Иммуномодулирующие слитые белки и пути их применения

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитому белку, связывающемуся с CD47 для передачи костимулирующего сигнала CD28 Т-клетке, и может быть использовано в медицине. Слитый белок, состоящий из CD47-связывающей части SIRPα, трансмембранной части CD28 и сигнального домена костимулирующей молекулы CD28, может быть использован для создания Т-клеток для эффективной иммунотерапии рака, экспрессирующего CD47. 9 н. и 42 з.п. ф-лы, 13 ил., 13 пр.

 

ИНФОРМАЦИЯ О ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей, прилагающийся к данной заявке, представлен в текстовом формате вместо бумажной копии и, таким образом, включен посредством ссылки в настоящее описание. Названием текстового файла, содержащего перечень последовательности, является 360056_433WO_SEQUENCE_LISTING.txt. Текстовый файл имеет размер 286 KB, был создан 4 марта 2016 г. и подается в электронном виде посредством EFS-Web.

Предпосылки

Способы иммунотерапии на основе Т-клеток начали развиваться, когда были обнаружены реактивные в отношении опухоли Т-клетки среди популяции инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) (Clark et al., Cancer Res. 29:705, 1969). Одна стратегия, известная как адоптивный перенос Т-клеток, в некоторых ситуациях предусматривает выделение инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, предварительно отобранных по реактивности в отношении опухоли, клональное размножение реактивных в отношении опухоли Т-клеток, индуцированных антителами к CD3 и к CD28 в присутствии IL-2 и, наконец, инфузию размноженной популяции клеток обратно пациенту, имеющему опухоль (вместе с химиотерапией и повторяющимся введением IL-2) (Dudley et al., Science 298:850, 2002). Данная форма адоптивной Т-клеточной терапии с помощью инфильтрирующих опухоль лимфоцитов может быть технически громоздкой и приводит к полной ремиссии только у незначительной части пациентов с меланомой и редко является эффективной при других формах рака (Besser et al., Clin. Cancer Res. 16:2646, 2010).

Выделение реактивных в отношении опухолей Т-клеточных клонов привело к развитию еще одного иммунотерапевтического подхода - созданию рекомбинантных Т-клеточных рецепторов (TCR), специфичных к конкретным антигенам, которые могут быть введены в T-клетки, например, с помощью векторной системы доставки для придания специфичности к желаемой мишени, такой как ассоциированный с опухолью пептид, презентируемый молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC), экспрессируемой на опухолевой клетке (известной у людей как молекула лейкоцитарного антигена человека (HLA)). Другой подход представляет синтетический рецептор, называемый химерным антигенным рецептором (CAR), который обычно содержит антиген-связывающий домен, который, например, в контексте противоопухолевой терапии, может связываться с опухоль-специфическим или ассоциированным антигеном, связан с одним или более внутриклеточными компонентами, содержащими эффекторные домены, такие как первичный сигнальный домен, например, сигнальный домен TCR, или, в некоторых случаях, костимулирующие сигнальные домены. В отличие от введения TIL, основные процедуры для Т-клеточной иммунотерапии с помощью сконструированных TCR или CAR в целом представляют собой генетическую модификацию Т-клеток человека с помощью трансгена, кодирующего фрагмент, нацеливающийся на опухоль, размножение ex vivo рекомбинантных Т-клеток и переливание размноженных Т-клеток обратно пациентам.

Было показано, что адоптивная Т-клеточная терапия с использованием Т-клеток, экспрессирующих рекомбинантные TCR, имеет многообещающее клиническое преимущество, особенно при определенных В-клеточных формах рака. Однако эффективная активация Т-клеток часто требует или усиливается сопутствующим костимулирующим сигналом (Chen and Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). В микроокружении опухоли костимулирующие молекулы обычно подавляются. В результате экзогенный стимул посредством IL-2, как правило, необходим для Т-клеток, которые экспрессируют рекомбинантные TCR, специфичные для антигенов рака.

Активация Т-клеток инициируется, когда TCR взаимодействует с конкретным пептидом, презентируемым в MHC на антиген-презентирующей клетке (APC) (Rossy et al., Frontiers in Immunol. 3: 1-12, 2012). Точка взаимодействия Т-клетки и APC становится иммунологическим синапсом, который состоит из трех концентрических супрамолекулярных активационных кластеров (SMAC), в том числе центрального cSMAC, периферического pSMAC и дистального dSMAC (Rossy et al., Frontiers in Immunol. 3: 1-12, 2012). В пределах cSMAC костимулирующие рецепторы могут привлекать сигнальные молекулы для усиления сигнала TCR. Такие костимулирующие рецепторы могут включать в себя CD28 и в некоторых случаях образовывать микрокластеры с TCR для снижения порога активации (Chen and Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). Доступ к cSMAC для трансмембранных белков, экспрессируемых T-клетками, может ограничиваться размером внеклеточного домена. Например, CD45 имеет большой эктодомен и, как правило, исключается из иммунологического синапса, за счет чего предотвращается его способность ингибировать передачу сигнала TCR (James and Vale, Nature 487:64-69, 2012).

В области иммунотерапии остается потребность в альтернативных композициях и способах, которые обеспечивают иммуномодулирующие сигналы клеткам-хозяевам для лечения различных заболеваний, таких как рак или инфекции. Раскрытые в данном документе варианты осуществления касаются этих потребностей и предоставляют другие связанные преимущества.

Краткое описание

В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, который содержит связывающий домен, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе.

В некоторых вариантах осуществления длина или пространственное расстояние комплекса, образованного между слитым белком и мишенью, или части такого комплекса слитый белок::мишень (как правило, внеклеточной части такого комплекса), представляет собой или охватывает определенное расстояние, например, в некоторых вариантах осуществления это расстояние, которое представляет собой менее чем или менее чем приблизительно определенное расстояние. В некоторых аспектах расстояние комплекса слитый белок::мишень (или, как правило, его внеклеточной части) составляет менее чем около или приблизительно 50 нм, менее чем около или приблизительно 40 нм, менее чем около или приблизительно 30 нм или менее чем около или приблизительно 20 нм, или равно или менее чем около или приблизительно 15 нм. В некоторых вариантах осуществления оно составляет около или приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нм, например, около или приблизительно 14 или 15 нм. В некоторых аспектах расстояние является аналогичным расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, или представляет собой расстояние, которое является таким же, приблизительно таким же или по существу таким же, как расстояние между ближайшей частью мембраны, например остатком, внеклеточного домена TCR и ближайшей частью мембраны, например остатком, молекулы MHC (например, HLA, такой как MHCI или MHCII), относительно комплекса TCR-пептид/MHC или расстояния, охватываемого внеклеточными частями такого комплекса (или пространственного расстояния, охватываемого внеклеточной частью, которая, как известно, содержится в синапсе, такой как комплекс, содержащий CD8, CD4, CD28 и соответствующего партнера по связыванию или его лиганда). В некоторых вариантах осуществления пространственные расстояния комплексов относятся к расстоянию между мембранами двух разных клеток, где как первая клетка, так и вторая клетка экспрессирует на своей поверхности партнера по связыванию, который может образовывать комплекс между мембранами, когда клетки находятся вблизи друг от друга. В некоторых аспектах расстояние представляет собой расстояние, которое является таким же, приблизительно таким же или по существу таким же, как расстояние, охватываемое внеклеточными частями комплекса, образованного между TCR и молекулой MHC путем когнатного взаимодействия. В некоторых аспектах, например, когда слитый белок содержит связывающий домен из молекулы, обычно способной проникать в иммунологический синапс или колокализованной с антигенным рецептором, расстояние является аналогичным или таким же, как то, которое охватывается комплексом, образованным между молекулой (имеющей связывающий домен, используемый в слитом белке) и ее естественным партнером по связыванию. В некоторых аспектах, например, когда слитый белок содержит связывающий домен из молекулы, обычно не способной проникать в иммунологический синапс или обычно не способной к колокализации с антигенным рецептором, расстояние отличается, например меньше или по существу меньше, чем расстояние, охватываемое комплексом, образованным между молекулой (имеющей связывающий домен или его функциональную часть, используемую в слитом белке) и ее естественным партнером по связыванию.

В некоторых вариантах осуществления связывающий домен внутри внеклеточного компонента слитого белка по настоящему раскрытию содержит мишень-связывающую часть молекулы, способной передавать ингибирующий сигнал, такой как ингибирующая молекула, например, иммуноингибирующая молекула, такая как иммуноингибирующий рецептор или молекула иммунной контрольной точки. В некоторых аспектах такая молекула является гликопротеином, представителем семейства контрольных точек. В определенных вариантах осуществления слитый белок, содержащий связывающий домен из гликопротеина, представителя семейства контрольных точек, не является B7 или молекулой, связывающей B7, или не является представителем суперсемейства CD28-B7 (например, не является CD28, CTLA4, ICOS или другой связывающей молекулой семейства B7). Иллюстративные гликопротеины, представители семейства контрольных точек, включают CD200R, SIRPα, CD279 (PD-1), CD2, CD95 (Fas), CTLA4 (CD152), CD223 (LAG3), CD272 (BTLA), A2aR, KIR, TIM3, CD300 или LPA5, или связывающий вариант любой такой молекулы. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен внутри внеклеточного компонента слитого белка по настоящему раскрытию содержит партнера по связыванию любого из вышеперечисленных или связывающий вариант любой такой молекулы. В некоторых аспектах таких вариантов осуществления внутриклеточная часть слитого белка включает в себя сигнальный домен, способный передавать стимулирующий, например костимулирующий, сигнал лимфоциту, такому как Т-клетка, например костимулирующей области CD28, 41BB, ICOS или другой костимулирующей молекулы. В некоторых аспектах внутриклеточная часть слитого белка не включает внутриклеточный сигнальный домен ингибирующей молекулы, например контрольной точки или иммуноингибирующей молекулы, когда внеклеточную связывающую часть получают из контрольной точки или иммуноингибирующей молекулы. В некоторых аспектах слитый белок не включает первичный сигнальный домен, такой как сигнальный домен CD3ζ или другой домен, способный передавать первичный сигнал Т-клетке.

В определенных аспектах внеклеточный компонент или его связывающая часть содержит или является связывающим доменом молекулы или эктодомена, способным специфически связываться с CD200, таким как связывающая часть CD200R или его вариант. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен представляет собой или включает связывающую область молекулы или эктодомена, которая способна специфически связываться с CD47, например эктодомен SIRP или его CD47-связывающая область, например эктодомен SIRPα или его CD47-связывающая область. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен способен связываться с молекулой PD-L1 или PD-L2, или LAG3. Иллюстративными мишенями могут быть один или более белков, экспрессия которых увеличивается или активируется в определенных клетках или тканях, связанных с или присущих заболеванию или состоянию, подлежащих лечению или улучшению с помощью слитых белков и композиций, предусмотренных в данном документе, таких как опухолевая клетка или микроокружение опухоли, или связана с рецептором, как правило, активируемым на иммунных клетках, таких как лимфоциты, инфильтрирующие пораженные ткани, такие как опухоль.

В некоторых вариантах осуществления внеклеточный компонент дополнительно содержит одну или более дополнительных областей или доменов, например, из молекулы, отличной от той, из которой получают связывающий домен, или отличной от молекулы, с которой связывающий домен разделяет идентичность. Один или более дополнительных внеклеточных доменов может содержать спейсерную область, такую как область из молекулы иммуноглобулина, которая может содержать весь или часть шарнира, или домен константной области, такой как домен CH2 или CH3, или из другой молекулы клеточной поверхности, такой как костимулирующий рецептор, например CD28. Дополнительный внеклеточный домен(-ы) может содержать в некоторых аспектах домен мультимеризации, например, домен или последовательность димеризации, которая может способствовать гомо- или гетеродимеризации с другой молекулой, такой как мультимеризация двух или более слитых белков. В некоторых вариантах осуществления такой домен содержит часть внеклеточного домена молекулы CD28, включающую по меньшей мере ближайший трансмембранный цистеин и, как правило, внеклеточную часть между таким цистеином и мембраной или его модифицированный вариант. В некоторых аспектах такой домен содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 32, или ее часть или ее вариант, такой как имеющий по меньшей мере 90%, 95% или 99% идентичности с ней. В некоторых аспектах такой домен может быть включен для облегчения или содействия мультимеризации. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий CD200-связывающий домен, такой как внеклеточная часть CD200R (или его часть, такую как его связывающий домен), например внеклеточная часть CD200R, имеющая аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 25, или кодируемая молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO: 2, или его CD200-связывающую часть или его вариант, или его связывающую часть. В некоторых аспектах таких вариантов осуществления внеклеточная часть слитого белка дополнительно содержит часть внеклеточной области CD28, такую как до от приблизительно 9 до приблизительно 12 ее аминокислот (например, 9 аминокислот или 12 аминокислот), и в некоторых аспектах включая ближайший к мембране остаток цистеина внеклеточной области CD28. В некоторых таких вариантах осуществления длина части CD200R внеклеточной области уменьшена по длине, соответствующей количеству дополнительных остатков в части, полученной из CD28, например на от приблизительно 9 до приблизительно 12 аминокислот (например, 9 аминокислот или 12 аминокислот) или на достаточное количество аминокислот, так что расстояние, охватываемое внеклеточной частью комплекса между слитым белком и молекулой CD200, аналогично, по существу аналогично или такое же, как и охватываемое внеклеточной частью комплекса между CD200R человека, например CD200R, и CD200; или охватываемое внеклеточной частью комплекса между TCR в когнатном взаимодействии с молекулой MHC (например, MHC I или MHCII) при связывании с комплексом когнатный пептид-MHC; или иммунологическим синапсом. В некоторых аспектах слитый белок дополнительно содержит трансмембранный домен, такой как трансмембранный домен CD28, например, трансмембранный домен, кодируемый последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 4, или его часть, или его модифицированный вариант, такой как вариант, модифицированный так, чтобы он содержал дополнительные заряженные области или остатки или гидрофильные остатки для облегчения межмолекулярных взаимодействий. В некоторых вариантах осуществления белок дополнительно содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28, такой как костимулирующий домен CD28, например домен, который способен привлекать одну или более адаптерных молекул к CD28 в ответ на связывание лиганда. В некоторых аспектах внутриклеточный домен CD28 включает или представляет собой последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5, или ее часть или функциональный вариант.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть CD200R, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть CD200R, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28 и внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB).

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть CD200R, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB).

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть SIRPα, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть CD279 (PD-1), (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть CD95 (Fas), (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть TIM3, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть LAG3, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.

В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к слитому белку, содержащему внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень, внутриклеточный компонент, состоящий из внутриклеточного сигнального домена, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что длина комплекса слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, где (a) внеклеточный компонент содержит внеклеточную часть CD2, (b) гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28.

В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, описываемый в данном документе.

В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый белок, описываемый в данном документе.

В некоторых других аспектах настоящее раскрытие относится к клетке-хозяину, содержащей слитый белок, нуклеиновую кислоту или вектор, описываемый в данном документе.

В некоторых других аспектах предусматривается способ повышения активности иммунной клетки, включающий введение субъекту, нуждающемуся в повышенной активности иммунных клеток, эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.

В других аспектах настоящее раскрытие относится к способу усиления или продления иммунного ответа, включающему введение субъекту, нуждающемуся в повышенной или продленной активности иммунных клеток, эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.

В других аспектах настоящее раскрытие предусматривает способ стимуляции антигенспецифического ответа Т-клеток, включающий введение субъекту, нуждающемуся в повышенной активности иммунных клеток, эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.

В других аспектах настоящее раскрытие относится к способу ингибирования иммуносупрессивного сигнального пути, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.

В других аспектах настоящее раскрытие относится к способу лечения рака, включающему введение субъекту, имеющему рак, терапевтически эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.

В других аспектах настоящее раскрытие относится к способу ингибирования иммунной резистентности раковых клеток, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.

В других аспектах настоящее раскрытие предусматривает способ лечения опухоли, включающий введение субъекту, имеющему опухоль, терапевтически эффективного количества клеток-хозяев, описываемых в данном документе, где вводимая клетка-хозяин способна пролиферировать в иммуносупрессивном микроокружении опухоли.

В настоящем раскрытие также предусматривается способ лечения инфекции, включающий введение субъекту, имеющему инфекцию, терапевтически эффективного количества клетки-хозяина, описываемой в данном документе.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидными при обращении к следующим подробному описанию и прилагающимся графическим материалам.

Краткое описание графических материалов

На фигурах 1A и 1B показаны конструкции CD200R-CD28, экспрессируемые на высоком уровне на первичных CD8⁺ T-клетках мыши. (A) Схематическое изображение иллюстративных конструкций CD200R-CD28. Конструкция «I» содержит внеклеточный («EC») и трансмембранный («TM») домены CD200R и внутриклеточный («IC») сигнальный домен CD28 (CD200Rtm-CD28). Конструкция «II» содержит внеклеточный домен CD200R и трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (CD200R-CD28tm). Конструкции «III-V» также содержат часть внеклеточного домена CD28 до трансмембранного ближнего цистеина для содействия мультимеризации и улучшения передачи сигнала CD28. Для обеспечения каких-либо дополнительных внеклеточных аминокислот (например, от одной до приблизительно 50 аминокислот; например, иллюстративные мышиные конструкции, раскрытые в данном документе, содержат дополнительные девять (9) аминокислот, а иллюстративные человеческие конструкции, раскрытые в данном документе, содержат двенадцать (12) аминокислот), некоторые конструкции имеют усеченную часть внеклеточного или внутриклеточного домена (например, CD200R, который сохраняет N-связанный участок гликозилирования). Например, конструкция IV имеет усеченную часть CD200R, которая усекается на 3 аминокислоты. Конструкция V имеет усеченную часть CD200R, которая усекается на 9 аминокислот. Конструкции «I», «II» и «V» поддерживают короткое пространственное расстояние между клетками (например, между T-клеткой и антиген-презентирующей клеткой) и могут колокализоваться с TCR в cSMAC и передавать сильный костимулирующий сигнал. (B) Трансгенная экспрессия мышиных конструкций CD200R-CD28 на T-клетках TCR_gag, обнаруживаемая с помощью антитела к CD200R. Контрольный вектор содержит зеленый флуоресцентный белок (GFP).

На фигурах 2A-2G показано, что конструкции CD200R-CD28 способствуют пролиферации, накоплению и эффекторной функции в ответ на опухолевые CD200⁺ клетки-мишени in vitro и накапливаются в иммунологическом синапсе. Спленоциты от наивных мышей TCR_gag стимулировали in vitro с помощью антител к CD3, антител к CD28 и рекомбинантного IL-2 человека (100 ед./мл) и трансдуцировали с помощью ретровирусного супернатанта в течение 2 дней. Клетки рестимулировали каждые 7 дней с помощью облученных FBL и спленоцитов и культивировали с rhIL-2 (50 ед./мл) в течение до трех стимуляций. Т-клетки использовали для анализов через 5-7 дней после последней стимуляции. (A) Пролиферация CD200R-CD28 и контрольных GFP Т-клеток TCR_gag, измеряемая с использованием разведения CellTrace Violet. Т-клетки стимулировали с помощью CD200^- FBL (верхние секции) или CD200⁺ FBL (нижние секции) в течение 3 дней. (B) Предпочтительное размножение/выживание трансдуцированных Т-клеток TCR_gag во время совместного культивирования с нетрансдуцированными Т-клетками TCR_gag в ходе недельных циклов стимуляции облученными CD200⁺ FBL и спленоцитами. (C) Обогащение трансдуцированными Т-клетками. Повторная рестимуляция облученными опухолевыми CD200⁺ клетками обогащала клетками, трансдуцированными CD200R-9aas-CD28Cys, по сравнению с Т-клетками дикого типа, трансдуцированными пустым контрольным вектором GFP. (D) Повышенная интенсивность сигнала CD200R и CD200 в синапсе T-клетка:FBL. Липидные рафты увеличиваются в иммунологическом синапсе (I). Слитые белки CD200R-9aas-CD28Cys колокализованы с липидными рафтами, указывая, что эти слитые белки концентрируются в пределах иммунологического синапса (III, IV). (E) CD200R-CD28⁺ CD8⁺ Т-клетки демонстрируют повышенную способность лизировать клетки CD200⁺ FBL in vitro. Опухолевые клетки-мишени метили с использованием различных разведений флуоресцентного красителя сукцинимидилового сложного эфира 5,6-карбоксифлуоресцеина диацетата (CFSE), как указано. Эффекторные Т-клетки TCR_gag, трансдуцированные указанным слитым белком CD200R-CD28 или пустым контрольным вектором, инкубировали при указанном соотношении эффектора к мишени со смесью 1:1 CD200⁺ FBL (CFSE^hi) и неспецифических контрольных мишеней EL4 (CFSE^l) в течение 5 часов. Процент FBL от суммы FBL и контрольных опухолевых клеток определяли с помощью проточной цитометрии. Процент лизиса определяли путем деления процента FBL, инкубированных с Т-клетками, на процент FBL, инкубированных без Т-клеток. (F) Опухолевые клетки-мишени для анализа CFSE в (G). Опухолевые клетки-мишени метили с использованием различных разведений флуоресцентных красителей CellTrace Violet (CTV) или CFSE. Получали смесь 1:1:1 клеток EL4 (CTV+), CD200⁺ FBL (CFSE^hi) и неспецифических контрольных мишеней EL4 (CFSE^l). (G) Анализ цитотоксичности CFSE. Т-клетки TCR_gag трансдуцировали рецептором CD200R-CD28 или контрольным вектором GFP. Эффекторные Т-клетки TCR_gag инкубировали при указанном соотношении эффектора к мишени со смесью 1:1 CD200^- FBL или CD200⁺ FBL и неспецифических контрольных мишеней EL4 в течение 4 часов. Процент FBL от суммы FBL и контрольных опухолевых клеток определяли с помощью проточной цитометрии. Процент лизиса определяли путем деления процента FBL, инкубированных с Т-клетками, на процент FBL, инкубированных без Т-клеток.

На фигурах 3A-3D показано, что Т-клетки, трансдуцированные с помощью CD200R-9aas-CD28Cys, преимущественно накапливаются в ответ на введение опухоли in vivo и экспрессируют поверхностные белки в соответствии с эффекторным фенотипом после введения обработанным цитоксаном мышам, несущим FBL. Трансдуцированные Т-клетки TCR_gag получали, как описано в примере 2. (A) Экспериментальная схема. Мышам C57BL/6 вводили 4×10⁶ клеток CD200⁺ FBL. Через пять дней Т-клетки TCR_gagCD200R-9aas-CD28Cys (Thy1.1 гомозиготные) и контрольные eGFP (Thy1.1 гетерозиготные) совместно вводили обработанным цитоксаном мышам B6, несущим FBL, при 4×10⁶ клеток/мышь. IL-2 вводили каждые 2 дня (2×10⁴ ед./дозу). На 8-й день после переноса Т-клеток мышей подвергали эвтаназии и собирали селезенку и паховые лимфатические узлы. (B) Т-клетки TCR_gag CD200R-9aas-CD28Cys накапливались в селезенке в ответ на FBL. (LN=лимфатический узел; Spl=селезенка). (C) Сравнение поверхностных белков через 3 дня после переноса Т-клеток, трансдуцированных для экспрессии CD200R-9aas-CD28Cys, T-клеток, трансдуцированных пустым вектором, и эндогенных Т-клеток. Т-клетки TCR_gag CD200R-9aas-CD28Cys экспрессировали сниженный CD62L по сравнению с контрольными Т-клетками TCR_gag, что указывает на эффекторный фенотип Т-клеток. (D) Сравнение поверхностных белков через 15 дней после переноса Т-клеток, трансдуцированных для экспрессии CD200R-9aas-CD28Cys⁺, T-клеток, трансдуцированных пустым вектором, и эндогенных Т-клеток. Т-клетки TCR_gag CD200R-9aas-CD28Cys экспрессируют сходные уровни белков клеточной поверхности по сравнению с контрольными Т-клетками TCR_gag.

На фигурах 4A-4D показано, что адоптивная иммунотерапия CD200R-CD28-трансдуцированными T-клетками может устранять диссеминированный лейкоз. (A) Схема эксперимента. Мышам C57BL/6 вводили 4×10⁶ клеток CD200⁺ FBL. Через пять дней Т-клетки TCR_gag CD200R-CD28tm, CD200R-CD28Cys, CD200R-9aas-CD28Cys или eGFP вводили i.p. обработанным цитоксаном мышам, несущим FBL, при 10⁵ клеток/мышь. IL-2 вводили каждые 2 дня (2×10⁴ ед./дозу) в когорте мышей, как указано. (B) Иллюстративный пример экспрессии белков клеточной поверхности в T-клетках, трансдуцированных CD200R-CD28tm, и нетрансдуцированных Т-клетках в день инъекции IL-2, определяемой с помощью проточной цитометрии. (C) Выживаемость мышей, обработанных в присутствии инъекций IL-2. (D) Выживаемость мышей, обработанных в отсутствие инъекций IL-2. Перенос Т-клеток TCR_gag CD200R-9aas-CD28Cys значительно улучшал выживаемость в отсутствие инъекций IL-2 (p < 0,05, логарифмический ранговый критерий Кокса-Мантеля).

На фигурах 5A-5C показано, что T-клетки, экспрессирующие CD200R-9aas-CD28Cys, не вызывают обнаруживаемое аутоиммунное повреждение печени или инфильтрацию нормальных тканей. (A) Схема эксперимента. Обработанным цитоксаном мышам Alb/Gag вводили 4×10⁶ клеток CD200⁺ FBL. Через пять дней Т-клетки TCR_gag CD200R-9aas-CD28Cys и eGFP вводили i.p. обработанным цитоксаном мышам, несущим FBL, при 10⁵ клеток/мышь. IL-2 вводили каждые 2 дня (2×10⁴ ед./дозу) в когорте мышей, как указано. Через три и 7 дней после переноса оценивали повреждение печени путем количественного определения уровней ферментов печени в сыворотке: аспартатаминотрансферазы (AST) и аланинаминотрансферазы (ALT). (B) Уровни AST и ALT, измеренные через 3 и 7 дней после переноса у мышей, не получавших Т-клетки, получавших контрольные Т-клетки, экспрессирующие GFP, или Т-клетки, экспрессирующие CD200R-9aas-CD28Cys, не изменялись при лечении. (C) Оценка Т-клеточной инфильтрации нормальной ткани. Ограниченное присутствие Т-клеток в ткани печени наблюдали с использованием антител, специфичных к маркеру Т-клеток CD3 (левая секция), без существенного отличия между реципиентами TCR_gagCD200R-9aas-CD28Cys или контрольных T-клеток TCR_gag (правая секция).

На фигурах 6A-6D показано, что костимулирующие сигнальные домены 4-1BB стимулируют накопление и эффекторную функцию трансдуцированных Т-клеток in vitro и способствуют выживаемости имеющих опухоль реципиентов трансдуцированных Т-клеток в ответ на опухолевые CD200⁺ клетки-мишени. (A) Схематическое представление конструкций CD200R-CD28 («V»), -4-1BB («VI») и -CD28-4-1BB («VII»). (B) Размножение трансдуцированных Т-клеток TCR_gag по сравнению с не трансдуцированными Т-клетками TCR_gag после недельной стимуляции облученными CD200⁺ FBL и спленоцитами. CD200R-4-1BB и CD200R-CD28-4-1BB также способствуют накоплению трансдуцированных Т-клеток in vitro. (C) CD200R-9aas-4-1BB⁺ CD8⁺ T-клетки демонстрируют повышенную способность к лизированию клеток CD200⁺ FBL in vitro по сравнению с контрольными с использованием стандартного анализа цитотоксичности на основе CFSE. Процент FBL от суммы FBL и контрольных опухолевых клеток определяли с помощью проточной цитометрии. Процент лизиса определяли путем деления процента FBL, инкубированных с Т-клетками, на процент FBL, инкубированных без Т-клеток. (D) CD200R-41BB-трансдуцированные Т-клетки также стимулируют выживаемость по сравнению с контрольными. Мышам C57BL/6 вводили 4×10⁶ клеток CD200⁺ FBL. Через пять дней Т-клетки TCR_gagCD200R-9aas-CD28, CD200R-9aas-4-1BB, CD200R-9aas-CD28-4-1BB или eGFP вводили i.p. обработанным цитоксаном мышам, несущим FBL, при 10⁵ клеток/мышь.

На фигурах 7A-7D показано, что первичные Т-клетки человека, трансдуцированные для экспрессии слитого белка с WT1-специфичным TCR и CD200Rtm-CD28, демонстрируют повышенную пролиферацию в отношении клеток-мишеней, которые экспрессируют CD200, и повышенное продуцирование цитокинов в ответ на опухолевые клетки, которые экспрессируют CD200. (A) Экспрессия WT1₁₂₆-специфичного TCR, C4 и CD200Rtm-CD28. (B) Экспрессия CD200 в клетках T2 и K562. T2-клетки проявляют эндогенную экспрессию CD200 на низком уровне. (C) Пролиферация Т-клеток, как указано с помощью CFSE. Клетки, которые пролиферируют в ответ на антиген, демонстрируют снижение интенсивности флуоресценции CFSE. Т-клетки, трансдуцированные как C4, так и IFP, демонстрируют повышенную пролиферацию по отношению к клеткам-мишеням, экспрессирующим низкие уровни CD200, по сравнению с Т-клетками, трансдуцированными только C4. (D) Продуцирование цитокинов в ответ на воздействие опухолевых клеток CD200dim, как измерено с помощью проточной цитометрии. Относительно контрольных Т-клеток, трансдуцированных только TCR C4, T-клетки, трансдуцированные как C4, так и IFP CD200Rtm-CD28, показали повышенное продуцирование цитокинов.

На фигурах 8A-8E показано, что слитые белки, содержащие внеклеточные компоненты SIRPα и костимулирующие сигнальные домены CD28, способствуют накоплению и пролиферации трансдуцированных Т-клеток in vitro. (A) Схематическое изображение иллюстративных конструкций SIRPα-CD28. Конструкция «I» содержит внеклеточный («EC») и трансмембранный («TM») домены SIRPα и внутриклеточный («IC») сигнальный домен CD28 (SIRPαtm-CD28). Конструкция «II» содержит внеклеточный домен SIRPα и трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (SIRPα-CD28tm). Конструкции «III-VI» также содержат часть внеклеточного домена CD28 до трансмембранного ближнего цистеина для содействия мультимеризации и улучшения передачи сигнала CD28. Для обеспечения дополнительных внеклеточных аминокислот (например, дополнительные девять (9) аминокислот для мышиных конструкций, или двенадцать (12) аминокислот для человеческих конструкций) некоторые конструкции имеют усеченную часть внеклеточного или внутриклеточного домена (например, SIRPα который сохраняет N-связанный участок гликозилирования). Конструкция IV имеет усеченную часть SIRPα, которая усекается на 6 аминокислот, чтобы сохранить N-связанный участок гликозилирования. Конструкция V имеет усеченную часть SIRPα, которая усекается на 9 аминокислот. Конструкция VI имеет усеченную часть SIRPα, которая усекается на 23 аминокислоты. Конструкции «I», «II» и «V» поддерживают короткое пространственное расстояние между клетками (например, между T-клеткой и антиген-презентирующей клеткой) и могут колокализоваться с TCR в cSMAC и передавать сильный костимулирующий сигнал. (B) Размножение трансдуцированных Т-клеток TCR_gag по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками TCR_gag после недельной стимуляции облученными SIRPα⁺ FBL и спленоцитами. Конструкции SIRPα-CD28 стимулируют накопление трансдуцированных Т-клеток in vitro, при этом SIRPα-9aas-CD28Cys демонстрирует повышенное накопление. (C) Пролиферация Т-клеток, трансдуцированных конструкциями SIRPα-CD28, в анализе пролиферации с разведением CellTrace Violet (CTV). Т-клетки, экспрессирующие конструкции SIRPα-CD28, сконструированные для поддержания расстояния T-клетка - опухолевая клетка, показали повышенную пролиферацию по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками. (D) Опухолевые CD47⁺ клетки уничтожались после совместного культивирования с SIRPα-CD28⁺ T-клетками, трансдуцированными для экспрессии конструкций SIRPαtm-CD28 или SIRPα-9aas-CD28Cys. Напротив, опухолевые клетки не уничножались при культивировании с Т-клетками, получавшими пустой вектор или усеченный SIRPα, лишенный своего внутриклеточного домена. (E) Результаты анализа IncuCyte, используемого для количественного определения уничтожения опухолевых CD47⁺ клеток. Опухолевые клетки CD47⁺ FBL трансдуцировали с помощью mCherry. Потеря красного сигнала указывает на уничтожение опухолевых клеток. Уничтожение опухолевых клеток испытывали при соотношении эффектор:мишень, составляющем 10:1, 2:1 и 0,4:1. SIRPα-CD28⁺ T-клетки уничтожали опухолевые CD47⁺ клетки даже при самом низком испытываемом соотношении эффектора к мишени.

На фигурах 9A и 9B показано, что слитые белки, содержащие внеклеточные компоненты PD-1 и костимулирующие сигнальные домены CD28, способствуют продуцированию цитокинов in vitro. (A) Схематическое изображение иллюстративных конструкций PD-1-CD28. Конструкция «I» содержит внеклеточный («EC») и трансмембранный («TM») домены PD-1 и внутриклеточный («IC») сигнальный домен CD28 (PD1tm-CD28). Конструкция «II» содержит внеклеточный домен PD-1 и трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (PD1-CD28tm). Конструкции «III-VII» также содержат часть внеклеточного домена CD28, смежную с трансмембранным ближним цистеином, для содействия мультимеризации и улучшения передачи сигнала CD28. Для обеспечения дополнительных внеклеточных аминокислот (например, дополнительные девять (9) аминокислот для мышиных конструкций, или двенадцать (12) аминокислот для человеческих конструкций) конструкции IV-VII имеют усеченную часть PD-1. Конструкция IV имеет усеченную часть PD-1, которая усекается на 9 аминокислот. Конструкция V имеет усеченную часть PD-1, которая усекается на 12 аминокислот. Конструкция VI имеет усеченную часть PD-1, которая усекается на 15 аминокислот. Конструкция VII имеет усеченную часть PD-1, которая усекается на 21 аминокислоту. Конструкции «I», «II» и «V» поддерживают короткое пространственное расстояние между клетками (например, между T-клеткой и антиген-презентирующей клеткой) и могут колокализоваться с TCR в cSMAC и передавать сильный костимулирующий сигнал. (B) PD1-CD28⁺ T-клетки демонстрировали повышенное продуцирование цитокинов в ответ на стимуляцию в течение 5 часов в присутствии Brefeldin A с клетками FBL, которые эндогенно экспрессируют лиганды PD-1, PD-L1 и PD-L2. Стимулированные Т-клетки оценивали в отношении внутриклеточной экспрессии эффекторных цитокинов, IFNγ и TNFα, с помощью проточной цитометрии.

На фигуре 10 показана коэкспрессия TCR C4 и IFP PD-1 (PD1-12aas-CD28Cys, PD1-15aas-CD28Cys или PD1-21aas-CD28Cys). T-клетки, трансдуцированные с помощью C4 и PD1-12aas-CD28Cys или PD1-15aas-CD28Cys, демонстрировали высокую эффективность трансдукции и экспрессию обоих белков.

На фигурах 11A-11C показано, что слитые белки, содержащие внеклеточные компоненты Fas и костимулирующие сигнальные домены CD28, накапливаются in vitro при стимуляции облученными клетками FBL. (A) Схематическое изображение иллюстративных конструкций Fas-CD28. Конструкция «I» содержит внеклеточный («EC») и трансмембранный («TM») домены Fas и внутриклеточный («IC») сигнальный домен CD28 (Fastm-CD28). Конструкция «II» содержит внеклеточный домен Fas и трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (Fas-CD28tm). Конструкции «III» и «IV» также содержат часть внеклеточного домена CD28, смежную с трансмембранным ближним цистеином, для содействия мультимеризации и улучшения передачи сигнала CD28. Для обеспечения дополнительных внеклеточных аминокислот (например, дополнительные девять (9) аминокислот для мышиных конструкций, или двенадцать (12) аминокислот для человеческих конструкций), конструкция IV имеет усеченную часть Fas, где внеклеточный домен Fas усекается на 9 аминокислот. Конструкции «I», «II» и «IV» поддерживают короткое пространственное расстояние между клетками (например, между T-клеткой и антиген-презентирующей клеткой) и могут колокализоваться с TCR в cSMAC и передавать сильный костимулирующий сигнал. (B) Накопление Т-клеток TCR_gag, трансдуцированных конструкциями Fas, при множественных стимуляциях облученными клетками FBL. Все конструкции способствовали накоплению Т-клеток по сравнению с контрольными Т-клетками. (C) Экспрессия конструкций Fas-CD28, но не полноразмерного (FL) Fas, способствует выживаемости и размножению Т-клеток при множественных стимуляциях in vitro.

На фигурах 12A и 12B показана структура и экспрессия слитых белков, содержащих внеклеточные компоненты LAG3 и костимулирующие сигнальные домены CD28. (A) Схематическое изображение иллюстративных конструкций LAG3-CD28. Конструкция «I» содержит внеклеточный («EC») и трансмембранный («TM») домены LAG3 и внутриклеточный («IC») сигнальный домен CD28 (LAG3tm-CD28). Конструкция «II» содержит внеклеточный домен LAG3 и трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (LAG3-CD28tm). Конструкции «III» и «IV» также содержат часть внеклеточного домена CD28, смежную с трансмембранным ближним цистеином, для содействия мультимеризации и улучшения передачи сигнала CD28. Для обеспечения дополнительных внеклеточных аминокислот (например, дополнительные девять (9) аминокислот для мышиных конструкций, или двенадцать (12) аминокислот для человеческих конструкций), конструкция IV имеет усеченную часть LAG3, где внеклеточный домен LAG3 усекается на 9 аминокислот. Конструкции «I», «II» и «IV» поддерживают короткое пространственное расстояние между клетками (например, между T-клеткой и антиген-презентирующей клеткой) и могут колокализоваться с TCR в cSMAC и передавать сильный костимулирующий сигнал. (B) Экспрессия конструкций LAG3-CD28 CD8⁺ T-клетками мыши, как определено с помощью окрашивания антителами к LAG3 и проточной цитометрии. T-клетки, трансдуцированные для экспрессии конструкций LAG3-CD28 (LAG3tm-CD28; LAG3-CD28tm; LAG3-CD28Cys; LAG3-9aas-CD28Cys), демонстрировали экспрессию данных конструкций в отличие от контрольных Т-клеток, которые получили пустой вектор.

На фигурах 13A и 13B показана структура и экспрессия слитых белков, содержащих внеклеточные компоненты TIM3 и костимулирующие сигнальные домены CD28. (A) Схематическое изображение иллюстративных конструкций TIM3-CD28. Конструкция «I» содержит внеклеточный («EC») и трансмембранный («TM») домены TIM3 и внутриклеточный («IC») сигнальный домен CD28 (TIM3tm-CD28). Конструкция «II» содержит внеклеточный домен TIM3 и трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (TIM3-CD28tm). Конструкции «III» и «IV» также содержат часть внеклеточного домена CD28, смежную с трансмембранным ближним цистеином, для содействия мультимеризации и улучшения передачи сигнала CD28. Для обеспечения дополнительных внеклеточных аминокислот (например, дополнительные девять (9) аминокислот для мышиных конструкций, или двенадцать (12) аминокислот для человеческих конструкций), конструкция IV имеет усеченную часть TIM3, где внеклеточный домен TIM3 усекается на 9 аминокислот. Конструкции «I», «II» и «IV» поддерживают короткое пространственное расстояние между клетками (например, между T-клеткой и антиген-презентирующей клеткой) и могут колокализоваться с TCR в cSMAC и передавать сильный костимулирующий сигнал. (B) Экспрессия конструкций TIM3-CD28 CD8⁺ T-клетками мыши, как определено с помощью окрашивания антителами к TIM3 и проточной цитометрии. T-клетки, трансдуцированные для экспрессии конструкций TIM3-CD28 (TIM3tm-CD28; TIM3-CD28tm; TIM3-CD28Cys; TIM3-9aas-CD28Cys), как правило, демонстрировали экспрессию данных конструкций в отличие от контрольных Т-клеток, которые получили пустой вектор.

Подробное описание

Настоящее раскрытие предусматривает слитые белки, которые модулируют передачу сигнала в клетке-хозяине, такой как иммунная клетка. Например, слитые белки по настоящему раскрытию могут обеспечивать активационный или костимулирующий сигнал в Т-клетке человека, где Т-клетка может быть необязательно сконструирована так, чтобы иметь предпочтительный антигенспецифический TCR. Эти иммуномодулирующие слитые белки (IFP) могут взаимодействовать с повсеместно экспрессирующимися мишенями или с мишенями, которые обычно активируются или сверхэкспрессируются в аномальных клетках (например, раковой клетке). Такие IFP имеют внеклеточный связывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен. При трансдукции Т-клеток сконструированными TCR (например, высокоаффинными TCR) и слитыми белками по настоящему раскрытию, которые генерируют сигналы активации, определенные варианты осуществления Т-клеток могут больше не требовать экзогенной костимуляции при взаимодействии, например, с опухолевой клеткой.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предусматривает клетки-хозяева (например, иммунные клетки, такие как Т-клетки, дендритные клетки, NK-клетки или т.п.), содержащие IFP, векторы, кодирующие IFP, и способы активации Т-клеток, содержащих IFP, для различных терапевтических применений, включая лечение заболевания у субъекта (например, рак, инфекционное заболевание).

Перед тем, как перейти к более подробному изложению настоящего раскрытия, для его понимания может быть полезным привести определения некоторых выражений, используемых в данном документе. Дополнительные определения изложены на всем протяжении настоящего раскрытия.

В настоящем описании любой диапазон концентраций, процентный диапазон, диапазон соотношений или диапазон целых чисел следует понимать с включением значения любого целого числа в пределах указанного диапазона и, при необходимости, его долей (таких как одна десятая и одна сотая целого числа), если не указано иное. Кроме того, любой числовой диапазон, указанный в данном документе, относящийся к любому из физических признаков, такому как субъединицы, размер или толщина полимера, следует понимать с включением любого целого числа в пределах указанного диапазона, если не указано иное. Используемое в данном документе выражение «приблизительно» означает ±20% к указанному диапазону, значению или позиции, если не указано иное. Следует понимать, что формы единственного числа, используемые в данном документе, относятся к «одному или более» перечисленным компонентам. Использование предлогов альтернативы (например, «или») следует понимать как обозначение одной, одной и другой или любой комбинации альтернатив. Используемые в данном документе выражения «включает», «имеет» и «содержит» используют синонимично, при этом подразумевают, что выражения и их варианты толкуют как неограничивающие.

Выражение «состоящий, по сути, из» ограничивает объем пункта формулы изобретения конкретными материалами или стадиями или тем, что существенно не влияет на основные характеристики заявленного изобретения. Например, домен белка, область или блок (например, связывающий домен, шарнирная область, линкерный блок) или белок (который может иметь одно или более из доменов, областей или блоков) «состоит, по сути, из» конкретной аминокислотной последовательности, когда аминокислотная последовательность домена, области или блока или белка содержит удлинения, делеции, мутации или любые их комбинации (например, аминокислоты на амино- или карбокси-конце или между доменами), которые, в комбинации, составляют не более 20% (например, не более 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%) от длины домена, области или блока или белка и не оказывают существенного влияния (т.e. не уменьшают активность более чем на 50%, например не более чем на 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или 1%) на активность домена(-ов), области(-ей), блока(-ов) или белка (например, аффинность связывания мишени у связывающего белка).

Используемое в данном документе выражение «гетерологичный», или «неэндогенный», или «экзогенный» относится к любому из гена, белка, соединения, молекулы или активности, которые не являются нативными для клетки-хозяина или субъекта, или представляет собой любое из гена, белка, соединения, молекулы или активности, нативных для хозяина или клетки-хозяина, но которые были изменены или подвергнуты мутации, так что структура, активность или и то, и другое различны у нативной и мутированной молекулы. В определенных вариантах осуществления гетерологичные, неэндогенные или экзогенные молекулы (например, рецепторы, лиганды) могут не быть эндогенными для клетки-хозяина или субъекта, но вместо этого нуклеиновая кислота, кодирующая такие молекулы, может быть добавлена в клетку-хозяина путем конъюгации, трансформации, трансфекции, электропорации или тому подобного, где добавленная молекула нуклеиновой кислоты может интегрироваться в геном клетки-хозяина или может существовать в виде внехромосомного генетического материала (например, в виде плазмиды или другого самореплицирующегося вектора). Выражение «гомологичный» или «гомолог» относится к молекуле или активности, обнаруженной или полученной из клетки-хозяина, вида или штамма. Например, гетерологичные или экзогенные молекула или ген, кодирующий молекулу, могут быть гомологичными нативному хозяину или молекуле клетки-хозяина или гену, который кодирует молекулу, соответственно, но могут иметь измененные структуру, последовательность, уровень экспрессии или их комбинации. Неэндогенная молекула может быть получена от того же вида, от другого вида или их комбинации.

Используемое в данном документе выражение «эндогенный» или «нативный» относится к гену, белку, соединению, молекуле или активности, которая в норме присутствует у хозяина или в клетке-хозяине и не имеет сконструированных изменений.

Выражение «связывающий домен» (также называемый «связывающей областью» или «связывающим фрагментом»), используемое в данном документе, относится к молекуле, такой как пептид, олигопептид, полипептид или белок, которая обладает способностью специфически и нековалентно ассоциироваться, сопрягаться или объединяться с молекулой-мишенью (например, CD200, CD47, CD19, CD20, CD22, ROR1, мезотелином, PD-L1, PD-L2, PSMA, WT-1, циклином-A1). Связывающий домен включает любого встречающегося в природе, синтетического, полусинтетического или полученного рекомбинантным способом партнера по связыванию для биологической молекулы или другой мишени, представляющей интерес, или ее связывающего белка. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен представляет собой антиген-связывающий домен, такой как антитело или Т-клеточный рецептор (TCR) или функциональный связывающий домен или его антиген-связывающий фрагмент. Иллюстративные связывающие домены включают эктодомены рецепторов (например, эктодомены CD200R, PD-1, CTLA4, BTLA, CD2, Fas) или их связывающие части, лиганды (например, цитокины, такие как IL35, хемокины) или их связывающие части, одноцепочечные вариабельные области антител (например, доменные антитела, sFv, scFv, Fab) или их связывающие части, антиген-связывающие области Т-клеточных рецепторов (TCR), такие как одноцепочечные TCR (scTCR), или синтетические полипептиды, выбранные по специфической способности связываться с биологической молекулой.

В некоторых вариантах осуществления выражение «специфически связывается» относится к ассоциации или сопряжению связывающего домена или его слитого белка с молекулой-мишенью с аффинностью или K_a (т.e. равновесной константой ассоциации для конкретного взаимодействия связывания с единицами 1/M), составляющей 10⁵ M^-1 или больше, или связыванию с такой молекулой-мишенью в то же время без существенных ассоциации или сопряжения с любыми другими молекулами или компонентами в образце. Связывающие домены (или их слитые белки) могут классифицироваться как «высокоаффинные» связывающие домены (или их слитые белки) или «низкоаффинные» связывающие домены (или их слитые белки). «Высокоаффинные» связывающие домены относятся к связывающим доменам с K_a по меньшей мере 10⁷ M^-1, по меньшей мере 10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M^-1 или по меньшей мере 10¹³ M^-1. «Низкоаффинные» связывающие домены относятся к связывающим доменам с K_a до 10⁷ M^-1, до 10⁶ M^-1, до 10⁵ M^-1. В качестве альтернативы, аффинность может быть определена как равновесная константа диссоциации (K_d) конкретного взаимодействия связывания с единицами M (например, от 10^-5 M до 10^-13 M). В определенных вариантах осуществления связывающий домен может характеризоваться «повышенной аффинностью», что относится к подвергнутому отбору или сконструированному связывающему домену с более сильным связыванием с антигеном-мишенью, чем у связывающего домена дикого типа (или исходного). Например, повышенная аффинность может быть связана с K_a (равновесной константой ассоциации) для антигена-мишени, которая выше, чем у связывающего домена дикого типа, или связана с K_d (константой диссоциации) для антигена-мишени, которая меньше, чем у связывающего домена дикого типа, или связана со скоростью диссоциации (K_off) для антигена-мишени, которая меньше, чем у связывающего домена дикого типа. Различные анализы известны для идентификации связывающих доменов по настоящему раскрытию, которые специфически связывают конкретную мишень, а также для определения степеней аффинности связывающего домена или слитого белка, такие как вестерн-блот-анализ, ELISA и Biacore® (см. также, например, Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; и патенты США №№5283173, 5468614 или их эквиваленты).

Используемое в данном документе выражение «слитый белок» относится к полипептиду, который в одной цепи имеет по меньшей мере два различных домена, где домены не встречаются естественным образом вместе в белке. Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок, можно сконструировать с использованием ПЦР, рекомбинантно сконструировать или т.п., или такие слитые белки можно получить с использованием способов белкового синтеза. Слитый белок может дополнительно содержать другие компоненты (например, ковалентно связанные), такие как метка или биологически активная молекула. В определенных вариантах осуществления слитый белок, экспрессированный или продуцированный клеткой-хозяином (например, T-клеткой), располагается на поверхности клетки, где слитый белок прикрепляется к клеточной мембране частью слитого белка, находящейся внеклеточно (например, содержащей связывающий домен), и частью слитого белка, находящейся внутриклеточно (например, содержащей сигнальный домен).

Выражение «гидрофобный компонент», используемое в данном документе, означает любую аминокислотную последовательность, имеющую трехмерную структуру, которая является термодинамически стабильной в клеточной мембране и обычно находится в диапазоне длин от приблизительно 15 аминокислот до приблизительно 30 аминокислот. Структура гидрофобного компонента может включать альфа-спираль, бета-цилиндр, бета-лист, бета-спираль или любую их комбинацию. В определенных вариантах осуществления гидрофобный компонент состоит из «трансмембранного домена» от известного трансмембранного белка, который представляет собой часть трансмембранного белка, способную встраиваться в клеточную мембрану или проникать через нее. В дополнительных вариантах осуществления гидрофобный компонент или трансмембранный домен могут располагаться между и соединять внеклеточные и внутриклеточные части слитого белка. Кроме того, гидрофобный компонент можно модифицировать так, чтобы он содержал заряженные области или гидрофильные остатки для облегчения межмолекулярных взаимодействий.

Используемый в данном документе «внутриклеточный сигнальный домен» представляет собой внутриклеточную часть молекулы, такую как та, которая используется в слитом белке по настоящему раскрытию, которая может непосредственно или опосредованно стимулировать ответ, например, костимулирующий, положительный или активирующий биологический или физиологический ответ в клетке при получении соответствующего сигнала. В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен является частью белка или белкового комплекса, который принимает сигнал при связывании или сам может непосредственно связываться с молекулой-мишенью для передачи сигнала другим компонентам в клетке. Внутриклеточный сигнальный домен может непосредственно стимулировать клеточный ответ, если он содержит один или более сигнальных доменов или мотивов, таких как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив immunoreceptor tyrosine-based activation motif(ITAM), киназный домен, костимулирующий домен и т.п. В других вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен будет опосредованно стимулировать клеточный ответ путем ассоциации с одним или более другими белками, которые, в свою очередь, непосредственно стимулируют клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или его функциональный фрагмент может быть из CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD40, CD47, CD79A, CD79B, CD134 (OX40), CD137 (4 1BB), CD150 (SLAMF1), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), CARD11, DAP10, DAP12, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, Ryk, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2 или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или его функциональный фрагмент не содержит CD3ζ.

«Домен мультимеризации», используемый в данном документе, относится к полипептидной молекуле или области, которая преимущественно взаимодействует или ассоциируется с другой полипептидной молекулой или областью непосредственно или опосредованно, где взаимодействие доменов мультимеризации существенно способствует или эффективно стимулирует мультимеризацию (т.e. образование димера, тримера, тетрамера или мультимеров более высоких порядков, которые могут быть гомодимером, гетеродимером, гомотримером, гетеротримером, гомомультимером, гетеромультимером и т.п.). Например, мультимеризация может быть обусловлена одним или более типами молекулярных сил, включая ковалентные связи (например, дисульфидные связи или мостики), ионные связи, металлические связи, электростатические взаимодействия, солевые мостики, диполь-дипольные силы, водородную связь, Ван-дер-Ваальсовы силы, гидрофобные взаимодействия или любую их комбинацию. Мультимер стабилен при соответствующих условиях (например, физиологических условиях, в водном растворе, подходящем для экспрессии, очистки или хранения рекомбинантных или сконструированных белков, или в условиях не денатурирующего или не восстанавливающего электрофореза). Иллюстративные домены мультимеризации могут содержать одну или более дисульфидных связей, мотив цинкового пальца, мотив лейциновой «молнии», спираль-поворот-спираль, спираль-петлю-спираль и т.п.

В определенных вариантах осуществления слитый белок может содержать «линкер», который может обеспечивать спейсерную функцию для облегчения взаимодействия двух одноцепочечных слитых белков или располагать один или более связывающих доменов таким образом, что полученная полипептидная структура сохраняет специфическую аффинность связывания с молекулой-мишенью или сохраняет сигнальную активность (например, активность эффекторного домена) или и то, и другое. Иллюстративные линкеры содержат от одного до десяти повторов Gly_xSer_y, где x и y независимо представляют собой целое число от 1 до 5.

«Соединительные аминокислоты» или «соединительные аминокислотные остатки» относятся к одному или более (например, приблизительно 2-20) аминокислотным остаткам между двумя соседними мотивами, областями или доменами слитого белка, например, между связывающим доменом и смежным гидрофобным компонентом или на одном или обоих концах гидрофобного компонента. Соединительные аминокислоты могут быть результатом моделирования конструкции слитого белка (например, аминокислотные остатки, полученные в результате применения участка для рестрикционного фермента при конструировании молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок). В определенных вариантах осуществления соединительные аминокислоты образуют линкер, такой как те, которые имеют от одного до приблизительно десяти повторов Gly_xSer_y, где x и y независимо представляют собой целое число от 1 до 5.

Используемое в данном документе выражение «клетка иммунной системы» означает любую клетку иммунной системы, которая происходит из гемопоэтической стволовой клетки в костном мозге, которая является источником двух основных линий, миелоидной клетки-предшественника (которая является источником миелоидных клеток, таких как моноциты, макрофаги, дендритные клетки, мегакариоциты и гранулоциты) и лимфоидной клетки-предшественника (которая является источником лимфоидных клеток, таких как Т-клетки, В-клетки и естественные клетки-киллеры (NK)). Иллюстративные клетки иммунной системы включают CD4⁺ T-клетку, CD8⁺ T-клетку, CD4^- CD8^- двойную отрицательную T-клетку, γδ T-клетку, регуляторную T-клетку, естественную клетку-киллера и дендритную клетку. Макрофаги и дендритные клетки можно назвать «антиген-презентирующими клетками» или «APC», которые являются специализированными клетками, способными активировать Т-клетки, когда рецептор главного комплекса гистосовместимости (MHC) на поверхности APC, образовавший комплекс с пептидом, взаимодействует с TCR на поверхности Т-клетки.

«T-клетка» представляет собой клетку иммунной системы, которая созревает в тимусе и продуцирует Т-клеточные рецепторы (TCR). Т-клетки могут быть наивными (не подвергнутыми воздействию антигена; с повышенной экспрессией CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 и CD45RA и сниженной экспрессией CD45RO по сравнению с T_CM), Т-клетками памяти (T_M) (подвергнутыми воздействию антигена и долгоживущими) и эффекторными клетками (подвергнутыми воздействию антигена, цитотоксическими). T_M можно дополнительно разделить на подмножества центральных Т-клеток памяти (T_CM, с повышенной экспрессией CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO и CD95 и сниженной экспрессией CD54RA по сравнению с наивными Т-клетками) и эффекторных Т-клеток памяти (T_EM, со сниженной экспрессией CD62L, CCR7, CD28, CD45RA и повышенной экспрессией CD127 по сравнению с наивными Т-клетками или T_CM). Эффекторные Т-клетки (T_E) относятся к подвергнутым воздействию антигена CD8⁺ цитотоксическим T-лимфоцитам, которые обладают сниженной экспрессией CD62L, CCR7, CD28 и являются положительными на гранзим и перфорин по сравнению с T_CM. Другие иллюстративные Т-клетки включают регуляторные Т-клетки, такие как CD4⁺ CD25⁺ (Foxp3⁺) регуляторные Т-клетки и Treg17-клетки, а также Т-клетки, рестриктированные по Tr1, Th3, CD8⁺CD28^- и Qa-1.

«T-клеточный рецептор» (TCR) относится к молекуле, находящейся на поверхности T-клеток (или T-лимфоцитов), которая совместно с CD3, как правило, отвечает за распознавание антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC). В большинстве T-клеток TCR представляет собой связанный дисульфидными связями гетеродимер высоковариабельных α- и β-цепей (также известных как TCRα и TCRβ, соответственно). В меньшей субпопуляции T-клеток TCR представляет собой гетеродимер вариабельных γ- и δ-цепей (также известных как TCRγ и TCRδ, соответственно). Каждая цепь TCR является представителем суперсемейства иммуноглобулинов и содержит один N-концевой вариабельный домен иммуноглобулина, один константный домен иммуноглобулина, трансмембранную область и короткий цитоплазматический «хвост» на C-концевой области (см. Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3^е изд., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). TCR, как используется в настоящем раскрытии, может быть получен от различных видов животных, в том числе человека, мыши, крысы, кошки, собаки, козы, лошади или других млекопитающих. TCR могут быть связанными с клетками (т.e. иметь трансмембранную область или домен) или могут быть в растворимой форме

Выражение «молекулы главного комплекса гистосовместимости» (молекулы MHC), которое используется взаимозаменяемо и понимается, так же, как относящееся к человеческому аналогу лейкоцитарного антигена человека (молекулы HLA), относится к гликопротеинам, которые доставляют пептидные антигены на поверхность клетки. Молекулы MHC класса I являются гетеродимерами, состоящими из трансмембранной α-цепи (с тремя α-доменами) и нековалентно связанного β2-микроглобулина. Молекулы MHC класса II состоят из двух трансмембранных гликопротеинов, α и β, оба из которых проходят через мембрану. Каждая цепь имеет два домена. Молекулы MHC (HLA) класса I доставляют пептиды, образующиеся в цитозоле, на поверхность клетки, где комплекс пептид:MHC (или пептид:HLA у человека) распознается CD8⁺ T-клетками. Молекулы MHC (HLA) класса II доставляют пептиды, образующиеся в везикулярной системе, на поверхность клетки, где они распознаются CD4⁺ T-клетками. Молекула MHC может быть получена от различных видов животных, в том числе человека, мыши, крысы или других млекопитающих.

«Молекула нуклеиновой кислоты» или полинуклеотид может быть в форме РНК или ДНК, что включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть двунитевой или однонитевой и в случае однонитевой может представлять собой кодирующую нить или некодирующую (антисмысловую нить). Кодирующая молекула может иметь кодирующую последовательность, идентичную кодирующей последовательности, известной из уровня техники, или может иметь другую кодирующую последовательность, которая в результате избыточности или вырожденности генетического кода или в результате сплайсинга может кодировать тот же полипептид.

Также рассматриваются варианты молекул нуклеиновых кислот или полинуклеотидов по настоящему раскрытию. Вариантные полинуклеотиды являются по меньшей мере на 90% и предпочтительно 95%, 99% или 99,9% идентичными одному из полинуклеотидов определенной последовательности, описываемой в данном документе, или теми, которые гибридизуются с одним из этих полинуклеотидов определенной последовательности в жестких условиях гибридизации с 0,015 М хлорида натрия, 0,0015 М цитрата натрия при температуре приблизительно 65-68°С или 0,015 М хлорида натрия, 0,0015 М цитрата натрия и 50% формамида при температуре приблизительно 42°С. Варианты полинуклеотидов сохраняют способность кодировать связывающий домен или его слитый белок, имеющий функциональные свойства, описанные в данном документе.

Выражение «жесткий» используется для обозначения условий, которые обычно понимаются в данной области техники как жесткие. Жесткость гибридизации в основном определяется температурой, ионной силой и концентрацией денатурирующих средств, таких как формамид. Примерами жестких условий для гибридизации и промывания являются 0,015 М хлорид натрия, 0,0015 М цитрат натрия при температуре приблизительно 65-68°С или 0,015 М хлорид натрия, 0,0015 М цитрат натрия и 50% формамид при температуре приблизительно 42°С (см. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1989).

Также могут быть использованы более жесткие условия (такие как более высокая температура, более низкая ионная сила, высший формамид или другое денатурирующее средство); однако это повлияет на скорость гибридизации. В случаях, когда речь идет о гибридизации дезоксиолигонуклеотидов, дополнительные иллюстративные жесткие условия гибридизации включают промывание в 6x SSC, 0,05% пирофосфата натрия при 37°C (для 14-основных олигонуклеотидов), 48°C (для 17-основных олигонуклеотидов), 55°C (для 20-основных олигонуклеотидов) и 60°C (для 23-основных олигонуклеотидов).

«Вектор» представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту. Векторами могут являться, например, плазмиды, космиды, вирусы или фаг. «Вектор экспрессии» представляет собой вектор, способный управлять экспрессией белка, кодируемого одним или более генами, находящимися в векторе, когда он находится в соответствующем окружении.

«Ретровирусы» представляют собой вирусы с РНК-геномом. «Гаммаретровирус» относится к роду семейства Retroviridae. Иллюстративные гаммаретровирусы включают вирус, поражающий стволовые клетки мышей, вирус лейкоза мышей, вирус лейкоза кошачьих, вирус саркомы кошачьих и вирусы ретикулоэндотелиоза птиц.

«Лентивирус» относится к роду ретровирусов, способных инфицировать делящиеся и неделящиеся клетки. Некоторые примеры лентивирусов включают HIV (вирус иммунодефицита человека: в том числе HIV 1 типа и HIV 2 типа); вирус инфекционной анемии лошадей; вирус иммунодефицита кошачьих (FIV); бычий вирус иммунодефицита (BIV) и вирус иммунодефицита обезьян (SIV).

Выражения «идентичный» или «процент идентичности» в контексте двух или более последовательностей молекул полипептида или нуклеиновой кислоты означает две или более последовательности или подпоследовательности, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми в определенной области (например, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности) при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в окне сравнения или в обозначенной области, как измерено с использованием способов, известных из уровня техники, таких как алгоритм сравнения последовательностей, путем ручного выравнивания или путем визуального осмотра. Например, предпочтительными алгоритмами, подходящими для определения процента идентичности последовательности и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389 и Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403, соответственно.

«Лечить», или «лечение», или «облегчение» относится к медицинскому контролю заболевания, нарушения или состояния у субъекта (например, человека или отличного от человека млекопитающего, такого как примат, лошадь, собака, мышь или крыса). В целом, соответствующую дозу или схему лечения, включающую клетку-хозяина, экспрессирующую слитый белок по настоящему раскрытию, и, необязательно вспомогательное вещество или вспомогательную терапию, вводят в количестве, достаточном, чтобы вызвать терапевтическую или профилактическую пользу. Терапевтическая или профилактическая/предупредительная польза включает в себя улучшение клинического исхода; уменьшение или ослабление симптомов, ассоциированных с заболеванием; снижение степени проявления симптомов; улучшение качества жизни; более длительный период состояния без признаков заболевания; уменьшение степени заболевания, стабилизацию болезненного состояния; задержку прогрессирования заболевания; ремиссию; выживание; длительное выживание или любую их комбинацию.

«Терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» слитого белка или клетки, экспрессирующей слитый белок по настоящему раскрытию (например, CD200R-CD28, SIRPα-CD28, CD200R-41BB, SIRPα-41BB, CD200R-CD28-41BB, SIRPα-CD28-4-1BB или другие такие слитые белки), в контексте заболевания или состояния, подлежащих лечению, относится к такому количеству слитого белка или количеству клеток, которое достаточно для улучшения одного или более симптомов заболевания, подлежащего лечению, статистически значимым образом (например, уменьшения инфекции, уменьшения размера опухоли, подавления развития рака или т.п.)

Иммуномодулирующие слитые белки (IFP)

В определенных аспектах настоящее раскрытие предусматривает слитый белок, содержащий внеклеточный компонент, гидрофобный компонент и внутриклеточный компонент. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный компонент включает связывающий домен, такой как тот, который специфически связывается с мишенью. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен получают из молекулы, которая обычно, например, в своей естественной обстановке, способна передавать отрицательный или ингибирующий сигнал при связывании со своим партнером по связыванию или лигандом или рецептором, таким как иммуноингибирующий рецептор или молекула контрольной точки, или мишень представляет собой ингибирующий рецептор или лиганд или молекулу контрольной точки или другой ингибирующий лиганд. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный компонент включает сигнальный домен, такой как костимулирующий сигнальный домен или сигнальная область молекулы, в целом способной передавать костимулирующий или положительный сигнал, например, иммунной клетке. Таким образом, в некоторых аспектах слитые белки способны передавать положительный или костимулирующий сигнал в ответ на событие связывания, которое в естественной обстановке приведет к ингибирующему сигналу.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок является таким, с которым достигается конкретное расстояние. Например, в некоторых вариантах осуществления комплекс слитый белок::мишень (такой как состоящий из внеклеточной части комплекса, образованного между слитым белком и мишенью посредством специфического связывания с ней) имеет определенную длину или охватывает определенное расстояние, такое как расстояние вплоть до расстояния между мембранами в иммунологическом синапсе или охваченное внеклеточной частью родственного комплекса между молекулой TCR и MHC, например, после их специфического распознавания с помощью TCR, или расстояние, охваченное внеклеточной частью комплекса, образованного между природной молекулой и ее естественным партнером по связыванию. В некоторых вариантах осуществления расстояние или длина достаточны для содействия колокализации слитого белка с антигенным рецептором или другой сигнальной молекулой при экспрессии в иммунной клетке, такой как Т-клетка, или вхождению в иммунологический синапс.

В качестве пояснения, иммунологический синапс представляет собой поверхность контакта между клетками, которая может образовываться между различными клетками, например, между иммунными клетками (Rossy et al., Frontiers in Immunol. 3: 1-12, 2012; Hatherley et al., Structure 21:820, 2013). Например, в случае Т-клетки, контактирующей с антиген-презентирующей клеткой (APC), иммунологический синапс может образовываться путем связывания TCR (находящегося на поверхности Т-клетки) с комплексом HLA-пептид (MHC-пептид для отличных от человека хозяев) (находящимся на поверхности, например, APC; молекулы HLA класса I могут находиться на поверхности всех ядерных клеток, тогда как HLA класса II условно могут экспрессироваться на всех типах клеток, но постоянно находятся на APC). Кроме того, иммунологический синапс может быть организован в супрамолекулярные активационные кластеры (SMAC), которые могут влиять на активацию лимфоцитов, управлять презентацией комплекса антиген-HLA (или антиген-MHC) лимфоцитам и управлять секрецией цитокинов или литических гранул между клетками. SMAC может состоять из трех структур, расположенных в концентрических окружностях: центральной области (cSMAC), содержащей большое количество TCR, а также костимулирующие и ингибирующие молекулы, периферической области (pSMAC), где группируются LFA-1 и талины, и дистальной области (dSMAC), которая обогащена молекулами CD43 и CD45. В определенных вариантах осуществления иммунологический синапс будет охватывать от приблизительно 10 нм до приблизительно 15 нм. Например, белковые взаимодействия, обнаруженные в иммунологическом синапсе, такие как взаимодействие TCR::HLA-пептид или взаимодействие слитый белок-мишень, обычно охватывают приблизительно 14 нм между мембранами. В определенных вариантах осуществления ширина SMAC в иммунологическом синапсе не превышает 15 нм.

В некоторых вариантах осуществления внеклеточная протяженность комплекса слитый белок: мишень такова, что он может локализоваться в конкретном компартменте иммунологического синапса. Некоторые комплексы, которые, как предполагается, локализуются в различных компартментах иммунологического синапса, хорошо охарактеризованы в отношении длины их внеклеточной протяженности. Например, считается, что комплекс MHC-TCR имеет внеклеточную протяженность приблизительно 10-15 нм, и полагают, что более сложные комплексы на основе интегрина имеют внеклеточную протяженность порядка приблизительно 40 нм (Alakoskela et al., Biophys J 100:2865, 2011). Дополнительные иллюстративные комплексы включают комплекс CD2-CD48, который, как считается, имеет внеклеточную протяженность приблизительно 12,8 нм (Milstein et al., J Biol Chem 283:34414, 2008). Кроме того, иллюстративные лигандсвязывающие молекулы, которые, как считается, локализуются в cSMAC, включают комплексы TCR и MHC, CD2, CD4, CD8, CD28 и их лиганды (Dustin et al., CSH Perspectives in Biology 2:a002311, 2010); таким образом, предполагается, что эти молекулы в комплексе с их природными лигандами имеют подходящий размер, чтобы локализоваться в cSMAC.

В некоторых аспектах длина или расстояние или приблизительная длина или расстояние конкретной конструкции или ее сконструированной внеклеточной части, такой как внеклеточная часть слитого белка, или комплекса любого из вышеперечисленного, например, с его партнером по связыванию, могут быть определены или смоделированы с помощью известных способов. В некоторых иллюстративных моделях третичную структуру белка, связывающие домены и другие характеристики можно аппроксимировать с использованием вводимой аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновых кислот. Третичную структуру белка можно использовать для аппроксимации размера внеклеточной части, гибкости и других характеристик, полезных для определения приблизительной длины внеклеточной части белка или его комплекса. В целом, способы моделирования или аппроксимации длины внеклеточной части белка являются известными. Например, molbiol-tools.ca и Swiss-Model содержат несколько инструментов, полезных для прогнозирования структуры белка (см. также Schwede, T., Structure 21:1531, 2013).

В определенных вариантах осуществления слитый белок по настоящему раскрытию, находящийся в комплексе, связанный или взаимодействующий с мишенью, способен находиться в иммунологическом синапсе. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть комплекса слитый белок::мишень охватывает иммунологический синапс. В других вариантах осуществления комплекс слитый белок::мишень локализуется в супрамолекулярном активационном кластере (SMAC), таком как cSMAC. В дополнительных вариантах осуществления внеклеточная часть комплекса слитый белок::мишень охватывает иммунологический синапс, определяемый внеклеточной частью взаимодействия TCR::HLA-пептид. В еще одном варианте осуществления длина внеклеточной части комплекса слитый белок::мишень составляет от приблизительно 12 нм до приблизительно 15 нм или составляет приблизительно 14 нм.

Расстояние между клеточными мембранами клеток, взаимодействующих в иммунологическом синапсе, можно измерить любым способом, известным из уровня техники. Например, в конкретных вариантах осуществления расстояние можно измерить способом субдифракционного разрешения или электронной микроскопии (James and Vale, Nature 487:64-69, 2012).

В конкретных вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, содержит внеклеточную часть, которая тянется менее чем на 40 нм от клеточной мембраны. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, содержит внеклеточную часть, которая тянется менее чем на 30 нм от клеточной мембраны. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, содержит внеклеточную часть, которая тянется менее чем на 20 нм от клеточной мембраны. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, содержит внеклеточную часть, которая тянется менее чем на 15 нм от клеточной мембраны.

В некоторых вариантах осуществления предусмотренные слитые белки обеспечивают преимущество наличия внеклеточной длины или пространственного расстояния по сравнению с расстоянием между клеточной мембраной(-ами), которое позволяет вход в синапс или колокализацию с антигенным рецептором, или которое имитирует расстояние или длину, присутствующую в природных белках. В некоторых вариантах осуществления, где внеклеточная часть слитого белка включает домен(-ы) из дополнительной молекулы, который получают не из той молекулы, из которой получен связывающий домен, длина внеклеточного компонента, содержащего связывающий домен, уменьшена, например усечена, по сравнению с внеклеточной областью природной молекулы для обеспечения такой же длины или расстояния. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, описываемый в данном документе, содержит внеклеточный компонент, содержащий внеклеточный домен рецептора клеточной поверхности и второй домен (например, линкер или внеклеточный домен второго рецептора клеточной поверхности). В некоторых таких вариантах осуществления для сохранения внеклеточного компонента, способного находиться в иммунологическом синапсе или охватывать иммунологический синапс при образовании комплекса с молекулой-мишенью, один или более доменов внеклеточного компонента могут быть усечены.

При некоторых заболеваниях (например, раке) амплитуда и качество ответа Т-клетки, возникающего в результате распознавания антигена Т-клеточным рецептором (TCR), могут быть дисрегулированы (например, уменьшены) из-за дисбаланса между костимулирующими и ингибирующими сигналами, что может привести к иммунной резистентности. Одним из преимуществ определенных слитых белков настоящего раскрытия является то, что первый сигнал может быть преобразован в качественно другой второй сигнал. Например, в некоторых вариантах осуществления слитые белки таковы, что отрицательный или ингибирующий сигнал можно эффективно превратить в положительный или костимулирующий сигнал, чтобы тем самым облегчить или минимизировать иммунную резистентность, связанную с заболеванием, таким как рак. Например, при связывании с мишенью, которая, если она связана ее естественным партнером по связыванию, приведет к ингибированию или доставке отрицательного сигнала, слитый белок, предусматриваемый в данном документе, в некоторых вариантах осуществления способен вместо этого доставлять положительный, например, косимулирующий сигнал, в клетку, в которой он экспрессируется, например, в Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления слитый белок по настоящему раскрытию содержит внеклеточный компонент, связанный с отрицательным сигналом, и внутриклеточный компонент, связанный с положительным сигналом. Иллюстративный рецептор, находящийся на поверхности Т-клеток, ассоциированный с цитотоксическим T-лимфоцитом антиген 4 (CTLA4 или CD152), может получить ингибирующий сигнал при связывании одним из его лигандов, CD80 или CD86, находящимся на APC. CTLA4 регулирует амплитуду ранней стадии активации Т-клеток, противодействуя костимулирующему Т-клеточному рецептору CD28 (см. Rudd et al., Immunol. Rev. 229:12, 2009). Другой иллюстративный рецептор, обнаруженный на поверхности Т-клеток, белок запрограммированной гибели клеток 1 (PD-1 или CD279), может принимать ингибирующий сигнал при связывании одним из его лигандов, PD-L1 (B7-H1, CD274) или PD-L2 (B7-DC, CD73), находящимся на APC. PD-1 ограничивает активность Т-клеток в периферических тканях во время воспаления и сводит к минимуму аутоиммунность (см. Keir et al., Annu. Rev. Immunol. 26:677, 2008). Типичные слитые белки по настоящему раскрытию, содержащие внеклеточный компонент, связанный с отрицательным сигналом (например, CTLA4 или PD-1), и внутриклеточный компонент, связанный с положительным сигналом (например, CD28, CD137), включают слитый белок CTLA4-CD28, слитый белок CTLA4-CD137, слитый белок CTLA4-CD28-CD137, слитый белок PD1-CD28, слитый белок PD1-CD137 или слитый белок PD1-CD28-CD137.

Слитые белки по настоящему раскрытию могут блокировать или уменьшать количество ингибирующих сигналов, принимаемых иммунной клеткой. Например, в некоторых вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, превращает ингибирующий сигнал в положительный сигнал, за счет чего уменьшается общее количество ингибирующих сигналов, принимаемых иммунной клеткой, или превращая обычно отрицательный или ингибирующий сигнал в положительный. В других вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, блокирует передачу сигнала рецептора дикого типа. Например, слитые белки с преобладанием отрицательного сигнала включены в объем настоящего раскрытия. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, связывается с рецептором дикого типа и блокирует передачу сигнала рецептора дикого типа путем образования олигомера с рецептором дикого типа.

Еще одно преимущество определенных слитых белков по настоящему раскрытию состоит в том, что более чем один такой слитый белок может экспрессироваться клеткой, обеспечивая множественные стимулирующие сигналы. Было замечено, что рекомбинантные TCR, обладающие несколькими костимулирующими доменами, могут не создавать адекватную передачу костимулирующего сигнала. Коэкспрессия нескольких иммуномодулирующих слитых белков, особенно тех, которые могут находиться в иммунологическом синапсе, может обеспечить передачу костимулирующего сигнала, необходимую Т-клеткам, чтобы избежать анергии и пролиферации.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок по настоящему раскрытию действует in trans относительно TCR или химерного антигенного рецептора (CAR) или другого антигенного рецептора. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, раскрываемый в данном документе, действует вне иммунологического синапса.

В еще одном аспекте слитый белок по настоящему раскрытию позволяет накапливать трансдуцированные Т-клетки при рестимуляции опухолевыми клетками, экспрессирующими лиганд, который связывается с слитым белком, без необходимости в сортировке.

В одном иллюстративном варианте осуществления предусмотрен слитый белок, содержащий (а) внеклеточную часть CD200R, (b) трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный сигнальный домен CD28. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, примыкающую к трансмембранному домену CD28. В дополнительных вариантах осуществления внеклеточная часть CD200R содержит по меньшей мере приблизительно 231 аминокислоту с N-конца CD200R. В еще одном варианте осуществления слитый белок дополнительно содержит внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB).

В другом иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает слитый белок, содержащий (а) внеклеточную часть SIRPα, (b) трансмембранный домен CD28, и (c) внутриклеточный сигнальный домен CD28. В некоторых вариантах осуществления слитый белок дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, примыкающую к трансмембранному домену CD28. В дополнительных вариантах осуществления внеклеточная часть SIRPα содержит по меньшей мере приблизительно 361 аминокислоту с N-конца SIRPα. В еще одном варианте осуществления слитый белок дополнительно содержит внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB).

Составные части слитых белков по настоящему раскрытию дополнительно подробно описаны в данном документе.

Внеклеточный компонент

Описываемый в данном документе слитый белок по настоящему раскрытию обычно содержит внеклеточный компонент, содержащий связывающий домен, который специфически связывает мишень. Связывание мишени с помощью связывающего домена слитого белка может (1) блокировать взаимодействие мишени с другой молекулой (например, блокировать или препятствовать взаимодействию рецептор-лиганд), (2) препятствовать, уменьшать или устранять определенные функции мишени (например, ингибирующую сигнальную трансдукцию), (3) индуцировать определенные биологические пути, которые обычно не индуцируются при связывании мишени (например, превращение ингибирующего или отрицательного сигнала в стимулирующий или положительный сигнал), например, в клетке, в которой экспрессируется слитый белок, или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления слитые белки, описываемые в данном документе, содержат внеклеточную часть, где внеклеточная часть содержит внеклеточную часть белка, связанного с отрицательным сигналом.

Иллюстративными связывающими доменами по настоящему раскрытию могут являться эктодомены рецепторов клеточной поверхности или их связывающие части, эктодомены лигандов клеточной поверхности, цитокины (например, IL35), хемокины, связывающие домены на основе антител, связывающие домены на основе TCR, нетрадиционные связывающие домены или любая их комбинация. Например, связывающие домены, содержащие эктодомен CD200R, SIRPα, CD279 (PD-1), CD2, CD95 (Fas), CTLA4 (CD152), CD223 (LAG3), CD272 (BTLA), A2aR, KIR, TIM3, CD300 или LPA5, входят в объем настоящего раскрытия. Используемое в данном документе выражение «эктодомен» из рецептора или лиганда клеточной поверхности включает полный внеклеточный домен или его функциональный (связывающий) фрагмент. В определенных вариантах осуществления эктодомен содержит мутированный внеклеточный домен или его функциональный (связывающий) фрагмент, который имеет более высокую авидность к мишени по сравнению с белком дикого типа или эталонным белком. В определенных вариантах осуществления эктодомен содержит домен, подобный вариабельному, или CDR домена, подобного вариабельному.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий CD200-связывающий домен, такой как эктодомен CD200R или его CD200-связывающую часть. В качестве пояснения, CD200R представляет собой рецептор, который связывается с CD200, мембранным белком типа 1 суперсемейства иммуноглобулинов (Tonks et al., Leukemia 21:566-568, 2007). Сообщалось, что CD200 активируется при различных злокачественных новообразованиях, включая лейкоз, множественную миелому и различные солидные опухоли (например, меланому, карциному молочной железы и плоскоклеточную карциному). Фактически, высокие уровни экспрессии CD200 были связаны с плохим прогнозом при остром миелоидном лейкозе (AML), и было показано, что передача сигнала CD200R оказывает ингибирующее действие на Т-клетки (Coles et al., Leukemia 26: 2148-2151, 2012). В определенных вариантах осуществления эктодомен CD200R включает полноразмерную внеклеточную часть белка CD200R, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка CD200R, связывающий фрагмент внеклеточной части белка CD200R или связывающий фрагмент внеклеточной части белка CD200R вместе с частью трансмембранного домена CD200R, или любую их комбинацию.

В дополнительных вариантах осуществления CD200R кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:2. В определенных других вариантах осуществления эктодомен CD200R содержит по меньшей мере 200 аминокислот с N-конца CD200R. В некоторых других вариантах осуществления CD200R кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:11. В других вариантах осуществления внеклеточная часть CD200R содержит по меньшей мере 180, 190, 200, 210, 220, 230, 231, 234 или 243 аминокислоты с N-конца CD200R. Например, в определенных вариантах осуществления CD200R кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:8. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления CD200R, эктодомен CD200R или любой его CD200R-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой CD200R человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены CD200R, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах осуществления CD200R содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления CD200R содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34. В определенных вариантах осуществления CD200R содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:31. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления CD200R, эктодомен CD200R или любой его CD200R-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой CD200R человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены CD200R, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:25.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий CD47-связывающий домен, такой как эктодомен SIRPα или его связывающую часть. В качестве пояснения, CD47 представляет собой широко экспрессируемый трансмембранный белок, который играет роль в защите клеток от фагоцитоза (Willingham et al., PNAS 109: 6662-6667, 2012). Связывание CD47 с SIRPα инициирует передачу сигнала SIRPα, который ингибирует фагоцитоз макрофагами. Соответственно, подавление SIRPα приведет к увеличению фагоцитоза макрофагами. SIRPα экспрессируется на множестве типов опухолей человека, включая AML, хронический миелолейкоз (CML), острый лимфобластный лейкоз (ALL), неходжкинскую лимфому (NHL), множественную миелому (MM), солидные опухоли легкого, мочевого пузыря и другие солидные опухоли. В определенных вариантах осуществления эктодомен SIRPα включает полноразмерную внеклеточную часть белка SIRPα, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка SIRPα, связывающий фрагмент внеклеточной части белка SIRPα и связывающий фрагмент внеклеточной части белка SIRPα вместе с частью трансмембранного домена SIRPα, или любую их комбинацию.

В дополнительных вариантах осуществления эктодомен SIRPα или его связывающая часть кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:17. В определенных вариантах осуществления эктодомен SIRPα содержит по меньшей мере 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 361, 370, 373 или более аминокислоты с N-конца SIRPα. В некоторых других вариантах осуществления SIRPα кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:21. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления SIRPα, эктодомен SIRPα или любой его SIRPα-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой SIRPα человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены SIRPα, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:17.

В дополнительных вариантах осуществления эктодомен SIRPα содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:40. В некоторых вариантах осуществления SIRPα содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:44. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления SIRPα, эктодомен SIRPα или любой его SIRPα-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой SIRPα человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены SIRPα, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:40.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий связывающий домен, который связывается с PD-L1, PD-L2 или и с тем, и с другим. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий эктодомен PD-1 или его лиганд-связывающую часть. В определенных вариантах осуществления эктодомен PD-1 включает полноразмерную внеклеточную часть белка PD-1, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка PD-1, связывающий фрагмент внеклеточной части белка PD-1 или связывающий фрагмент внеклеточной части белка PD-1 вместе с частью трансмембранного домена PD-1, или любую их комбинацию. В определенных вариантах осуществления эктодомен PD-1 содержит по меньшей мере 80, 90, 100, 110, 120, 125, 130, 132, 135, 137, 140, 149, 150, 155, 158, 160 или 170 аминокислот с N-конца PD-1. Например, в определенных вариантах осуществления эктодомен PD-1 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:91, 93 или 95. В дополнительных вариантах осуществления эктодомен PD-1 содержит по меньшей мере от приблизительно 90 аминокислот до по меньшей мере приблизительно 130 аминокислот из PD-1, как изложено под SEQ ID NO:60. В еще одном варианте осуществления эктодомен PD-1 содержит 170 аминокислот с N-конца эктодомена PD-1, как изложено под SEQ ID NO:90. В некоторых вариантах осуществления PD-1 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:89. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления PD-1, эктодомен PD-1 или любой его PD-1-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой PD-1 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены PD-1, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:60. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены PD-1, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:90. В других вариантах осуществления предусмотрены связывающие домены PD-1, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:89.

В определенных вариантах осуществления эктодомен PD-1 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:92, 94 или 96. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены PD-1, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 92, 94 или 96. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления PD-1, эктодомен PD-1 или любой его PD-1-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой PD-1 человека.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий эктодомен CD2. В определенных вариантах осуществления эктодомен CD2 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:61. В определенных вариантах осуществления эктодомен CD2 включает полноразмерную внеклеточную часть белка CD2, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка CD2, связывающий фрагмент внеклеточной части белка CD2 или связывающий фрагмент внеклеточной части белка CD2 вместе с частью трансмембранного домена CD2, или любую их комбинацию. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления CD2, эктодомен CD2 или любой его CD2-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой CD2 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены CD2, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной в GenBank под номером доступа NM_001767.3. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены CD2, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:61.

В некоторых вариантах осуществления эктодомен CD2 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:62. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены CD2, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:62. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления CD2, эктодомен CD2 или любой его CD2-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой CD2 человека.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий связывающий домен, который связывается с FasL. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий эктодомен Fas (CD95). Fas экспрессируется на опухолеассоциированной сосудистой сети и предотвращает инфильтрацию CD8 клеток путем индуцирования клеточной гибели. В определенных вариантах осуществления эктодомен Fas включает полноразмерную внеклеточную часть белка Fas, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка Fas, связывающий фрагмент внеклеточной части белка Fas и связывающий фрагмент внеклеточной части белка Fas вместе с частью трансмембранного домена Fas, или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления эктодомен Fas кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:71. В других вариантах осуществления эктодомен Fas содержит по меньшей мере 150, 160, 161, 166, 170 или 173 аминокислоты с N-конца Fas. Например, в определенных вариантах осуществления Fas кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:73. В определенных других вариантах осуществления Fas кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:75. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления Fas, эктодомен Fas или любой его Fas-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой Fas человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены Fas, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной в GenBank под номером доступа NM_000043.4. В других дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены Fas, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:71.

В некоторых вариантах осуществления эктодомен Fas содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:72. В определенных вариантах осуществления эктодомен Fas содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:74. В определенных других вариантах осуществления эктодомен Fas содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:76. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления Fas, эктодомен Fas или любой его Fas-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой Fas человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены Fas, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:72.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий эктодомен LAG3 (CD223). В определенных вариантах осуществления эктодомен LAG3 включает полноразмерную внеклеточную часть белка LAG3, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка LAG3, связывающий фрагмент внеклеточной части белка LAG3 и связывающий фрагмент внеклеточной части белка LAG3 вместе с частью трансмембранного домена LAG3, или любую их комбинацию. Например, в некоторых вариантах осуществления эктодомен LAG3 содержит приблизительно 420, 416, 415, 413 или 410 аминокислот с N-конца LAG3. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления LAG3, эктодомен LAG3 или любой его LAG3-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой LAG3 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены LAG3, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной в GenBank под номером доступа NM_ 002286.5.

В дополнительных вариантах осуществления LAG3 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:153. В определенных других вариантах осуществления эктодомен LAG3 содержит по меньшей мере 430, 435, 438, 440, 445 или 450 аминокислот с N-конца LAG3. Например, в определенных вариантах осуществления LAG3 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:161. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления LAG3, эктодомен LAG3 или любой его LAG3-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой LAG3 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены LAG3, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:153.

В некоторых вариантах осуществления LAG3 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:154. В некоторых вариантах осуществления LAG3 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:162. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления LAG3, эктодомен LAG3 или любой его LAG3-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой LAG3 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены LAG3, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:154.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит внеклеточный компонент, содержащий эктодомен TIM3. В определенных вариантах осуществления эктодомен TIM3 включает полноразмерную внеклеточную часть белка TIM3, полноразмерную зрелую внеклеточную часть белка TIM3, связывающий фрагмент внеклеточной части белка TIM3 и связывающий фрагмент внеклеточной части белка TIM3 вместе с частью трансмембранного домена TIM3, или любую их комбинацию. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления TIM3, эктодомен TIM3 или любой его TIM3-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой TIM3 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены TIM3, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной в GenBank под номером доступа NM_032782.4.

В дополнительных вариантах осуществления TIM3 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:167. В определенных других вариантах осуществления эктодомен TIM3 содержит по меньшей мере 180, 185, 190, 195 или 200 аминокислот с N-конца TIM3. Например, в определенных вариантах осуществления TIM3 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:177. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления TIM3, эктодомен TIM3 или любой его TIM3-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой TIM3 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены TIM3, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:167.

В некоторых вариантах осуществления TIM3 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:168. В некоторых вариантах осуществления TIM3 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:178. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления TIM3, эктодомен TIM3 или любой его TIM3-фрагмент, используемый в слитом белке по настоящему раскрытию, представляет собой TIM3 человека. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены эктодомены TIM3, имеющие последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 100% идентична эктодомену молекулы, имеющей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:168.

Связывающий домен может являться любым пептидом, который специфически связывает представляющую интерес мишень. Источники связывающих доменов включают вариабельные области антител от различных видов (которые могут быть в форме антител, sFvs, scFvs, Fabs, «grababody» на основе scFv или растворимых VH-доменов или доменных антител), в том числе человека, грызуна, птицы или овцы. Дополнительные источники связывающих доменов включают вариабельные области антител от других видов, таких как верблюдовые (от верблюдов, дромадеров или лам; Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414:521, 1997; Vincke et al., J. Biol. Chem. 284:3273, 2009; Hamers-Casterman et al., Nature 363:446, 1993 и Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275:413, 1998), акулы-няньки (Roux et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 95:11804, 1998), американский гидролаг (Nguyen et al., Immunogen. 54:39, 2002), или миноговые (Herrin et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 105:2040, 2008 и Alder et al. Nat. Immunol. 9:319, 2008). Эти антитела могут образовывать антиген-связывающие области с использованием только вариабельной области тяжелой цепи, т.e. эти функциональные антитела являются гомодимерами только тяжелых цепей (называемые «антителами, состоящими только из тяжелых цепей») (Jespers et al., Nat. Biotechnol. 22:1161, 2004; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 64:2853, 2004; Baral et al., Nature Med. 12:580, 2006; и Barthelemy et al., J. Biol. Chem. 283:3639, 2008).

Альтернативные источники нетрадиционных связывающих доменов по настоящему раскрытию включают последовательности, которые кодируют случайные пептидные библиотеки, или последовательности, которые кодируют сконструированное многообразие аминокислот в петлевых областях альтернативных, отличных от антител каркасов, таких как scTCR (см., например, Lake et al., Int. Immunol.11:745, 1999; Maynard et al., J. Immunol. Methods 306:51, 2005; патент США №8361794), домены фибриногена (см., например, Weisel et al., Science 230:1388, 1985), домены Куница (см., например, патент США №6423498), сконструированные белки анкириновых повторов (DARPin) (Binz et al., J. Mol. Biol. 332:489, 2003 и Binz et al., Nat. Biotechnol. 22:575, 2004), фибронектин-связывающие домены (аднектины или монотела) (Richards et al., J. Mol. Biol. 326:1475, 2003; Parker et al., Protein Eng. Des. Selec. 18:435, 2005 и Hackel et al. (2008) J. Mol. Biol. 381:1238-1252), минибелки с цистеиновыми узлами (Vita et al. (1995) Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 92:6404-6408; Martin et al. (2002) Nat. Biotechnol. 21:71, 2002 и Huang et al. (2005) Structure 13:755, 2005), домены тетратрикопептидных повторов (Main et al., Structure 11:497, 2003 и Cortajarena et al., ACS Chem. Biol. 3:161, 2008), домены богатых лейцином повторов (Stumpp et al., J. Mol. Biol. 332:471, 2003), липокалиновые домены (см., например, WO 2006/095164, Beste et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 96:1898, 1999 и Schönfeld et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 106:8198, 2009), V-подобные домены (см., например, публикацию заявки на патент США №2007/0065431), лектиновые домены C-типа (Zelensky and Gready, FEBS J. 272:6179, 2005; Beavil et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 89:753, 1992 и Sato et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 100:7779, 2003), mAb² или Fcab™ (см., например, публикации заявок на выдачу патента PCT №№ WO 2007/098934; WO 2006/072620), белки с повторами армадилло (см., например, Madhurantakam et al., Protein Sci. 21: 1015, 2012; публикация заявки на выдачу патента PCT № WO 2009/040338), аффилин (Ebersbach et al., J. Mol. Biol. 372: 172, 2007), аффибоди, авимеры, ноттины (пептиды с цистиновыми узлами) финомеры, атримеры, ассоциированный с цитотоксическим Т-лимфоцитом белок-4 (Weidle et al., Cancer Gen. Proteo. 10:155, 2013) или подобные (Nord et al., Protein Eng. 8:601, 1995; Nord et al., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord et al., Euro. J. Biochem. 268:4269, 2001; Binz et al., Nat. Biotechnol. 23:1257, 2005; Boersma and Plückthun, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849, 2011).

В некоторых вариантах осуществления связывающий домен представляет собой одноцепочечный T-клеточный рецептор (scTCR), содержащий цепи V_α/β и C_α/β (например, V_α-C_α, V_β-C_β, V_α-V_β) или содержащий пару V_α-C_α, V_β-C_β, V_α-V_β, специфичную для представляющей интерес мишени (например, комплекса пептид-MHC или комплекса пептид-HLA).

В определенных вариантах осуществления связывающий домен содержит или представляет собой последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или на 100% идентична эктодомену, молекулы, имеющей аминокислотную последовательность V_α, V_β, C_α или C_β TCR, где каждый CDR содержит ноль изменений или не более одного, двух или трех изменений из TCR или его фрагмента или производного, которое специфически связывается с представляющей интерес мишенью.

В определенных вариантах осуществления область V_α, V_β, C_α или C_β связывающего домена по настоящему раскрытию может быть получена из или на основе V_α, V_β, C_α или C_β известного TCR (например, высокоаффинного TCR) и содержать одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) вставок, одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) делеций или одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) аминокислотных замен (например, консервативных аминокислотных замен или неконсервативных аминокислотных замен), или комбинацию вышеуказанных изменений по сравнению с V_α, V_β, C_α или C_β известного TCR. Вставка, делеция или замена может находиться в любом месте в области V_α, V_β, C_α или C_β, в том числе на амино- или карбокси-конце или на обоих концах данной области, при условии, что каждый CDR содержит ноль изменений или не более одного, двух или трех изменений, и при условии, что связывающий домен, содержащий модифицированную область V_α, V_β, C_α или C_β, по-прежнему может специфически связывать свою мишень с аффинностью, подобной аффинности дикого типа. В определенных вариантах осуществления TCR имеет аффинность к комплексу пептид-HLA в диапазоне от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 500 мкМ. В дополнительных вариантах осуществления TCR имеет высокую аффинность к комплексу пептид-HLA в диапазоне от приблизительно 10 нM до приблизительно 200 пM.

В определенных аспектах слитый белок по настоящему раскрытию имеет внеклеточный компонент, состоящий из связывающего домена, который специфически связывает мишень (например, лиганд или рецептор), где внеклеточный компонент необязательно включает один или более другие функциональные подкомпоненты или домены, такие как домен мультимеризации, линкер, соединительные аминокислоты или любая их комбинация.

В определенных вариантах осуществления слитый белок, раскрытый в данном документе, также содержит дополнительную внеклеточную область в дополнение к связывающему домену или в дополнение к части, полученной из молекулы, из которой получен связывающий домен, такую как спейсер или домен мультимеризации. Например, в некоторых аспектах домен мультимеризации содержится в или является частью внеклеточного компонента слитого белка. Например, домен мультимеризации может быть создан путем изменения (например, мутации) внеклеточного компонента, или домен мультимеризации может быть создан путем добавления от 1 до приблизительно 50 аминокислотных остатков к внеклеточному компоненту. Домен мультимеризации может располагаться между связывающим доменом внеклеточного компонента и гидрофобным компонентом слитого белка по настоящему раскрытию. В определенных вариантах осуществления слитый белок, экспрессируемый на поверхности клетки, содержит домен мультимеризации во внеклеточном компоненте, который расположен близко к клеточной мембране на расстоянии от одной до 50 аминокислот от гидрофобного компонента. Например, домен мультимеризации слитого белка может содержать один или более остатков цистеина, расположенных на расстоянии 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислот от гидрофобного компонента слитого белка, где такой один или более остатков цистеина из одного слитого белка могут образовывать один или более дисульфидных мостиков с одним или более другими слитыми белками. В некоторых вариантах осуществления дополнительную внеклеточную часть получают из той же молекулы, из которой получают трансмембранную или стимулирующую область слитого белка.

В дополнительных вариантах осуществления взаимодействие(-я) между доменами мультимеризации двух или более слитых белков по существу способствуют или эффективно стимулируют сигнальную трансдукцию (например, стимуляцию или активацию иммунных клеток) по сравнению с мономером слитого белка. В определенных вариантах осуществления мультимеризация слитых белков стимулирует сигнальную трансдукцию в клетке-хозяине статистически значимым образом относительно мономеров слитого белка. В дополнительных вариантах осуществления мультимеризация слитых белков, которая стимулирует или усиливает сигнальную трансдукцию в клетке-хозяине, осуществляется через дисульфидный мостик.

Иллюстративный мультимер - это «димер», который относится к биологическому объекту, содержащему две молекулы, такие как два слитых белка, связанные друг с другом. Такой димер считается «гомодимером», когда два связанных слитых белка имеют по существу сходные или идентичные аминокислотные последовательности. Аналогичным образом, мультимеризация трех существенно или полностью идентичных слитых белков упоминается как «гомотример». В некоторых вариантах осуществления домен мультимеризации содержит по меньшей мере один остаток цистеина, где остаток цистеина домена мультимеризации из первого слитого белка может образовывать дисульфидный мостик с остатком цистеина домена мультимеризации из второго слитого белка. В определенных вариантах осуществления димер слитого белка образуется с помощью дисульфидного мостика. В других вариантах осуществления тример слитого белка образуется с помощью двух или более дисульфидных мостиков. В качестве альтернативы, димер, гомодимер, тример или гомотример могут мультимеризоваться с помощью мотива цинкового пальца или мотива лейциновой «молнии». В другом дополнительном варианте осуществления слитый белок содержит несколько доменов мультимеризации, которые могут быть расположены внеклеточно, внутриклеточно или и то, и другое.

В некоторых вариантах осуществления домен мультимеризации, содержащийся во внеклеточном компоненте слитого белка, содержит внеклеточную часть, примыкающую к гидрофобному компоненту. Например, в некоторых вариантах осуществления домен мультимеризации, содержащийся во внеклеточном компоненте слитого белка, содержит внеклеточную часть CD28, примыкающую к трансмембранному домену CD28. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть CD28 содержит приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или до приблизительно 25 аминокислот, смежных с трансмембранным доменом. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть CD28 содержит 9 аминокислот или 12 аминокислот, смежных с трансмембранным доменом. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть CD28 содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть CD28 содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:32. В еще одном иллюстративном варианте осуществления домен мультимеризации, содержащийся во внеклеточном компоненте слитого белка, содержит внеклеточную часть CD137 (4-1BB) (например, в диапазоне от одной до приблизительно 50 аминокислот), примыкающую к трансмембранному домену CD137 (4-1BB). В определенных вариантах осуществления домен мультимеризации и гидрофобный компонент получают из разных белков. Например, домен мультимеризации, содержащийся во внеклеточном компоненте слитого белка, содержит внеклеточную часть CD28, тянущуюся от трансмембранного домена CD137, или содержит внеклеточную часть CD137, примыкающую к трансмембранному домену CD28. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления домен мультимеризации может дополнительно содержать участок гликозилирования.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок может содержать линкерные или соединительные аминокислоты, соединяющие, например, внеклеточный компонент с доменом мультимеризации, или соединяющие внеклеточный компонент с гидрофобным компонентом, или соединяющие гидрофобный компонент с внутриклеточным компонентом. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой Gly_xSer_y, где x и y независимо представляют собой целое число от 1 до 5.

Молекула-мишень, которая специфически связывается связывающим доменом, содержащимся в слитом белке по настоящему раскрытию, может находиться на представляющей интерес клетке («клетке-мишени») или в ассоциации с ней. Иллюстративные клетки-мишени включают иммунную клетку, раковую клетку, клетку, связанную с аутоиммунным заболеванием или нарушением или с воспалительным заболеванием или нарушением, и инфекционные организм или клетку (например, бактерию, вирус, инфицированную вирусом клетку), или любую клетку, презентирующую антиген в комплексе с MHC или лейкоцитарным антигеном человека (HLA). Клетка инфекционного организма, такого как паразит млекопитающего, также предусматривается в качестве клетки-мишени. В некоторых вариантах осуществления мишень представляет собой иммуносупрессорый лиганд. В некоторых вариантах осуществления мишень выбрана из CD47, CD58, CD80, CD86, CD95L (FasL), CD200, CD270 (HVEM), CD274 (PD-L1) или GAL9.

Внутриклеточный компонент

Внутриклеточный компонент, содержащийся в слитом белке по настоящему раскрытию, будет иметь внутриклеточный сигнальный домен, такой как активирующий домен или костимулирующий домен, способный передавать функциональные сигналы в клетку. В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен будет опосредованно стимулировать клеточный ответ путем ассоциации с одним или более другими белками, которые непосредственно стимулируют клеточный ответ. Внутриклеточный сигнальный домен может включать один, два, три или более рецепторных сигнальных домена, костимулирующих домена или их комбинации. Любой внутриклеточный компонент, содержащий активирующий домен, костимулирующий домен или и то, и другое из любой из множества сигнальных молекул (например, рецепторов сигнальной трансдукции), можно использовать в слитых белках по настоящему раскрытию.

Используемое в данном документе выражение «внутриклеточный сигнальный домен» из рецептора или лиганда клеточной поверхности включает полный внутриклеточный домен, часть, содержащую внутриклеточный сигнальный домен, или его функциональный (сигнальный) фрагмент. В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит мутированный внутриклеточный домен или его функциональный (сигнальный) фрагмент, который имеет повышенную сигнальную активность по сравнению с внутриклеточным сигнальным доменом дикого типа или эталонным внутриклеточным сигнальным доменом.

Используемое в данном документе выражение «костимулирующая молекула» относится к рецептору или молекуле клеточной поверхности, которая может трансдуцировать сигналы в Т-клетки для положительной модуляции активации Т-клеток (Chen and Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). В качестве пояснения, активация и пролиферация Т-клеток требует двух сигналов, опосредованных вовлечением Т-клеточного антигенспецифического рецептора (TCR) и костимулирующего сигнала, наиболее типично, связывания CD28 с CD80 и CD86 (Ledbetter et al., Blood 75:1531, 1990).

Внутриклеточный сигнальный домен или его функциональный фрагмент, пригодный в слитых белках по настоящему раскрытию, может быть получен из CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD40, CD47, CD79A, CD79B, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), CARD11, DAP10, DAP12, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, Ryk, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2 или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или его функциональный фрагмент не содержит первичный сигнал. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен не содержит CD3ζ.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен слитого белка по настоящему раскрытию содержит CD28. Передача сигнала CD28 способствует пролиферации Т-клеток, стимулированных через TCR (Chen and Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). CD28 образует связанные дисульфидами гомодимеры за счет остатков цистеина, ближайших к трансмембранному домену (Lazar-Molnar et al., Cell Immunol. 244: 125-129, 2006). В определенных вариантах осуществления сигнальный домен CD28 включает полноразмерную внутриклеточную часть белка CD28, полноразмерную зрелую внутриклеточную часть белка CD28, сигнальный фрагмент внутриклеточной части белка CD28 и сигнальный фрагмент внутриклеточной части белка CD28 вместе с трансмембранным доменом или его фрагментом из CD28, или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен слитого белка содержит внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB). CD137 представляет собой костимулирующую молекулу, где связывание CD137 с его лигандом (4-1BBL или CD137L) ассоциировано с активацией и пролиферацией Т-клеток (Cheuk et al., Cancer Gene Therapy 11: 215-226, 2004). В определенных вариантах осуществления сигнальный домен CD137 включает полноразмерную внутриклеточную часть белка CD137, полноразмерную зрелую внутриклеточную часть белка CD137, сигнальный фрагмент внутриклеточной части белка CD137 и сигнальный фрагмент внутриклеточной части белка CD137 вместе с трансмембранным доменом или его фрагментом из CD137, или любую их комбинацию.

В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен рецептора лимфоцитов или содержит аминокислотные последовательности с одним или множеством иммунорецепторных тирозиновых активирующих мотивов immunoreceptor tyrosine-based activation motif(ITAM). В других дополнительных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит цитоплазматическую часть, которая ассоциирована с цитоплазматическим сигнальным белком, где цитоплазматический сигнальный белок представляет собой рецептор лимфоцитов или его сигнальный домен, белок, содержащий множество ITAM, костимулирующий фактор или любую их комбинацию.

В некоторых иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает слитый белок, имеющий внеклеточный компонент, содержащий внеклеточную часть CD200R, которая специфически связывает CD200, внутриклеточный компонент, содержащий внутриклеточную часть CD28, и гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, при условии, что комплекс слитый белок::мишень охватывает расстояние, аналогичное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе.

В конкретных вариантах осуществления внутриклеточный компонент слитого белка по настоящему раскрытию содержит CD28, CD137 (4-1BB) или и то, и другое. Например, в некоторых вариантах осуществления внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:5. В некоторых других вариантах осуществления внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:13. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный компонент содержит два внутриклеточных сигнальных домена, например, CD28 и CD137 (4-1BB). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:5 и аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:13.

Гидрофобный компонент

Гидрофобная часть, содержащаяся в одноцепочечном слитом белке по настоящему раскрытию, позволит слитому белку по данному раскрытию ассоциировать с клеточной мембраной таким образом, что часть слитого белка будет располагаться внеклеточно, а часть будет располагаться внутриклеточно (например, внутриклеточный сигнальный домен). Гидрофобный компонент, как правило, будет располагаться в пределах фосфолипидного бислоя клеточной мембраны. В определенных вариантах осуществления одна или более соединительных аминокислот могут располагаться между и соединять гидрофобную часть с внутриклеточным сигнальным доменом.

В определенных вариантах осуществления гидрофобный домен представляет собой трансмембранный домен, как, например, полученный из интегрального мембранного белка (например, рецептор, молекула кластера дифференцировки (CD), фермент, переносчик, молекула клеточной адгезии и т.п.). В некоторых вариантах осуществления гидрофобный домен содержит трансмембранный домен, находящийся или полученный из интегрального мембранного белка, где трансмембранный домен был модифицирован путем добавления, удаления или замены одной или более аминокислот по меньшей мере одной отличающейся аминокислотой, или любой их комбинацией, такой как заряженные или гидрофильные остатки, которые облегчают межмолекулярные взаимодействия. Таким образом, выражение «гидрофобный домен» включает трансмембранные домены, имеющие, например, модификации, которые могут снижать гидрофобность.

В некоторых вариантах осуществления гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD2, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD40, CD47, CD79A, CD79B, CD80, CD86, CD95 (Fas), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD200R, CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD272 (BTLA), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), TIM3, CD300, CD357 (GITR), A2aR, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, GAL9, KIR, Lck, LAT, LPA5, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PTCH2, ROR2, Ryk, Slp76, SIRPα, pTα, TCRα, TCRβ, TIM3, TRIM или Zap70. В конкретных вариантах осуществления гидрофобная часть представляет собой трансмембранный домен CD28, CD4, CD8, CD27 или CD137 (4-1BB). В определенных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD28 с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:4. В определенных других вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD200R с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:3. В других вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен SIRPα с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:18. В дополнительных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен CD2 с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:63. В других дополнительных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен Fas с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:77. В других дополнительных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен TIM3. В других дополнительных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен TIM3 с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:169. В других дополнительных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен LAG3. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен LAG3 с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:155.

Нуклеиновые кислоты и клетки-хозяева

В определенных аспектах настоящее раскрытие предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любой один или более из слитых белков, описанных в данном документе, которые могут быть иммуномодулирующими слитыми белками (IFP). Такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть вставлены в соответствующий вектор (например, вирусный вектор или невирусный плазмидный вектор) для введения в клетку-хозяина, представляющую интерес (например, гемопоэтическую клетку-предшественника, Т-клетку).

Используемый в данном документе выражение «рекомбинантный» или «отличный от природного» относится к организму, микроорганизму, клетке, молекуле нуклеиновой кислоты или вектору, которые включают по меньшей мере одно генетическое изменение или были модифицированы путем введения экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты, где такие изменения или модификации вводят с помощью способов генной инженерии. Генетические изменения включают, например, модификации с введением экспрессируемых молекул нуклеиновых кислот, кодирующих белки, слитые белки или ферменты, или другие добавления молекул нуклеиновых кислот, делеции, замены или другие функциональные нарушения генетического материала клетки. Дополнительные модификации включают, например, некодирующие регуляторные области, в которых модификации изменяют экспрессию гена или оперона. В определенных вариантах осуществления клетка, такая как Т-клетка, полученная от субъекта, может быть превращена в отличную от природной или рекомбинантную клетку (например, отличную от природной или рекомбинантную Т-клетку) путем введения нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый белок, описываемый в данном документе, и в результате чего клетка экспрессирует слитый белок.

В определенных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые белки, могут быть кодон-оптимизированы для повышения или увеличения до максимума экспрессии в определенных типах клеток, таких как T-клетки (Scholten et al., Clin. Immunol. 119: 135-145, 2006).

В одном иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию CD200R-CD28 (huCD200Rtm-CD28), где внеклеточный компонент содержит эктодомен CD200R, гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD200R и внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28. Например, в одном варианте осуществления предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты, изложенная под SEQ ID NO:1.

В другом иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию CD200R-CD28 (huCD200R-CD28tm), где гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28. Например, в одном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:6.

В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию CD200R-CD28, где внеклеточный компонент содержит усеченный внеклеточный домен CD200R и внеклеточную часть CD28. Например, внеклеточный домен CD200R может быть усечен на 9 аминокислот (например, huCD200R-9aas-CD28Cys, SEQ ID NO:7) или на 12 аминокислот (например, huCD200R-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO:10).

В одном иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию CD200R-CD28-4-1BB (huCD200R-9aas-CD28Cystm-41BBic или huCD200R-12aas-CD28Cystm-41BBic), где внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB). Например, в одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты имеет нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14.

В другом иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию CD200R-CD28-4-1BB (huCD200R-9aas-CD28Cys tm ic 41BBic или huCD200R-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic), где внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28 и CD137 (4-1BB). В одном варианте осуществления, например, нуклеиновая кислота по настоящему раскрытию имеет нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:15.

В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию SIRPα-CD28. Например, настоящее раскрытие включает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:16 (huSIRPαtm-CD28) или SEQ ID NO:19 (huSIRPα-CD28tm).

В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию SIRPα-CD28, где внеклеточный компонент содержит усеченный внеклеточный домен SIRPα и внеклеточную часть CD28. Например, внеклеточный домен SIRPα может быть усечен на 12 аминокислот (например, huSIRPα-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO:20).

В одном иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию SIRPα-CD28-4-1BB (huSIRPα-12aas-CD28Cystm-41BBic), где внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB). Например, в одном варианте осуществления нуклеиновая кислота по настоящему раскрытию имеет нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:22.

В другом иллюстративном варианте осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию SIRPα-CD28-4-1BB (huSIRPα-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic), где внутриклеточный компонент содержит внутриклеточный сигнальный домен CD28 и CD137 (4-1BB). В одном варианте осуществления, например, нуклеиновая кислота по настоящему раскрытию имеет нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:23.

В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию PD-1-CD28. Например, настоящее раскрытие включает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:97 (huPD1-CD28Cys).

В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию PD-1-CD28, где внеклеточный компонент содержит усеченный внеклеточный домен PD-1 и внеклеточную часть CD28. Например, внеклеточный домен PD-1 может быть усечен на 12 аминокислот (например, huPD1-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO:99), 15 аминокислот (например, huPD1-15aas-CD28Cys, SEQ ID NO:101), или 21 аминокислоту (например, huPD1-21aas-CD28Cys, SEQ ID NO:103).

В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию CD2-CD28. Например, настоящее раскрытие включает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:69 (huCD2-CD28Cys).

В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию Fas-CD28. Например, настоящее раскрытие включает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:83 (huFas-CD28Cys).

В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию Fas-CD28, где внеклеточный компонент содержит усеченный внеклеточный домен Fas и внеклеточную часть CD28. Например, внеклеточный домен Fas может быть усечен на 7 аминокислот (например, huFas-7aas-CD28Cys, SEQ ID NO:85) или 12 аминокислот (например, huFas-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO:87).

В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию TIM3-CD28. Например, настоящее раскрытие включает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:173 (huTIM3-CD28Cys). Также в объем настоящего раскрытия включен слитый белок TIM3-CD28, где внеклеточный компонент содержит усеченный внеклеточный домен TIM3 и внеклеточную часть CD28. Например, внеклеточный домен TIM3 может быть усечен на 12 аминокислот (например, huTIM3-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO:175).

В других иллюстративных вариантах осуществления настоящее раскрытие предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует конструкцию LAG3-CD28. Например, настоящее раскрытие включает молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:163 (huLAG3-CD28Cys). Также в объем настоящего раскрытия включен слитый белок LAG3-CD28, где внеклеточный компонент содержит усеченный внеклеточный домен LAG3 и внеклеточную часть CD28. Например, внеклеточный домен LAG3 может быть усечен на 12 аминокислот (например, huLAG3-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO:159).

Вектор, который кодирует нуклеокапсид вируса, называют в данном документе «вирусным вектором». Существует большое количество доступных вирусных векторов, пригодных для применения с композициями по настоящему раскрытию, в том числе те, которые идентифицированы для применений в генной терапии человека (см. Pfeifer and Verma, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177, 2001). Подходящие вирусные векторы включают векторы на основе РНК-вирусов, такие как векторы, полученные на основе ретровируса, например, векторы, полученные на основе вируса мышиного лейкоза Молони (MLV), и включают более сложные векторы, полученные на основе ретровируса, например, векторы, полученные на основе лентивируса. Векторы, полученные на основе HIV-1, относятся к этой категории. Другие примеры включают лентивирусные векторы, полученные из HIV-2, FIV, вируса инфекционной анемии лошадей, SIV и вируса Меди-Висна (лентивируса овец). Способы использования ретровирусных и лентивирусных вирусных векторов и упаковывающих клеток для трансдукции клеток млекопитающих-хозяев вирусными частицами, содержащими трансгены химерных антигенных рецепторов, известны из уровня техники и были ранее описаны, например, в патенте США №8119772; Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010; Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009. Ретровирусные и лентивирусные векторные конструкции и системы экспрессии также коммерчески доступны.

В определенных вариантах осуществления вирусный вектор применяют для введения неэндогенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, или неэндогенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, специфичный к мишени. Вирусный вектор может представлять собой ретровирусный вектор или лентивирусный вектор. Вирусный вектор может также включать последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие маркер трансдукции. Маркеры трансдукции для вирусных векторов известны из уровня техники и включают маркеры отбора, которые могут придавать устойчивость к лекарственным средствам, или детектируемые маркеры, такие как флуоресцентные маркеры, или белки клеточной поверхности, которые могут быть выявлены с помощью таких способов, как проточная цитометрия. В конкретных вариантах осуществления вирусный вектор дополнительно содержит ген-маркер для трансдукции, включающий зеленый флуоресцентный белок (GFP), внеклеточный домен CD2 человека или усеченный EGFR человека (huEGFRt; см. Wang et al., Blood 118:1255, 2011). Если геном вирусного вектора содержит множество последовательностей нуклеиновых кислот, которые необходимо экспрессировать в клетке-хозяине в виде отдельных транскриптов, то вирусный вектор может также содержать дополнительные последовательности между двумя (или более) транскриптами, что обеспечивает возможность бицистронной или мультицистронной экспрессии. Примеры таких последовательностей, применяемых в вирусных векторах, включают участки внутренней посадки рибосомы (IRES), участки расщепления фурином, вирусный пептид 2A или любую их комбинацию.

Другие векторы также можно применять для доставки полинуклеотидов, в том числе векторы на основе вирусной ДНК, включая, например, векторы на основе аденовируса и векторы на основе адено-ассоциированного вируса (AAV); векторы, полученные из вирусов простого герпеса (HSV), в том числе ампликон-векторы, HSV с недостаточной репликацией и аттенуированный HSV (Krisky et al., Gene Ther. 5: 1517, 1998).

Другие векторы, недавно разработанные для применений в генной терапии, также можно применять с композициями и способами по настоящему раскрытию. Такие векторы включают векторы, полученные из бакуловирусов и α-вирусов (Jolly, D. J. 1999. Emerging Viral Vectors. pp. 209-40, под ред. Friedmann T. The Development of Human Gene Therapy. Нью-Йорк: Cold Spring Harbor Lab) или плазмидные векторы (такие как «спящая красавица» и другие транспозонные векторы). В некоторых вариантах осуществления вирусный или плазмидный вектор дополнительно содержит генный маркер трансдукции (например, зеленый флуоресцентный белок, huEGFRt).

В некоторых вариантах осуществления вектор, кодирующий слитый белок, раскрываемый в данном документе, может кодировать более чем один слитый белок. Например, вектор может кодировать два разных слитых белка (например, первый слитый белок, содержащий эктодомен PD-1, и второй слитый белок, содержащий эктодомен TIM3).

В некоторых вариантах осуществления вектор, кодирующий слитый белок, раскрываемый в данном документе, может дополнительно содержать антигенспецифический TCR. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифический TCR является экзогенным. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифический TCR специфичен в отношении антигена, рестриктированного по HLA (MHC) класса I. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой рак-специфический антиген. Варианты осуществления, в которых рак-специфический антиген включает WT-1, мезотелин или циклин-A1, также входят в объем настоящего раскрытия. В других вариантах осуществления вектор, который кодирует слитый белок, раскрываемый в данном документе, дополнительно кодирует лиганд, который может представлять собой CD200, CD47, PD-L1 или CD58. В других вариантах осуществления вектор, который кодирует слитый белок, раскрываемый в данном документе, дополнительно кодирует siRNA для уменьшения экспрессии эндогенного рецептора. В некоторых конкретных вариантах осуществления эндогенный рецептор представляет собой CD200R, SIRPα, CD279 (PD-1), CD95 (Fas) или CD2.

В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева, способные экспрессировать слитый белок по настоящему раскрытию на поверхности клетки, являются иммунными клетками. В некоторых вариантах осуществления клетками-хозяевами, способными экспрессировать слитый белок по настоящему раскрытию на клеточной поверхности, являются T-клетки, в том числе первичные клетки или клеточные линии, полученные от человека, мыши, крысы или других млекопитающих. При получении от млекопитающего Т-клетка может быть получена из различных источников, включая кровь, костный мозг, лимфатический узел, тимус или другие ткани или жидкости. T-клетка может быть накоплена или очищена. T-клеточные линии хорошо известны из уровня техники, некоторые из них описаны в Sandberg et al., Leukemia 21:230, 2000. В определенных вариантах осуществления применяют Т-клетки, лишенные эндогенной экспрессии цепей TCRα и β. Такие T-клетки могут естественным образом не иметь эндогенной экспрессии цепей TCRα и β или могут быть модифицированы с блокированием экспрессии (например, T-клетки от трансгенных мышей, которые не экспрессируют цепи TCRα и β, или клетки, которых подвергли манипуляции для ингибирования экспрессии цепей TCRα и β) или с нокаутом TCRα-цепи, TCRβ-цепи или обоих генов. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки могут быть сконструированы для экспрессии TCR, специфичного для конкретного антигена.

В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, является функциональной Т-клеткой, такой как вирус-специфичная Т-клетка, специфичная к опухолевому антигену цитотоксичная Т-клетка, наивная Т-клетка, стволовая Т-клетка памяти, центральная или эффекторная Т-клетка памяти, γδ T-клетки или регуляторная CD4⁺ CD25⁺ T-клетка. В дополнительных вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок по настоящему раскрытию, вводят в совокупность CD8+ Т-клеток, наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ T_CM-клеток, CD8+ T_EM-клеток или любую их комбинацию. В других вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок по настоящему раскрытию, вводят в совокупность CD4+ T-клеток, наивных CD4+ T-клеток, CD4+ T_CM-клеток, CD4+ T_EM-клеток или любую их комбинацию. В других вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок по настоящему раскрытию, вводят в популяцию Т-клеток, обогащенную наивными CD8+ Т-клетками и CD8+ T_CM-клетками. В других вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок по настоящему раскрытию, вводят в популяцию T-клеток, обогащенную наивными CD4+ T-клетками и CD4+ T_CM-клетками. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления Т-клетки дополнительно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую сконструированный антигенспецифический Т-клеточный рецептор (TCR), сконструированный антигенспецифический высокоаффинный TCR, экзогенную костимулирующую молекулу, химерный антигенный рецептор (CAR) или любую их комбинацию.

В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, является функциональной естественной клеткой-киллером.

В культуру, используемую для размножения Т-клеток, можно добавлять один или более факторов роста-цитокинов, которые стимулируют пролиферацию Т-клеток, экспрессирующих слитый белок по настоящему раскрытию. Цитокины могут быть человеческими или отличными от человеческих. Иллюстративные факторы роста-цитокины, которые можно применить для стимуляции пролиферации Т-клеток, включают IL2, IL15 или подобные.

В некоторых вариантах осуществления Т-клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, представляет собой CD4⁺ Т-клетку, которая также экспрессирует антигенспецифический высокоаффинный TCR, специфичный в отношении антигена, рестриктированного по HLA (MHC) класса I (см. Soto et al., Cancer Immunol Immunother. 62: 359-369, 2013).

В определенных вариантах осуществления Т-клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, также экспрессирует рекомбинантный TCR, специфичный к раковому антигену. В некоторых вариантах осуществления раковый антиген представляет собой WT1. «WT1»означает опухоль Вильма 1, фактор транскрипции, который содержит четыре мотива «цинковые пальцы» на C-конце и богатый пролином/глутамином ДНК-связывающий домен на N-конце. WT1 играет важную роль в нормальном развитии мочеполовой системы и является мутировавшим у небольшой субпопуляции пациентов с опухолями Вильма. Высокий уровень экспрессии WT1 наблюдается при различных формах рака, включая рак молочной железы, рак яичников, формы острого лейкоза, сосудистые новообразования, формы меланомы, рак толстой кишки, рак легких, рак щитовидной железы, саркому кости и мягких тканей и рак пищевода. Альтернативный сплайсинг был описан для WT1.

В определенных вариантах осуществления Т-клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, также экспрессирует рекомбинантный TCR, специфичный к мезотелину. «Мезотелин» (MSLN) относится к гену, который кодирует белок-предшественник, который расщепляется на два продукта: фактор стимуляции мегакариоцитов и мезотелин. Фактор стимуляции мегакариоцитов действует как цитокин, который может стимулировать колониеобразование мегакариоцитов в костном мозге. Мезотелин представляет собой закрепленный с помощью гликозилфосфатидилинозита белок клеточной поверхности, который может функционировать как белок клеточной адгезии. Этот белок сверхэкспрессируется в эпителиальных мезотелиомах, формах рака яичников и в отдельных формах плоскоклеточных карцином. Альтернативный сплайсинг дает в результате множество вариантов транскриптов.

В определенных вариантах осуществления Т-клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, также экспрессирует рекомбинантный TCR, специфичный к циклину-A1.

В определенных вариантах осуществления Т-клетка-хозяин, трансфицированная для экспрессии слитого белка по настоящему раскрытию, также экспрессирует CAR.

В других вариантах осуществления клетка-хозяин, которая экспрессирует слитый белок, раскрываемый в данном документе, дополнительно содержит лиганд, который может представлять собой CD200, CD47, PD-L1 или CD58. В других вариантах осуществления клетка-хозяин, которая экспрессирует слитый белок, раскрываемый в данном документе, дополнительно экспрессирует siRNA для уменьшения экспрессии эндогенного рецептора. В некоторых конкретных вариантах осуществления эндогенный рецептор представляет собой CD200R, SIRPα, CD279 (PD-1), CD95 (Fas) или CD2.

В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин, которая экспрессирует слитый белок, раскрываемый в данном документе, может экспрессировать более чем один слитый белок. Например, клетка-хозяин может экспрессировать два разных слитых белка (например, первый слитый белок, содержащий эктодомен PD-1, и второй слитый белок, содержащий эктодомен TIM3).

Применения

Заболевания, которые можно лечить с использованием клеток, экспрессирующих слитые белки, описываемые в настоящем раскрытии, включают рак, инфекционные заболевания (вирусные, бактериальные, протозойные инфекции), иммунные заболевания (например, аутоиммунные) или заболевания, связанные со старением (например, физиологическим старением). Адоптивная иммунная и генная терапия представляют собой перспективные способы лечения различных типов рака (Morgan et al., Science 314:126, 2006; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; June, J. Clin. Invest. 117:1466, 2007) и инфекционных заболеваний (Kitchen et al., PLoS One 4:38208, 2009; Rossi et al., Nat. Biotechnol. 25:1444, 2007; Zhang et al., PLoS Pathog. 6:e1001018, 2010; Luo et al., J. Mol. Med. 89:903, 2011).

Разнообразные формы рака, включая солидные опухоли и формы лейкоза, восприимчивы к композициям и способам, раскрытым в данном документе. Иллюстративные типы рака, которые можно лечить, включают аденокарциному молочной железы, предстательной железы и толстой кишки; все формы бронхогенной карциномы легкого; миелоидный лейкоз; меланому; гепатому; нейробластому; папиллому; апудому; хористому; бранхиому; злокачественный карциноидный синдром; карциноидную болезнь сердца и карциному (например, крациносаркому Уокера, базально-клеточную карциному, базальную плоскоклеточную карциному, карциному Брауна-Пирса, внутрипротоковую карциному, опухоль Эрлиха, карциному Кребса 2, карциному из клеток Меркеля, слизеобразующий рак, немелкоклеточный рак легкого, овсяноклеточный рак, папиллярную карциному, фиброзный рак, рак бронха, бронхогенный рак, плоскоклеточный рак и переходноклеточный рак). Другие типы рака, которые можно лечить, включают гистиоцитарные нарушения; злокачественный гистиоцитоз; лейкоз; болезнь Ходжкина; средиземноморскую лимфому; неходжкинскую лимфому; плазмоцитому; ретикулоэндотелиоз; меланому; хондробластому; хондрому; хондросаркому; фиброму; фибросаркому; гигантоклеточные опухоли; гистиоцитому; липому; липосаркому; мезотелиому; миксому; миксосаркому; остеому; остеосаркому; хордому; краниофарингиому; дисгерминому; гамартому; мезенхимому; мезонефрому; миосаркому; амелобластому; цементому; одонтому; тератому; тимому; трофобластическую опухоль. Кроме того, следующие типы рака также рассматриваются как поддающиеся лечению: аденома; холангиома; холестеатома; циклиндрома; цистаденокарцинома; цистаденома; гранулезоклеточная опухоль; арренобластома; гепатома; гидраденома; инсулома; опухоль из клеток Лейдига; папиллома; опухоль из клеток Сертоли; текаклеточная опухоль; лейомиома; лейомиосаркома; зернисто-клеточная миобластома; миома; миосаркома; рабдомиома; рабдомиосаркома; эпендимома; ганглионеврома; глиома; медуллобластома; менингиома; невринома; нейробластома; эпендимома; нейрофиброма; неврома; параганглиома; нехромаффинная параганглиома. Типы рака, которые можно лечить, также включают ангиокератому; ангиолимфоидную гиперплазию с эозинофилией; склерозирующую ангиому; ангиоматоз; гломангиому; гемангиоэндотелиому; гемангиому; гемангиоперицитому; гемангиосаркому; лимфангиому; лимфангиомиому; лимфангиосаркому; пинеалому; карциносаркому; хондросаркому; листовидную цистосаркому; фибросаркому; гемангиосаркому; леймиосаркому; лейкосаркому; липосаркому; лимфангиосаркому; миосаркому; миксосаркому; карциному яичников; рабдомиосаркому; саркому; новообразования; нейрофиброматоз и дисплазию шейки матки.

Иллюстрацией различных гиперпролиферативных нарушений, восприимчивых к терапии с помощью Т-клеток со слитым белком, являются формы B-клеточного рака, в том числе B-клеточные лимфомы (такие как различные формы болезни Ходжкина, неходжкинская лимфома (NHL) или лимфомы центральной нервной системы), лейкозы (такие как острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL), злокачественный ретикулоэндотелиоз, бластная трансформация В-клеток при хроническом миелоидном лейкозе) и миеломы (такие как множественная миелома). Дополнительные формы В-клеточного рака включают мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому маргинальной зоны селезенки, плазмаклеточную миелому, солитарную плазмоцитому кости, экстраоссальную плазмоцитому, экстранодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT), нодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны, фолликулярную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, диффузную В-крупноклеточную лимфому, В-крупноклеточную лимфому средостения (из тимуса), внутрисосудистую В-крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, лимфому/лейкоз Беркитта, формы B-клеточной пролиферации с неопределенным потенциалом злокачественности, лимфогранулематоз и посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение.

Воспалительные и аутоиммунные заболевания включают артрит, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, полихондрит, псориатический артрит, псориаз, дерматит, полимиозит/дерматомиозит, миозит с включенными тельцами, воспалительный миозит, токсический эпидермальный некролиз, системную склеродермию и склероз, CREST-синдром, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS), менингит, энцефалит, увеит, колит, гломерулонефрит, аллергические состояния, экзему, астму, состояния, включающие инфильтрацию Т-клеток и хронические воспалительные реакции, атеросклероз, аутоиммунный миокардит, нарушение адгезии лейкоцитов, системную красную волчанку (SLE), подострую кожную красную волчанку, дискоидную волчанку, миелит при системной красной волчанке, энцефалит при системной красной волчанке, ювенильный диабет, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит, нейромиелит зрительного нерва, острый ревматизм, хорею Сиденгама, иммунные реакции, ассоциированные с острой гиперчувствительностью и гиперчувствительностью замедленного типа, опосредованными цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, гранулематоз, в том числе гранулематоз Вегенера и болезнь Чарга-Стросса, агранулоцитоз, васкулит (в том числе аллергический васкулит/ангиит, ANCA и ревматоидный васкулит), апластическую анемию, анемию Даймонда-Блекфана, иммунную гемолитическую анемию, в том числе аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), пернициозную анемию, истинную эритроцитарную аплазию (PRCA), дефицит фактора VIII, гемофилию А, аутоиммунную нейтропению, панцитопению, лейкопению, заболевания, связанные с диапедезом лейкоцитов, воспалительные заболевания центральной нервной системы (CNS), синдром полиорганной недостаточности, миастению гравис, заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело, легочный гемосидероз с гломерулонефритом, антифосфолипидный синдром, аллергический неврит, болезнь Бехчета, синдром Каслмана, синдром Гудпасчера, миастенический синдром Ламберта-Итона, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, отторжение трансплантата паренхиматозных органов, болезнь «трансплантат против хозяина» (GVHD), буллезный пемфигоид, пемфигус, формы аутоиммунной полиэндокринопатии, формы серонегативной спондилоартропатии, болезнь Рейтера, синдром скованного человека, гигантоклеточный артериит, нефрит, ассоциированный с нарушенным выведением иммунных комплексов, IgA-нефропатию, формы IgM-полиневропатии или опосредованную IgM невропатию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), тромбоцитопенический акроангиотромбоз (TTP), пурпуру Шенлейна-Геноха, аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунное заболевание яичек и яичников, в том числе аутоиммунные орхит и оофорит, первичный гипотиреоз, аутоиммунные эндокринные заболевания, в том числе аутоиммунный тиреоидит, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото), подострый тиреоидит, идиопатический гипотиреоз, болезнь Аддисона, болезнь Грейвса, аутоиммунные полигландулярные синдромы (или синдромы полигландулярной эндокринопатии), диабет I типа, также известный как инсулин-зависимый сахарный диабет (IDDM) и синдром Шихана, аутоиммунный гепатит, лимфоидный интерстициальный пневмонит (HIV), облитерирующий бронхиолит (без пересадки), неспецифическую интерстициальную пневмонию (NSIP), синдром Гийена-Барре, васкулит крупных сосудов (в том числе ревматическую полимиалгию и гигантоклеточный артериит (синдром Такаясу), васкулит средних сосудов (в том числе болезнь Кавасаки и узелковый полиартериит), узелковый полиартериит (PAN), анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Бергера (IgA-нефропатию), быстро прогрессирующий гломерулонефрит, первичный билиарный цирроз печени, целиакию-спру (глютеновую энтеропатию), криоглобулинемию, криоглобулинемию, ассоциированную с гепатитом, латеральный амиотрофический склероз (ALS), ишемическую болезнь сердца, семейную средиземноморскую лихорадку, микроскопический полиангиит, синдром Когана, синдром Вискотта-Олдрича и облитерирующий тромбангиит.

В конкретных вариантах осуществления способ лечения субъекта с использованием слитого белка, раскрываемого в данном документе, включает лечение острого миелоцитарного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза и хронического миелоцитарного лейкоза.

Инфекционные заболевания включают заболевания, связанные с возбудителями инфекции, которые включают любое из множества бактерий (например, патогенных E. coli, S. typhimurium, P. aeruginosa, B. anthracis, C. botulinum, C. difficile, C. perfringens, H. pylori, V. cholerae, Listeria spp., Rickettsia spp., Chlamydia spp. и т.п.), микобактерий и паразитов (в том числе любого из известных паразитарных представителей Protozoa). Инфекционные вирусы включают вирусы эукариотических клеток, такие как аденовирус, буньявирус, герпесвирус, паповавирус, папилломавирус (например, HPV), парамиксовирус, пикорнавирус, рабдовирус (например, вирус бешенства), ортомиксовирус (например, вирус гриппа), поксвирус (например, вирус коровьей оспы), реовирус, ретровирус, лентивирус (например, HIV), флавивирус (например, HCV, HBV) или т.п. В определенных вариантах осуществления инфекцию, вызванную цитозольными патогенами, антигены которых обрабатываются и презентируются молекулами HLA (MHC) класса I, лечат с использованием слитых белков по настоящему раскрытию.

Слитый белок по настоящему раскрытию можно вводить субъекту в связанной с клеткой форме (например, генная терапия популяции клеток-мишеней (зрелых T-клеток (например, CD8⁺ или CD4⁺ T-клеток) или других клеток Т-клеточной линии дифференцировки)). В конкретном варианте осуществления клетки Т-клеточной линии дифференцировки, экспрессирующие слитые белки, вводимые субъекту, являются сингенными, аллогенными или аутологичными клетками.

Фармацевтические композиции, содержащие слитые белки по настоящему раскрытию, можно вводить способом, подходящим для заболевания или состояния, подлежащих лечению (или предупреждению), определяемым специалистами в области медицины. Соответствующая доза, подходящая длительность и частота введения композиций будут определяться такими факторами, как состояние пациента, габариты, тип и тяжесть заболевания, конкретная форма активного ингредиента и способ введения. Настоящее раскрытие предусматривает фармацевтические композиции, содержащие клетки, экспрессирующие слитый белок, раскрываемый в данном документе, и фармацевтически приемлемые носитель, растворители или наполнитель. Подходящие наполнители включают воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин или подобное и их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления раскрытие относится к способу увеличения активности иммунной клетки, увеличения или продления иммунного ответа, стимулирования антигенспецифического ответа Т-клеток, ингибирования иммуносупрессорного сигнального пути, лечения рака или опухоли, подавления иммунной резистентности раковых клеток или лечения инфекции, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества клетки-хозяина, экспрессирующей слитый белок, описываемый в данном документе. В дополнительных вариантах осуществления клетка-хозяин для применения в любом из вышеупомянутых способов дополнительно экспрессирует сконструированный антигенспецифический TCR, сконструированный антигенспецифический высокоаффинный TCR, CAR, костимулирующую молекулу или любую их комбинацию. В конкретных вариантах осуществления предусмотрены способы лечения лейкоза, включающие коэкспрессию слитого белка, раскрываемого в данном документе, и рекомбинантного антигенспецифического TCR.

В некоторых вариантах осуществления предусмотрены способы индуцирования или усиления ответа HLA класса I с помощью CD4+ Т-клетки, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества CD4+ Т-клетки, экспрессирующей слитый белок, описываемый в данном документе. В дополнительных вариантах осуществления клетка-хозяин для применения в индуцировании или усилении ответа HLA класса I с помощью CD4+ Т-клетки дополнительно экспрессирует сконструированный антигенспецифический TCR, сконструированный антигенспецифический высокоаффинный TCR, CAR, костимулирующую молекулу или любую их комбинацию.

В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления способы эффективны в отсутствие введения экзогенного IL-2.

В других вариантах осуществления субъект в любом из вышеупомянутых способов дополнительно получает лечение с помощью вспомогательной терапии, такой как химиотерапия. Иллюстративные химиотерапевтические средства включают, например, алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; хлорэтиламины, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид мехлорэтамин оксида, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, каминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофенольная кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромоностанола, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства для угнетения функции надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; заменитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; эльформитин; эллиптиний ацетат; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSKTM; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-C»); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, например, паклитаксел (Taxol™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, Нью-Джерси) и доцетаксел (Taxotere™, Rhone-Poulenc Rorer, Энтони, Франция); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины, капецитабин и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных.

В некоторых вариантах осуществления вспомогательная терапия представляет собой вакцину, ингибитор сигнала иммуносупрессии, ингибитор B-Raf, ингибитор MEK, ингибитор тирозинкиназы, цитотоксическое средство, химиотерапевтическое средство или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления ингибитор сигнала иммуносупрессии представляет собой антитело или siRNA. В некоторых вариантах осуществления антитело или siRNA специфичны для PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, LAG3, KIR, CD244, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, TIM3, A2aR или любой их комбинации.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Конструкции слитого белка CD200R-CD28

Иллюстративные слитые белки, описываемые в данном документе, проиллюстрированы с использованием схематических изображений на фигуре 1А. Иллюстративные слитые белки включают иммуномодулирующие слитые белки (IFP), состоящие из внеклеточного домена CD200R или его части, и внутриклеточного сигнального домена CD28 или его части (фигура 1A, конструкции I-V). Гидрофобный компонент может состоять из трансмембранного домена либо CD200R (фигура 1А, конструкция I), либо CD28 (фигура 1А, конструкции II-V), или их частей. В некоторых иллюстративных слитых белках CD200R-CD28 гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, а внеклеточный компонент дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, в частности внеклеточный остаток цистеина, смежный с гидрофобным компонентом (например, фигура 1A конструкция III, CD200R-CD28Cys, конструкция IV, CD200R-3aas-CD28Cys и конструкция V, CD200R-9aas-CD28Cys). Внеклеточный компонент может содержать всю или часть внеклеточного домена CD200R. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный компонент содержит целый внеклеточный домен CD200R (фигура 1А, конструкции I-III). В других примерах внеклеточный компонент содержит первые 235 аминокислот (с сохранением N-связанного участка гликозилирования) (например, фигура 1А, конструкция IV, CD200R-3aas-CD28Cys) или первые 229 аминокислот (например, фигура 1А, конструкция V, CD200R-9aas-CD28Cys) с N-конца CD200R. Размер внеклеточного компонента, на который можно воздействовать путем корректировки конструкции слитого белка, может влиять на способность слитого белка проникать в иммунологический синапс и колокализоваться с TCR в cSMAC для обеспечения сильного костимулирующего сигнала. Кроме того, конструкция CD200R-CD28 имеет возможность превращать то, что обычно является ингибирующим сигналом при связывании CD200R с его мишенью, в положительный сигнал, генерируемый внутриклеточным сигнальным доменом CD28.

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок CD200R-CD28, содержит следующие элементы (от 5' к 3'): Внеклеточный компонент (CD200R)-домен мультимеризации (CD28-цистеин)-гидрофобный компонент (трансмембранный CD28)-внутриклеточный компонент (внутриклеточный CD28). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок CD200R-CD28, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под любым из SEQ ID NO:47-51 или 1, 6, 7, 10, 12, 14 или 15.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие конструкции, заказывали в Invitrogen или создавали на месте с помощью ПЦР, затем направленно TOPO-клонировали в вектор pENTR™/D-TOPO^® (Invitrogen) и переносили в ретровирусный вектор pMP71-attR с использованием технологии Gateway^® (Invitrogen). В определенных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие IFP по настоящему раскрытию, кодон-оптимизировали перед клонированием в ретровирусный вектор pMP71-attR.

Пример 2

Трансгенная экспрессия конструкций CD200R-CD28

Доклиническую мышиную модель диссеминированного лейкоза на основе индуцированного у мышей C57BL/6 вирусом Френда эритролейкоза (FBL) и трансгенных мышей TCR_gag использовали для определения того, могут ли химерные рецепторы CD200R-CD28 улучшить функцию T-клеток.

Трансгенных по TCR мышей получали для получения CD8+ T-клеток, специфичных к эпитопу gag (TCR_gag). Мышей C57BL/6 (B6) приобретали в Jackson Laboratory. Трансгенные мыши TCR_gag экспрессируют трансген TCR, специфичный для эпитопа gag вируса Френда в CD8⁺ T-клетке (Öhlén et al., J. Immunol. 166: 2863-2870, 2001). Все проведенные исследования на животных были одобрены в соответствии с протоколом Институционального комитета по уходу за животными и их использованию университета штата Вашингтон (протокол № 2013-01). Индуцированный вирусом B6 Френда мыши эритролейкоз (FBL) экспрессирует кодируемый F-MuLV эпитоп gag (пептид CCLCLTVFL).

Химерные конструкции CD200R-CD28 на основе генов мыши вставляли в ретровирусный вектор pMP71 и использовали для трансдукции первичных спленоцитов мыши, стимулированных антителами к CD3 и антителами к CD28. Конструкции конструировали, как описано в примере 1, и заказывались в Invitrogen или создавали на месте с помощью ПЦР. Затем конструкции направленно TOPO-клонировали в вектор pENTR™/D-TOPO^® (Invitrogen) и переносили в ретровирусный вектор pMP71-attR с использованием технологии Gateway® (Invitrogen). Ретровирусную упаковывающую клеточную линию Plat-E (Morita et al., 2000, Gene Therapy 7: 1063-1066, 2000; Cell Biolabs, Inc.) трансдуцировали ретровирусным вектором с использованием реагента для трансдукции Effectene (Qiagen). Вирусный супернатант собирали на 2-й и 3-й день, а затем использовали для трансдуцирования Т-клеток TCR_gag.

За один день до трансфекции Т-клетки TCR_gag стимулировали антителами к CD3/CD28 и 100 ед./мл rhIL-2. Трансдукцию Т-клеток TCR_gag проводили на 12-луночных планшетах в присутствии IL-2 и полибрена путем центрифугирования в течение 90 минут при 1000 g. Клетки FBL трансдуцировали с помощью CD200 при центрифугировании с полибреном аналогично трансдукции Т-клеток и затем сортировали с получением гомогенной популяции.

Через пять дней после трансдукции CD8⁺ Т-клетки анализировали в отношении экспрессии конструкции с помощью окрашивания антителом к CD200R и проточной цитометрии (фигура 1B). Вектор, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), использовали в качестве контроля. Эффективность трансдукции варьировалась от 4 до 36%, а средняя интенсивность флуоресценции (MFI) трансдуцированных клеток была сходной между конструкциями.

Пример 3

Конструкции CD200R-CD28 стимулируют пролиферацию, накопление и эффекторную функцию трансдуцированных Т-клеток in vitro

Конструкции CD200R-CD28, описанные в примерах 1 и 2, оценивали в отношении их способности стимулировать пролиферацию, накопление и эффекторную функцию Т-клеток TCR_gag.

Размножение эффекторных клеток in vitro

Эффекторные клетки TCR_gag получали in vitro как описано ранее (Stromnes et al., J. Clin. Invest. 120: 3722-34, 2010). Облученные антиген-презентирующие спленоциты (5×10⁶), облученные FBL (3×10⁶) и клетки TCR_gag tg (10⁶) культивировали вместе с IL-2 (50 ед./мл) в 10 мл культуральной среды (IMDM, дополненная незаменимыми аминокислотами, 2 мкМ глутамина, 100 ед./мл смеси пенициллина/стрептомицина, 10% FBS и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола). Т-клетки рестимулировали еженедельно и оценивали с помощью проточной цитометрии через 5-7 дней после последней стимуляции.

Анализ пролиферации Т-клеток in vitro

Т-клетки TCR_gag трансдуцировали, как в примере 2. Для оценки пролиферации Т-клеток in vitro Т-клетки TCR_gag окрашивали с использованием CellTrace Violet (CTV, Life Technologies) в соответствии с протоколом производителя. CTV-меченые Т-клетки Tg (10⁵) и контрольные Т-клетки GFP стимулировали титруемым количеством клеток CD200^- FBL или CD200⁺ FBL. Через 3 дня CTV-разведение Т-клеток TCR_gagоценивали с помощью проточной цитометрии.

Результаты проточной цитометрии, указывающие количество Т-клеток TCR_gag после стимуляции титруемым количеством клеток CD200-FBL (введху) или CD200⁺ FBL (внизу) показаны на фигуре 2A. Четыре из пяти испытываемых конструкций CD200R-CD28 значительно улучшали пролиферацию Т-клеток TCR_gag в ответ на CD200⁺ FBL (синие линии) по сравнению с трансдуцированными GFP-контролем Т-клетками (красные линии).

Анализ накопления Т-клеток in vitro

Для определения того, приводит ли усиленная пролиферация также к повышенному накоплению трансдуцированных клеток, измеряли долю трансдуцированных клеток в общей популяции TCR_gag в течение нескольких циклов стимуляции облученными CD200⁺ FBL.

Некоторые из конструкций способствовали накоплению трансдуцированных Т-клеток, включая CD200R-CD28tm, CD200R-CD28Cys, CD200R-3aas-CD28Cys и CD200R-9aas-CD28Cys (фигура 2B). Из этих конструкций CD200R-9aas-CD28Cys проявляла наибольший прирост трансдуцированных Т-клеток при множественных стимуляциях, что приводило к более чем 3-кратному росту за 3 стимуляции.

Анализ обогащения Т-клеток in vitro

Смешанную популяцию трансдуцированных и нетрансдуцированных CD8⁺ T-клеток рестимулировали с помощью облученных с помощью CD200⁺ или CD200^- клеток FBL, чтобы определить, будет ли рестимуляция обогащать популяцию трансдуцированными CD200R-9aas-CD28Cys IFP⁺ T-клетками. Повторная рестимуляция облученными опухолевыми CD200⁺ клетками обогащала клетками, трансдуцированными с помощью IFP, по сравнению с Т-клетками дикого типа, демонстрируя, что распознавание мишени, экспрессирующей лиганд для IRP CD200R-9aas-CD28Cys, усиливает ответ (фигура 2C).

Анализ колокализации in vitro

Трансдуцированные Т-клетки визуализировали с помощью микроскопии, чтобы определить, был ли IFP CD200R-9aas-CD28Cys колокализован с когнатным лигандом в иммунологическом синапсе (IS) во время активации Т-клеток. CTxB использовали для окрашивания липидов в клеточной мембране, которые накапливаются в синапсе (фигура 2D, секция I). Для визуализации местоположения молекул относительно IS использовали меченые антитела, нацеленные на CD200, экспрессируемый клеткой FBL (фигура 2D, секция II) или CD200R, экспрессируемый Т-клеткой (фигура 2D, секция III). Лиганд CD200 и CD200R колокализованы в пределах IS (фигура 2D, секция IV), демонстрируя, что конструкция имеет размер, подходящий для размещения в иммунологическом синапсе.

Анализ цитотоксичности на основе CFSE

Увеличенная передача сигнала CD28 также способствует эффекторной функции (Chen and Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). Трансдуцированные слитым белком CD200R-CD28 Т-клетки испытывали в отношении повышенного уничтожения опухолевых клеток-мишеней. Опухоли FBL и контрольные EL4 инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре с 2,5 мкM (CFSE_hi) или 0,25 мкM (CFSE^l) CFSE в PBS, соответственно. Избыток красителя удаляли путем промывания опухолевых клеток в содержащей сыворотку среде. Смесь 1:1 опухолевых клеток EL4 и FBL инкубировали с титруемым количеством трансдуцированных вектором CD200R-CD28 или GFP размноженных in vitro эффекторных T-клеток TCR_gag в течение 4 часов в 96-луночных круглодонных планшетах при 37°C и 5% CO₂. Специфический лизис FBL определяли с помощью проточного цитометрического анализа % CFSE_hi (FBL) от общего числа CFSE-положительных клеток (FBL+ EL4), оставшихся в лунке.

Т-клетки TCR_gag, трансдуцированные конструкциями CD200R-CD28, демонстрировали повышенную способность лизировать опухоль FBL in vitro по сравнению с Т-клетками TCR_gag, трансдуцированными пустым вектором (фигуры 2E, 2G). Опухолевые клетки-мишени метили с использованием различных разведений флуоресцентных красителей CellTrace Violet (CTV) или CFSE с получением смеси 1:1:1 клеток EL4 (CTV⁺), CD200⁺ FBL (CFSE^hi) и неспецифических контрольных мишеней EL4 (CFSE^l) (фигура 2F). Кроме того, контрольные GFP-трансдуцированные Т-клетки TCR_gag лизировали CD200^- FBL и CD200⁺ FBL с равной эффективностью (фигура 2G). В противоположность этому, Т-клетки TCR_gag, трансдуцированные с помощью CD200R-9aas-CD28Cys, демонстрировали усиленное уничтожение клеток CD200⁺ FBL по сравнению с контрольными T-клетками, лизируя более 40% CD200⁺ FBL при самом низком испытанном соотношении E:T (фигура 2G).

В совокупности эти данные показывают, что конструкции CD200R-CD28 способствуют увеличению накопления и литической активности трансдуцированных Т-клеток в ответ на стимуляцию опухолевыми клетками.

Пример 4

T-клетки, трансдуцированные с помощью CD200R-9aas-CD28Cys, демонстрируют повышенное накопление in vivo в ответ на распознавание FBL

Мышам B6 внутрибрюшинно (i.p.) вводили 4×10⁶ живых клеток лейкоза FBL, как описано ранее (Stromnes et al., J. Clin. Invest. 120: 3722-34, 2010). После обеспечения распространения FBL в течение 5 дней мыши получали 180 мг/кг циклофосфамида (Cy, «цитоксан») i.p. по меньшей мере за 6 часов до переноса эффекторных Т-клеток. Для исследований выживаемости 10⁵ Т-клеток TCR_gag, которых ранее подвергали 1-3 стимуляциям in vitro, пересаживали мышам, имеющим опухоль. Для оценки кратковременной пролиферации и накопления 2×10⁶ каждой из трансдуцированных слитым белком и трансдуцированных GFP-контролем Т-клеток совместно вводили мышам, имеющим опухоль, и через 8 дней мышей подвергали эвтаназии для анализа. У мышей регулярно контролировали опухолевую нагрузку и подвергали эвтаназии, если ожидалась прогнозируемая по прогрессированию опухоли летальность в течение 24-48 часов.

Для оценки того, демонстрируют ли трансдуцированные слитым белком CD200R-9aas-CD28Cys T-клетки большую пролиферацию и накопление in vivo в ответ на распознавание FBL, смешанную популяцию клеток, трансдуцированных слитым белком и контролем, пересаживали мышам, имеющим опухоль, и сравнивали соотношение клеток с помощью анализа ex vivo через 8 дней после переноса (фигура 3A). С применением конгенных маркеров трансдуцированные Т-клетки обнаруживали при в 1,2-1,4 раза большем соотношении с контрольными клетками как в селезенке, так и в лимфатических узлах, по сравнению с соотношением, которое вводили (фигура 3В). Трансдуцированные Т-клетки CD200R-9aas-CD28Cys⁺ TCR_gag демонстрировали сниженную экспрессию CD62L через 3 дня после переноса мышам, имеющим опухоль, что свидетельствует об эффекторном фенотипе Т-клеток (фигура 3C). К 15-му дню трансдуцированные и контрольные Т-клетки демонстрировали сходные фенотипы, в том числе отсутствие маркеров истощения (фигура 3D). Подобно результатам in vitro, Т-клетки, которые экспрессировали CD200R-9aas-CD28Cys, проявляли повышенное накопление в ответ на стимуляцию опухолями in vivo. Кроме того, они демонстрировали характер экспрессии белка, согласующийся с эффекторным фенотипом Т-клеток, в течение по меньшей мере 3 дней после переноса мышам, имеющим опухоль.

Пример 5

Адоптивная иммунотерапия с помощью CD200R-CD28⁺ T-клеток демонстрирует большую активность при лечении диссеминированного лейкоза

Адоптивная иммунотерапия с помощью Т-клеток, трансдуцированных с помощью CD200R-CD28, опосредовала повышенную терапевтическую активность на доклинической мышиной модели диссеминированного лейкоза.

Мышам вводили летальную дозу клеток лейкоза CD200⁺ FBL и через пять дней когорты Cy-обработанных мышей получали дополнительную терапию с помощью 10⁵ T-клеток (фигура 4A). Вклад цистеиновой связи CD28 в эффективность, опосредованную конструкцией CD200R-CD28, оценивали путем сравнения Т-клеток, трансдуцированных с помощью CD200R-CD28tm, CD200R-9aas-CD28Cys и контрольных конструкций GFP, как показано на фигуре 1A. IL-2 вводили в течение 10 дней в качестве дополнительного терапевтического средства когорте мышей для стимуляции активности Т-клеток (Stromnes et al., J. Clin. Invest. 120: 3722-34, 2010). Перед введением Т-клетки оценивали в отношении различных поверхностных белков посредством проточной цитометрии. Трансдуцированные и контрольные Т-клетки TCR_gag проявляли сходные фенотипы, указывая, что трансдукция не меняет фенотип клеток до введения (фигура 4B).

В небольшой когорте мышей, которые получали инъекции IL-2, T-клетки улучшали выживаемость, но значительная разница в выживаемости мышей, которые получали другие группы Т-клеток, не могла быть обнаружена (фигура 4C). Однако в когорте мышей, которые не получали инъекции IL-2, наблюдалось значительное улучшение выживаемости мышей, которые получали Т-клетки, трансдуцированные конструкциями CD200R-CD28 с размерами, подходящими для соответствия иммунологическому синапсу (фигура 4D). Большинство мышей, не получавшие Т-клетки, получавшие Т-клетки, трансдуцированные с помощью контрольного вектора GFP, или Т-клетки, трансдуцированные самым крупным эктодоменом (IFP CD200R-CD28Cys), не выживали дольше 30 дней (фигуры 4C и 4D, черная сплошная, пунктирная и оранжевая линии, соответственно). В отличие от этого, 71% мышей, которые получали CD200R-CD28tm⁺ T-клетки, и 83% мышей, которые получали CD200R-9aas-CD28Cys⁺ T-клетки, выживали более чем 100 дней после терапии (фигуры 4C и 4D, зеленая и красная линии, соответственно). Эти данные показывают, что трансдукция Т-клеток конструкциями CD200R-CD28, которые охватывают расстояние, подобное расстоянию между мембранами в иммунологическом синапсе, обеспечивает достаточную костимуляцию для преодоления зависимости Т-клеточной иммунотерапии от инъекции экзогенного IL-2. Кроме того, хотя были обнаружены различия в пролиферации и накоплении между конструкциями CD200Rtm-CD28 и CD200R-9aas-CD28Cys, испытанными на мышах, которые не получали инъекций экзогенного IL-2, оба IFP эффективно повышали Т-клеточную иммунотерапию со значительным улучшением клинического результата в остальных случаях прогрессирующего лейкоза.

Пример 6

CD200R-9aas-CD28Cys⁺ T-клетки не вызывают аутореактивность в отношении эндогенных тканей и не демонстрируют инфильтрацию нормальных тканей in vivo

Для определения того, снижала ли трансдукция Т-клеток TCR_gag порог активации в достаточной степени, чтобы приводить к аутореактивности в отношении эндогенных тканей, оценивали аутоиммунную токсичность у трансгенных мышей, сконструированных для экспрессии опухолевого антигена FBL gag в виде аутоантигена в гепатоцитах под контролем альбуминового промотора (фигура 5А). Эффекторы TCR_gag получали in vitro и 10⁶ переносили обработанным цитоксаном мышам Alb:Gag с диссеминированным лейкозом. Через 3 и 7 дней после переноса оценивали повреждение печени путем количественного определения уровней ферментов печени в сыворотке: аспартатаминотрансферазы (AST) и аланинаминотрансферазы (ALT). Адоптивная терапия контрольными или CD200R-9aas-CD28Cys⁺ TCR_gag клетками у мышей не влияла на уровни AST или ALT в сыворотке через 3 или 7 дней после переноса, указывая, что CD200R-9aas-CD28Cys не вызывает обнаруживаемого аутоиммунного повреждения печени у мышей Alb:Gag (фигура 5B).

Т-клетки, трансдуцированные с помощью IFP, не демонстрируют повышенной инфильтрации нормальных тканей по сравнению с контрольными Т-клетками. Мышей подвергали эвтаназии через 7 дней после переноса, и срезы печени окрашивали антителом к Т-клеточному маркеру CD3 для количественного определения инфильтрации Т-клеток. Наблюдалось ограниченное присутствие Т-клеток в тканях печени без существенной разницы между реципиентами CD200R-9aas-CD28Cys⁺ или контрольных TCR_gag, что указывает на отсутствие повышенной лимфоцитарной клеточной инфильтрации в результате экспрессии IFP (фигура 5C).

Пример 7

Костимулирующий сигнальный домен 4-1BB стимулирует накопление трансдуцированных Т-клеток in vitro

Костимулирующий рецептор 4-1BB активируется на активированных Т-клетках, что способствует выживанию Т-клеток и продуцированию цитокинов (Chen and Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). Для оценки того, может ли внутриклеточный сигнальный домен 4-1BB с внутриклеточным сигнальным доменом CD28 или без него индуцировать повышенную пролиферацию и накопление Т-клеток, получали IFP с использованием 4-1BB (CD200R-9aas-4-1BB) или комбинации 4-1BB с CD28 (CD200R-9aas-CD28-4-1BB) (фигура 6A) с помощью способов, описанных в примере 2. Т-клетки TCR_gag трансдуцировали, как в примере 2, и in vitro получали эффекторные клетки TCR_gag, как в примере 3.

Как наблюдалось с CD200R-9aas-CD28Cys, T-клетки, трансдуцированные конструкциями 4-1BB, накапливались в течение нескольких циклов стимуляции in vitro (фигура 6B). Эти данные показывают, что IFP 4-1BB также способствуют пролиферации и выживаемости Т-клеток.

Т-клетки TCR_gag, трансдуцированные CD200R-4-1BB, демонстрировали повышенную способность к лизису опухоли FBL in vitro с использованием анализа цитотоксичности на основе CFSE, описанного в примере 3 (фигура 6C). CD200R-41BB-трансдуцированные Т-клетки также способствуют выживанию (фигура 6D).

Пример 8

Коэкспрессия CD200Rtm-CD28 улучшает функцию первичных Т-клеток с WT1-специфичным TCR

Человеческую конструкцию CD200Rtm-CD28 (SEQ ID NO:1) получали для определения того, улучшает ли экспрессия IFP Т-клеточную функцию первичных Т-клеток человека. Конструкцию объединяли с бета- и альфа-цепями рестриктированного по HLA-A2 WT1₁₂₆-специфичного TCR «C4» путем связывания генов с элементами P2A (фигура 7A). Первую последовательность P2A кодон-оптимизировали для предотвращения генетической рекомбинации со второй последовательностью P2A. Для получения лентивирусов клетки 293 T/17 (3×10⁶ клеток/планшет) трансдуцировали человеческими конструкциями в pRRLSIN и упаковочными векторами pMDLg/pRRE, pMD2-G и pRSV-REV с использованием Effectene (Qiagen). Культуральные среды меняли в 1-й день после трансфекции, а содержащий вирус супернатант собирали на 2-й и 3-й дни и замораживали аликвоты для будущего применения.

Сублинию Jurkat Т-клеток человека, которые лишены эндогенного TCR, использовали для испытания экспрессии IFP и TCR. Эти Т-клетки Jurkat трансдуцировали путем центрифугирования 2×10⁶ клеток с 2 мл ретровирусного супернатанта при 1000 g в течение 90 мин. при 32°C. Трансдукция линии Jurkat Т-клеток человека трехгенной конструкцией приводила к высокой экспрессии IFP и экспрессии TCR с аналогичной MFI, как и в Т-клетках, трансдуцированных только TCR (фигура 7A).

Для трансдукции первичных Т-клеток человека собирали мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) у HLA-A2+ доноров. CD8⁺ T-клетки очищали с помощью магнитных гранул Miltenyi и стимулировали с использованием парамагнитных микрочастиц Dynabeads Human T cell Expander CD3/CD28 (Life Technologies) и 50 МЕ/мл IL-2. Через четыре часа после стимуляции Т-клетки трансдуцировали, как описано выше для Т-клеток Jurkat. Т-клетки рестимулировали каждые 10-14 дней с использованием протокола быстрого размножения (REP), как было описано ранее (Ho et al., J Immunol Methods 310:40-52, 2006).

Линию клеток T2 человека использовали в качестве APC, поскольку она является дефицитной по TAP и, следовательно, не способна презентовать эндогенные пептиды, тогда как низкоуровневая экспрессия MHCI обеспечивает презентацию экзогенно загруженных пептидов. Экспрессию CD200 клетками T2 оценивали с помощью проточной цитометрии (фигура 7B). Клетки Т2 проявляли низкий уровень эндогенной экспрессии CD200 (фигура 7B).

Трансдуцированные Т-клетки стимулировали с помощью WT1₁₂₆-сенсибилизированных клеток T2. Несмотря на низкий уровень экспрессии CD200 на клетках-мишенях, CD200Rtm-CD28-трансдуцированные Т-клетки демонстрировали повышенную пролиферацию по сравнению с Т-клетками, трансдуцированными только TCR C4 (фигура 7C). Кроме того, стимулированные CD200Rtm-CD28-трансдуцированные Т-клетки (т.е. IFP⁺ Т-клетки) продуцировали повышенные уровни IFNγ и IL-2 по сравнению с контрольными Т-клетками под воздействием опухолевых CD200dim клеток (фигура 7D).

В целом, эти результаты показали, что первичные Т-клетки, трансдуцированные для экспрессии человеческой конструкции CD200Rtm-CD28 и бета- и альфа-цепей WT1₁₂₆-специфичного TCR, демонстрировали повышенную пролиферацию и увеличенное продуцирование цитокинов по сравнению с Т-клетками, трансдуцированными только конструкцией TCR.

Пример 9

Конструкции слитого белка SIRPα-CD28 стимулируют накопление трансдуцированных Т-клеток in vitro

Иллюстративные слитые белки, описываемые в данном документе, также включают IFP, состоящие из внеклеточного домена SIRPα или его части, и внутриклеточного сигнального домена CD28 (фигура 8A). Гидрофобный компонент может состоять из трансмембранного домена либо SIRPα, либо CD28, или их частей. В некоторых иллюстративных слитых белках SIRPα-CD28 гидрофобный компонент содержит трансмембранный домен CD28, а внеклеточный компонент дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, в частности внеклеточный остаток цистеина, смежный с гидрофобным компонентом (например, SIRPα-CD28Cys, SIRPα-6aas-CD28Cys, SIRPα-9aas-CD28Cys и SIRPα-9aas-CD28Cys). Внеклеточный компонент может содержать всю или часть внеклеточного домена SIRPα. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный компонент содержит целый внеклеточный домен SIRPα. В других примерах внеклеточный компонент содержит первые 367 аминокислот (например, SIRPα-6aas-CD28Cys), первые 364 аминокислоты (например, SIRPα-9aas-CD28Cys) или первые 350 аминокислот (SIRPα-23aas-CD28Cys) с N-конца SIRPα. Размер внеклеточного компонента может влиять на способность слитого белка проникать в иммунологический синапс и колокализоваться с TCR в cSMAC для обеспечения сильного костимулирующего сигнала. В некоторых примерах внеклеточный компонент содержит усеченный SIRPα, который может изменять размер внеклеточного компонента. Например, для обеспечения дополнительных внеклеточных аминокислот внеклеточного домена слитого белка (например, дополнительных 9 или 12 аминокислот), SIRPα-6aas-CD28 имеет усеченную часть SIRPα, которая сохраняет природный N-связанный участок гликозилирования. В другом примере SIRPα-23aas-CD28 имеет усеченную часть SIRPα, которая лишена целой области стебля внеклеточного домена SIRPα. Кроме того, конструкция SIRPα-CD28 имеет возможность превращать сигнал, инициированный связыванием SIRPα с его мишенью, в положительный (например, костимулирующий) сигнал, генерируемый внутриклеточным сигнальным доменом CD28.

IFP с использованием внеклеточных компонентов SIRPα (фигура 8A) получали с помощью способов, описанных в примере 2. Т-клетки TCR_gag трансдуцировали, как в примере 2, и in vitro получали эффекторные клетки TCR_gag, как в примере 3. Клетки FBL трансдуцировали с помощью CD47 или mCherry при центрифугировании с полибреном аналогично трансдукции Т-клеток и затем сортировали с получением гомогенной популяции.

Как наблюдалось с CD200R-9aas-CD28Cys, T-клетки, трансдуцированные конструкциями SIRPα, накапливались в течение нескольких циклов стимуляции in vitro (фигура 8B). Эти данные показывают, что IFP SIRPα-CD28 также способствуют пролиферации и выживаемости Т-клеток.

Для оценки пролиферации Т-клеток in vitro проводили анализ пролиферации с разведениями CTV, как описано в примере 2. Как наблюдалось с CD200R-9aas-CD28Cys, T-клетки, трансдуцированные конструкциями SIRPα, сконструированными для поддержания расстояния в синапсе Т-клетка-опухолевая клетка, демонстрировали повышенную пролиферацию по сравнению с контрольными Т-клетками (фигура 8C). Кроме того, опухолевые CD47⁺ клетки эффективно уничтожались через 3 дня совместного культивирования с SIRPα-CD28⁺ T-клетками, но не с контрольными Т-клетками или Т-клетками, трансдуцированными конструкцией SIRPα, которая лишена внутриклеточного сигнального домена (фигура 8D). Чтобы дополнительно оценить литическую способность SIRPα-CD28⁺ T-клеток, использовали анализ IncuCyte для количественной оценки уничтожения CD47⁺ FBL. В общей сложности 10⁵ mCherry⁺ CD47⁺ FBL совместно культивировали в 24-луночных планшетах с титрованием Т-клеток человека, трансдуцированных конструкциями SIRPα-CD28. Планшет инкубировали в IncuCyte (Essen BioScience) внутри инкубатора для клеточных культур в течение 70 часов. Изображения фиксировали каждый час для контроля уничтожения опухолевых клеток, как определялось по потере красного сигнала. SIRPα-CD28⁺ T-клетки уничтожали опухолевые CD47⁺ клетки даже при самом низком испытываемом соотношении эффектора и мишени (0,4:1; фигура 8E).

Пример 10

Конструкции слитого белка PD-1-CD28 стимулируют продуцирование цитокинов в трансдуцированных Т-клетках in vitro

Иллюстративные слитые белки, описываемые в данном документе, также включают IFP, состоящие из внеклеточного домена PD-1 или его части, и внутриклеточного сигнального домена CD28 (фигура 9A). Трансмембранный компонент может состоять из трансмембранного домена либо PD-1, либо CD28, или их частей. В некоторых иллюстративных слитых белках PD1-CD28 трансмембранный компонент содержит трансмембранный домен CD28, а внеклеточный компонент дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, в частности внеклеточный остаток цистеина, смежный с трансмембранным компонентом (например, PD1-CD28Cys, PD1-9aas-CD28Cys и PD1-21aas-CD28Cys) для содействия межцепочечной димеризации. Внеклеточный компонент может содержать весь или часть внеклеточного домена PD-1 или может быть усечен (например, -9aas в мышиной конструкции, -12aas или -15aas в человеческих конструкциях; не имеет области стебля PD-1, -21aas) для поддержания короткого пространственного расстояния между клетками, чтобы облегчить доступ рецептора с лигандом в иммунологический синапс. Кроме того, конструкция PD1-CD28 имеет возможность превращать то, что обычно является ингибирующим сигналом при связывании PD1 с его мишенью, в положительный (например, костимулирующий) сигнал, генерируемый внутриклеточным сигнальным доменом CD28.

IFP, содержащие внеклеточные компоненты PD-1 (фигура 9A), получали с помощью способов, описанных в примере 2. Т-клетки TCR_gag трансдуцировали, как в примере 2, и in vitro получали эффекторные клетки TCR_gag, как в примере 3.

Мышиные IFP PD1-CD28 получали с использованием конструкций I-IV и VII (фиг. 9A). PD1-CD28⁺ Т-клетки рестимулировали в присутствии Brefeldin A (для сохранения продуцируемых цитокинов) с клетками FBL, эндогенно экспрессирующими лиганды PD-1, PD-L1 и PD-L2. Через 5 часов клетки фиксировали и обрабатывали с использованием набора BD Cytofix/Cytoperm, чтобы обеспечить внутриклеточное окрашивание эффекторных цитокинов, IFNγ и TNFα. Трансдукция с помощью каждой из пяти конструкций PD1-CD28 усиливала продуцирование внутриклеточных цитокинов по сравнению с контрольными Т-клетками (фигура 9B).

Человеческие IFP PD1-CD28 получали с использованием конструкций I-III и V-VII (фигура 9A). Векторы, содержащие IFP PD1-CD28 и TCR C4, получали, как описано выше. Т-клетки Jurkat трансдуцировали, как описано выше. T-клетки, трансдуцированные с помощью TCR и PD1-12aas-CD28Cys или PD1-15aas-CD28Cys, демонстрировали высокую эффективность трансдукции и экспрессию обоих белков (фигура 10).

Пример 11

Конструкции слитого белка Fas-CD28 стимулируют накопление и усиливают функцию трансдуцированных Т-клеток in vitro

Иллюстративные слитые белки, описываемые в данном документе, также включают IFP, состоящие из внеклеточного домена Fas или его части, и внутриклеточного сигнального домена CD28 (фигура 11A). Трансмембранный компонент может состоять из домена либо Fas, либо CD28, или их частей. В некоторых иллюстративных слитых белках Fas-CD28 трансмембранный компонент содержит трансмембранный домен CD28, а внеклеточный компонент дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, в частности внеклеточный остаток цистеина, смежный с трансмембранным компонентом (например, Fas-CD28Cys и Fas-9aas-CD28Cys). Внеклеточный компонент может содержать весь или часть внеклеточного домена Fas или может быть усечен, чтобы сохранить поддержание короткого пространственного расстояния между клетками (-9aas) при взаимодействии рецептор-лиганд. Кроме того, конструкция Fas-CD28 имеет возможность превращать сигнал, инициированный связыванием Fas с его мишенью, в положительный (например, костимулирующий) сигнал, генерируемый внутриклеточным сигнальным доменом CD28.

IFP, содержащие внеклеточные компоненты Fas (фигура 11A), получали с помощью способов, описанных в примере 2. Т-клетки TCR_gag трансдуцировали, как в примере 2, и in vitro получали эффекторные клетки TCR_gag, как в примере 3.

Для определения того, приводит ли экспрессия IFP Fas-CD28 к повышенному накоплению трансдуцированных клеток, измеряли долю трансдуцированных клеток из смешанной популяции в общей популяции TCR_gag в течение нескольких циклов стимуляции облученными FBL, как описано в примере 3. Все конструкции способствовали накоплению трансдуцированных Т-клеток по сравнению с контрольными Т-клетками (фигура 11B). Кроме того, экспрессия конструкций Fas-CD28, но не полноразмерного (FL) Fas, способствовала выживанию или размножению Т-клеток при множественных стимуляциях in vitro (фигура 11C).

Пример 12

Конструкции слитого белка LAG3-CD28

Иллюстративные слитые белки, описываемые в данном документе, также включают IFP, состоящие из внеклеточного домена LAG3 или его части, и внутриклеточного сигнального домена CD28 (фигура 12A). Трансмембранный компонент может состоять из домена либо LAG3, либо CD28, или их частей. В некоторых иллюстративных слитых белках LAG3-CD28 трансмембранный компонент содержит трансмембранный домен CD28, а внеклеточный компонент дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, в частности внеклеточный остаток цистеина, смежный с трансмембранным компонентом (например, LAG3-CD28Cys и LAG3-9aas-CD28Cys). Внеклеточный компонент может содержать весь или часть внеклеточного домена LAG3 или может быть усечен, чтобы поддержать короткое пространственное расстояние между клетками (например, -9aas) при взаимодействии рецептор-лиганд. Кроме того, конструкция LAG3-CD28 имеет возможность превращать то, что обычно является ингибирующим сигналом при связывании LAG3 с его мишенью, в положительный (например, костимулирующий) сигнал, генерируемый внутриклеточным сигнальным доменом CD28.

IFP с использованием внеклеточных компонентов LAG3 (фигура 12A) получали с помощью способов, описанных в примере 2. T-клетки трансдуцировали конструкциями LAG3-eGFP, как описано. Через пять дней после трансдукции CD8⁺ Т-клетки анализировали в отношении экспрессии конструкции с помощью окрашивания антителом к LAG3 и проточной цитометрии (фигура 12B). Вектор, кодирующий только зеленый флуоресцентный белок (GFP), использовали в качестве контроля. Все конструкции демонстрировали экспрессию LAG3 (фигура 12B).

Пример 13

Конструкции слитого белка TIM3-CD28

Иллюстративные слитые белки, описываемые в данном документе, также включают IFP, состоящие из внеклеточного домена TIM3 или его части, и внутриклеточного сигнального домена CD28 (фигура 13A). Трансмембранный компонент может состоять из домена либо TIM3, либо CD28, или их частей. В некоторых иллюстративных слитых белках TIM3-CD28 трансмембранный компонент содержит трансмембранный домен CD28, а внеклеточный компонент дополнительно содержит внеклеточную часть CD28, в частности внеклеточный остаток цистеина, смежный с трансмембранным компонентом (например, TIM3-CD28Cys и TIM3-9aas-CD28Cys). Внеклеточный компонент может содержать весь или часть внеклеточного домена TIM3 или может быть усечен, чтобы поддерживать короткое пространственное расстояние между клетками (например, -9aas). Кроме того, конструкция TIM3-CD28 имеет возможность превращать то, что обычно является ингибирующим сигналом при связывании TIM3 с его мишенью, в положительный сигнал, генерируемый внутриклеточным сигнальным доменом CD28.

Новые IFP с использованием внеклеточных компонентов TIM3 (фигура 13A) получали с помощью способов, описанных в примере 2. T-клетки трансдуцировали конструкциями GFP-TIM3, как описано. Через пять дней после трансдукции CD8⁺ Т-клетки анализировали в отношении экспрессии конструкции с помощью окрашивания антителом к TIM3 и проточной цитометрии (фигура 13B). Вектор, кодирующий только зеленый флуоресцентный белок (GFP), использовали в качестве контроля. Большинство конструкций демонстрировали сходную экспрессию TIM3 (фигура 13B).

Хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения проиллюстрированы и описаны, будет понятно, что различные варианты осуществления, описанные выше, могут быть объединены для обеспечения дополнительных вариантов осуществления и что в них могут быть внесены различные изменения без отступления от сущности и объема настоящего изобретения.

Все патенты США, публикации заявок на патент США, заявки на патент США, иностранные патенты, заявки на иностранный патент и непатентные публикации, упомянутые в настоящем описании и/или перечисленные в информационном листке заявки, включая без ограничения предварительную заявку на патент США №62/128979, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Аспекты вариантов осуществления могут быть модифицированы, если необходимо использовать концепции различных патентов, заявок и публикаций, для получения дополнительных вариантов осуществления.

Эти и другие изменения могут быть сделаны в вариантах осуществления с учетом приведенного выше подробного описания. В целом, в нижеследующей формуле изобретения используемые термины не должны толковаться как ограничивающие формулу изобретения конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в настоящем описании и формуле изобретения, но должны быть истолкованы с включением всех возможных вариантов наряду с полным объемом эквивалентов, на которые эта формула изобретения имеет право. Соответственно, формула изобретения не ограничивается настоящим раскрытием.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

<110> ФРЕД ХАТЧИНСОН КАНСЭР РИСЁЧ СЕНТЕР

Ода, Шеннон К.

Гринберг, Филипп Д.

<120> ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СЛИТЫЕ БЕЛКИ И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 360056.433WO

<140> PCT

<141> 2016-03-04

<150> US 62/128,979

<151> 2015-03-05

<160> 178

<170> FastSEQ для Windows версии 4.0

<210> 1

<211> 915

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция huCD200Rtm-CD28

<400> 1

atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60

gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120

gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180

tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240

cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300

accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360

cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420

ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480

cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540

atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600

aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660

ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgctgcctg tgcctggcgc caagaagtcc 720

gccaagctgt acatccccta catcatcctg acaatcatca ttctgaccat cgtgggcttc 780

atctggctgc tgcgcagcaa gcggagcaga ggcggccaca gcgactacat gaacatgacc 840

cctagacggc ctggccccac cagaaagcac taccagccct acgcccctcc ccgggacttt 900

gccgcctaca gaagc 915

<210> 2

<211> 728

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> целый внеклеточный домен huCD200R

<400> 2

tgctgtgccc ttggagaacc gccaacctgg gcctgctgct gatcctgacc atcttcctgg 60

tggccgccag cagcagcctg tgcatggacg agaagcagat cacccagaac tacagcaagg 120

tgctggccga agtgaacacc agctggcccg tgaagatggc caccaacgcc gtgctgtgct 180

gccctcctat cgccctgcgg aacctgatca tcatcacctg ggagatcatc ctgcggggcc 240

agcccagctg taccaaggcc taccggaaag agacaaacga gacaaaagaa acaaactgca 300

ccgacgagcg gatcacatgg gtgtccagac ccgaccagaa cagcgacctg cagatcagac 360

ccgtggccat cacccacgac ggctactacc ggtgcatcat ggtcaccccc gatggcaact 420

tccaccgggg ataccatctg caggtgctcg tgacccccga agtgaccctg ttccagaacc 480

ggaacagaac cgccgtgtgc aaggccgtgg ccggaaaacc tgccgcccag atctcttgga 540

tccccgaggg cgattgcgcc accaagcagg aatactggtc caacggcacc gtgaccgtga 600

agtccacctg tcactgggag gtgcacaacg tgtccaccgt gacatgccac gtgtcccacc 660

tgaccggcaa caagagcctg tacatcgagc tgctgcctgt gcctggcgcc aagaagtccg 720

ccaagctg 728

<210> 3

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный домен huCD200R

<400> 3

tacatcccct acatcatcct gacaatcatc attctgacca tcgtgggctt catctggctg 60

ctg 63

<210> 4

<211> 81

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный домен CD28

<400> 4

ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg 60

gccttcatca tcttttgggt c 81

<210> 5

<211> 123

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> внутриклеточный домен CD28

<400> 5

cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc tagacggcct 60

ggccccacca gaaagcacta ccagccctac gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga 120

agc 123

<210> 6

<211> 933

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция huCD200R-CD28tm

<400> 6

atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60

gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120

gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180

tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240

cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300

accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360

cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420

ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480

cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540

atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600

aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660

ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgctgcctg tgcctggcgc caagaagtcc 720

gccaagctgt tctgggtgct ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg 780

gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc 840

gactacatga acatgacccc tagacggcct ggccccacca gaaagcacta ccagccctac 900

gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga agc 933

<210> 7

<211> 942

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция huCD200R-9aas-CD28Cys

<400> 7

atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60

gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120

gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180

tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240

cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300

accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360

cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420

ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480

cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540

atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600

aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660

ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgctgcctg tgtgtcccag ccctctgttt 720

cccggcccta gcaagccttt ctgggtgctg gtggtggtcg gaggcgtgct ggcctgctac 780

agcctgctgg tcaccgtggc cttcatcatc ttttgggtcc gcagcaagcg gagcagaggc 840

ggccacagcg actacatgaa catgacccct agacggcctg gccccaccag aaagcactac 900

cagccctacg cccctccccg ggactttgcc gcctacagaa gc 942

<210> 8

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huCD200R-9aas часть внеклеточного домена

<400> 8

atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60

gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120

gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180

tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240

cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300

accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360

cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420

ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480

cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540

atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600

aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660

ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgctgcctg tg 702

<210> 9

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD28Cys домен мультимеризации

<400> 9

tgtcccagcc ctctgtttcc cggccctagc aagcct 36

<210> 10

<211> 933

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция huCD200R-12aas-CD28Cys

<400> 10

atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60

gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120

gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180

tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240

cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300

accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360

cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420

ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480

cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540

atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600

aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660

ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgtgtccca gccctctgtt tcccggccct 720

agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg 780

gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc 840

gactacatga acatgacccc tagacggcct ggccccacca gaaagcacta ccagccctac 900

gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga agc 933

<210> 11

<211> 693

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huCD200R-12aas часть внеклеточного домена

<400> 11

atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60

gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120

gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180

tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240

cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300

accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360

cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420

ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480

cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540

atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600

aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660

ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctg 693

<210> 12

<211> 945

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция huCD200R-9aas-CD28Cys tm-41BBic

<400> 12

atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60

gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120

gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180

tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240

cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300

accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360

cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420

ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480

cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540

atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600

aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660

ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgctgcctg tgtgtcccag ccctctgttt 720

cccggcccta gcaagccttt ctgggtgctg gtggtggtcg gaggcgtgct ggcctgctac 780

agcctgctgg tcaccgtggc cttcatcatc ttttgggtca agcggggcag aaagaagctg 840

ctgtacatct tcaagcagcc tttcatgcgg cccgtgcaga ccacccagga agaggacggc 900

tgctcctgca gattccccga ggaagaagaa ggcggctgcg agctg 945

<210> 13

<211> 126

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> внутриклеточный компонент 4-1BB

<400> 13

aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ctttcatgcg gcccgtgcag 60

accacccagg aagaggacgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 120

gagctg 126

<210> 14

<211> 936

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция huCD200R-12aas-CD28Cys tm-41BBic

<400> 14

atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60

gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120

gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180

tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240

cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300

accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360

cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420

ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480

cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540

atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600

aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660

ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgtgtccca gccctctgtt tcccggccct 720

agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg 780

gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc 840

ttcaagcagc ctttcatgcg gcccgtgcag accacccagg aagaggacgg ctgctcctgc 900

agattccccg aggaagaaga aggcggctgc gagctg 936

<210> 15

<211> 1059

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция huCD200R-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic

<400> 15

atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60

gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120

gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180

tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240

cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300

accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360

cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420

ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480

cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540

atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600

aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660

ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgtgtccca gccctctgtt tcccggccct 720

agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg 780

gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc 840

gactacatga acatgacccc tagacggcct ggccccacca gaaagcacta ccagccctac 900

gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga agcaagcggg gcagaaagaa gctgctgtac 960

atcttcaagc agcctttcat gcggcccgtg cagaccaccc aggaagagga cggctgctcc 1020

tgcagattcc ccgaggaaga agaaggcggc tgcgagctg 1059

<210> 16

<211> 1305

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция huSIRP альфа tm-CD28

<400> 16

atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60

gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120

aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180

atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240

aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360

tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420

gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480

acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540

accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600

gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660

gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720

agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780

cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840

cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900

accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960

tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020

gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080

gccgccgaga acaccggcag caacgagcgg aacatctaca tcgtcgtggg cgtcgtgtgc 1140

accctgctgg tggcactgct gatggccgct ctgtacctcg tgcgcagcaa gcggagcaga 1200

ggcggccaca gcgactacat gaacatgacc cctagacggc ctggccccac cagaaagcac 1260

taccagccct acgcccctcc ccgggacttt gccgcctaca gaagc 1305

<210> 17

<211> 1119

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> целый внеклеточный домен huSIRP-альфа

<400> 17

atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60

gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120

aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180

atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240

aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360

tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420

gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480

acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540

accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600

gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660

gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720

agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780

cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840

cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900

accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960

tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020

gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080

gccgccgaga acaccggcag caacgagcgg aacatctac 1119

<210> 18

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный домен huSIRP-альфа

<400> 18

atcgtcgtgg gcgtcgtgtg caccctgctg gtggcactgc tgatggccgc tctgtacctc 60

gtg 63

<210> 19

<211> 1323

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция huSIRP альфа-CD28tm

<400> 19

atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60

gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120

aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180

atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240

aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360

tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420

gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480

acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540

accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600

gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660

gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720

agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780

cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840

cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900

accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960

tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020

gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080

gccgccgaga acaccggcag caacgagcgg aacatctact tctgggtgct ggtggtggtc 1140

ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1200

cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc tagacggcct 1260

ggccccacca gaaagcacta ccagccctac gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga 1320

agc 1323

<210> 20

<211> 1323

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция huSIRP альфа 12aas-CD28Cys

<400> 20

atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60

gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120

aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180

atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240

aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360

tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420

gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480

acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540

accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600

gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660

gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720

agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780

cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840

cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900

accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960

tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020

gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080

gcctgtccca gccctctgtt tcccggccct agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc 1140

ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1200

cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc tagacggcct 1260

ggccccacca gaaagcacta ccagccctac gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga 1320

agc 1323

<210> 21

<211> 1083

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> часть внеклеточного домена huSIRP альфа 12aas

<400> 21

atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60

gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120

aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180

atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240

aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360

tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420

gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480

acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540

accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600

gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660

gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720

agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780

cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840

cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900

accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960

tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020

gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080

gcc 1083

<210> 22

<211> 1326

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция huSIRP альфа-12aas-CD28Cys tm-41BBic

<400> 22

atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60

gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120

aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180

atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240

aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360

tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420

gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480

acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540

accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600

gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660

gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720

agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780

cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840

cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900

accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960

tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020

gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080

gcctgtccca gccctctgtt tcccggccct agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc 1140

ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1200

aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ctttcatgcg gcccgtgcag 1260

accacccagg aagaggacgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 1320

gagctg 1326

<210> 23

<211> 1449

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> конструкция huSIRP альфа-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic

<400> 23

atggaacctg ccggacctgc tcctggcaga ctgggacctc tgctgtgtct gctgctggcc 60

gcctcttgtg cttggagcgg agtggctggc gaagaggaac tgcaagtgat ccagcccgac 120

aagagcgtgc tggtggccgc tggcgaaacc gccaccctga gatgtacagc caccagcctg 180

atccccgtgg gccccatcca gtggtttaga ggcgctggcc ctggcagaga gctgatctac 240

aaccagaaag agggccactt ccccagagtg accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatccg gatcggcaac atcacccctg ccgatgccgg cacctactac 360

tgcgtgaagt tccggaaggg cagccccgac gacgtggaat tcaaaagcgg agccggcacc 420

gagctgagcg tgcgggctaa accttctgcc cctgtggtgt ctggacctgc cgccagagct 480

acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc gagagccacg gcttcagccc cagagacatc 540

accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct 600

gtgggcgaga gcgtgtccta cagcatccac agcaccgcca aggtggtgct gacccgcgaa 660

gatgtgcaca gccaagtgat ctgcgaggtg gcccacgtga cactgcaggg cgatcctctg 720

agaggaaccg ccaacctgtc cgagacaatc agagtgcccc ccaccctgga agtgacccag 780

cagcctgtgc gggccgagaa ccaagtgaac gtgacctgcc aagtgcggaa gttctacccc 840

cagcggctgc agctgacctg gctggaaaac ggcaatgtgt cccggaccga gacagccagc 900

accgtgaccg agaacaagga tggcacctac aattggatga gctggctgct cgtgaacgtg 960

tccgcccacc gggacgatgt gaagctgaca tgccaggtgg aacacgacgg ccagcctgcc 1020

gtgtccaaga gccacgatct gaaggtgtca gcccatccca aagagcaggg ctccaacaca 1080

gcctgtccca gccctctgtt tcccggccct agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc 1140

ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1200

cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc tagacggcct 1260

ggccccacca gaaagcacta ccagccctac gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga 1320

agcaagcggg gcagaaagaa gctgctgtac atcttcaagc agcctttcat gcggcccgtg 1380

cagaccaccc aggaagagga cggctgctcc tgcagattcc ccgaggaaga agaaggcggc 1440

tgcgagctg 1449

<210> 24

<211> 305

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huCD200Rtm-CD28

<400> 24

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser

35 40 45

Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile

50 55 60

Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly

65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys

85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp

100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly

115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly

130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn

145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala

165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr

180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val

195 200 205

His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn

210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser

225 230 235 240

Ala Lys Leu Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile Leu Thr Ile Ile Ile Leu Thr

245 250 255

Ile Val Gly Phe Ile Trp Leu Leu Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly

260 265 270

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

275 280 285

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

290 295 300

Ser

305

<210> 25

<211> 243

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> целый внеклеточный домен huCD200R

<400> 25

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser

35 40 45

Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile

50 55 60

Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly

65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys

85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp

100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly

115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly

130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn

145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala

165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr

180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val

195 200 205

His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn

210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser

225 230 235 240

Ala Lys Leu

<210> 26

<211> 21

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный домен huCD200R

<400> 26

Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile Leu Thr Ile Ile Ile Leu Thr Ile Val Gly

1 5 10 15

Phe Ile Trp Leu Leu

20

<210> 27

<211> 27

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD28 трансмембранный домен белок

<400> 27

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 28

<211> 41

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD28 внутриклеточный домен белок

<400> 28

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 29

<211> 311

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huCD200R-CD28tm

<400> 29

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser

35 40 45

Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile

50 55 60

Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly

65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys

85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp

100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly

115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly

130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn

145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala

165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr

180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val

195 200 205

His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn

210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser

225 230 235 240

Ala Lys Leu Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys

245 250 255

Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser

260 265 270

Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

275 280 285

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

290 295 300

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

305 310

<210> 30

<211> 314

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huCD200R-9aas-CD28Cys

<400> 30

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser

35 40 45

Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile

50 55 60

Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly

65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys

85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp

100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly

115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly

130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn

145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala

165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr

180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val

195 200 205

His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn

210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Cys Pro Ser Pro Leu Phe

225 230 235 240

Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

245 250 255

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

260 265 270

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met

275 280 285

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

290 295 300

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

305 310

<210> 31

<211> 234

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huCD200R-9aas

<400> 31

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser

35 40 45

Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile

50 55 60

Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly

65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys

85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp

100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly

115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly

130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn

145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala

165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr

180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val

195 200 205

His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn

210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val

225 230

<210> 32

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок (внеклеточная часть) CD28Cys

<400> 32

Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

1 5 10

<210> 33

<211> 311

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huCD200R-12aas-CD28Cys

<400> 33

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser

35 40 45

Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile

50 55 60

Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly

65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys

85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp

100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly

115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly

130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn

145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala

165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr

180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val

195 200 205

His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn

210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro

225 230 235 240

Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys

245 250 255

Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser

260 265 270

Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

275 280 285

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

290 295 300

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

305 310

<210> 34

<211> 231

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huCD200R-12aas

<400> 34

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser

35 40 45

Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile

50 55 60

Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly

65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys

85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp

100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly

115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly

130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn

145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala

165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr

180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val

195 200 205

His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn

210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu

225 230

<210> 35

<211> 315

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huCD200R-9aas-CD28Cys tm-41BBic

<400> 35

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser

35 40 45

Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile

50 55 60

Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly

65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys

85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp

100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly

115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly

130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn

145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala

165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr

180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val

195 200 205

His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn

210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Cys Pro Ser Pro Leu Phe

225 230 235 240

Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

245 250 255

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

260 265 270

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

275 280 285

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

290 295 300

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

305 310 315

<210> 36

<211> 42

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок 4-1BB внутриклеточный компонент

<400> 36

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 37

<211> 312

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huCD200R-12aas-CD28Cys tm-41BBic

<400> 37

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser

35 40 45

Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile

50 55 60

Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly

65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys

85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp

100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly

115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly

130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn

145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala

165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr

180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val

195 200 205

His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn

210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro

225 230 235 240

Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys

245 250 255

Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg

260 265 270

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

275 280 285

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

290 295 300

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

305 310

<210> 38

<211> 353

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huCD200R-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic

<400> 38

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser

35 40 45

Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile

50 55 60

Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly

65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys

85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp

100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly

115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly

130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn

145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala

165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr

180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val

195 200 205

His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn

210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro

225 230 235 240

Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys

245 250 255

Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser

260 265 270

Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

275 280 285

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

290 295 300

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

305 310 315 320

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

325 330 335

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

340 345 350

Leu

<210> 39

<211> 435

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huSIRP альфа tm-CD28

<400> 39

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

85 90 95

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

130 135 140

Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser

165 170 175

Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser

195 200 205

Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser

210 215 220

Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu

225 230 235 240

Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu

245 250 255

Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr

260 265 270

Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu

275 280 285

Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu

290 295 300

Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val

305 310 315 320

Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp

325 330 335

Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn

355 360 365

Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val

370 375 380

Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg

385 390 395 400

Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

405 410 415

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

420 425 430

Tyr Arg Ser

435

<210> 40

<211> 373

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huSIRP-альфа целый внеклеточный домен

<400> 40

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

85 90 95

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

130 135 140

Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser

165 170 175

Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser

195 200 205

Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser

210 215 220

Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu

225 230 235 240

Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu

245 250 255

Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr

260 265 270

Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu

275 280 285

Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu

290 295 300

Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val

305 310 315 320

Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp

325 330 335

Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn

355 360 365

Glu Arg Asn Ile Tyr

370

<210> 41

<211> 21

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huSIRP-альфа трансмембранный домен

<400> 41

Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val Ala Leu Leu Met Ala

1 5 10 15

Ala Leu Tyr Leu Val

20

<210> 42

<211> 441

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huSIRP альфа-CD28tm

<400> 42

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

85 90 95

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

130 135 140

Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser

165 170 175

Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser

195 200 205

Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser

210 215 220

Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu

225 230 235 240

Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu

245 250 255

Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr

260 265 270

Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu

275 280 285

Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu

290 295 300

Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val

305 310 315 320

Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp

325 330 335

Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn

355 360 365

Glu Arg Asn Ile Tyr Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

370 375 380

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

385 390 395 400

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

405 410 415

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

420 425 430

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

435 440

<210> 43

<211> 441

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huSIRP альфа-12aas-CD28Cys

<400> 43

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

85 90 95

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

130 135 140

Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser

165 170 175

Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser

195 200 205

Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser

210 215 220

Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu

225 230 235 240

Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu

245 250 255

Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr

260 265 270

Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu

275 280 285

Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu

290 295 300

Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val

305 310 315 320

Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp

325 330 335

Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

355 360 365

Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

370 375 380

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

385 390 395 400

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

405 410 415

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

420 425 430

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

435 440

<210> 44

<211> 361

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huSIRP альфа-12aas

<400> 44

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

85 90 95

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

130 135 140

Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser

165 170 175

Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser

195 200 205

Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser

210 215 220

Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu

225 230 235 240

Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu

245 250 255

Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr

260 265 270

Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu

275 280 285

Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu

290 295 300

Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val

305 310 315 320

Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp

325 330 335

Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala

355 360

<210> 45

<211> 442

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huSIRP альфа-12aas-CD28Cys tm-41BBic

<400> 45

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

85 90 95

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

130 135 140

Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser

165 170 175

Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser

195 200 205

Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser

210 215 220

Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu

225 230 235 240

Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu

245 250 255

Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr

260 265 270

Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu

275 280 285

Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu

290 295 300

Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val

305 310 315 320

Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp

325 330 335

Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

355 360 365

Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

370 375 380

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

385 390 395 400

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

405 410 415

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

420 425 430

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

435 440

<210> 46

<211> 483

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок huSIRP альфа-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic

<400> 46

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

85 90 95

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

130 135 140

Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser

165 170 175

Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser

195 200 205

Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser

210 215 220

Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu

225 230 235 240

Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu

245 250 255

Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr

260 265 270

Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu

275 280 285

Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu

290 295 300

Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val

305 310 315 320

Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp

325 330 335

Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

355 360 365

Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

370 375 380

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

385 390 395 400

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

405 410 415

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

420 425 430

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

435 440 445

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

450 455 460

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

465 470 475 480

Cys Glu Leu

<210> 47

<211> 900

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD200Rtm-CD28

<400> 47

atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60

gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120

acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180

agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240

agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300

aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360

ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420

aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480

agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540

ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600

tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660

aaccagagcc tgagcatcga gctgagcaga ggcggaaacc agtccctgag gccctacatc 720

ccttacatca tccccagcat catcatcctg atcatcatcg gctgcatctg cctgctgaac 780

agcagaagaa acagaggcgg ccagagcgac tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc 840

ctgaccagaa agccctacca gccttacgcc cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 900

<210> 48

<211> 918

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD200R-CD28tm

<400> 48

atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60

gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120

acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180

agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240

agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300

aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360

ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420

aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480

agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540

ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600

tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660

aaccagagcc tgagcatcga gctgagcaga ggcggaaacc agtccctgag gcccttctgg 720

gccctggtgg tggtggccgg cgtgctgttt tgttacggcc tgctcgtgac cgtggccctg 780

tgcgtgatct ggaccaacag cagaagaaac agaggcggcc agagcgacta catgaacatg 840

acccccagaa ggcctggcct gaccagaaag ccctaccagc cttacgcccc tgccagagac 900

ttcgccgcct acagacct 918

<210> 49

<211> 945

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD200R-CD28Cys

<400> 49

atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60

gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120

acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180

agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240

agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300

aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360

ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420

aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480

agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540

ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600

tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660

aaccagagcc tgagcatcga gctgagcaga ggcggaaacc agtccctgag gccctgccac 720

acccagagca gccccaagct gttctgggcc ctggtggtgg tggccggcgt gctgttttgt 780

tacggcctgc tcgtgaccgt ggccctgtgc gtgatctgga ccaacagcag aagaaacaga 840

ggcggccaga gcgactacat gaacatgacc cccagaaggc ctggcctgac cagaaagccc 900

taccagcctt acgcccctgc cagagacttc gccgcctaca gacct 945

<210> 50

<211> 936

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD200R-3aas-CD28Cys

<400> 50

atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60

gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120

acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180

agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240

agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300

aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360

ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420

aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480

agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540

ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600

tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660

aaccagagcc tgagcatcga gctgagcaga ggcggaaacc agtcctgcca cacccagagc 720

agccccaagc tgttctgggc cctggtggtg gtggccggcg tgctgttttg ttacggcctg 780

ctcgtgaccg tggccctgtg cgtgatctgg accaacagca gaagaaacag aggcggccag 840

agcgactaca tgaacatgac ccccagaagg cctggcctga ccagaaagcc ctaccagcct 900

tacgcccctg ccagagactt cgccgcctac agacct 936

<210> 51

<211> 918

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD200R-9aas-CD28Cys

<400> 51

atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60

gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120

acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180

agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240

agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300

aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360

ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420

aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480

agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540

ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600

tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660

aaccagagcc tgagcatcga gctgagctgc cacacccaga gcagccccaa gctgttctgg 720

gccctggtgg tggtggccgg cgtgctgttt tgttacggcc tgctcgtgac cgtggccctg 780

tgcgtgatct ggaccaacag cagaagaaac agaggcggcc agagcgacta catgaacatg 840

acccccagaa ggcctggcct gaccagaaag ccctaccagc cttacgcccc tgccagagac 900

ttcgccgcct acagacct 918

<210> 52

<211> 939

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD200R-9aas-CD28Cys tm-41BBic

<400> 52

atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60

gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120

acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180

agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240

agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300

aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360

ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420

aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480

agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540

ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600

tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660

aaccagagcc tgagcatcga gctgagctgc cacacccaga gcagccccaa gctgttctgg 720

gccctggtgg tggtggccgg cgtgctgttt tgttacggcc tgctcgtgac cgtggccctg 780

tgcgtgatct ggaccagcgt gctgaagtgg atcagaaaga agttccccca catcttcaag 840

cagcccttca agaaaaccac cggcgctgcc caggaagagg acgcctgcag ctgtagatgc 900

cctcaggaag aagaaggcgg cggaggcggc tacgagctg 939

<210> 53

<211> 1062

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD200R-9aas-CD28Cys tm ic-41BBic

<400> 53

atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60

gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120

acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180

agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240

agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300

aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360

ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420

aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480

agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540

ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600

tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660

aaccagagcc tgagcatcga gctgagctgc cacacccaga gcagccccaa gctgttctgg 720

gccctggtgg tggtggccgg cgtgctgttt tgttacggcc tgctcgtgac cgtggccctg 780

tgcgtgatct ggaccaacag cagaagaaac agaggcggcc agagcgacta catgaacatg 840

acccccagaa ggcctggcct gaccagaaag ccctaccagc cttacgcccc tgccagagac 900

ttcgccgcct acagacctag cgtgctgaag tggatcagaa agaagttccc ccacatcttc 960

aagcagccct tcaagaaaac caccggcgct gcccaggaag aggacgcctg cagctgtaga 1020

tgccctcagg aagaagaagg cggcggaggc ggctacgagc tg 1062

<210> 54

<211> 1305

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muSIRP альфа tm-CD28

<400> 54

atggaacctg ctggacctgc ccctggcaga ctgggacctc tgctgctgtg cctgctgctg 60

agcgccagct gtttctgtac cggcgccacc ggcaaagaac tgaaagtgac ccagcccgag 120

aagtccgtgt ctgtggccgc tggcgacagc accgtgctga actgtaccct gaccagcctg 180

ctgcccgtgg gccccatcag atggtataga ggcgtgggcc ctagcagact gctgatctac 240

agcttcgctg gcgagtacgt gcccagaatc agaaacgtgt ccgacaccac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatcag gatcagcaac gtgacccctg ccgacgccgg catctactac 360

tgcgtgaagt tccagaaggg cagcagcgag cccgacaccg agattcagtc tggcggcgga 420

accgaggtgt acgtgctggc taagcccagc cctcctgagg tgtccggccc tgctgataga 480

ggcatccccg accagaaagt gaacttcaca tgcaagagcc acggcttcag ccccagaaac 540

atcaccctga agtggttcaa ggacggccag gaactgcacc ccctggaaac caccgtgaac 600

cccagcggca agaacgtgtc ctacaacatc agctccaccg tgcgggtggt gctgaacagc 660

atggacgtga acagcaaagt gatctgcgag gtggcccaca tcacactgga cagaagcccc 720

ctgagaggaa tcgccaacct gagcaacttc atcagagtgt ccccaaccgt gaaagtgaca 780

cagcagagcc ccaccagcat gaaccaagtg aacctgacct gcagagccga gagattctac 840

cccgaggacc tgcagctgat ctggctggaa aacggcaacg tgtccagaaa cgacaccccc 900

aagaacctga caaagaacac cgacggcacc tacaactaca cctccctgtt tctcgtgaac 960

tcctccgccc accgcgagga cgtggtgttc acgtgccaag tgaagcacga ccagcagccc 1020

gccatcacca gaaaccacac agtgctgggc ttcgcccaca gcagcgacca gggcagcatg 1080

cagaccttcc ccgacaacaa cgccacccac aactggaacg tgttcatcgg cgtgggcgtg 1140

gcctgtgctc tgctggtggt gctgctgatg gccgccctgt ataacagcag aagaaacaga 1200

ggcggccaga gcgactacat gaacatgacc cccagaaggc ctggcctgac cagaaagccc 1260

taccagcctt acgcccctgc cagagacttc gccgcctaca gacct 1305

<210> 55

<211> 1323

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muSIRP альфа-CD28tm

<400> 55

atggaacctg ctggacctgc ccctggcaga ctgggacctc tgctgctgtg cctgctgctg 60

agcgccagct gtttctgtac cggcgccacc ggcaaagaac tgaaagtgac ccagcccgag 120

aagtccgtgt ctgtggccgc tggcgacagc accgtgctga actgtaccct gaccagcctg 180

ctgcccgtgg gccccatcag atggtataga ggcgtgggcc ctagcagact gctgatctac 240

agcttcgctg gcgagtacgt gcccagaatc agaaacgtgt ccgacaccac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatcag gatcagcaac gtgacccctg ccgacgccgg catctactac 360

tgcgtgaagt tccagaaggg cagcagcgag cccgacaccg agattcagtc tggcggcgga 420

accgaggtgt acgtgctggc taagcccagc cctcctgagg tgtccggccc tgctgataga 480

ggcatccccg accagaaagt gaacttcaca tgcaagagcc acggcttcag ccccagaaac 540

atcaccctga agtggttcaa ggacggccag gaactgcacc ccctggaaac caccgtgaac 600

cccagcggca agaacgtgtc ctacaacatc agctccaccg tgcgggtggt gctgaacagc 660

atggacgtga acagcaaagt gatctgcgag gtggcccaca tcacactgga cagaagcccc 720

ctgagaggaa tcgccaacct gagcaacttc atcagagtgt ccccaaccgt gaaagtgaca 780

cagcagagcc ccaccagcat gaaccaagtg aacctgacct gcagagccga gagattctac 840

cccgaggacc tgcagctgat ctggctggaa aacggcaacg tgtccagaaa cgacaccccc 900

aagaacctga caaagaacac cgacggcacc tacaactaca cctccctgtt tctcgtgaac 960

tcctccgccc accgcgagga cgtggtgttc acgtgccaag tgaagcacga ccagcagccc 1020

gccatcacca gaaaccacac agtgctgggc ttcgcccaca gcagcgacca gggcagcatg 1080

cagaccttcc ccgacaacaa cgccacccac aactggaact tctgggccct ggtggtggtg 1140

gccggcgtgc tgttttgtta cggcctgctc gtgaccgtgg ccctgtgcgt gatctggacc 1200

aacagcagaa gaaacagagg cggccagagc gactacatga acatgacccc cagaaggcct 1260

ggcctgacca gaaagcccta ccagccttac gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga 1320

cct 1323

<210> 56

<211> 1350

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muSIRP альфа-CD28cys

<400> 56

atggaacctg ctggacctgc ccctggcaga ctgggacctc tgctgctgtg cctgctgctg 60

agcgccagct gtttctgtac cggcgccacc ggcaaagaac tgaaagtgac ccagcccgag 120

aagtccgtgt ctgtggccgc tggcgacagc accgtgctga actgtaccct gaccagcctg 180

ctgcccgtgg gccccatcag atggtataga ggcgtgggcc ctagcagact gctgatctac 240

agcttcgctg gcgagtacgt gcccagaatc agaaacgtgt ccgacaccac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatcag gatcagcaac gtgacccctg ccgacgccgg catctactac 360

tgcgtgaagt tccagaaggg cagcagcgag cccgacaccg agattcagtc tggcggcgga 420

accgaggtgt acgtgctggc taagcccagc cctcctgagg tgtccggccc tgctgataga 480

ggcatccccg accagaaagt gaacttcaca tgcaagagcc acggcttcag ccccagaaac 540

atcaccctga agtggttcaa ggacggccag gaactgcacc ccctggaaac caccgtgaac 600

cccagcggca agaacgtgtc ctacaacatc agctccaccg tgcgggtggt gctgaacagc 660

atggacgtga acagcaaagt gatctgcgag gtggcccaca tcacactgga cagaagcccc 720

ctgagaggaa tcgccaacct gagcaacttc atcagagtgt ccccaaccgt gaaagtgaca 780

cagcagagcc ccaccagcat gaaccaagtg aacctgacct gcagagccga gagattctac 840

cccgaggacc tgcagctgat ctggctggaa aacggcaacg tgtccagaaa cgacaccccc 900

aagaacctga caaagaacac cgacggcacc tacaactaca cctccctgtt tctcgtgaac 960

tcctccgccc accgcgagga cgtggtgttc acgtgccaag tgaagcacga ccagcagccc 1020

gccatcacca gaaaccacac agtgctgggc ttcgcccaca gcagcgacca gggcagcatg 1080

cagaccttcc ccgacaacaa cgccacccac aactggaact gccacaccca gagcagcccc 1140

aagctgttct gggctctggt ggtggtggcc ggcgtgctgt tttgttacgg cctgctcgtg 1200

accgtggccc tgtgcgtgat ctggaccaac agcagaagaa acagaggcgg ccagagcgac 1260

tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc ctgacccgga agccttacca gccttacgcc 1320

cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 1350

<210> 57

<211> 1332

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muSIRP альфа-6aas-CD28cys

<400> 57

atggaacctg ctggacctgc ccctggcaga ctgggacctc tgctgctgtg cctgctgctg 60

agcgccagct gtttctgtac cggcgccacc ggcaaagaac tgaaagtgac ccagcccgag 120

aagtccgtgt ctgtggccgc tggcgacagc accgtgctga actgtaccct gaccagcctg 180

ctgcccgtgg gccccatcag atggtataga ggcgtgggcc ctagcagact gctgatctac 240

agcttcgctg gcgagtacgt gcccagaatc agaaacgtgt ccgacaccac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatcag gatcagcaac gtgacccctg ccgacgccgg catctactac 360

tgcgtgaagt tccagaaggg cagcagcgag cccgacaccg agattcagtc tggcggcgga 420

accgaggtgt acgtgctggc taagcccagc cctcctgagg tgtccggccc tgctgataga 480

ggcatccccg accagaaagt gaacttcaca tgcaagagcc acggcttcag ccccagaaac 540

atcaccctga agtggttcaa ggacggccag gaactgcacc ccctggaaac caccgtgaac 600

cccagcggca agaacgtgtc ctacaacatc agctccaccg tgcgggtggt gctgaacagc 660

atggacgtga acagcaaagt gatctgcgag gtggcccaca tcacactgga cagaagcccc 720

ctgagaggaa tcgccaacct gagcaacttc atcagagtgt ccccaaccgt gaaagtgaca 780

cagcagagcc ccaccagcat gaaccaagtg aacctgacct gcagagccga gagattctac 840

cccgaggacc tgcagctgat ctggctggaa aacggcaacg tgtccagaaa cgacaccccc 900

aagaacctga caaagaacac cgacggcacc tacaactaca cctccctgtt tctcgtgaac 960

tcctccgccc accgcgagga cgtggtgttc acgtgccaag tgaagcacga ccagcagccc 1020

gccatcacca gaaaccacac agtgctgggc ttcgcccaca gcagcgacca gggcagcatg 1080

cagaccttcc ccgacaacaa ctgccacacc cagagcagcc ccaagctgtt ctgggctctg 1140

gtggtggtgg ccggcgtgct gttttgttac ggcctgctcg tgaccgtggc cctgtgcgtg 1200

atctggacca acagcagaag aaacagaggc ggccagagcg actacatgaa catgaccccc 1260

agaaggcctg gcctgacccg gaagccttac cagccttacg cccctgccag agacttcgcc 1320

gcctacagac ct 1332

<210> 58

<211> 1323

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muSIRP альфа-9aas-CD28cys

<400> 58

atggaacctg ctggacctgc ccctggcaga ctgggacctc tgctgctgtg cctgctgctg 60

agcgccagct gtttctgtac cggcgccacc ggcaaagaac tgaaagtgac ccagcccgag 120

aagtccgtgt ctgtggccgc tggcgacagc accgtgctga actgtaccct gaccagcctg 180

ctgcccgtgg gccccatcag atggtataga ggcgtgggcc ctagcagact gctgatctac 240

agcttcgctg gcgagtacgt gcccagaatc agaaacgtgt ccgacaccac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatcag gatcagcaac gtgacccctg ccgacgccgg catctactac 360

tgcgtgaagt tccagaaggg cagcagcgag cccgacaccg agattcagtc tggcggcgga 420

accgaggtgt acgtgctggc taagcccagc cctcctgagg tgtccggccc tgctgataga 480

ggcatccccg accagaaagt gaacttcaca tgcaagagcc acggcttcag ccccagaaac 540

atcaccctga agtggttcaa ggacggccag gaactgcacc ccctggaaac caccgtgaac 600

cccagcggca agaacgtgtc ctacaacatc agctccaccg tgcgggtggt gctgaacagc 660

atggacgtga acagcaaagt gatctgcgag gtggcccaca tcacactgga cagaagcccc 720

ctgagaggaa tcgccaacct gagcaacttc atcagagtgt ccccaaccgt gaaagtgaca 780

cagcagagcc ccaccagcat gaaccaagtg aacctgacct gcagagccga gagattctac 840

cccgaggacc tgcagctgat ctggctggaa aacggcaacg tgtccagaaa cgacaccccc 900

aagaacctga caaagaacac cgacggcacc tacaactaca cctccctgtt tctcgtgaac 960

tcctccgccc accgcgagga cgtggtgttc acgtgccaag tgaagcacga ccagcagccc 1020

gccatcacca gaaaccacac agtgctgggc ttcgcccaca gcagcgacca gggcagcatg 1080

cagaccttcc cctgccacac ccagagcagc cccaagctgt tctgggctct ggtggtggtg 1140

gccggcgtgc tgttttgtta cggcctgctc gtgaccgtgg ccctgtgcgt gatctggacc 1200

aacagcagaa gaaacagagg cggccagagc gactacatga acatgacccc cagaaggcct 1260

ggcctgaccc ggaagcctta ccagccttac gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga 1320

cct 1323

<210> 59

<211> 1281

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muSIRP альфа-23aas-CD28cys

<400> 59

atggaacctg ctggacctgc ccctggcaga ctgggacctc tgctgctgtg cctgctgctg 60

agcgccagct gtttctgtac cggcgccacc ggcaaagaac tgaaagtgac ccagcccgag 120

aagtccgtgt ctgtggccgc tggcgacagc accgtgctga actgtaccct gaccagcctg 180

ctgcccgtgg gccccatcag atggtataga ggcgtgggcc ctagcagact gctgatctac 240

agcttcgctg gcgagtacgt gcccagaatc agaaacgtgt ccgacaccac caagcggaac 300

aacatggact tcagcatcag gatcagcaac gtgacccctg ccgacgccgg catctactac 360

tgcgtgaagt tccagaaggg cagcagcgag cccgacaccg agattcagtc tggcggcgga 420

accgaggtgt acgtgctggc taagcccagc cctcctgagg tgtccggccc tgctgataga 480

ggcatccccg accagaaagt gaacttcaca tgcaagagcc acggcttcag ccccagaaac 540

atcaccctga agtggttcaa ggacggccag gaactgcacc ccctggaaac caccgtgaac 600

cccagcggca agaacgtgtc ctacaacatc agctccaccg tgcgggtggt gctgaacagc 660

atggacgtga acagcaaagt gatctgcgag gtggcccaca tcacactgga cagaagcccc 720

ctgagaggaa tcgccaacct gagcaacttc atcagagtgt ccccaaccgt gaaagtgaca 780

cagcagagcc ccaccagcat gaaccaagtg aacctgacct gcagagccga gagattctac 840

cccgaggacc tgcagctgat ctggctggaa aacggcaacg tgtccagaaa cgacaccccc 900

aagaacctga caaagaacac cgacggcacc tacaactaca cctccctgtt tctcgtgaac 960

tcctccgccc accgcgagga cgtggtgttc acgtgccaag tgaagcacga ccagcagccc 1020

gccatcacca gaaaccacac agtgctgggc tgccacaccc agagcagccc caagctgttc 1080

tgggctctgg tggtggtggc cggcgtgctg ttttgttacg gcctgctcgt gaccgtggcc 1140

ctgtgcgtga tctggaccaa cagcagaaga aacagaggcg gccagagcga ctacatgaac 1200

atgaccccca gaaggcctgg cctgacccgg aagccttacc agccttacgc ccctgccaga 1260

gacttcgccg cctacagacc t 1281

<210> 60

<211> 137

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> эктодомен huPD-1

<400> 60

Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn

1 5 10 15

Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu

20 25 30

Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala

35 40 45

Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val

50 55 60

Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala

65 70 75 80

Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala

85 90 95

Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr

100 105 110

Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg

115 120 125

Ser Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val

130 135

<210> 61

<211> 627

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> целый внеклеточный домен huCD2

<400> 61

atgagctttc catgtaaatt tgtagccagc ttccttctga ttttcaatgt ttcttccaaa 60

ggtgcagtct ccaaagagat tacgaatgcc ttggaaacct ggggtgcctt gggtcaggac 120

atcaacttgg acattcctag ttttcaaatg agtgatgata ttgacgatat aaaatgggaa 180

aaaacttcag acaagaaaaa gattgcacaa ttcagaaaag agaaagagac tttcaaggaa 240

aaagatacat ataagctatt taaaaatgga actctgaaaa ttaagcatct gaagaccgat 300

gatcaggata tctacaaggt atcaatatat gatacaaaag gaaaaaatgt gttggaaaaa 360

atatttgatt tgaagattca agagagggtc tcaaaaccaa agatctcctg gacttgtatc 420

aacacaaccc tgacctgtga ggtaatgaat ggaactgacc ccgaattaaa cctgtatcaa 480

gatgggaaac atctaaaact ttctcagagg gtcatcacac acaagtggac caccagcctg 540

agtgcaaaat tcaagtgcac agcagggaac aaagtcagca aggaatccag tgtcgagcct 600

gtcagctgtc cagagaaagg tctggac 627

<210> 62

<211> 209

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> целый внеклеточный домен huCD2

<400> 62

Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn

1 5 10 15

Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu

20 25 30

Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe

35 40 45

Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp

50 55 60

Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu

65 70 75 80

Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His

85 90 95

Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr

100 105 110

Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu

115 120 125

Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu

130 135 140

Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln

145 150 155 160

Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp

165 170 175

Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val

180 185 190

Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu

195 200 205

Asp

<210> 63

<211> 78

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный домен huCD2

<400> 63

atctatctca tcattggcat atgtggagga ggcagcctct tgatggtctt tgtggcactg 60

ctcgttttct atatcacc 78

<210> 64

<211> 26

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный домен huCD2

<400> 64

Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met Val

1 5 10 15

Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr

20 25

<210> 65

<211> 828

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК huCD2tm-CD28

<400> 65

atgagctttc catgtaaatt tgtagccagc ttccttctga ttttcaatgt ttcttccaaa 60

ggtgcagtct ccaaagagat tacgaatgcc ttggaaacct ggggtgcctt gggtcaggac 120

atcaacttgg acattcctag ttttcaaatg agtgatgata ttgacgatat aaaatgggaa 180

aaaacttcag acaagaaaaa gattgcacaa ttcagaaaag agaaagagac tttcaaggaa 240

aaagatacat ataagctatt taaaaatgga actctgaaaa ttaagcatct gaagaccgat 300

gatcaggata tctacaaggt atcaatatat gatacaaaag gaaaaaatgt gttggaaaaa 360

atatttgatt tgaagattca agagagggtc tcaaaaccaa agatctcctg gacttgtatc 420

aacacaaccc tgacctgtga ggtaatgaat ggaactgacc ccgaattaaa cctgtatcaa 480

gatgggaaac atctaaaact ttctcagagg gtcatcacac acaagtggac caccagcctg 540

agtgcaaaat tcaagtgcac agcagggaac aaagtcagca aggaatccag tgtcgagcct 600

gtcagctgtc cagagaaagg tctggacatc tatctcatca ttggcatatg tggaggaggc 660

agcctcttga tggtctttgt ggcactgctc gttttctata tcacccgcag caagcggagc 720

agaggcggcc acagcgacta catgaacatg acccctagac ggcctggccc caccagaaag 780

cactaccagc cctacgcccc tccccgggac tttgccgcct acagaagc 828

<210> 66

<211> 276

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huCD2tm-CD28

<400> 66

Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn

1 5 10 15

Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu

20 25 30

Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe

35 40 45

Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp

50 55 60

Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu

65 70 75 80

Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His

85 90 95

Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr

100 105 110

Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu

115 120 125

Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu

130 135 140

Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln

145 150 155 160

Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp

165 170 175

Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val

180 185 190

Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu

195 200 205

Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met

210 215 220

Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Arg Ser Lys Arg Ser

225 230 235 240

Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

245 250 255

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

260 265 270

Ala Tyr Arg Ser

275

<210> 67

<211> 831

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huCD2-CD28tm

<400> 67

atgagctttc catgtaaatt tgtagccagc ttccttctga ttttcaatgt ttcttccaaa 60

ggtgcagtct ccaaagagat tacgaatgcc ttggaaacct ggggtgcctt gggtcaggac 120

atcaacttgg acattcctag ttttcaaatg agtgatgata ttgacgatat aaaatgggaa 180

aaaacttcag acaagaaaaa gattgcacaa ttcagaaaag agaaagagac tttcaaggaa 240

aaagatacat ataagctatt taaaaatgga actctgaaaa ttaagcatct gaagaccgat 300

gatcaggata tctacaaggt atcaatatat gatacaaaag gaaaaaatgt gttggaaaaa 360

atatttgatt tgaagattca agagagggtc tcaaaaccaa agatctcctg gacttgtatc 420

aacacaaccc tgacctgtga ggtaatgaat ggaactgacc ccgaattaaa cctgtatcaa 480

gatgggaaac atctaaaact ttctcagagg gtcatcacac acaagtggac caccagcctg 540

agtgcaaaat tcaagtgcac agcagggaac aaagtcagca aggaatccag tgtcgagcct 600

gtcagctgtc cagagaaagg tctggacttc tgggtgctgg tggtggtcgg aggcgtgctg 660

gcctgctaca gcctgctggt caccgtggcc ttcatcatct tttgggtccg cagcaagcgg 720

agcagaggcg gccacagcga ctacatgaac atgaccccta gacggcctgg ccccaccaga 780

aagcactacc agccctacgc ccctccccgg gactttgccg cctacagaag c 831

<210> 68

<211> 277

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huCD2-CD28tm

<400> 68

Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn

1 5 10 15

Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu

20 25 30

Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe

35 40 45

Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp

50 55 60

Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu

65 70 75 80

Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His

85 90 95

Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr

100 105 110

Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu

115 120 125

Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu

130 135 140

Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln

145 150 155 160

Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp

165 170 175

Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val

180 185 190

Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu

195 200 205

Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

210 215 220

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

225 230 235 240

Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

245 250 255

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

260 265 270

Ala Ala Tyr Arg Ser

275

<210> 69

<211> 969

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huCD200R-CD28Cys

<400> 69

atgctgtgcc cttggagaac cgccaacctg ggcctgctgc tgatcctgac catcttcctg 60

gtggccgcca gcagcagcct gtgcatggac gagaagcaga tcacccagaa ctacagcaag 120

gtgctggccg aagtgaacac cagctggccc gtgaagatgg ccaccaacgc cgtgctgtgc 180

tgccctccta tcgccctgcg gaacctgatc atcatcacct gggagatcat cctgcggggc 240

cagcccagct gtaccaaggc ctaccggaaa gagacaaacg agacaaaaga aacaaactgc 300

accgacgagc ggatcacatg ggtgtccaga cccgaccaga acagcgacct gcagatcaga 360

cccgtggcca tcacccacga cggctactac cggtgcatca tggtcacccc cgatggcaac 420

ttccaccggg gataccatct gcaggtgctc gtgacccccg aagtgaccct gttccagaac 480

cggaacagaa ccgccgtgtg caaggccgtg gccggaaaac ctgccgccca gatctcttgg 540

atccccgagg gcgattgcgc caccaagcag gaatactggt ccaacggcac cgtgaccgtg 600

aagtccacct gtcactggga ggtgcacaac gtgtccaccg tgacatgcca cgtgtcccac 660

ctgaccggca acaagagcct gtacatcgag ctgctgcctg tgcctggcgc caagaagtcc 720

gccaagctgt gtcccagccc tctgtttccc ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg 780

gtggtcggag gcgtgctggc ctgctacagc ctgctggtca ccgtggcctt catcatcttt 840

tgggtccgca gcaagcggag cagaggcggc cacagcgact acatgaacat gacccctaga 900

cggcctggcc ccaccagaaa gcactaccag ccctacgccc ctccccggga ctttgccgcc 960

tacagaagc 969

<210> 70

<211> 323

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huCD200R-CD28Cys

<400> 70

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser

35 40 45

Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile

50 55 60

Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly

65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys

85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp

100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly

115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly

130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn

145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala

165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr

180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val

195 200 205

His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn

210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser

225 230 235 240

Ala Lys Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe

245 250 255

Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu

260 265 270

Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg

275 280 285

Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

290 295 300

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

305 310 315 320

Tyr Arg Ser

<210> 71

<211> 519

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> целый внеклеточный домен huFas

<400> 71

atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60

aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120

gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180

aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240

gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300

tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360

cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420

gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480

tccaacacaa agtgcaaaga ggaaggcagc agaagcaac 519

<210> 72

<211> 173

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> целый внеклеточный домен huFas

<400> 72

Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala

1 5 10 15

Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser

20 25 30

Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn

35 40 45

Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro

50 55 60

Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro

65 70 75 80

Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His

85 90 95

Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly

100 105 110

Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg

115 120 125

Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp

130 135 140

Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr

145 150 155 160

Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn

165 170

<210> 73

<211> 498

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huFas внеклеточный домен -7aas

<400> 73

atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60

aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120

gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180

aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240

gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300

tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360

cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420

gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480

tccaacacaa agtgcaaa 498

<210> 74

<211> 166

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huFas внеклеточный домен -7aas

<400> 74

Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala

1 5 10 15

Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser

20 25 30

Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn

35 40 45

Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro

50 55 60

Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro

65 70 75 80

Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His

85 90 95

Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly

100 105 110

Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg

115 120 125

Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp

130 135 140

Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr

145 150 155 160

Ser Asn Thr Lys Cys Lys

165

<210> 75

<211> 483

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huFas внеклеточный домен -12aas

<400> 75

atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60

aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120

gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180

aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240

gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300

tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360

cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420

gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480

tcc 483

<210> 76

<211> 161

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huFas внеклеточный домен -12aas

<400> 76

Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala

1 5 10 15

Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser

20 25 30

Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn

35 40 45

Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro

50 55 60

Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro

65 70 75 80

Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His

85 90 95

Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly

100 105 110

Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg

115 120 125

Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp

130 135 140

Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr

145 150 155 160

Ser

<210> 77

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный домен huFas

<400> 77

ctgggctggc tgtgcctcct gctgctgccc atccctctga tcgtgtgggt c 51

<210> 78

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный домен huFas

<400> 78

Leu Gly Trp Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val Trp

1 5 10 15

Val

<210> 79

<211> 693

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huFAStm-CD28

<400> 79

atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60

aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120

gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180

aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240

gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300

tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360

cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420

gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480

tccaacacaa agtgcaaaga ggaaggcagc agaagcaacc tgggctggct gtgcctcctg 540

ctgctgccca tccctctgat cgtgtgggtc cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc 600

gactacatga acatgacccc tagacggcct ggccccacca gaaagcacta ccagccctac 660

gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga agc 693

<210> 80

<211> 231

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huFAStm-CD28

<400> 80

Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala

1 5 10 15

Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser

20 25 30

Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn

35 40 45

Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro

50 55 60

Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro

65 70 75 80

Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His

85 90 95

Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly

100 105 110

Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg

115 120 125

Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp

130 135 140

Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr

145 150 155 160

Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp

165 170 175

Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val Trp Val Arg Ser

180 185 190

Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

195 200 205

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

210 215 220

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

225 230

<210> 81

<211> 723

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huFAS-CD28tm

<400> 81

atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60

aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120

gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180

aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240

gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300

tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360

cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420

gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480

tccaacacaa agtgcaaaga ggaaggcagc agaagcaact tctgggtgct ggtggtggtc 540

ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 600

cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc tagacggcct 660

ggccccacca gaaagcacta ccagccctac gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga 720

agc 723

<210> 82

<211> 241

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huFAS-CD28tm

<400> 82

Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala

1 5 10 15

Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser

20 25 30

Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn

35 40 45

Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro

50 55 60

Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro

65 70 75 80

Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His

85 90 95

Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly

100 105 110

Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg

115 120 125

Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp

130 135 140

Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr

145 150 155 160

Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Phe Trp Val

165 170 175

Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr

180 185 190

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly

195 200 205

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

210 215 220

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

225 230 235 240

Ser

<210> 83

<211> 759

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huFAS-CD28Cys

<400> 83

atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60

aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120

gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180

aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240

gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300

tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360

cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420

gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480

tccaacacaa agtgcaaaga ggaaggcagc agaagcaact gtcccagccc tctgtttccc 540

ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg gtggtcggag gcgtgctggc ctgctacagc 600

ctgctggtca ccgtggcctt catcatcttt tgggtccgca gcaagcggag cagaggcggc 660

cacagcgact acatgaacat gacccctaga cggcctggcc ccaccagaaa gcactaccag 720

ccctacgccc ctccccggga ctttgccgcc tacagaagc 759

<210> 84

<211> 253

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huFAS-CD28Cys

<400> 84

Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala

1 5 10 15

Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser

20 25 30

Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn

35 40 45

Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro

50 55 60

Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro

65 70 75 80

Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His

85 90 95

Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly

100 105 110

Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg

115 120 125

Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp

130 135 140

Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr

145 150 155 160

Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Cys Pro Ser

165 170 175

Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val

180 185 190

Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile

195 200 205

Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr

210 215 220

Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln

225 230 235 240

Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

245 250

<210> 85

<211> 738

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huFAS-7aas-CD28Cys

<400> 85

atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60

aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120

gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180

aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240

gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300

tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360

cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420

gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480

tccaacacaa agtgcaaatg tcccagccct ctgtttcccg gccctagcaa gcctttctgg 540

gtgctggtgg tggtcggagg cgtgctggcc tgctacagcc tgctggtcac cgtggccttc 600

atcatctttt gggtccgcag caagcggagc agaggcggcc acagcgacta catgaacatg 660

acccctagac ggcctggccc caccagaaag cactaccagc cctacgcccc tccccgggac 720

tttgccgcct acagaagc 738

<210> 86

<211> 246

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huFAS-7aas-CD28Cys

<400> 86

Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala

1 5 10 15

Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser

20 25 30

Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn

35 40 45

Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro

50 55 60

Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro

65 70 75 80

Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His

85 90 95

Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly

100 105 110

Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg

115 120 125

Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp

130 135 140

Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr

145 150 155 160

Ser Asn Thr Lys Cys Lys Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser

165 170 175

Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

180 185 190

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

195 200 205

Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

210 215 220

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

225 230 235 240

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

245

<210> 87

<211> 723

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FAS-12aas-CD28Cys

<400> 87

atgctgggca tctggaccct gctgcctctg gtgctgacaa gcgtggccag actgagcagc 60

aagagcgtga acgcccaagt gaccgacatc aacagcaagg gcctggaact gagaaagacc 120

gtgaccaccg tggaaaccca gaacctggaa ggcctgcacc acgacggcca gttctgccac 180

aagccttgtc cccctggcga gcggaaggcc agagactgta ctgtgaacgg cgacgagccc 240

gactgcgtgc cctgtcagga aggcaaagag tacaccgaca aggcccactt cagcagcaag 300

tgccggcggt gcagactgtg tgatgagggc cacggcctgg aagtggaaat caactgcacc 360

cggacccaga acaccaagtg cagatgcaag cccaacttct tctgcaacag caccgtgtgc 420

gagcactgcg acccctgtac caagtgcgaa cacggcatca tcaaagagtg caccctgacc 480

tcctgtccca gccctctgtt tcccggccct agcaagcctt tctgggtgct ggtggtggtc 540

ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 600

cgcagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc tagacggcct 660

ggccccacca gaaagcacta ccagccctac gcccctcccc gggactttgc cgcctacaga 720

agc 723

<210> 88

<211> 241

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FAS-12aas-CD28Cys

<400> 88

Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala

1 5 10 15

Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser

20 25 30

Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn

35 40 45

Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro

50 55 60

Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro

65 70 75 80

Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His

85 90 95

Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly

100 105 110

Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg

115 120 125

Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp

130 135 140

Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr

145 150 155 160

Ser Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val

165 170 175

Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr

180 185 190

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly

195 200 205

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

210 215 220

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

225 230 235 240

Ser

<210> 89

<211> 510

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1 целый внеклеточный домен 2

<400> 89

atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60

cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120

ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180

gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240

gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300

cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360

tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420

gagctgagag tgaccgagag aagggccgaa gtgcctaccg cccaccctag cccatctcca 480

agacctgccg gccagttcca gacactggtc 510

<210> 90

<211> 170

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1 целый внеклеточный домен 2

<400> 90

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val

165 170

<210> 91

<211> 474

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1 2 -12aas

<400> 91

atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60

cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120

ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180

gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240

gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300

cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360

tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420

gagctgagag tgaccgagag aagggccgaa gtgcctaccg cccaccctag ccca 474

<210> 92

<211> 158

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1 2 -12aas

<400> 92

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro

145 150 155

<210> 93

<211> 465

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1 2 -15aas

<400> 93

atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60

cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120

ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180

gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240

gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300

cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360

tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420

gagctgagag tgaccgagag aagggccgaa gtgcctaccg cccac 465

<210> 94

<211> 155

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1 2 -15aas

<400> 94

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His

145 150 155

<210> 95

<211> 447

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1 2 -21aas

<400> 95

atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60

cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120

ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180

gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240

gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300

cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360

tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420

gagctgagag tgaccgagag aagggcc 447

<210> 96

<211> 149

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1 2 -21aas

<400> 96

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala

145

<210> 97

<211> 750

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1-CD28Cys

<400> 97

atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60

cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120

ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180

gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240

gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300

cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360

tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420

gagctgagag tgaccgagag aagggccgaa gtgcctaccg cccaccctag cccatctcca 480

agacctgccg gccagttcca gacactggtc tgtcccagcc ctctgtttcc cggccctagc 540

aagcctttct gggtgctggt ggtggtcgga ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtc 600

accgtggcct tcatcatctt ttgggtccgc agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac 660

tacatgaaca tgacccctag acggcctggc cccaccagaa agcactacca gccctacgcc 720

cctccccggg actttgccgc ctacagaagc 750

<210> 98

<211> 250

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1-CD28Cys

<400> 98

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Cys Pro Ser Pro Leu Phe

165 170 175

Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

180 185 190

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

195 200 205

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met

210 215 220

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

225 230 235 240

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

245 250

<210> 99

<211> 714

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1-12aas-CD28Cys

<400> 99

atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60

cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120

ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180

gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240

gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300

cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360

tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420

gagctgagag tgaccgagag aagggccgaa gtgcctaccg cccaccctag cccatgtccc 480

agccctctgt ttcccggccc tagcaagcct ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg 540

ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg gccttcatca tcttttgggt ccgcagcaag 600

cggagcagag gcggccacag cgactacatg aacatgaccc ctagacggcc tggccccacc 660

agaaagcact accagcccta cgcccctccc cgggactttg ccgcctacag aagc 714

<210> 100

<211> 238

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1-12aas-CD28Cys

<400> 100

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Cys Pro

145 150 155 160

Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val

165 170 175

Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe

180 185 190

Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp

195 200 205

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr

210 215 220

Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

225 230 235

<210> 101

<211> 705

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1-15aas-CD28Cys

<400> 101

atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60

cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120

ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180

gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240

gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300

cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360

tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420

gagctgagag tgaccgagag aagggccgaa gtgcctaccg cccactgtcc cagccctctg 480

tttcccggcc ctagcaagcc tttctgggtg ctggtggtgg tcggaggcgt gctggcctgc 540

tacagcctgc tggtcaccgt ggccttcatc atcttttggg tccgcagcaa gcggagcaga 600

ggcggccaca gcgactacat gaacatgacc cctagacggc ctggccccac cagaaagcac 660

taccagccct acgcccctcc ccgggacttt gccgcctaca gaagc 705

<210> 102

<211> 235

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1-15aas-CD28Cys

<400> 102

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Cys Pro Ser Pro Leu

145 150 155 160

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

165 170 175

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

180 185 190

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn

195 200 205

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

210 215 220

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

225 230 235

<210> 103

<211> 687

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1-21aas-CD28Cys

<400> 103

atgcagatcc ctcaggcccc ttggcctgtc gtgtgggctg tgctgcagct gggatggcgg 60

cctggctggt ttctggacag ccccgacaga ccctggaacc cccctacatt ttcccctgcc 120

ctgctggtcg tgaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gtagcttcag caacaccagc 180

gagagcttcg tgctgaactg gtacagaatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240

gccttccccg aggatagatc tcagcccggc caggactgcc ggttcagagt gacccagctg 300

cccaacggcc gggacttcca catgtctgtc gtgcgggcca gacggaacga cagcggcaca 360

tatctgtgcg gcgccatcag cctggccccc aaggcccaga tcaaagagag cctgagagcc 420

gagctgagag tgaccgagag aagggcctgt cccagccctc tgtttcccgg ccctagcaag 480

cctttctggg tgctggtggt ggtcggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc 540

gtggccttca tcatcttttg ggtccgcagc aagcggagca gaggcggcca cagcgactac 600

atgaacatga cccctagacg gcctggcccc accagaaagc actaccagcc ctacgcccct 660

ccccgggact ttgccgccta cagaagc 687

<210> 104

<211> 229

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huPD1-21aas-CD28Cys

<400> 104

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys

145 150 155 160

Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

165 170 175

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

180 185 190

Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

195 200 205

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

210 215 220

Ala Ala Tyr Arg Ser

225

<210> 105

<211> 810

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD2tm-CD28

<400> 105

atgaagtgca agttcctggg ctcattcttc ctgctgttca gcctgagcgg caagggcgcc 60

gactgcagag acaacgagac aatctggggc gtgctgggcc acggcatcac cctgaacatc 120

cccaacttcc agatgaccga cgacatcgac gaagtgcgct gggtgcgaag aggcacactg 180

gtggccgagt tcaagagaaa gaagccccca ttcctgatca gcgagacata cgaggtgctg 240

gccaacggca gcctgaagat caagaaaccc atgatgagaa acgacagcgg cacctacaac 300

gtgatggtgt acggcaccaa cggcatgacc agactggaaa aggacctgga cgtgcggatc 360

ctggaaaggg tgtccaagcc catgatccac tgggagtgcc ccaacaccac cctgacctgt 420

gctgtgctgc agggcaccga cttcgagctg aagctgtacc agggcgagac actgctgaac 480

tccctgcccc agaaaaacat gagctaccag tggaccaacc tgaacgcccc cttcaagtgc 540

gaggccatca accccgtgtc caaagaaagc aagatggaag tcgtgaactg ccccgagaag 600

ggcctgagct tctacgtgac agtgggcgtg ggagctggcg gactgctgct ggtgctgctg 660

gtggccctgt tcatcttctg catctgcaac agcagacgga acagaggcgg ccagagcgac 720

tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc ctgaccagaa agccctacca gccttacgcc 780

cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 810

<210> 106

<211> 270

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD2tm-CD28

<400> 106

Met Lys Cys Lys Phe Leu Gly Ser Phe Phe Leu Leu Phe Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Lys Gly Ala Asp Cys Arg Asp Asn Glu Thr Ile Trp Gly Val Leu

20 25 30

Gly His Gly Ile Thr Leu Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp

35 40 45

Ile Asp Glu Val Arg Trp Val Arg Arg Gly Thr Leu Val Ala Glu Phe

50 55 60

Lys Arg Lys Lys Pro Pro Phe Leu Ile Ser Glu Thr Tyr Glu Val Leu

65 70 75 80

Ala Asn Gly Ser Leu Lys Ile Lys Lys Pro Met Met Arg Asn Asp Ser

85 90 95

Gly Thr Tyr Asn Val Met Val Tyr Gly Thr Asn Gly Met Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Lys Asp Leu Asp Val Arg Ile Leu Glu Arg Val Ser Lys Pro Met

115 120 125

Ile His Trp Glu Cys Pro Asn Thr Thr Leu Thr Cys Ala Val Leu Gln

130 135 140

Gly Thr Asp Phe Glu Leu Lys Leu Tyr Gln Gly Glu Thr Leu Leu Asn

145 150 155 160

Ser Leu Pro Gln Lys Asn Met Ser Tyr Gln Trp Thr Asn Leu Asn Ala

165 170 175

Pro Phe Lys Cys Glu Ala Ile Asn Pro Val Ser Lys Glu Ser Lys Met

180 185 190

Glu Val Val Asn Cys Pro Glu Lys Gly Leu Ser Phe Tyr Val Thr Val

195 200 205

Gly Val Gly Ala Gly Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Phe

210 215 220

Ile Phe Cys Ile Cys Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp

225 230 235 240

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr

245 250 255

Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

260 265 270

<210> 107

<211> 813

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD2-CD28tm

<400> 107

atgaagtgca agttcctggg ctcattcttc ctgctgttca gcctgagcgg caagggcgcc 60

gactgcagag acaacgagac aatctggggc gtgctgggcc acggcatcac cctgaacatc 120

cccaacttcc agatgaccga cgacatcgac gaagtgcgct gggtgcgaag aggcacactg 180

gtggccgagt tcaagagaaa gaagccccca ttcctgatca gcgagacata cgaggtgctg 240

gccaacggca gcctgaagat caagaaaccc atgatgagaa acgacagcgg cacctacaac 300

gtgatggtgt acggcaccaa cggcatgacc agactggaaa aggacctgga cgtgcggatc 360

ctggaaaggg tgtccaagcc catgatccac tgggagtgcc ccaacaccac cctgacctgt 420

gctgtgctgc agggcaccga cttcgagctg aagctgtacc agggcgagac actgctgaac 480

tccctgcccc agaaaaacat gagctaccag tggaccaacc tgaacgcccc cttcaagtgc 540

gaggccatca accccgtgtc caaagaaagc aagatggaag tcgtgaactg ccccgagaag 600

ggcctgagct tctgggccct ggtggtggtg gccggcgtgc tgttttgtta cggcctgctc 660

gtgaccgtgg ccctgtgcgt gatctggacc aacagcagaa gaaacagagg cggccagagc 720

gactacatga acatgacccc cagaaggcct ggcctgacca gaaagcccta ccagccttac 780

gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga ccc 813

<210> 108

<211> 271

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD2-CD28tm

<400> 108

Met Lys Cys Lys Phe Leu Gly Ser Phe Phe Leu Leu Phe Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Lys Gly Ala Asp Cys Arg Asp Asn Glu Thr Ile Trp Gly Val Leu

20 25 30

Gly His Gly Ile Thr Leu Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp

35 40 45

Ile Asp Glu Val Arg Trp Val Arg Arg Gly Thr Leu Val Ala Glu Phe

50 55 60

Lys Arg Lys Lys Pro Pro Phe Leu Ile Ser Glu Thr Tyr Glu Val Leu

65 70 75 80

Ala Asn Gly Ser Leu Lys Ile Lys Lys Pro Met Met Arg Asn Asp Ser

85 90 95

Gly Thr Tyr Asn Val Met Val Tyr Gly Thr Asn Gly Met Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Lys Asp Leu Asp Val Arg Ile Leu Glu Arg Val Ser Lys Pro Met

115 120 125

Ile His Trp Glu Cys Pro Asn Thr Thr Leu Thr Cys Ala Val Leu Gln

130 135 140

Gly Thr Asp Phe Glu Leu Lys Leu Tyr Gln Gly Glu Thr Leu Leu Asn

145 150 155 160

Ser Leu Pro Gln Lys Asn Met Ser Tyr Gln Trp Thr Asn Leu Asn Ala

165 170 175

Pro Phe Lys Cys Glu Ala Ile Asn Pro Val Ser Lys Glu Ser Lys Met

180 185 190

Glu Val Val Asn Cys Pro Glu Lys Gly Leu Ser Phe Trp Ala Leu Val

195 200 205

Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala

210 215 220

Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser

225 230 235 240

Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro

245 250 255

Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

260 265 270

<210> 109

<211> 840

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD2-CD28Cys

<400> 109

atgaagtgca agttcctggg ctcattcttc ctgctgttca gcctgagcgg caagggcgcc 60

gactgcagag acaacgagac aatctggggc gtgctgggcc acggcatcac cctgaacatc 120

cccaacttcc agatgaccga cgacatcgac gaagtgcgct gggtgcgaag aggcacactg 180

gtggccgagt tcaagagaaa gaagccccca ttcctgatca gcgagacata cgaggtgctg 240

gccaacggca gcctgaagat caagaaaccc atgatgagaa acgacagcgg cacctacaac 300

gtgatggtgt acggcaccaa cggcatgacc agactggaaa aggacctgga cgtgcggatc 360

ctggaaaggg tgtccaagcc catgatccac tgggagtgcc ccaacaccac cctgacctgt 420

gctgtgctgc agggcaccga cttcgagctg aagctgtacc agggcgagac actgctgaac 480

tccctgcccc agaaaaacat gagctaccag tggaccaacc tgaacgcccc cttcaagtgc 540

gaggccatca accccgtgtc caaagaaagc aagatggaag tcgtgaactg ccccgagaag 600

ggcctgagct gccacaccca gagcagcccc aagctgttct gggccctggt ggtggtggcc 660

ggcgtgctgt tttgttacgg cctgctcgtg accgtggccc tgtgcgtgat ctggaccaac 720

agcagaagaa acagaggcgg ccagagcgac tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc 780

ctgaccagaa agccctacca gccttacgcc cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 840

<210> 110

<211> 280

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD2-CD28Cys

<400> 110

Met Lys Cys Lys Phe Leu Gly Ser Phe Phe Leu Leu Phe Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Lys Gly Ala Asp Cys Arg Asp Asn Glu Thr Ile Trp Gly Val Leu

20 25 30

Gly His Gly Ile Thr Leu Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp

35 40 45

Ile Asp Glu Val Arg Trp Val Arg Arg Gly Thr Leu Val Ala Glu Phe

50 55 60

Lys Arg Lys Lys Pro Pro Phe Leu Ile Ser Glu Thr Tyr Glu Val Leu

65 70 75 80

Ala Asn Gly Ser Leu Lys Ile Lys Lys Pro Met Met Arg Asn Asp Ser

85 90 95

Gly Thr Tyr Asn Val Met Val Tyr Gly Thr Asn Gly Met Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Lys Asp Leu Asp Val Arg Ile Leu Glu Arg Val Ser Lys Pro Met

115 120 125

Ile His Trp Glu Cys Pro Asn Thr Thr Leu Thr Cys Ala Val Leu Gln

130 135 140

Gly Thr Asp Phe Glu Leu Lys Leu Tyr Gln Gly Glu Thr Leu Leu Asn

145 150 155 160

Ser Leu Pro Gln Lys Asn Met Ser Tyr Gln Trp Thr Asn Leu Asn Ala

165 170 175

Pro Phe Lys Cys Glu Ala Ile Asn Pro Val Ser Lys Glu Ser Lys Met

180 185 190

Glu Val Val Asn Cys Pro Glu Lys Gly Leu Ser Cys His Thr Gln Ser

195 200 205

Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe

210 215 220

Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn

225 230 235 240

Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

245 250 255

Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala

260 265 270

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

275 280

<210> 111

<211> 861

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD2-CD28Cys-41BBic

<400> 111

atgaagtgca agttcctggg ctcattcttc ctgctgttca gcctgagcgg caagggcgcc 60

gactgcagag acaacgagac aatctggggc gtgctgggcc acggcatcac cctgaacatc 120

cccaacttcc agatgaccga cgacatcgac gaagtgcgct gggtgcgaag aggcacactg 180

gtggccgagt tcaagagaaa gaagccccca ttcctgatca gcgagacata cgaggtgctg 240

gccaacggca gcctgaagat caagaaaccc atgatgagaa acgacagcgg cacctacaac 300

gtgatggtgt acggcaccaa cggcatgacc agactggaaa aggacctgga cgtgcggatc 360

ctggaaaggg tgtccaagcc catgatccac tgggagtgcc ccaacaccac cctgacctgt 420

gctgtgctgc agggcaccga cttcgagctg aagctgtacc agggcgagac actgctgaac 480

tccctgcccc agaaaaacat gagctaccag tggaccaacc tgaacgcccc cttcaagtgc 540

gaggccatca accccgtgtc caaagaaagc aagatggaag tcgtgaactg ccccgagaag 600

ggcctgagct gccacaccca gagcagcccc aagctgttct gggccctggt ggtggtggcc 660

ggcgtgctgt tttgttacgg cctgctcgtg accgtggccc tgtgcgtgat ctggaccagc 720

gtgctgaagt ggatcagaaa gaagttcccc cacatcttca agcagccctt caagaaaacc 780

accggcgctg cccaggaaga ggacgcctgc agctgtagat gccctcagga agaagaaggc 840

ggcggaggcg gctacgagct g 861

<210> 112

<211> 287

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD2-CD28Cys-41BBic

<400> 112

Met Lys Cys Lys Phe Leu Gly Ser Phe Phe Leu Leu Phe Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Lys Gly Ala Asp Cys Arg Asp Asn Glu Thr Ile Trp Gly Val Leu

20 25 30

Gly His Gly Ile Thr Leu Asn Ile Pro Asn Phe Gln Met Thr Asp Asp

35 40 45

Ile Asp Glu Val Arg Trp Val Arg Arg Gly Thr Leu Val Ala Glu Phe

50 55 60

Lys Arg Lys Lys Pro Pro Phe Leu Ile Ser Glu Thr Tyr Glu Val Leu

65 70 75 80

Ala Asn Gly Ser Leu Lys Ile Lys Lys Pro Met Met Arg Asn Asp Ser

85 90 95

Gly Thr Tyr Asn Val Met Val Tyr Gly Thr Asn Gly Met Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Lys Asp Leu Asp Val Arg Ile Leu Glu Arg Val Ser Lys Pro Met

115 120 125

Ile His Trp Glu Cys Pro Asn Thr Thr Leu Thr Cys Ala Val Leu Gln

130 135 140

Gly Thr Asp Phe Glu Leu Lys Leu Tyr Gln Gly Glu Thr Leu Leu Asn

145 150 155 160

Ser Leu Pro Gln Lys Asn Met Ser Tyr Gln Trp Thr Asn Leu Asn Ala

165 170 175

Pro Phe Lys Cys Glu Ala Ile Asn Pro Val Ser Lys Glu Ser Lys Met

180 185 190

Glu Val Val Asn Cys Pro Glu Lys Gly Leu Ser Cys His Thr Gln Ser

195 200 205

Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe

210 215 220

Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Ser

225 230 235 240

Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro

245 250 255

Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys

260 265 270

Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu

275 280 285

<210> 113

<211> 1080

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD200R-3aas-CD28Cys tm ic-41BB

<400> 113

atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60

gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120

acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180

agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240

agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300

aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360

ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420

aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480

agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540

ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600

tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660

aaccagagcc tgagcatcga gctgagcaga ggcggaaacc agtcctgcca cacccagagc 720

agccccaagc tgttctgggc cctggtggtg gtggccggcg tgctgttttg ttacggcctg 780

ctcgtgaccg tggccctgtg cgtgatctgg accaacagca gaagaaacag aggcggccag 840

agcgactaca tgaacatgac ccccagaagg cctggcctga ccagaaagcc ctaccagcct 900

tacgcccctg ccagagactt cgccgcctac agacctagcg tgctgaagtg gatcagaaag 960

aagttccccc acatcttcaa gcagcccttc aagaaaacca ccggcgctgc ccaggaagag 1020

gacgcctgca gctgtagatg ccctcaggaa gaagaaggcg gcggaggcgg ctacgagctg 1080

<210> 114

<211> 360

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD200R-3aas-CD28Cys tm ic-41BB

<400> 114

Met Phe Cys Phe Trp Arg Thr Ser Ala Leu Ala Val Leu Leu Ile Trp

1 5 10 15

Gly Val Phe Val Ala Gly Ser Ser Cys Thr Asp Lys Asn Gln Thr Thr

20 25 30

Gln Asn Asn Ser Ser Ser Pro Leu Thr Gln Val Asn Thr Thr Val Ser

35 40 45

Val Gln Ile Gly Thr Lys Ala Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ile Pro Leu

50 55 60

Thr Lys Ala Val Leu Ile Thr Trp Ile Ile Lys Leu Arg Gly Leu Pro

65 70 75 80

Ser Cys Thr Ile Ala Tyr Lys Val Asp Thr Lys Thr Asn Glu Thr Ser

85 90 95

Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro Asp His Ser Pro

100 105 110

Glu Leu Gln Ile Ser Ala Val Thr Leu Gln His Glu Gly Thr Tyr Thr

115 120 125

Cys Glu Thr Val Thr Pro Glu Gly Asn Phe Glu Lys Asn Tyr Asp Leu

130 135 140

Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Pro Glu Lys Asn Arg

145 150 155 160

Ser Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser

165 170 175

Trp Ser Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Thr Ser Glu Ser His Ser Asn

180 185 190

Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu Gln Asn Asn Val

195 200 205

Ser Asp Val Ser Cys Ile Val Ser His Leu Thr Gly Asn Gln Ser Leu

210 215 220

Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gln Ser Cys His Thr Gln Ser

225 230 235 240

Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe

245 250 255

Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn

260 265 270

Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

275 280 285

Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala

290 295 300

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys

305 310 315 320

Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala

325 330 335

Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu

340 345 350

Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu

355 360

<210> 115

<211> 966

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD200R-CD28Cys tm ic-41BB

<400> 115

atgttctgct tctggcggac aagcgccctg gccgtgctgc tgatctgggg agtgtttgtg 60

gccggcagca gctgcaccga caagaaccag accacccaga acaacagcag cagccccctg 120

acccaagtga acaccaccgt gtccgtgcag atcggcacca aggccctgct gtgctgtttc 180

agcatccctc tgaccaaggc tgtgctgatc acctggatca tcaagctgag aggcctgccc 240

agctgcacaa tcgcctacaa ggtggacacc aagaccaacg agacaagctg cctgggcaga 300

aacatcacct gggccagcac cccagaccac agccctgagc tgcagatcag cgccgtgaca 360

ctgcagcacg agggcaccta cacatgcgag acagtgaccc ccgagggcaa cttcgagaag 420

aactacgatc tgcaggtgct ggtgcccccc gaagtgacct acttccccga gaagaataga 480

agcgccgtgt gcgaggccat ggctggcaaa cctgccgccc agatctcttg gagccctgac 540

ggcgactgtg tgaccaccag cgagagccac agcaacggca cagtgaccgt gcggagcacc 600

tgtcactggg agcagaacaa cgtgtccgac gtgtcctgca tcgtgtccca cctgaccggc 660

aaccagagcc tgagcatcga gctgagcaga ggcggaaacc agtccctgag gccctgccac 720

acccagagca gccccaagct gttctgggcc ctggtggtgg tggccggcgt gctgttttgt 780

tacggcctgc tcgtgaccgt ggccctgtgc gtgatctgga ccagcgtgct gaagtggatc 840

agaaagaagt tcccccacat cttcaagcag cccttcaaga aaaccaccgg cgctgcccag 900

gaagaggacg cctgcagctg tagatgccct caggaagaag aaggcggcgg aggcggctac 960

gagctg 966

<210> 116

<211> 322

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muCD200R-CD28Cys tm ic-41BB

<400> 116

Met Phe Cys Phe Trp Arg Thr Ser Ala Leu Ala Val Leu Leu Ile Trp

1 5 10 15

Gly Val Phe Val Ala Gly Ser Ser Cys Thr Asp Lys Asn Gln Thr Thr

20 25 30

Gln Asn Asn Ser Ser Ser Pro Leu Thr Gln Val Asn Thr Thr Val Ser

35 40 45

Val Gln Ile Gly Thr Lys Ala Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ile Pro Leu

50 55 60

Thr Lys Ala Val Leu Ile Thr Trp Ile Ile Lys Leu Arg Gly Leu Pro

65 70 75 80

Ser Cys Thr Ile Ala Tyr Lys Val Asp Thr Lys Thr Asn Glu Thr Ser

85 90 95

Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro Asp His Ser Pro

100 105 110

Glu Leu Gln Ile Ser Ala Val Thr Leu Gln His Glu Gly Thr Tyr Thr

115 120 125

Cys Glu Thr Val Thr Pro Glu Gly Asn Phe Glu Lys Asn Tyr Asp Leu

130 135 140

Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Pro Glu Lys Asn Arg

145 150 155 160

Ser Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser

165 170 175

Trp Ser Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Thr Ser Glu Ser His Ser Asn

180 185 190

Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu Gln Asn Asn Val

195 200 205

Ser Asp Val Ser Cys Ile Val Ser His Leu Thr Gly Asn Gln Ser Leu

210 215 220

Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gln Ser Leu Arg Pro Cys His

225 230 235 240

Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly

245 250 255

Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile

260 265 270

Trp Thr Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe

275 280 285

Lys Gln Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala

290 295 300

Cys Ser Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr

305 310 315 320

Glu Leu

<210> 117

<211> 681

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muFas tm-CD28

<400> 117

atgctgtgga tctgggccgt gctgcctctg gtgctggctg gatcacagct gagagtgcac 60

acccagggca ccaacagcat cagcgagagc ctgaagctga gaagaagagt gcgcgagaca 120

gacaagaact gcagcgaggg cctgtaccag ggcggaccct tctgctgtca gccttgccag 180

cccggcaaga aaaaggtgga agattgcaag atgaacggcg gcacccctac ctgcgcccct 240

tgtacagagg gcaaagagta catggacaag aaccactacg ccgacaagtg cagacggtgc 300

accctgtgcg acgaggaaca cggcctggaa gtggaaacaa actgcaccct gacccagaac 360

accaagtgca agtgcaaacc cgacttctac tgcgacagcc ccggctgcga gcactgcgtc 420

agatgtgcct cttgcgagca cggcaccctg gaaccttgta ccgccaccag caacaccaac 480

tgccggaagc agagccccag aaacagactg tggctgctga ccatcctggt gctgctgatc 540

cccctggtgt tcatctacaa cagcagaaga aacagaggcg gccagagcga ctacatgaac 600

atgaccccca gaaggcctgg cctgaccaga aagccctacc agccttacgc ccctgccaga 660

gacttcgccg cctacagacc t 681

<210> 118

<211> 227

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muFas tm-CD28

<400> 118

Met Leu Trp Ile Trp Ala Val Leu Pro Leu Val Leu Ala Gly Ser Gln

1 5 10 15

Leu Arg Val His Thr Gln Gly Thr Asn Ser Ile Ser Glu Ser Leu Lys

20 25 30

Leu Arg Arg Arg Val Arg Glu Thr Asp Lys Asn Cys Ser Glu Gly Leu

35 40 45

Tyr Gln Gly Gly Pro Phe Cys Cys Gln Pro Cys Gln Pro Gly Lys Lys

50 55 60

Lys Val Glu Asp Cys Lys Met Asn Gly Gly Thr Pro Thr Cys Ala Pro

65 70 75 80

Cys Thr Glu Gly Lys Glu Tyr Met Asp Lys Asn His Tyr Ala Asp Lys

85 90 95

Cys Arg Arg Cys Thr Leu Cys Asp Glu Glu His Gly Leu Glu Val Glu

100 105 110

Thr Asn Cys Thr Leu Thr Gln Asn Thr Lys Cys Lys Cys Lys Pro Asp

115 120 125

Phe Tyr Cys Asp Ser Pro Gly Cys Glu His Cys Val Arg Cys Ala Ser

130 135 140

Cys Glu His Gly Thr Leu Glu Pro Cys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asn

145 150 155 160

Cys Arg Lys Gln Ser Pro Arg Asn Arg Leu Trp Leu Leu Thr Ile Leu

165 170 175

Val Leu Leu Ile Pro Leu Val Phe Ile Tyr Asn Ser Arg Arg Asn Arg

180 185 190

Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu

195 200 205

Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala

210 215 220

Tyr Arg Pro

225

<210> 119

<211> 711

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muFas-CD28tm

<400> 119

atgctgtgga tctgggccgt gctgcctctg gtgctggctg gatcacagct gagagtgcac 60

acccagggca ccaacagcat cagcgagagc ctgaagctga gaagaagagt gcgcgagaca 120

gacaagaact gcagcgaggg cctgtaccag ggcggaccct tctgctgtca gccttgccag 180

cccggcaaga aaaaggtgga agattgcaag atgaacggcg gcacccctac ctgcgcccct 240

tgtacagagg gcaaagagta catggacaag aaccactacg ccgacaagtg cagacggtgc 300

accctgtgcg acgaggaaca cggcctggaa gtggaaacaa actgcaccct gacccagaac 360

accaagtgca agtgcaaacc cgacttctac tgcgacagcc ccggctgcga gcactgcgtc 420

agatgtgcct cttgcgagca cggcaccctg gaaccttgta ccgccaccag caacaccaac 480

tgccggaagc agagccccag aaacagattc tgggccctgg tggtggtggc cggcgtgctg 540

ttttgttacg gcctgctcgt gaccgtggcc ctgtgcgtga tctggaccaa cagcagaaga 600

aacagaggcg gccagagcga ctacatgaac atgaccccca gaaggcctgg cctgaccaga 660

aagccctacc agccttacgc ccctgccaga gacttcgccg cctacagacc t 711

<210> 120

<211> 237

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muFas-CD28tm

<400> 120

Met Leu Trp Ile Trp Ala Val Leu Pro Leu Val Leu Ala Gly Ser Gln

1 5 10 15

Leu Arg Val His Thr Gln Gly Thr Asn Ser Ile Ser Glu Ser Leu Lys

20 25 30

Leu Arg Arg Arg Val Arg Glu Thr Asp Lys Asn Cys Ser Glu Gly Leu

35 40 45

Tyr Gln Gly Gly Pro Phe Cys Cys Gln Pro Cys Gln Pro Gly Lys Lys

50 55 60

Lys Val Glu Asp Cys Lys Met Asn Gly Gly Thr Pro Thr Cys Ala Pro

65 70 75 80

Cys Thr Glu Gly Lys Glu Tyr Met Asp Lys Asn His Tyr Ala Asp Lys

85 90 95

Cys Arg Arg Cys Thr Leu Cys Asp Glu Glu His Gly Leu Glu Val Glu

100 105 110

Thr Asn Cys Thr Leu Thr Gln Asn Thr Lys Cys Lys Cys Lys Pro Asp

115 120 125

Phe Tyr Cys Asp Ser Pro Gly Cys Glu His Cys Val Arg Cys Ala Ser

130 135 140

Cys Glu His Gly Thr Leu Glu Pro Cys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asn

145 150 155 160

Cys Arg Lys Gln Ser Pro Arg Asn Arg Phe Trp Ala Leu Val Val Val

165 170 175

Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys

180 185 190

Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr

195 200 205

Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln

210 215 220

Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

225 230 235

<210> 121

<211> 738

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muFas-CD28Cys

<400> 121

atgctgtgga tctgggccgt gctgcctctg gtgctggctg gatcacagct gagagtgcac 60

acccagggca ccaacagcat cagcgagagc ctgaagctga gaagaagagt gcgcgagaca 120

gacaagaact gcagcgaggg cctgtaccag ggcggaccct tctgctgtca gccttgccag 180

cccggcaaga aaaaggtgga agattgcaag atgaacggcg gcacccctac ctgcgcccct 240

tgtacagagg gcaaagagta catggacaag aaccactacg ccgacaagtg cagacggtgc 300

accctgtgcg acgaggaaca cggcctggaa gtggaaacaa actgcaccct gacccagaac 360

accaagtgca agtgcaaacc cgacttctac tgcgacagcc ccggctgcga gcactgcgtc 420

agatgtgcct cttgcgagca cggcaccctg gaaccttgta ccgccaccag caacaccaac 480

tgccggaagc agagccccag aaacagatgc cacacccaga gcagccccaa gctgttctgg 540

gccctggtgg tggtggccgg cgtgctgttt tgttacggcc tgctcgtgac cgtggccctg 600

tgcgtgatct ggaccaacag cagaagaaac agaggcggcc agagcgacta catgaacatg 660

acccccagaa ggcctggcct gaccagaaag ccctaccagc cttacgcccc tgccagagac 720

ttcgccgcct acagacct 738

<210> 122

<211> 246

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muFas-CD28Cys

<400> 122

Met Leu Trp Ile Trp Ala Val Leu Pro Leu Val Leu Ala Gly Ser Gln

1 5 10 15

Leu Arg Val His Thr Gln Gly Thr Asn Ser Ile Ser Glu Ser Leu Lys

20 25 30

Leu Arg Arg Arg Val Arg Glu Thr Asp Lys Asn Cys Ser Glu Gly Leu

35 40 45

Tyr Gln Gly Gly Pro Phe Cys Cys Gln Pro Cys Gln Pro Gly Lys Lys

50 55 60

Lys Val Glu Asp Cys Lys Met Asn Gly Gly Thr Pro Thr Cys Ala Pro

65 70 75 80

Cys Thr Glu Gly Lys Glu Tyr Met Asp Lys Asn His Tyr Ala Asp Lys

85 90 95

Cys Arg Arg Cys Thr Leu Cys Asp Glu Glu His Gly Leu Glu Val Glu

100 105 110

Thr Asn Cys Thr Leu Thr Gln Asn Thr Lys Cys Lys Cys Lys Pro Asp

115 120 125

Phe Tyr Cys Asp Ser Pro Gly Cys Glu His Cys Val Arg Cys Ala Ser

130 135 140

Cys Glu His Gly Thr Leu Glu Pro Cys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asn

145 150 155 160

Cys Arg Lys Gln Ser Pro Arg Asn Arg Cys His Thr Gln Ser Ser Pro

165 170 175

Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr

180 185 190

Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg

195 200 205

Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

210 215 220

Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp

225 230 235 240

Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

245

<210> 123

<211> 711

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muFas-9aas-CD28Cys

<400> 123

atgctgtgga tctgggccgt gctgcctctg gtgctggctg gatcacagct gagagtgcac 60

acccagggca ccaacagcat cagcgagagc ctgaagctga gaagaagagt gcgcgagaca 120

gacaagaact gcagcgaggg cctgtaccag ggcggaccct tctgctgtca gccttgccag 180

cccggcaaga aaaaggtgga agattgcaag atgaacggcg gcacccctac ctgcgcccct 240

tgtacagagg gcaaagagta catggacaag aaccactacg ccgacaagtg cagacggtgc 300

accctgtgcg acgaggaaca cggcctggaa gtggaaacaa actgcaccct gacccagaac 360

accaagtgca agtgcaaacc cgacttctac tgcgacagcc ccggctgcga gcactgcgtc 420

agatgtgcct cttgcgagca cggcaccctg gaaccttgta ccgccaccag caacaccaac 480

tgccacaccc agagcagccc caagctgttc tgggccctgg tggtggtggc cggcgtgctg 540

ttttgttacg gcctgctcgt gaccgtggcc ctgtgcgtga tctggaccaa cagcagaaga 600

aacagaggcg gccagagcga ctacatgaac atgaccccca gaaggcctgg cctgaccaga 660

aagccctacc agccttacgc ccctgccaga gacttcgccg cctacagacc t 711

<210> 124

<211> 237

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muFas-9aas-CD28Cys

<400> 124

Met Leu Trp Ile Trp Ala Val Leu Pro Leu Val Leu Ala Gly Ser Gln

1 5 10 15

Leu Arg Val His Thr Gln Gly Thr Asn Ser Ile Ser Glu Ser Leu Lys

20 25 30

Leu Arg Arg Arg Val Arg Glu Thr Asp Lys Asn Cys Ser Glu Gly Leu

35 40 45

Tyr Gln Gly Gly Pro Phe Cys Cys Gln Pro Cys Gln Pro Gly Lys Lys

50 55 60

Lys Val Glu Asp Cys Lys Met Asn Gly Gly Thr Pro Thr Cys Ala Pro

65 70 75 80

Cys Thr Glu Gly Lys Glu Tyr Met Asp Lys Asn His Tyr Ala Asp Lys

85 90 95

Cys Arg Arg Cys Thr Leu Cys Asp Glu Glu His Gly Leu Glu Val Glu

100 105 110

Thr Asn Cys Thr Leu Thr Gln Asn Thr Lys Cys Lys Cys Lys Pro Asp

115 120 125

Phe Tyr Cys Asp Ser Pro Gly Cys Glu His Cys Val Arg Cys Ala Ser

130 135 140

Cys Glu His Gly Thr Leu Glu Pro Cys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asn

145 150 155 160

Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val

165 170 175

Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys

180 185 190

Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr

195 200 205

Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln

210 215 220

Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

225 230 235

<210> 125

<211> 693

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muPD1tm-CD28

<400> 125

atgtgggtgc gacaggtgcc ctggtctttc acctgggctg tgctgcagct gagctggcag 60

tctggctggc tgctggaagt gcctaacggc ccttggagaa gcctgacctt ctaccccgct 120

tggctgaccg tgtctgaggg cgccaacgcc accttcacct gtagcctgag caattggagc 180

gaggacctga tgctgaactg gaacagactg agccccagca accagaccga gaagcaggcc 240

gccttctgca acggcctgtc tcagcctgtg caggacgcca gattccagat catccagctg 300

cccaacagac acgacttcca catgaacatc ctggacacca gaagaaacga cagcggcatc 360

tacctgtgcg gcgccatcag cctgcacccc aaggccaaga tcgaggaatc tcctggcgcc 420

gagctggtcg tgaccgagag aatcctggaa acctccacca gataccccag ccccagccct 480

aagcccgagg gcagatttca gggcatggtc atcggcatca tgagcgccct cgtgggcatc 540

ccagtgttgc tgctgctggc ctgggccctg aacagcagaa gaaacagagg cggccagagc 600

gactacatga acatgacccc cagaaggcct ggcctgacca gaaagcccta ccagccttac 660

gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga cct 693

<210> 126

<211> 231

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muPD1tm-CD28

<400> 126

Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp

20 25 30

Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met

50 55 60

Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala

65 70 75 80

Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln

85 90 95

Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp

100 105 110

Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val

130 135 140

Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala

165 170 175

Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Asn Ser

180 185 190

Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

195 200 205

Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg

210 215 220

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

225 230

<210> 127

<211> 711

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muPD1-CD28tm

<400> 127

atgtgggtgc gacaggtgcc ctggtctttc acctgggctg tgctgcagct gagctggcag 60

tctggctggc tgctggaagt gcctaacggc ccttggagaa gcctgacctt ctaccccgct 120

tggctgaccg tgtctgaggg cgccaacgcc accttcacct gtagcctgag caattggagc 180

gaggacctga tgctgaactg gaacagactg agccccagca accagaccga gaagcaggcc 240

gccttctgca acggcctgtc tcagcctgtg caggacgcca gattccagat catccagctg 300

cccaacagac acgacttcca catgaacatc ctggacacca gaagaaacga cagcggcatc 360

tacctgtgcg gcgccatcag cctgcacccc aaggccaaga tcgaggaatc tcctggcgcc 420

gagctggtcg tgaccgagag aatcctggaa acctccacca gataccccag ccccagccct 480

aagcccgagg gcagatttca gggcatgttc tgggccctgg tggtggtggc cggcgtgctg 540

ttttgttacg gcctgctcgt gaccgtggcc ctgtgcgtga tctggaccaa cagcagaaga 600

aacagaggcg gccagagcga ctacatgaac atgaccccca gaaggcctgg cctgaccaga 660

aagccctacc agccttacgc ccctgccaga gacttcgccg cctacagacc t 711

<210> 128

<211> 237

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muPD1-CD28tm

<400> 128

Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp

20 25 30

Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met

50 55 60

Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala

65 70 75 80

Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln

85 90 95

Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp

100 105 110

Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val

130 135 140

Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Phe Trp Ala Leu Val Val Val

165 170 175

Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys

180 185 190

Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr

195 200 205

Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln

210 215 220

Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

225 230 235

<210> 129

<211> 738

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muPD1-CD28Cys

<400> 129

atgtgggtgc gacaggtgcc ctggtctttc acctgggctg tgctgcagct gagctggcag 60

tctggctggc tgctggaagt gcctaacggc ccttggagaa gcctgacctt ctaccccgct 120

tggctgaccg tgtctgaggg cgccaacgcc accttcacct gtagcctgag caattggagc 180

gaggacctga tgctgaactg gaacagactg agccccagca accagaccga gaagcaggcc 240

gccttctgca acggcctgtc tcagcctgtg caggacgcca gattccagat catccagctg 300

cccaacagac acgacttcca catgaacatc ctggacacca gaagaaacga cagcggcatc 360

tacctgtgcg gcgccatcag cctgcacccc aaggccaaga tcgaggaatc tcctggcgcc 420

gagctggtcg tgaccgagag aatcctggaa acctccacca gataccccag ccccagccct 480

aagcccgagg gcagatttca gggcatgtgc cacacccaga gcagccccaa gctgttctgg 540

gctctggtgg tggtggccgg cgtgctgttt tgttacggcc tgctcgtgac cgtggccctg 600

tgcgtgatct ggaccaacag cagacggaac agaggcggcc agagcgacta catgaatatg 660

acccccagaa ggcctggcct gaccagaaag ccctaccagc cttacgcccc tgccagagac 720

ttcgccgcct acagacct 738

<210> 130

<211> 246

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muPD1-CD28Cys

<400> 130

Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp

20 25 30

Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met

50 55 60

Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala

65 70 75 80

Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln

85 90 95

Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp

100 105 110

Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val

130 135 140

Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Cys His Thr Gln Ser Ser Pro

165 170 175

Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr

180 185 190

Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg

195 200 205

Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

210 215 220

Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp

225 230 235 240

Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

245

<210> 131

<211> 711

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muPD1-9aas-CD28Cys

<400> 131

atgtgggtgc gacaggtgcc ctggtctttc acctgggctg tgctgcagct gagctggcag 60

tctggctggc tgctggaagt gcctaacggc ccttggagaa gcctgacctt ctaccccgct 120

tggctgaccg tgtctgaggg cgccaacgcc accttcacct gtagcctgag caattggagc 180

gaggacctga tgctgaactg gaacagactg agccccagca accagaccga gaagcaggcc 240

gccttctgca acggcctgtc tcagcctgtg caggacgcca gattccagat catccagctg 300

cccaacagac acgacttcca catgaacatc ctggacacca gaagaaacga cagcggcatc 360

tacctgtgcg gcgccatcag cctgcacccc aaggccaaga tcgaggaatc tcctggcgcc 420

gagctggtcg tgaccgagag aatcctggaa acctccacca gataccccag ccccagccct 480

tgccacaccc agagcagccc caagctgttc tgggctctgg tggtggtggc cggcgtgctg 540

ttttgttacg gcctgctcgt gaccgtggcc ctgtgcgtga tctggaccaa cagcagacgg 600

aacagaggcg gccagagcga ctacatgaat atgaccccca gaaggcctgg cctgaccaga 660

aagccctacc agccttacgc ccctgccaga gacttcgccg cctacagacc t 711

<210> 132

<211> 237

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muPD1-9aas-CD28Cys

<400> 132

Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp

20 25 30

Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met

50 55 60

Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala

65 70 75 80

Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln

85 90 95

Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp

100 105 110

Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val

130 135 140

Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val

165 170 175

Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys

180 185 190

Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr

195 200 205

Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln

210 215 220

Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

225 230 235

<210> 133

<211> 675

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muPD1-21aas-CD28Cys

<400> 133

atgtgggtgc gacaggtgcc ctggtctttc acctgggctg tgctgcagct gagctggcag 60

tctggctggc tgctggaagt gcctaacggc ccttggagaa gcctgacctt ctaccccgct 120

tggctgaccg tgtctgaggg cgccaacgcc accttcacct gtagcctgag caattggagc 180

gaggacctga tgctgaactg gaacagactg agccccagca accagaccga gaagcaggcc 240

gccttctgca acggcctgtc tcagcctgtg caggacgcca gattccagat catccagctg 300

cccaacagac acgacttcca catgaacatc ctggacacca gaagaaacga cagcggcatc 360

tacctgtgcg gcgccatcag cctgcacccc aaggccaaga tcgaggaatc tcctggcgcc 420

gagctggtcg tgaccgagag aatctgccac acccagagca gccccaagct gttctgggct 480

ctggtggtgg tggccggcgt gctgttttgt tacggcctgc tcgtgaccgt ggccctgtgc 540

gtgatctgga ccaacagcag acggaacaga ggcggccaga gcgactacat gaatatgacc 600

cccagaaggc ctggcctgac cagaaagccc taccagcctt acgcccctgc cagagacttc 660

gccgcctaca gacct 675

<210> 134

<211> 225

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muPD1-21aas-CD28Cys

<400> 134

Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp

20 25 30

Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met

50 55 60

Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala

65 70 75 80

Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln

85 90 95

Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp

100 105 110

Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val

130 135 140

Thr Glu Arg Ile Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala

145 150 155 160

Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr

165 170 175

Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly

180 185 190

Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg

195 200 205

Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

210 215 220

Pro

225

<210> 135

<211> 1512

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muLag3tm-CD28

<400> 135

atgagagagg acctgctgct gggctttctg ctgctgggac tgctgtggga ggcccctgtg 60

gtgtcatctg gccctggcaa agaactgccc gtcgtgtggg ctcaggaagg cgctcctgtg 120

catctgccct gcagcctgaa gtcccccaac ctggacccca acttcctgag aagaggcggc 180

gtgatctggc agcaccagcc tgattctggc cagcccacac ctatccctgc cctggatctg 240

caccagggca tgcctagccc tagacagcct gcccctggca gatacaccgt gctgtctgtg 300

gctcctggcg gcctgagaag tggcagacag cctctgcacc ctcacgtgca gctggaagag 360

aggggactgc agaggggcga cttcagcctg tggctgaggc ctgccctgag aacagatgcc 420

ggcgagtacc acgctaccgt gcggctgcct aacagagccc tgagctgctc cctgagactg 480

agagtgggcc aggccagcat gatcgcctct ccatctggcg tgctgaagct gagcgactgg 540

gtgctgctga actgcagctt ctccagaccc gacagacccg tgtccgtgca ctggttccag 600

ggacagaaca gagtgcccgt gtacaacagc cccagacact tcctggccga gacattcctg 660

ctgctgcccc aggtgtcccc tctggactct ggcacatggg gctgcgtgct gacatacagg 720

gacggcttca acgtgtccat cacctacaac ctgaaggtgc tgggcctgga acccgtggct 780

cctctgacag tgtacgccgc cgagggcagc agagtggaac tgccttgtca tctgccaccc 840

ggcgtgggca caccttctct gctgatcgcc aagtggaccc ctccaggcgg aggacctgaa 900

ctgccagtgg ctggcaagag cggcaacttc accctgcacc tggaagcagt gggcctggct 960

caggccggca cctacacctg tagcatccat ctgcagggcc agcagctgaa cgccaccgtg 1020

acactggccg tgatcaccgt gacccccaag agctttggcc tgcctggctc cagaggcaag 1080

ctgctgtgtg aagtgacccc cgccagcggc aaagaaagat tcgtgtggcg gcctctgaac 1140

aacctgagca gatcctgccc aggccccgtg ctggaaatcc aggaagccag actgctggcc 1200

gagcggtggc agtgccagct gtatgaggga cagcgactgc tgggcgccac tgtgtacgct 1260

gctgagtcta gctctggcgc ccacagcgcc agaagaatca gcggcgatct gaagggcggc 1320

cacctggtgc tggtgctgat cctgggcgct ctgagcctgt tcctgctggt ggctggcgct 1380

ttcggcttta acagcagaag aaacagaggc ggccagagcg actacatgaa catgaccccc 1440

agaaggcctg gcctgaccag aaagccctac cagccttacg cccctgccag agacttcgcc 1500

gcctacagac ct 1512

<210> 136

<211> 504

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muLag3tm-CD28

<400> 136

Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp

1 5 10 15

Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser

35 40 45

Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu

65 70 75 80

His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr

85 90 95

Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu

100 105 110

His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe

115 120 125

Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His

130 135 140

Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu

145 150 155 160

Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys

165 170 175

Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg

180 185 190

Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr

195 200 205

Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln

210 215 220

Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg

225 230 235 240

Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu

245 250 255

Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val

260 265 270

Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu

275 280 285

Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala

290 295 300

Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala

305 310 315 320

Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu

325 330 335

Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe

340 345 350

Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala

355 360 365

Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg

370 375 380

Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala

385 390 395 400

Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala

405 410 415

Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg

420 425 430

Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu Val Leu Val Leu Ile Leu

435 440 445

Gly Ala Leu Ser Leu Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Phe Gly Phe Asn

450 455 460

Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

465 470 475 480

Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala

485 490 495

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

500

<210> 137

<211> 1530

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muLag3-CD28tm

<400> 137

atgagagagg acctgctgct gggctttctg ctgctgggac tgctgtggga ggcccctgtg 60

gtgtcatctg gccctggcaa agaactgccc gtcgtgtggg ctcaggaagg cgctcctgtg 120

catctgccct gcagcctgaa gtcccccaac ctggacccca acttcctgag aagaggcggc 180

gtgatctggc agcaccagcc tgattctggc cagcccacac ctatccctgc cctggatctg 240

caccagggca tgcctagccc tagacagcct gcccctggca gatacaccgt gctgtctgtg 300

gctcctggcg gcctgagaag tggcagacag cctctgcacc ctcacgtgca gctggaagag 360

aggggactgc agaggggcga cttcagcctg tggctgaggc ctgccctgag aacagatgcc 420

ggcgagtacc acgctaccgt gcggctgcct aacagagccc tgagctgctc cctgagactg 480

agagtgggcc aggccagcat gatcgcctct ccatctggcg tgctgaagct gagcgactgg 540

gtgctgctga actgcagctt ctccagaccc gacagacccg tgtccgtgca ctggttccag 600

ggacagaaca gagtgcccgt gtacaacagc cccagacact tcctggccga gacattcctg 660

ctgctgcccc aggtgtcccc tctggactct ggcacatggg gctgcgtgct gacatacagg 720

gacggcttca acgtgtccat cacctacaac ctgaaggtgc tgggcctgga acccgtggct 780

cctctgacag tgtacgccgc cgagggcagc agagtggaac tgccttgtca tctgccaccc 840

ggcgtgggca caccttctct gctgatcgcc aagtggaccc ctccaggcgg aggacctgaa 900

ctgccagtgg ctggcaagag cggcaacttc accctgcacc tggaagcagt gggcctggct 960

caggccggca cctacacctg tagcatccat ctgcagggcc agcagctgaa cgccaccgtg 1020

acactggccg tgatcaccgt gacccccaag agctttggcc tgcctggctc cagaggcaag 1080

ctgctgtgtg aagtgacccc cgccagcggc aaagaaagat tcgtgtggcg gcctctgaac 1140

aacctgagca gatcctgccc aggccccgtg ctggaaatcc aggaagccag actgctggcc 1200

gagcggtggc agtgccagct gtatgaggga cagcgactgc tgggcgccac tgtgtacgct 1260

gctgagtcta gctctggcgc ccacagcgcc agaagaatca gcggcgatct gaagggcggc 1320

cacctgttct gggccctggt ggtggtggcc ggcgtgctgt tttgttacgg cctgctcgtg 1380

accgtggccc tgtgcgtgat ctggaccaac agcagaagaa acagaggcgg ccagagcgac 1440

tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc ctgaccagaa agccctacca gccttacgcc 1500

cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 1530

<210> 138

<211> 510

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muLag3-CD28tm

<400> 138

Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp

1 5 10 15

Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser

35 40 45

Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu

65 70 75 80

His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr

85 90 95

Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu

100 105 110

His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe

115 120 125

Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His

130 135 140

Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu

145 150 155 160

Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys

165 170 175

Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg

180 185 190

Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr

195 200 205

Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln

210 215 220

Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg

225 230 235 240

Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu

245 250 255

Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val

260 265 270

Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu

275 280 285

Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala

290 295 300

Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala

305 310 315 320

Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu

325 330 335

Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe

340 345 350

Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala

355 360 365

Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg

370 375 380

Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala

385 390 395 400

Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala

405 410 415

Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg

420 425 430

Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu Phe Trp Ala Leu Val Val

435 440 445

Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu

450 455 460

Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp

465 470 475 480

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr

485 490 495

Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

500 505 510

<210> 139

<211> 1557

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muLag3-CD28Cys

<400> 139

atgagagagg acctgctgct gggctttctg ctgctgggac tgctgtggga ggcccctgtg 60

gtgtcatctg gccctggcaa agaactgccc gtcgtgtggg ctcaggaagg cgctcctgtg 120

catctgccct gcagcctgaa gtcccccaac ctggacccca acttcctgag aagaggcggc 180

gtgatctggc agcaccagcc tgattctggc cagcccacac ctatccctgc cctggatctg 240

caccagggca tgcctagccc tagacagcct gcccctggca gatacaccgt gctgtctgtg 300

gctcctggcg gcctgagaag tggcagacag cctctgcacc ctcacgtgca gctggaagag 360

aggggactgc agaggggcga cttcagcctg tggctgaggc ctgccctgag aacagatgcc 420

ggcgagtacc acgctaccgt gcggctgcct aacagagccc tgagctgctc cctgagactg 480

agagtgggcc aggccagcat gatcgcctct ccatctggcg tgctgaagct gagcgactgg 540

gtgctgctga actgcagctt ctccagaccc gacagacccg tgtccgtgca ctggttccag 600

ggacagaaca gagtgcccgt gtacaacagc cccagacact tcctggccga gacattcctg 660

ctgctgcccc aggtgtcccc tctggactct ggcacatggg gctgcgtgct gacatacagg 720

gacggcttca acgtgtccat cacctacaac ctgaaggtgc tgggcctgga acccgtggct 780

cctctgacag tgtacgccgc cgagggcagc agagtggaac tgccttgtca tctgccaccc 840

ggcgtgggca caccttctct gctgatcgcc aagtggaccc ctccaggcgg aggacctgaa 900

ctgccagtgg ctggcaagag cggcaacttc accctgcacc tggaagcagt gggcctggct 960

caggccggca cctacacctg tagcatccat ctgcagggcc agcagctgaa cgccaccgtg 1020

acactggccg tgatcaccgt gacccccaag agctttggcc tgcctggctc cagaggcaag 1080

ctgctgtgtg aagtgacccc cgccagcggc aaagaaagat tcgtgtggcg gcctctgaac 1140

aacctgagca gatcctgccc aggccccgtg ctggaaatcc aggaagccag actgctggcc 1200

gagcggtggc agtgccagct gtatgaggga cagcgactgc tgggcgccac tgtgtacgct 1260

gctgagtcta gctctggcgc ccacagcgcc agaagaatca gcggcgatct gaagggcggc 1320

cacctgtgcc acacccagag cagccccaag ctgttctggg ccctggtggt ggtggccggc 1380

gtgctgtttt gttacggcct gctcgtgacc gtggccctgt gcgtgatctg gaccaacagc 1440

agaagaaaca gaggcggcca gagcgactac atgaacatga cccccagaag gcctggcctg 1500

accagaaagc cctaccagcc ttacgcccct gccagagact tcgccgccta cagacct 1557

<210> 140

<211> 519

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muLag3-CD28Cys

<400> 140

Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp

1 5 10 15

Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser

35 40 45

Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu

65 70 75 80

His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr

85 90 95

Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu

100 105 110

His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe

115 120 125

Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His

130 135 140

Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu

145 150 155 160

Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys

165 170 175

Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg

180 185 190

Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr

195 200 205

Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln

210 215 220

Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg

225 230 235 240

Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu

245 250 255

Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val

260 265 270

Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu

275 280 285

Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala

290 295 300

Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala

305 310 315 320

Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu

325 330 335

Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe

340 345 350

Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala

355 360 365

Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg

370 375 380

Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala

385 390 395 400

Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala

405 410 415

Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg

420 425 430

Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu Cys His Thr Gln Ser Ser

435 440 445

Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys

450 455 460

Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser

465 470 475 480

Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

485 490 495

Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg

500 505 510

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

515

<210> 141

<211> 1530

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muLag3-9aas-CD28Cys

<400> 141

atgagagagg acctgctgct gggctttctg ctgctgggac tgctgtggga ggcccctgtg 60

gtgtcatctg gccctggcaa agaactgccc gtcgtgtggg ctcaggaagg cgctcctgtg 120

catctgccct gcagcctgaa gtcccccaac ctggacccca acttcctgag aagaggcggc 180

gtgatctggc agcaccagcc tgattctggc cagcccacac ctatccctgc cctggatctg 240

caccagggca tgcctagccc tagacagcct gcccctggca gatacaccgt gctgtctgtg 300

gctcctggcg gcctgagaag tggcagacag cctctgcacc ctcacgtgca gctggaagag 360

aggggactgc agaggggcga cttcagcctg tggctgaggc ctgccctgag aacagatgcc 420

ggcgagtacc acgctaccgt gcggctgcct aacagagccc tgagctgctc cctgagactg 480

agagtgggcc aggccagcat gatcgcctct ccatctggcg tgctgaagct gagcgactgg 540

gtgctgctga actgcagctt ctccagaccc gacagacccg tgtccgtgca ctggttccag 600

ggacagaaca gagtgcccgt gtacaacagc cccagacact tcctggccga gacattcctg 660

ctgctgcccc aggtgtcccc tctggactct ggcacatggg gctgcgtgct gacatacagg 720

gacggcttca acgtgtccat cacctacaac ctgaaggtgc tgggcctgga acccgtggct 780

cctctgacag tgtacgccgc cgagggcagc agagtggaac tgccttgtca tctgccaccc 840

ggcgtgggca caccttctct gctgatcgcc aagtggaccc ctccaggcgg aggacctgaa 900

ctgccagtgg ctggcaagag cggcaacttc accctgcacc tggaagcagt gggcctggct 960

caggccggca cctacacctg tagcatccat ctgcagggcc agcagctgaa cgccaccgtg 1020

acactggccg tgatcaccgt gacccccaag agctttggcc tgcctggctc cagaggcaag 1080

ctgctgtgtg aagtgacccc cgccagcggc aaagaaagat tcgtgtggcg gcctctgaac 1140

aacctgagca gatcctgccc aggccccgtg ctggaaatcc aggaagccag actgctggcc 1200

gagcggtggc agtgccagct gtatgaggga cagcgactgc tgggcgccac tgtgtacgct 1260

gctgagtcta gctctggcgc ccacagcgcc agaagaatct gccacaccca gagcagcccc 1320

aagctgttct gggccctggt ggtggtggcc ggcgtgctgt tttgttacgg cctgctcgtg 1380

accgtggccc tgtgcgtgat ctggaccaac agcagaagaa acagaggcgg ccagagcgac 1440

tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc ctgaccagaa agccctacca gccttacgcc 1500

cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 1530

<210> 142

<211> 510

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muLag3-9aas-CD28Cys

<400> 142

Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp

1 5 10 15

Glu Ala Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Gly Lys Glu Leu Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro Cys Ser Leu Lys Ser

35 40 45

Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly Gly Val Ile Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile Pro Ala Leu Asp Leu

65 70 75 80

His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Thr

85 90 95

Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Gln Pro Leu

100 105 110

His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu Gln Arg Gly Asp Phe

115 120 125

Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp Ala Gly Glu Tyr His

130 135 140

Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser Cys Ser Leu Arg Leu

145 150 155 160

Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro Ser Gly Val Leu Lys

165 170 175

Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg

180 185 190

Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn Arg Val Pro Val Tyr

195 200 205

Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe Leu Leu Leu Pro Gln

210 215 220

Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys Val Leu Thr Tyr Arg

225 230 235 240

Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu

245 250 255

Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Arg Val

260 265 270

Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val Gly Thr Pro Ser Leu Leu

275 280 285

Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Glu Leu Pro Val Ala

290 295 300

Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu Glu Ala Val Gly Leu Ala

305 310 315 320

Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His Leu Gln Gly Gln Gln Leu

325 330 335

Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe

340 345 350

Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Ala

355 360 365

Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro Leu Asn Asn Leu Ser Arg

370 375 380

Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln Glu Ala Arg Leu Leu Ala

385 390 395 400

Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Leu Leu Gly Ala

405 410 415

Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly Ala His Ser Ala Arg Arg

420 425 430

Ile Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val

435 440 445

Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu

450 455 460

Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp

465 470 475 480

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr

485 490 495

Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

500 505 510

<210> 143

<211> 765

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muTim3tm-CD28

<400> 143

atgttcagcg gcctgaccct gaactgcgtg ctcctgctgc tgcagctgct gctggccaga 60

agcctggaaa acgcctacgt gttcgaagtg ggcaagaacg cctacctgcc ctgcagctac 120

accctgtcta cacctggcgc cctggtgcct atgtgttggg gcaagggctt ctgcccttgg 180

agccagtgca ccaacgagct gctgagaacc gacgagagaa acgtgaccta ccagaagtcc 240

agcagatacc agctgaaggg cgacctgaac aagggcgacg tgtccctgat catcaagaac 300

gtgaccctgg acgaccacgg cacctactgc tgcagaatcc agttccccgg cctgatgaac 360

gacaagaagc tggaactgaa gctggacatc aaggccgcca aagtgacccc tgcccagaca 420

gcccacggcg actctacaac agccagcccc agaaccctga ccaccgagag gaacggcagc 480

gagacacaga ccctcgtgac actgcacaac aacaacggca ccaagatcag cacctgggcc 540

gacgagatca aggacagcgg cgagacaatc agaaccgcca tccacatcgg cgtgggcgtg 600

tccgctggac tgacactggc tctgatcatc ggagtgctga tcaacagcag aagaaacaga 660

ggcggccaga gcgactacat gaacatgacc cccagaaggc ctggcctgac cagaaagccc 720

taccagcctt acgcccctgc cagagacttc gccgcctaca gacct 765

<210> 144

<211> 255

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muTim3tm-CD28

<400> 144

Met Phe Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asn Ala Tyr Val Phe Glu Val Gly Lys

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ala Leu

35 40 45

Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr

50 55 60

Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser

65 70 75 80

Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu

85 90 95

Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg

100 105 110

Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu

115 120 125

Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp

130 135 140

Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile

165 170 175

Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr

180 185 190

Ala Ile His Ile Gly Val Gly Val Ser Ala Gly Leu Thr Leu Ala Leu

195 200 205

Ile Ile Gly Val Leu Ile Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser

210 215 220

Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro

225 230 235 240

Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

245 250 255

<210> 145

<211> 783

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muTim3-CD28tm

<400> 145

atgttcagcg gcctgaccct gaactgcgtg ctcctgctgc tgcagctgct gctggccaga 60

agcctggaaa acgcctacgt gttcgaagtg ggcaagaacg cctacctgcc ctgcagctac 120

accctgtcta cacctggcgc cctggtgcct atgtgttggg gcaagggctt ctgcccttgg 180

agccagtgca ccaacgagct gctgagaacc gacgagagaa acgtgaccta ccagaagtcc 240

agcagatacc agctgaaggg cgacctgaac aagggcgacg tgtccctgat catcaagaac 300

gtgaccctgg acgaccacgg cacctactgc tgcagaatcc agttccccgg cctgatgaac 360

gacaagaagc tggaactgaa gctggacatc aaggccgcca aagtgacccc tgcccagaca 420

gcccacggcg actctacaac agccagcccc agaaccctga ccaccgagag gaacggcagc 480

gagacacaga ccctcgtgac actgcacaac aacaacggca ccaagatcag cacctgggcc 540

gacgagatca aggacagcgg cgagacaatc agaaccgcct tctgggccct ggtggtggtg 600

gccggcgtgc tgttttgtta cggcctgctc gtgaccgtgg ccctgtgcgt gatctggacc 660

aacagcagaa gaaacagagg cggccagagc gactacatga acatgacccc cagaaggcct 720

ggcctgacca gaaagcccta ccagccttac gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga 780

cct 783

<210> 146

<211> 261

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muTim3-CD28tm

<400> 146

Met Phe Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asn Ala Tyr Val Phe Glu Val Gly Lys

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ala Leu

35 40 45

Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr

50 55 60

Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser

65 70 75 80

Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu

85 90 95

Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg

100 105 110

Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu

115 120 125

Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp

130 135 140

Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile

165 170 175

Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr

180 185 190

Ala Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly

195 200 205

Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg

210 215 220

Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

225 230 235 240

Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe

245 250 255

Ala Ala Tyr Arg Pro

260

<210> 147

<211> 810

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muTim3-CD28Cys

<400> 147

atgttcagcg gcctgaccct gaactgcgtg ctcctgctgc tgcagctgct gctggccaga 60

agcctggaaa acgcctacgt gttcgaagtg ggcaagaacg cctacctgcc ctgcagctac 120

accctgtcta cacctggcgc cctggtgcct atgtgttggg gcaagggctt ctgcccttgg 180

agccagtgca ccaacgagct gctgagaacc gacgagagaa acgtgaccta ccagaagtcc 240

agcagatacc agctgaaggg cgacctgaac aagggcgacg tgtccctgat catcaagaac 300

gtgaccctgg acgaccacgg cacctactgc tgcagaatcc agttccccgg cctgatgaac 360

gacaagaagc tggaactgaa gctggacatc aaggccgcca aagtgacccc tgcccagaca 420

gcccacggcg actctacaac agccagcccc agaaccctga ccaccgagag gaacggcagc 480

gagacacaga ccctcgtgac actgcacaac aacaacggca ccaagatcag cacctgggcc 540

gacgagatca aggacagcgg cgagacaatc agaaccgcct gccacaccca gagcagcccc 600

aagctgttct gggccctggt ggtggtggcc ggcgtgctgt tttgttacgg cctgctcgtg 660

accgtggccc tgtgcgtgat ctggaccaac agcagaagaa acagaggcgg ccagagcgac 720

tacatgaaca tgacccccag aaggcctggc ctgaccagaa agccctacca gccttacgcc 780

cctgccagag acttcgccgc ctacagacct 810

<210> 148

<211> 270

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muTim3-CD28Cys

<400> 148

Met Phe Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asn Ala Tyr Val Phe Glu Val Gly Lys

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ala Leu

35 40 45

Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr

50 55 60

Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser

65 70 75 80

Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu

85 90 95

Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg

100 105 110

Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu

115 120 125

Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp

130 135 140

Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile

165 170 175

Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Asp Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr

180 185 190

Ala Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val

195 200 205

Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu

210 215 220

Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp

225 230 235 240

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr

245 250 255

Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro

260 265 270

<210> 149

<211> 783

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muTim3-9aas-CD28Cys

<400> 149

atgttcagcg gcctgaccct gaactgcgtg ctcctgctgc tgcagctgct gctggccaga 60

agcctggaaa acgcctacgt gttcgaagtg ggcaagaacg cctacctgcc ctgcagctac 120

accctgtcta cacctggcgc cctggtgcct atgtgttggg gcaagggctt ctgcccttgg 180

agccagtgca ccaacgagct gctgagaacc gacgagagaa acgtgaccta ccagaagtcc 240

agcagatacc agctgaaggg cgacctgaac aagggcgacg tgtccctgat catcaagaac 300

gtgaccctgg acgaccacgg cacctactgc tgcagaatcc agttccccgg cctgatgaac 360

gacaagaagc tggaactgaa gctggacatc aaggccgcca aagtgacccc tgcccagaca 420

gcccacggcg actctacaac agccagcccc agaaccctga ccaccgagag gaacggcagc 480

gagacacaga ccctcgtgac actgcacaac aacaacggca ccaagatcag cacctgggcc 540

gacgagatca agtgccacac ccagagcagc cccaagctgt tctgggccct ggtggtggtg 600

gccggcgtgc tgttttgtta cggcctgctc gtgaccgtgg ccctgtgcgt gatctggacc 660

aacagcagaa gaaacagagg cggccagagc gactacatga acatgacccc cagaaggcct 720

ggcctgacca gaaagcccta ccagccttac gcccctgcca gagacttcgc cgcctacaga 780

cct 783

<210> 150

<211> 261

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> muTim3-9aas-CD28Cys

<400> 150

Met Phe Ser Gly Leu Thr Leu Asn Cys Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ala Arg Ser Leu Glu Asn Ala Tyr Val Phe Glu Val Gly Lys

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Ser Tyr Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ala Leu

35 40 45

Val Pro Met Cys Trp Gly Lys Gly Phe Cys Pro Trp Ser Gln Cys Thr

50 55 60

Asn Glu Leu Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asn Val Thr Tyr Gln Lys Ser

65 70 75 80

Ser Arg Tyr Gln Leu Lys Gly Asp Leu Asn Lys Gly Asp Val Ser Leu

85 90 95

Ile Ile Lys Asn Val Thr Leu Asp Asp His Gly Thr Tyr Cys Cys Arg

100 105 110

Ile Gln Phe Pro Gly Leu Met Asn Asp Lys Lys Leu Glu Leu Lys Leu

115 120 125

Asp Ile Lys Ala Ala Lys Val Thr Pro Ala Gln Thr Ala His Gly Asp

130 135 140

Ser Thr Thr Ala Ser Pro Arg Thr Leu Thr Thr Glu Arg Asn Gly Ser

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Val Thr Leu His Asn Asn Asn Gly Thr Lys Ile

165 170 175

Ser Thr Trp Ala Asp Glu Ile Lys Cys His Thr Gln Ser Ser Pro Lys

180 185 190

Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly

195 200 205

Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg

210 215 220

Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

225 230 235 240

Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe

245 250 255

Ala Ala Tyr Arg Pro

260

<210> 151

<211> 1536

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huLag3tm-CD28

<400> 151

atgtgggaag cgcagtttct tggacttctt tttctccagc cgctgtgggt tgcgccagta 60

aagccgctcc aacccggtgc agaggttccg gtagtgtggg cgcaagaggg tgcaccagcg 120

cagctcccct gcagtccgac gattccgctg caagatttgt cactgcttag aagggcgggc 180

gtaacgtggc agcaccaacc ggatagtggc cctccggctg cagcaccagg gcacccactc 240

gcccccggcc ctcatcccgc agcaccgagc agctggggtc ctagaccacg cagatataca 300

gtactctcag taggtcccgg cggcctgcgg tccggtcgct tgccccttca acctagagta 360

cagctggatg aaagaggtcg acaacggggt gatttctccc tctggttgag gcctgcacga 420

cgagcagatg ctggggagta tagggctgcc gtacacctgc gagaccgcgc acttagttgt 480

agactccggc tccggctggg acaggcctct atgacagcgt ccccccctgg gtccctgcga 540

gcctctgatt gggtaatact caactgctca ttttctcggc cagatcgccc cgctagtgtt 600

cattggttcc gaaatcgcgg ccaaggtcgc gtgcctgttc gagaatctcc acaccaccat 660

ttggcggagt cttttctttt tctgcctcag gtctccccta tggactctgg accgtggggc 720

tgtattttga catatcggga tgggtttaac gtgagtataa tgtataatct cactgtcttg 780

ggtcttgagc cacctacgcc gctgacggtg tacgcgggag ccggcagccg ggttggtctg 840

ccctgcaggc tgcctgcagg agtcgggaca aggtcattcc ttacagcaaa gtggaccccg 900

ccaggtgggg ggcccgacct ccttgtaacg ggagataatg gagatttcac tctgagactt 960

gaggatgtct ctcaagctca ggctgggact tatacatgtc acattcactt gcaagaacag 1020

cagttgaatg cgacggttac cctggctatc ataacagtaa cacctaaatc tttcggtagt 1080

ccgggtagcc tgggcaaact gttgtgtgag gtaacccccg tgtcaggtca agagcggttc 1140

gtctggagct cattggacac tccctcacag cgatccttta gcggaccctg gctcgaagcc 1200

caagaagccc agctgctttc ccaaccatgg cagtgtcaac tctatcaggg tgagcgcctt 1260

ctcggtgcgg ctgtctactt caccgaattg tcctctccgg gagcgcaaag aagtggacgc 1320

gccccagggg ccctcccggc aggacacctt ctgctgtttt tgattttggg ggtacttagt 1380

ttgctgctgc ttgtcacagg cgctttcggt ttccgcagca agcggagcag aggcggccac 1440

agcgactaca tgaacatgac ccctagacgg cctggcccca ccagaaagca ctaccagccc 1500

tacgcccctc cccgggactt tgccgcctac agaagc 1536

<210> 152

<211> 512

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huLag3tm-CD28

<400> 152

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val

275 280 285

Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His

325 330 335

Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser

370 375 380

Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly

435 440 445

His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu

450 455 460

Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His

465 470 475 480

Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys

485 490 495

His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

500 505 510

<210> 153

<211> 1350

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> эктодомен huLag3

<400> 153

atgtgggaag cgcagtttct tggacttctt tttctccagc cgctgtgggt tgcgccagta 60

aagccgctcc aacccggtgc agaggttccg gtagtgtggg cgcaagaggg tgcaccagcg 120

cagctcccct gcagtccgac gattccgctg caagatttgt cactgcttag aagggcgggc 180

gtaacgtggc agcaccaacc ggatagtggc cctccggctg cagcaccagg gcacccactc 240

gcccccggcc ctcatcccgc agcaccgagc agctggggtc ctagaccacg cagatataca 300

gtactctcag taggtcccgg cggcctgcgg tccggtcgct tgccccttca acctagagta 360

cagctggatg aaagaggtcg acaacggggt gatttctccc tctggttgag gcctgcacga 420

cgagcagatg ctggggagta tagggctgcc gtacacctgc gagaccgcgc acttagttgt 480

agactccggc tccggctggg acaggcctct atgacagcgt ccccccctgg gtccctgcga 540

gcctctgatt gggtaatact caactgctca ttttctcggc cagatcgccc cgctagtgtt 600

cattggttcc gaaatcgcgg ccaaggtcgc gtgcctgttc gagaatctcc acaccaccat 660

ttggcggagt cttttctttt tctgcctcag gtctccccta tggactctgg accgtggggc 720

tgtattttga catatcggga tgggtttaac gtgagtataa tgtataatct cactgtcttg 780

ggtcttgagc cacctacgcc gctgacggtg tacgcgggag ccggcagccg ggttggtctg 840

ccctgcaggc tgcctgcagg agtcgggaca aggtcattcc ttacagcaaa gtggaccccg 900

ccaggtgggg ggcccgacct ccttgtaacg ggagataatg gagatttcac tctgagactt 960

gaggatgtct ctcaagctca ggctgggact tatacatgtc acattcactt gcaagaacag 1020

cagttgaatg cgacggttac cctggctatc ataacagtaa cacctaaatc tttcggtagt 1080

ccgggtagcc tgggcaaact gttgtgtgag gtaacccccg tgtcaggtca agagcggttc 1140

gtctggagct cattggacac tccctcacag cgatccttta gcggaccctg gctcgaagcc 1200

caagaagccc agctgctttc ccaaccatgg cagtgtcaac tctatcaggg tgagcgcctt 1260

ctcggtgcgg ctgtctactt caccgaattg tcctctccgg gagcgcaaag aagtggacgc 1320

gccccagggg ccctcccggc aggacacctt 1350

<210> 154

<211> 450

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> эктодомен huLag3

<400> 154

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val

275 280 285

Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His

325 330 335

Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser

370 375 380

Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly

435 440 445

His Leu

450

<210> 155

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный домен huLag3

<400> 155

ctgctgtttt tgattttggg ggtacttagt ttgctgctgc ttgtcacagg cgctttcggt 60

ttc 63

<210> 156

<211> 21

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный домен huLag3

<400> 156

Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu Val Thr

1 5 10 15

Gly Ala Phe Gly Phe

20

<210> 157

<211> 1554

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huLag3-CD28tm

<400> 157

atgtgggaag cgcagtttct tggacttctt tttctccagc cgctgtgggt tgcgccagta 60

aagccgctcc aacccggtgc agaggttccg gtagtgtggg cgcaagaggg tgcaccagcg 120

cagctcccct gcagtccgac gattccgctg caagatttgt cactgcttag aagggcgggc 180

gtaacgtggc agcaccaacc ggatagtggc cctccggctg cagcaccagg gcacccactc 240

gcccccggcc ctcatcccgc agcaccgagc agctggggtc ctagaccacg cagatataca 300

gtactctcag taggtcccgg cggcctgcgg tccggtcgct tgccccttca acctagagta 360

cagctggatg aaagaggtcg acaacggggt gatttctccc tctggttgag gcctgcacga 420

cgagcagatg ctggggagta tagggctgcc gtacacctgc gagaccgcgc acttagttgt 480

agactccggc tccggctggg acaggcctct atgacagcgt ccccccctgg gtccctgcga 540

gcctctgatt gggtaatact caactgctca ttttctcggc cagatcgccc cgctagtgtt 600

cattggttcc gaaatcgcgg ccaaggtcgc gtgcctgttc gagaatctcc acaccaccat 660

ttggcggagt cttttctttt tctgcctcag gtctccccta tggactctgg accgtggggc 720

tgtattttga catatcggga tgggtttaac gtgagtataa tgtataatct cactgtcttg 780

ggtcttgagc cacctacgcc gctgacggtg tacgcgggag ccggcagccg ggttggtctg 840

ccctgcaggc tgcctgcagg agtcgggaca aggtcattcc ttacagcaaa gtggaccccg 900

ccaggtgggg ggcccgacct ccttgtaacg ggagataatg gagatttcac tctgagactt 960

gaggatgtct ctcaagctca ggctgggact tatacatgtc acattcactt gcaagaacag 1020

cagttgaatg cgacggttac cctggctatc ataacagtaa cacctaaatc tttcggtagt 1080

ccgggtagcc tgggcaaact gttgtgtgag gtaacccccg tgtcaggtca agagcggttc 1140

gtctggagct cattggacac tccctcacag cgatccttta gcggaccctg gctcgaagcc 1200

caagaagccc agctgctttc ccaaccatgg cagtgtcaac tctatcaggg tgagcgcctt 1260

ctcggtgcgg ctgtctactt caccgaattg tcctctccgg gagcgcaaag aagtggacgc 1320

gccccagggg ccctcccggc aggacacctt ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg 1380

ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg gccttcatca tcttttgggt ccgcagcaag 1440

cggagcagag gcggccacag cgactacatg aacatgaccc ctagacggcc tggccccacc 1500

agaaagcact accagcccta cgcccctccc cgggactttg ccgcctacag aagc 1554

<210> 158

<211> 518

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huLag3-CD28tm

<400> 158

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val

275 280 285

Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His

325 330 335

Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser

370 375 380

Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly

435 440 445

His Leu Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

450 455 460

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

465 470 475 480

Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

485 490 495

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

500 505 510

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

515

<210> 159

<211> 1554

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huLag3-12aas-CD28Cys

<400> 159

atgtgggaag cgcagtttct tggacttctt tttctccagc cgctgtgggt tgcgccagta 60

aagccgctcc aacccggtgc agaggttccg gtagtgtggg cgcaagaggg tgcaccagcg 120

cagctcccct gcagtccgac gattccgctg caagatttgt cactgcttag aagggcgggc 180

gtaacgtggc agcaccaacc ggatagtggc cctccggctg cagcaccagg gcacccactc 240

gcccccggcc ctcatcccgc agcaccgagc agctggggtc ctagaccacg cagatataca 300

gtactctcag taggtcccgg cggcctgcgg tccggtcgct tgccccttca acctagagta 360

cagctggatg aaagaggtcg acaacggggt gatttctccc tctggttgag gcctgcacga 420

cgagcagatg ctggggagta tagggctgcc gtacacctgc gagaccgcgc acttagttgt 480

agactccggc tccggctggg acaggcctct atgacagcgt ccccccctgg gtccctgcga 540

gcctctgatt gggtaatact caactgctca ttttctcggc cagatcgccc cgctagtgtt 600

cattggttcc gaaatcgcgg ccaaggtcgc gtgcctgttc gagaatctcc acaccaccat 660

ttggcggagt cttttctttt tctgcctcag gtctccccta tggactctgg accgtggggc 720

tgtattttga catatcggga tgggtttaac gtgagtataa tgtataatct cactgtcttg 780

ggtcttgagc cacctacgcc gctgacggtg tacgcgggag ccggcagccg ggttggtctg 840

ccctgcaggc tgcctgcagg agtcgggaca aggtcattcc ttacagcaaa gtggaccccg 900

ccaggtgggg ggcccgacct ccttgtaacg ggagataatg gagatttcac tctgagactt 960

gaggatgtct ctcaagctca ggctgggact tatacatgtc acattcactt gcaagaacag 1020

cagttgaatg cgacggttac cctggctatc ataacagtaa cacctaaatc tttcggtagt 1080

ccgggtagcc tgggcaaact gttgtgtgag gtaacccccg tgtcaggtca agagcggttc 1140

gtctggagct cattggacac tccctcacag cgatccttta gcggaccctg gctcgaagcc 1200

caagaagccc agctgctttc ccaaccatgg cagtgtcaac tctatcaggg tgagcgcctt 1260

ctcggtgcgg ctgtctactt caccgaattg tcctctccgg gagcgcaaag aagttgtccc 1320

agccctctgt ttcccggccc tagcaagcct ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg 1380

ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg gccttcatca tcttttgggt ccgcagcaag 1440

cggagcagag gcggccacag cgactacatg aacatgaccc ctagacggcc tggccccacc 1500

agaaagcact accagcccta cgcccctccc cgggactttg ccgcctacag aagc 1554

<210> 160

<211> 518

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huLag3-12aas-CD28Cys

<400> 160

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val

275 280 285

Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His

325 330 335

Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser

370 375 380

Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser

435 440 445

Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

450 455 460

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

465 470 475 480

Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

485 490 495

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

500 505 510

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

515

<210> 161

<211> 1314

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huLag3-12aas

<400> 161

atgtgggaag cgcagtttct tggacttctt tttctccagc cgctgtgggt tgcgccagta 60

aagccgctcc aacccggtgc agaggttccg gtagtgtggg cgcaagaggg tgcaccagcg 120

cagctcccct gcagtccgac gattccgctg caagatttgt cactgcttag aagggcgggc 180

gtaacgtggc agcaccaacc ggatagtggc cctccggctg cagcaccagg gcacccactc 240

gcccccggcc ctcatcccgc agcaccgagc agctggggtc ctagaccacg cagatataca 300

gtactctcag taggtcccgg cggcctgcgg tccggtcgct tgccccttca acctagagta 360

cagctggatg aaagaggtcg acaacggggt gatttctccc tctggttgag gcctgcacga 420

cgagcagatg ctggggagta tagggctgcc gtacacctgc gagaccgcgc acttagttgt 480

agactccggc tccggctggg acaggcctct atgacagcgt ccccccctgg gtccctgcga 540

gcctctgatt gggtaatact caactgctca ttttctcggc cagatcgccc cgctagtgtt 600

cattggttcc gaaatcgcgg ccaaggtcgc gtgcctgttc gagaatctcc acaccaccat 660

ttggcggagt cttttctttt tctgcctcag gtctccccta tggactctgg accgtggggc 720

tgtattttga catatcggga tgggtttaac gtgagtataa tgtataatct cactgtcttg 780

ggtcttgagc cacctacgcc gctgacggtg tacgcgggag ccggcagccg ggttggtctg 840

ccctgcaggc tgcctgcagg agtcgggaca aggtcattcc ttacagcaaa gtggaccccg 900

ccaggtgggg ggcccgacct ccttgtaacg ggagataatg gagatttcac tctgagactt 960

gaggatgtct ctcaagctca ggctgggact tatacatgtc acattcactt gcaagaacag 1020

cagttgaatg cgacggttac cctggctatc ataacagtaa cacctaaatc tttcggtagt 1080

ccgggtagcc tgggcaaact gttgtgtgag gtaacccccg tgtcaggtca agagcggttc 1140

gtctggagct cattggacac tccctcacag cgatccttta gcggaccctg gctcgaagcc 1200

caagaagccc agctgctttc ccaaccatgg cagtgtcaac tctatcaggg tgagcgcctt 1260

ctcggtgcgg ctgtctactt caccgaattg tcctctccgg gagcgcaaag aagt 1314

<210> 162

<211> 438

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huLag3-12aas

<400> 162

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val

275 280 285

Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His

325 330 335

Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser

370 375 380

Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser

435

<210> 163

<211> 1590

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huLag3-CD28Cys

<400> 163

atgtgggaag cgcagtttct tggacttctt tttctccagc cgctgtgggt tgcgccagta 60

aagccgctcc aacccggtgc agaggttccg gtagtgtggg cgcaagaggg tgcaccagcg 120

cagctcccct gcagtccgac gattccgctg caagatttgt cactgcttag aagggcgggc 180

gtaacgtggc agcaccaacc ggatagtggc cctccggctg cagcaccagg gcacccactc 240

gcccccggcc ctcatcccgc agcaccgagc agctggggtc ctagaccacg cagatataca 300

gtactctcag taggtcccgg cggcctgcgg tccggtcgct tgccccttca acctagagta 360

cagctggatg aaagaggtcg acaacggggt gatttctccc tctggttgag gcctgcacga 420

cgagcagatg ctggggagta tagggctgcc gtacacctgc gagaccgcgc acttagttgt 480

agactccggc tccggctggg acaggcctct atgacagcgt ccccccctgg gtccctgcga 540

gcctctgatt gggtaatact caactgctca ttttctcggc cagatcgccc cgctagtgtt 600

cattggttcc gaaatcgcgg ccaaggtcgc gtgcctgttc gagaatctcc acaccaccat 660

ttggcggagt cttttctttt tctgcctcag gtctccccta tggactctgg accgtggggc 720

tgtattttga catatcggga tgggtttaac gtgagtataa tgtataatct cactgtcttg 780

ggtcttgagc cacctacgcc gctgacggtg tacgcgggag ccggcagccg ggttggtctg 840

ccctgcaggc tgcctgcagg agtcgggaca aggtcattcc ttacagcaaa gtggaccccg 900

ccaggtgggg ggcccgacct ccttgtaacg ggagataatg gagatttcac tctgagactt 960

gaggatgtct ctcaagctca ggctgggact tatacatgtc acattcactt gcaagaacag 1020

cagttgaatg cgacggttac cctggctatc ataacagtaa cacctaaatc tttcggtagt 1080

ccgggtagcc tgggcaaact gttgtgtgag gtaacccccg tgtcaggtca agagcggttc 1140

gtctggagct cattggacac tccctcacag cgatccttta gcggaccctg gctcgaagcc 1200

caagaagccc agctgctttc ccaaccatgg cagtgtcaac tctatcaggg tgagcgcctt 1260

ctcggtgcgg ctgtctactt caccgaattg tcctctccgg gagcgcaaag aagtggacgc 1320

gccccagggg ccctcccggc aggacacctt tgtcccagcc ctctgtttcc cggccctagc 1380

aagcctttct gggtgctggt ggtggtcgga ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtc 1440

accgtggcct tcatcatctt ttgggtccgc agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac 1500

tacatgaaca tgacccctag acggcctggc cccaccagaa agcactacca gccctacgcc 1560

cctccccggg actttgccgc ctacagaagc 1590

<210> 164

<211> 530

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huLag3-CD28Cys

<400> 164

Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp

1 5 10 15

Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val

20 25 30

Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile

35 40 45

Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln

50 55 60

His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu

65 70 75 80

Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro

85 90 95

Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly

100 105 110

Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln

115 120 125

Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala

130 135 140

Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser

180 185 190

Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln

195 200 205

Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser

210 215 220

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly

225 230 235 240

Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn

245 250 255

Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val

275 280 285

Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu

305 310 315 320

Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His

325 330 335

Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr

340 345 350

Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu

355 360 365

Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser

370 375 380

Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln

405 410 415

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser

420 425 430

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly

435 440 445

His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp

450 455 460

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val

465 470 475 480

Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly

485 490 495

Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr

500 505 510

Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr

515 520 525

Arg Ser

530

<210> 165

<211> 792

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huTim3tm-CD28

<400> 165

atgttctccc atcttccctt cgactgtgtg ttgctccttc tcctcctgct tctcacccgg 60

tcaagcgaag tagagtaccg ggcggaagta ggtcagaacg catatctccc ctgtttttac 120

acacccgctg cgccgggaaa cctggttccc gtgtgttggg gaaagggggc atgccctgtt 180

ttcgagtgtg gcaacgtggt cctccggacg gatgagcgag acgtgaatta ttggacgagc 240

agatattggt tgaatggcga ttttagaaag ggtgatgtga gcttgaccat tgagaatgta 300

acgcttgctg atagcgggat atattgctgt agaattcaaa tccctggtat aatgaacgac 360

gaaaaattca atctgaagct ggtaattaag ccggccaagg tgacacccgc cccgacacga 420

cagcgcgact tcacggctgc ctttccacgc atgttgacca caaggggaca tggtccagcg 480

gagacccaga cacttggtag cctcccggac ataaacctca cacaaatatc cacgttggcg 540

aacgagctcc gagattccag gcttgcgaat gacctgaggg attctggagc taccatcaga 600

atcggtatct acataggtgc cgggatatgc gccggtctcg cacttgcctt gattttcggg 660

gcactgattc gcagcaagcg gagcagaggc ggccacagcg actacatgaa catgacccct 720

agacggcctg gccccaccag aaagcactac cagccctacg cccctccccg ggactttgcc 780

gcctacagaa gc 792

<210> 166

<211> 264

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huTim3tm-CD28

<400> 166

Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu

35 40 45

Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly

50 55 60

Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile

100 105 110

Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val

115 120 125

Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe

130 135 140

Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu

180 185 190

Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly

195 200 205

Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Arg

210 215 220

Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

225 230 235 240

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

245 250 255

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

260

<210> 167

<211> 606

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> эктодомен huTim3

<400> 167

atgttctccc atcttccctt cgactgtgtg ttgctccttc tcctcctgct tctcacccgg 60

tcaagcgaag tagagtaccg ggcggaagta ggtcagaacg catatctccc ctgtttttac 120

acacccgctg cgccgggaaa cctggttccc gtgtgttggg gaaagggggc atgccctgtt 180

ttcgagtgtg gcaacgtggt cctccggacg gatgagcgag acgtgaatta ttggacgagc 240

agatattggt tgaatggcga ttttagaaag ggtgatgtga gcttgaccat tgagaatgta 300

acgcttgctg atagcgggat atattgctgt agaattcaaa tccctggtat aatgaacgac 360

gaaaaattca atctgaagct ggtaattaag ccggccaagg tgacacccgc cccgacacga 420

cagcgcgact tcacggctgc ctttccacgc atgttgacca caaggggaca tggtccagcg 480

gagacccaga cacttggtag cctcccggac ataaacctca cacaaatatc cacgttggcg 540

aacgagctcc gagattccag gcttgcgaat gacctgaggg attctggagc taccatcaga 600

atcggt 606

<210> 168

<211> 202

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> эктодомен huTim3

<400> 168

Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu

35 40 45

Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly

50 55 60

Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile

100 105 110

Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val

115 120 125

Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe

130 135 140

Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu

180 185 190

Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly

195 200

<210> 169

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный huTim3

<400> 169

atctacatag gtgccgggat atgcgccggt ctcgcacttg ccttgatttt cggggcactg 60

att 63

<210> 170

<211> 21

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> трансмембранный huTim3

<400> 170

Ile Tyr Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1 5 10 15

Phe Gly Ala Leu Ile

20

<210> 171

<211> 810

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huTim3-CD28tm

<400> 171

atgttctccc atcttccctt cgactgtgtg ttgctccttc tcctcctgct tctcacccgg 60

tcaagcgaag tagagtaccg ggcggaagta ggtcagaacg catatctccc ctgtttttac 120

acacccgctg cgccgggaaa cctggttccc gtgtgttggg gaaagggggc atgccctgtt 180

ttcgagtgtg gcaacgtggt cctccggacg gatgagcgag acgtgaatta ttggacgagc 240

agatattggt tgaatggcga ttttagaaag ggtgatgtga gcttgaccat tgagaatgta 300

acgcttgctg atagcgggat atattgctgt agaattcaaa tccctggtat aatgaacgac 360

gaaaaattca atctgaagct ggtaattaag ccggccaagg tgacacccgc cccgacacga 420

cagcgcgact tcacggctgc ctttccacgc atgttgacca caaggggaca tggtccagcg 480

gagacccaga cacttggtag cctcccggac ataaacctca cacaaatatc cacgttggcg 540

aacgagctcc gagattccag gcttgcgaat gacctgaggg attctggagc taccatcaga 600

atcggtttct gggtgctggt ggtggtcgga ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtc 660

accgtggcct tcatcatctt ttgggtccgc agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac 720

tacatgaaca tgacccctag acggcctggc cccaccagaa agcactacca gccctacgcc 780

cctccccggg actttgccgc ctacagaagc 810

<210> 172

<211> 270

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huTim3-CD28tm

<400> 172

Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu

35 40 45

Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly

50 55 60

Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile

100 105 110

Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val

115 120 125

Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe

130 135 140

Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu

180 185 190

Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Phe Trp Val Leu Val Val

195 200 205

Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe

210 215 220

Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp

225 230 235 240

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr

245 250 255

Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

260 265 270

<210> 173

<211> 846

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huTim3-CD28Cys

<400> 173

atgttctccc atcttccctt cgactgtgtg ttgctccttc tcctcctgct tctcacccgg 60

tcaagcgaag tagagtaccg ggcggaagta ggtcagaacg catatctccc ctgtttttac 120

acacccgctg cgccgggaaa cctggttccc gtgtgttggg gaaagggggc atgccctgtt 180

ttcgagtgtg gcaacgtggt cctccggacg gatgagcgag acgtgaatta ttggacgagc 240

agatattggt tgaatggcga ttttagaaag ggtgatgtga gcttgaccat tgagaatgta 300

acgcttgctg atagcgggat atattgctgt agaattcaaa tccctggtat aatgaacgac 360

gaaaaattca atctgaagct ggtaattaag ccggccaagg tgacacccgc cccgacacga 420

cagcgcgact tcacggctgc ctttccacgc atgttgacca caaggggaca tggtccagcg 480

gagacccaga cacttggtag cctcccggac ataaacctca cacaaatatc cacgttggcg 540

aacgagctcc gagattccag gcttgcgaat gacctgaggg attctggagc taccatcaga 600

atcggttgtc ccagccctct gtttcccggc cctagcaagc ctttctgggt gctggtggtg 660

gtcggaggcg tgctggcctg ctacagcctg ctggtcaccg tggccttcat catcttttgg 720

gtccgcagca agcggagcag aggcggccac agcgactaca tgaacatgac ccctagacgg 780

cctggcccca ccagaaagca ctaccagccc tacgcccctc cccgggactt tgccgcctac 840

agaagc 846

<210> 174

<211> 282

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huTim3-CD28Cys

<400> 174

Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu

35 40 45

Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly

50 55 60

Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile

100 105 110

Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val

115 120 125

Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe

130 135 140

Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu

180 185 190

Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Cys Pro Ser Pro Leu Phe

195 200 205

Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

210 215 220

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

225 230 235 240

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met

245 250 255

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

260 265 270

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

275 280

<210> 175

<211> 810

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huTim3-12aas-CD28Cys

<400> 175

atgttctccc atcttccctt cgactgtgtg ttgctccttc tcctcctgct tctcacccgg 60

tcaagcgaag tagagtaccg ggcggaagta ggtcagaacg catatctccc ctgtttttac 120

acacccgctg cgccgggaaa cctggttccc gtgtgttggg gaaagggggc atgccctgtt 180

ttcgagtgtg gcaacgtggt cctccggacg gatgagcgag acgtgaatta ttggacgagc 240

agatattggt tgaatggcga ttttagaaag ggtgatgtga gcttgaccat tgagaatgta 300

acgcttgctg atagcgggat atattgctgt agaattcaaa tccctggtat aatgaacgac 360

gaaaaattca atctgaagct ggtaattaag ccggccaagg tgacacccgc cccgacacga 420

cagcgcgact tcacggctgc ctttccacgc atgttgacca caaggggaca tggtccagcg 480

gagacccaga cacttggtag cctcccggac ataaacctca cacaaatatc cacgttggcg 540

aacgagctcc gagattccag gcttgcgaat tgtcccagcc ctctgtttcc cggccctagc 600

aagcctttct gggtgctggt ggtggtcgga ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtc 660

accgtggcct tcatcatctt ttgggtccgc agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac 720

tacatgaaca tgacccctag acggcctggc cccaccagaa agcactacca gccctacgcc 780

cctccccggg actttgccgc ctacagaagc 810

<210> 176

<211> 270

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huTim3-12aas-CD28Cys

<400> 176

Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu

35 40 45

Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly

50 55 60

Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile

100 105 110

Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val

115 120 125

Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe

130 135 140

Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Cys Pro

180 185 190

Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val

195 200 205

Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe

210 215 220

Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp

225 230 235 240

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr

245 250 255

Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

260 265 270

<210> 177

<211> 570

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huTim3-12aas

<400> 177

atgttctccc atcttccctt cgactgtgtg ttgctccttc tcctcctgct tctcacccgg 60

tcaagcgaag tagagtaccg ggcggaagta ggtcagaacg catatctccc ctgtttttac 120

acacccgctg cgccgggaaa cctggttccc gtgtgttggg gaaagggggc atgccctgtt 180

ttcgagtgtg gcaacgtggt cctccggacg gatgagcgag acgtgaatta ttggacgagc 240

agatattggt tgaatggcga ttttagaaag ggtgatgtga gcttgaccat tgagaatgta 300

acgcttgctg atagcgggat atattgctgt agaattcaaa tccctggtat aatgaacgac 360

gaaaaattca atctgaagct ggtaattaag ccggccaagg tgacacccgc cccgacacga 420

cagcgcgact tcacggctgc ctttccacgc atgttgacca caaggggaca tggtccagcg 480

gagacccaga cacttggtag cctcccggac ataaacctca cacaaatatc cacgttggcg 540

aacgagctcc gagattccag gcttgcgaat 570

<210> 178

<211> 190

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huTim3-12aas

<400> 178

Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln

20 25 30

Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu

35 40 45

Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly

50 55 60

Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile

100 105 110

Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val

115 120 125

Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe

130 135 140

Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala

145 150 155 160

Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn

180 185 190

<---

1. Слитый белок, связывающийся с CD47 для передачи костимулирующего сигнала CD28 Т-клетке, содержащий: (а) внеклеточный компонент, состоящий из CD47-связывающей части SIRPα или его связывающего варианта, где внеклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью к аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:44, (b) внутриклеточный компонент, состоящий из сигнального домена костимулирующей молекулы CD28 или его варианта, где внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью к аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:28, и (с) гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, содержащий трансмембранную часть CD28, где гидрофобный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:27.

2. Слитый белок по п. 1, где экспрессия слитого белка в Т-клетке, содержащей TCR или химерный антигенный рецептор, специфичный в отношении антигена, приводит к по меньшей мере 1,5-кратному, 2-кратному или 3-кратному увеличению показателя выживания, размножения, цитотоксичности, секреции цитокинов и/или ответа на несколько циклов стимуляции у Т-клетки в ответ на связывание антигена и/или после введения субъекту и/или приводит к по меньшей мере 1,5-кратному, 2-кратному или 3-кратному увеличению показателя времени выживания, выживаемости без признаков заболевания или уменьшению интенсивности одного или более симптомов заболевания у субъекта, которому вводится клетка, по сравнению с клеткой по существу такой же, как Т-клетка, но не содержащей слитый белок.

3. Слитый белок по п. 1, где в случае экспрессии в Т-клетке слитый белок способен колокализоваться с TCR или CAR, экспрессируемыми Т-клеткой.

4. Слитый белок по п. 1, где внеклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:40.

5. Слитый белок по п. 4, где внеклеточный компонент дополнительно содержит дополнительную внеклеточную часть, где дополнительная внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:32.

6. Слитый белок по п. 1, где внутриклеточный компонент дополнительно содержит второй сигнальный домен костимулирующей молекулы, предусматривающий внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB) или его вариант, где второй сигнальный домен костимулирующей молекулы содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 95% идентичностью к аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:36.

7. Слитый белок по п. 1, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:42.

8. Слитый белок по п. 1, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:43.

9. Слитый белок по п. 1, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:46.

10. Слитый белок по п. 1, где (a) внеклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:40, (b) гидрофобный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:27, и (c) внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:28.

11. Слитый белок по п. 1, где (a) внеклеточный компонент содержит связывающий домен с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:44, и домен мультимеризации с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:32, (b) гидрофобный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:27, и (c) внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:28.

12. Слитый белок по п. 1, где (a) внеклеточный компонент содержит связывающий домен с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:44, и домен мультимеризации с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:32, (b) гидрофобный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:27, и (c) внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:28, и аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:36.

13. Слитый белок для передачи костимулирующего сигнала CD-28 Т-клетке, содержащий: (а) внеклеточный компонент, состоящий из CD47-связывающей части SIRPα или его связывающего варианта, где внеклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:21, (b) внутриклеточный компонент, состоящий из сигнального домена костимулирующей молекулы CD-28 или его варианта, где внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:5, и (с) гидрофобный компонент, соединяющий внеклеточный и внутриклеточный компоненты, содержащий трансмембранную часть CD28, где гидрофобный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:4.

14. Слитый белок по п. 13, где внеклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:17.

15. Слитый белок по п. 13, где внеклеточный компонент дополнительно содержит дополнительную внеклеточную часть, где дополнительная внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:9.

16. Слитый белок по п. 13, где внутриклеточный компонент дополнительно содержит второй сигнальный домен костимулирующей молекулы, предусматривающий внутриклеточный сигнальный домен CD137 (4-1BB) или его вариант, где второй сигнальный домен костимулирующей молекулы содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:13.

17. Слитый белок по п. 13, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:19.

18. Слитый белок по п. 13, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:20.

19. Слитый белок по п. 13, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:23.

20. Слитый белок по п. 13, где (a) внеклеточный компонент содержит связывающий домен с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:21, и домен мультимеризации с аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:9, (b) гидрофобный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:4, и (c) внутриклеточный компонент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:5.

21. Слитый белок по п. 20, где внутриклеточный компонент дополнительно содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:13.

22. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп. 13-21.

23. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 22.

24. Вектор экспрессии по п. 23, где вектор является вирусным вектором.

25. Вектор экспрессии по п. 24, где вирусный вектор является лентивирусным или ретровирусным вектором.

26. Вектор экспрессии по п. 25, где вирусный вектор является лентивирусным вектором.

27. Вектор экспрессии для доставки молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, и нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенспецифический TCR, содержащий: (а) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок для передачи костимулирующего сигнала CD28 Т-клетке, содержащую (i) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный компонент и характеризующуюся по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:21, (b) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гидрофобный компонент и содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO:4, и (c) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую внутриклеточный компонент и характеризующуюся по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:5; и (b) нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенспецифический TCR.

28. Вектор экспрессии по п. 27, где TCR является экзогенным для клетки-хозяина.

29. Вектор экспрессии по п. 27, где TCR является специфичным к рестриктированному по HLA класса I антигену.

30. Вектор экспрессии по п. 27, где антиген представляет собой ракспецифический антиген.

31. Вектор экспрессии по п. 30, где ракспецифический антиген предусматривает WT-1, мезотелин или циклин-A1.

32. Вектор экспрессии по п. 27, дополнительно кодирующий CD47.

33. Вектор экспрессии по п. 27, дополнительно кодирующий siRNA для снижения экспрессии эндогенного рецептора, где эндогенный рецептор предусматривает SIRPα или представляет собой TCR или его часть.

34. Т-клетка, презентирующая слитый белок по любому из пп. 13-21, содержащая вектор экспрессии по п. 23, причем указанная клетка не является клеткой эмбриона человека или клеткой зародышевой линии человека.

35. Т-клетка по п. 34, где T-клетка представляет собой CD4⁺ T-клетку.

36. Т-клетка по п. 34, где T-клетка представляет собой CD8⁺ T-клетку.

37. Т-клетка, презентирующая слитый белок для передачи костимулирующего сигнала CD28 Т-клетке и для нацеливания на антиген, содержащая: (а) слитый белок для передачи костимулирующего сигнала CD28 Т-клетке, содержащий (i) внеклеточный компонент, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:21, (b) гидрофобный компонент, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, изложенной под SEQ ID NO:4, и (c) внутриклеточный компонент, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере 95% идентичностью к нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:5, где гидрофобный компонент соединяет внеклеточный и внутриклеточный компоненты; и (b) антигенный рецептор, который необязательно представляет собой антигенспецифический TCR.

38. Т-клетка по п. 37, где антигенспецифический TCR является экзогенным для клетки или хозяина.

39. Т-клетка по п. 37, где TCR связывается с комплексом антиген::HLA с высокой аффинностью.

40. Т-клетка по п. 39, где высокоаффинное связывание характеризуется значением K_a, составляющим 10⁷ M^-1 или больше.

41. Т-клетка по п. 37, где TCR является специфичным к рестриктированному по HLA класса I антигену.

42. Т-клетка по п. 37, где антиген представляет собой ракспецифический антиген.

43. Т-клетка по п. 42, где ракспецифический антиген предусматривает WT-1, мезотелин или циклин-A1.

44. Т-клетка по п. 37, где антигенный рецептор является химерным антигенным рецептором.

45. Т-клетка по п. 44, где химерный антигенный рецептор содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен, способный передавать первичный сигнал Т-клетке, и необязательно костимулирующий домен.

46. Т-клетка по п. 37, дополнительно cодержащая CD47.

47. Т-клетка по п. 37, дополнительно cодержащая siRNA для снижения экспрессии эндогенного SIRPα.

48. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту вектора экспрессии по п. 23, где раковые клетки экспрессируют CD47.

49. Способ по п. 48, где субъект является человеком.

50. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту Т-клетки по п. 34, где раковые клетки экспрессируют CD47.

51. Способ по п. 50, где субъект является человеком.