Аримокломол для лечения ассоциированных с глюкоцереброзидазой нарушений

Изобретение относится к применению активного фармацевтического ингредиента, выбранного из (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида и его кислотно-аддитивных солей, для лечения ассоциированной с глюкоцереброзидазой (GBA) болезни Паркинсона (PD) или GBA-ассоциированного паркинсонизма, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона или паркинсонизм ассоциированы с пониженными активностью и/или уровнями фермента GBA. Изобретение также относится к вариантам применения активного фармацевтического ингредиента, выбранного из (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида и его кислотно-аддитивных солей. Технический результат: предложено применение (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида и его кислотно-аддитивных солей для лечения ассоциированной с глюкоцереброзидазой (GBA) болезни Паркинсона (PD) или GBA-ассоциированного паркинсонизма, которые ассоциированы с пониженными активностью и/или уровнями фермента GBA. 3 н. и 30 з.п. ф-лы, 20 ил., 11 пр.

 

Уровень техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к активному фармацевтическому ингредиенту, выбранному из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей (аримокломол), для применения в способе лечения ассоциированного с глюкоцереброзидазой (GBA) нарушения, отличного от болезни Гоше (GD), в том числе GBA-ассоциированных альфа-синуклеинопатий, таких как GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона (PD), GBA-ассоциированная деменция с тельцами Леви (DLB) и GBA-ассоциированная множественная системная атрофия (MSA).

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Болезнь Гоше (GD) является наиболее распространенной из лизосомных болезней накопления, характеризующихся накоплением глюкоцереброзидов. Указанная болезнь представляет собой форму сфинголипидоза, поскольку она связана с нарушением метаболизма сфинголипидов. На сегодняшний день известно до 300 мутаций в гене GBA, и они связаны с болезнью Гоше. Мутации GBA можно классифицировать как «мягкие» (обуславливающие GD I типа, не являющуюся нейропатической) или «тяжелые» (обуславливающие GD II и III типов). Мутации GBA в гомозиготном состоянии, а также мутации в компаунд-гетерозиготном состоянии обуславливают GD. Преобладают несколько распространенных мутаций, причем наиболее превалирующей в случае GD I типа является миссенс-мутация, приводящая в результате к замене серина на аспарагин по аминокислотному остатку 370 (N370S), а наиболее превалирующей в случае II и III типов является L444P (кодоны пронумерованы от первого кодона зрелого белка, т. е. без учета сигнального пептида).

Многие из этих мутаций также обнаружены у пациентов с болезнью Паркинсона (PD).

Было выявлено, что мутации в гетерозиготном состоянии, обнаруженные у носителей мутации GBA (с одним мутированным геном GBA), предрасполагают к развитию болезни Паркинсона (Gan-Or et al., Neurology, 2015). Мутации в GBA на данный момент считают одним из основным генетических факторов риска развития болезни Паркинсона. По оценкам, по меньшей мере у 8% пациентов с болезнью Паркинсона наблюдаются мутации в гене GBA, как «мягкие», так и «тяжелые» мутации GBA, включая гетерозигот по L444P. Также вторичный дефицит активности GBA может быть связан с болезнью Паркинсона.

Первичная патология, ведущая от дефицита GBA к болезни Паркинсона, еще не выяснена, однако доклинические эксперименты свидетельствуют о наличии взаимосвязи с α-синуклеином.

Носители мутаций гена GBA, по-видимому, имеют повышенный риск развития деменции с тельцами Леви (DLB) и, вероятно, множественной системной атрофии (MSA), что предусматривает связь между дефицитом GBA и по меньшей мере некоторыми из альфа-синуклеинопатий.

В WO 2014/071282 раскрыт рекомбинантный самокомплементарный вектор на основе аденоассоциированного вируса, кодирующий глюкоцереброзидазу человека (AAV-GBAl), в моделях для создания направленных на восполнение глюкоцереброзидазы видов терапии PD и связанных синуклеинопатий и таупатий.

В WO 2013/148333 раскрыты производные салициловой кислоты в качестве активаторов глюкоцереброзидазы для лечения болезни Гоше и ингибирования возникновения симптомов болезни Гоше у пациента с мутацией гена GBA и для лечения болезни Паркинсона.

В WO 2009/155936 раскрыты белок теплового шока 70 и его индукторы для лечения лизосомных болезней накопления, в том числе болезни Гоше.

В WO 2005/041965 раскрыто применение индуктора белков теплового шока аримокломола для защиты нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, в том числе болезни Паркинсона.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Аримокломол представляет собой усилитель продукции белков теплового шока, который в настоящее время подлежит апробации для лечения лизосомных болезней накопления у детей и бокового амиотрофического склероза (ALS).

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что аримокломол повышает уровни GBA и повышает активность GBA не только у гомозигот по мутации GBA (с болезнью Гоше и существенно пониженной активностью GBA), но также у гетерозигот по мутантному GBA (носители). В частности, аримокломол повышает активность GBA у гомозигот по GBA (пациент с болезнью Гоше) до уровня активности, наблюдаемого у клинически здорового индивидуума. Кроме того, аримокломол повышает активность GBA у гетерозигот по GBA (клинически здоровых) и обеспечивает повышение количества фермента GBA (общий уровень и зрелый GBA/GBA после транспорта из ER).

Авторы настоящего изобретения в настоящем документе также показали, что аримокломол повышает активность GBA у страдающих болезнью Паркинсона пациентов с мутантными аллелями GBA (в гетерозиготном состоянии или в гомозиготном состоянии, клинически здоровые в отношении болезни Гоше).

Согласно одному аспекту предусмотрен активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида (аримокломол), его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей, для применения в способе лечения ассоциированного с глюкоцереброзидазой (GBA) нарушения.

Согласно одному варианту осуществления указанное GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с пониженными уровнями фермента GBA и/или пониженной активностью фермента GBA. Согласно одному варианту осуществления указанное GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с одной или несколькими мутациями гена GBA, включая мутации гена GBA в гетерозиготном и гомозиготном состоянии.

Согласно одному варианту осуществления указанное GBA-ассоциированное нарушение представляет собой GBA-ассоциированную альфа-синуклеинопатию, как, например, выбранную из группы, состоящей из GBA-ассоциированной болезни Паркинсона (PD), GBA-ассоциированной деменции с тельцами Леви (DLB) и GBA-ассоциированной множественной системной атрофии (MSA).

Согласно одному варианту осуществления указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона ассоциирована с генотипом по GBA, являющимся генетическим фактором высокого риска развития болезни Паркинсона.

Также предусмотрен активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей, для применения в способе повышения уровней GBA и/или активности GBA.

Описание чертежей

Фиг. 1. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках (фибробласты человека) от индивидуума с аллелем GBA в гетерозиготном состоянии, предусматривающим мутации L444P, A456P, V460V в цис-положении (носитель, клинически здоровый в отношении болезни Гоше). См. пример 1.

Фиг. 2. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества фермента GBA в первичных клетках (фибробласты человека) от индивидуума с аллелем GBA в гетерозиготном состоянии, предусматривающим мутации L444P, A456P, V460V в цис-положении (носитель, не страдающий болезнью Гоше). См. пример 1.

Фиг. 3. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение активности GBA у пациента с болезнью Гоше TII, имеющего генотип L444P/L444P, A456P, V460V. Уровень повышался до наблюдаемого у клинически здорового индивидуума уровня (пунктирная линия). См. пример 2.

Фиг. 4. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение активности GBA у гетерозиготы по L444P, A456P, V460V (носитель; клинически здоровый родственник пациента с болезнью Гоше, генотип, являющийся генетическим фактором высокого риска развития болезни Паркинсона). Уровень повышался более чем 2 раза. См. пример 2.

Фиг. 5. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение активности GBA в первичных клетках от пациентов с болезнью Гоше I типа (N370S/V394L и N370S/1-BP ins 84G), II типа (E326K, L444P/E326K, L444P и G325R/C342G и P415R/L444P) или III типа (L444P/L444P). См. пример 3.

Фиг. 6. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение активности GBA в первичных клетках от страдающего болезнью Паркинсона пациента с аллелем GBA в гетерозиготном состоянии, предусматривающим мутацию N370S (N370S/+). См. пример 4.

Фиг. 7. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение активности GBA в фибробластах человека от здоровых индивидуумов без мутации GBA (+/+), у которых не наблюдаются симптомы заболевания. См. пример 5.

Фиг. 8. Индуцированное аримокломолом повышение степени мечения активного GBA ME569 в первичных клетках от пациентов с болезнью Гоше I типа (N370S/V394L), II типа (G325R/C342G) и III типа (L444P/L444P). См. пример 6.

Фиг. 9. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках от пациента с болезнью Гоше I типа (N370S/V394L). Винкулин применяли в качестве контроля нагрузки. См. пример 7.

Фиг. 10. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках от пациента с болезнью Гоше I типа (N370S/1-BP ins 84G). RPA применяли в качестве контроля нагрузки. См. пример 7.

Фиг. 11. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение уровня белка GBA в первичных клетках от пациента с болезнью Гоше I типа (N370S/1-BP ins 84G). RPA применяли в качестве контроля нагрузки. См. пример 7.

Фиг. 12. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках от пациента с болезнью Гоше II типа (L444P/P415R). RPA применяли в качестве контроля нагрузки. См. пример 8.

Фиг. 13. Индуцированное аримокломолом повышение количества ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках от пациента с болезнью Гоше II типа (G325R/C342G). Винкулин применяли в качестве контроля нагрузки. См. пример 8.

Фиг. 14. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение уровня белка GBA в первичных клетках от пациента с болезнью Гоше II типа (L444P/P415R). Винкулин применяли в качестве контроля нагрузки. См. пример 8.

Фиг. 15. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение уровня белка GBA в первичных клетках от пациента с болезнью Гоше II типа (G325R/C342G). RPA применяли в качестве контроля нагрузки. См. пример 8.

Фиг. 16. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках от пациента с болезнью Гоше III типа (L444P/L444P). Винкулин применяли в качестве контроля нагрузки. См. пример 9.

Фиг. 17. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение уровня белка GBA в первичных клетках от пациента с болезнью Гоше III типа (L444P/L444P). RPA применяли в качестве контроля нагрузки. См. пример 9.

Фиг. 18. Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках от индивидуума с PD-GBA (N370S/N370S). Винкулин применяли в качестве контроля нагрузки. См. пример 10.

Фиг. 19. Аримокломол не влияет на дифференцировку по нейрональному пути MASC от индивидуумов с GD с указанными мутациями GBA. Клетки обрабатывали либо имитирующим контролем (PBS), либо 400 мкМ аримокломола (Ari) в течение 9 дней. Экспрессию нейрональных маркеров бета-тубулина 3 (фиг. 19A) и NeuN (Фиг. 19B) оценивали с помощью иммуноокрашивания. См. пример 11.

Фиг. 20. Индуцированное аримокломолом повышение активности GBA в первичных нейроноподобных клетках от индивидуумов с GD с указанными мутациями GBA. Полученные из кожи фибробласты от индивидуума с GDTIII (L444P/L444P) были включены в качестве контроля. Клетки обрабатывали либо имитирующим контролем (PBS), либо 400 мкМ аримокломола (Ari). См. пример 11.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Бета-глюкоцереброзидаза или глюкоцереброзидаза (запись UniProt P04062, GLCM_HUMAN, также называемая глюкозилцерамидазой, кислой бета-глюкозидазой, D-глюкозил-N-ацилсфингозин глюкогидролазой, GCазой или GBA), представляет собой фермент с глюкозилцерамидазной активностью, который расщепляет, посредством гидролиза, бета-гликозидную связь глюкоцереброзида, промежуточного соединения в метаболизме гликолипидов:

D-глюкозил-N-ацилсфингозин + H₂O = D-глюкоза + N-ацилсфингозин.

Для активности GBA требуются сапозин C и анионные фосфолипиды. Она находится в лизосоме. Она кодируется геном GBA (формальное название: глюкозидаза, бета, кислая; номер гена/локуса в MIM 606463; EC 3.2.1.45). В результате альтернативного сплайсинга образуется множество вариантов транскриптов.

Мутации в гене GBA, который кодирует лизосомный фермент, недостаточность которого наблюдается при болезни Гоше, являются важными и распространенными факторами риска развития болезни Паркинсона и ассоциированных нарушений. Эта связь впервые была признана в клинике в тех случаях, когда отмечался, хотя и редко, паркинсонизм у пациентов с болезнью Гоше, и чаще у родственников, которые являлись облигатными носителями (индивидуум, который может быть клинически здоровым, но который должен нести мутацию гена, как следует из анализа семейного анамнеза).

Информация о мутациях гена GBA постоянно обновляется в базе данных мутаций LOVD лаборатории молекулярной генетики CCHMC (CCHMC Molecular Genetics Laboratory), болезнь Гоше; глюкозидаза, бета, кислая (GBA), по адресу https://research.cchmc.org/LOVD2/home.php?select_db=GBA.

В последующем результаты масштабных исследований продемонстрировали, что у пациентов с болезнью Паркинсона и ассоциированными нарушениями с тельцами Леви наблюдалась повышенная частота мутаций GBA по сравнению с контрольными индивидуумами. У пациентов с GBA-ассоциированным паркинсонизмом проявляются различные формы паркинсонического фенотипа, однако имеет место тенденция к развитию в более раннем возрасте и более выраженному проявлению ассоциированных когнитивных изменений, по сравнению с пациентами с паркинсонизмом без мутаций GBA. Гипотезы, предлагаемые для объяснения этой связи, включают приобретение функции вследствие мутаций в гене глюкоцереброзидазы, что способствует агрегации α-синуклеина; накопление субстрата вследствие утраты ферментативной функции, что способствует нарушению процессинга и клиренса α-синуклеина; и двунаправленную петлю обратной связи.

Альфа-синуклеин представляет собой белок семейства синуклеинов с неизвестной функцией, изначально обнаруженный в нервной ткани. Он может подвергаться агрегации с образованием нерастворимых фибрилл при патологических состояниях, характеризующихся наличием телец Леви, таких как болезнь Паркинсона, деменция с тельцами Леви и множественная системная атрофия. Альфа-синуклеин является основным структурным компонентом фибрилл в составе телец Леви.

Аримокломол представляет собой низкомолекулярный индуктор белков теплового шока, в том числе Hsp70. В настоящее время он находится на стадии исследования для лечения бокового амиотрофического склероза (ALS) и лизосомной болезни накопления, представляющей собой Болезнь Ниманна-Пика типа C. Индукция белков теплового шока, в том числе Hsp70, обеспечивает защиту мембран лизосом и повышение активности ферментов лизосом, ответственных за разрушение субстрата лизосом.

Авторы настоящего изобретения в настоящем документе показали, что аримокломол повышает активность GBA в клетках от пациента с болезнью Гоше III типа (например, L444P/L444P) до наблюдаемых у клинически здорового индивидуума уровней (в некоторых случаях таких же уровней, как у носителей мутации GBA). Также в настоящем документе показано, что аримокломол неожиданно повышает активность GBA в клетках от носителя мутации GBA (например, L444P в гетерозиготном состоянии) более чем в 2 раза относительно наблюдаемых у клинически здорового индивидуума уровней активности. Кроме того, аримокломол повышает активность GBA с N370S в клетках от пациента с PD. Таким образом, активность GBA – и уровни – также могут быть повышены в клетках от гетерозигот с мутантным GBA (носители) и в клетках от гомозигот с мутантным GBA, которые являются клинически здоровыми в отношении болезни Гоше.

Индуцированное аримокломолом повышение уровней и/или активности GBA, таким образом, может оказаться пригодным для лечения множества протеинопатий, при которых уровни и/или активность GBA являются аномальными.

Аримокломол в настоящем документе определен как активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей.

В настоящем изобретении предусмотрен аримокломол для применения в лечении форм дефицита GBA. Согласно одному варианту осуществления указанный дефицит GBA не включает болезнь Гоше (GD) per se/саму по себе.

В настоящем изобретении предусмотрен аримокломол для применения в лечении ассоциированного с глюкоцереброзидазой (GBA) нарушения, отличного от болезни Гоше (GD).

Согласно одному варианту осуществления указанное лечение является профилактическим, терапевтическим или обеспечивающим облегчение симптомов. Согласно конкретному варианту осуществления указанное лечение является профилактическим. Согласно другому варианту осуществления указанное лечение является терапевтическим. Согласно дополнительному варианту осуществления указанное лечение обеспечивает облегчение симптомов.

Также в настоящем изобретении предусмотрено применение аримокломола для изготовления лекарственного препарата для лечения ассоциированного с глюкоцереброзидазой (GBA) нарушения, отличного от болезни Гоше (GD).

Также в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения ассоциированного с глюкоцереброзидазой (GBA) нарушения, отличного от болезни Гоше (GD), причем указанный способ предусматривает введение эффективного количества аримокломола нуждающемуся в этом индивидууму.

Термин «индивидуум» или «субъект» относится к позвоночным, в частности, представителю вида млекопитающих, предпочтительно приматам, включая людей. Согласно предпочтительному варианту осуществления индивидуум в контексте настоящего документа представляет собой человека, мужского или женского пола, любого возраста.

«Нуждающийся в этом индивидуум» относится к индивидууму, который может получить пользу от настоящего изобретения. Согласно одному варианту осуществления указанный нуждающийся индивидуум представляет собой страдающего заболеванием индивидуума, где указанным заболеванием является GBA-ассоциированное нарушение.

GBA-ассоциированные нарушения

Согласно одному варианту осуществления предусмотрено соединение, выбранное из группы, состоящей из (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид цитрата; (-)-S-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид цитрата; (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид малеата; и (-)-S-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид малеата, для применения в лечении GBA-ассоциированного нарушения.

Отсылка к аримокломолу, как определено в настоящем документе, для применения в лечении GBA-ассоциированного нарушения, охватывает любое из нижеприведенных состояний.

GBA-ассоциированное нарушение, как определено в настоящем документе, может относится к любому нарушению, которое ассоциировано с уровнями GBA и/или активностью GBA. Таким образом, пониженные уровни и/или пониженная активность GBA связаны с GBA-ассоциированным нарушением, как определено в настоящем документе. Согласно одному варианту осуществления выражение «ассоциирован с» означает предрасположенность (или повышение риска развития; или наличие).

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение не является болезнью Гоше. Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение не является болезнью Гоше I типа. Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение не является болезнью Гоше II типа. Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение не является болезнью Гоше III типа. Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение не является болезнью Гоше II или III типов.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с пониженными уровнями фермента GBA.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с пониженной активностью фермента GBA.

Пониженные уровни фермента GBA и/или активность GBA также могут быть определены как уменьшенные уровни фермента GBA и/или активность GBA; недостаточные уровни фермента GBA и/или активность GBA; или низкие уровни фермента GBA и/или активность GBA.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение упоминают как дефицит GBA.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение характеризуется активностью и/или уровнем фермента GBA, которые являются пониженными, но достаточными для сохранения статуса «клинически здоровый» в отношении болезни Гоше (т. е. болезнь Гоше отсутствует и не диагностируется). Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение характеризуется активностью GBA и/или уровнем фермента, которые снижены по сравнению с уровнями активности в случае дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с одной или несколькими мутациями гена GBA индивидуума. Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у индивидуума с одной или несколькими мутациями гена GBA, который остается клинически здоровым в отношении болезни Гоше.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с одной или несколькими «мягкими» мутациями гена GBA (ассоциированы с GD I типа; TI).

Согласно другому варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с одной или несколькими «тяжелыми» мутациями гена GBA (ассоциированы с GD II типа; TII, и GD III типа; TIII).

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с одной или несколькими мутациями гена GBA в гетерозиготном состоянии, где указанные мутации гена GBA в гетерозиготном состоянии не обуславливают или не приводят в результате к развитию болезни Гоше.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у индивидуума с одной или несколькими мутациями гена GBA в гетерозиготном состоянии, который остается клинически здоровым в отношении болезни Гоше.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с одной или несколькими мутациями гена GBA в гомозиготном состоянии и/или мутациями гена GBA в компаунд-гетерозиготном состоянии, где указанные мутации гена GBA не обуславливают или не приводят в результате к развитию болезни Гоше.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у индивидуума с одной или несколькими мутациями гена GBA в гомозиготном и/или компаунд-гетерозиготном состоянии, который остается клинически здоровым в отношении болезни Гоше.

Конкретные мутации в гене GBA, которые могут влиять на активность белка GBA, включают L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G,

V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S и IVS2+1G>A/N188S.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с (или предусматривает, характеризуется) одной или несколькими мутациями в гене GBA, выбранными из группы, состоящей из L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R Y133*, F213I, N188S и IVS2+1G>A/N188S. Указанные одна или несколько мутаций в гене GBA могут представлять собой мутации в гетерозиготном состоянии, компаунд-гетерозиготном состоянии или гомозиготном состоянии.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у индивидуума с одной или несколькими мутациями гена GBA, выбранными из группы, состоящей из L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R Y133*, F213I, N188S и IVS2+1G>A/N188S, который остается клинически здоровым в отношении болезни Гоше. Указанные одна или несколько мутаций в гене GBA могут представлять собой мутации в гетерозиготном состоянии, компаунд-гетерозиготном состоянии или гомозиготном состоянии.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA L444P (L444P/, L444P/+ или L444P/L444P). Аллель GBA в гетерозиготном состоянии, предусматривающий мутацию L444P, может упоминаться как L444P/+.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA D409H.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA D409V.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA E235A.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA E340A.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA E326K.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA N370S. Аллель GBA в гомозиготном состоянии, предусматривающий мутацию N370S, может упоминаться как N370S/N370S. Аллель GBA в гетерозиготном состоянии, предусматривающий мутацию N370S, может упоминаться как N370S/+.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA N370S/1-BP ins 84G.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA V394L.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA A456P.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA V460V.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA C342G.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA G325R.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA P415R.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA Y133*.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA F213I.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с мутацией гена GBA N188S и/или IVS2+1G>A/N188S.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с одной или несколькими мутациями гена GBA без сопутствующего снижения активности фермента GBA.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с пониженной активностью фермента GBA, и при этом указанный ген GBA является геном дикого типа. Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с идиопатически пониженной активностью фермента GBA.

Аллель GBA дикого типа может быть упомянута как (+/+) (без мутации GBA).

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с пониженной активностью GBA вследствие супрессии активности белка.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с пониженной активностью GBA вследствие репрессии транскрипции или трансляции гена/белка.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение ассоциировано с пониженной активностью GBA, и при этом указанный ген GBA является геном дикого типа, и снижение активности GBA обусловлено супрессией активности белка и/или репрессией транскрипции или трансляции гена/белка.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у индивидуума с аллелем GBA в гетерозиготном состоянии, предусматривающим одну или несколько мутаций, выбранных из группы, состоящей из L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S и IVS2+1G>A/N188S.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у индивидуума с аллелем GBA в гетерозиготном состоянии, предусматривающим мутации L444P, A456P, V460V в цис-положении.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у гетерозиготы по L444P, A456P, V460V.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у гетерозиготы по комплексному аллелю GBA с L444P, A456P, V460V.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у носителя мутации GBA. Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у облигатного носителя. Согласно одному варианту осуществления носитель мутации GBA является клинически здоровым в отношении болезни Гоше.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у клинически здорового прародителя, родителя, сиблинга или ребенка пациента с болезнью Гоше.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у клинически здорового родителя или сиблинга пациента с болезнью Гоше.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у индивидуума с аллелем GBA в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии, предусматривающим одну или несколько мутаций, выбранных из группы, состоящей из L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S и IVS2+1G>A/N188S, где указанный индивидуум остается клинически здоровым в отношении болезни Гоше.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у индивидуума с аллелем GBA в гомозиготном состоянии, предусматривающим мутацию N370S/N370S.

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей, для применения в способе лечения ассоциированного с глюкоцереброзидазой (GBA) нарушения, такого как ассоциированное с глюкоцереброзидазой (GBA) нарушение, отличное от болезни Гоше (GD).

Согласно одному варианту осуществления ассоциированное с глюкоцереброзидазой (GBA) нарушение представляет собой ассоциированный с GBA паркинсонизм.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение представляет собой GBA-ассоциированное нарушение с тельцами Леви, такое как GBA-ассоциированное нарушение с тельцами Леви, выбранное из группы, состоящей из GBA-ассоциированной болезни Паркинсона, GBA-ассоциированной деменции с тельцами Леви и GBA-ассоциированной множественной системной атрофии.

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей, для применения в способе лечения GBA-ассоциированной альфа-синуклеинопатии.

GBA-ассоциированная альфа-синуклеинопатия в настоящем документе может быть определена как альфа-синуклеинопатия, ассоциированная с уровнем и/или активностью фермента GBA. Согласно одному варианту осуществления альфа-синуклеинопатия характеризуется пониженными уровнями и/или активностью GBA, что ассоциировано с повышением количества альфа-синуклеина. Согласно одному варианту осуществления лечение аримокломолом обеспечивает уменьшение степени агрегации альфа-синуклеина. Согласно одному варианту осуществления лечение аримокломолом обеспечивает повышение активности и/или уровней GBA.

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей, для применения в способе лечения GBA-ассоциированной альфа-синуклеинопатии, выбранной из группы, состоящей из GBA-ассоциированной болезни Паркинсона (PD), GBA-ассоциированной деменции с тельцами Леви (DLB) и GBA-ассоциированной множественной системной атрофии (MSA).

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей, для применения в способе лечения болезни Паркинсона, в частности, GBA-ассоциированной болезни Паркинсона.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с пониженными уровнями и/или активностью фермента GBA.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с одной или несколькими мутациями гена GBA. Согласно одному варианту осуществления индивидуум с GBA-ассоциированной болезнью Паркинсона остается клинически здоровым в отношении болезни Гоше.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с мутацией гена GBA в гетерозиготном состоянии. Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у индивидуума с одной или несколькими мутациями гена GBA в гетерозиготном состоянии, который остается клинически здоровым в отношении болезни Гоше.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с мутацией гена GBA в гомозиготном состоянии. Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у индивидуума с одной или несколькими мутациями гена GBA в гомозиготном и/или компаунд-гетерозиготном состоянии, который остается клинически здоровым в отношении болезни Гоше.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение обусловлено генотипом по GBA, являющимся генетическим фактором высокого риска развития болезни Паркинсона. Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение представляет собой GBA-дефицитную болезнь Паркинсона (PD-GBA). Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у страдающих болезнью Паркинсона пациентов с аллелями GBA в гетерозиготном состоянии. Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение наблюдается у страдающих болезнью Паркинсона пациентов с аллелями GBA в гомозиготном состоянии, клинически здоровых в отношении болезни Гоше.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с мутацией гена GBA, выбранной из группы, состоящей из L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S и IVS2+1G>A/N188S. Указанные одна или несколько мутаций в гене GBA могут представлять собой мутации в гетерозиготном состоянии, компаунд-гетерозиготном состоянии или гомозиготном состоянии. Согласно одному варианту осуществления индивидуум, у которого наблюдается мутация гена GBA, является клинически здоровым в отношении болезни Гоше.

Согласно одному варианту осуществления у индивидуума с GBA-ассоциированной болезнью Паркинсона наблюдается мутация гена GBA, выбранная из группы, состоящей из L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S и IVS2+1G>A/N188S.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с мутацией гена GBA N370S.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с мутацией гена GBA N370S в гетерозиготном состоянии (N370S/+).

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с мутацией гена GBA N370S в гомозиготном состоянии (N370S/N370S).

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с мутацией гена GBA L444P в гетерозиготном состоянии.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с мутацией гена GBA A456P в гетерозиготном состоянии.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с мутацией гена GBA V460V в гетерозиготном состоянии.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с мутацией гена GBA E326K в гетерозиготном состоянии.

Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение представляет собой болезнь Паркинсона, ассоциированную с идиопатически пониженной активностью и/или уровнями GBA. Согласно одному варианту осуществления GBA-ассоциированное нарушение представляет собой болезнь Паркинсона с идиопатически пониженными активностью и/или уровнями GBA, при которой не идентифицированы мутации гена GBA.

Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей, для применения в способе одного или нескольких из

- повышения активности GBA,

- повышения уровней (или количества) GBA,

- повышения количества активного мутантного GBA,

- повышения количества активного GBA дикого типа,

- усиления фолдинга остающегося в ER мутантного GBA,

- повышения количества процессированного/зрелого GBA,

- повышения количества зрелого (после транспорта из ER) GBA и/или

- повышения количества зрелого GBA, достигающего лизосом.

Согласно одному варианту осуществления аримокломол предназначен для применения в способе повышения уровней и/или активности GBA у индивидуума с GBA-ассоциированным нарушением, таким как GBA-ассоциированная альфа-синуклеинопатия, такая как GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона.

Согласно одному варианту осуществления происходит повышение указанной активности GBA до 50% или больше от гипотетических уровней активности в случае дикого типа, как, например, 50-60%, как, например, 60-70%, как, например, 70-80%, как, например, 80-90%, как, например, 90-100%, как, например, 100-110%, как, например, 110-120%, как, например, 120-130%, как, например, 130-140%, как, например, 140-150% от гипотетических уровней активности в случае дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления происходит повышение указанной активности GBA до гипотетических уровней активности в случае дикого типа или больше.

Согласно одному варианту осуществления происходит повышение указанной активности GBA по меньшей мере на 10%, как, например, по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 30%, как, например, по меньшей мере 40%, например, по меньшей мере 50%, как, например, по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80%, например, по меньшей мере 90%, как, например, по меньшей мере 100%, например, по меньшей мере 110%, как, например, по меньшей мере 120%, например, по меньшей мере 130%, как, например, по меньшей мере 140%, например, по меньшей мере 150%, как, например, по меньшей мере 160%, например, по меньшей мере 170%, как, например, по меньшей мере 180%, например, по меньшей мере 190%, как, например, по меньшей мере 200%, например, по меньшей мере 210%, как, например, по меньшей мере 220%, например, по меньшей мере 230%, как, например, по меньшей мере 240%, например, по меньшей мере 250%, как, например, по меньшей мере 260%, например, по меньшей мере 200%, как, например, по меньшей мере 270%, например, по меньшей мере 280%, как, например, по меньшей мере 290%, например, по меньшей мере 300%.

Согласно одному варианту осуществления происходит повышение указанного уровня (или количества) GBA до 50% или больше от гипотетических уровней в случае дикого типа, как, например, 50-60%, как, например, 60-70%, как, например, 70-80%, как, например, 80-90%, как, например, 90-100%, как, например, 100-110%, как, например, 110-120%, как, например, 120-130%, как, например, 130-140%, как, например, 140-150% от гипотетических уровней в случае дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления происходит повышение указанного уровня GBA до гипотетических уровней в случае дикого типа или больше.

Согласно одному варианту осуществления происходит повышение указанных уровня и/или активности GBA по меньшей мере в 1,5 раза, как, например, по меньшей мере в 2 раза, например, по меньшей мере в 2,5 раза, как, например, по меньшей мере в 3 раза.

Согласно одному варианту осуществления происходит повышение указанного уровня (или количества) GBA по меньшей мере на 10%, как, например, по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 30%, как, например, по меньшей мере 40%, например, по меньшей мере 50%, как, например, по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80%, например, по меньшей мере 90%, как, например, по меньшей мере 100%, например, по меньшей мере 110%, как, например, по меньшей мере 120%, например, по меньшей мере 130%, как, например, по меньшей мере 140%, например, по меньшей мере 150%, как, например, по меньшей мере 160%, например, по меньшей мере 170%, как, например, по меньшей мере 180%, например, по меньшей мере 190%, как, например, по меньшей мере 200%, например, по меньшей мере 210%, как, например, по меньшей мере 220%, например, по меньшей мере 230%, как, например, по меньшей мере 240%, например, по меньшей мере 250%, как, например, по меньшей мере 260%, например, по меньшей мере 200%, как, например, по меньшей мере 270%, например, по меньшей мере 280%, как, например, по меньшей мере 290%, например, по меньшей мере 300%.

Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей, для применения в способе уменьшения степени агрегации альфа-синуклеина.

Профилактическое применение

Согласно другому аспекту предусмотрен активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей, для применения в способе снижения риска развития у индивидуума ассоциированного с глюкоцереброзидазой (GBA) нарушения, отличного от болезни Гоше, где у указанного индивидуума наблюдаются пониженные уровень и/или активность фермента GBA.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдаются уровни и/или активность GBA ниже гипотетических уровней в случае дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдаются уровни (или количество) GBA ниже гипотетических уровней в случае дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдается активность GBA ниже гипотетических уровней активности в случае дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдаются уровни и/или активность GBA, превышающие клинически патологические уровни и/или активность у пациента с болезнью Гоше.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдаются уровни и/или активность GBA ниже гипотетических уровней и/или активности в случае дикого типа, но выше клинически патологических уровней и/или активности у пациента с болезнью Гоше.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдается активность GBA, пониженная до такой же степени, что и у носителя мутации гена GBA (мутация GBA в гетерозиготном состоянии), такого как клинически здоровый носитель, как, например, облигатный носитель.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдаются уровни GBA, пониженные до такой же степени, что и у носителя мутации гена GBA (мутация GBA в гетерозиготном состоянии), такого как клинически здоровый носитель, как, например, облигатный носитель.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума с пониженными уровнями и/или активностью GBA наблюдается одна или несколько мутаций гена GBA в гетерозиготном состоянии.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума с пониженными уровнями и/или активностью GBA наблюдается одна или несколько мутаций гена GBA в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдаются активность и/или уровень GBA, пониженные до определенной степени гипотетических уровней в случае дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдаются активность и/или уровни GBA, составляющие от приблизительно 5 до 95% или от 10 до 90% от гипотетических уровней в случае дикого типа, как, например, 5-10%, как, например, 10-20%, как, например, 20-30%, как, например, 30-40%, как, например, 40-50%, как, например, 50-60%, как, например, 60-70%, как, например, 70-80%, как, например, 80-90%, как, например, 90-95% от гипотетических активности и/или уровней в случае дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдаются активность и/или уровни GBA, составляющие от приблизительно 25 до 75% от гипотетических уровней в случае дикого типа. Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдаются активность и/или уровни GBA, составляющие приблизительно 50% от гипотетических уровней в случае дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдаются активность и/или уровни GBA, составляющие приблизительно 10% от гипотетических уровней и/или активности в случае дикого типа, как, например, 20%, как, например, 30%, как, например, 40%, как, например, 50%, как, например, 60%, как, например, 70%, как, например, 80%, как, например, 90% от гипотетических уровней и/или активности в случае дикого типа.

Согласно одному варианту осуществления указанное GBA-ассоциированное нарушение представляет собой GBA-ассоциированную альфа-синуклеинопатию, такую как GBA-ассоциированная альфа-синуклеинопатия, выбранная из группы, состоящей из GBA-ассоциированной болезни Паркинсона (PD), GBA-ассоциированной деменции с тельцами Леви (DLB) и GBA-ассоциированной множественной системной атрофии (MSA).

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей, для применения в способе снижения риска развития у индивидуума болезни Паркинсона, в частности, GBA-ассоциированной болезни Паркинсона, где у указанного индивидуума наблюдаются пониженные уровни и/или активность фермента GBA.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдается одна или несколько мутаций гена GBA в гетерозиготном состоянии. Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдается одна или несколько мутаций гена GBA в гетерозиготном состоянии, выбранные из группы, состоящей из L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S и IVS2+1G>A/N188S. Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдается мутация гена GBA L444P в гетерозиготном состоянии. Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдается мутация гена GBA E326K в гетерозиготном состоянии. Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдается мутация гена GBA N370S в гетерозиготном состоянии.

Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдается одна или несколько мутаций гена GBA в гомозиготном состоянии. Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдается одна или несколько мутаций гена GBA в гомозиготном состоянии, выбранные из группы, состоящей из L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S и IVS2+1G>A/N188S. Согласно одному варианту осуществления у указанного индивидуума наблюдается мутация гена GBA N370S в гомозиготном состоянии.

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей, для применения в способе снижения риска развития у индивидуума GBA-ассоциированной болезни Паркинсона, где указанным индивидуумом является пациент с болезнью Гоше, такой как болезнь Гоше I типа, II типа или III типа.

Активность GBA

Активность глюкоцереброзидазы можно оценивать с помощью способов, известных в данной области. Например, активность глюкоцереброзидазы можно измерять в цереброспинальной жидкости млекопитающих. Согласно некоторым вариантам осуществления млекопитающее относится к дикому типу по гену GBA. Термин «дикий тип» относится к гену или белку без выявляемых мутаций, о которых известно, что они влияют на уровень и/или ферментативную активность белка.

Если ген оказывается дикого типа, но наблюдают снижение активности глюкоцереброзидазы, снижение активности может быть обусловлено супрессией активности белка или репрессией транскрипции или трансляции гена/белка. Такие механизмы хорошо известны в данной области. Например, продукция белка может быть репрессирована в результате нарушения клеточного механизма. В качестве альтернативы, белок может быть модифицирован в клетке, что приводит к снижению ферментативной активности или ее утрате.

Аримокломол

В настоящем документе отсылка к аримокломолу охватывает активный фармацевтический ингредиент (API), выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида (аримокломол), его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей. Аримокломол также описан, например, в WO 00/50403.

Аримокломол относится к основному соединению N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлориду, его оптически активному (+) или (-) энантиомеру, смеси энантиомеров в любом соотношении и к рацемическому соединению, кроме того, объектами настоящего изобретения являются кислотно-аддитивные соли, образованные из любого из вышеприведенных соединений с неорганическими или органическими кислотами. Все возможные геометрические изомерные формы N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида входят в объем настоящего изобретения. Термин «стереоизомеры N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида» относится ко всем возможным оптическим и геометрическим изомерам соединения.

При необходимости, N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид или один из его оптически активных энантиомеров с помощью известных способов можно превратить в кислотно-аддитивную соль с использованием неорганической или органической кислоты.

Согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент представляет собой рацемат N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида.

Согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент представляет собой оптически активный стереоизомер N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида.

Согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент представляет собой энантиомер N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида.

Согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент выбран из группы, состоящей из (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида и (-)-(S)-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида.

Согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент представляет собой кислотно-аддитивную соль N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида.

Согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент выбран из группы, состоящей из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид цитрата (также известного как BRX-345) и N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид малеата (также известного как BRX-220).

Согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент выбран из группы, состоящей из (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид цитрата; (-)-S-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид цитрата; (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид малеата; и (-)-S-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид малеата.

Композиция

Хотя активный фармацевтический ингредиент можно вводить в виде исходного химического вещества, согласно некоторым вариантам осуществления его предпочтительно давать в форме фармацевтического состава. Соответственно, в настоящем изобретении также предусмотрена композиция, такая как фармацевтическая композиция, т. е. фармацевтически безопасная композиция, содержащая активный фармацевтический ингредиент, как определено в настоящем документе. Согласно одному варианту осуществления композиция содержит фармацевтически и/или физиологически приемлемые носители или вспомогательные вещества.

Фармацевтические композиции, содержащие биологически активное средство по настоящему изобретению, можно получать с помощью традиционных методик, например, как описано в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20-е издание, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Истон, Пенсильвания, 2000 г.

Таким образом, одним аспектом является получение композиции, такой как фармацевтическая композиция, содержащая активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей (аримокломол), для применения в лечении ассоциированного с глюкоцереброзидазой (GBA) нарушения, отличного от болезни Гоше (GD), как определено в настоящем документе.

Введение и дозировка

Согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент или содержащую его композицию, как определено в настоящем документе, вводят нуждающимся в этом индивидуумам в фармацевтически эффективных дозах или терапевтически эффективном количестве.

Согласно одному варианту осуществления терапевтически эффективное количество активного фармацевтического ингредиента представляет собой количество, достаточное для излечения, предупреждения, снижения риска развития, ослабления или частичной задержки клинических проявлений данного заболевания или нарушения и его осложнений. Количество, которое является эффективным для конкретной терапевтической цели, будет зависеть от тяжести и типа нарушения, а также от веса и общего состояния здоровья субъекта. Количество, достаточное для достижения этого, определяется как «терапевтически эффективное количество».

Согласно одному варианту осуществления композицию вводят в дозах от 1 мкг/день до 100 мг/день; как, например, от 1 мкг/день до 10 мкг/день, как, например, от 10 мкг/день до 100 мкг/день, как, например, от 100 мкг/день до 250 мкг/день, как, например, от 250 мкг/день до 500 мкг/день, как, например, от 500 мкг/день до 750 мкг/день, как, например, от 750 мкг/день до 1 мг/день, как, например, от 1 мг/день до 2 мг/день, как, например, от 2 мг/день до 5 мг/день, или как, например, от 5 мг/день до 10 мг/день, как, например, от 10 мг/день до 20 мг/день, как, например, от 20 мг/день до 30 мг/день, как, например, от 30 мг/день до 40 мг/день, как, например, от 40 мг/день до 50 мг/день, как, например, от 50 мг/день до 75 мг/день, как, например, от 75 мг/день до 100 мг/день, как, например, от 100 мг/день до 150 мг/день, как, например, от 150 мг/день до 200 мг/день, или как, например, от 200 мг/день до 250 мг/день, как, например, от 250 мг/день до 300 мг/день, как, например, от 300 мг/день до 400 мг/день, как, например, от 400 мг/день до 500 мг/день, как, например, от 500 мг/день до 600 мг/день, как, например, от 600 мг/день до 700 мг/день, как, например, от 700 мг/день до 800 мг/день, как, например, от 800 мг/день до 900 мг/день, как, например, от 900 мг/день до 1000 мг/день.

Согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент или композицию вводят в дозе от 1 мкг/кг веса тела до 100 мг/кг веса тела; как, например, 1-10 мкг/кг веса тела, как, например, 10-100 мкг/день, как, например, 100-250 мкг/кг веса тела, как, например, 250-500 мкг/кг веса тела, как, например, 500-750 мкг/кг веса тела, как, например, от 750 мкг/кг веса тела до 1 мг/кг веса тела, как, например, от 1 мг/кг веса тела до 2 мг/кг веса тела, как, например, 2-5 мг/кг веса тела, как, например, 5-10 мг/кг веса тела, как, например, 10-20 мг/кг веса тела, как, например, 20-30 мг/кг веса тела, как, например, 30-40 мг/кг веса тела, как, например, 40-50 мг/кг веса тела, как, например, 50-75 мг/кг веса тела, или как, например, 75-100 мг/кг веса тела.

Согласно одному варианту осуществления дозу вводят один или несколько раз в день, как, например, от 1 до 6 раз в день, как, например, от 1 до 5 раз в день, как, например, от 1 до 4 раз в день, как, например, от 1 до 3 раз в день, как, например, от 1 до 2 раз в день, как, например, от 2 до 4 раз в день, как, например, от 2 до 3 раз в день. Согласно одному варианту осуществления дозу вводят менее одного раза в день, как, например, через день или один раз в неделю.

Пути введения

Понятно, что предпочтительный путь введения будет зависеть от общего состояния и возраста подлежащего лечению субъекта, характера подлежащего лечению состояния, местоположения подлежащей лечению ткани в организме и выбранного активного ингредиента.

Системное лечение

Согласно одному варианту осуществления путь введения обеспечивает возможность введения биологически активного средства в кровяное русло для целенаправленного воздействия, в конечном итоге, на участки приложения требуемого действия.

Согласно одному варианту осуществления пути введения представляют собой любой подходящий путь, такой как энтеральный путь (включая пероральное, ректальное, назальное, легочное, буккальное, сублингвальное, чрескожное, интрацистернальное и внутрибрюшинное введение) и/или парентеральный путь (включая подкожное, внутримышечное, интратекальное, внутривенное и внутрикожное введение).

Соответствующие лекарственные формы для такого введения можно получать с помощью традиционных методик.

Парентеральное введение

Парентеральное введение представляет собой любой путь введения, не являющийся пероральным/энтеральным путем, при котором биологически активное средство не подвергается пресистемному метаболизму в печени. Соответственно, парентеральное введение включает любые инъекции и инфузии, например, болюсную инъекцию или непрерывную инфузию, как, например, внутривенное введение, внутримышечное введение или подкожное введение. Кроме того, парентеральное введение включает ингаляции и местное введение.

Соответственно, согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент или композицию вводят местно с обеспечением проникновения через любую слизистую оболочку животного, например, в носу, влагалище, в глазу, во рту, половом протоке, легких, желудочно-кишечном тракте или прямой кишке, например, слизистую оболочку носа или рта, и, соответственно, парентеральное введение может также включать буккальное, сублингвальное, назальное, ректальное, вагинальное и внутрибрюшинное введение, а также легочное и бронхиальное введение путем ингаляции или инстилляции. Согласно некоторым вариантам осуществления биологически активное средство вводят местно с обеспечением проникновения через кожу.

Согласно одному варианту осуществления используют внутривенную, подкожную и внутримышечную формы парентерального введения.

Местное лечение

Согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент или композицию применяют в качестве местного лечения, т. е. вводят непосредственно в участок(-ки) приложения действия. Соответственно, активный фармацевтический ингредиент можно наносить непосредственно на кожу или слизистую оболочку или можно вводить путем инъекции в участок приложения действия, например, в пораженную заболеванием ткань или концевую артерию, ведущую прямо к пораженной заболеванием ткани.

Комбинированное лечение

Также согласно одному аспекту предусмотрен активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей (аримокломол), для применения в способе лечения ассоциированного с глюкоцереброзидазой (GBA) нарушения, отличного от болезни Гоше (GD), в комбинации с другими терапевтическими средствами.

Таким образом, согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент вводят нуждающемуся в этом индивидууму в комбинации по меньшей мере с одним другим терапевтическим средством, как, например, традиционными или известными терапевтическими средствами для лечения GBA-ассоциированных нарушений, в том числе GBA-ассоциированных альфа-синуклеинопатий, таких как GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона (PD), GBA-ассоциированная деменция с тельцами Леви (DLB) и GBA-ассоциированная множественная системная атрофия (MSA).

Введение более одного терапевтического средства в комбинации можно осуществлять либо одновременно, либо последовательно. Одновременное введение может предусматривать два соединения, содержащиеся в одной и той же композиции, или содержащиеся в отдельных композициях, или может предусматривать одну композицию и одно другое терапевтическое средство, применяемое практически в то же время. Последовательное введение означает, что более одного терапевтического средства вводят в различные моменты времени, например, сначала вводят одно терапевтическое средство, а после него вводят второе терапевтическое средств. Временной интервал для последовательного введения более одного терапевтического средства может быть определен специалистом в данной области для достижения оптимального эффекта, и согласно одному варианту осуществления он может составлять от 30 минут до 72 часов.

Терапевтические средства в виде химических соединений можно вводить вместе или по отдельности, каждое в его наиболее эффективной дозировке. Введение более одного соединения может оказывать синергический эффект, эффективно снижая таким образом требуемую дозировку каждого лекарственного средства.

Также согласно одному аспекту предусмотрена композиция, содержащая, по отдельности или вместе, i)

активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей (аримокломол), и ii) другие терапевтические средства, для применения в лечении GBA-ассоциированных нарушений, в том числе GBA-ассоциированных альфа-синуклеинопатий, таких как GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона (PD), GBA-ассоциированная деменция с тельцами Леви (DLB) и GBA-ассоциированная множественная системная атрофия (MSA).

Согласно одному варианту осуществления другие терапевтические средства, или традиционные или известные терапевтические средства, упоминают как дополнительные активные ингредиенты.

Согласно одному варианту осуществления активный фармацевтический ингредиент, выбранный из N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида, его стереоизомеров и их кислотно-аддитивных солей (аримокломол), составляют в виде комбинированного препарата с одним или несколькими дополнительными активными ингредиентами, и/или вводят в комбинации с ними.

Согласно одному варианту осуществления дополнительный активный ингредиент выбран из одного или нескольких активных ингредиентов, известных и/или используемых в лечении GBA-ассоциированных нарушений, в том числе GBA-ассоциированных альфа-синуклеинопатий, таких как GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона (PD), GBA-ассоциированная деменция с тельцами Леви (DLB) и GBA-ассоциированная множественная системная атрофия (MSA).

Согласно одному варианту осуществления дополнительный активный ингредиент представляет собой соединение, применяемое для лечения болезни Паркинсона. Согласно одному варианту осуществления указанное соединение, применяемое для лечения болезни Паркинсона, выбрано из группы, состоящей из дофамина, L-DOPA, леводопы, агонистов дофаминовых рецепторов, ингибиторов карбоксилазы, таких как карбидопа или бенсеразид, антагонистов NMDA, таких как, например, аматидин (Symmetrel), ингибиторов катехол-О-метилтрансферазы (COMT), таких как, например, толкапон и энтакапон, ингибиторов MAO-B, таких как, например, селегилин и разагилин, карбидопы-леводопы, антихолинергических средств и амантадина.

Согласно одному варианту осуществления дополнительный активный ингредиент представляет собой соединение, применяемое для лечения болезни Гоше. Согласно одному варианту осуществления дополнительный активный ингредиент выбран из группы, состоящей из препаратов для ферментозаместительной терапии, аллостерических шаперонов, фармакологических шаперонов и препаратов для субстрат-редуцирующей терапии. Согласно одному варианту осуществления указанный дополнительный активный ингредиент выбран из группы, состоящей из миглустата (Zavesca), имиглюцеразы (Cerezyme), элиглустата (Cerdelga), VPRIV, талиглюцеразы альфа (Elelyso) и велаглюцеразы альфа.

Примеры

Пример 1. Дозозависимый ответ у гетерозигот с болезнью Гоше II типа (генотип, обуславливающий болезнь Паркинсона) – индукция BiP и GBA.

Материалы и способы

Клеточная культура

Клеточные линии первичных фибробластов человека культивировали в стандартных условиях культивирования клеток (37ºC и 5% CO₂) в DMEM, дополненной заменимыми аминокислотами (NEAA), 1% Pen-Strep (пенициллин-стрептомицин) и 12% FCS. Их пересевали 1-2 раза/неделю с индексом разведения 1:2 или 1:3. Клетки применяли для экспериментов примерно на 16-26 пассаже, при условии, что признаков репликативного старения не наблюдалось (визуальное наблюдение).

Клеточная линия	Мутация GBA	Возраст на момент отбора образцов	Тип GD
GM00877	L444P/L444P, A456P, V460V	1Y	II
GM00878	L444P, A456P, V460V	-	Носитель

Вестерн-блоттинг

Клетки собирали в PBS и центрифугировали при 3500 об./мин. в течение 5 мин. при 4°C. Клеточные осадки лизировали в 1X буфере для экстракции (Enzo Life Science), содержащем ингибиторы протеаз, подвергали обработке ультразвуком и осветляли путем центрифугирования при 13000 об./мин. в течение 10 мин. при 4°C. Концентрацию белка измеряли с помощью BCA-анализа. Образцы, содержащие примерно 10-20 мкг белка, разводили в гликопротеин-денатурирующем буфере (New England Biolabs) и подвергали денатурации путем инкубации в течение 10 мин. при 100ºC. Образцы инкубировали с EndoH (New England Biolabs) или без него в течение 1 ч. при 37ºC, добавляли буфер Лэммли для образцов и подвергали образцы SDS-PAGE с применением готового геля TGX (Bio-Rad). После переноса на нитроцеллюлозную мембрану (Trans-Blot Turbo, Bio-Rad), мембраны в течение непродолжительного времени окрашивали с помощью понсо S, а затем блокировали в 5% обезжиренном молоке в PBS + 0,1% tween (PBS-T). Инкубацию с первичными антителами (в разведении от 1:500 до 1:2000) осуществляли в накрытых парафильмом стеклянных чашках в течение ночи при 4°C. После промывки в PBS-T мембраны инкубировали 1 ч. с вторичным антителом, разведенным 1:10000 в 5% обезжиренном молоке в PBS-T. Мембраны для блоттинга проявляли с применением субстрата SuperSignal™ West Dura Extended Duration Substrate (Life technologies) и визуализировали с применением системы G-box (Syngene).

Результаты

Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках

Сообщалось, что аримокломол обеспечивает повышение уровней экспрессии белков теплового шока, например, белка теплового шока 70 (HSP70) (Kieran et al., Nature Medicine, 2004).

Для оценки эффекта аримокломола в отношении уровня экспрессии ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках, фибробласты человека от индивидуума с аллелем GBA в гетерозиготном состоянии, предусматривающим мутации L444P, A456P, V460V в цис-положении (носитель, клинически здоровый в отношении болезни Гоше), обрабатывали 0, 10, 50 или 200 мкМ аримокломола в течение 14 дней. Затем клетки собирали для проведения вестерн-блот-анализа. Лизат необработанных нормальных фибробластов человека применяли в качестве контроля.

Из полученных авторами настоящего изобретения результатов видно, что аримокломол дозозависимым образом повышает уровни экспрессии BiP в клеточной линии фибробластов человека, гетерозиготной по L444P, A456P, V460V комплексного аллеля GBA. Это свидетельствует о том, что аримокломол посредством повышения уровня экспрессии BiP может обеспечивать усиленный фолдинг остающегося в ER мутантного GBA.

Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества фермента GBA в первичных клетках

Эффект аримокломола в отношении уровней белка GBA также оценивали в клеточной линии фибробластов человека, гетерозиготной по L444P, A456P, V460V комплексного аллеля GBA. В линии с повышенным уровнем экспрессии ER-шаперона BiP дозозависимое повышение общего уровня GBA наблюдали в клетках, обработанных аримокломолом.

Пример 2. Дозозависимый ответ в отношении активности GBA у гомозигот и гетерозигот с болезнью Гоше II типа (GTII и генотип, обуславливающий высокий риск развития болезни Паркинсона).

Материалы и способы

Клеточная культура

Клеточные линии первичных фибробластов человека культивировали в стандартных условиях культивирования клеток (37ºC и 5% CO₂) в DMEM, дополненной заменимыми аминокислотами (NEAA), 1% Pen-Strep и 12% FCS. Их пересевали 1-2 раза/неделю с индексом разведения 1:2 или 1:3. Клетки применяли для экспериментов примерно на 16-26 пассаже, при условии, что признаков репликативного старения не наблюдалось (визуальное наблюдение).

Анализ активности GBA

Активность GBA измеряли с применением анализа GBA в интактных клетках с применением в качестве субстрата 4-метилумбеллиферил-бета-D-глюкопиранозида (4-MUG) (Mu et al, Cell, 2008). Вкратце, фибробласты высевали в 12-луночные планшеты и в трех повторностях обрабатывали указанными концентрациями аримокломола в течение 4 недель. Среду пополняли свежим соединением каждые 2-3 дня, и клетки рассевали дважды в ходе эксперимента. Через 4 недели после обработки клетки переносили в 96-луночные планшеты и измеряли активность GBA с применением 4-MUG в качестве субстрата при pH 4,0. Высвобожденный флуорофор 4-MU количественно определяли в виде единиц флуоресценции (FLU) и нормализовали к плотности клеток с применением окрашивания кристаллическим фиолетовым параллельного планшета. Нормализованные данные представлены в виде относительных единиц (среднее ± SD).

Результаты

Эффект аримокломола в отношении активности GBA в первичных клетках с мутациями GBA оценивали в фибробластах от пациента с болезнью Гоше II типа, имеющего генотип L444P/L444P, A456P, V460V. Авторы настоящего изобретения наблюдали, что обработка аримокломолом обеспечивает повышение активности GBA дозозависимым образом. Следует отметить, что повышение активности GBA, индуцированное 50 мкМ аримокломола, соответствует уровню активности у клеток, гетерозиготных по аллелю с L444P, A456P, V460V (обозначено серой линией на фиг. 3), от индивидуума, у которого не наблюдаются симптомы заболевания.

Важно отметить, что аримокломол также повышает активность GBA в первичных фибробластах, гетерозиготных по аллелю с L444P, A456P, V460V. Из результатов видно, что активность GBA может быть повышена даже в клетках от гетерозигот по мутантному GBA (носители).

Пример 3. Дозозависимый ответ в отношении активности GBA у гомозигот с болезнью Гоше I типа, II типа и II типа.

Материалы и способы

Клеточная культура

Клеточные линии первичных фибробластов человека культивировали в стандартных условиях культивирования клеток (37ºC и 5% CO₂) в DMEM, дополненной заменимыми аминокислотами (NEAA), 1% Pen-Strep и 12% FCS. Их пересевали 1-2 раза/неделю с индексом разведения 1:2 или 1:3. Клетки применяли для экспериментов примерно на 16-26 пассаже, при условии, что признаков репликативного старения не наблюдалось (визуальное наблюдение).

Клеточная линия	Мутация GBA	Возраст на момент отбора образцов	Заболевание
GM08760	L444P, E326K/L444P, E326K	1Y	GD TII
GM10915	L444P/L444P	7Y	GD TIII
GM01607	N370S/V394L	30Y	GD TI
GM00372	N370S/1-BP ins 84G	29Y	GD TI
GM02627	G325R/C342G	3Y	GD TII
GM01260	L444P/P415R	11M	GD TII

Анализ активности GBA

Активность GBA измеряли с применением анализа GBA в интактных клетках с применением в качестве субстрата 4-метилумбеллиферил-бета-D-глюкопиранозида (4-MUG) (Mu et al, Cell, 2008). Вкратце, фибробласты высевали в 96-луночные планшеты и в трех повторностях обрабатывали указанными концентрациями аримокломола в течение 5 дней. Среду пополняли свежим соединением каждые 2-3 дня. Активность GBA измеряли с применением 4-MUG в качестве субстрата при pH 4,0. Высвобожденный флуорофор 4-MU количественно определяли в виде единиц флуоресценции (FLU) и нормализовали к плотности клеток с применением окрашивания кристаллическим фиолетовым параллельного планшета. Нормализованные данные представлены в виде кратности изменения относительно ложно-обработанных контрольных клеток (среднее ± SD).

Результаты

Эффект аримокломола в отношении активности GBA в первичных клетках с дополнительными мутациями GBA оценивали путем обработки клеток с определенным генотипом аримокломолом. Из полученных авторами настоящего изобретения данных видно, что аримокломол дозозависимым образом повышает активность GBA в двух клеточных линиях GD I типа: N370S/V394L и N370S/1-BP ins 84G. Важно отметить, что, поскольку аллель с мутацией 1-BP ins 84G считается молчащим, эти результаты демонстрируют, что аримокломол повышает активность мутации N370S.

Дозозависимый эффект аримокломола также наблюдали в отношении активности GBA в первичных клетках от пациентов с GD II/III типа, которые являются либо гомозиготами по L444P (L444P/L444P), либо компаунд-гетерозиготами по мутациям GBA G325R/C342G или P415R/L444P. Менее выраженное повышение активности GBA обнаружено в обработанных аримокломолом клетках в случае GD II типа, гомозиготных по аллелю с E326K, L444P.

Пример 4. Дозозависимый ответ в отношении активности GBA в первичных клетках от страдающего болезнью Паркинсона пациента с аллелем GBA в гетерозиготном состоянии, предусматривающим мутацию N370S.

Материалы и способы

Клеточная культура

Клеточную линию первичных фибробластов человека культивировали в стандартных условиях культивирования клеток (37ºC и 5% CO₂) в DMEM, дополненной заменимыми аминокислотами (NEAA), 1% Pen-Strep и 12% FCS. Клетки пересевали 1 раз/неделю с индексом разведения 1:2. Клетки применяли для экспериментов примерно на 16-26 пассаже, при условии, что признаков репликативного старения не наблюдалось (визуальное наблюдение).

Клеточная линия	Мутация GBA	Возраст на момент отбора образцов	Заболевание
ND34263	N370S	65Y	PD

Анализ активности GBA

Активность GBA измеряли с применением анализа GBA в интактных клетках с применением в качестве субстрата 4-метилумбеллиферил-бета-D-глюкопиранозида (4-MUG) (Mu et al, Cell, 2008). Вкратце, фибробласты высевали в 96-луночные планшеты и в трех повторностях обрабатывали указанными концентрациями аримокломола в течение 5 дней. Среду пополняли свежим соединением каждые 2-3 дня. Активность GBA измеряли с применением 4-MUG в качестве субстрата при pH 4,0. Высвобожденный флуорофор 4-MU количественно определяли в виде единиц флуоресценции (FLU) и нормализовали к плотности клеток с применением окрашивания кристаллическим фиолетовым параллельного планшета. Нормализованные данные представлены в виде кратности изменения относительно ложно-обработанных контрольных клеток (среднее ± SD).

Результаты

С целью изучения эффекта аримокломола в отношении мутации N370S при болезни Паркинсона, первичные клетки от пациента с PD с мутацией N370S обрабатывали аримокломолом. Из полученных авторами настоящего изобретения данных видно, что аримокломол дозозависимым образом повышает активность GBA с N370S в клетках от пациента с PD.

Пример 5. Дозозависимый ответ в отношении активности GBA в первичных клетках от здоровых индивидуумов без мутаций GBA (+/+).

Материалы и способы

Клеточная культура

Клеточные линии первичных фибробластов человека культивировали в стандартных условиях культивирования клеток (37ºC и 5% CO₂) в DMEM, дополненной заменимыми аминокислотами (NEAA), 1% Pen-Strep и 12% FCS. Их пересевали 1-2 раза/неделю с индексом разведения 1:2 или 1:3. Клетки применяли для экспериментов примерно на 16-26 пассаже, при условии, что признаков репликативного старения не наблюдалось (визуальное наблюдение).

Клеточная линия	Мутация GBA	Возраст на момент отбора образцов	Заболевание
GM00498	-	3Y	-
GM05659	-	1Y	-
GM08401	-	75Y	-

Анализ активности GBA

Активность GBA измеряли с применением анализа GBA в интактных клетках с применением в качестве субстрата 4-метилумбеллиферил-бета-D-глюкопиранозида (4-MUG) (Mu et al, Cell, 2008). Вкратце, фибробласты высевали в 96-луночные планшеты и в трех повторностях обрабатывали указанными концентрациями аримокломола в течение 5 дней. Среду пополняли свежим соединением каждые 2-3 дня. Активность GBA измеряли с применением 4-MUG в качестве субстрата при pH 4,0. Высвобожденный флуорофор 4-MU количественно определяли в виде единиц флуоресценции (FLU) и нормализовали к плотности клеток с применением окрашивания кристаллическим фиолетовым параллельного планшета. Нормализованные данные представлены в виде кратности изменения относительно ложно-обработанных контрольных клеток (среднее ± SD).

Результаты

С целью изучения эффекта аримокломола в отношении белка GBA WT первичные клетки от здоровых индивидуумов без мутаций GBA (+/+) обрабатывали аримокломолом. Авторы настоящего изобретения наблюдали, что обработка аримокломолом обеспечивает повышение активности GBA WT дозозависимым образом во всех трех клеточных линиях, хотя и до отличающихся значений.

Пример 6. Индуцированное аримокломолом повышение степени мечения флуоресцентным зондом с зависимой от активности генерацией сигнала активного GBA при болезни Гоше TI/TII/TIII.

Материалы и способы

Клеточная культура

Клеточные линии первичных фибробластов человека культивировали в стандартных условиях культивирования клеток (37ºC и 5% CO2) в DMEM, дополненной заменимыми аминокислотами (NEAA), 1% Pen-Strep и 12% FCS. Их пересевали 1-2 раза/неделю с индексом разведения 1:2 или 1:3. Клетки применяли для экспериментов примерно на 16-26 пассаже, при условии, что признаков репликативного старения не наблюдалось (визуальное наблюдение).

Клеточная линия	Мутация GBA	Возраст на момент отбора образцов	Заболевание
GM01607	N370S/V394L	30Y	GD TI
GM02627	G325R/C342G	3Y	GD TII
GM10915	L444P/L444P	7Y	GD TIII

Мечение GBA ME569

Активный GBA можно селективно метить флуоресцентным зондом с зависимой от активности генерацией сигнала (ABP) ME569 (Witte et al, 2010). Вкратце, фибробласты высевали на чашки и в двух повторностях обрабатывали указанными концентрациями аримокломола в течение 5 дней. Среду пополняли свежим соединением каждые 2-3 дня. Клетки собирали в PBS, экстрагировали белки и определяли концентрации с применением BCA-анализа. Равное количество общего белка инкубировали с ME569 в течение 30 минут при 37°C. Добавляли буфер для внесения, образцы инкубировали в течение 5 мин. при 98°C, а затем подвергали SDS-PAGE с применением готового геля TGX (Bio-Rad). После гель-электрофореза детектировали флуоресценцию с применением красных LED/фильтра 705M (G-box, Syngene). Количество меченного GBA определяли с применением программного обеспечения GeneTools v.4.03.01.0 от Syngene. Нормализованные данные представлены в виде кратности изменения относительно ложно-обработанных контрольных клеток (среднее ± SEM, n = 3-4).

Результаты

Эффект аримокломола в отношении количества GBA, меченного флуоресцентным ABP, оценивали в первичных клетках от пациентов с GD, имеющих определенный генотип. Из полученных авторами настоящего изобретения данных видно, что аримокломол дозозависимым образом повышает степень мечения GBA в клеточной линии GD TI (N370S/V394L) и клеточной линии GD TII (G325R/C342G). В клеточной линии GD TII (гомозиготы по L444P) оценивали только высокую дозу аримокломола, и в этой клеточной линии аримокломол также обеспечивал повышение количества GBA, который может быть мечен флуоресцентным ABP.

Вместе эти данные демонстрируют, что аримокломол обеспечивает повышение количества активного мутантного GBA в первичных клетках в случае всех трех типов болезни Гоше (TI 1 типа, TII II типа и TIII III типа).

Пример 7. Дозозависимый ответ в случае болезни Гоше I типа – индукция BiP и GBA.

Материалы и способы

Клеточная культура

Клеточные линии первичных фибробластов человека культивировали в стандартных условиях культивирования клеток (37ºC и 5% CO₂) в DMEM, дополненной заменимыми аминокислотами (NEAA), 1% Pen-Strep и 12% FCS. Их пересевали 1-2 раза/неделю с индексом разведения 1:2 или 1:3. Клетки применяли для экспериментов примерно на 16-26 пассаже, при условии, что признаков репликативного старения не наблюдалось (визуальное наблюдение).

Клеточная линия	Мутация GBA	Возраст на момент отбора образцов	Тип GD
GM00372	N370S/1-BP ins 84G	29Y	I
GM01607	N370S/V394L	30Y	I

Вестерн-блоттинг

Клетки собирали в PBS и центрифугировали при 3500 об./мин. в течение 5 мин. при 4°C. Клеточные осадки лизировали в буфере для лизиса (Enzo Life Science), содержащем ингибиторы протеаз, подвергали обработке ультразвуком и осветляли путем центрифугирования при 13000 об./мин. в течение 10 мин. при 4°C. Концентрацию белка измеряли с помощью BCA-анализа. Образцы, содержащие примерно 10-20 мкг белка, разводили в гликопротеин-денатурирующем буфере (New England Biolabs) и подвергали денатурации путем инкубации в течение 10 мин. при 100°C. Образцы инкубировали с EndoH (New England Biolabs) или без него в течение 1 ч. при 37ºC, добавляли буфер Лэммли для образцов и подвергали образцы SDS-PAGE с применением готового геля TGX (Bio-Rad). После переноса на нитроцеллюлозную мембрану (Trans-Blot Turbo, Bio-Rad), мембраны в течение непродолжительного времени окрашивали с помощью понсо S, а затем блокировали в 5% обезжиренном молоке в PBS + 0,1% tween (PBS-T). Инкубацию с первичными антителами (в разведении от 1:500 до 1:2000) осуществляли в накрытых парафильмом стеклянных чашках в течение ночи при 4°C. После промывки в PBS-T мембраны инкубировали 1 ч. с вторичным антителом, разведенным 1:10000 в 5% обезжиренном молоке в PBS-T. Мембраны для блоттинга проявляли с применением субстрата SuperSignal™ West Dura Extended Duration Substrate (Life technologies) и визуализировали с применением системы G-box (Syngene).

Результаты

Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках в случае GD I типа

Сообщалось, что аримокломол обеспечивает повышение уровней экспрессии белков теплового шока, например, белка теплового шока 70 (HSP70) (Kieran et al., Nature Medicine, 2004). Для оценки эффекта аримокломола в отношении уровня экспрессии ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках, фибробласты человека от пациентов с GD TI обрабатывали 0, 25, 100, 200 или 400 мкМ аримокломола (N370S/V394L) или 0, 100, 200 или 400 мкМ аримокломола (N370S/1-BP ins 84G) в течение 5 дней. Затем клетки собирали для проведения вестерн-блот-анализа.

Из полученных авторами настоящего изобретения результатов видно, что аримокломол дозозависимым образом повышает уровни экспрессии BiP в клеточных линиях фибробластов человека от индивидуумов с болезнью Гоше I типа. Это свидетельствует о том, что аримокломол посредством повышения уровня экспрессии BiP может обеспечивать усиленный фолдинг остающегося в ER мутантного GBA.

Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества фермента GBA в первичных клетках в случае GD I типа

Эффект аримокломола в отношении уровней белка GBA также оценивали в клеточной линии фибробластов человека от пациента с болезнью Гоше I типа, имеющего генотип N370S/1-BP ins 84G. В линии с повышенным уровнем экспрессии ER-шаперона BiP дозозависимое повышение общего уровня GBA наблюдали в обработанных аримокломолом клетках от такого индивидуума. Более того, увеличение EndoH-устойчивой фракции свидетельствует о том, что аримокломол обеспечивает повышение количества процессированного/зрелого GBA в клетке.

Пример 8. Дозозависимый ответ в случае болезни Гоше II типа – индукция BiP и GBA.

Материалы и способы

Клеточная культура

Клеточные линии первичных фибробластов человека культивировали в стандартных условиях культивирования клеток (37ºC и 5% CO₂) в DMEM, дополненной заменимыми аминокислотами (NEAA), 1% Pen-Strep и 12% FCS. Их пересевали 1-2 раза/неделю с индексом разведения 1:2 или 1:3. Клетки применяли для экспериментов примерно на 16-26 пассаже, при условии, что признаков репликативного старения не наблюдалось (визуальное наблюдение).

Клеточная линия	Мутация GBA	Возраст на момент отбора образцов	Тип GD
GM01260	L444P/P415R	11M	II
GM02627	G325R/C342G	3Y	II

Вестерн-блоттинг

Клетки собирали в PBS и центрифугировали при 3500 об./мин. в течение 5 мин. при 4°C. Клеточные осадки лизировали в буфере для лизиса (Enzo Life Science), содержащем ингибиторы протеаз, подвергали обработке ультразвуком и осветляли путем центрифугирования при 13000 об./мин. в течение 10 мин. при 4°C. Концентрацию белка измеряли с помощью BCA-анализа. Образцы, содержащие примерно 10-20 мкг белка, разводили в гликопротеин-денатурирующем буфере (New England Biolabs) и подвергали денатурации путем инкубации в течение 10 мин. при 100°C. Образцы инкубировали с EndoH (New England Biolabs) или без него в течение 1 ч. при 37ºC, добавляли буфер Лэммли для образцов и подвергали образцы SDS-PAGE с применением готового геля TGX (Bio-Rad). После переноса на нитроцеллюлозную мембрану (Trans-Blot Turbo, Bio-Rad), мембраны в течение непродолжительного времени окрашивали с помощью понсо S, а затем блокировали в 5% обезжиренном молоке в PBS + 0,1% tween (PBS-T). Инкубацию с первичными антителами (в разведении от 1:500 до 1:2000) осуществляли в накрытых парафильмом стеклянных чашках в течение ночи при 4°C. После промывки в PBS-T мембраны инкубировали 1 ч. с вторичным антителом, разведенным 1:10000 в 5% обезжиренном молоке в PBS-T. Мембраны для блоттинга проявляли с применением субстрата SuperSignal™ West Dura Extended Duration Substrate (Life technologies) и визуализировали с применением системы G-box (Syngene).

Результаты

Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках в случае GD II типа

Для оценки эффекта аримокломола в отношении уровня экспрессии ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках, фибробласты человека от пациентов с болезнью Гоше II типа обрабатывали указанными концентрациями аримокломола в течение 5 дней. Затем клетки собирали для проведения вестерн-блот-анализа.

Из полученных авторами настоящего изобретения результатов видно, что аримокломол дозозависимым образом повышает уровни экспрессии BiP в клеточных линиях фибробластов человека от индивидуумов с GD TII, имеющих генотипы L444P/P415R или G325R/C342G. Это свидетельствует о том, что аримокломол посредством повышения уровня экспрессии BiP может обеспечивать усиленный фолдинг остающегося в ER мутантного GBA в клетках в случае GD TII.

Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества фермента GBA в первичных клетках в случае GD TII

Эффект аримокломола в отношении уровней и созревания белка GBA также оценивали в первичных клеточных линиях в случае GD TII. В линии с повышенным уровнем экспрессии ER-шаперона BiP дозозависимое повышение общего уровня GBA наблюдали в обработанных аримокломолом клетках от таких индивидуумов. Более того, увеличение EndoH-устойчивой фракции свидетельствует о том, что аримокломол обеспечивает повышение количества зрелого (после транспорта из ER) GBA в клетках в случае GD II типа.

Пример 9. Дозозависимый ответ в случае болезни Гоше III типа – индукция BiP и GBA.

Материалы и способы

Клеточная культура

Клетки, представляющие собой первичные фибробласты человека, культивировали в стандартных условиях культивирования клеток (37ºC и 5% CO₂) в DMEM, дополненной заменимыми аминокислотами (NEAA), 1% Pen-Strep и 12% FCS. Их пересевали 1-2 раза/неделю с индексом разведения 1:2 или 1:3. Клетки применяли для экспериментов примерно на 16-26 пассаже, при условии, что признаков репликативного старения не наблюдалось (визуальное наблюдение).

Клеточная линия	Мутация GBA	Возраст на момент отбора образцов	Тип GD
GM10915	L444P/L444P	7Y	III

Вестерн-блоттинг

Клетки собирали в PBS и центрифугировали при 3500 об./мин. в течение 5 мин. при 4°C. Клеточные осадки лизировали в буфере для лизиса (Enzo Life Science), содержащем ингибиторы протеаз, подвергали обработке ультразвуком и осветляли путем центрифугирования при 13000 об./мин. в течение 10 мин. при 4°C. Концентрацию белка измеряли с помощью BCA-анализа. Образцы, содержащие примерно 10-20 мкг белка, разводили в гликопротеин-денатурирующем буфере (New England Biolabs) и подвергали денатурации путем инкубации в течение 10 мин. при 100°C. Образцы инкубировали с EndoH (New England Biolabs) или без него в течение 1 ч. при 37ºC, добавляли буфер Лэммли для образцов и подвергали образцы SDS-PAGE с применением готового геля TGX (Bio-Rad). После переноса на нитроцеллюлозную мембрану (Trans-Blot Turbo, Bio-Rad), мембраны в течение непродолжительного времени окрашивали с помощью понсо S, а затем блокировали в 5% обезжиренном молоке в PBS + 0,1% tween (PBS-T). Инкубацию с первичными антителами (в разведении от 1:500 до 1:2000) осуществляли в накрытых парафильмом стеклянных чашках в течение ночи при 4°C. После промывки в PBS-T мембраны инкубировали 1 ч. с вторичным антителом, разведенным 1:10000 в 5% обезжиренном молоке в PBS-T. Мембраны для блоттинга проявляли с применением субстрата SuperSignal™ West Dura Extended Duration Substrate (Life technologies) и визуализировали с применением системы G-box (Syngene).

Результаты

Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках в случае GD TIII

Для оценки эффекта аримокломола в отношении уровня экспрессии ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках, фибробласты человека от индивидуума с болезнью Гоше III типа (L444P/L444P) обрабатывали указанными концентрациями аримокломола в течение 5 дней. Затем клетки собирали для проведения вестерн-блот-анализа.

Из полученных авторами настоящего изобретения результатов видно, что аримокломол дозозависимым образом повышает уровни экспрессии BiP в этой клеточной линии, гомозиготной по L444P. Это свидетельствует о том, что аримокломол посредством повышения уровня экспрессии BiP может обеспечивать усиленный фолдинг остающегося в ER мутантного GBA.

Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества фермента GBA в первичных клетках в случае GD TIII

Эффект аримокломола в отношении уровней и созревания белка GBA также оценивали в линии первичных клеток L444P/L444P GD TIII. В линии с повышенным уровнем экспрессии ER-шаперона BiP дозозависимое повышение общего уровня GBA наблюдали в клетках, обработанных аримокломолом. Более того, увеличение EndoH-устойчивой фракции свидетельствует о том, что аримокломол обеспечивает повышение количества зрелого GBA в клетках в случае GD TIII.

В совокупности эти результаты показывают, что активность GBA повышается благодаря аримокломолу, по-видимому, за счет того, что большее количество зрелого GBA достигает лизосом.

Пример 10. Дозозависимый ответ в отношении экспрессии BiP при GBA-дефицитной болезни Паркинсона.

Материалы и способы

Клеточная культура

Клетки, представляющие собой первичные фибробласты человека, культивировали в стандартных условиях культивирования клеток (37ºC и 5% CO₂) в DMEM, дополненной заменимыми аминокислотами (NEAA), 1% Pen-Strep и 12% FCS. Их пересевали 1-2 раза/неделю с индексом разведения 1:2 или 1:3. Клетки применяли для экспериментов примерно на 16-26 пассаже, при условии, что признаков репликативного старения не наблюдалось (визуальное наблюдение).

Клеточная линия	Мутация GBA	Возраст на момент отбора образцов
ND34263	N370S/N370S	65Y	PD-GBA

Вестерн-блоттинг

Клетки собирали в PBS и центрифугировали при 3500 об./мин. в течение 5 мин. при 4°C. Клеточные осадки лизировали в буфере для лизиса (Enzo Life Science), содержащем ингибиторы протеаз, подвергали обработке ультразвуком и осветляли путем центрифугирования при 13000 об./мин. в течение 10 мин. при 4°C. Концентрацию белка измеряли с помощью BCA-анализа и подвергали образцы SDS-PAGE с применением готового геля TGX (Bio-Rad). После переноса на нитроцеллюлозную мембрану (Trans-Blot Turbo, Bio-Rad), мембраны в течение непродолжительного времени окрашивали с помощью понсо S, а затем блокировали в 5% обезжиренном молоке в PBS + 0,1% tween (PBS-T). Инкубацию с первичными антителами (в разведении от 1:500 до 1:2000) осуществляли в накрытых парафильмом стеклянных чашках в течение ночи при 4°C. После промывки в PBS-T мембраны инкубировали 1 ч. с вторичным антителом, разведенным 1:10000 в 5% обезжиренном молоке в PBS-T. Мембраны для блоттинга проявляли с применением субстрата SuperSignal™ West Dura Extended Duration Substrate (Life technologies) и визуализировали с применением системы G-box (Syngene).

Результаты

Индуцированное аримокломолом дозозависимое повышение количества ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках в случае PD-GBA

Для оценки эффекта аримокломола в отношении уровня экспрессии ER Hsp70 (BiP) в первичных клетках от индивидуума с GBA-дефицитной болезнью Паркинсона (PD-GBA), фибробласты человека от индивидуума с PD-GBA (N370S/N370S) обрабатывали указанными концентрациями аримокломола в течение 5 дней. Затем клетки собирали для проведения вестерн-блот-анализа.

Из полученных авторами настоящего изобретения результатов видно, что аримокломол дозозависимым образом повышает уровни экспрессии BiP в первичных клетках от индивидуума с PD-GBA (N370S/N370S). Это свидетельствует о том, что аримокломол посредством повышения уровня экспрессии BiP обеспечивает усиленный фолдинг остающегося в ER мутантного GBA.

Пример 11. Эффект аримокломола в отношении активности GBA в первичных нейроноподобных клетках от индивидуумов с GDTI и GDTIII.

Материалы и способы

Клеточная культура

Мультипотентные стволовые клетки взрослого человека (MASC) выделяли у индивидуумов с GD из биоптатов кожи. Генотип MASC представлен ниже. Клетки индуцировали к дифференцировке по нейрональному пути, как описано в Bergamin et al. Orphanet Journal of Rare Diseases 2013. Поверхностный иммунофенотип стволовых клеток анализировали с помощью FACS. Экспрессию маркеров стволовых клеток и нейрональных маркеров оценивали по иммунофлуоресценции.

Клеточная линия MASC	Мутация GBA	Тип GD
1	N370S/Y133*	I
2	F213I/L444P	III
3	L444P/L444P	III
4	IVS2+1G>A/N188S	III

Звездочкой обозначено место сдвига рамки считывания и образующийся в результате этого новый стоп-кодон

MASC индуцировали к дифференцировке по нейрональной линии в день 0. В день 1 клетки обрабатывали имитирующим контролем (PBS) или 400 мкМ аримокломола. Обработку продолжали на протяжении дифференцировки в течение в общей сложности 9 дней. В день 9 дифференцировку оценивали по иммунофлуоресценции нейрональных маркеров. Активность GBA измеряли с применением флуорогенного субстрата 4-MUG.

Результаты

Аримокломол не влияет на дифференцировку по нейрональному пути полученных из кожи мультипотентных стволовых клеток взрослого человека от индивидуумов с GD TI и GDTIII

Для оценки эффекта аримокломола в отношении дифференцировки по нейрональному пути MASC от индивидуумов с GD индуцировали к дифференцировке с обработкой при этом имитирующим контролем или аримокломолом. Из полученных авторами настоящего изобретения результатов видно, что экспрессия нейрональных маркеров бета-тубулина 3 и NeuN не была затронута действием аримокломола.

Индуцированное аримокломолом повышение активности GBA в нейронах от индивидуумов с GD TI и GDTIII

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что аримокломол обеспечивает повышение активности мутантного GBA в нейронах от индивидуума с GD I типа (N370S/Y133*) и у трех индивидуумов с GD III типа (F213I/L444P, L444P/L444P или IVS2+1G>A/N188S).

В совокупности полученные авторами настоящего изобретения результаты демонстрируют, что аримокломол обеспечивает повышение активности мутантного GBA в нейронах от индивидуумов с GD TI и GD TIII без воздействия на дифференцировку нейронов.

Список литературы

Kieran, D., Kalmar, B., Dick, J. R. T., Riddoch-Contreras, J., Burnstock, G., & Greensmith, L. (2004). Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nature Medicine, 10(4), 402–405

Mu, T., Ong, D. S. T., Wang, Y., Balch, W. E., Yates, J. R., Segatori, L., & Kelly, J. W. (2008). Chemical and biological approaches synergize to ameliorate protein-folding diseases. Cell, 134(5), 769–81

Bergamin, N., Dardis, A., Beltrami, A., Cesselli, D., Rigo, S., Zampieri, S., … Beltrami, C. A. (2013). A human neuronal model of Niemann Pick C disease developed from stem cells isolated from patient’s skin. Orphanet Journal of Rare Diseases, 8(1), 34.

Witte, M. D., Kallemeijn, W. W., Aten, J., Li, K.-Y., Strijland, A., Donker-Koopman, W. E., Aerts, J. M. F. G. (2010). Ultrasensitive in situ visualization of active глюкоцереброзидаза molecules. Nature Chemical Biology, 6(12), 907–13.

1. Применение активного фармацевтического ингредиента, выбранного из (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида и его кислотно-аддитивных солей, для лечения ассоциированной с глюкоцереброзидазой (GBA) болезни Паркинсона (PD) или GBA-ассоциированного паркинсонизма, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона или паркинсонизм ассоциированы с пониженными активностью и/или уровнями фермента GBA.

2. Применение по п.1 для лечения GBA-ассоциированного паркинсонизма.

3. Применение по п. 1 для лечения GBA-ассоциированной болезни Паркинсона.

4. Применение по п. 1, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона или паркинсонизм ассоциирована с пониженными уровнями фермента GBA.

5. Применение по п. 1, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона или паркинсонизм ассоциирована с пониженной активностью фермента GBA.

6. Применение по п. 1, где указанный ген GBA является геном дикого типа и снижение активности и/или уровней GBA обусловлено супрессией активности белка или репрессией транскрипции или трансляции гена/белка, или является идиопатическим.

7. Применение по п. 1, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона или паркинсонизм ассоциирована с одной или более мутациями гена GBA индивидуума.

8. Применение по п. 1, где индивидуум с GBA-ассоциированной болезнью Паркинсона или паркинсонизмом остается клинически здоровым в отношении болезни Гоше.

9. Применение по п. 1, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона или паркинсонизм ассоциирована с одной или более мутациями гена GBA в гетерозиготном состоянии.

10. Применение по п. 1, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона или паркинсонизм ассоциирована с одной или более мутациями гена GBA в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии.

11. Применение по любому из пп. 9-10, где указанные одна или более мутаций гена GBA индивидуума являются «мягкими» (ассоциированы с GD I типа).

12. Применение по любому из пп. 9-10, где указанные одна или более мутаций гена GBA индивидуума являются «тяжелыми» (ассоциированы с GD II и III типов).

13. Применение по любому из пп.9-10, где указанная мутация гена GBA выбрана из группы, состоящей из L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R, P415R, Y133*, F213I, N188S и IVS2+1G>A/N188S.

14. Применение по любому из пп. 9-10, где указанная мутация гена GBA представляет собой L444P.

15. Применение по любому из пп. 9-10, где указанная мутация гена GBA представляет собой E326K.

16. Применение по любому из пп. 9-10, где указанная мутация гена GBA представляет собой N370S.

17. Применение по п. 1, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона или паркинсонизм наблюдается у гетерозиготы по L444P, A456P, V460V.

18. Применение по п. 1, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона или паркинсонизм наблюдается у носителя мутации GBA, такого как облигатный носитель, такого как носитель, который является клинически здоровым в отношении болезни Гоше.

19. Применение по п. 1, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона или паркинсонизм наблюдается у клинически здорового родителя или сиблинга пациента с болезнью Гоше.

20. Применение по п. 3, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона ассоциирована с одной или более мутациями гена GBA, выбранными из группы, состоящей из L444P, D409H, D409V, E235A, E340A, E326K, N370S, N370S/1-BP ins 84G, V394L, A456P, V460V, C342G, G325R и P415R.

21. Применение по п. 3, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона ассоциирована с мутацией гена GBA N370S/N370S в гетерозиготном или гомозиготном состоянии.

22. Применение по п. 3, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона ассоциирована с генотипом по GBA, являющимся генетическим фактором высокого риска развития болезни Паркинсона.

23. Применение по п. 3, где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона ассоциирована с идиопатически пониженными активностью и/или уровнями фермента GBA без сопутствующих идентифицированных мутаций гена GBA.

24. Применение по п. 1, где указанный активный фармацевтический ингредиент выбран из группы, состоящей из

(+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид цитрата; и

(+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид малеата.

25. Применение по п.1, где указанный активный фармацевтический ингредиент представляет собой (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид цитрат.

26. Применение по п.1, где указанный активный фармацевтический ингредиент повышает активность и/или уровни GBA по меньшей мере на 10%.

27. Применение по п.1, где указанный активный фармацевтический ингредиент повышает активность и/или уровни GBA по меньшей мере на 50% от гипотетических активности и/или уровней в случае дикого типа.

28. Применение по п. 1, где указанное лечение является профилактическим, терапевтическим или обеспечивающим облегчение симптомов.

29. Применение активного фармацевтического ингредиента, выбранного из (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида и его кислотно-аддитивных солей, для изготовления лекарственного средства для лечения ассоциированной с глюкоцереброзидазой (GBA) болезни Паркинсона (PD) или GBA-ассоциированного паркинсонизма; где указанная GBA-ассоциированная болезнь Паркинсона или паркинсонизм ассоциированы с пониженными активностью и/или уровнями фермента GBA.

30. Применение активного фармацевтического ингредиента, выбранного из (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорида и его кислотно-аддитивных солей, для снижения риска развития у индивидуума GBA-ассоциированной болезни Паркинсона (PD) или GBA-ассоциированного паркинсонизма, где у указанного индивидуума наблюдается пониженный уровень GBA и/или пониженная активность GBA.

31. Применение по п. 29 или 30, где указанный активный фармацевтический ингредиент представляет собой (+)-R-N-[2-гидрокси-3-(1-пиперидинил)-пропокси]-пиридин-1-оксид-3-карбоксимидоил хлорид цитрат.

32. Применение по п. 30, где у указанного индивидуума с пониженными уровнем и/или активностью GBA наблюдается одна или более мутаций гена GBA, таких как мутация гена GBA в гетерозиготном состоянии или таких как мутация гена GBA в гомозиготном состоянии.

33. Применение по п. 30 для снижения риска развития GBA-ассоциированной болезни Паркинсона у индивидуума.