Способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе трипсина, гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами

Настоящее изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины, а именно к способу получения иммобилизованного ферментного препарата на основе трипсина, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты, включающему растворение трипсина в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг трипсина на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1.5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем проводят иммобилизацию трипсина путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана 50-100 кДа (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля. Настоящее изобретение обеспечивает разработку способа получения иммобилизованного жидкого или гелеобразного ферментного препарата на основе трипсина, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) или высокомолекулярной (800 кДа), благодаря чему растворы трипсина можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а фермент при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи, при этом внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом по сравнению с не модифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение трипсина, поддерживая его необходимую концентрацию в течение длительного времени. 3 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу стабилизации трипсина растворами гиалуроновой кислоты и графт-сополимерами с полисахаридной основной цепью из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с боковыми цепями из гомополимеров N-винилимидазола (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата (ДМАЭМА). Изобретение может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии.

Трипсин (КФ 3.4.21.4) - фермент класса гидролаз, расщепляющий пептиды и белки; обладает также эстеразной активностью. Молекула бычьего трипсина состоит из 223 аминокислотных остатков, образующих одну полипептидную цепь, и содержит 6 дисульфидных связей. Активный центр трипсина состоит из серина и гистидина. Трипсин используют для изготовления лекарств. Препараты трипсина обладают противовоспалительным и противоотечным действием (при внутривенном и внутримышечном введении); способны избирательно расщеплять ткани, подвергшиеся некрозу. В медицине трипсин применяют для лечения ран, ожогов, тромбозов, часто в сочетании с другими ферментами и антибиотиками.

Трипсин входит в состав композиции для обработки ран, нуждающихся в санации раневой поверхности [Патент RU 2619351 С1, МПК A61K 38/48, A61K 9/10, A61K 47/30, A61K 47/44, А61Р 17/02, С12Ν 9/00, опубл. 15.05.2017, Бюл. №14], используется для получения живой клеточной вакцины для профилактики рака молочных желез [Патент RU 2407789 С2, МКП C12N 5/00, А61Р 35/00, опубл. 27.12.2010, Бюл. №36]. Препараты трипсина применяются для лечения патологических процессов, сопровождающихся образованием гнойно-некротических масс, накоплением густых вязких экссудатов [Патент RU 2055600 С1, МКП 6A61L 15/44, A61K 31/71, 38/43, опубл. 10.03.1996]. Трипсин входит в состав мази для лечения послеоперационных ран, а также застаревших, обильно обсемененных патогенной микрофлорой ран, трудно поддающихся или неподдающихся заживлению, переходящих в трофические [Патент RU 2397752 С2, МПК A61K 9/06, A61K 33/38, A61K 38/43, A61K 47/30, А61Р 17/02, опубл. 27.08.2010, Бюл. №24]. Фармацевтическая композиция на основе трипсина используется для удаления мертвой или шелушащейся кожи со здоровой кожи [Патент RU 2264824 С2, МПК A61K 38/48, опубл. 27.11.2005, Бюл. №33].

Гиалуроновая кислота состоит из повторяющихся полианионных дисахаридных звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина, соединенных между собой гликозидными связями. [Fujioka-Kobayashi Μ., Mueller Α., Lussi Α., Sculean Α., Schmidlin P.R. et al. In vitro effects of hyaluronic acid on human periodontal ligament cells. - BMC Oral Health. - 2017; 17(1): 44.].

На сегодняшний день существуют различные косметические, фармацевтические препараты и композиции на основе гиалуроновой кислоты. В офтальмологии для лечения травматических повреждений, химических ожогов и трофических нарушений роговицы, конъюнктивы могут быть использованы глазные капли, содержащие в качестве биологически активного вещества высокомолекулярную гиалуроновую кислоту [Патент RU 2163123 С2, МПК A61K 31/728, A61F 9/00, опубл. 20.02.2001]. Гиалуроновая кислота используется для увеличения резерва стволовых клеток в организме [Патент RU 2347583 С1, МПК A61K 38/47, А61Р 43/00, опубл. 27.02.2009, Бюл. №6]. Известен биорассасывающийся наполнитель, образованный гиалуроновой кислотой и/или ее производными, используемый в качестве наполнителя мягких тканей в эстетической хирургии и в лечебно-косметических средствах для коррекции дефектов кожи [Патент RU 2394552 С2, МПК A61K 8/14, A61K 8/73, A61K 9/127, A61Q 19/08, А61Р 19/02, опубл. 20.07.2010, Бюл. №20]. Низкомолекулярная гиалуроновая кислота входит в состав средства для профилактики и/или лечения аллергического ринита, конъюнктивита, атопического дерматита и астмы [Патент RU 2519781 С2, МПК С07Н 15/04, A61K 31/728, А61Р 37/08, А61Р 11/02, А61Р 11/06, А61Р 17/00, А61Р 27/14, опубл. 20.06.2014, Бюл. №17], косметической композиции для ухода за волосами и кожей головы, обладающей высокой эффективностью против выпадения волос, устраняющей причины алопеции, себореи, обеспечивающей усиление роста волос [Патент RU 2671511 С1, МПК A61K 8/03, A61Q 19/10, A61K 8/04, A61K 8/64, A61K 8/67, A61K 8/73, A61K 8/97, A61K 8/36, A61K 8/44, A61Q 5/00, A61Q 19/08, опубл. 01.11.2018, Бюл. №31]. Гиалуроновая кислота используется для увлажнения и заживления кожи головы, облегчает связывание с водой и влагоудержание, защиту кожи от неблагоприятного воздействия окружающей среды, эффективное восстановление, тонизирование, эпителизацию, регенерацию, уменьшение воспалений, болеутоляющее, противовоспалительное, омолаживающее, согревающее действие, стабильность готового продукта, улучшение потребительских свойств [Патент RU 2660350 С1, МПК A61K 8/67, A61K 8/73, A61K 8/97, A61Q 19/08, опубл. 05.07.2018, Бюл. №19]. Гиалуроновая кислота является одним из компонентов средства биологического омоложения кожи, обеспечивает повышение проникающей способности активных компонентов и усиление выраженного омолаживающего действия, а именно улучшение показателей влагометрии, эластометрии и профилометрии [Патент RU 2640188 С1, МПК A61K 8/14, A61K 8/63, A61K 8/64, A61K 8/73, A61Q 19/08, опубл. 26.12.2017, Бюл. №36].

Графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы или хитозана с боковыми цепями из N-винилимидазола или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата благодаря своей низкой токсичности, биосовместимости и биодеградируемости находят применение в области биомедицины. Известно, что эти сополимеры могут образовывать нековалентно связанные коньюгаты с противоопухолевым препаратом «Паклитаксел» и позволяют обеспечить его контролируемое высвобождение в течение 144 часов. Отдельно стоит отметить, что такие полимеры характеризуется высокой эффективностью загрузки препарата за счет наличия боковых звеньев с высокой комплексообразующей способностью [V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya et al. Graft copolymers of carboxymethyl cellulose with N-vinylimidazole: synthesis and application for drug delivery. 2019. Polymer Bulletin. Vol. 76. P. 4929-949; V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, M.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and N,N-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z].

На данный момент нет сведений о комплексах трипсина с гиалуроновой кислотой и полисахаридами, модифицированными виниловыми мономерами, такими как графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА).

Известен способ иммобилизации трипсина [Патент RU 2437936 С1, МПК C12N 11/18, опубл. 27.12.2011, Бюл. №36]. Данный способ иммобилизации трипсина смешением полимерного носителя, включает использование сополимера винилиденфторида и гексафторпропилена, фторэласта, сополимера винилиденфторида и перфторметилвинилового эфира и сшивающего агента. Количество фермента варьируют от 0.0025 до 0.25 г на 1 г носителя и сшивающего агента - 1.4 бис(2-меркаптобензтиазолилметилен)-пиперазина в количестве 0.01-0.04 г на 1 г носителя. Смешение проводят на вальцах или в смесителе при температуре 37°С.Полученный иммобилизованный фермент обладает высокой протеолитической активностью нативного препарата и диспергирующей активностью, необходимой для получения полноценных клеточных культур.

Недостатком способа является получение ферментного препарата в твердой фазе, не позволяющей проникать молекулам трипсина в глубокие слои кожи.

Запатентован способ стабилизации ферментов - пепсина, химотрипсина, трипсина, панкреатина, папаина и других протеаз, путем добавления в их растворы полисахаридов - гуаровой камеди, ксантановой камеди, камеди бобов рожкового дерева, крахмала, декстрана, пуллулана, альгиновой кислоты, гиалуроновой кислоты, каррагинана, пектина, хитозана и прочих полисахаридов, а также производных целлюлозы: карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, этилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы [JPH034791A].

В отличие от этого способа предложенное нами использование полисахаридов (карбоксиметилцеллюлозы и хитозана), модифицированных виниловыми мономерами (N-винилимидазолом или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом) обеспечивает большее количество связей между полисахаридом и ферментом в ходе иммобилизации, что увеличивает прочность образуемого комплекса и пролонгирует процесс высвобождения фермента в область поврежденных тканей.

Известно, что полимеры на основе поли-β-гликозидов (целлюлозы и ее производных, хитозана, гиалуроновой кислоты и т.д.) склонны к образованию пленок, которые могут защитить кожу от пересыхания или обеспечить дополнительную защиту на поверхности раневого повреждения. Однако способность образовывать конъюгаты у таких полимеров несколько ограничена рядом факторов: поверхностным зарядом, типом функциональной группы и т.д. Поэтому для придания ряда новых свойств целесообразно проводить химическую модификацию природных полисахаридов. Так, например, введение азольных заместителей повышает комплексообразующую способность полисахаридов и снижает поверхностный отрицательный заряд карбоксиметилцеллюлозы [V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya et al. Graft copolymers of carboxymethyl cellulose with N-vinylimidazole: synthesis and application for drug delivery. 2019. Polymer Bulletin. Vol. 76. P. 4929-4949], а введение звеньев Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилата не только снижает поверхностный заряд, но придает водному раствору модифицированного полисахарида стимулочувствительные свойства [V.A. Kuznetsov, Α.V. Sorokin, Μ.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and Ν,Ν-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z].

В качестве прототипа служила топическая противомикробная дерматологическая композиция [Патент RU 2668827 С2, МПК A61K 38/08, A61K 31/728, А61Р 31/00, А61Р 17/00, A61K 31/722, опубл. 02.10.2018, Бюл. №28], предложенная в качестве лекарственного средства в медицине и ветеринарии, включающая комбинацию по меньшей мере одного положительно заряженного противомикробного пептида, соединенного с липидом, и гиалуроновой кислоты со средним молекулярным весом от 100 кДа до 800 кДа или одной из ее солей, причем противомикробный пептид представляет собой гексапептид, соединенный с пальмитиновой кислотой, содержащий дисульфидные мостики.

В отличие от прототипа в качестве действующего вещества мы используем не противомикробный пептид, а фермент трипсин, который кроме антимикробных свойств обладает противовоспалительным и противоотечным действием, способен избирательно расщеплять ткани, подвергшиеся некрозу, применяется для лечения ран, ожогов, пролежней, тромбозов, при парадонтите, периодоните, тромбофлебите, гайморите, заболеваниях дыхательных путей часто в сочетании с другими ферментами и с антибиотиками.

Кроме того, добавление нами в раствор графт-сополимеров карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) позволяет путем включения в полисахаридный гель (один из способов физической иммобилизации ферментов) дополнительно стабилизировать трипсин и обеспечить ему пролонгированное действие.

Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения иммобилизованного жидкого или гелеобразного ферментного препарата на основе трипсина, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) или высокомолекулярной (800 кДа), благодаря чему растворы трипсина можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а фермент при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи, при этом внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом, по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение трипсина, поддерживая его необходимую концентрацию в течение длительного времени. Кроме того, способность модифицированных полисахаридов образовывать устойчивые пленки защищает фермент и обрабатываемый участок кожи от пересыхания, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.

Технический результат достигается тем, что в способе получения иммобилизованного ферментного препарата на основе трипсина, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты, включающем растворение трипсина в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг трипсина на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1.5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем проводят иммобилизацию трипсина путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана 50-100 кДа (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.

Фиг. 1. Диаграмма значений каталитической активности (А) трипсина в присутствии гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы после его хранения при 4°С.

Фиг. 2. Диаграмма значений каталитической активности (А) трипсина в присутствии гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы после его хранения при 25°С.

Фиг. 3. Таблица 1. Вязкость препаратов, содержащих трипсин, гиалуроновую кислоту и полисахариды, модифицированные виниловыми мономерами.

Пример реализации способа.

В качестве объекта исследования был выбран трипсин фирмы «МР biomedicals)), субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich)). В качестве стабилизирующих агентов применяли три вида гиалуроновой кислоты (ООО «Лаборатория Гиалика») с молекулярной массой 300 (НМГК), 500 (СМГК) и 800 (ВМГК) кДа. В качестве матрицы для иммобилизации трипсина применяли графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) с молекулярной массой 50-100 кДа.

Стабилизацию трипсина осуществляли путем растворения его навески массой 10 мг в 2 мл водного раствора гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 300 (НМГК), 500 (СМГК) или 800 (ВМГК) кДа в концентрации 1.5% с последующим перемешиванием при комнатной температуре до полного растворения. Затем к полученной смеси добавляли для иммобилизации трипсина графт-сополимер карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) (при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля (табл. 1).

Содержание белка в иммобилизованных препаратах трипсина определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. -V. 193. - P. 265-275]. Измерение уровня протеолитической активности фермента проводили на субстрате азоказеине [ F. L. The digestive proteases of langostilla (Pleuroncodes planipes, Decapoda): their partial characterization and the effect of feed on their composition // Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry - 1992. - V. 103. - P. 575-578]. К 200 мкл образца добавляли 200 мкл фосфатного буфера (рН 6.5), 800 мкл азоказеина (0.5% в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6.5) и инкубировали 2 часа при 37°С.Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5%), инкубировали 10 минут при минус 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 200 мкл фосфатного буфера и 200 мкл образца, который вносили после инкубации смеси в течение 2 часов при 37°С. За единицу каталитической активности трипсина принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность трипсина рассчитывали по формуле:

ПА=D*l 000/120/200/С,

где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка,

D - оптическая плотность пробы при 410 нм,

С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,

120 - время инкубации в минутах,

200 - объем пробы, в мкл,

1000 - пересчет в мкМ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.

Были проведены исследования стабильности трипсина в растворах гиалуроновой кислоты (300, 500 и 800 кДа) по сравнению с нативным энзимом. Препараты инкубировали при 4 и 25°С в течение 0, 1, 2, 3, 7, 14 и 21 суток с дальнейшим измерением протеолитической активности. Полученные результаты отражены на фиг. 1, 2.

В ходе наших экспериментов было выявлено, что гиалуроновая кислота не ингибирует трипсин. На фиг. 1 представлена диаграмма зависимости каталитической активности энзима от времени его хранения при 4°С. Установлено, что нативный трипсин сохраняет свою активность после 3 суток инкубации при 4°С на 74%. На 7 и 14 день хранения ферментативная способность энзима составляет 55 и 44% соответственно. После 21 дня инкубации трипсин практически полностью инактивирован, его каталитическая активность - 29% от первоначального уровня. Раствор трипсина с низкомолекулярной гиалуроновой кислотой (300 кДа) на 7 сутки хранения проявляет каталитическую способность на 57%, после 2 и 3 недель инкубации она составляет 37-38% от исходного уровня. Трипсин в растворе со среднемолекулярной гиалуроновой кислотой (500 кДа) на 7 сутки хранения активен на 81% от начального уровня. После 14 и 21 суток инкубации при 4°С фермент сохраняет не более 68-69% активности от интактного образца. Трипсин в растворе высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) на 7 и 14 сутки хранения проявляет активность на 52-53%. После 3 недель инкубации энзим сохраняет 43% каталитической способности.

На фиг. 2 изображена диаграмма изменения каталитической активности трипсина после его хранения при 25°С. Выявлено, что свободный фермент на 7 сутки инкубации при температуре 25°С сохраняет 37% активности, а на 14 и 21 сутки инактивируется до 27 и 18%. Раствор трипсина в низкомолекулярной гиалуроновой кислоте (300 кДа) после 7, 14 и 21 суток инкубации при температуре 25°С стабильнее раствора нативного фермента и сохраняет соответственно 80, 52 и 40% от исходной протеолитической способности. Раствор трипсина в среднемолекулярной гиалуроновой кислоте (500 кДа) на 7 сутки теряет 53% каталитической активности по сравнению с неинкубированным препаратом, при повышении срока хранения происходит более значительная инактивация энзима (до 28%). Трипсин в растворе высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) оказался наиболее стабильным из растворов фермента в гиалуроновой кислоте при трехнедельной инкубации и проявлял 46% первоначальной протеолитической способности.

Таким образом, был разработан способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе трипсина, низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) и высокомолекулярной (800 кДа) гиалуроновой кислоты с последующим добавлением графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) для иммобилизации трипсина.

Полученный предложенным способом препарат можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а трипсин при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи. Внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом, по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение трипсина, поддерживая его необходимую концентрацию в течение длительного времени. Кроме того, способность модифицированных полисахаридов образовывать устойчивые пленки защищает фермент и обрабатываемый участок кожи от пересыхания, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.

Способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе трипсина, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты, включающий растворение трипсина в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг трипсина на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1.5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем проводят иммобилизацию трипсина путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана 50-100 кДа (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.