Способ выявления сахарного диабета первого типа

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической диагностике, и может быть использовано для выявления сахарного диабета первого типа у беременных. Осуществляют забор образца крови пациента; пробоподготовку образца крови пациента с получением аналита; определение содержания в качестве маркера сахарного диабета первого типа в аналите белка Angiotensinogen и/или Apolipoprotein С-III и/или Vitronectin. При значении относительного содержания Angiotensinogen не менее 1,29% от общего содержания белков в аналите и/или при значении Apolipoprotein С-III не менее 2,91% от общего содержания белков в аналите и/или при отсутствии у пациента диагноза «ожирение» при значении Vitronectin не более 0,71% от общего содержания белков в аналите выявляют сахарный диабет первого типа. Определение содержания маркера сахарного диабета первого типа в аналите проводят методом иммуноферментного анализа или методом хромато-масс-спектрометрии. Способ обеспечивает повышение точности анализа в диагностике сахарного диабета первого типа у беременных женщин, а также расширение арсенала существующих способов анализа в диагностике диабета первого типа, за счет определения содержания методами иммуноферментного анализа или хромато-масс-спектрометрии по меньшей мере одного маркера сахарного диабета первого типа в аналите. 2 з.п. ф-лы, 8 табл., 3 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области клинической диагностики, а именно к способам анализа в диагностике диабета.

Сахарный диабет относится к группе метаболических заболеваний, обусловленных дефектом секреции инсулина, нарушением действия инсулина или сочетанием этих факторов, что сопровождается гипергликемией [Торосян К.Э., Непсо Ю.Р., Новикова В.А., Пенжоян Г А. САХАРНЫЙ ДИАБЕТ 1 ТИПА И БЕРЕМЕННОСТЬ: КЛИНИЧЕСКИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ // Современные проблемы науки и образования. - 2016. - №4.; URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id-24998]. Сахарный диабет I типа - это инсулинозависимый сахарный диабет, является аутоиммунным заболеванием, индуцированным хроническими стрессорными факторами внешней среды на фоне определенной генетической предрасположенности [Айламазян Э.К., Кулаков В.И., Радзинский В.Е., Савельева Г.М. Акушерство: национальное руководство. - М.: ГОЭТАР - Медиа, 2014. - 1200 с.]. При некоторых формах сахарного диабета I типа отсутствуют убедительные доказательства аутоиммунной природы и заболевание считается идиопатическим. Также сахарный диабет I типа может случиться у лиц с избыточной массой тела или ожирением [Handelsman Y., Bloomgarden Z.T., Grunberger G., Umpierrez G., Zimmerman R.S. AACE Task Force for Developing a Diabetes. AACE/ACE Diabetes Guidelines, Endocr Pract. 2015; 21(Suppl 1).].

Распространенность сахарного диабета I и II типа среди женщин фертильного возраста в РФ составляет 0,9-2%. Прегестационный сахарный диабет выявляется у 1% беременных, в 1-5% случаев развивается гестационный сахарный диабет или манифестирует истинный сахарный диабет [Айламазян Э.К., Кулаков В.И., Радзинский В.Е., Савельева Г.М. Акушерство: национальное руководство. - М.: ГОЭТАР - Медиа, 2014. - 1200 с.].

Согласно «Глобальному отчету по диабету» Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) от 2016 года [Глобальный доклад по диабету. Резюме, Всемирная организация здравоохранения. - 2016. - 8 с.], в 2014 году в мире сахарным диабетом страдали 422 миллиона взрослого населения, что в 4 раза превышало аналогичные данные от 1980 года - 108 миллионов. Увеличение заболеваемости сахарным диабетом может быть обусловлено растущими показателями избыточного веса или ожирения, низким или средним уровнем дохода в стране. В 2012 году превышение содержания глюкозы в крови по сравнению с нормой явилось причиной 2,2 миллиона смертельных случаев, сахарный диабет - причиной 1,5 миллиона смертельных случаев.

Сахарный диабет, независимо от типа, способен привести к инфаркту, инсульту, почечной недостаточности, ампутации ног, потере зрения и поражению нервов, повышает суммарный риск преждевременной смерти. Не компенсированный полностью сахарный диабет во время беременности увеличивает вероятность гибели плода и развития множества осложнений [Global report on diabetes. World Health Organization. - Paris. - 2016. - 88 p.].

Гликемический контроль является наиболее важным фактором риска для врожденных пороков развития, перинатальной заболеваемости и перинатальной смертности у женщин с сахарным диабетом I и II типов [Murphy H.R., Elleri D., Allen J.M. et al. Pathophysiology of postprandial hyperglycaemia in women with type 1 diabetes during pregnancy // Diabetologia. 2012 Feb. 55(2):282-93.]. Наиболее удручающими являются перинатальные исходы у женщин с сахарным диабетом I типа [Murphy H.R., Steel S.A., Roland J.M. et al. Obstetric and perinatal outcomes in pregnancies complicated by Type 1 and Type 2 diabetes: innuences of glycaemic control, obesity and social disadvantage // Diabet Med. 2011 Sep. 28(9): 1060-7.].

Сахарный диабет во время беременности повышает риск последующего развития ожирения или СД II типа у ребенка [Global report on diabetes. World Health Organization. - Paris. - 2016. - 88 р.]. По данным Американской ассоциации клинических эндокринологов и Американского колледжа эндокринологии (American association of clinical endocrinologists and American College of Endocrinology - AACE/ACE) (2015), установлена линейная зависимость между концентрацией глюкозы в крови беременной и весом новорожденного, частотой макросомии плода и родоразрешения путем операции кесарева сечения [Handelsman Y., Bloomgarden Z.T., Grunberger G., Umpierrez G., Zimmerman R.S. AACE Task Force for Developing a Diabetes. AACE/ACE Diabetes Guidelines, Endocr Pract. 2015; 21(Suppl 1).]. В отчете ВОЗ (2016) также указывается, что неконтролируемый сахарный диабет во время беременности может оказывать негативное воздействие на мать и плод, существенно увеличивает риск потери плода, врожденных пороков развития, мертворождения, перинатальной смертности, акушерских осложнений и материнской заболеваемости и смертности. Таким образом, своевременная диагностика сахарного диабета у беременных - важнейшая задача современной медицины.

Современные методы диагностики сахарного диабета базируется на использовании иммуноферментного анализа для определения антител к бета-клеткам поджелудочной железы, инсулину, глютаматдекарбоксилазе, а также на биохимических показателях уровня глюкозы в крови и уровня гликированного гемоглобина. Таким образом, ближайшими аналогами заявленного изобретения являются применение метода ИФА вкупе с применением клинического биохимического анализа [American Diabetes Association. 2. Classification and Diagnosis of Diabetes: Standards of Medical Care in Diabetes-2019. Diabetes Care. 2019; 42 (Suppl 1):S13-S28. doi:10.2337/dc19-S002].

В настоящее время диагностика сахарного диабета I является клинически сложной задачей. В соответствии с рекомендациями ВОЗ, Российской Ассоциации Эндокринологов, а также международной Диабетической Ассоциации, клиническая диагностика сахарного диабета проводится по совокупности нескольких лабораторных и антропометрических показателей. В частности, диагноз сахарного диабета устанавливается по наличию антител в бета-клеткам поджелудочной железа (что включает также установление аутоиммунной природы заболевания), антител к глутамат-декарбоксилазе, антитела к инсулину, показатели С-пептида инсулина, а также показатели уровня глюкозы в крови (натощак и при различных нагрузках) и уровень гликированного гемоглобина. Как видно, установление диагноза является весьма длительным и дорогостоящим, более того большая часть анализов проводится с использования ИФА (иммуноферментного анализа). Несмотря на достаточно высокую специфичность и точность анализа по совокупности всех показателей (до 90% и до 75%, соответственно), современные подходы в диагностике не позволяют провести анализ достаточно быстро и экономически выгодно. Более того, в зависимости от антропометрических и эпигенетических факторов, во многих случаях выявление заболевания происходит уже на поздних сроках заболевания, когда провести корректирующую терапию с высокой эффективностью уже не представляется возможным.

Из уровня техники известен способ получения аналитической тест-системы (MRM-теста) для мультиплексной идентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов, предусматривающий следующие стадии:

1) выявление уникальных для белка протеотипических маркерных пептидных последовательностей;

2) отбор по меньшей мере двух маркерных протеотипических пептидных последовательностей белка, наиболее пригодных для исследования методом мониторинга множественных реакций;

3) предсказание фрагментов пептидов;

4) предсказание MRM-теста в виде перечня маркерных пептидов, их фрагментов и наилучших параметров детекции методом мониторинга множественных реакций;

5) синтез одного или нескольких маркерных пептидов;

6) определение профиля переходов одного и нескольких синтетических маркерных пептидов методом мониторинга множественных реакций в условиях ускоренного хроматографического градиента;

7) оптимизация MRM-теста в соответствии с полученными профилями, удаление из набора пептидных фрагментов, характеризующихся наименьшими значениями интенсивности в масс-спектре;

8) очистка пептидов, синтезированных на стадии 5);

9) подготовка биологического образца, предусматривающая удаление мажорных белков;

10) идентификация белка в биологическом образце с заколом синтетических пептидов методом мониторинга множественных реакций в условиях нормального хроматографического градиента на основании профилей, полученных на стадии 6);

11) определение значений времени удержания маркерных пептидов с внесением установленных значений в MRM-тесты;

12) проведение мультиплексных калибровочных измерений в условиях нормального хроматографического градиента в буферном растворе очищенных синтетических пептидов на фоне смеси не имеющих к ним отношения белков и/или пептидов;

13) количественное измерение содержания маркерных пептидов в биологическом образце в условиях нормального хроматографического градиента с вводом синтетических пептидов; и

14) суждение о содержании интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов, количественно определенных на стадии 13) [патент РФ RU 2595835]. Данный способ представляет собой общий подход к идентификации белков протеома и сам по себе неприменим для выявления сахарного диабета 1 типа у беременных.

Протеомика (англ. Proteomics) - область молекулярной биологии, посвященная идентификации и количественному анализу белков (иными словами, высокопроизводительному исследованию белков). Совокупность всех белков клетки называют протеомом [James P. Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics. (англ.) // Quarterly Reviews Of Biophysics. - 1997. - November (vol. 30, no. 4). - P. 279-331. - PMID 9634650]. Из уровня техники известно, что данные, полученные методами протеомики, могут быть использованы для формирования более глубокого понимания причин возникновения разнообразных заболеваний, например, нейродегенеративных, а также в целях разработки методов лечения. С помощью протеомики осуществляется поиск антигенов, пригодных для создания новых вакцин. Идентификация белков, которые аномально экспрессируются при различных раковых заболеваниях, имеет огромное значение для диагностики с помощью биомаркеров, прогнозирования и лечения рака [Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем. - М.: ТЕХНОСФЕРА, 2005. - С. 185. - 256 с. - ISBN 94836-044-Х.].

В рамках клинического исследования протеома беременных женщин, страдающих различными типами сахарного диабета (гестационный сахарный диабет, сахарный диабет 1 и 2 типа), были выявлены маркеры, аномальное содержание которых в протеоме коррелирует с развитием сахарного диабета 1 типа у беременных. Данные маркеры позволяют проводить дифференциальную диагностику на малом объеме биологического материала (используемый в работе объем плазмы крови составлял 2 мкл) и выявлять первичные причины развития диабета первого типа, что позволяет более точно говорить о его этиологии, и прогнозировать его течение. Средние значения содержания белков в протеоме женщин контрольной группы представлены в таблице 1.

В таблице 2 представлены динамические изменения относительного содержания белков протеома участников исследования с диагностированным диабетом 1 типа по отношению к контрольной группе (беременные женщины).

Полученные данные позволили разработать метод малоинвазивного мониторинга развития патологии. Учитывая корреляцию различных маркеров, предложенный метод дает возможность наблюдать полномасштабную протеомную картину сахарного диабета первого типа. Установлена связь между различными маркерными белками и процессами липидного обмена, сигнальными путями PPAR-рецепторов, процессами гемостаза, а также белками внеклеточного матрикса и архитектуры внеклеточного пространства. В совокупности эти процессы способствуют высокому риску развитию диабетической ангиопатии, что напрямую связывает сахарный диабет с протромбическим состоянием. В предложенном способе маркерами нарушения гемостаза и липидного обмена могут служить АРОС3 и ангиотензиноген.

АРОС3 является непосредственным участником процесса клиренса и ремоделлинга липопротеоновых частиц высокой и очень низкой плотности (HDL и VLDL). Регуляция экспрессии АРОС3 происходит посредством PPAR/RXR рецепторов, лигандом которых является 9-цис-ретиноевая кислота и полиненасыщенные жирные кислоты, соответственно. Дефицит по этим компонентам приводит к снижению экспрессии гена, кодирующего АРОС3 и, как следствие, снижению клиренса холестерола и триглицеридов из крови. В свою очередь, это приводит к таким вторичным последствия, как повышение активности синтазы жирных кислот (FASN), аккумуляции жирных кислот и снижению активности липротеиновой липазы (LPL), которая является основным ферментом катаболизма триглицеридов. Активность FASN обратно пропорциональна реакции рецепторов инсулина, что отражается на снижении эффективности связывания инсулина с INSR1 рецепторами и его интернализации в клетки. Нарушение регуляции сигналинга с участием инсулина приводит к снижению катаболизма глюкозы и ее утилизации, что выражается в ее накоплении (повышение уровня глюкозы в крови) и быстром автоокислении. Однако процесс автоокисления глюкозы имеет более глубокие последствия, которые выражаются в неизбирательном гликировании белков (в частности, клинический показатель гликированного огемоглобина) и нарушении утилизации таких белков за счет убиквитинирования, что способствует формированию белковых амилоидных бляшек. Именно по это причине в совокупности с аккумуляции липидов и нарушением клиренса холестерола, у пациентов с сахарным диабетом в 63% случае наблюдается развитие ангиопатии и протромбического состояния в течение первых 10 лет после установленного диагноза в случае несоблюдения должного лечения. Это подтверждает необходимость своевременной и точной постановки диагноза в начале течения заболевания для принятия должных мер лечения.

Маркером нарушения гемостаза в заявленном способе служит ангиотензиноген, который является не только участником ренин-ангиотензин-альдостероновой эндокринной оси, но у элементов негативной регуляции гемостаза. Повышение уровня ангиотензина и его производных (в частности, ангиотензина-1-7) является индикатором развития воспалительных процессов. Ангиотензин также является положительным регулятором системы комплимента, развитие которой по классическому пути также отражает активно идущие процессы воспаления. В данном случае, воспалительные процессы обусловлены двумя факторами: во-первых, накоплением активных форм кислорода и азота, продуцентами которых являются глюкозы и ненасыщенных жирные кислоты, синтез которых активно происходит за счет работы FASN; во-вторых, формированием холестериновых и амилодных структур, прежде всего, на стенках сосудистого эндотелия, которые подвергаются механическим повреждениям и, таким образом, способствует развитию воспалительных реакция через активацию различных цитокинов, в том числе, факторов системы комплемента. Ангиотензин, в данном случае, опосредованно поддерживает необходимый уровень активности цитокинов и, соответственно, воспалительной реакции, которая в данном случае во многом обусловлена окислительным стрессом.

Протекающие процессы непосредственно отражаются на архитектуре внеклеточного матрикса, маркеров которых в нашем случае является витронектин, так этот белок выполняет функцию транспорта многих секретируемых белков, в том числе фибулина, с которым он вступает в функциональный комплекс, выполняющий стабилизационную роль в поддержании структурной целостности и ригидности внеклеточного матрикса. Соответственно, снижение экспрессии витронектина снижает стехиометрическое соотношение в сторону свободного фибулина и, таким образом, действует на внеклеточный матрикс. Это увеличивает проницаемость матрикса, снижает эффективность паракринного ответа, влияет на свойства внешней стенки клеточной мембраны (в том числе на ее поляризацию), а также нарушает множество процессов транспорта различных сигнальных элементов к поверхностным рецепторам клетки.

Полученные данные о взаимосвязанных клеточных процессах с учетом полуколичественных величин позволяют определить пределы нормы содержания тех или отдельных маркеров или их сочетаний в различных группах исследования и провести дифференциальные уровни их содержания в группах с сахарным диабетом первого типа.

Таким образом, техническим результатом заявленного изобретения является повышение точности анализа в диагностике сахарного диабета первого типа у беременных женщин, а также расширение арсенала существующих способов анализа в диагностике диабета первого типа.

Технический результат обеспечивает способ выявления сахарного диабета первого типа у беременных, включающий:

- забор образца крови пациента;

- пробоподготовку образца крови пациента с получением аналита;

- определение содержания по меньшей мере одного маркера сахарного диабета первого типа в аналите.

Определение содержания маркеров сахарного диабета первого типа в аналите может осуществляться методами иммуноферментного анализа, хромато-масс-спектрометрии или любыми другими методами, позволяющими определять содержание указанных маркеров.

Например, определение содержания маркеров сахарного диабета первого типа плода в аналите методом хромато-масс-спектрометрии может осуществляться следующим образом.

Для проведения анализа отбирают 1-2 мкл пробы плазмы крови человека. К 2 мкл (около 100 мкг белка) пробы плазмы добавляют 10 мкл денатурирующего раствора, состоящего из 5 М мочевины, 15% ацетонитрила, 0,5% дезоксихолиевой кислоты натриевой соли, 300 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6.0) и 5 мМ ТСЕР (трис-(2-карбоксиэтил)фосфин). Раствор инкубируют при температуре 45°С в течение 20 минут для восстановления сульфогидрильных групп аминокислотных остатков цистеина. Затем добавляют 1,5 мкл раствора 2% 4-винилпиридина в 30% пропан-2-оле до конечной концентрации около 0,2%. Реакцию алкилирования винилпиридином проводят при комнатной температуре (22±2°С) в течение 30 минут. Объем пробы доводят до 100 мкл (расчетная концентрация белка в пробе составляет 1 мкг/мкл) 100 мМ раствором триэтиламмония бикарбоната для достижения реакции среды до рН=7,5-8,5.

Далее проводят ферментативное расщепление белков трипсином, предварительно разведенном в 30 мМ уксусной кислоте до конечной концентрации 200 нг/мкл, в два этапа, на первом из которых добавляют трипсин в соотношении 1:50 (по массе белка), а на втором этапе - аликвоту трипсина, эквивалентную соотношению 1:100 (по массе белка). В обоих случаях реакцию ферментативного гидролиза проводят при температуре 38°С в течение 3-х часов на каждом этапе. Реакцию останавливают путем добавления 2 мкл 10% раствора муравьиной кислоты.

Полученные растворы высушивают под вакуумом при температуре 30°С в режиме V-HV (вакуум, летучие соединения) в течение 40-60 минут. Сухой остаток проб восстанавливают в 100 мкл раствора 0,5% муравьиной кислоты (до конечной концентрации пептидов 1 мкг/мкл). С полученной после восстановления пробой проводят хромато-масс-спектрометрический анализ.

Хроматографическое разделение проводят на системе Ultimate 3000 RSLC Nano (Thermo Scientific) с установленным объемом петли инжектора 5 мкл и коэффициент вымывания пробы из петли - 3 (три полных объема петли перед переключением клапана в режим загрузки). Образцы постоянно термостатируют в пределах температуры +5±0,5°С. На колонку наносят 5 мкл пробы. Скорость отбора пробы 12 мкл/мин, скорость инжекции пробы 15 мкл/мин. Скорость потока аналитического насоса 0,3 мкл/мин, ограничение по давлению не более 800 бар (номинальное ограничение не более 1000 бар) с динамическим ускорением потока при градиенте 0,996 мкл/мин². Коэффициент вязкости на канале «А» - 101%, на канале «В» - 64,7%. Аналитическое время - 55 минут, время уравновешивания 13 минут, общее время анализа 68 минут. Разделение пептидов проводят в градиенте подвижной фазы «А» (водный раствор 0,01% муравьиной кислоты, 0,03% уксусной кислоты, рН=2,5-2,7 в зависимости от температуры раствора в пределах 18-20°С), и подвижная фаза «В» (90% ацетонитрила, 10% метанола, 0,01% муравьиной кислоты, 0.03% уксусной кислоты) на стационарной фазе Acclaim Pepmap® (геометрия 75 мкм × 150 мм, 1,8 мкм, 60А). Начальные условия градиента элюции 98% «А»:2% «В», скорость потока 0,3 мкл/мин, давление на колонку 310-320 бар, скорость загрузки на обогащающую колонку - 15 мкл/мин. В ходе хроматографического разделения применяют динамическое изменение скорости потока до 0,45 мл/мин при высоком относительном содержании подвижной фазы «В» в целях увеличения эффективности промывки колонки от связанных гидрофобных компонентов.

Масс-спектрометрический анализ проводят на гибридном масс-спектрометре высокого разрешения Orbitrap Fusion (Thermo Scientinc) с источником ионизации NS1 в режиме положительной электростатической ионизации и динамическим потенциалом на входной S-линзе. Прекурсорные ионы регистрируют с использованием орбитального масс-анализатора с разрешением 60К в диапазоне m/z 425-1250 с максимальной скоростью накопления ионов - 15 миллисекунд, или минимальным числом интеграции -4е5 ионов. Селекция по зарядному состоянию z=2+…6+, активное динамическое исключение после шести сканов (n=6) в течение 4 секунд длительностью 180 секунд с ассиметричной изоляцией +10/-25 ppm. Пик-зависимая активация сканирования на уровне 40% высоты хроматографического пика при средней величине FWHM=24 секунды и уровнем сигнала к шуму не менее 150. Тандемное сканирование проводят после изоляции через квадруполь с окном изоляции ±0,75 Th со сдвигом 0,5 Th. Тип активации - HCD, относительная энергия активации - 27% с переменным смещением +/-20%. Тип детектора фрагментных ионов -орбитальный с разрешением 15К с максимальным временем накопления 47 миллисекунд, или числом интеграции ионов - 5е4.

Исходные файлы данных (raw-формат, получаемые при записи данных с масс-спектрометров производства Thermo Fisher) были конвертированы mgf-формат с помощью программы MSConvert (ProteomeWizard). Идентификацию проводят против базы данных аминокислотных последовательностей белков (база с аминокислотными последовательностями в формате FASTA с ограничением таксономической группы «Human», доступна на открытом репозитории Uniprot, версия актуализируется каждые 3-4 месяца) с включением обращенных последовательностей для верификации полученных идентификаций. Для проведения поиска в качестве гидролизующего фермента был выбран трипсин (специфическое расщепление по остаткам лизина и аргинина, если в положении Р1 не стоит пролин) с максимальным допустимым числом пропущенных внутренних участков расщепления не более одного. Разрешенные зарядные состояния были от z=2+ до z=6+ с допустимой точностью измерения прекурсорного иона ±5 ppm и допустимой точностью измерения фрагментного иона ±0,01 Да. Переменной модификацией, используемой для поиска и обнаружения, были дезамидирование Q/E, однократное окисление метионина и 4-гидроксипролин. Фиксированной модификацией было пиридилэтилирование 4-винилпиридином. Результаты верифицируют по уровню отсечения FDR=1% (false discovery rate) на основе суммарной частоты ложных положительных результатов для спектров, соответствующих пептидам (PSM, peptide-spectra match).

Качественный состав протеома определяют по идентификациям белков, которые проводили с помощью программного обеспечения Search Gui версии 3.3 (Compomics, Бельгия) по поисковому алгоритму X! Tandem Vengeance версии 12.15.2. Количественный анализ проводят на основании показателя NSAF (нормировании показатель спектральной интенсивности) в выборке общих для группы проб белков после выравнивания по интенсивности опорных спектров. Выборку интересующих белков нормируют по показателям NSAF на сумму их парциального вклада в субпротеоме исследования и выравнивали по отношению к контрольным пробам. Динамические изменения индивидуальных белков анализируют с использованием открытой программы Heatmapper (Канада), а парную кластеризацию - с помощью программы Pairwise Distance (Канада). Изменения рассчитываются по отношению к контрольным пробам или их группе и проверяются на корректность кластеризации к той или иной группе исследования через ранговый коэффициент корреляции Кендала. Численно динамические изменения выражаются в единицах FC (folds change) или в логарифмической величине FC, если изменения превышают FC>10.

В качестве маркера сахарного диабета первого типа в аналите может использоваться белок Angiotensinogen. При этом значение относительного содержания белка при сахарном диабете первого типа составляет не менее 1,29% от общего содержания белков в аналите.

Также в качестве маркера сахарного диабета первого типа в аналите может использоваться белок Apolipoprotein С-III. При этом значение относительного содержания белка при сахарном диабете первого типа составляет не менее 2,91% от общего содержания белков в аналите.

Также заявленный способ может дополнительно включать этап исключения у пациента диагноза «ожирение». В данном случае в качестве маркера сахарного диабета первого типа в аналите может использоваться белок Vitronectin. При этом значение относительного содержания белка при сахарном диабете первого типа составляет не более 0,71% от общего содержания белков в аналите.

Указанный способ позволяет составлять полные и модульные диагностические панели для проведения мониторингового анализа и подтверждающего анализа в диагностике сахарного диабета первого типа.

В случае ранней диагностики и оценки риска развития данной патологии возникает возможность проведения своевременной корректирующей или компенсаторной терапии.

Проведение исследования в формате диагностической панели по предложенным в рамках изобретения маркерам или их сочетаниям возможно в формате иммуноферментного анализа (ИФА) или масс-спектрометрического (МС) анализа. При этом, преимуществами МС анализа является индифферентность к типу белкового маркера, более высокая чувствительность, высокая производительность (возможность проведения анализа за 15-30 минут в расчете на одного пациента), невысокий уровень затрат на анализ, высокая точность измерения сигнала маркеров, возможность составления модульных диагностических панелей без дополнительных финансовых затрат за несколько минут в зависимости от цели проведения анализа (диагностика, наблюдение, подтверждение) без ущерба производительности, а также возможность проведения количественного анализа протеомного профиля пациента, направленного на оценку риска развития сахарного диабета первого типа.

Заявленный способ иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1

Пациентка К., 28 лет, первая нормально протекающая беременность. Наследственность не отягощена. Отмечает в последнее время периодическое чувство слабости, испытывает жажду. При обследовании уровень глюкозы натощак составил 7,5 ммоль/л. Направлена к эндокринологу с предварительным диагнозом сахарный диабет 1 типа.

Показатели глюкозотолерантного теста в 4 точках: 7,4; 14,3; 9,4; 7,7 ммоль/л, соответственно.

На сроке 29 недель проведено протеомное исследование плазмы крови на наличие маркеров диабета 1 типа в соответствии с заявленным способом. Результаты исследования приведены в таблице 3.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что пациент страдает сахарным диабетом 1 типа.

В качестве дополнительного подтверждающего лабораторного исследования методом ИФА определялось содержание антител к бета-клеткам поджелудочной железы, инсулину, глютаматдекарбоксилазе. Результаты исследования приведены в таблице 4.

На основании полученных данных поставлен диагноз - сахарный диабет 1 типа.

Таким образом, использование заявленного способа позволяет осуществлять анализ в диагностике диабета 1 типа с высокой точностью.

Пример 2

Пациентка С., 31 год, первая нормально протекающая беременность. Наследственность не отягощена. Ожирением не страдает. Отмечает в последнее время периодическое чувство слабости, испытывает жажду. При обследовании уровень глюкозы натощак составил 5,9 ммоль/л. Направлена к эндокринологу с предварительным диагнозом сахарный диабет 1 типа.

Показатели глюкозотолерантного теста в 4 точках: 5,9; 7,5; 6,7; 6,1 ммоль/л, соответственно. Постановка диагноза на основании полученных результатов затруднительна.

В целях повышения точности анализа в диагностике сахарного диабета первого типа на сроке 29 недель проведено протеомное исследование плазмы крови на наличие маркеров сахарного диабета 1 типа в соответствии с заявленным способом. Результаты исследования приведены в таблице 5.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что пациент страдает сахарным диабетом 1 типа.

В качестве дополнительного подтверждающего лабораторного исследования методом ИФА определялось содержание антител к бета-клеткам поджелудочной железы, инсулину, глютаматдекарбоксилазе. Результаты исследования приведены в таблице 6.

На основании полученных данных поставлен диагноз - сахарный диабет 1 типа.

Таким образом, использование заявленного способа позволяет повысить точность диагностики диабета 1 типа.

Пример 3

Пациентка Д., 27 лет, вторая нормально протекающая беременность. Наследственность не отягощена. Ожирением не страдает. Отмечает в последнее время периодическое чувство слабости, испытывает жажду. При обследовании уровень глюкозы натощак составил 5,7 ммоль/л. Направлена к эндокринологу с предварительным диагнозом сахарный диабет 1 типа.

Показатели глюкозотолерантного теста в 4 точках: 5,7; 7,5; 6,3; 5,9 ммоль/л, соответственно. Постановка диагноза на основании полученных результатов затруднительна.

В целях повышения точности анализа в диагностике сахарного диабета первого типа на сроке 29 недель проведено протеомное исследование плазмы крови на наличие маркеров сахарного диабета 1 типа в соответствии с заявленным способом. Результаты исследования приведены в таблице 7.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что пациент не страдает сахарным диабетом 1 типа.

В качестве дополнительного подтверждающего лабораторного исследования методом ИФА определялось содержание антител к бета-клеткам поджелудочной железы, инсулину, глютаматдекарбоксилазе. Результаты исследования приведены в таблице 8.

На основании полученных данных исключен диагноз - сахарный диабет 1 типа.

Таким образом, использование заявленного способа позволяет повысить точность диагностики диабета 1 типа.

1. Способ выявления сахарного диабета первого типа у беременных, включающий:

- забор образца крови пациента;

- пробоподготовку образца крови пациента с получением аналита;

- определение содержания в качестве маркера сахарного диабета первого типа в аналите белка Angiotensinogen и/или Apolipoprotein С-III и/или Vitronectin;

и при значении относительного содержания Angiotensinogen не менее 1,29% от общего содержания белков в аналите и/или при значении Apolipoprotein С-III не менее 2,91% от общего содержания белков в аналите и/или при отсутствии у пациента диагноза «ожирение» при значении Vitronectin не более 0,71% от общего содержания белков в аналите выявляют сахарный диабет первого типа.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение содержания маркера сахарного диабета первого типа в аналите проводят методом иммуноферментного анализа.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение содержания маркера сахарного диабета первого типа в аналите проводят методом хромато-масс-спектрометрии.