Способ получения культуры, содержащей мегакариоциты, и способ получения тромбоцитов с ее применением

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения культуры, содержащей мегакариоциты или мегакариоцитарные клетки-предшественники, имеющие повышенную способность к продукции тромбоцитов. Также раскрыт способ получения тромбоцитов, а также способ экспансии культуры мегакариоцитами или мегакариоцитарными клетками-предшественниками, имеющими повышенную способность к продукции тромбоцитов. Изобретение также относится к применению лекарственного средства, проявляющего цитотоксичность, для получения культуры, содержащей мегакариоциты или мегакариоцитарные клетки-предшественники, имеющие повышенную производительность тромбоцитов на клетку. Изобретение позволяет эффективно получать мегакариоциты или мегакариоцитарные клетки-предшественники, имеющие повышенную способность к продукции тромбоцитов. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 10 ил., 2 табл.

 

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к способу получения культуры, содержащей мегакариоциты, и способу получения тромбоцитов с ее применением.

Уровень техники

[0002] Для лечения связанных с кровью заболеваний или хирургического лечения необходимо снабжение клетками крови. Среди клеток крови следующие клетки имеют особенно важное значение: тромбоциты, являющиеся клетками, важными для свертывания крови (гемостаз); протромбоциты и мегакариоцитарные клетки, являющиеся клетками, продуцирующими тромбоциты. Существует большой спрос на тромбоциты, в частности, например, при лейкозе, трансплантации костного мозга и противораковой терапии, и, таким образом, существует потребность в стабильном снабжении.

[0003] Плюрипотентные стволовые клетки, например, клетки ES и клетки iPS, используют в качестве источника для искусственного получения клеток крови, таких как тромбоциты. В последние годы, по причине разработки клеток iPS, применимость плюрипотентных стволовых клеток в качестве важного источника в клеточной терапии в регенеративной медицине привлекает все большее внимание. К настоящему моменту, например, Takayama et al. успешно индуцировали дифференцировку мегакариоцитарных клеток и тромбоцитов из клеток ES человека (Takayama N. et al., Blood, 111, pp. 5298-5306, 2008).

Список цитирования

Непатентные документы

[0004] Непатентный документ 1: Takayama N. et al., Blood, 111, pp. 5298-5306, 2008

Сущность изобретения

Техническая проблема

[0005] Цитокины, такие как тромбопоэтин (TPO), могут специфически индуцировать дифференцировку гемопоэтических клеток-предшественников в мегакариоцитарные клетки (Takayama N. et al., Blood (там же)). Однако длительное поддержание фенотипа дифференцировки (CD41a-положительный, CD42a-положительный или CD42b-положительный) мегакариоцитарными клетками, получаемыми общепринятыми способами индукции дифференцировки, является затруднительным.

Решение проблемы

[0006] Авторы настоящего изобретения осуществляли индукцию дифференцировки в мегакариоцитарные клетки в условиях, вызывающих гибель лишь тех клеток, которые не экспрессируются мегакариоцит-специфический поверхностный клеточный маркер, и неожиданно обнаруживали, что получаемые мегакариоцитарные клетки могут стабильно поддерживать свой фенотип дифференцировки на длительной основе, и что эти клетки проявляли очень высокую способность продуцировать тромбоциты на клетку. Настоящее изобретение основано на этом открытии.

[0007] Таким образом, настоящая заявка включает следующие изобретения.

[1] Способ получения культуры мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников, включающий:

стадию культивирования в условиях, вызывающих гибель клеток, не экспрессирующих ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, группы клеток, содержащих мегакариоциты или клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты.

[2] Способ по п.[1], где группу клеток трансформируют с использованием гена резистентности к лекарственному средству, проявляющему цитотоксичность, гена резистентности к лекарственному средству, располагаемому под контролем промотора гена, специфически экспрессируемого мегакариоцитами, и лекарственного средства, добавляемого на стадии культивирования.

[3] Способ по п.[1], где группу клеток трансформируют с использованием гена, вызывающего гибель клеток, не экспрессирующих ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, и этот ген располагают под контролем промотора гена, специфически экспрессируемого клетками, не экспрессирующими ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами.

[4] Способ по любому из пп. [1]-[3], где ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, является геном, кодирующим поверхностный клеточный маркер, специфически экспрессируемый мегакариоцитами.

[5] Способ по п.[4], где поверхностным клеточным маркером, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, является CD41a, CD42a и/или CD42b.

[6] Способ по любому из пп. [1]-[5], где клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты, представляют собой по меньшей мере один тип, выбранный из группы, состоящей из гемопоэтических стволовых клеток, гемопоэтических клеток-предшественников, CD34-положительных клеток и мегакариоцитарных клеток-предшественников.

[7] Способ по любому из пп. [1]-[6], где стадию культивирования осуществляют в отсутствие сыворотки и/или фидерных клеток.

[8] Способ по любому из пп. [1]-[7], где мегакариоциты в культуре, подлежащей получению, сохраняют свой фенотип дифференцировки, и имеют повышенную способность продуцировать тромбоциты.

[9] Способ по любому из пп.[2]-[8], где группу клеток трансформируют с использованием вектора, в котором промотор и ген резистентности к лекарственному средству или летальный ген функционально связаны.

[10] Способ по любому из пп. [2] и [4]-[9], где ген резистентности к лекарственному средству представляет собой по меньшей мере один тип, выбранный из группы, состоящей из гена резистентности к пуромицину, гена резистентности к неомицину, гена резистентности к канамицину, гена резистентности к хлорамфениколу, гена резистентности к эритромицину, гена резистентности к тетрациклину, гена резистентности к гигромицину, гена резистентности к ампициллину, гена резистентности к зеоцину, гена резистентности к бластицидину S и гена резистентности к гистидинолу.

[11] Способ по любому из пп. [3]-[9], где летальный ген представляет собой по меньшей мере один тип, выбранный из группы, состоящей из гена HSV-TK, гена цитохрома C и гена Mule/ARF-BP-1.

[12] Способ по любому из пп. [1]-[11], где стадию культивирования осуществляют в среде для культивирования, содержащей TPO и SCF.

[13] Способ по п.1, где группа клеток содержит клетки, получаемые посредством встраивания c-MYC, BMI1 и BCL-xL в гемопоэтические клетки-предшественники.

[14] Способ получения тромбоцитов с использованием мегакариоцитов, получаемых способом по любому из пп. [1]-[10].

[15] Способ экспансии культуры мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников, включающий:

стадию культивирования в условиях, вызывающих гибель клеток, не экспрессирующих ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, группой клеток, содержащей мегакариоциты или клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты.

[16] Способ по п.[15], где группу клеток трансформируют с использованием гена резистентности к лекарственному средству, проявляющему цитотоксичность, гена резистентности к лекарственному средству, располагаемого под контролем промотора гена, специфически экспрессируемого мегакариоцитами, и лекарственного средства, добавляемого на стадии культивирования.

[17] Способ по п.[15] или [16], где ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, является геном, кодирующим поверхностный клеточный маркер, специфически экспрессируемый мегакариоцитами.

[18] Способ по п.[17], где поверхностный клеточный маркер специфически экспрессируемый мегакариоцитами, является CD41a, CD42a и/или CD42b.

[19] Способ по любому из пп. [15]-[18], где клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты, представляют собой по меньшей мере один тип, выбранный из группы, состоящей из гемопоэтических стволовых клеток, гемопоэтических клеток-предшественников, CD34-положительных клеток и мегакариоцитарных клеток-предшественников.

[20] Способ по любому из пп. [15]-[19], где стадию культивирования осуществляют в отсутствие сыворотки и/или фидерных клеток.

[21] Способ по любому из пп. [15]-[20], где после экспансии культуры мегакариоциты сохраняют свой фенотип дифференцировки и имеют повышенную способность продуцировать тромбоциты.

[22] Способ по любому из пп. [15]-[21], где группу клеток трансформируют с использованием вектора, в котором промотор и ген резистентности к лекарственному средству или летальный ген функционально связаны.

[23] Способ по любому из пп. [15]-[22], где ген резистентности к лекарственному средству представляет собой по меньшей мере один тип, выбранный из группы, состоящей из гена резистентности к пуромицину, гена резистентности к неомицину, гена резистентности к канамицину, гена резистентности к хлорамфениколу, гена резистентности к эритромицину, гена резистентности к тетрациклину, гена резистентности к гигромицину, гена резистентности к ампициллину, гена резистентности к зеоцину, гена резистентности к бластицидину S и гена резистентности к гистидинолу.

[24] Способ по любому из пп. [15]-[23], где стадию культивирования осуществляют в среде для культивирования, содержащей TPO и SCF.

[25] Способ по любому из пп. [15]-[24], где группа клеток содержит клетки, получаемые посредством встраивания c-MYC, BMI1 и BCL-xL в гемопоэтические клетки-предшественники.

[26] Культура, полученная посредством культивирования в условиях, вызывающих гибель клеток, не экспрессирующих ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, из группы клеток, содержащих мегакариоциты или клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты.

Полезные эффекты изобретения

[0008] Способом получения по настоящему изобретению получают мегакариоцитарные клетки, имеющие способность длительно сохранять фенотип дифференцировки. При элиминации клеток, которые могли бы дифференцироваться в другие линии клеток при получении, не только повышается количество получаемых тромбоцитов на популяцию клеток, но мегакариоциты, получаемые с помощью настоящего изобретения, являются очень неожиданными в том смысле, что они имеют повышенную производительность тромбоцитов на клетку. С этой точки зрения, можно сказать, что способ получения по настоящему изобретению является очень полезным относительно существующего уровня техники.

[0009] Кроме того, способ получения по настоящему изобретению также может приводить к улучшению эффективности получения линий мегакариоцитарных клеток, имеющих способность к самовоспроизведению. Кроме того, способ получения по настоящему изобретению также может приводить к крупномасштабной пролиферации линии мегакариоцитарных клеток без какого-либо использования сыворотки или фидерных клеток, и таким образом, также является полезным в том, что предотвращает появление проблемы иммуногенности, когда полученные тромбоциты используют в клинических условиях. Суспензионная культура, например, во флаконах и т.д., возможна, когда культивирование клеток или получение тромбоцитов можно осуществлять без использования фидерных клеток и, в результате, можно ограничивать производственные затраты, а также становится возможным массовое получение тромбоцитов.

Краткое описание чертежей

[0010] На фиг. 1 показан лентивирусный вектор с промотором CD41a и геном резистентности к пуромицину.

На фиг. 2 представлено подтверждение фенотипа дифференцировки мегакариоцитарных клеток посредством проточной цитометрии после встраивания промотора CD41a и гена резистентности к пуромицину.

На фиг. 3 представлено подтверждение CD41a-положительного фенотипа мегакариоцитарных клеток, полученных в присутствие фидерных клеток, посредством проточной цитометрии.

На фиг. 4 представлено изменение количества клеток при увеличенном времени культивирования после встраивания промотора CD41a и гена резистентности к пуромицину.

На фиг. 5 представлено подтверждение CD41a-положительного фенотипа мегакариоцитарных клеток, полученных в отсутствие фидерных клеток, посредством проточной цитометрии.

На фиг. 6A представлено сравнение, CD41a-положительного фенотипа мегакариоцитарных клеток, полученных в присутствие и в отсутствие фидерных клеток, посредством проточной цитометрии.

На фиг. 6B представлено сравнение изменения количества клеток с увеличенным временем культивирования после встраивания промотора CD41a и гена резистентности к пуромицину в присутствие фидерных клеток по сравнению с отсутствием фидерных клеток.

На фиг. 7 представлено изменение количества клеток с увеличенным временем культивирования во встряхиваемой культуре (флакон).

На фиг. 8 представлено изменение количества клеток с увеличенным временем культивирования во встряхиваемой культуре (мешок).

На фиг. 9 представлено количество полученных тромбоцитов в случае мегакариоцитарных клеток, полученных в присутствие фидерных клеток.

На фиг. 10 представлено количество полученных тромбоцитов в случае мегакариоцитарных клеток, полученных в отсутствие фидерных клеток.

Описание вариантов осуществления

[0011] (Способ получения мегакариоцитарных клеток)

Способ получения мегакариоцитов по настоящему изобретению включает стадию культивирования в условиях, вызывающих гибель клеток, не экспрессирующих ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, группой клеток, содержащей мегакариоциты или клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты. Примером гена, специфически экспрессируемого мегакариоцитами, могут являться поверхностные клеточные маркеры, например, CD41a, CD42a, CD42b, CD9, CD61, CD62P и GATA1, NF-E2, β-тубулин, тромбоцитарный фактор 4 и т.д., являющиеся генами, специфически экспрессируемыми мегакариоцитарными клетками. Условия, летальные для клеток, не экспрессирующих ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитарными клетками, должны являться условиями, вызывающими летальность исключительно в отношении клеток, иных, чем мегакариоциты или клетки, не дифференцирующиеся в мегакариоциты, в то же время не вызывающими летальность в отношении клеток, дифференцирующихся в мегакариоциты, мегакариоцитарные клетки-предшественники, мегакариоцитарные клетки, зрелые мегакариоцитарные клетки и т.д., но эти условия конкретно не ограничены иным образом. Можно предусматривать, например, следующее: систему, в которой резистентность к лекарственному средству придается только мегакариоцитарным клеткам, мегакариоцитарным клеткам-предшественникам и т.д. с последующим уничтожением нежелательных клеток соответствующим лекарственным средством; или систему, в которой летальный ген экспрессируется только в нежелательных клетках.

[0012] Таким образом, в первом варианте осуществления настоящего изобретения, используя систему культивирования, в которой ген резистентности к лекарственному средству регулируется промотором, специфически активируемым в мегакариоцитарных клетках, только клетки, не экспрессирующие ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, можно уничтожать посредством культивирования в присутствие соответствующего лекарственного средства из группы клеток, содержащих мегакариоцитарные клетки или клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоцитарные клетки. Такую систему культивирования можно конструировать, например, помещая ген резистентности к лекарственному средству под контролем промотора для гена, специфически экспрессируемого мегакариоцитарными клетками. В результате, резистентность к лекарственному средству можно придавать только клетками, экспрессирующими мегакариоцит-специфические поверхностные клеточные маркеры. В предпочтительном варианте осуществления резистентность к лекарственному средству придают посредством встраивания вектора, в котором промотор функционально связан с геном резистентности к лекарственному средству, расположенном ниже его, в клетки перед культивированием.

[0013] Промоторная область гена интегрина αIIBβ3 (CD41a) является примером промотора, специфически активируемого в мегакариоцитарных клетках (Wilcox D.A., et al., Blood (2000), Fang J., et al., Blood (2005)). Помимо этого, в настоящем изобретении также можно использовать следующее: промоторы для гена CD42a, гена CD42b и т.д., являющихся поверхностными клеточными маркерами, специфически экспрессируемыми мегакариоцитарными клетками, или промоторы генов, кодирующих GATA1, NF-E2, β-тубулин, тромбоцитарный фактор 4 и т.д., являющихся генами, специфически экспрессируемыми мегакариоцитарными клетками.

[0014] Примером гена резистентности к лекарственному средству может являться ген резистентности к пуромицину, ген резистентности к неомицину, ген резистентности к канамицину, ген резистентности к хлорамфениколу, ген резистентности к эритромицину, ген резистентности к тетрациклину, ген резистентности к гигромицину, ген резистентности к ампициллину, ген резистентности к зеоцину, ген резистентности к бластицидину S и ген резистентности к гистидинолу. Лекарственное средство, соответствующее каждому из генов, добавляют в среду для культивирования после трансформации клеток с использованием гена перед культивированием.

[0015] Во втором варианте осуществления настоящего изобретения, используя систему культивирования, где летальный ген регулируется промотором, специфическим для клеток, не экспрессирующих ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, мегакариоцитарные клетки можно эффективно концентрировать, вызывая гибель исключительно тех клеток, в которых этот промотор функционирует, посредством культивирования мегакариоцитарных клеток, или клеток, способных дифференцироваться в мегакариоцитарные клетки. Примерами такого промотора могут являться промоторы для поверхностных клеточных маркеров (например, CD235 в случае эритроцитов), специфических для клеток, не экспрессирующих мегакариоцит-специфические поверхностные клеточные маркеры. Клетки, не дифференцирующиеся в мегакариоцитарные клетки, можно удалять, располагая летальный ген, например, ген HSV-TK, ген цитохрома C и ген Mule/ARF-BP-1, под контролем такого промотора и, таким образом, регулируя летальный ген.

[0016] Экспрессию гена резистентности к лекарственному средству или летального гена можно регулировать с использованием системы экспрессии индуцибельных генов, например, системы Tet-on (зарегистрированная торговая марка) или системы Tet-off (зарегистрированная торговая марка).

[0017] В этом варианте осуществления группу клеток, содержащую мегакариоциты или клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты, трансформируют с использованием гена-мишени. Если ген-мишень гиперэкспрессирован в клетке в течение стадии культивирования по настоящему изобретению, специалист в этой области может осуществлять эту стадию известными способами. Экспрессию можно осуществлять посредством трансдукции гена-мишени в клетки с использованием, например, вируса для трансдукции гена на основе лентивируса или ретровируса. Если экспрессию генов осуществляют с использованием системы трансдукции генов на основе вирусов, вектор может содержать ген-мишень, функционально связанный ниже подходящего промотора. В этом случае термин "функционально" связанный означает, что ген-мишень регулируется промотором в цис-положении, и промотор и ген-мишень связаны таким образом, что достигают желаемой экспрессии гена-мишени. В вариантах осуществления настоящего изобретения, например, ген-мишень можно конститутивно экспрессировать с использованием, например, промотора CMV, промотора EF1 и т.д.; или, подходящий промотор (индуцибельный промотор) можно располагать под контролем элемента, активно контролируемого транс-фактором, например, элементом, чувствительным к лекарственному средству, например, к тетрациклину, и, например, ген-мишень также может индуцибельно экспрессироваться под контролем, например, посредством добавления лекарственного средства. Специалист в этой области, которому необходимо осуществлять контроль над экспрессией желаемого гена-мишени, легко может выбирать подходящую систему из многочисленных доступных в настоящее время систем экспрессии генов. Можно использовать коммерчески доступный набор и т.д. Кроме того, описанный ниже онкоген и т.д. и ген резистентности к лекарственному средству или летальный ген, являющийся геном-мишенью для контроля экспрессии, можно встраивать в различные векторы относительно друг друга или в один вектор.

[0018] Ингибирования экспрессии генов в мегакариоцитарных клетках можно достигать, например, посредством деактивации индукции экспрессии указанной выше индуцируемой системы экспрессии, посредством удаления, например, лекарственного средства. Или можно осуществлять ингибиторный контроль в отношении экспрессии генов посредством удаления, например, встроенного онкогена, с использованием, например, системы Cre/lox. Например, при необходимости, также можно использовать коммерческий набор для осуществления ингибиторной регуляции экспрессии генов.

[0019] В рамках изобретения термин "клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты" относится к клеткам, происходящим из гемопоэтических стволовых клеток, и которые могут претерпевать дифференцировку в мегакариоциты в зависимости от условий индукции дифференцировки. Примерами являются гемопоэтические стволовые клетки, гемопоэтические клетки-предшественники, CD34-положительные клетки, мегакариоцитарно-эритроидные клетки-предшественники (MEP), мегакариоцитарные клетки-предшественники и т.д. Клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты, можно получать известными способами; например, их можно получать посредством выделения из костного мозга, пуповинной крови, периферической крови и т.д., а также их можно получать посредством индукции дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток, например, клеток ES и клеток iPS. Если гемопоэтические клетки-предшественники используют в качестве клеток, имеющих способность дифференцироваться в мегакариоциты, в клетки предварительно можно встраивать c-MYC, BMI1 и BCL-xL перед стадией культивирования по настоящему изобретению.

[0020] Клетки, не экспрессирующие поверхностные клеточные маркеры, специфические для мегакариоцитарных клеток, включают CD41-отрицательные/CD42-отрицательные клетки, в конечном итоге не дифференцирующиеся в мегакариоциты, например, эритроциты или их клетки-предшественники, но не обязательно, чтобы они были ограничены клетками, полученными из гемопоэтических стволовых клеток. Например, в варианте осуществления, в котором используют ген резистентности к лекарственному средству, резистентность к лекарственному средству придают исключительно клеткам, имеющим способность дифференцироваться в мегакариоциты, и, таким образом, все другие клетки могут быть ограничены.

[0021] Мегакариоциты в культуре, получаемой с помощью настоящего изобретения, могут присутствовать в виде популяции клеток, включающей не только мегакариоцитарные клетки, но также и мегакариоцитарные клетки-предшественники, которые перед созреванием имеют недостаточную способность продуцировать тромбоциты, мегакариоцитарные клетки, мультинуклеация которых прогрессирует, и т.д. Среди всех клеток, присутствующих в культуре, доля мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников и, в частности, мегакариоцитов предпочтительно составляет по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90%. Полученные мегакариоциты имеют значительно более высокую производительность тромбоцитов на клетку, чем мегакариоциты, полученные общепринятыми способами, в которых не удаляют клетки, не экспрессирующие поверхностные клеточные маркеры, специфические для мегакариоцитарных клеток. Хотя уровень повышения производительности тромбоцитов варьируется в зависимости от условий культивирования, производительность в несколько раз превышает таковую в случае общепринятых способов; например, производительность можно получать по меньшей мере в 5 раз. Повышение производительности тромбоцитов вычисляют посредством сравнения количество тромбоцитов, получаемых с помощью CD41a-положительных клеток и, предпочтительно, CD41a-положительных и CD42b-положительных клеток, на высеянную клетку. Присутствие/отсутствие функциональности полученных тромбоцитов можно подтверждать известными способами, например, можно измерять количество активированных тромбоцитов с использованием PAC-1, являющегося антителом, связывающимся исключительно с интегрином человека αIIBβ3 на мембране активированных тромбоцитов.

[0022] Мегакариоциты, полученные по настоящему изобретению, могут стабильно поддерживать свой фенотип дифференцировки в более длительной перспективе, чем мегакариоциты, индуцированные общепринятыми способами. Сохранение фенотипа дифференцировки можно оценивать, например, с использованием доли клеток, экспрессирующих мегакариоцитарные маркеры. После некоторого конкретного периода времени мегакариоциты, полученные по настоящему изобретению, имеют более высокую долю положительных по мегакариоцитарному маркеру (CD41a, CD42a, CD42b и т.д.) клеток, чем мегакариоциты, индуцированные общепринятыми способами. Кроме того, например, мегакариоциты, полученные по настоящему изобретению, также могут более стабильно сохранять свой фенотип дифференцировки по меньшей мере в течение 90 дней, чем мегакариоциты, индуцированные общепринятыми способами. Настоящее изобретение также может приводить к улучшению эффективности развития линий мегакариоцитарных клеток, проявляющих способность к саморепликации.

[0023] Стадию культивирования, используемую в настоящем изобретении, можно осуществлять в присутствие или в отсутствие фидерных клеток. Фидерные клетки должны являться клетками, делающими возможной индукцию мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников, но не ограничены конкретно другим образом, и их примером могут являться C3H10T1/2 (Katagiri T., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 172, 295-299 (1990)). Как правило, производительность тромбоцитов мегакариоцитарными клетками-предшественниками улучшается при использовании фидерных клеток, но мегакариоциты, получаемые по настоящему изобретению, обладают преимуществом, состоящим в том, что они способны продуцировать тромбоциты приблизительно на том же уровне на клетку, независимо от того, используют ли фидерные клетки, или нет.

[0024] Можно получать среду для культивирования, используемую в настоящем изобретении, хотя она конкретно не ограничена, на основе сред для культивирования, используемых для культивирования клеток животных в качестве минимальных сред. Минимальные среды включают, например, среду IMDM, среду 199, минимальную поддерживающую среду Игла (EMEM), среду αMEM, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM), среду Хэма F12, среду RPMI 1640, среду Фишера, нейробазальную среду (Life Technologies Corporation) и смешанные среды для культивирования из указанных выше. Среда для культивирования может содержать сыворотку или может являться бессывороточной. При необходимости, среда для культивирования также может содержать по меньшей мере одно вещество, например, из альбумина, инсулина, трансферрина, селена, жирных кислот, микроэлементов, 2-меркаптоэтанола, тиоглицерина, липидов, аминокислот, L-глутамина, неявляющихся необходимыми аминокислот, витаминов, факторов роста, низкомолекулярных соединений, антибиотиков, антиоксидантов, пировиноградной кислоты, буферов, неорганических солей и цитокинов. Цитокины являются белками, способствующими дифференцировке клеток крови, и их примерами могут являться VEGF, TPO, SCF и т.д. Среда IMDM, содержащая сыворотку, инсулин, трансферрин, селен, тиоглицерин, аскорбиновую кислоту и TPO, является предпочтительной средой для настоящего изобретения. Более предпочтительно, среда дополнительно содержит SCF. При использовании экспрессирующего вектора, содержащего чувствительный к лекарственному средству промотор, такого как система Tet-on (зарегистрированная торговая марка) или система Tet-off (зарегистрированная торговая марка), в среду на стадии гиперэкспрессии предпочтительно включают соответствующее лекарственное средство, например, тетрациклин или доксициклин.

[0025] Условия культивирования, хотя они конкретно не ограничены, могут являться, например, такими, при которых клетки культивируют в присутствие TPO (от 10 до 200 нг/мл и, предпочтительно, приблизительно от 50 до 100 нг/мл), или в присутствие TPO (от 10 до 200 нг/мл и, предпочтительно, приблизительно от 50 до 100 нг/мл) и SCF (от 10 до 200 нг/мл и, предпочтительно, приблизительно 50 нг/мл), или в присутствие TPO (от 10 до 200 нг/мл и, предпочтительно, приблизительно от 50 до 100 нг/мл), SCF (от 10 до 200 нг/мл и предпочтительно приблизительно 50 нг/мл) и гепарина (от 10 до 100 Ед./мл и, предпочтительно, приблизительно 25 Ед./мл). Что касается температуры культивирования, установлено, что дифференцировку мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников стимулируют посредством культивирования при температуре по меньшей мере 35,0°C. Температурой культивирования является температура, не повреждающая клетки, и, например, температура от 35,0°C до 42,0°C является предпочтительной, температура от 36,0°C до 40,0°C является более предпочтительной, и температура от 37,0°C до 39,0°C является еще более предпочтительной.

[0026] Специалист в этой области может определять подходящее время культивирования при мониторинге, например, количества мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников. Например, долю мегакариоцитарных клеток в культуре можно определять с использованием проточной цитометрии для анализа поверхностных клеточных маркеров, специфически экспрессируемых мегакариоцитами, и, например, культивирование можно осуществлять для доведения доли мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников и, в частности, мегакариоцитов по меньшей мере до 50%, например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% от всех клеток, присутствующих в культуре. Количество дней, хотя конкретно не ограничено при условии, что получают желаемые мегакариоцитарные клетки-предшественники, составляет, например, предпочтительно - по меньшей мере 3 дня, более предпочтительно - по меньшей мере 6 дней, и даже более предпочтительно - по меньшей мере 9 дней. Однако, т.к. длительное время культивирования не вызывает проблем, оно может составлять по меньшей мере 12 дней, по меньшей мере 18 дней, по меньшей мере 24 дня, по меньшей мере 30 дней, по меньшей мере 42 дня, по меньшей мере 48 дней, по меньшей мере 54 дня или по меньшей мере 60 дней. При необходимости в течение периода культивирования осуществляют субкультивирование.

[0027] Можно использовать следующие лекарственные средства, например, если клетки трансформируют с использованием гена резистентности к лекарственному средству: пуромицину, неомицину, канамицину, хлорамфениколу, эритромицину, тетрациклину, гигромицину, ампициллину, зеоцину, бластицидину S или гистидинолу.

[0028] До тех пор, пока не нарушены эффекты настоящего изобретения, уровень техники, касающийся получения мегакариоцитов, известный специалисту в этой области, можно использовать в отношении способа получения по настоящему изобретению. Например, в варианте осуществления способа по настоящему изобретению для получения мегакариоцитов среда может дополнительно содержать (a) вещество, ингибирующее экспрессию или функцию продукта гена p53, (b) ингибитор функциональности комплекса актомиозина, (c) ингибитор ROCK и (d) ингибитор HDAC. Эти способы можно осуществлять в соответствии со способом, описанным, например, в WO 2012/157586.

[0029] Кроме того, как описано в WO 2011/034073, степень получения мегакариоцитарных клеток также можно повышать посредством гиперэкспрессии онкогенов, например, гена c-MYC, и/или экзогенных генов, например, гена Polycomb. В таком варианте осуществления способ получения по изобретению в соответствии с настоящей заявкой может дополнительно включать стадию отключения гиперэкспрессии в мегакариоцитах или мегакариоцитарных клетках-предшественниках и культивирования. Что касается способа отключения гиперэкспрессии, например, если гиперэкспрессию осуществляют с использованием чувствительного к лекарственному средству вектора, отключения гиперэкспрессии можно достигать посредством устранения контакта с соответствующим лекарственным средством и клетками. В ином случае, при использовании вектора содержащего LoxP, см. выше, отключения гиперэкспрессии можно достигать посредством встраивания рекомбиназы Cre в клетки. При использовании встраивания транзиторно экспрессирующего вектора и встраивания РНК или белка, отключения гиперэкспрессии можно достигать посредством прекращения контакта с вектором и т.д. Среда для культивирования, используемая на этой стадии, может являться той же, что и среды для культивирования, описываемые выше.

[0030] Условия культивирования при отключении гиперэкспрессии конкретно не ограничены, но, например, температура от 35,0°C до 42,0°C является предпочтительной, температура от 36,0°C до 40,0°C является более предпочтительной, и температура от 37,0°C до 39,0°C является даже более предпочтительной.

[0031] При необходимости время культивирования после отключения гиперэкспрессии можно определять в ходе мониторинга, например, количества клеток и, в частности, количества мегакариоцитарных клеток; однако, оно составляет предпочтительно - по меньшей мере 2 дня после отключения гиперэкспрессии, например, от 2 до 14 дней. Это время культивирования более предпочтительно составляет от 3 до 12 дней, и еще более предпочтительно составляет от 4 до 10 дней. При необходимости, в течение периода культивирования осуществляют замену среды для культивирования или субкультивирование.

[0032] Мегакариоциты, полученные по настоящему изобретению, после достаточного созревания могут продуцировать функциональные тромбоциты с хорошей эффективностью. В рамках изобретения, термин "созревание мегакариоцита" относится к мегакариоциту, подвергаемому достаточной мультинуклеации для того, чтобы продуцировать функциональные тромбоциты. Созревание мегакариоцитов также можно подтверждать, например, по повышению экспрессии группы генов, связанных с созреванием мегакариоцитов, таких как GATA1, p45 NF-E2 и бета 1-тубулин, образованию протромбоцитов и мультинуклеации в клетках. Уже подтверждали in vivo и in vitro, что эти тромбоциты имеют высокую тромбогенность.

[0033] Кроме того, мегакариоциты и/или мегакариоцитарные клетки-предшественники могут продуцировать функциональные тромбоциты даже после криоконсервации и размораживания. Линии мегакариоцитарных клеток, получаемых по настоящему изобретению, можно распространять в криосохраненном состоянии.

[0034] (Способ получения тромбоцитов)

Способ получения тромбоцитов по настоящему изобретению отличается тем, что в нем используют культуру, получаемую описываемым выше способом получения. В более конкретном варианте осуществления способ получения тромбоцитов по настоящему изобретению включает стадию культивирования мегакариоцитов, мегакариоцитарных клеток-предшественников и/или линии мегакариоцитарных клеток, полученных описываемым выше способом, и выделения тромбоцитов из культуры.

[0035] Условия культивирования не ограничены, но, например, культивирование можно осуществлять в присутствие TPO (от 10 до 200 нг/мл и, предпочтительно, приблизительно от 50 до 100 нг/мл) или в присутствие TPO (от 10 до 200 нг/мл и предпочтительно приблизительно от 50 до 100 нг/мл), SCF (от 10 до 200 нг/мл и, предпочтительно, приблизительно 50 нг/мл) и гепарина (от 10 до 100 Ед./мл и предпочтительно приблизительно 25 Ед./мл).

[0036] Время культивирования, желательно, составляет по меньшей мере 3 дня, но оно конкретно не ограничено, при условии поддержания функциональности получаемых тромбоцитов. Время культивирования составляет, например, от 3 до 14 дней. Время культивирования предпочтительно составляет от 4 до 12 дней, и более предпочтительно - от 5 до 10 дней.

[0037] Температура культивирования конкретно не ограничена и, например, составляет от 35,0°C до 42,0°C. Температура культивирования от 36,0°C до 40°C является предпочтительной, в то время как температура от 37,0°C до 39,0°C является более предпочтительной.

[0038] Стадию культивирования мегакариоцитов можно осуществлять в способе получения по настоящему изобретению в бессывороточных условиях и/или условиях без фидерных клеток. Предпочтительным является способ, в котором мегакариоциты, получаемые способом по настоящему изобретению, культивируют в TPO-содержащей среде для культивирования. Если используют фидерные клетки, в варианте осуществления можно использовать кондиционированную среду. Кондиционированную среду, хотя она конкретно не ограничена, специалист в этой области может получать известными способами и т.д.; например, при необходимости, можно культивировать фидерные клетки и можно получать кондиционированную среду посредством удаления фидерных клеток из культуры с использованием фильтра.

[0039] Ингибитор ROCK и/или ингибитор функциональности комплекса актомиозина добавляют в среду для культивирования в варианте осуществления способа получения тромбоцитов по настоящему изобретению. Ингибитор ROCK и ингибитор функциональности комплекса актомиозина могут являться теми же, что и используемые в описываемом выше способе получения многоядерных мегакариоцитов. Примером ингибитора ROCK может являться Y27632, гидрохлорид фасудила и дигидрохлорид H1152. Примерами ингибитора функциональности комплекса актомиозина могут являться ингибиторы активности АТФазы миозина и ингибиторы киназы легких цепей миозина. Примерами являются блеббистатин, ML-7 и ML-9. Ингибитор ROCK или ингибитор функциональности комплекса актомиозина можно добавлять в отдельности или можно добавлять комбинацию ингибитора ROCK и ингибитора функциональности комплекса актомиозина.

[0040] Ингибитор ROCK и/или ингибитор функциональности комплекса актомиозина можно добавлять в количестве, например, от 0,1 до 30,0 мкМ. Концентрация ингибитора, предпочтительно, составляет от 0,5 до 25,0 мкМ, более предпочтительно - от 1,0 до 20,0 мкМ, и еще более предпочтительно - от 5,0 до 15,0 мкМ.

[0041] Время культивирования при добавлении ингибитора ROCK и/или ингибитора функциональности комплекса актомиозина может составлять, например, от 1 до 15 дней. Время культивирования, предпочтительно, составляет от 3 до 13 дней, более предпочтительно - от 5 до 11 дней, и еще более предпочтительно - 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней или 10 дней. Дополнительного повышения доли CD42b-положительных тромбоцитов можно достигать посредством добавления ингибитора ROCK и/или ингибитора функциональности комплекса актомиозина.

[0042] Тромбоциты можно отделять от среды для культивирования способами, известными специалисту в этой области. Тромбоциты, полученные по настоящему изобретению, являются очень безопасными тромбоцитами, не экспрессирующими экзогенные гены. Мегакариоциты, получаемые по настоящему изобретению, хотя конкретно не ограничены, могут экспрессировать, например, экзогенный ген супрессора апоптоза и ген злокачественного новообразования. В таком случае условие представляет собой организацию стадии получения тромбоцитов, посредством которой ингибируют экспрессию экзогенных генов.

[0043] Тромбоциты, получаемые по настоящему изобретению, можно вводить пациенту в виде состава. В зависимости от введения, тромбоциты, полученные способом по настоящему изобретению, можно хранить и составлять с использованием, например, плазмы человека, инфузионного раствора, цитратного физиологического раствора, раствора на основе дополненного глюкозой ацетата Рингера, PAS (добавочного раствора для тромбоцитов) (Gulliksson, H. et al., Transfusion, 32:435-440 (1992)) и т.д. Период хранения составляет приблизительно 14 дней после составления. Предпочтительный период составляет десять дней. Более предпочтительными являются восемь дней. Что касается условий хранения, хранение предпочтительно осуществляют со встряхиванием при комнатной температуре (от 20°C до 24°C).

[0044] Далее следует более подробное описание с использованием примеров, но настоящее изобретение никоим образом не ограничено примерами.

Примеры

[0045] 1. Получение гемопоэтических клеток-предшественников из клеток iPS

Дифференцировочное культивирование в клетки крови осуществляли из клеток человека iPS (692D2, 1108A2: клетки iPS, полученные из мононуклеарных клеток периферической крови и разрабатывали с использованием эписомного вектора, описанного в Okita K., et al., Stem Cells 31, 458-66, 2012; TKDN SeV2: клетки iPS, полученные из фетальных фибробластов кожи человека и разработанные с использованием вируса Сендай) способом, описанным в Takayama N., et al., J. Exp. Med. 2817-2830 (2010). Таким образом, колонии клеток человека ES/iPS сокультивировали в течение 14 дней с фидерными клетками C3H10T1/2 в присутствие 20 нг/мл VEGF (R&D Systems, Inc.) для получения гемопоэтических клеток-предшественников (HPC). Условия культивирования представляли собой 20% O₂ и 5% CO₂ (эти же условия использовали в дальнейшем, если конкретно не указано иное).

[0046] 2. Вирусная инфекция c-MYC и BMI1 в гемопоэтические клетки-предшественники

5×10⁴ клеток/лунку клеток HPC, полученных описываемым выше способом, высевали в 6-луночные планшеты, которые предварительно засевали фидерными клетками C3H10T1/2, и гиперэкспрессирование c-MYC и BMI1 осуществляли лентивирусным способом. В этом случае, использовали 6 лунок на линию клеток. Таким образом, в среду для культивирования добавляли вирусные частицы для достижения MOI 20 для каждого, и осуществляли инфицирование посредством центрифужного инфицирования (32°C, 900 об./мин., центрифугирование в течение 60 минут). Это действие осуществляли дважды с интервалом 12 часов. Используемую в этом случае среду получали посредством добавления протамина в конечной концентрации 10 мкг/мл в среду (обозначаемую ниже как дифференцировочная среда), получаемую посредством включения 50 нг/мл тромбопоэтина человека (TPO) (R&D Systems, Inc.), 50 нг/мл фактора стволовых клеток человека (SCF) (R&D Systems, Inc.) и 2 мкг/мл доксициклина (Dox) в минимальную среду (IMDM (модифицированная по способу Исков среда Дульбекко) (Sigma-Aldrich Corporation), содержащую 15% эмбриональную телячью сыворотку (GIBCO), 1% пенициллина-стрептомицина-глутамина (GIBCO), 1% раствора инсулина, трансферрина, селена (ITS-G) (GIBCO), 0,45 мМ 1-тиоглицерина (Sigma-Aldrich Corporation) и 50 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich Corporation)). Лентивирусные векторы (соответственно, LV-TRE-c-MYc-Ubc-tTA-I2G, LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G и LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G) являлись тетрациклин-контролируемыми индуцибельными векторами, и их конструировали посредством рекомбинации c-MYC, BMI1 и BCL-xL с кассетой mOKS LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G (Kobayashi, T., et al., Cell 142, 787-799 (2010)). Вирусные частицы, используемые в инфицировании, получали посредством экспрессии лентивирусных векторов в клетках 293T.

[0047] 3. Получения самореплицирующихся линий мегакариоцитов и поддерживающее культивирование

Самореплицирующиеся линии мегакариоцитов, полученные из 692D2 и 1108A2, соответствующим образом получали посредством культивирования, как описано ниже, мегакариоцитарных клеток, трансдуцированных с использованием генов cMYC и BMI1, используя день, в который осуществляли вирусную инфекцию cMYC и BMI1 указанным выше способом, в качестве дня инфицирования 0.

[0048] ⋅ Дни инфицирования 2-11

Клетки крови после вирусной инфекции, полученные описываемым выше способом, выделяли посредством пипетирования; центрифугирование осуществляли в течение 5 минут при 1200 об./мин.; удаляли супернатант; затем осуществляли суспендирование в свежей дифференцировочной среде и высевание (6-луночный планшет) на свежих фидерных клетках C3H10T1/2. Субкультивирование осуществляли тем же способом в день инфицирования 9. После измерения количества клеток осуществляли высевание (6-луночный планшет) на фидерные клетки C3H10T1/2 в количестве 1×10⁵ клеток/2 мл/лунку.

[0049] ⋅ Дни инфицирования 12-13

Осуществляли тот же способ, что и в день инфицирования 2. После измерения количества клеток осуществляли высевание (чашка 100 мм) на фидерные клетки C3H10T1/2 в количество 3×10⁵ клеток/10 мл/чашку 100 мм.

[0050] ⋅ День инфицирования 14

Клетки крови после вирусной инфекции выделяли и подвергали реакции с антителами на 1,0×10⁵ клеток, 2 мкл, 1 мкл и 1 мкл, соответственно, антителом против CD41a-APC человека (BioLegend, Inc.), антителом против CD42b-PE человека (eBioscience) и антителом против CD235ab-Pacific Blue человека (BioLegend, Inc.). После реакции осуществляли анализ с использованием FACSVerse (BD). Самореплицирующуюся линию мегакариоцитов получали, когда доля CD41a-положительных клеток в день инфицирования 14 составляла по меньшей мере 50%.

[0051] 4. BCL-xL-вирусная инфекция самореплицирующихся линий мегакариоцитов

Трансдукцию с использованием гена BCL-xL осуществляли лентивирусным способом в день 14 культивирования клеток крови после вирусной инфекции. В среду для культивирования добавляли вирусные частицы для получения MOI 10 и инфицирования достигали посредством центрифужного инфицирования (32°C, 900 об./мин., центрифугирование в течение 60 минут).

[0052] 5. Получение иммортализованных линий мегакариоцитов и поддерживающее культивирование

⋅ Дни инфицирования 14-18

Клетки крови после вирусной инфекции, получаемые описываемым выше способом, выделяли и подвергали центрифугированию в течение 5 минут при 1200 об./мин. После центрифугирования осажденные клетки суспендировали в свежей дифференцировочной среде, а затем высевали (6-луночный планшет) в количестве 2×10⁵ клеток/2 мл/лунку на свежие фидерные клетки C3H10T1/2.

[0053] ⋅ День инфицирования 18: субкультивирование

После измерения количества клеток осуществляли высевание в количестве 3×10⁵ клеток/10 мл/чашку 100 мм.

[0054] ⋅ День инфицирования 24: субкультивирование

После измерения количества клеток осуществляли высевание в количестве 1×10⁵ клеток/10 мл/чашку 100 мм. Затем осуществляли поддерживающее культивирование посредством субкультивирования каждые 4-7 дней.

[0055] Клетки крови выделяли в день инфицирования 24 и подвергали их иммуноокрашиванию на 1,0×10⁵ клеток, 2 мкл, 1 мкл и 1 мкл, соответственно, с использованием антитела против CD41a-APC человека (BioLegend, Inc.), антитела CD42b-PE человека (eBioscience) и антитела CD235ab-Pacific Blue человека (Anti-CD235ab-PB; BioLegend, Inc.). После этого осуществляли анализ с использованием FACSVerse (BD). Линии, имевшие долю CD41a-положительных клеток по меньшей мере 50% даже в день инфицирования 24, считали иммортализованными линиями мегакариоцитарных клеток.

[0056] Клетки, полученные из клеток iPS (692D2, 1108A2), можно выращивать по меньшей мере в течение 24 дней после инфекции в результате поддерживающего культивирования клеток, подвергнутых инфицированию BCL-xL-лентивируса. Эти клетки считали иммортализованными линиями мегакариоцитов (сравнительные примеры 1 и 2). Иммортализованную линию мегакариоцитов также получали тем же способом с использованием TKDN SeV2 (сравнительный пример 3).

[0057] Подтверждали, что все иммортализованные линии мегакариоцитов из сравнительных примеров 1-3 можно субкультивировать в течение по меньшей мере 40 дней. С другой стороны, также подтверждали, что культивирование сопровождалось повышением количества клеток, трансформировавшихся в адгезивные клетки.

[0058] 6. Конструирование экспрессирующего вектора с геном резистентности к лекарственному средству с использованием промотора для экспрессии мегакариоцит-специфических генов

Вектор LV-TetON (Clontech Laboratories, Inc.), последовательность промотора CD41a (SEQ ID NO: 1), клонированную из клеток KhES3 (разработанных в Kyoto University), и последовательность гена резистентности к пуромицину, субклонированную из pENTR-DMD-Donor04_EF1a-Puro, затем рекомбинировали в CS-CDF-UG-PRE, расщепляемом ферментами рестрикции EcoRI и XhoI. Эту рекомбинацию осуществляли с использованием набора для клонирования продуктов ПЦР In-Fusion Advance (Clontech Laboratories, Inc.). В результате можно сконструировать лентивирусный вектор, содержащий промотор CD41a-ген резистентности к пуромицину (фиг. 1).

[0059] 7. Трансдукция генов с использованием лентивирусного вектора, содержащего промотор CD41a-ген резистентности к пуромицину

Клетки HEK293T трансфицировали с использованием лентивирусного вектора, содержащего промотор CD41a-ген резистентности к пуромицину. Лентивирус, содержащий промотор CD41a-ген резистентности к пуромицину, затем концентрировали и получали из супернатанта культуры трансфицированных клеток HEK293T. Иммортализованную линию мегакариоцитарных клеток, высеянную в количестве 2×10⁶ клеток/10 мл/чашку на клетки C3H10T1/2 (фидерные клетки) в чашку 10 см, инфицировали при MOI 10 лентивирусом, содержащим промотор CD41a-ген резистентности к пуромицину. После инфицирования иммортализованную линию мегакариоцитарных клеток статически культивировали в условиях 37°C и 5% CO₂ с использованием среды для культивирования (пуромицин-содержащей дифференцировочной среды), получаемой посредством включения 2 мкг/мл пуромицина в среду (дифференцировочную среду), содержащую 50 нг/мл тромбопоэтина человека (TPO) (R&D Systems, Inc.), 50 нг/мл фактора стволовых клеток человека (SCF) (R&D Systems, Inc.) и 2 мкг/мл доксициклина (Dox) в минимальной среде (IMDM (модифицированной по способу Исков среде Дульбекко) (Sigma-Aldrich Corporation), содержащей 15% эмбриональную телячью сыворотку (GIBCO), 1% пенициллина-стрептомицина-глутамина (GIBCO), 1% раствора инсулина, трансферрина, селена (ITS-G) (GIBCO), 0,45 мМ 1-тиоглицерина (Sigma-Aldrich Corporation) и 50 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich Corporation)).

[0060] Линии клеток, трансдуцированные с использованием лентивируса, содержащего промотор CD41a-ген резистентности к пуромицину, обозначали как пример 1 (полученный с помощью 692D2), пример 2 (полученный с помощью 1108A2) и пример 3 (полученный с помощью TKDN SeV2).

[0061] 8. Анализ мегакариоцитарных маркеров (в присутствие фидерных клеток)

Клетки окрашивали с использованием антитела против CD41a (APC против CD41, BioLegend, Inc.), антитела против CD42b (против CD42b, eBioscience) и антитела против CD235ab (против CD235ab-PB, BioLegend, Inc.) и анализировали с использованием проточного цитометра BD FACSVerse. В соответствии с результатами, группа клеток, трансдуцированная с использованием лентивируса, содержащего промотор CD41a-ген резистентности к пуромицину (пример 1), имела более высокую долю CD41a-положительных клеток, чем группа нетрансдуцированных клеток (сравнительный пример 1) (фиг. 2). Даже при продолжении культивирования после этого, культура, полученная посредством культивирования группы клеток из примера 1, проявляла более высокую долю CD41a-положительных клеток, чем в сравнительном примере 1 (фиг. 3). Количество CD41a-положительных клеток в примере 1 продолжало расти (фиг. 4).

[0062] 9. Анализ мегакариоцитарных маркеров (в отсутствие фидерных клеток)

Линию клеток, полученных из 1108A2, трансдуцированных лентивирусом, содержащим промотор CD41a-ген резистентности к пуромицину, получали в тех же условиях, что и в примере 1, но без использования фидерных клеток при культивировании (пример 2). Сравнительный пример 2 представлял собой линию нетрансдуцированных клеток, полученных из 1108A2. Даже в случае культивирования без использования фидерных клеток, культура, полученная посредством культивирования группы клеток из примера 2, могла демонстрировать более высокую долю CD41a-положительных клеток, чем в сравнительном примере 2 (фиг. 5).

[0063] 10. Сравнение присутствия фидерных клеток с отсутствием фидерных клеток

В случае полученного из 692D2 примера 1, высокую долю CD41a-положительных клеток наблюдали (фиг. 6A) в случае обоих условий, т.е. в присутствие фидерных клеток и в отсутствие фидерных клеток, даже когда концентрацию пуромицина, присутствующего в среде для культивирования линии клеток, повышали до, соответственно, 5 мкг/мл в день культивирования 14 и 10 мкг/мл в день культивирования 28. Кроме того, в каждом случае измеряли изменение количества клеток с течением времени. Количество клеток измеряли с использованием гемоцитометра (Waken BTech Co., Ltd.), при этом культивируемые клетки разводили 0,1% (об./об.) раствором трипанового синего. Результаты показали, что клетки росли с течением времени с приблизительно одинаковой скоростью, независимо от присутствия/отсутствия фидерных клеток (фиг. 6B).

[0064] 11. Измерение наращивания клеток (встряхиваемая культура)

Линию клеток, полученных из 692D2, трансдуцированных лентивирусом, содержащим промотор CD41a-ген резистентности к пуромицину, получали в тех же условиях, что и в примере 1, но с использованием культивирования во флаконе и культивирования в мешке в качестве способа культивирования (культивирование во флаконе: пример 4; культивирование в мешке: пример 5). В соответствии с результатами, доля CD41a-положительных клеток значительно повышалась в культурах, полученных посредством культивирования групп клеток в примере 4 и примере 5 (фиг. 7 (пример 4), фиг. 8 (пример 5)).

[0065] 12. Измерение количества тромбоцитов (статическая культура, в присутствие фидерных клеток)

Тромбоциты, присутствующие в супернатанте культуры, окрашивали антителом против CD41a (APC против CD41, BioLegend, Inc.), антителом против CD42a (против CD42a, eBioscience) и антителом против CD42b (против CD42b, eBioscience) и осуществляли анализ с использованием проточного цитометра BD FACSVerse. В соответствии с результатами, группа клеток, трансдуцированных с использованием промотора CD41a-гена резистентности к пуромицину (пример 1), имела производительность CD41a-положительных, CD42b-положительных тромбоцитов (количество полученных тромбоцитов на высеянную клетку), по меньшей мере в два раза более высокую, чем в группе нетрансдуцированных клеток (сравнительный пример 1) (таблица 1, фиг. 9).

[Таблица 1]

	Фидерные клетки	Количество тромбоцитов
Количество	AV	/мкл	/количество высеянных клеток
Сравнительный пример 1	+	866	866	144	1,4
Пример 1	+	1977	1977	330	3,3

[0066] 13. Измерение количества тромбоцитов (статическая культура, в отсутствие фидерных клеток)

Повышение производительности CD41a-положительных, CD42b-положительных тромбоцитов (количество полученных тромбоцитов на высеянную клетку) также подтверждали в случае получения тромбоцитов без какого-либо использования фидерных клеток. Группа клеток, трансдуцированных с использованием промотора CD41a-гена резистентности к пуромицину (пример 2), имела производительность тромбоцитов, приблизительно в пять раз более высокую, чем в группе нетрансдуцированных клеток (сравнительный пример 2) (таблица 2, фиг. 10).

[Таблица 2]

	Фидерные клетки	Количество тромбоцитов
Количество	AV	/мкл	/количество высеянных клеток
Сравнительный пример 2	-	340	340	57	0,6
Пример 2	-	2007	2007	335	3,3

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Megakaryon Corporation

<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ МЕГАКАРИОЦИТЫ, И СПОСОБ

ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОЦИТОВ С ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕМ

<130> K1019AGP01

<140> PCT/JP2016/057467

<141> 2016-03-09

<150> JP2015-046281

<151> 2015-03-09

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 948

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

tgtgaacgga ccaagagtaa acagtgtgct caatgctgtg cctacgtgtg ttagcccacg 60

cggccagcct gaggagtcag ggaaggctcc cctaggcaaa gcccccaacc agaatcaagt 120

cttaatggtt aaagagctcc atcacccaaa aaggattgag ggcctacctt caactgaaca 180

gctaatgcat aatctcagaa actgtgagtc aaaattccct ggaataactc cactttatcc 240

ccaatctcct tgccacctag accaaggtcc attcaccacc ctgtccccag cactgactgc 300

actgctgtgg ccacactaaa gcttggctca agacggagga ggagtgagga agctgctgca 360

ccaatatggc tggttgaggc cgcccaaggt cctagaagga ggaagtgggt aaatgccata 420

tccaaaaaga tacagaagcc tcaggtttta tcgggggcag cagcttcctt ctccttcccc 480

gacctgtggc caagtcacaa agcaccacag ctgtacagcc agatggggga agggaggaga 540

ttagaactgt aggctagagt agacaagtat ggaccagttc acaatcacgc tatcccaagc 600

agaaagtgat ggtggcttgg actagcacgg tggtagtaga gatggggtaa agattcaaga 660

gacatcattg ataggcagaa ccaataggac atggtaataa actattctca ggaaagggga 720

ggagtcatgg ctttcagcca tgagcatcca ccctctgggt ggcctcaccc acttcctggc 780

aattctagcc accatgagtc caggggctat agccctttgc tctgcccgtt gctcagcaag 840

ttacttgggg ttccagtttg ataagaaaag acttcctgtg gaggaatctg aagggaagga 900

ggaggagctg gcccattcct gcctgggagg ttgtggaaga aggaagat 948

<---

1. Способ получения культуры, содержащей мегакариоциты или мегакариоцитарные клетки-предшественники, имеющие повышенную способность к продукции тромбоцитов, включающий:

стадию культивирования в условиях, вызывающих гибель клеток, не экспрессирующих ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, группы клеток, содержащей мегакариоциты или клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты;

в котором после указанной стадии культивирования производительность тромбоцитов на клетку указанных мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников повышается по сравнению с производительностью тромбоцитов на клетку мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников, полученных способом, не включающим указанную стадию культивирования, и

в котором группу клеток трансформируют с использованием гена резистентности к лекарственному средству, проявляющему цитотоксичность, причем ген резистентности к лекарственному средству находится под контролем промотора гена, специфически экспрессируемого мегакариоцитами, и лекарственное средство добавляют на стадии культивирования, причем лекарственное средство представляет собой пуромицин, и ген резистентности к лекарственному средству представляет собой ген резистентности к пуромицину.

2. Способ по п.1, в котором указанная производительность тромбоцитов на клетку увеличивается по меньшей мере в 5 раз.

3. Способ по п.1, где группу клеток трансформируют с использованием гена, вызывающего гибель клеток, не экспрессирующих ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, и этот ген располагают под контролем промотора гена, специфически экспрессируемого клетками, не экспрессирующими ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами.

4. Способ по любому из пп.1-3, где ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, является геном, кодирующим поверхностный клеточный маркер, специфически экспрессируемый мегакариоцитами.

5. Способ по п.4, где поверхностным клеточным маркером, специфически экспрессируемым мегакариоцитами, является CD41a, CD42a и/или CD42b.

6. Способ по любому из пп.1-5, где клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты, представляют собой по меньшей мере один тип, выбранный из группы, состоящей из гемопоэтических стволовых клеток, гемопоэтических клеток-предшественников, CD34-положительных клеток и мегакариоцитарных клеток-предшественников.

7. Способ по любому из пп.1-6, где стадию культивирования осуществляют в отсутствие сыворотки и/или фидерных клеток.

8. Способ по любому из пп.1-7, где мегакариоциты в культуре, подлежащие получению, сохраняют свой фенотип дифференцировки и имеют повышенную способность продуцировать тромбоциты.

9. Способ по любому из пп.2-8, где группу клеток трансформируют с использованием вектора, в котором промотор и ген резистентности к лекарственному средству или летальный ген функционально связаны.

10. Способ получения тромбоцитов, включающий:

стадию культивирования в условиях, вызывающих гибель клеток, не экспрессирующих ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, группы клеток, содержащей мегакариоциты или клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты; и

стадию получения тромбоцитов с использованием мегакариоцитов,

в котором после указанной стадии культивирования производительность тромбоцитов на клетку указанных мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников повышается по сравнению с производительностью тромбоцитов на клетку мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников, полученных способом, не включающим указанную стадию культивирования, и

в котором группу клеток трансформируют с использованием гена резистентности к лекарственному средству, проявляющему цитотоксичность, причем ген резистентности к лекарственному средству находится под контролем промотора гена, специфически экспрессируемого мегакариоцитами, и лекарственное средство добавляют на стадии культивирования, причем лекарственное средство представляет собой пуромицин, и ген резистентности к лекарственному средству представляет собой ген резистентности к пуромицину.

11. Способ экспансии культуры мегакариоцитами или мегакариоцитарными клетками-предшественниками, имеющими повышенную способность к продукции тромбоцитов, включающий:

стадию культивирования в условиях, вызывающих гибель клеток, не экспрессирующих ген, специфически экспрессируемый мегакариоцитами, группы клеток, содержащих мегакариоциты или клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты;

в котором после указанной стадии культивирования производительность тромбоцитов на клетку указанных мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников повышается по сравнению с производительностью тромбоцитов на клетку мегакариоцитов или мегакариоцитарных клеток-предшественников, полученных способом, не включающим указанную стадию культивирования, и

в котором группу клеток трансформируют с использованием гена резистентности к лекарственному средству, проявляющему цитотоксичность, причем ген резистентности к лекарственному средству находится под контролем промотора гена, специфически экспрессируемого мегакариоцитами, и лекарственное средство добавляют на стадии культивирования, причем лекарственное средство представляет собой пуромицин, и ген резистентности к лекарственному средству представляет собой ген резистентности к пуромицину.

12. Способ по п.11, где группу клеток трансформируют с использованием гена резистентности к лекарственному средству, проявляющему цитотоксичность, гена резистентности к лекарственному средству, располагаемому под контролем промотора гена, специфически экспрессируемого мегакариоцитами, и лекарственного средства, добавляемого на стадии культивирования.

13. Применение лекарственного средства, проявляющего цитотоксичность, для получения культуры, содержащей мегакариоциты или мегакариоцитарные клетки-предшественники, имеющие повышенную производительность тромбоцитов на клетку;

в котором указанная культура содержит группу клеток, содержащую мегакариоциты или клетки, имеющие способность дифференцироваться в мегакариоциты, причем указанные клетки содержат ген, придающий резистентность к указанному лекарственному средству,

в котором группу клеток трансформируют с использованием гена резистентности к лекарственному средству, проявляющему цитотоксичность, причем ген резистентности к лекарственному средству находится под контролем промотора гена, специфически экспрессируемого мегакариоцитами, и лекарственное средство добавляют на стадии культивирования, причем лекарственное средство представляет собой пуромицин, и ген резистентности к лекарственному средству представляет собой ген резистентности к пуромицину.