Микроорганизм рода corynebacterium, продуцирующий l-аминокислоты, и способ получения l-аминокислот с использованием этого микроорганизма

Группа изобретений относится к микроорганизму рода Corynebacterium, продуцирующему L-аминокислоты, и способу получения L-аминокислот с использованием этого микроорганизма. Предложен микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования L-аминокислоты, в котором активность белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, инактивирована. При этом указанный микроорганизм рода Corynebacterium демонстрирует повышенную продуктивность в отношении L-аминокислоты, по сравнению с родительским или немодифицированным микроорганизмом рода Corynebacterium, в котором белок экспрессируется от природы. Также предложен способ получения L-аминокислоты, включающий культивирование указанного микроорганизма в среде и выделение L-аминокислоты из микроорганизма или среды. Группа изобретений обеспечивает продукцию L-аминокислоты с высоким выходом. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 10 табл., 12 пр.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к микроорганизму рода Corynebacterium, продуцирующему L-аминокислоты, и способу получения L-аминокислот с использованием этого микроорганизма.

Предшествующий уровень техники

L-аминокислоты представляют собой структурные единицы белков и используются в качестве важных веществ для лекарственных препаратов, пищевых добавок, кормов для животных, питательных веществ, пестицидов, бактерицидов и так далее. Среди L-аминокислот L-лизин представляет собой незаменимую аминокислоту, которая не синтезируется в живом организме и, как известно, является необходимой для стимуляции роста, метаболизма кальция, стимуляции выделения желудочного сока и устойчивости к заболеваниям. L-лизин широко используется в кормах, медицинских продуктах, продуктах питания и так далее. Кроме того, L-валин также представляет собой одну из незаменимых аминокислот и, как известно, обладает антиоксидантным действием и эффектом непосредственного стимулирования синтеза белка мышечных клеток. L-валин используют в лекарственных добавках, медицинских продуктах, продуктах питания, кормах, ароматизирующих веществах, кондиционерах для волос и кожи и так далее.

Между тем известно, что штамм рода Corynebacterium, особенно Corynebacterium glutamicum, представляет собой грамположительный микроорганизм, часто применяемый в получении L-аминокислот и других полезных веществ. Были проведены многочисленные исследования для создания микроорганизма с высокой эффективностью продуцирования и технологии ферментирования для получения аминокислот. Например, в основном используются подходы применительно к конкретному веществу-мишени для повышения экспрессии гена, кодирующего фермент, вовлеченный в биосинтез аминокислоты, или для удаления генов, не являющихся необходимыми в биосинтезе аминокислоты у штамма рода Corynebacterium (патенты Кореи №10-0924065 и 1208480). В дополнение к этим способам также используют способ делетирования генов, которые не вовлечены в продуцирование аминокислоты, и способ делетирования генов, конкретные функции которых в продуцировании аминокислоты неизвестны. Однако все еще существует потребность в изыскании способа, позволяющего эффективно получать L-аминокислоты с высоким выходом.

На основании этого уровня техники, авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования для создания микроорганизма, способного продуцировать L-аминокислоты с высоким выходом, и в результате они обнаружили, что когда инактивируется конкретный ген, выходы продукции L-аминокислот повышаются, тем самым создав настоящее изобретение.

Техническая задача

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-аминокислоты, где активность белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, инактивирована.

Другая задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения L-аминокислот с использованием этого микроорганизма.

Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить применение микроорганизма для повышения продуктивности по L-аминокислот.

Еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ усиления продуктивности по L-аминокислот, включающий: инактивацию активности белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 по настоящему изобретению, у микроорганизма рода Corynebacterium.

Техническое решение

Ниже настоящее изобретение будет описано подробно. При этом описания и воплощения, раскрытые здесь, также можно применять к другим описаниям и воплощениям. Другими словами, все комбинации различных элементов, раскрытых здесь, входят в объем настоящего изобретения. При этом объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными раскрытиями, описанными ниже.

Для выполнения указанных выше задач в одном аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-аминокислоты, где активность белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, инактивирована.

При использовании здесь, термин «L-аминокислота» может включать все L-аминокислоты, которые могут быть продуцированы микроорганизмом из многих видов источников углерода посредством метаболических процессов. Более точно, L-аминокислота может включать основные аминокислоты, такие как L-лизин, L-аргинин, L-гистидин и так далее, неполярные аминокислоты, такие как L-валин, L-лейцин, L-глицин, L-изолейцин, L-аланин, L-пролин, L-метионин и так далее, полярные аминокислоты, такие как L-серин, L-треонин, L-цистеин, L-аспарагин, L-глутамин и так далее, ароматические аминокислоты, такие как L-фенилаланин, L-тирозин, L-триптофан и так далее, кислые аминокислоты, такие как L-глутаминовая кислота, L-аспарагиновая кислота, алифатические аминокислоты, такие как L-аланин, L-валин, L-изолейцин, L-серин и так далее, и аминокислоты с разветвленной цепью, такие как L-валин, L-лейцин, L-изолейцин и так далее. В настоящем изобретении L-аминокислота может представлять собой, более точно, основные аминокислоты, алифатические аминокислоты, аминокислоты с разветвленной цепью и, еще более точно, L-лизин или L-валин, но не ограничиваясь этим. L-аминокислота может включать любую аминокислоту без ограничения, если ее продуктивность повышается, когда активность белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 по настоящему изобретению, инактивирована.

При использовании здесь, термин «белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1» относится к белку, который, будучи кодированным геном NCg10275, присутствующим от природы у микроорганизма рода Corynebacterium, и, более точно, регуляторному белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, который от природы присутствует у микроорганизма рода Corynebacterium. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 и полинуклеотидная последовательность гена, кодирующего белок, могут быть получены из известной базы данных, например GenBank NCBI и так далее, но не ограничивается этим. Кроме того, белок может представлять собой белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, белок, по существу состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, но не ограничиваясь этим.

Также, белок по настоящему изобретению может состоять из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более гомологию с SEQ ID NO: 1, а также из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более гомологию с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, может включать белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более, конкретно 83% или более, 84% или более, 88% или более, 90% или более, 93% или более, 95% или более, или 97% или более, гомологию или идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Очевидно, что любая аминокислотная последовательность, имеющая делецию, модификацию, замену, консервативную замену или добавление в части последовательности также включена в качестве аминокислотной последовательности, имеющей гомологию или идентичность с последовательностью, в объем настоящего изобретения, пока она представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую биологическую активность, по существу идентичную или соответствующую таковой у аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

В настоящем изобретении, даже при описании как «белок или полипептид, состоящий из конкретной SEQ OD NO», такой белок очевидным образом входит в объем настоящего изобретения, хотя он может содержать белок, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой, консервативной заменой или вставкой в части последовательности, пока белок имеет активность такую же или соответствующую активности полипептида, который состоит из аминокислотной последовательности соответствующей SEQ ID NO. Даже когда полипептид содержит аминокислотную последовательность соответствующей SEQ ID NO, он очевидным образом входит в объем настоящего изобретения.

Кроме того, зонд, который может быть получен из известной последовательности гена, например, последовательности, кодирующей белок, имеющей активность белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, путем гибридизации в жестких условиях с комплементарной последовательностью до полной или части полинуклеотидной последовательности, может быть включен без ограничения.

Например, белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, может кодироваться геном, включающим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. Кроме того, белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, может кодироваться геном, включающим полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, геном, по существу состоящим из полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, или геном, состоящим из полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, но не ограничиваясь этим.

Кроме того, полинуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2 может включать полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с SEQ ID NO: 2, а также полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.

Более точно, любая полинуклеотидная последовательность включена в объем настоящего изобретения, пока она может кодировать белок, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с SEQ ID NO: 1. Белок может кодироваться геном, включающим полинуклеотидную последовательность, имеющую 80% или более, конкретно 83% или более, 84% или более, 88%) или более, 90% или более гомологию, 93% или более, 95% или более, или 97% или более гомологию или идентичность с полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2.

Очевидно, что в полинуклеотидную последовательность SEQ ГО NO: 2 также включены полинуклеотиды, транслированные в белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ГО NO: 1, или белок, имеющий гомологию с ним вследствие вырожденности кодона. Зонд, полученный из известной нуклеотидной последовательности, например, любой последовательности, которая гибридизуется с последовательностью, комплементарной всей или части полинуклеотидной последовательности, в жестких условиях, для кодирования белка, имеющего активность белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, также может быть включен без ограничения. «Жесткие условия» означают условия, при которых обеспечивается возможность специфической гибридизации между полинуклеотидами. Такие условия более точно описаны в литературе (например J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; EM. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). Жесткие условия могут включать, например, условия, при которых гены, имеющие высокую гомологию, 40% или более высокую гомологию, более точно 90% или более высокую гомологию, еще более точно 95% или более высокую гомологию, еще более точно 97% или более высокую гомологию, еще гораздо более точно 99% или более высокую гомологию, гибридизуются друг с другом, и гены, имеющие гомологию ниже приведенной выше гомологии, не гибридизуются друг с другом, или обычные условия промывания Саузерн-гибридизации, то есть промывание один раз, более точно два или три раза при концентрации солей и температуре, соответствующим 60°С, ×SSC, 0,1% SDS, более точно, 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS и еще более точно 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS. Для гибридизации требуется, чтобы два полинуклеотида содержали комплементарные последовательности, хотя, в зависимости от жесткости гибридизации, возможны ошибки спаривания между основаниями. Термин «комплементарный» используют для описания взаимоотношений между нуклеотидными основаниями, которые поддаются гибридизации друг с другом. Например, что касается ДНК, аденозин комплементарен тимину и цитозин комплементарен гуанину. Следовательно, настоящее изобретение также может включать выделенный фрагмент полинуклеотида, комплементарный полной последовательности, а также полинуклеотидную последовательность, по существу подобную ей.

Более точно, полинуклеотид, имеющий гомологию, может быть обнаружен с использованием условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении Т пл. 55°С при описанных выше условиях. Кроме того, значение Т пл. может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничиваясь этим, и соответствующим образом регулируется специалистом в данной области техники в зависимости от его цели.

При использовании здесь, термин «гомология» или «идентичность» относится к степени совпадения с данной аминокислотной последовательностью или полинуклеотидной последовательностью, и гомология может выражаться в виде процента. Термины «гомология» и «идентичность» часто используют взаимозаменяемо друг с другом. В настоящем изобретении гомология последовательности, имеющей активность, которая идентична или подобна данной аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности, выражается в виде «% гомологии».

Гомологию или идентичность с аминокислотной или полинуклеотидной последовательностью можно определять посредством, например, алгоритма BLAST [смотри Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)] или FASTA от Pearson [смотри Methods Enzymol., 183, 63(1990)]. На основе этого алгоритма BLAST была разработана программа, названная BLASTN или BLASTX [смотри http://www.ncbi.nlm.nih.gov].

Кроме того, гомология, подобие или идентичность между аминокислотными или полинуклеотидными последовательностями может быть определена путем сравнения последовательностей с использованием саузерн-гибридизации в жестких условиях.

Жесткие условия являются частью состава соответствующей технологии и могут быть определены с помощью способа, понятного специалисту в данной области техники (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

При использовании здесь, выражение «активность белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, инактивирована» означает, что белок не экспрессируется совсем или белок экспрессируется, но проявляет отсутствие активности или снижение активности по сравнению с таковой у нативного штамма дикого типа, родительского штамма, или с активностью штамма, не имеющего модификацию в белке, состоящем из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. При этом снижение относится к понятию, включающему случай, когда активность самого белка ниже активности белка, имеющейся у микроорганизма в природном состоянии, вследствие модификации или делеции гена, кодирующего белок, случай, когда уровень суммарной активности белка в клетках ниже такового у нативного штамма или у штамма до модификации вследствие ингибирования экспрессии или трансляции гена, кодирующего белок, или их комбинации.

В настоящем изобретении инактивация может быть достигнута посредством различных, хорошо известных в данной области техники способов. Примеры способов могут включать 1) способ делетирования целого или части гена, кодирующего белок; 2) способ модификации последовательности регуляции экспрессии таким образом, чтобы снизить экспрессию гена, кодирующего белок; 3) способ модификации последовательности гена, кодирующего белок таким образом, чтобы активность белка была устранена или ослаблена; 4) способ введения антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего белок; 5) способ, делающий присоединение рибосомы невозможным посредством образования вторичной структуры путем добавления последовательности Шайна-Дальгарно и комплементарной ей последовательности на переднем конце последовательности Шайна-Дальгарно гена, кодирующего белок; 6) способ обратной транскрипции (RTE), при котором добавляют промотор для обеспечения обратной транскрипции на 3'-конце открытой рамки считывания (ORF) полинуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок, и так далее, и могут также включать их комбинацию, но конкретно не ограничиваясь этим.

Более точно, способ делетирования части или целого гена, кодирующего белок, может быть осуществлен путем замены полинуклеотида, кодирующего эндогенный белок-мишень на хромосоме, на полинуклеотид или маркерный ген, где часть нуклеотидной последовательности делетирована, с помощью вектора для вставки хромосомы в микроорганизм. В типичном воплощении способа делетирования части или целого полинуклеотида можно использовать способ делетирования полинуклеотида посредством гомологичной рекомбинации, но не ограничиваясь этим. В другом типичном воплощении способа делетирования части или целого полинуклеотида можно индуцировать мутацию с использованием света, такого как УФ, или химических веществ и из полученных мутантов отобрать штамм, имеющий делетированный ген-мишень.

Способ делетирования гена может включать способ с использованием методики генетической рекомбинации. Например, полинуклеотидная последовательность или вектор, включающий полинуклеотидную последовательность, имеющую гомологию с геном-мишенью, вводят в микроорганизм с целью вызвать гомологичную рекомбинацию. Также, полинуклеотидная последовательность или вектор, подлежащие введению, могут включать доминантный селективный маркер, но не ограничиваясь этим.

Далее, способ модификации последовательности регулирования экспрессии можно осуществлять путем использования целого ряда способов, хорошо известных в данной области техники. Например, способ может быть осуществлен путем индуцирования модификации последовательности регуляции экспрессии в полинуклеотидной последовательности с помощью делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации для дополнительного ослабления активности последовательности регуляции экспрессии, или путем замены последовательности регуляции экспрессии на полинуклеотидную последовательность, имеющую более слабую активность. Последовательность регуляции экспрессии может включать промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую участок связывания с рибосомой, и последовательности, регулирующие терминацию транскрипции и трансляции, но не ограничиваясь этим.

Кроме того, способ модификации нуклеотидной последовательности может быть выполнен путем индуцирования модификации в последовательности с помощью делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации в нуклеотидной последовательности для дополнительного ослабления активности фермента, или путем замены нуклеотидной последовательности на нуклеотидную последовательность, которую улучшали для того, чтобы иметь более слабую активность, или нуклеотидную последовательность, которую улучшали с тем, чтобы не иметь активности, но не ограничиваясь этим.

При использовании здесь, термин «микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоты» может относиться к микроорганизму, по природе имеющему способность продуцировать L-аминокислоты, или микроорганизму, который получен путем придания способности продуцировать L-аминокислоты родительскому штамму, не имеющему способности продуцировать L-аминокислоты. Например, микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоты, может представлять собой микроорганизм, в котором активность белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, инактивирована. Дополнительно, микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоты, может представлять собой микроорганизм, у которого экспрессия гена, кодирующего фермент, вовлеченный в пути биосинтеза L-аминокислот, повышена или фермент, вовлеченный в пути биодеградации, инактивирован. Альтернативно, микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоты, может представлять собой микроорганизм, полученный посредством инактивации активности белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 в родительском штамме, у которого экспрессия гена, кодирующего фермент, вовлеченный в пути биосинтеза L-аминокислот, повышена или фермент, вовлеченный в пути биодеградации, инактивирован. Микроорганизм, продуцирующий L-аминокислоты, может быть получен посредством применения различных известных способов.

В настоящем изобретении «микроорганизм Corynebacterium}} может включать все микроорганизмы рода Corynebacterium, более точно, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniaгенов, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris или Corynebacterium flavescens и, еще более точно, может представлять собой Corynebacterium glutamicum.

Микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-аминокислоты, у которого активность белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 по настоящему изобретению, инактивирована, может представлять собой микроорганизм, у которого продуктивность по L-аминокислоте повышена. Более точно, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, имеющий повышенную продуктивность по L-аминокислоте по сравнению с немодифицированным штаммом. Немодифицированный штамм может представлять собой нативный штамм дикого типа, родительский штамм или немодифицированный штамм, у которого белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, не инактивирован.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения L-аминокислот, включающий стадии культивирования микроорганизма согласно настоящему изобретению в среде; и выделение L-аминокислот из микроорганизма или среды.

Микроорганизм согласно настоящему изобретению такой же, как описано выше.

В способе по настоящему изобретению культивирование микроорганизма рода Corynebacterium можно осуществлять с использованием любых условий культивирования и способа, известного в данной области техники.

При использовании здесь, термин «культивирование» означает, что микроорганизму обеспечивается возможность для роста в искусственно регулируемых условиях окружающей среды. В настоящем изобретении способ получения L-аминокислот с использованием микроорганизма, продуцирующего L-аминокислоты, может быть выполнен с использованием способа, широко известного в данной области техники. Более точно, культивирование может быть выполнено посредством периодического процесса, периодического процесса с подпиткой или повторяющегося периодического процесса с подпиткой непрерывным образом, но не ограничиваясь этим. Любую среду для культивирования можно использовать без ограничения, например, культуральная среда для штаммов Corynebacterium известна в данной области техники (например, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981).

Источники углерода, используемые в среде, могут включать сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как этиловый спирт и глицерин; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти вещества можно использовать по отдельности или в смеси, но не ограничиваясь этим.

Пригодные источники азота могут включать пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевый жмых и мочевину или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота также можно использовать по отдельности или в смеси, но не ограничиваясь этим.

Пригодные источники фосфора могут включать однозамещенный фосфат калия или гидроортофосфат калия или соответствующие натрийсодержащие соли. Кроме того, культуральная среда может включать соль металла, такую как сульфат магния или сульфат железа, которая требуется для роста. Кроме того, в дополнение к описанным выше веществам, можно использовать незаменимые факторы роста, такие как аминокислоты и витамины, но не ограничиваясь этим. Дополнительно, можно использовать предшественники, подходящие для культуральной среды. Эти вещества могут быть надлежащим образом добавлены к культуре во время культивирования периодическим или непрерывным образом, но не ограничиваясь этим.

Основные соединения, такие как гидроксид натрия, гидроксид калия или аммиак, или кислые соединения, такие как фосфорная кислота или серная кислота, можно добавлять во время культивирования микроорганизма подходящим образом, посредством этого регулируя pH культуральной среды. Кроме того, можно использовать пеногаситель, такой как полигликолевый эфир жирной кислоты, для подавления образования пузырьков. Для поддержания аэробных условий в культуру можно вводить кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух), но не ограничиваясь этим. Температура культуральной среды обычно может составлять от 20°С до 45°С, более точно от 25°С до 40°С. Культивирование можно продолжать до получения желаемого количества L-аминокислоты, и обычно оно может выполняться в течение от 10 часов до 160 часов, но не ограничиваясь этим.

L-аминокислоты могут быть выделены из культуральной среды посредством обычного способа, известного в данной области техники. Способы выделения могут включать центрифугирование, фильтрование, хроматографию, кристаллизацию и так далее. Например, супернатант, полученный путем центрифугирования культуральной среды при низкой скорости и удаления биомассы, можно разделять посредством ионообменной хроматографии, но не ограничиваясь этим.

Стадия выделения может дополнительно включать процесс очистки.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение микроорганизма рода Corynebacterium для повышения продуктивности по L-аминокислотам, где активность белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, инактивирована.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ повышения продуктивности по L-аминокислотам, включающий: инактивацию активности белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, у микроорганизма рода Corynebacterium.

Полезные эффекты изобретения

Микроорганизм по настоящему изобретению, продуцирующий L-аминокислоты, может продуцировать L-аминокислоты с высоким выходом. Кроме того, полученные L-аминокислоты можно применять для целого ряда продуктов, таких как пищевые продукты или пищевые добавки для людей или медицинские продукты, а также корма или кормовые добавки для животных.

Воплощение изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры. Однако эти Примеры предназначены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1: Получение библиотеки случайных мутаций с использованием транспозона

Для получения штамма, имеющего улучшенную продуктивность по лизину, была получена векторная библиотека следующим способом.

Сначала плазмиду, полученную с использованием набора EZ-Tn5™<R6Kγ или i/KAN-2>Tnp Transposome™ (Epicentre), трансформировали в Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (патент Кореи №10-0159812; этот микроорганизм был раскрыт в виде KFCC10881 и повторно депонирован в международном органе депонирования, в соответствии с Будапештским договором, с депозитарным номером доступа КССМ11016Р) в качестве родительского штамма посредством способа электрического импульса (Appl. Microbiol. Biothcenol. 52:541-545, 1999), и наносили мазками по планшету с комплексной средой, содержащей канамицин (25 мг/л), с получением примерно 20000 колоний.

Планшет с комплексной средой (pH 7,0) 10 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г мясного экстракта, 5 г дрожжевого экстракта, 18,5 г сердечно-мозговой вытяжки, 2,5 г NaCl, 2 г мочевины, 91 г сорбита, 20 г агара (в расчете на 1 л дистиллированной воды).

Пример 2: Скрининг библиотеки случайных мутаций с использованием транспозона

Каждую из примерно 20000 колоний, полученных в Примере 1, инокулировали в 300 мкл приведенной ниже селективной среды и культивировали в 96-луночных планшетах с глубокими лунками при 32°С при 1000 об/мин в течение примерно 24 часов.

Селективная среда (pH 8,0)

10 г глюкозы, 5,5 г сульфата аммония, 1,2 г MgSO₄ 7H₂O, 0,8 г КН₂РО₄, 16,4 г K₂HPO₄, 100 мкг г биотина, 1 мг г тиамина HCl, 2 мг г кальция пантотенат, 2 мг г никотинамида (в расчете на 1 л дистиллированной воды)

Для анализа количества L-лизина, продуцированного в культуральной среде, использовали нингидриновый способ (Moore, S., Stein, W.H., Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem. 1948, 176, 367-388).

После завершения культивирования приводили во взаимодействие 10 мкл культурального супернатанта и 190 мкл раствора для нингидриновой реакции при 65°С в течение 30 минут. После этого измеряли поглощение при длине волны 570 нм с использованием спектрофотометра, и было отобрано примерно 60 типов колоний, показывающих высокое поглощение по сравнению со штаммом Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р, который представляет собой контрольную группу. Было подтверждено, что другие колонии показывают подобное или пониженное поглощение по сравнению с таковым у штамма Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р, используемого в качестве контрольной группы.

60 типов отобранных штаммов культивировали таким же образом, как описано выше, и нингидриновую реакцию проводили в повторах. В результате были отобраны лучшие 10 мутантных штаммов, имеющих улучшенную продуктивность по L-лизину по сравнению со штаммом Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р в качестве родительского штамма.

Пример 3: Анализ продуктивности по L-лизину отобранных мутантных штаммов

Для окончательного отбора штаммов, имеющих повышенную продуктивность по L-лизину, культивирование выполняли посредством приведенного ниже способа для 10 типов мутантных штаммов, отобранных в Примере 2. Каждый из штаммов инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 25 мл посевной среды, и культивировали при встряхивании при 30°С и 200 об/мин в течение 20 часов. После этого 1 мл посевной культуры инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 24 мл среды для продуцирования, и культивировали при встряхивании при 32°С и 200 об/мин в течение 72 часов. Каждая из посевной среды и среды для продуцирования имеет приведенные ниже составы. После завершения культивирования анализировали концентрации L-лизина в культуральной среде с использованием ВЭЖХ (Waters, 2478); концентрации L-лизина каждого мутантного штамма показаны в Таблице 1 ниже.

Посевная среда (pH 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1 мг тиамина HCl, 2 мг пантотената кальция, 2 мг никотинамида (в расчете на 1 л дистиллированной воды)

Среда для продуцирования (pH 7,0)

100 г глюкозы, 40 г (NH₄)₂SO₄, 2,5 г соевого белка, 5 г твердой фракции кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г KH₂PO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1 мг тиамина HCl, 2 мг пантотената кальция, 3 мг никотинамида, 30 г СаСО₃ (в расчете на 1 л дистиллированной воды)

Среди 10 типов отобранных мутантов, приведенных выше, KCCM11016P/mt-3 был отобран окончательно в качестве штамма, имеющего значительно улучшенную продуктивность по L-лизину.

Пример 4: Установление причины повышенной продуктивности по L-лизину у окончательно отобранных штаммов

В этом Примере у мутантных штаммов, окончательно отобранных в Примере 3, идентифицировали гены, которые делетированы вследствие случайной вставки транспозона.

Геномную ДНК KCCM11016P/mt-3, показывающего самую лучшую продуктивность по L-лизину, выделяли и затем расщепляли. После этого полученные в результате фрагменты лигировали, трансформировали в Е. coli DH5α и затем высевали на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). После отбора 20 типов трансформированных колоний получали плазмиды, содержащие части неизвестных генов, и нуклеотидные последовательности анализировали с использованием праймера 1 (SEQ ID NO: 3) и праймера 2 (SEQ ID NO: 4) в EZ-Tn5™<R6Kγ или в наборе i/KAN-2>Tnp Transposome™.

В результате было подтверждено, что полинуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2 делетирована. Было подтверждено, что полинуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2 кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и что полинуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2 представляла собой регуляторный белок, функции которого недостаточно ясно раскрыты, на основе нуклеотидной последовательности, о которой сообщалось в Genbank Национального Института Здоровья США (NIH, USA).

Праймер 1 (SEQ ID NO: 3): ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC

Праймер 2 (SEQ ID NO: 4): CTACCCTGTGGAACACCTACATCT

Соответственно, для подтверждения того, влияет ли инактивация активности белка на продуктивность по L-лизину, этот ген был отобран в качестве гена-кандидата для делеции.

Пример 5: Конструирование рекомбинантного вектора для делеции гена

В этом Примере для подтверждения того, влияет ли инактивация белка, состоящего из аминокислотой последовательности SEQ ID NO: 1, на продуцирование L-лизина, конструировали рекомбинантную плазмиду для делеции гена, отобранного в Примере 4, на хромосоме продуцирующего L-лизин микроорганизма рода Corynebacterium. С этой целью были синтезировали праймеры 3-6, как показано в приведенной ниже Таблице 2.

Более подробно, для делетирования ORF (открытой рамки считывания) (SEQ ID NO: 2) генаHaNCg10275 синтезировали праймер 3 (SEQ ID NP: 5), праймер 4 (SEQ ID NO: 6), праймер 5 (SEQ ID NO: 7) и праймер 6 (SEQ ID NO: 8) (Таблица 2) с получением сайтов рестрикции EcoRI и Sail в 5'- и 3'-концах, соответственно, и геномную ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 дикого типа использовали в качестве матрицы для выполнения ПЦР (Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1989).

В результате были амплифицированы фрагменты ДНК 500 п.н., соответствующие участкам гена по ходу транскрипции и против хода транскрипции. При этом условия ПЦР следующие: 30 циклов, где каждый состоит из денатурации при 95°С в течение 30 секунд; отжига при 50°С в течение 30 секунд; и элонгации при 72°С в течение 1 минуты с последующей элонгацией при 72°С в течение 7 минут. Вектор pDZ (патент Кореи №10-0924065), который не реплицируется в Corynebacterium glutamicum, и фрагменты ДНК, амплифицированные посредством ПЦР, обрабатывали с помощью ферментов рестрикции EcoRI и Sail для вставки в хромосому, лигировали друг с другом, используя ДНК-лигазу, трансформировали в Е. coli DH5α и затем высевали на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л).

После отбора колоний, трансформированных с помощью плазмиды, в которую был вставлен посредством ПЦР желаемый ген, с использованием способа выделения плазмид получали плазмиду и обозначали как pDZ-ΔNCg10275.

Пример 6: Получение штамма с делетированным NCg10275 из Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р и оценка его продуктивности по L-лизину

На основе штамма КССМ11016Р, который представляет собой репрезентативный продуцирующий L-лизин штамм рода Corynebacterium, получали штамм с делетированным NCg10275, отобранный из приведенных выше, и приступили к оценке его продуктивности по L-лизину.

Более подробно, рекомбинантную плазмиду pDZ-ANCg10275,

сконструированную в Примере 5, трансформировали в продуцирующий L-лизин-Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р путем гомологичной рекомбинации на хромосоме (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999).

После этого выполняли вторичную рекомбинацию на планшете с твердой средой, содержащей 4% сахарозы. Хромосомную делецию гена SEQ ID NO: 2 в трансформанте Corynebacterium glutamicum, в котором была завершена вторичная рекомбинация, подтверждали посредством ПЦР с использованием праймера 3 и праймера 6. Рекомбинантный штамм обозначали как Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р-NCg10275.

Для анализа продуктивности по L-лизину полученного штамма Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-NCg10275 также культивировали родительский штамм (то есть штамм Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р) посредством следующего способа.

Каждый из Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р в качестве родительского штамма и Corynebacterium glutamicum KCCM11016P-NCg10275, полученного в Примере 6, инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 25 мл приведенной ниже посевной среды, и культивировали при встряхивании при 30°С и 200 об/мин в течение 20 часов. После этого 1 мл посевной культуры инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 24 мл среды для продуцирования, и культивировали при встряхивании при 30°С и 200 об/мин в течение 72 часов. Составы посевной среды и среды для продуцирования такие, как показано ниже, соответственно.

Посевная среда (pH 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1 мг тиамина HCl, 2 мг пантотената кальция, 2 мг никотинамида (в расчете на 1 л дистиллированной воды)

Среда для продуцирования (pH 7,0)

100 г глюкозы, 40 г (NH₄)₂SO₄, 2,5 г соевого белка, 5 г твердой фракции кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г KH₂PO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1 мг тиамина HCl, 2 мг пантотената кальция, 3 мг никотинамида, 30 г CaCO₃ (в расчете на 1 л дистиллированной воды)

После завершения культивирования измеряли продуцирование L-лизина с использованием ВЭЖХ и концентрации L-лизина, анализированные таким образом, представили в Таблице 3 ниже.

Как показано в приведенных выше результатах, когда NCg10275 был делетирован у L-лизин-продуцирующего Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р, продуктивность по L-лизину повышалась на 17,2% по сравнению со средним, в сравнении с таковой у родительского штамма.

Соответственно, было подтверждено, что продуктивность по L-лизину улучшалась посредством инактивации белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, у микроорганизма рода Corynebacterium.

Кроме того, штамм KCCM11016P-NCg10275 обозначали как СА01-7512 и депонировали в Корейском Центре Культур Микроорганизмов (КССМ), в международном органе депонирования, в соответствии с Будапештским договором, с депозитарным номером доступа КССМ12153Р 7 ноября 2017.

Пример 7: Получение штамма с делетированным NCg10275 из Corynebacterium glutamicum КССМ11347Р и оценка его продуктивности по L-лизину

Для изучения того, проявляются ли приведенные выше эффекты также у других продуцирующих L-лизин штаммов Corynebacterium glutamicum, штамм с делетированным NCg10275 получали из продуцирующего L-лизин Corynebacterium glutamicum КССМ11347Р (патент Кореи №10-0073610; этот микроорганизм был раскрыт как KFCC10750 и повторно депонирован в международном органе депонирования в соответствии с Будапештским договором с номером доступа КССМ11347Р) таким же образом, как в Примере 6, и обозначали как КССМ11347Р-NCg10275.

После этого штамм культивировали таким же образом, как в Примере 6. После завершения культивирования измеряли продуцирование L-лизина с использованием ВЭЖХ, и концентрации L-лизина, анализированные таким образом, представлены в Таблице 4 ниже.

Как показано в приведенных выше результатах, было подтверждено, что когда ген NCg10275 был делетирован у продуцирующего L-лизин Corynebacterium glutamicum КССМ11347Р, продуктивность по L-лизину повышалась на 13,6% по сравнению со средним.

Соответственно, как и в результате Примера 6, было подтверждено, что продуктивность по L-лизину улучшалась посредством инактивации белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, у микроорганизма рода Corynebacterium, по сравнению с немодифицированным микроорганизмом.

Пример 8: Получение штамма с делетированным NCg10275 из Corynebacterium glutamicum КССМ10770Р и оценка его продуктивности по L-лизину

Для изучения того, проявляются ли приведенные выше эффекты также у других продуцирующих L-лизин штаммов Corynebacterium glutamicum, штамм с делетированным NCg10275 получали из продуцирующего L-лизин Corynebacterium glutamicum КССМ10770Р (патент Кореи №10-0924065) таким же образом, как в Примере 6, и обозначали как KCCM10770P-NCg10275.

После этого штамм культивировали таким же образом, как в Примере 6. После завершения культивирования измеряли продуцирование L-лизина с использованием ВЭЖХ, и концентрации L-лизина, анализированные таким образом, представлены в Таблице 5 ниже.

Как показано в приведенных выше результатах, было подтверждено, что когда ген NCg10275 был делетирован у продуцирующего L-лизин Corynebacterium glutamicum КССМ10770Р, продуктивность по L-лизину повышалась на 14,6% по сравнению со средним.

Соответственно, как и в результате Примера 7, это подтверждало, что продуктивность по L-лизину можно улучшать посредством инактивации белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, у различных L-продуцирующих лизин микроорганизмов рода Corynebacterium, по сравнению с родительским штаммом.

Пример 9: Получение штамма с делетированным NCg10275 из Corynebacterium glutamicum CJ3P и оценка его продуктивности по L-лизину

Для изучения того, проявляются ли приведенные выше эффекты также у других продуцирующих L-лизин штаммов Corynebacterium glutamicum, штамм с делетированным NCg10275 получали из продуцирующего L-лизин Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40) таким же образом, как в Примере 6, и обозначали как CJ3P-NCg10275.

После этого штамм культивировали таким же образом, как в Примере 6. После завершения культивирования измеряли продуцирование L-лизина с использованием ВЭЖХ, и концентрации L-лизина, анализированные таким образом, показаны в Таблице 6 ниже.

Как показано в приведенных выше результатах, было подтверждено, что когда ген NCg10275 был делетирован у продуцирующего L-лизин Corynebacterium glutamicum CJ3P, продуктивность по L-лизину повышалась на 15,8% по сравнению со средним.

Соответственно, как и в результатах Примеров 6-8, это подтверждало, что продуктивность по L-лизину может быть улучшена посредством инактивации белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, у различных продуцирующих L-лизин микроорганизмов рода Corynebacterium.

Пример 10: Получение штамма с делетированным NCg10275 из Corynebacterium glutamicum КССМ11201Р и оценка его продуктивности по L-валину

Изучали, улучшается ли продуктивность по валину также при делетировании гена NCg10275 у Corynebacterium glutamicum, имеющего продуктивность по L-валину помимо продуктивности по L-лизину.

Рекомбинантную плазмиду pDZ-ANCg10275, сконструированную в Примере 5, трансформировали в Corynebacterium glutamicum КССМ11201Р (патент Кореи №10-1117022), продуцирующий L-валин, путем гомологичной рекомбинации на хромосоме (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). После этого выполняли вторичную рекомбинацию на планшете с твердой средой, содержащей 4% сахарозы. Штамм, у которого ген NCg10275 был делетирован на хромосоме, получали из трансформанта Corynebacterium glutamicum, в котором была выполнена вторичная рекомбинация, посредством ПЦР с использованием праймера 3 и праймера 6. Рекомбинантный штамм был обозначен как Corynebacterium glutamicum КССМ11201Р-NCg10275.

Для анализа продуктивности по L-валину у полученного штамма, штамм культивировали способом, как описано ниже, и анализировали компоненты культуральной среды. Штамм инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 25 мл среды для продуцирования, и культивировали при встряхивании при 30°С и 200 об/мин в течение 72 часов. После этого измеряли концентрации L-валина с использованием ВЭЖХ, и концентрации L-валина, анализированные таким образом, представлены в Таблице 7 ниже.

Среда для продуцирования (pH 7,0)

100 г глюкозы, 40 г сульфата аммония, 2,5 г соевого белка, 5 г твердой фракции кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г двухосновного фосфата калия, 0,5 г гептагидрата сульфата магния, 100 мкг биотина, 1 мг тиамина HCl, 2 мг пантотената кальция, 3 мг никотинамида, 30 г карбоната кальция (в расчете на 1 л дистиллированной воды)

Как показано в приведенных выше результатах, было подтверждено, что продуктивность по L-валину штамма KCCM11201P-NCg10275 повышалась на 25,0% по сравнению с таковой у контрольной группы. То есть это подтверждало, что продуктивность по L-валину может быть улучшена путем делетирования гена NCg10275 у микроорганизмов рода Corynebacterium.

Это также подтверждало, что продуктивность по различным L-аминокислотам может быть улучшена путем инактивации белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, у микроорганизмов рода Corynebacterium.

Пример 11: Получение штамма с делетированным NCg10275 из Corynebacterium glutamicum CJ7V и оценка его продуктивности по L-валину

Для изучения того, проявляются ли приведенные выше эффекты также у других продуцирующих L-валин штаммов Corynebacterium glutamicum, один тип мутации [ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467] был введен Corynebacterium glutamicum ATCC14067 дикого типа для получения штамма, имеющего улучшенную продуктивность по L-валину.

Более подробно, геномную ДНК штамма Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 дикого типа выделяли с использованием мининабора для выделения ДНК G-spin Total (Intron, Cat. No 17045) согласно протоколу, предложенному в наборе. Геномную DNA использовали в качестве матрицы для выполнения ПЦР. При конструировании вектора для введения мутации A42V в ген ilvN использовали набор праймеров из праймера 7 (SEQ ID NO: 9) и праймера 8 (SEQ ID NO: 10) и набора праймеров из праймера 9 (SEQ ID NO: 11) и праймера 10 (SEQ ID N: 12) для получения фрагментов ДНК (А, В). Условия ПЦР следующие: денатурация при 94°С в течение 5 минут, 25 циклов, где каждый состоит из денатурации при 94°С в течение 30 секунд; отжига при 55°С в течение 30 секунд; и элонгации при 72°С в течение 60 секунд с последующей элонгацией при 72°С в течение 7 минут.

В результате были получены фрагменты А и В, где каждый содержит полинуклеотид из 537 п. н. Эти два фрагмента в качестве матрицы и праймер 7 (SEQ ID NO: 9) и праймер 10 (SEQ ID NO: 12) использовали для выполнения ПЦР с перекрывающимися праймерами. Получали продукт ПЦР из 1044 п. н. (называемый в дальнейшем «фрагмент с введенной мутацией»).

Полученный фрагмент с введенной мутацией обрабатывали с помощью фермента рестрикции Xbal (New England Biolabs, Beverly, MA) и затем лигировали в вектор pDZ, который был обработан с помощью такого же фермента рестрикции, с использованием Т4-лигазы (New England Biolabs, Beverly, MA). Полученный ген трансформировали в Е. coli DH5a и затем селектировали на среде LB, содержащей канамицин. ДНК получали с использованием набора для очистки плазмидной ДНК DNA-spin (iNtRON). Вектор для введения мутации A42V в ген ilvN обозначали как pDZ-ilvN(A42V).

После этого полученную рекомбинантную плазмиду pDZ-ilvN(A42V) трансформировали в Corynebacterium glutamicum ATCC14067 дикого типа путем гомологичной рекомбинация на хромосоме (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Затем выполняли вторичную рекомбинацию на планшете с твердой средой, содержащей 4% сахарозы. Фрагмент гена амплифицировали из трансформанта Corynebacterium glutamicum, в котором была завершена вторичная рекомбинация, посредством ГТЦР с использованием праймера 7 и праймера 10. Штамм с введенной мутацией подтверждали путем анализа с секвенированием. Рекомбинантный штамм обозначали как Corynebacterium glutamicum CJ7V.

В заключение, из Corynebacterium glutamicum CJ7V, имеющего продуктивность по L-валину, штамм с делетированным NCg10275 получали таким же образом, как в Примере 9, и обозначали как CJ7V-NCg10275. Для сравнения продуктивности по L-валину у полученного штамма штамм культивировали таким же образом, как в Примере 9, и затем анализировали концентрации L-валина и концентрации L-валина, анализированные таким образом, показали в Таблице 9 ниже.

Как показано в приведенных выше результатах, было подтверждено, что продуктивность по L-валину штамма CJ7V-NCg10275 повышалась на 17,6% по сравнению с таковой у контрольной группы. То есть это подтверждало, что продуктивность по L-валину может быть улучшена путем делетирования гена NCg10275 у различных микроорганизмов рода Corynebacterium, имеющих продуктивность по L-валину.

Как и в Примерах 6-10 это подтверждало, что продуктивность по разным L-аминокислотам может быть улучшена посредством инактивации белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 в микроорганизмах рода Corynebacterium.

Пример 12: Получение штамма с делетированным NCg10275 из Corynebacterium glutamicum CJ8V и оценка его продуктивности по L-валину

Для изучения того, проявляются приведенные выше эффекты также у других продуцирующих L-валин штаммов Corynebacterium glutamicum, один тип мутации [ilvN(A42V)] вводили в Corynebacterium glutamicum ATCC13869 дикого типа таким же образом, как в Примере 10, для получения мутантного штамма, имеющего улучшенную продуктивность по L-валину. Этот рекомбинантный штамм обозначали как Corynebacterium glutamicum CJ8V.

Из Corynebacterium glutamicum CJ8V, имеющего продуктивность по L-валину, штамм с делетированным NCg10275- получали таким же образом, как в Примере 9, и обозначали CJ8V-NCg10275.

Для сравнения продуктивности по L-валину у полученного штамма, его культивировали таким же образом, как в Примере 9, и затем анализировали концентрации L-валина и концентрации L-валина, анализированные таким образом, показали в Таблице 10 ниже.

Как показано в приведенных выше результатах, было подтверждено, что продуктивность по L-валину штамма CJ8V-NCg10275 повышалась на 25,9% по сравнению с таковой у контрольной группы. То есть, как и в Примерах 10-11, было подтверждено, что продуктивность по L-валину может быть улучшена путем делетирования гена NCg10275 у различных микроорганизмов рода Corynebacterium, имеющих продуктивность по L-валину.

Соответственно, как в Примерах 6-11, было подтверждено, что продуктивность по различным L-аминокислотам может быть улучшена посредством инактивации белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в микроорганизмах рода Corynebacterium.

На основе приведенного выше описания, специалисту в данной области техники будет понятно, что настоящее изобретение может быть осуществлено в другой конкретной форме без отступления от его технической идеи или существенных признаков. Следовательно, следует понимать, что приведенные выше воплощения являются не ограничивающими, но иллюстративными во всех аспектах. Объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим ему описанием и, следовательно, все изменения и модификации, которые попадают в пределы формулы изобретения, или эквиваленты таких пределов, следовательно, предназначены к охватыванию формулой изобретения.

Номер доступа

Учреждение депонирования: Корейский центр культур микроорганизмов (КССМ) (Международный орган депонирования)

Номер доступа: КССМ12153Р

Дата депонирования: 7 ноября 2017

--->

Перечень последовательностей

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> A microorganism of corynebacterium genus having L-amino acid

productivity and method for producing L-amino acid using the same

<130> OPA18432

<150> KR 10-2018-0009633

<151> 2018-01-25

<160> 12

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

Met Thr Ser Val Ile Pro Glu Gln Arg Asn Asn Pro Phe Tyr Arg Asp

1 5 10 15

Ser Ala Thr Ile Ala Ser Ser Asp His Thr Glu Arg Gly Glu Trp Val

20 25 30

Thr Gln Ala Lys Cys Arg Asn Gly Asp Pro Asp Ala Leu Phe Val Arg

35 40 45

Gly Ala Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Ile Cys Arg His Cys Pro Val

50 55 60

Ala Met Gln Cys Cys Ala Asp Ala Leu Asp Asn Lys Val Glu Phe Gly

65 70 75 80

Val Trp Gly Gly Leu Thr Glu Arg Gln Arg Arg Ala Leu Leu Arg Lys

85 90 95

Lys Pro His Ile Thr Asn Trp Ala Glu Tyr Leu Ala Gln Gly Gly Glu

100 105 110

Ile Ala Gly Val

115

<210> 2

<211> 351

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 2

atgacgtctg tgattccaga gcagcgcaac aacccctttt atagggacag cgccacaatt 60

gcttcctcgg accacacaga gcgtggtgag tgggtcactc aggcaaagtg tcgaaatggc 120

gacccagatg cattgtttgt tcgtggtgca gcgcaacgcc gagcagcagc aatttgccgc 180

cactgccctg tagccatgca gtgctgcgcc gatgccttag ataacaaggt ggaattcgga 240

gtctggggag gcctgaccga gcgccagcgc cgtgcattgc ttcgaaagaa gccgcacatt 300

actaactggg ctgaatattt ggctcagggg ggcgagatcg ccggggttta a 351

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 1

<400> 3

acctacaaca aagctctcat caacc 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 2

<400> 4

ctaccctgtg gaacacctac atct 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 3

<400> 5

gaattcgcgc cccactggcc cttc 24

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 4

<400> 6

accccggcgg cgctgctctg gaatcac 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 5

<400> 7

gagcagcgcc gccggggttt aattaat 27

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 6

<400> 8

gcaggtcgac ctggttaccg gtctgaatc 29

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 7

<400> 9

aatttctaga ggcagaccct attctatgaa gg 32

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 8

<400> 10

agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 9

<400> 11

gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact 30

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 10

<400> 12

aatttctaga cgtgggagtg tcactcgctt gg 32

<---

1. Микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования L-аминокислоты, где активность белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, инактивирована, и где микроорганизм рода Corynebacterium демонстрирует повышенную продуктивность в отношении L-аминокислоты, по сравнению с родительским или немодифицированным микроорганизмом рода Corynebacterium, в котором белок экспрессируется от природы.

2. Микроорганизм рода Corynebacterium по п.1, где L-аминокислота представляет собой основные аминокислоты, алифатические аминокислоты или аминокислоты с разветвленной цепью.

3. Микроорганизм рода Corynebacterium по п.1, где L-аминокислота представляет собой L-лизин или L-валин.

4. Микроорганизм рода Corynebacterium по п. 1, где микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.

5. Способ получения L-аминокислоты, включающий:

культивирование микроорганизма по любому из пп.1-4 в среде; и

выделение L-аминокислоты из микроорганизма или среды.

6. Способ получения L-аминокислоты по п.5, где L-аминокислота представляет собой основные аминокислоты, алифатические аминокислоты или аминокислоты с разветвленной цепью.

7. Способ получения L-аминокислоты по п.5, где L-аминокислота представляет собой L-лизин или L-валин.