7500

tctcttatct aaacgctaaa gaagtcatac gagaatattc atcaaactca ctttgatgtg 7560

gtgctaaagt tctcatcatt tctttaccgt caatataaaa ttctactggt ctatttgcta 7620

agcttttaat ccagttttct aatttgtcta acggtataac cgcttccgct tgatttcctc 7680

tacctttgta actatctcct gcaacatatc ctcccataaa tgttggttgt gttactatac 7740

caccattgta taagtatggt actttaggaa gatttactcc gaagtgttta cctccaacga 7800

cagggacaaa gtctggtatt gttacactta ttttatttaa tccgcttata gcactattaa 7860

caagtcctat aactgcattt aaaggagctt ttattactgc acctaatccg ttcattattc 7920

ctccgaatat atttacaact ccttgccaag cccttgacca gttagcggta aatacacctt 7980

ttacaaattc tataatccca ttaaaaattt gttttacaga attaaatata tttttaacat 8040

tcgctagatg tgaatttaat atatctccta taaatccaaa agcattagac caatcaactg 8100

taaaagcgtt tttaatccaa tttataacag ttgaaaaagc ttctttaacc gcttcccaag 8160

ttccaacaac cacatttcta aatgtttcag aggtattcca tgcatataca aaagcacctg 8220

ctaaagcacc aagaagccct ataactatcc ctatcggatt cgccataaat accgcattta 8280

atattgccat agcaccacta aagctcttta ccatagttaa ggcagtaaat aaaggtttta 8340

caaatgcaat tataccactt acaatagcat agccctttat agccgctaaa taacctacta 8400

taacacttaa cgctaatcct atgttattta atattccatc taggtttccg ctttgtaaag 8460

cttgtacaag ccaactgata ccatctgtaa cgaatttaac cgcattagtt aacggttctg 8520

aaaacttttc gtacgctgct atacctaaac cttctagtgc tgatttaaaa ttgtccatag 8580

ccccttttaa gtttccactc atagttttag ccatttcctc agctgaacct tgtgagtttg 8640

ctatatgttt gcttaattca tcaaatctct ctccactatt ggcaagtaaa gcgttagcac 8700

tctttaaatc aactttgtta aataattcgc ttagaacttt agttctttct tgttctgtca 8760

tagttccgag tattttattt aaatctttaa atatttcatt tgtacccctc atattaccac 8820

ttgcgtcata aacttctaaa cctaattttt tcataagttt agcagctttg tctgttggag 8880

aacctaaaga aagtataatg tttcttaacg cagttcctcc ttccgcacct tttataccgt 8940

tgtcagctaa gattccaagt tgtgtattta attctactgt tccaccttta agagatttcg 9000

cagttccccc aactgttagt atagcttctc ctaattgtgc aacatttgta tttgctttct 9060

gtgaggtttt agccatttgg tcggtgaatc cttcaagttg gtctgtttct attcctaaag 9120

ctgacataga atccgtaact aagtcagaag cataggcaag gtcaattcct cccgccgctg 9180

ccaagttaag aactttaggt aatgcactta tagctttgtc tgtatcatat cctgcaagtg 9240

ccaagtagtt caacgcttca gctgattgtg aagcactata cttagttgta gctcccattt 9300

gtttggcggc atccgaaagt tttttgaagt tagaattaga agcatctcca actataccca 9360

ttgttgcagc tacttgatcc atacttgctt caaaatccat accaactttc gttgctgcac 9420

ccgctgcaac tcctaaacct ccagctataa ctgcaccagc aactttagta gcttttccca 9480

ttctactcgc aacactttca gttttctttc cactttcatc tattttacta ttatagttct 9540

tattgtcaat gcttatttca gccattaaag tgaataaatt catctattca cctcctttga 9600

atttattata aatttctgtg caaatttctt caacattctt ctcttcttct tttacatttt 9660

gatttttcat attttcgtat aattcctcaa aactcttaaa ctttttatct ctatttaaag 9720

attgagaaca tatccaaagc gattgagcca tatgcctttt atgtgtccat tctaagttgt 9780

attcgttctc tttctctatt aaaactacat ttatagcctt aaaagaaagg gagcggaagt 9840

tactcaaata aataataact tttccactcc ctaaagtttt gaggattgct aaaaatttag 9900

aagttcttta tcactccata attcttttaa ttgtttgatt gtttgtactg gattttgctt 9960

tctaatctct tcgaccgtct tatcatttac aattgctaat acattataaa tgttttcttt 10020

atgcttttta agaaggatag gaattaattt agtgaaatta ctcacacctt tagccaaccc 10080

tttgattttt ccttctttct cgtccatatc agttatatct aatctatcat agaatataga 10140

gattaactct tcatcttgca taatttcgcc taaatacgga gttatttcaa ttactttttc 10200

tatacaaaca tcattattca tttcacttaa tttcatccat attctccttt atactaaata 10260

aatttctatt ggactttcgt ctggtttagc taaatcaata caaggggtta attctaaatc 10320

aaatttacct tttccttgat tttctatctc aaagtttaaa ccaccagtcg atattgcatt 10380

tttaactcta acaaccataa gtccatcact tttattaagc gttcccgccc aaactatttc 10440

tttgtagtcc ttagaaagaa aatggtttct tagagttatt ttcttccctg tacttcctaa 10500

agttgcttct tctgcgcaac ctatagccat taacattgtt cccgctttaa cttctgctat 10560

tttagtttta actttacagt caattttatt aaccgctaaa cagtccttat acatcccaac 10620

tgcaccgtca acatcttcca ttaaatctct tatgtctgga actatctcga tacttcctcc 10680

accacttgta gcacctaaca cattcgtcgg cgttcccata gcagttgtta ttgcatttct 10740

taaagcttct tcatccgaaa ctccttccca agttacacca gtcaaccaaa ctccagcatc 10800

taattgaaag ttctgtggtg tagtttgtgt caatccgttt aataatttca ttttatccct 10860

ccttataggt atattcttgc ttgtataacg ccatataaac gcttaatatt cggttcttca 10920

tcttgtaaca tttctccaaa cggagagcct ttatacaact gtatagagcc attagaagta 10980

aataccactt ttccattgct tatatcctcg cctagtaaat ccaatttact cgctacagtt 11040

tttaatgaag tcgatttatc ccatatagag aactgaatta aagcgtcgtc atagtttggc 11100

gtataactta aattgtaagt taggtaaggg aattgcgtac cttgcggaac gtttccctct 11160

aaaaatgaag gcatgatgct attaaaatag ctatacaacg cctttgaata ctctgtaaat 11220

ttttccacgt cgcaactcct ttccttattc taattctatc atatttatgc taaaacatac 11280

aactctgcac taagttgctt attttgaact ctagctcgtt taggtgtgat catatcctcc 11340

ggtctactcg taacccttag ataatcatta ccccttttaa caacatcgtt aaagttaaga 11400

ggcacattta tatcaactgt tatagtatat agcgatgtta ctccttgttg ttccgcaagt 11460

tttgcttgag tagagttatc taaacttata gcacccttaa aagttgctcc ctctatccat 11520

gaagtttcat atccacccat tccgtcagaa gctgttcttt tctccattat aatcagattt 11580

tctttataat catctagcat atttctttca cccctctttt atcccaaaat aattttggtt 11640

ttctatatgg ttttaattca tttgaaaaca cctcttgcca tgttaaagct tgaccttttg 11700

cattagttgc taagctataa gaataattcc caaaactttc acttacgata gcactcggtt 11760

tattttcact ctcatatgct tctattttag ctttaaggct tattaaatcg cttggaatag 11820

caagagagga tattatcccc tcaaactctt catcttgcat cgtaaggctt tctagtgtta 11880

tattttgacc atctacaaaa gcgaccttat ataccccatc atttagtgta ctgccttcta 11940

ttcttacata ttgacctatt atatatttac cttttactgt tatagtgtta gtgtttattg 12000

aatagcttcc tctttcgtaa aatttataaa agtaattatt tatagaattc aatatctttt 12060

ccatttatac acctcttttt attatttaaa aagcaataaa aaaaagaact ttaatagacc 12120

tcttaatatt atctttatat ttctaatttg tagttcacaa taattatcaa tagtgaattg 12180

ttattctgat atcttaaacc attgcaccgt tatcggcgaa tttagattat taacccatgt 12240

agagtttacg ctatcccacc taatacatct aataacagca gtagtatttg tatcatttcc 12300

ctcgcttaaa tcttgtctta taattattat atcgtttttt atatttgtta aaggtggttg 12360

acttataaaa acttttcctt taacttttct attataagta atagtagcaa ttccattttc 12420

tgagatagtt acattcccac tatctaaata tttgtttcct actttaacag gaaatgagct 12480

atctttcaaa ttacctaaga aatcgtaaat atttccattg taatttattt ctggtcgcat 12540

tctgtttaca ttaaagttat aattaccgtt gacattgtca tattcgcaat tatctcgaat 12600

aataggcata ttgttattaa atatatattt atttgcatat gctgtcggaa atgaaggagc 12660

tgatattcca aaaccaccat ttatttttat agcatagttt ttacaaccac actcagtatt 12720

actaaatagt ctggtttctg catttcctgt tttgggcatt tgtttacagt tgtctaaagt 12780

taaactatat aaatcagaac caacaccaaa cataaaacta ttagcattgc attgtaatgc 12840

gaatatacaa tttataaatt tatagctttt cccatcaact tttataatac ttccactttt 12900

ttcaatttga taatcgcact caaagttaca tccatcaaat acaacatatg aatttaaact 12960

taaatttatt gaatttatag atttcaaacc aaaattacaa tctctaaaat tagcttgtat 13020

tgattttaaa atcaaaggtt tatcacattc attacagtac actttttcaa atactacgcc 13080

gaagctattg ccgtcgctta tattagttaa aattccgttt gtacatctgt caattcttat 13140

tttgttaaaa aatacattcc atagaataaa tgtattagct attgataaat ctttattaat 13200

acctattgat attccatttt caaaattatc tattcttaga ttttcaaaat tcgaaaaatg 13260

cacctgataa ccttcttcat cattattttg tttaccaaac attaaaccac ttgtattatc 13320

ctttacacct gtgtttatta actgaaaatt actaatatta acatacctat catttacatt 13380

tataaaaaat gctgaacacc cttcgcataa tatttttgaa tatgaattag caatatctcc 13440

ttcgccataa atagttatat tttgtctatt tatatgaata ggttttttta ttttataatt 13500

accctttggg aaatataaaa cgctatttgt ttgcaataaa ttatttatta tatctgaatt 13560

atccgttaca ccatcgtttt ttacaccatg ttccaaaaca ttaacacaaa tatcatttat 13620

tttactcgta ttatgttcca attgtgaatc aaatttgtct aatcttctat ttaaattgac 13680

ttctccccct ctagcttgaa ctatctcact attagttgcg ctttcaaccc cattagtaat 13740

attagctacc gcttcatcaa attgcgtttg taatgaattg gcaatatttt gaaacttttt 13800

tacttcccct tggtactcaa cgacttcatt tttatattct tctgtttttt gattaaactc 13860

atttatttta ttttcatact taggaaattc caaattagcc tttttgatgt attcttctat 13920

tttctttaac gcttcaattt catttgtgtt agcaataact tcaccactaa ccaatccttt 13980

tcctatctta aaagtagcat aagaacttgt tattcttcca ctagaatcag atatatctag 14040

ttgaaataat gcgtagcctt ctttattaaa tgcactattt ttaagtttaa cagtaacttc 14100

acctttgcta gcattcgttg gagttatttg gtcggtctgt tctaccaaag tcccatctat 14160

acgcctaaca taaaccttta tagtctgact ggataggtct ttaggcgtct tattttcagt 14220

tacaacaata tttaattcta cattatcttc ttgatttatc ccttcaattg gcactggatt 14280

tcttatcata gtatcaatag ttaaaggtat ctttttaaat gccatttctt cacttccttt 14340

ctatctaaat tatatcatat aaaagaaaaa gacgacaata ttttgtcgcc ctattctgca 14400

gtcatataac ctttagcttt taagtctttt agaagtttat tgaaccctgc taaaagagtt 14460

gccccatctt ctccgactaa ttcatctatt ttatcaagct taggaatcac cgcgtcagca 14520

cctttcgctc ccgctggccc tgctggccct tgtagtcctg gttctcctct ttgtccttgt 14580

ggccctgctg gccctggtgt taattctata ttagcgattc cattctctat gttattcaat 14640

ttttctttag ttattaattc gtcatcagtc caagtgtgtt ttgaataagc catcttttaa 14700

cctcctagac ttcttccttt ttagttctac ccttgccagt ttttgccttc cctactttag 14760

aaagttcgaa ggcttcacta gggtgtagct acttttattt ttcttaatac acctgctttt 14820

cttgagttct ttaaaacaac tcccattact gcctcaactt caccatcaat tataacccca 14880

gtatcagtta catctttttg ataagtcttt attatcttat cacccgctgg tgaaatcccg 14940

tggaatcctc ctaaatctat tttaactcca tagatagaag tttctttaga agtatcgttt 15000

atatctatta tttctttagc tttagaaccg tcataataag tacctacaac ataaaaaggt 15060

attccgtcgt agttgtctac tcctcttcca aaagcatctt ctgttcttgt gtaataacct 15120

aattttctag cgatagactt cattttaact gccattttgc tattcattat taagaaatcc 15180

ggtttctctt caaataaaga taaccactca tctaatgtat cagcaaacaa ttcagcattt 15240

tctgtcattt ttgcagaagt tgataagtca atagcctctg ccggttcgta ttctgtttct 15300

gtcccttcta aaagcttatc taatccatca aattcagggt tgcttccact tgcagtttta 15360

gctttatccc cttttattaa agcatagtta aataaattaa cagccccttt tattttttgt 15420

tgcatttgga aagcaacttc gtcgattgct ccacttgttt gagcgataac tctatcaacc 15480

ccgaagctac caccgaatat tttacaatca gcagtctttg cttctcttat tgcttcattt 15540

gcagtatagt tttctcctat ctttctgaat tttgcagttg aaggagtttt taattgttga 15600

taaccatatg ttaatgtaga accaccagta cccggtgaaa ccgcattatc aaataccatt 15660

ttatctaaca atgttgattc tcttctaaac atatcaatta cagtttggtc gaccttatta 15720

gccataccga ctttactttg ttctaatgta agtgccattc gccttacctc ctattataaa 15780

tattttccta aagcatttgc tagaggatta tcattgtttt ctgtttgtgt atctcttggt 15840

ggttgtactg aacccaaacc actaacactc tcttgcttta taaaatcaga ataattttcc 15900

tttaacggat taactatgtt atcccaatct tttatagcat cattttcaat ctctaaagtt 15960

tctaaatcta tttctttagt taacaacttt agtatttttt cgttgaatcc ttcttttttt 16020

agttgttcgg ttaataaacc tctcttctgt tcattaatct tttcaacttc tatgttattt 16080

ttatatgtgt caaattcact ctgtaaagct tcatatttac tcttatactc gtcagtattt 16140

gagttctcaa tcttagcttc taaatctgca atagtgttat taagttcatc tatagcacca 16200

actttcttat tgtattgttg cttagaaacg aactccttag ggatttctgc ttttatagtg 16260

tctgctatag tgtccactaa ctcaccttct aatccacatc tttttaatat tgcttttaaa 16320

tccatttata ttcctccttt acgtttttat agagttgtaa gctcttagga taatttaatt 16380

atatcaaata cgttataaat ttgtaaagtg cataaaaaaa agaacaccgt gaaagggtgc 16440

cctttttgca aaacacttta tcgtttggag gtacttttat acttacatta tagcaaaaat 16500

agctttacgt gtcaagaatt ttcgtgagga ggaaacctcc ttcactctcc ccttgtaaca 16560

aaataaaaat ctaagttact acatttacta caaaaactac actaatttct atatagcaaa 16620

tatttataaa aaaatatata tataatttat tattataaat aaactcttga aaataaatgt 16680

agtaaatgta gtaaatatat ataaagctag tgataccaac ggtttgaagg ggttacaaaa 16740

atgtagtaaa agtgtagtaa aaaatgtagt aagcctaaaa atgtagtaaa acggttaata 16800

atatatgaat gaattttaac agtttatcaa taaggtttat tgttaaaaat gtagtaaact 16860

acaaaaatgt aaccgcaaaa tgtagtaaaa atgtagtatt actacataaa aatgtagtaa 16920

ctgaatccga aaatgtagta attgaaaata aaaaaaagac agtaaaatac tgccttaatt 16980

tattcccagt aatctcttat aaatggtatt ttgtaaccac ggattgattt accatcaact 17040

ttatatggtt ggttaggtat tcctctcctc ataagctcat tagcaagtgc tttcttttct 17100

tttatattaa gcttttcagc tatttctgta agcttgtaca ctctcaagtc gttactttcc 17160

cagtctactt tatcatctaa tatgattgat atatctgttt gagcattaaa ttgtctatta 17220

attatttttt gtttcgcttc ttcctcttta gttaaccaat cgatactata attagtcaac 17280

cacatatcgt atactgcgcc ccaaaactca aacatattga aattgtcaaa ctcttctata 17340

ttacaagatt taacaggaat tacccaaaac cttcttgaac ctgtttcatc ttttaagaaa 17400

tcttttttgt taacattggc aatataactt gttagccttg gatatatttc agcgacacga 17460

ccaaacggaa ctctatattc atcggttgta ttagttaaaa actgcttaat tttaccttgg 17520

tcagctttta aagttgtatc taattctgct aactcaacaa gaatatattt agtattttgg 17580

atcacgctat cagttttatc ggggtctaaa gatactccat ctttgaataa gtcattaagt 17640

ggcattaatt tgcgtgcaaa cgttgattta cggcatcctt gttcaccttg gagtgttaat 17700

actccattag aactataacg gttttctaac tcattgtgag ccattttaac aacatttaga 17760

agccatttat aaaacaaagt gaaataatac tctgcatctt ctaaagcatc atcttgaagc 17820

gttaaacact tttcaaacac atcaagcact atatcgtgat tatcatttct atacttcttc 17880

aacatatcta caaaggggtt tatttctttt ctattagcta tatcaattaa atattcgtcg 17940

cataccgccc tattaagatt taaaccttct ttcacttgta aatcatatac aaatgtcagc 18000

atctcacctc tttttttaaa ctttctgcct tccatttgta aagttaattc atgagttatc 18060

ttattcataa ctggatttat tccataatga tttaacaaat attctaaatt tgccattgtc 18120

tttattggaa ctgttccgcc atcttttaaa tacttaacct ccggaaattg tataagagaa 18180

acgttgctct ttttattctt aacatcatta attgaaaaaa cttttttagt gttttgcatt 18240

ttaatatcct ccttatttac cattaactat ttccattata gcgatatgaa taggtttttc 18300

acctctccaa ttatcaaacg cttttttctc tttttcagta agatagaatt taacttgttt 18360

acttctctta cgatttttca tattatcacc tcgcaagaca ataataacat agtgggtaca 18420

cacttgtaaa gtattttttt atttattgac aaaataatta agtaagtgta taattaactt 18480

ataaatattc ttaggaggtg ctattatgat tggttttttg ctaggcgttg acattacttt 18540

gttaattgaa atagttatac tagaaattat ttacgaaaga acgaataata aatggggcgt 18600

tttaagtaag atttcaacat atttaggttg gtgtatatac gcactaaatt taattatttt 18660

ttcgattttt gctataggaa gtttttaaat tgtttattag gaggtattat catgggtaga 18720

tttatatgtg aagctattcc ttataatgga tttaaggaga gaattaaaat atgtaaggag 18780

ctacaaagaa aaagaatgag atttagtata gaaggaaata ttatatttgt ttattagagg 18840

agggttgacc ttctcttttt tttatgagat caaaacaaaa aaaagaagag gattgctccc 18900

cttcttaaaa accaaaccaa ttaggtaaat tataaaacca gtcagctatt aaagcaccta 18960

taaaagctat agcaacaacc aatattggtg ctacaactgt aaaaaacata tttcttaaaa 19020

actttctata attccatttc ataattaaaa cctccaaact ttaattatac ttaaattata 19080

acatacttaa ttatattgtc aataataaaa taaaaaaaag agaggatttt ttcctctcgt 19140

cttaggggtg agtatatttt atcaaaggag aatttcatgt ccaactatat tatagcaaac 19200

ttaactatcg ttgtcaatct tttaacgttt gttcgattaa ctttttgtaa tcttccttat 19260

aatccattat agcgggtttg agtgttggtc ttgcgggttg cctactcgtt cccgcttcaa 19320

gaaatggagc gtattggaca ttagagccta tggcaacctt cttatcttgg gttttaactg 19380

cataattagc actattccta aatcttccag tatcaacaac tttcttagcg gtgataactt 19440

tttgccatat actaaccgct ttcaatccaa ctgcatttaa gcactttata accttgctat 19500

ccatttcttt tttgaataca ttggcgttgt tttcaaactt tattttcatt gctttaattc 19560

ctttaatttt ctttgcatac tttttatgtc tttcatcaag cttgttttgc ttctttttgt 19620

ctttgacaat tcccttatta catcatctac tttcctgttg ccaaattgaa ttccgctgac 19680

tggatagtat tgtttcgcta aatctaaagc taccttgttt agttgctttt ctgtcataac 19740

ttttaattct ttatcttggt aaaatttaac tttattctta acttccttct tggttacttt 19800

ttttgctttt tctttagttg ttgttcgttt tttattttcc tcttttgtta ttttagattc 19860

tttaatttta ttcttttctt cttttgaaac tattttcttt tctttccttt cttgccactc 19920

ttcaaaactc attttcctaa gtgtttcatc aagttctttt tctttttctc ctttttcaaa 19980

acctacaaat tcagtagtca tagtacatct acaacggatt acttcacttg ctccaccgtt 20040

aggatcaccc gggtacatta aaccattact aaaaggctta tccaagtcaa ctatttcacc 20100

attaactctc tgatgtgatt ccctagttct cttatccatt gtagctaacc aagatttctg 20160

aatctttaac cctttctttt ctgcaaattt ataactgtct aatctaccta cattttctat 20220

tctagtcgtt tcagttctag caattctaag agaatcatta tagttctttt cagttatttt 20280

tttaattctt gaagctatct gctgcatact ctcaccttgt agaagtccac taccaagagc 20340

tttctttaat tccttataca aagtagtctt atctgttaaa tcatcaatag ccatcaaggt 20400

aaacgggttt atctcttctt ttaataataa cttgatagcg tttctattat aaagtgtata 20460

ccctatatct ttagcaactg ccttttctac ttcataagca ctccaattat agtttaaaga 20520

gtaaatatct atcatatcat cgttcataat gtccatagca accttattag cattattaac 20580

aactagcgac atttctctta taatggcttc taaacgcttt ttctgttgta attgattata 20640

tatctgttgt ggttctttag cagtgtctat tcggcttata agggtattta atttactttt 20700

taattctctt aaagcatcag aatataattc ttcaatattc ttttctagct tagcaaggat 20760

tttatcagtt tctttatgtg ctttatccat aatatcacct ctctttaatt atactaaaaa 20820

aagagatagc attacactac ctcttcataa gtcttttcga atatatcggg tttgcaagga 20880

taaaattcac ctttaatacc ttttataata taatcacctt ccgttgcggt tataactcct 20940

tctaaagtct ttatatcaca ataagatttt ccgtttatag ttttttctgt tctgaaattg 21000

taagcttttc catttgtaaa ttctttaatt tcttcaaaac aatctcgagt aaattttacc 21060

gcttctacta caactggttt ttttctatat ttcatgaaat cacctcctgt attaattata 21120

tcacaattat aaattaatta aaacctcctt cgggttcttt caatttaaat ttatcagcaa 21180

cttcttcatc tattagttgc ttttctaact taacatcatc tatcataggg tggcttctta 21240

aagcagtatc taaactcatt atagaagcac taacagaatt aattatatta ttaattactt 21300

ctgtttcatc tactaaccta tttctaacga aattaataga atatttctca ttaggttttt 21360

tgatgtattc taaatataat tggattatat tgtcacaaaa atctaagcaa ccagtttcga 21420

actcatctgt ctttaaatct aaatccatca tatttgcttt tatagcaacg ttggttaaac 21480

taccacccgc taatatagaa gtatcaagtc ccatggcatc agaataaata gatttattta 21540

gcatatttaa aatagtttct cttgcttgat atggcacttc tatagtgtga ggagttgcat 21600

cgccttcttc gtcaacattt atcattttat attgctttag atcacttaaa aagtcccccg 21660

cttctccgtt gtaattcttt aacgcccaat aaatatcttc gttatcttca aagttattag 21720

agaaatctga ataaacaatg tcgtataagt cgattttctg tttcaaagca aatgtaaatc 21780

tagatgtcct tatatcattt gcatataaag ggaatatcgg aagtctactg aatccttctt 21840

gtccgatttc tctctcctct atagcatctt taacggtctt gataatgtaa ttcttcttag 21900

attctgttat ttctatcttg ttcttatcac acttatactc tgtctttcca tcttcttcat 21960

acagttctat ccacataggc ttatcagtat ctatttgcca aaatcttatc cccgctctaa 22020

cttgacctgt cctttcatct tctaacggta taaattcagt tcctctccat atatcaatat 22080

caaattgtcc tttagagtta ataaaacaat aaccccaacc cacaccgtct acaagcgcag 22140

cagttccaca tcttttaagt ttaatatcga atttcttccc taaaccttct ttgacttttt 22200

cttctgtcat aagcccgttt gctaatagat aactaacctc ttgcttaatt atcttaggaa 22260

atagcgtatt agcgatttta ttattagcct taaacttatc tactacttgc cttcctaaac 22320

tatcataaag ccatttaaga cggtttttaa tctttgtatt ttcttctcta taatatgctt 22380

gtgcttctac agcattatta tatttactcg ttcctttaaa ttcttgtata gcctggagga 22440

taaatgaagc tttatcccca ctagcttgaa agtcttggaa tgttttcatt ttattcctcc 22500

ttttctagtt ctctctttaa ataaaatata gccttctcta aatcttgctt tttattccct 22560

ttgtgttcgc atctagcaat gtatttaata gcgttaccta aagaaaaacc aagttcccag 22620

tcctctataa catctataac ctcataacca cctttattat aatggcttgg atggtttacc 22680

atatcagctt caacatcttg tactttaaca gctatatgct tagcgttttt ctcccaataa 22740

ccatatccac aatagaatct ttctccgttt tctaaaactt cataatgaac aaagtagtct 22800

aaaaaatcta aagccttaac tctttcacct tctaagtcat atatttcatc ttttttatat 22860

ttcatcttaa tacctcctaa aaaatcttat ttgcactaaa gctacgtttc tgttttcttc 22920

ttgctatatc cattatagca tacctaaccg cgtctatata gtggtcgttt ccatcgggat 22980

atttacttat aaactgccca tctttattca tctcatactc ataccctata aattccttag 23040

cggcgtttgg ggttcttttc ttatcaatta caatttcatc taacatctgc aaaaatttat 23100

aagtgaaatc cctactatca ggtccttttt tagctttttg catattcaag ccataccctc 23160

tcatttcaga gatggattta ggatcagcac tatctgcaac aataggcttc ttatagatat 23220

ttggttcttt ttccagtatt ttatcagtta gctttttatt gctcaatccc tgttcgtata 23280

tttcatctat aatataaagc ttgttgttct tataatggat tttacaccaa gttgcagggt 23340

ctatactaaa tccaaagtca acaccatact caaattcctc catattattt atttcctctt 23400

ttgttatttc tcttataatt acattatcaa atacatttcc accagttcca gttacttcac 23460

ctaaatattc atgtttgtaa gcttcttctt ttacattctt tagatgttca gcttctatta 23520

tgaattgttg ccctaaccaa tcagacggaa cagttaaata ggtactatgg tggatcaacc 23580

tgtcttctct atcaattagc tgctcttcat taacccagtt attcttagat ttaggagggt 23640

taaaagtata aaacacccag ttatcaccat tctttcttat aaaagactgt gtcatacttc 23700

ttatctcttc catgccattg aactggtcta actcctcata ccacacaatt cctattctac 23760

cgaatggaac ggttatacct ttagctttca tagggtcgtc gcaacctaaa aagacaattt 23820

cttgattagt tggagtataa acaatcttca aaggagattt ataaacctta aaataaccat 23880

ttaatcctaa atcatttata gaccaaatca tctgattata aacagaacct tttaatgtct 23940

gccctacttt tctgactata acagcgtggc aatcattatt agccattata agaagaggaa 24000

taaccttaga tacaaacgaa ctcttggtac ttcctctccc tcctttaagc atataatggg 24060

tgtgattatg ttccataaca tcataaagta aatcatcgaa gttcggtgct attttctcca 24120

aaaaattaat ctctcttgaa tacaatgtta acaccttcta ccttttgatc tacctctttc 24180

ttatctgtcc aatcatagtt attttttaat gcaaatataa tccctgttgt cggttgtcct 24240

gaactttgca atctttcttc tgtattcatt agcactcttt ctttagccct ttttacagtg 24300

ccgaaatacg cttctttttt accatagttt ataagggttt gcctgtctat ttctaagtaa 24360

tacgctaaac cgctcatagt cataggtttt tcattgattt cacaatactc aaaatattcg 24420

tctattcttc tttttaactc ttcttctgtt ttgaataaca aaggtcttcc catacctcta 24480

cacctcgctt tctatctata ttataccata tttacacaat aaaaatacac ctctttcgag 24540

gtgtgaatta ttagtcattt atataccatt ttccttttat ttcttctgtt gaaaatattt 24600

taaccgcctt atattcatat attgttttat aatcttttct ttttattttt attgcatctt 24660

cataaatttc gtatttaaaa ccactctcac aactttctat ctctttccct tcctcgaaag 24720

cttcaaacgc ttcttggaat gtgtattgtg atcttttaag tttgaacttt ttctcttttt 24780

ttatacctat ttcacgacaa ttaaaataat ttgttttatg ttttaaaacc aactcacttg 24840

ttttattatc aagataaatt tcaagcattt cactctccca aacttctcct tcttttatat 24900

tagcaattac ctctctaaaa gttaattctt tcatattaac actcacttct ttttcgatta 24960

tttcaaacat ttcttctgtc cacatccaac cgtcttcatc tatatctata tcataagata 25020

aacaatcata cacctctaca attgttgcta tcctaccttt aagtgtttcc atatagccac 25080

cgcaaaacat ttgttctcca taataactac caacaattaa atcttctcta accttcactt 25140

tatctccaac ttttaacatt ttaccacctc ttaacatctt tctctttcaa taattctttc 25200

ttacctttta gcaaagtttc tttatgtcct tttctctcat ttatagcata ttgttgtttg 25260

atagcactag ctaagtccat tatctcccct cccacaactt aatactttcg attctctcta 25320

taggaactat tatttcccct tgttcgtctt ccatttttac tctataatca tgtatctcta 25380

atattcttcc ttttatctct gacattccag tatttaagat tacaaaatct ccatcttgga 25440

aataaaaccc gttttctcct actaaataat taatgctcac ttttctaatt gacatttatt 25500

tctcctccca aaacttttct atctcatatt gatttatttt tctcgctttt tctctctcga 25560

ttctttcaag ttgccttgct atcttagctt cttttataaa ctctaaatga tttaattctg 25620

aatctgtcat gaacaatttt aactgctcta gcataatttc aacatctgca atttcttcaa 25680

cgaagttctc ttgaaaatgc aagtcgtttc taacacactt agaaattgca agtattagtt 25740

ctgctaactc ttcttgtgtt tgccttaatt gtggttcttt gccataatag ttggcaattt 25800

gaattaattt tgattctcta ttcatgttca acccccaaaa tttatttaca acttaattat 25860

aacatactta attattttgt cgatagttat ttattcatct tctaaaatta tttttgcaac 25920

cttataccct tgcctgtttt taacatcttt atcaattaaa ttctttgttg agctatccca 25980

acaacctaaa aacgctgatg tttcttttat agtatcaaac agttgtataa taggctcacc 26040

ctttacattg caatcataca ctgcataaca aacctctctt tgcgttctag gtcttttctg 26100

tttttcctct ttaaattcta taaatttcaa attgcttctt ttgtttcttt tattactctt 26160

tatttgtctt gatatcatat tatggtttat attcattaat ctacccaaag ctctttgcga 26220

atccgctatc gctataggta atccaaatac atctttattg aatgctaata ccatcttaaa 26280

ccctcctaat ccactcttct ggaatactta aattatattc ttgcgctaat ataaacgcca 26340

ctttagaaaa attagtaatt ccatagactt ttttagcgac tgatattaaa ttaccagttc 26400

cgcaatgtgt aaagcaagtg taaatacctt tttcatcatt tataactaaa gcccctttat 26460

tatctccacc atgcaaaaca catctaccaa tataattgcc attcacacgc ttaaattctc 26520

cacctagatg cttctgtatg aagtctttta agcttataga cgatattagt ctatttaaac 26580

actcttcttt atattgtggc ttaatataat cctcaccgtc atacttggta tatccttgtt 26640

caataacttt ttgcttagct ttgttatccc tctttaactt agattgataa gcatttataa 26700

gttttaccat taatgcgcaa cttataggaa tgtcgttctc tctgtaagtt acttctttat 26760

ttgtcccagc ccatatacga tttgcgttac ttgtagcttg atctaaatat ttattaaatt 26820

tccattgtag agccttatac aacaacttat aagtttctac atcaatagga ctttctaatc 26880

tataaatcaa tctgaattta gtgtaatcag tatcactaaa agttggatat tctattatag 26940

gataaacacc tagtttctta ttaactagtg caaccatttc aaataatgtg atctcatttt 27000

ctttactatc tacatctaaa gcaatacact ccaaacaatt aatgctgctt tcaaatatat 27060

ctttactacc ttcttgaaat tcagctaata aaacagaatg acctcttttt aaatattctt 27120

ttatttctct ataatcaacg tatatacaag ggtaattttt catacccatt gtaatatcta 27180

tcatatcagt tgcagttggt ttaactttat aacctttctg acttacttta atcttaatca 27240

tctacctaac ctccaaaacg aatttacaag ttaattatat aactacttaa ttatcttgtc 27300

aacactttta ttaaaaagac tagattttac tctagtctat aaactttatt tattttctcc 27360

caagtatttc tcctaactct tttgtctctt atttctacac ctaaataagt gtgatatggt 27420

attcctataa gtttagcagc ttcttcaata gttaatccta actctttacg tttagctttt 27480

atcttttctc tatttataaa aacatctttc atagtctttc ttgatttttc tctagctttt 27540

tcctttaaac attctttaca catagaccta taaccatctt ttccttgtgg gtggtgatag 27600

aaattagttt ctatatcttc gaatgctctg ttgcaattag tacaaatttt catttattca 27660

cctaaaatgg acattcttct tttatttctt caagaaaaga attttctaat ccattccctt 27720

tattttcttg tttgttatta ccacttataa aatcaaaagt ttctacaact acgtcagtag 27780

tatatctttt agtcccgtct tgagcttcat aacttccagt tcttatattt ccgcttatag 27840

caatttgaga acctttagag aaatattgat ttattatatc ggcagtttta ccgaacgcta 27900

tacaatttat aaaatcagct tcatctttct tgaactttct gtttactgct aacgtaaatc 27960

tagcaatatt agtattacct gttctataat ctacatcttt gcttaaacgt cctaataagt 28020

taacctgatt catattatta cctccttagt tggaaaagtg aggcgtacaa gatataggcg 28080

aatattttat tctcaacact ataaactcac tcaaccaact taaatttatt tacaatttaa 28140

ttatatactt attgatttat tttgtcaaga catttactac ataaaccttg ttcacacaat 28200

aaaactttgt aatctacaaa tggaatatga ggttttaata aatctatcat aataaaagcc 28260

aattctctaa tctctttctg tgcatgaata cactttcttt gtcttaaaaa gtttctaaag 28320

ttatttaaat ccattgtaac tattaaatta caagttgttg cttgtggtaa tattgctcta 28380

gcatcttctt ttttaattcc taattctatt aaatatctat acatttcttt ggaatgttca 28440

aaaaattctt ttaaatcttc ctttgctatt ttaccctttg tttcattcat ataatttaaa 28500

ttaggcataa caaaatcaaa gttactacca tcaacatatc tttgcgactg aacattaaac 28560

ttaaatgttc tatgtctagt caactgtgct aaacacgctc tcgaaattcc ttctatagca 28620

aaactaaaac taacgtgctc aagaggactt aaatgccctt ctaacataag cggcatcacg 28680

aaatcacaca tttctttatc gcttttaatt tttatatcat tccacccttt tgcactataa 28740

catattcggt aggatttaaa aatcttttct atgggattag gagttatatc tatcaattca 28800

actttcattc tatattacct ctctttcata aatccattta taaccttttg attgcttgta 28860

tttgttttga caacacctaa caacgcttgc tctatctata tttaatttct tcttaacctc 28920

taaagcgctt gaaaaattac atataaatcc actttttaaa ttaattccta taactggttt 28980

tcgataattc ttttgtttgt cattgtaatt attgttgtaa acagcgtcgc accattctaa 29040

attacaaagt ctgttgtcat cttttatctc atttatatga ttaacttgtt ctttattttt 29100

aggcatatca acaaaactca ataaaaccac tctgtgaacc ctcgcttgtt tttttattcc 29160

atttttacac agagtaaaat acaaatatcc atccttatcc tttgtagttt taattatttt 29220

tcctttaact tttctaccta aagaatctat tctatctagt gattttattc ttcctaaatc 29280

acttgcctga tataaacctt cataattagg tatatctctc catttctctt taatcacttt 29340

ctattctcct ttaactcttt aattataatc gcagtagcaa ccccaccaac tgtaacacct 29400

attaaaatag gtttagctaa gatactgcta ttaggatagg ctattaatcc cattaaagct 29460

attcctacac ttgtaattaa acacgcttta ctatcactca ttcaattcaa cccccacatt 29520

aaaatttctt aaaagataat ttctaacttc ataatataaa gtgttgtata tctcgctccc 29580

catatattca cttggtattg cttctatagt agtgttgtat tcagcttcaa agccttttat 29640

cctagcgtgt aatgttttag gttcgtacct acttctatac ttcccttctc ttaaatgctt 29700

atgaaataat ttatcctcta taaacaatct aaccttagta ttattagctt ttaaaatagc 29760

aaactcttta cttattcttg gataatcaga actactaaaa ttacttgcta tttcatctat 29820

agaagctttt ctttcaacta ctataagctt atcaaaatat aaatcccttt ctatgccttt 29880

cagagcacct ttgggaagga aacaactata atcaccttgt tctaatttct gaaccttaaa 29940

agtttttttc ttagccttaa accacgctaa tacgtggtcg ttggcttttt ctcttgtatc 30000

aactattata gttaagtctt ttaatgcttt ttttatttct gtttcagtaa atctatatct 30060

cattattttt gaactttctc caatctacta caaatgttat cgtactgatc tttagtcatt 30120

tgacttatat cagatactcc aaattctttt acgcattgag cagttatagt tgcttggttt 30180

attcctttag attttcctat agcaaacaat ctgcttaatt gcttatctga taaaccttcc 30240

tttggcttag aacttccatg agtagttaaa tttgcatcat catcttcgcc tgtattaaga 30300

tttaaaatag cttgatatga ataccttcta agataagtta ttaagctacc tgcttgttgt 30360

gggtcgtttt taactggttt catgaataac ggttcactct ctatatattc cccactctca 30420

tgtagtaaaa tagtctgtat tcctatttct ccagtttctt tgcttaacgg catttgtaag 30480

actgacaaac cattcttctg caatatatcc ctagttgcta atataagctt atcaagtgtt 30540

acataatcac ttttgaagaa tggattttta gcatcttttg atatacttgt tacttcggca 30600

ttgaacttcg ctaaagcaac tgctaattta actattgttt cacttctatt cataaaaata 30660

cctcctttta actgacaatt taattataca ccaacttaac taccttgtca atcatcttat 30720

ttttaaactt tcctcttgca ctaatttagc cccttctatt ttctcgccat ttttcaacgc 30780

ttctttaagc attttcttat ccacgctagg agtatttaca ataaattgtc tcggtatagc 30840

gtttaaatcc tctacaatcg ctttaggagg gtttttcttt acacttacag taaatatacc 30900

acctttgact tctctcttct ctaatccgtt tatagtatca aataaatacc cttgtaagtt 30960

ctcaatctta ttctctctta tctttcgttc tcttgctaat cttttttctt ccgcttttaa 31020

cgcttccgct tctgcttgta ggtttttaat taatctcacg atattttcta cctttgtaga 31080

taaatcgcac tctaatcctt tcatagagtt tataactaac tcttttaaat tttcatcttc 31140

tcccgcattt tctaaaactt gttgtaagtt tctaaagttt tgtgataatt catatagttt 31200

cattaaataa ctccctcctc tttaaactgt tttatataag gtcttaaaac cttaactgct 31260

tctgattctt taggacaacc aattataaaa gcgattcttt taataaatct agttgttaac 31320

tccggacttt tataagccgc catgttggtt ttgcaagtcc tttcttccat tcttctccaa 31380

tcttgaagag cttttctgat ttcacttttc ttaataacca tcataatacc tcctcgatgt 31440

tctctacaag tataattata gcgtacttaa ttatcttgtc aatacttttt tctaaaaaat 31500

aattatgggg tgatgaggtg aaaatatttt atttcattat tcgtctcgga gcatctttga 31560

accattataa gaaataaaaa ttaatcactt actacattta ctacaaaaac tacatcattt 31620

tctatatagc acatttttat ataaaatata tatattattt tattacttat aataaagtct 31680

tataattcaa tgtagtaaat gtagtaaata tatataaagc gttggtatca ctagcttaca 31740

aagggtttta aaaatgtagt aattatgtag taaaaaatgt agtaagctta aaaatgtagt 31800

aaatatttta attaattatg aattgattgg taacattttg tttataatta agtgtagtaa 31860

atgtagtaaa actacaaaaa tgtaacttaa aaatgtagta aatgtagtaa taaaaaaaga 31920

cacctattaa gtgcctttat aatggtttat ttatattgtt gtttgtagag catcatagta 31980

taattcttta aatacctagc atactcataa gcttcctttg tagtcttgca agtctttgtt 32040

tgtaataatt cgttagcgat tttatcaata ttcttcataa aaaatacctc ctaaagcttt 32100

atattttata tatatgctct aagaggtaaa aagattactc tttttcttca atttctttaa 32160

ctttatcatg aagcatttta tcaaccaact tgatataact tgcatcatat ccagtaaact 32220

caaagtcttg taaccatctg cgtatctttt ctatttcttt agaaactccg caaaggggtt 32280

ttaagacttt ttcagattct ttagggaatt tagcgactaa tctattagat atagaagcta 32340

tagtggtata aacttcgatt tcccaatcta aatacaattc taaatgttcc tttatagata 32400

aaggttcttt aactccttct aattcctccc aagacggttc gaggttttcg ctgaacatat 32460

caattacata gtgttgtaaa tccaccctat gacatctatc ctctttagat tgaactttat 32520

gccatctttt aaacccttgt aaccctttca tgtgtgctga cctgctaagg gtatcgtgaa 32580

tcatttcacc tctagcgctt aaatttatag cttcttttaa tagttttata gcttcattgt 32640

taaaatcata actcttaatc atgttttata tccctcaatt tcatcatagt gttgttatac 32700

atttttgagt gaagtatttt catatcttcc attaattcat ttataacagt cattattgct 32760

tttgtaccgg cttctaaacc atgtttattt attatcttgg aaatacactc cataaactct 32820

gtatcttctc ctaatggctc gtaaaccatt ttagctgatg aatattccat ggttttatct 32880

ttttctagca tagattctat ttttaaagca tcttttatat tatcaagcgc catggtcata 32940

gcttcaacac attcacaatc ccatttatcg gttaccatag ctttctctat tttaggcaaa 33000

gctttatcaa ttatctttcc gttaacttct attattttat tgtaatccat catttaccct 33060

cctttagcaa tcttataatt tcattatttt gctctataat ggtatttaat tttaagttag 33120

tttcttgctt taattcttcc ataagttcat cattagaagt ttgttttaga ttctcggtgt 33180

agtttaatac acctaagaat ccactaaaca aagctaaagc gtctaaatct cttaattgat 33240

tattcacttt cagaaactcc tgtagccaca taagaagtag gacaaactgg actttctact 33300

aagaaatgag aagtatcatt tccataaact actttgtact ttctcctact tctaatttgg 33360

tctgctctta aaatattacc ttttctacat aaaaccggta tagttgcagt tccgttcaaa 33420

attacaactg gcaacgttcc agcattgcta ggaattgatt gacaagttat taaacaatat 33480

tctttcaaat ttgttaatgt tgttgttgga atagttatgg ttaaactttg gtttggtaca 33540

gttccggtga ctgctatact tgtacttttt attattctat tacaatattg acaactcata 33600

agtcgtcctc ctttatttaa aataaaaaga gaggtatgtt atacccctct ataaaatcaa 33660

cctctatatg aggaatctta attagcaaag attataattt tctccgcaac catacggtgt 33720

gaatggaaca cattgaacag ggtaaggtct tacttgactt actatatttg cagtttgtgc 33780

cgcttgactt aatccaagtt ccgctgcttg aagtctatct ctcaaatctt gtatagtatt 33840

ttgagttaat aaggctcttg tagcttcacc atcagcgtgg atagcgttag ttatagcaca 33900

agtgttcttt tcagcctcat atctgttgat aagtagttct ttttgcgtat tacaacagca 33960

actagctatt tctgaactca aatctttaaa ttgtgctaag ttattatatc ctaagctaca 34020

taaaccttgt tgaagagtat tcatattata agtgttttgg tcgcttaatc ttcctagttg 34080

gttagaaagg ttagaataaa ggaagtcatt gttaatagtg ttaaatcctg ctccattacc 34140

tccaaatcct ccgaaaccat ttcctcccca tgctaaaagg aaaaataaga agaaaattaa 34200

gcttccgcca cctccaaaaa atccatcgtc atttttattg tctaaattgt atactggtgt 34260

tactcccagt ccttctgtca ttgccatttg caatcactcc tttactatta ttattttatt 34320

agtgccttcg cccacaacta cagcaccttt tcgtcttata actttaccgt aaacgctttg 34380

ataatttaaa tttaattctt cacaaacaga agataattgt ctttttttac cgtttaccaa 34440

aacaaatttg ttgttacttt tattccttga ttgttctttt aaagatatcc acctacaatt 34500

agatggagaa taatcttttt gacaatcaat tctatctaaa gttaaatcat ctttataacc 34560

attttttaaa gaccaatcaa taaaattcat tttgtctgaa acccattctt tacaaacttt 34620

aatacctttt ccaccccaat ttttaaaatt aagagtatta ggattgtaac atcttgtcat 34680

cattgaataa tactctttgt acaatctttc gttagacaat ccatgttttt tggcttttct 34740

tgattgaatt tccttacgta agcaaccaca agatttcgtg cttttaaaat tattagatgc 34800

cactaaagtt tcattgccac aatcacatct acacaaaaac aacttgtgtc catctttagc 34860

tttaccactc tcttttaaga ttgttaacct tcctattttt tctcctattt tcttcataaa 34920

atcactcctt atgttaatat gcaattatta taacataaaa agcatccgat ttcaattaaa 34980

acttaatacc aaattgttga gccatctgtc tgacttgttc ctcgctcatt cctttttgtt 35040

tagcaatatt cataatagtt tcttgaattt gttgaggatt tttgccttct aacattttct 35100

ttgcttgtcc catcatagga ttattaccaa acatattcat tagttgcata ggatttatat 35160

ttcccccttg catcatttgc attaattgca tcggattaaa attattcatt tttattacct 35220

cctaattggt ttaataaact atctaataca ttcttataat tgtctaaatc gctttttaag 35280

gcgttatatt cttctttagt acaataacct tctgtcggtt tttcttcctc tatagaaagc 35340

gtataagtat ctatatgtgg caaaccgttc atatctatat atttagtgta taatttcttg 35400

tttgttgtat cttcaaacca caatttgctc ccatcgaagt tcggagttat tcctctaact 35460

tcttctatag atgtaactgg tcttatagaa ggaaattgag gttgttgaac ttgttgtatt 35520

ggttgtggtt gttgttgttg attaaactgt tgttctaaag cgttcaatct attattcgca 35580

aagttaggat tgaaattagg attcattcca taatttccat atcctccata ataaggattc 35640

atattattac ctcctgttct ttatacttta attttacatt aggttataat ggttcttaaa 35700

tagaaataaa tagtaagttt taggtaaatt aaacgtaaaa aaagcaccct ttcggatgct 35760

ttaatattat tcttccatat tccttatatt aaaattacta taactattta aaattgattt 35820

tatacacatc atagataatt gtaagttata atttataaat cttactcttt gtatactctc 35880

tctgtctgtc ttaggttgtc cgtgtttatt tagatattta cttacaaatg tttttacaaa 35940

atccattgga acatctatag cacctatttt tagactatct aaatcccagt taacttttac 36000

ccaagcaccg gttatctgtc tatcaaagaa tcttaaagct tgattttctt gagataataa 36060

ttgatttctt tctttgatta tctgtaattc tttttctaac ttttctatat ctgcattttt 36120

agttagataa taaccatctt ttcttatctg cttaagaatt ttcttaactt ccttcttaaa 36180

ttgttttgct ataggttttc tgctttgcat taatacttca tacaatccat cttctgttaa 36240

aaatgtcatt tctcttgatt gaatcatatc tggtgtcttt attgtagata ccagcttttc 36300

ttcttcatct acaaccgaaa ccatttggct tactttatat ttcccgtttg attttgaata 36360

atctatccat tcagctacat ctttagctaa aaataatggg ttttctatat ctccataaat 36420

tttaaattcc tttgataata cctcttgttg tttaaaaact tttaattctt tcattttatc 36480

cacctatctt tcttatatta aatttagatt ttattattaa cctatataaa tcaccttccg 36540

ggattaatgt cattgtttgc gtatttctcg cttcattatg tgcgttccca ttttgggaag 36600

ccacattaac tacttctttt attccatctc tccttctttt ctgttattct ctcttaattc 36660

atataacccc tccaatatat ctaaaggtgt taatatatca tgattaactt ctatataaga 36720

aattatcata tctagttgtt cgtctgtcat ttatctcacc tcctgtaatt ataataacat 36780

ctataaaggt tataaaaatg acaaaaatat tacaatttgt aatttgaata aaaaaagagt 36840

agatttctct actcttaatt gtttaatatt tctcttttta atttatttaa tttcatccca 36900

taataactta caatgggtat atttacaatt cctattataa tagcaaacgg ggaaaataag 36960

gttaaaaata aacttaatat aataattaaa gcagatatag aaaaacaatt gcctattctt 37020

ttatacttag catctaaatc attattccct tttatctttt cctctataac tccaagctct 37080

gcaactcttt gttgtgcttt attttgcttt aatatttttt cttgttgttt tcttttcttt 37140

ctatttcttc taaaatcatt tatttcacca gctacccaaa ttttggttat gaactctaac 37200

atttaaaaca ccttcctaaa ccctaaaaat ctcatttctc tttcaatctc ttctttagtt 37260

ccctcaaatg taacctcttt aatatcatta ttccaaatat aatataaaag attttcactt 37320

gctatcttta acgcttgtaa tggttgttct ccctcttcaa ctaaatcatg atacaattca 37380

aaatcagcat gattatttcg gttgagagtg taagaaacac cctcacattc atataaagcg 37440

ccaacctcaa aataattatt cataatatcc ctccaaatca aattcaacct gataatctct 37500

ttctgttatt tttttatctt taagattttc ataatctttt ctagttcctt ttacaaatga 37560

aaaggcggta tgtgcatcta tatcatatat tattgctaaa agtaaagcat aataaccgtc 37620

attcatattt attcctccaa ccaactatta aaagtaccac aatagttatc ttcgtacatt 37680

cttaaatcat cttcaagttc ttcaattctg tctatagcag tatctaaagc atcttcaaaa 37740

tttcttcttt catctataag ttctcttatt ataaaaaccg ctttttctct gtcttttaaa 37800

tcttcaatag agcatatacg ttctccagtt tcactatcat ataaaaactt tccattaaat 37860

tctatgttca tcttcttcaa tctcctcatt cattattatt tctgatatag ctttttctat 37920

accacttata acaccggcat aaaagaaatt tttattttca aaaccttctg atctttcttt 37980

gtattgttct tttaagcttt ttaacgcttt taaagtgttt cttttcatat taatacctcc 38040

taaacatctt atgatttaat tataacatag ttaattatct tgtcaatagt tttatataaa 38100

aaagagagat atctctaccc ctctaaaatc ttcttaatta attcttgatt ttcccaagct 38160

ttagataatt tcttataagc tttatttcta taattggtaa cacttttaat actacaatct 38220

atttttatag aagctttctc ttgtgtcata ccccttatat ccactaattc aatcgctaaa 38280

cgttctttat ctttaaggtt aaccaattct aaggctaaca ttagaagagg tttagaaggg 38340

caatcaagca ccttctttat atcttctcta ttcataagat tacctctttt tcttaaatct 38400

tacttttctt tttcttgtta ctgttttctt ttgcctaact cccatttaac ctactccttt 38460

aatttatcat tatggattga attatcatta tagttattac catttattat ttgactttcg 38520

ccatcagaac tttgttcata agttgtagtt gtttcctcta ccaattcagc ttcataatta 38580

gcaaagaagt aaatagtact accacacatt attgttatac ttaaaaccac tgtagctaaa 38640

caagctaaac aaatcttttt ataaccttct aacgtttgtc tttggtgttt cattatttcc 38700

ataaaggttt catttgataa taattgaatt tccttatctt tgtccataaa tacctcctat 38760

ttgttaagtg ttacacttgc tataaacgca attatagaac ttattatacc agcaactatt 38820

aaatcccaac gcttactggg tgttgatttc aaatcgatta tatctctttt catttccgtt 38880

aaagtttcca ttatagtttt atattgatat tcttgaacgg agtgattctt ttccatctct 38940

gcaattcttt tttcgtgttc cctaacttct tttcttaatt gcataagttc actatattgg 39000

ttatcattac attccattta ttttccacct ttcggcaagt cgattcctcc agtttcggga 39060

ttattcatta atccgagtag cactgctata ctacaaacta atttaactgt tgtatctgcc 39120

cattctgcat ctattacata tccaaattga tttaataaaa gaacaattaa acctacaaga 39180

gaaatccaaa gggcaggatt tttgaaccta gcccaatatt ctttattttt tatactatta 39240

aacatttaga tcacctctat atcttttcag taaagcaata ataacctaac tcatcgctta 39300

ttctttgttg tgctttttca gcatcttctt tatttgtaaa tctttgtacg caaactctat 39360

aatagtcctg ttccttttct agtggtatat tagggtcgat agcatttgct aaatatctag 39420

ccataacctc gtatgggatt ggtgaccaaa tggaaa 39456

<---

1. Бактериофаг Clo-PEP-2 семейства Siphoviridae (учетный номер: KCTC 13185BP), имеющий природное происхождение, который обладает способностью уничтожать Clostridium perfringens и имеет геном, представленный SEQ ID NO: 1.

2. Композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, содержащая бактериофаг Clo-PEP-2 (учетный номер: KCTC 13185BP) по п. 1 в качестве активного ингредиента.

3. Композиция по п. 2, которую применяют для получения кормовой добавки, добавки для питьевой воды или дезинфицирующего средства.

4. Способ предупреждения или лечения заболевания, вызванного Clostridium perfringens, включающий:

введение животному, отличному от человека, композиции, содержащей в качестве активного ингредиента бактериофаг Clo-PEP-2 (учетный номер: KCTC 13185BP) по п. 2 или 3.

5. Способ по п. 4, где композицию вводят животному, отличному от человека, для применения в качестве кормовой добавки, добавки для питьевой воды или дезинфицирующего средства.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к выделенному полинуклеотиду вируса гриппа A. Предложен выделенный полинуклеотид вируса гриппа A, кодирующий мутант PB2 полимеразы вируса гриппа A, причем мутант PB2 полимеразы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с замещением одной аминокислоты, выбранным из группы, состоящей из: Q306H, Q306L, F323S, F323Y, S324G, S324I, S324N, S324R, S337L, S337P, F363L, K376N, K376Q, K376R, F404Y, M431I, M431T, N510K и N510T.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения рабочего посевного материала вируса гриппа, включающий инфицирование клеточной линии, адаптированной к бессывороточной культуре и суспензионной культуре, вакцинным вирусом гриппа, культивирование инфицированной клеточной линии и далее пассирование вирусной культуры в той же клеточной линии, причем из культур с различными коэффициентами разбавления, использованных для инфицирования вирусом, отбирают культуру с коэффициентом разбавления, при котором достигается самая высокая жизнеспособность клеток, при условии, что если титры в анализе гемагглютинации (ГА) (за исключением 0) для двух или более культур различаются в 4 раза или более, то отбирают культуру, имеющую коэффициент разбавления, для которого получают самый высокий титр ГА, и используют для следующего пассажа.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ спектрометрического определения концентрации рибонуклеопротеина вируса бешенства по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенных из полных частиц вируса бешенства после их штаммоспецифического связывания (NРНК ВБ), на основании линейной функции зависимости NРНК ВБ от содержания рибонуклеопротеина вируса бешенства в вирусной суспензии.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения концентрации противовирусных препаратов в биоматериалах лабораторных животных.

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и касается применения штамма цирковируса свиней 2 типа для производства профилактических и диагностических препаратов, используемых в научно-исследовательских институтах и предприятиях биологической промышленности при конструировании биопрепаратов, в частности вакцин против цирковируса свиней 2 типа.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Представлен штамм респираторно-синцитиального вируса RSV/Novosibirsk/66Hl/2018, депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером V-902, для использования в диагностике респираторно-синцитиальной вирусной инфекции и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro.

Изобретение относится к вирусологии. Предложен штамм вируса гриппа В/60/Колорадо/2017/1 (Линия Виктория).

Изобретение относится к области биотехнологии. Получен новый производственный вирулентный штамм цирковируса свиней для производства профилактических и диагностических препаратов, «PCV2/SHBC» цирковируса свиней, семейства Circoviridae, депонированного в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использована для получения композиций для борьбы с заражением вирусом ящура (FMDV) у животных.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к сконструированным клеткам нервной системы, которые содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид E4ORF1 аденовируса, и/или которые содержат полипептид E4ORF1 аденовируса.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2017-02-24 2021-05-31T14:01:11
Наверх