Способ тангенциального поточного фильтрования для концентрирования растворов биомолекул
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ концентрирования жидкости, содержащей биомолекулу. Способ включает пропускание жидкости через устройство тангенциального поточного фильтрования под давлением, которое циклически изменяют между более высоким и более низким давлением посредством циклического изменения скорости потока жидкости через клапан переменного потока, используя по меньшей мере 10 циклов. Также изобретение относится к аппарату концентрирования в линии для содержащей биомолекулу жидкости, способу концентрирования биомолекулы с помощью такого аппарата и к способу получения биомолекулы. Группа изобретений позволяет достичь высокой концентрации биомолекулы при увеличении скорости процесса. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 19 пр.
Настоящее изобретение относится к способу концентрирования растворов биомолекул, в частности, рекомбинантных полипептидов и нуклеиновых кислот, и к аппарату для выполнения такого способа.
Многие биомолекулы, в частности, рекомбинантные полипептиды и нуклеиновые кислоты, такие как плазмидная ДНК (пДНК), привлекают много внимания, в частности, для терапевтических применений. Такие биомолекулы обычно получают посредством культивирования рекомбинантных клеток-хозяев, которые сконструированы для того, чтобы экспрессировать желаемую биомолекулу. После этого биомолекулу извлекают из среды для культивирования с помощью способов, обычно включающих центрифугирование, фильтрование и хроматографическую очистку. Извлечение биомолекулы обычно включает корректировку природы и свойств жидкой среды, в которой растворяют или суспендируют биомолекулы. При используемой обработке обычно создают относительно разведенный раствор биомолекулы и, таким образом, повышение концентрации биомолекулы в среде во время извлечения из среды для культивирования и очистки может быть желательным, например, поскольку концентрация может быть настолько низкой, что использование биомолекулы в этой форме является непрактичным или необходимо хранить большое количество жидкости.
Стандартные процессы концентрирования включают прохождение начальной среды, содержащей биомолекулу, через фильтровальный аппарат, такой как микрофильтрующие или ультрафильтрующие мембраны, при постоянном давлении. Такой аппарат выбирают так, что биомолекулу удерживают в ретентате, но что часть среды проходит через фильтровальную среду в отходы. Ретентат рециркулируют в накопительный бак и процесс рециркуляции продолжают до тех пор, пока, не достигают желаемой концентрации биомолекулы. Недостаток такого процесса состоит в том, что стадия концентрирования является относительно медленной и, таким образом, замедляет обработку биомолекулы. Дополнительно, нестабильность или нерастворимость белка (например, агрегирование или денатурация) может возникать из-за повторного прохождения биомолекул через напор насоса и воздействия сил физического сдвига в широком диапазоне концентраций растворенного вещества и буфера по мере замены буфера. Кроме того, стандартные процессы концентрирования включают большие остаточные объемы. Желательно стадию концентрирования выполнять в линии, в качестве части обработки биомолекулы вместо необходимости порционного концентрирования на основе рециркуляции.
В US 7682511 описан способ и аппарат для концентрирования, в которых несколько устройств тангенциального поточного фильтрования соединяют в конфигурации «елки», как проиллюстрировано на фиг. 1, причем поток через устройства регулируют с помощью комбинации из двух насосов, один расположен выше по потоку, 1, и один ниже по потоку, 2, от фильтрационных устройств, 3, чтобы управлять скоростями потока подаваемого вещества, 4, и ретентата, 5. Избыток жидкости удаляют в пермеат, 6. Используют постоянное давление.
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предоставлен способ концентрирования жидкости, содержащей биомолекулу, который включает прохождение жидкости через устройство тангенциального поточного фильтрования под давлением, где прикладываемое давление циклически изменяют между по меньшей мере более высоким давлением и более низким давлением.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ осуществляют в линии, где ретентат не рециркулируют. Ретентат или используют или берут для дальнейшей обработки. В других вариантах осуществления способ осуществляют в порционном или частичном порционном режиме, где некоторый или весь ретентат рециркулируют в подаваемое вещество.
Устройства тангенциального поточного фильтрования («TFF»), которые можно использовать в аппарате, хорошо известны в данной области (см., например, Filtration in the Biopharmaceutical Industry, ред. T.H. Meltzer и M.W. Jornitz, 1998) и включают плоские листовые, половолоконные и кольцевые навитые устройства. Предпочтительно, TFF устройство представляет собой половолоконное фильтрационное устройство.
Выбирают TFF устройство, которое имеет такой порог, подходящий для свойств биомолекул, что биомолекула не проходит через барьер, тогда как меньшие компоненты жидкости могут проходить через барьер в пермеат.
Следует принимать во внимание, что степень разности между более высоким и более низким давлением зависит от используемых условий. Например, при прочих равных, работа при более высокой скорости потока подаваемого вещества ведет к большей разности, чем работа при более низкой скорости потока подаваемого вещества. Аналогичным образом, для полых волокон, более высокие скорости сдвига ведут к большей разности давлений, чем более низкие скорости сдвига.
Верхний предел давления, используемого в настоящей заявке, представляет собой рабочий предел для используемого аппарата. В определенных случаях можно выбирать верхний предел, равный рабочему пределу устройства, определяемому производителем. Следует принимать во внимание, что практический верхний предел для более высокого давления может быть значительно выше того, что определено производителем, и может быть без труда определен через стандартный эксперимент. Во многих вариантах осуществления более высокое давление представляет собой по меньшей мере 25%, например, по меньшей мере 30%, например, по меньшей мере 40%, обычно по меньшей мере 50%, обычно по меньшей мере 60%, часто по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80% и может составлять по меньшей мере 90% от рабочего предела.
В определенных вариантах осуществления более низкое давление составляет не больше чем 40%, обычно не больше чем 30%, обычно не больше чем 20 и предпочтительно не больше чем 10% от рабочего предела.
В некоторых вариантах осуществления разность между более низким и более высоким давлением выбирают равной больше чем 5% от более высокого давления. В определенных вариантах осуществления разность между более низким и более высоким давлением выбирают находящейся в диапазоне от больше чем 5 до 50%, например, от 10 до 40%, от более высокого давления. В других вариантах осуществления разность между более низким и более высоким давлением выбирают находящейся в диапазоне от больше чем 50 до 95%, например, от 70 до 90%, от более высокого давления.
Во многих особенно предпочтительных вариантах осуществления более высокое давление по меньшей мере в 1,05 раза больше, чем более низкое давление. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления более высокое давление по меньшей мере в 1,1-2,0 раза больше, чем более низкое давление. В других особенно предпочтительных вариантах осуществления более высокое давление в 2-10 раз, в частности, в 3-7 раз больше, чем более низкое давление.
Способ по первому аспекту изобретения может включать применение, например, двух, трех, четырех или больше различных давлений, наибольшее и наименьшее применяемые давления представляют собой то, что описано выше, и любое другое применяемое давление является промежуточным между ними. В определенных вариантах осуществления, где используют два различных давления, более высокое давление применяют в течение вплоть до 99,9%, например, вплоть до 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% или 90% от общего времени процесса и более низкое давление в течение остального. Во многих случаях, более высокое давление применяют в течение по меньшей мере 50% от общего времени процесса, часто по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 70%, и предпочтительно по меньшей мере 80% от общего времени процесса и более низкое давление в течение остального. Во многих предпочтительных вариантах осуществления более высокое давление применяют в течение от 85 до 99% от общего времени процесса и более низкое давление в течение остального.
Во многих вариантах осуществления, когда TFF устройство представляет собой половолоконное устройство, рабочий предел обычно составляет приблизительно от 2 до 4 бар, и когда TFF устройство представляет собой плоское листовое устройство, рабочий предел обычно составляет приблизительно от 5 до 7 бар.
Следует принимать во внимание, что, при прочих равных, длина используемого TFF устройства влияет на коэффициент концентрирования, которого можно достичь, так что чем больше длина пути текучего вещества в концентраторе, тем выше коэффициент концентрирования. Соотношение общей площади мембраны к общей эффективной ширине в случае плоских листовых устройств или периферии в случае половолоконных устройств влияет на коэффициент концентрирования. Более высокие соотношения ведут к более высокому коэффициенту концентрирования, чем меньшие соотношения для той же площади мембраны. В определенных вариантах осуществления длину пути выбирают больше 30 см, в частности больше 40 см и предпочтительно больше 50 см. Во многих случаях длина пути составляет вплоть до 200 см.
Средства приложения давления в TFF устройстве хорошо известны в данной области и включают приложение давления газа, в частности, инертного газа, такого как азот или гелий. Предпочтительно средство приложения давления представляет собой насос. Насосы, которые можно использовать, включают перистальтические, диафрагменные, лопастные и центробежные насосы. Можно использовать конструкции как одноразовых, так и многоразовых насосов. Средство приложения давления можно использовать с ограничителем потока, расположенным ниже по потоку от TFF устройства. Примеры ограничителей потока включают клапаны с зажимом. Во многих предпочтительных вариантах осуществления, ограничитель потока содержит клапан переменного потока.
Ограничители, которые можно использовать в настоящем изобретении, служат для того, чтобы регулировать поток жидкости через TFF устройство и, таким образом, в комбинации со средством для того, чтобы придавать потоку управление давлением, прикладываемым к жидкости в TFF устройстве, и, таким образом, относительными долями жидкости в ретентате и пермеате, и, таким образом, достигаемым коэффициентом концентрирования.
Когда ограничитель потока представляет собой фиксированный ограничитель, прикладываемое давление можно изменять, регулируя скорость потока жидкости через TFF устройство, например, посредством увеличения или уменьшения скорости насоса или увеличения или уменьшения прикладываемого давления газа.
Когда клапан переменного потока используют в качестве средства для изменения прикладываемого давления, клапан переменного потока может регулировать поток между первой, относительно низкой скоростью потока, при которой жидкость сохраняет способность течь, и по меньшей мере второй, более высокой скоростью потока. В предпочтительных вариантах осуществления клапан переменного потока представляет собой клапан прерывистого потока, который предотвращает поток в первом положении, но делает возможным поток по меньшей мере во втором положении.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления потоком жидкости через клапан переменного потока управляют с помощью программируемого блока управления, который регулирует открывание и закрывание клапана для того, чтобы достигать требуемой концентрации. Этого достигают через периодическое изменение, с предварительно определяемым периодом времени относительно низкой скорости потока и относительно более высоких скоростей потока, или, например, открывание и закрывание клапана для того, чтобы создавать желаемую концентрацию. Один цикл представляет изменение давления от исходного давления до более высокого или более низкого давления и возвращение к исходному давлению, что соответствует стадиям открывания и закрывания клапана и возвращению к начальному состоянию. Продолжительность цикла может быть постоянной или переменной. При многих условиях работы, продолжительность цикла клапана переменного потока поддерживают в виде константы на всем протяжении процесса концентрирования.
Во многих вариантах осуществления, используют несколько циклов. Используемое число циклов зависит от таких факторов, как длительность процесса, объем жидкости, подлежащей концентрированию, скорость потока, максимальное давление аппарата, длина и/или площадь TFF устройства и порог молекулярной массы для TFF устройства. В определенных вариантах осуществления можно использовать по меньшей мере 10 циклов, например, по меньшей мере 50, 100, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000, 7500, 10000 или больше циклов.
Следует принимать во внимание, что можно использовать диапазон частот циклов. При всех прочих равных факторах, более высокая частота будет создавать меньшую разность между более высоким и более низким давлениями, тогда как более низкая частота будет создавать более высокую разность. И то и другое может быть полезно в различных обстоятельствах, в зависимости от природы осуществляемого процесса. Во многих случаях, частота меньше 100 Гц, обычно меньше 50 Гц, обычно меньше 10 Гц и предпочтительно меньше 5 Гц. В определенных предпочтительных вариантах осуществления частота составляет 2 Гц или меньше, наиболее предпочтительно 1 Гц или меньше, например, от 0,05 до 0,5 Гц.
Когда открывают клапан переменного потока, жидкость проходит через TFF устройство и клапан в ретентат. Когда указанный клапан закрывают, жидкость проходит через TFF фильтр в пермеат, а любое растворенное вещество и/или биомолекулу выше порога TFF устройства удерживают в концентраторе, чтобы смывать в ретентат, когда в следующий раз откроют клапан на линии ретентата.
Во время работы TFF устройства обыкновенно происходит формирование гелевого слоя, содержащего биомолекулу, на стороне ретентата поверхности фильтра. Этот гелевый слой обычно удаляют из TFF устройства посредством включения смывания в конце концентрирования, и такую стадию смывания можно использовать в процессе по настоящему изобретению. Стадия смывания в конце концентрирования может вести к значимому пику в концентрации биомолекулы и, следовательно, может вести к концентрации биомолекулы выше ожидаемой. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения этапы смывания включены в интервалы на всем протяжении процесса концентрирования. Этап смывания может включать продление периода, за который жидкость проходит через TFF устройство при более низком давлении, и дополнительно может включать предотвращение потока пермеата так, что весь поток проходит в ретентат, например, посредством закрывания клапана на линии пермеата, предпочтительно в течение смывания. Длительность этапа смывания часто выбирают для того, чтобы достигать переноса по существу всего гелевого слоя в ретентат. Этап смывания в конце концентрирования может включать прохождение вплоть до пяти объемов TFF устройства. Этапы смывания, включенные в интервалы в процессе концентрирования могут содержать прохождение более низких объемов TFF устройства, например, 0,25, 0,5, 0,75 или 1 объем TFF устройства. В некоторых вариантах осуществления этап смывания используют после операции периодического изменения между более высоким и более низким давлением для прохождения 1 объема TFF устройства, 2 объемов TFF устройства, 5 объемов TFF устройства, 10 объемов TFF устройства или больше, после чего следует возвращение к операции периодического изменения между более высоким и более низким давлением. Во многих вариантах осуществления, где один или несколько этапов смывания включают в интервалы в процессе концентрирования, этап смывания выполняют посредством предотвращения потока пермеата, например, посредством закрывания клапана на линии пермеата, предпочтительно в течение смывания.
Жидкости, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой элюент из способов очистки (таких как хроматографические колонки, стадии стандартной или однопроходной TFF, стадии фильтрования/осветления, центрифужный супернатант/фугат или взвеси, стадии кондиционирования/разведения), вещество, выходящее из биореакторов и ферментеров, и вещество, выходящее из процессов разрушения клеток.
Аппарат в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для концентрирования жидкостей, содержащих биомолекулы, например, пДНК, тельца включения, в частности, тельца включения, содержащие полипептиды и, в частности, рекомбинантные полипептиды.
пДНК может находиться в одной или нескольких из множества форм, таких как сверхспиральная, линейная и разомкнутая кольцевая (т. е. содержащая разрывы или релаксированная) изоформы. Сверхспиральная изоформа пДНК имеет ковалентно замкнутую кольцевую форму и пДНК является отрицательно сверхспиральной в клетке-хозяине под действием ферментативных систем организма-хозяина. В разомкнутой кольцевой изоформе, одна нить дуплекса пДНК разорвана в одном или нескольких местах.
Способы получения пДНК хорошо известны в данной области. пДНК может быть природной или искусственной, такой как клонирующие векторы, несущие чужеродные ДНК вставки. Во многих вариантах осуществления пДНК находится в диапазоне разменов от 1 т. о. до 50 т. о. Например, пДНК, кодирующая экспрессируемую интерферирующую РНК, обычно находится в диапазоне размеров от 3 т. о. до 4 т. о.
Полипептиды, в частности, рекомбинантные полипептиды, включают терапевтические белки и пептиды, в том числе цитокины, факторы роста, антитела, фрагменты антител, иммуноглобулиноподобные полипептиды, ферменты, вакцины, пептидные гормоны, хемокины, рецепторы, фрагменты рецепторов, киназы, фосфатазы, изомеразы, гидролазы, факторы транскрипции и слитые полипептиды.
Антитела включают моноклональные антитела, поликлональные антитела и фрагменты антител, обладающие биологической активностью, в том числе поливалентные и/или полиспецифические формы любых из вышеуказанных.
Встречаемые в природе антитела обычно содержат четыре полипептидные цепи, две идентичные тяжелые (H) цепи и две идентичные легкие (L) цепи, соединенные друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH) и константную область (CH), область CH содержит в своей нативной форме три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область (VL) и константную область, содержащую один домен, CL.
Области VH и VL дополнительно можно подразделять на области гипервариабельности, называемые определяющим комплементарность областями (CDR), вперемежку с областями, которые более консервативны, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, которые расположены от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Фрагменты антител, которые можно экспрессировать, содержат часть интактного антитела, указанная часть имеет желаемую биологическую активность. Фрагменты антител в целом содержат по меньшей мере один антигенсвязывающий участок. Примеры фрагментов антител включают: (i) Fab фрагменты, имеющие домены VL, CL, VH и CH1; (ii) производные Fab, такие как фрагмент Fab', имеющий один или несколько остатков цистеина на C-конце домена CH1, которые могут формировать двухвалентные фрагменты посредством образования дисульфидных связей между двумя производными Fab; (iii) Fd фрагмент, имеющий домены VH и CH1; (iv) производные Fd, такие как производные Fd, имеющие один или несколько остатков цистеина на C-конце домена CH1; (v) Fv фрагменты, имеющие домены VL и VH одного плеча антитела; (vi) одноцепочечные молекулы антител, такие как одноцепочечные антитела Fv (scFv), в которых домены VL и VH ковалентно связаны; (vii) полипептид с доменом VH или VL без доменов константных областей, связанный с другим вариабельным доменом (полипептидом домена VH или VL), который содержит или не содержит домены константных областей, (например, VH-VH, VH-VL или VL-VL); (viii) фрагменты доменных антител, такие как фрагменты, состоящие из домена VH или домена VL, и антигенсвязывающие фрагменты доменов VH или VL, такие как выделенные области CDR; (ix) так называемые «диатела», содержащие два антигенсвязывающих участка, например, вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL), в одной и той же полипептидной цепи; и (x) так называемые линейные антитела, содержащие пару тандемных сегментов Fd, которые, вместе с комплементарными полипептидами легких цепей, образуют пару антигенсвязывающих областей.
Тельца включения включают нерастворимые агрегаты, образуемые в цитоплазме бактериальных клеток, таких как E. coli, которые наиболее часто содержат полипептид и, в частности, рекомбинантный полипептид.
В дополнение к биомолекуле, другие компоненты жидкости могут включать соли, в том числе буферные соли, среды для культивирования и питательные компоненты, растворители, обычно воду, образующие цвиттер-ионы средства, поверхностно-активные средства, имидазол или другие связывающие средства конкурентных лигандов, аминокислоты, хаотропные средства, такие как мочевина, восстановители, окислители, конъюгационные реагенты для пегилирования (субстраты, побочные продукты и активаторы), сахара, липиды, нуклеиновые кислоты, метаболиты и небольшие полипептиды.
Способ можно использовать в качестве единой операции, или он может содержать одну или несколько стадий в многостадийном процессе. В некоторых вариантах осуществления используют один способ концентрирования в соответствии с настоящим изобретением. В других вариантах осуществления используют два или больше способов концентрирования в соответствии с настоящим изобретением. Когда используют два или больше способов концентрирования, стадии могут быть последовательными и обычно разделенными одним или несколькими этапами очистки или обработки, такими как хроматография, центрифугирование, стандартное фильтрование или замена буфера. Два или больше способов концентрирования также можно осуществлять параллельно, например, при концентрировании различных технологических потоков, которые впоследствии объединяют и которые впоследствии можно подвергать дополнительному концентрированию с помощью способов в соответствии с настоящим изобретением.
Жидкости, получаемые с помощью аппарата и процессов по настоящему изобретению, можно использовать «как есть» без дополнительной обработки или можно подвергать одной или нескольким дополнительным стадиям обработки, таким как стадии очистки или обработки, например, стадии хроматографии, такой как аффинная хроматография, анионо- и/или катионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, эксклюзионная хроматография, аффинная хроматография; и/или дополнительные стадии фильтрования, осветления, кондиционирования, разведения или другого формулирования.
Способ получения биомолекулы, который включает способ по первому аспекту настоящего изобретения, образует второй аспект настоящего изобретения.
В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения, предоставлен аппарат концентрирования в линии для содержащей биомолекулу жидкости, который содержит TFF устройство в соединении по текучей среде со средством обеспечения течения жидкости через TFF устройство и клапан переменного потока, где средство обеспечения течения располагают выше по потоку от фильтрационного устройства, клапан переменного потока располагают ниже по потоку от TFF устройства и клапаном переменного потока управляют для периодического изменения между по меньшей мере более высоким давлением и более низким давлением.
TFF устройства, средство обеспечения течения, клапаны переменного потока, биомолекулы и жидкости, используемые в этом аспекте, представляют собой то, что описано выше по отношению к первому аспекту настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аппарат содержит одно TFF устройство. В других вариантах осуществления аппарат содержит два или больше TFF устройств, которые могут быть последовательными и/или параллельными. В определенных вариантах осуществления аппарат содержит два или больше TFF устройств, выполненных в соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения последовательно, где выпуск из TFF устройства выше по потоку находится в соединении по текучей среде с TFF устройством ниже по потоку.
В связанном аспекте предоставлен способ концентрирования биомолекулы в жидкости, где биомолекулу концентрируют с помощью аппарата в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения.
Способ концентрирования можно использовать в качестве единой операции или он может содержать одну или несколько стадий в многостадийном процессе. В некоторых вариантах осуществления используют одну стадию концентрирования в соответствии с настоящим изобретением. В других вариантах осуществления используют две или больше стадий концентрирования в соответствии с настоящим изобретением. Когда используют две или больше стадий концентрирования в соответствии с настоящим изобретением, стадии могут идти последовательно, обычно разделенными одной или несколькими этапами очистки или обработки, такими как хроматография, центрифугирование, стандартное фильтрование или замена буфера. Две или больше стадий концентрирования также можно осуществлять параллельно, например, при концентрировании различных технологических потоков, которые впоследствии объединяют и которые можно впоследствии подвергать дополнительному концентрированию с помощью процессов в соответствии с настоящим изобретением.
Аппарат в соответствии с настоящим изобретением проиллюстрирован на фиг. 2. TFF устройство, 7, располагают ниже по потоку от насоса, 8, который подает подаваемую жидкость, 9, в TFF устройство, 7. Клапан прерывистого потока, 10, располагают на линии ретентата, 11. Периодическое изменение клапана прерывистого потока, 10, между закрытым или более ограниченным и открытым или менее ограниченным положениями вызывает периодическое изменение давления в TFF устройстве, 7. Когда клапан, 10, закрывают или ограничивают, давление возрастает и жидкие компоненты меньше порога TFF устройства, 7, проталкивают в пермеат, 12, тем самым увеличивая концентрацию биомолекулы. Биомолекулу удерживают в TFF устройстве, 7, и пропускают в ретентат, 11.
Настоящая заявка проиллюстрирована без ограничения следующими примерами.
Пример 1
Сокращения
mPES - модифицированный полиэтиленсульфон
рчЛактоферрин - рекомбинантный лактоферрин человека
VCF - объемный коэффициент концентрирования
Стоковый раствор очищенного рчЛактоферрина при начальной концентрации 1 мг/мл в 25 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,5, использовали в экспериментальных исследованиях. Стоковый раствор объемно концентрировали с использованием системы концентратора, содержащей систему GE Healthcare ÄKTATM Explorer с половолоконным концентратором Spectrum Labs MidkrosTM (65 см в длину, 10 кДа mPES полое волокно, имеющее площадь поверхности 370 см2, максимальное рекомендованное рабочее давление 2 бар). Половолоконную линию ретентата в свою очередь непосредственно соединяли со впускным клапаном 1 контроллера переменного потока ниже по потоку, содержащего двойной впускной контроллер переменного потока. Двойной впускной контроллер переменного потока состоит из специальной (Gemü) пластмассы, двухклапанный манифольд с одним выпуском, имеющий 2 мм внутренний канал с быстродействующим соленоидным исполнительным механизмом под управлением миникомпьютера Raspberry Pi, который управляет потоком жидкости через манифольд и через концентратор. Впускной клапан 2 двойного впускного контроллера переменного потока оставался полностью закрытым на всем протяжении. Систему выполняли с возможностью запуска при постоянной скорости потока 15 мл/мин и рчЛактоферрин направляли в режиме нисходящего потока через положение 2 на клапане ÄKTA Explorer V2 в концентратор. Скорость потока половолоконного ретентата регулировали с помощью впускного клапана ниже по потоку. Время цикла клапана задавали равным 2 с и клапан полностью открывали в течение 5% от цикла, и полностью закрывали в течение остальных 95% от цикла, чтобы обеспечивать теоретический 20-кратный VCF. Выпуск из клапана прерывистого потока соединяли с клапаном V3, положение 2 на ÄKTATM Explorer, и осуществляли мониторинг концентрации рчЛактоферрина посредством измерения данных поглощения на 280 нм. Концентрированный раствор рчЛактоферрина в линии собирали через выпускную линию F8 на клапане V4 ÄKTATM Explorer. Пермеат из полого волокна собирали отдельно для того, чтобы определять объемный коэффициент концентрирования. Регистрировали максимальное и минимальное системное давление. Концентратор смывали буфером, после чего следовал рчЛактоферрин 1 мг/мл при полностью открытой линии ретентата, чтобы заливать концентратор. Для очистки концентратора от концентрирована рчЛактоферрина, линию ретентата полностью открывали прежде, чем концентратор смывали буфером.
Примеры с 2 до 12
Повторяли способ из примера 1, но при условиях, которые изменяли, как указано в таблице 1. Для примеров с 8 до 12 использовали более длинные полые волокна указанной длины.
Результаты примеров с 1 до 12 приведены в таблице 1.
Таблица 1
| Пример | Длина концентратора (см) | % времени открытого клапана | Скорость потока (мл/мин) | Макс. давление (бар) | Макс. -Мин. давление (бар) | Полученный VCF |
| 1 | 65 | 5 | 5 | 1,0 | 0,2 | 6,2 |
| 2 | 65 | 5 | 15 | 2,5 | 0,3 | 7,4 |
| 3 | 65 | 12,5 | 10 | 2,2 | 0,3 | 4,7 |
| 4 | 65 | 12,5 | 15 | 1,9 | 0,5 | 3,4 |
| 5 | 65 | 20 | 5 | 1,8 | 0,3 | 2,7 |
| 6 | 65 | 20 | 15 | 2,6 | 0,5 | 3,7 |
| 7 | 65 | 25 | 15 | 1,3 | 0,4 | 2,7 |
| 8 | 105 | 15 | 10 | 0,6 | 0,5 | 2,8 |
| 9 | 150 | 5 | 15 | 0,8 | 0,3 | 10,8 |
| 10 | 150 | 5 | 25 | 2,1 | 0,3 | 11,8 |
| 11 | 150 | 25 | 15 | 0,6 | 0,5 | 3,9 |
| 12 | 150 | 25 | 25 | 1,6 | 0,4 | 4,9 |
Примеры с 13 до 19
Способ из примера 1 повторяли, используя сток моноклонального антитела IgG1 против CD20 2 мг/мл, молекулярная масса приблизительно 150 кДа, с двумя 65 см полыми волокнами с порогом молекулярной массы 50 кДа последовательно, и условия изменяли, как указано в таблице 2.
Результаты примеров с 13 до 19 приведены в таблице 2.
Таблица 2
| Пример | Длина концентратора (см) | % времени открытого клапана | Скорость потока (мл/мин) | Макс. давление (бар) | Макс. -Мин. давление (бар) | Полученный VCF |
| 13 | 130 | 21 | 10 | 1,8 | 0,4 | 4,9 |
| 14 | 130 | 11 | 10 | 1,8 | 0,4 | 5,4 |
| 15 | 130 | 1 | 10 | 1,8 | 0,4 | 125,2 |
| 16 | 130 | 11 | 15 | 2,1 | 0,3 | 3,9 |
| 17 | 130 | 21 | 20 | 1,2 | 0,4 | 4,2 |
| 18 | 130 | 11 | 20 | 1,9 | 0,3 | 4,2 |
| 19 | 130 | 1 | 20 | 2,4 | 0,3 | 8,8 |
Результаты показывали обратную линейную зависимость между временем открытого клапана и полученным VCF. Кроме того, используя один 65 см половолоконный концентратор с клапаном прерывистого потока, можно получать VCF выше 7 крат. Это удивительно, поскольку это почти удваивает VCF, достигаемый с помощью концентратора PALL CadenceTM в линии, где конфигурация из четырех концентраторов CadenceTM в линии в линии дает длину прямого пути, сравнимую с 65 см полым волокном. Кроме того, удивительно то, что скорость потока оказывала только очень небольшое влияние на достигаемый VCF, тем самым предлагая бóльшую гибкость при работе. При всех прочих равных факторах, увеличение длины концентратора вело к получению более высоких коэффициентов концентрирования.
1. Способ концентрирования жидкости, содержащей биомолекулу, который включает пропускание жидкости через устройство тангенциального поточного фильтрования под давлением, где прикладываемое давление циклически изменяют между по меньшей мере более высоким давлением и более низким давлением посредством циклического изменения скорости потока жидкости через клапан переменного потока, и причем используют по меньшей мере 10 циклов.
2. Способ по п. 1, где способ осуществляют в линии.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором давление прикладывают посредством насоса и давление изменяют за счет работы клапана переменного потока.
4. Способ по п. 3, в котором клапан переменного потока представляет собой клапан прерывистого потока.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором используют два различных давления, более высокое давление используют в течение вплоть до 99,9% и предпочтительно от 85 до 99% от времени приложения давления.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором давление изменяют посредством работы клапана переменного потока, расположенного ниже по потоку от устройства тангенциального поточного фильтрования.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором используют частоту циклов меньше чем 100 Гц и предпочтительно меньше чем 5 Гц.
8. Способ по п. 7, в котором частота циклов составляет от 0,05 до 0,5 Гц.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором используют два различных давления, и более высокое давление по меньшей мере в 1,05 раза больше, чем более низкое давление, и предпочтительно по меньшей мере в 1,1-2,0 раза больше, чем более низкое давление.
10. Аппарат концентрирования в линии для содержащей биомолекулу жидкости, содержащий устройство тангенциального поточного фильтрования в соединении по текучей среде со средством обеспечения течения жидкости через устройство тангенциального поточного фильтрования и клапан переменного потока, где средство обеспечения течения расположено выше по потоку от устройства фильтрования, клапан переменного потока расположен ниже по потоку от устройства тангенциального поточного фильтрования, и средство управления клапаном переменного потока выполнено с возможностью обеспечения циклического изменения скорости потока жидкости через клапан переменного потока так, что давление циклически изменяется между по меньшей мере более высоким давлением и более низким давлением, причем аппарат выполнен с возможностью обеспечения применения по меньшей мере 10 циклов.
11. Аппарат по п. 10, в котором средство обеспечения течения содержит насос.
12. Способ концентрирования биомолекулы в жидкости, в котором биомолекулу концентрируют при помощи аппарата по п. 10 или 11, причем используют по меньшей мере 10 циклов.
13. Способ по п. 12, в котором используют два различных давления, более высокое давление используют в течение вплоть до 99,9% и предпочтительно от 85 до 99% от времени приложения давления.
14. Способ получения биомолекулы, который включает концентрирование жидкости, содержащей биомолекулу, посредством способа по любому одному из пп. 1-9.
15. Способ по п. 14, в котором биомолекула представляет собой рекомбинантный полипептид.
