Способ получения координационного комплекса иона gd3+ с синтетическим рекомбинантным белком с целью получения контрастирующего агента для магнитно-резонансной томографии

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения прочного комплекса иона Gd³⁺ с искусственным рекомбинантным белком W4. Способ отличается тем, что очищенный белок W4 наносят на колонку с ионообменным сорбентом в соотношении от 1:0,5 до 1:2 мг на мл сорбента в буфере HEPES с концентрацией 10-20 мМ и рН 7,0-7,4, и нитрат гадолиния в концентрации 1 мМ наносят в буфере для уравновешивания колонки в соотношении 0,2 мл на мл сорбента, при этом соотношение в комплексе составляет 1:12,193±0,1102 моль Gd³⁺ на моль белка. Изобретение расширяет арсенал способов получения комплексов иона Gd³⁺ с рекомбинантными белками, пригодных для контрастирования опухолей с помощью спектроскопии парамагнитного резонанса, а также для радиотерапии опухолей по принципу термоаблации. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, диагностике опухолей, магнитно-резонансной томографии и может быть использовано для получения координационного комплекса искусственною рекомбинантного белка W4, прочно удерживающего ион Gd³⁺. Комплекс белка W4 с ионами Gd³⁺, может быть использован для получения физиологически приемлемого Cd³⁺ -содержащего агента, необходимого для контрастирования опухолей с помощью спектроскопии парамагнитного резонанса, а также для радиотерапии опухолей по принципу термоаблации.

Уровень техники

Ион гадолиния (Gd³⁺) обладает уникальными парамагнитными свойствами, которые широко используются в медицинской диагностике для визуализации новообразований, сосудистой сети, включая капилляры методом магнитно-резонансной томографии (МРТ), а также для поражения опухолевых клеток вторичным тепловым излучением по принципу термоаблации [Goischke Н.K. MRI with gadolinium-based contrast agents: practical help to ensure patient safety // J. Am. Coll.Radiol. 2016. Vol. 1546-1440(16), P. 30315-30315]. За счет изменения времени релаксации Т1 в комплексе с органическими молекулами ион Gd³⁺ существенно отличается от растворителя, что позволяет наблюдать за тонкими морфологическими деталями ткани, насыщенной контрастирующим агентом на основе иона Gd³⁺ [Dinger S.C., Fridjhon P., Rubin D.M. Thermal Excitation of Gadolinium-Based Contrast Agents Using Spin Resonance //PLoSOne. 2016. Vol. 11(6), P. e0158194]. Использование иона Gd³⁺в качестве контрастирующего агента для МРТ осложнено тем, что он обладает высокой токсичностью для животных и человека. Однако, эта токсичность может быть подавлена за счет введения его в прочные координационные комплексы с различными мономерными и полимерными органическими соединениями, в частности, описанные в патентах WO 0071526, RU 2388762 С2, RU 2388762 и RU 2649402.

Из уровня техники известен способ получения полностью искусственного Gd³⁺-связывающего белка W4, описанный в патенте РФ № RU 2713792. Белок W4 содержит пептид F3, обладающий сродством к нуклеолину - перспективному поверхностному маркеру многих быстрорастущих опухолей, что обеспечивает высокую избирательность доставки Gd³⁺ в опухолевые клетки, а также основной Gd³⁺ связывающий блок гетероповторов состава Е2-М-Е4-М-Е2, где Е - эластиноподобный пептид, а М - N-концевой кальций-связывающий мотив кальмодулина человека. В патенте описан способ очистки белка W4, использующий методы ионообменной хроматографии и принцип осаждения избирательного белка в присутствии ионов Са²⁺, Gd³⁺ и гидрофильного хелатирующего агента ЭДТА. Однако, практическое применение белка W4 в качестве контрастирующего агента требует формирования устойчивого комплекса с ионами Gd³⁺. В прототипном изобретении описание способа получения белка W4 с ионами Gd³⁺ отсутствует. Между тем, простое смешивание нитрата Gd³⁺ с белком W4 в эквимолярньгх соотношениях не приводит к образованию пригодного к использованию продукта (контрастирующего агента для МРТ), так как при нейтральных и щелочных значениях рН наряду с прочным (координационным) комплексом W4 образуется слабый (солевой) комплекс, в котором ион Gd³⁺ сохраняет токсичность. При кислых значениях рН (ниже 6,8) слабый (солевой) комплекс белка W4 с ионом Gd практически не образуется, но белок утрачивает растворимость в воде и выпадает в осадок, что не позволяет осуществлять его внутривенное введение в качестве контрастирующего агента.

Таким образом, научно-технической задачей, решаемой в ходе осуществления изобретения, является разработка способа, позволяющего с высоким выходом получать растворимый в воде прочный комплекс белка W4 с ионом Gd³⁺, не обладающий токсичностью и пригодный для использования в качестве контрастирующего агента для МРТ.

Осуществление изобретения

Для наработки белка W4 используют штамм-продуцент, получаемый химической трансформацией клеток Е. coli BL21 (DE3) плазмидной ДНК pW4. Очистку белка до гомогенного состояния проводят с использованием колоночной ионнобменной хроматографии и способами бесколоночного фракционирования, как описано в патенте РФ № RU 2713792. Концентрацию очищенного белка W4 в растворе определяют, используя метод Бредфорд с помощью набора Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США), как описано в работе [Bradford, М.М. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254]. Для построения калибровочного графика используют бычий сывороточный альбумин, входящий в состав набора Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США), в концентрациях 25, 50, 100, 250, 500, 1000 мкг/мл. Измерение А595 в ходе построения калибровочного графика и при определении концентрации белка W4 производят в плоскодонных иммунологических планшетах Costar, США (каталожный № 2240096) с помощью планшетного спектрофотометра Униплан (ЗАО Пикон, Россия). Образцы белка W4 вносят в реакционную смесь без разведения в объеме 5 мкл.

Для проведения процедуры сорбции белка на колонку готовят два концентрированных раствора 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES) в концентрации 1 М, используя в качестве растворителя стерильную апирогенную деионизованную воду. рН концентрированных растворов доводят до 7,0 и до 7,4, соответственно, с помощью 1 М NaOH. Далее три аликвоты белка W4, каждая из которых содержит 17,5 мг общего белка, разводят (1) в 17,5 мл буфера HEPES 10 мМ, рН 7,0; (2) в 17,5 мл буфера HEPES 20 мМ, рН 7,0; (3) (1) в 17,5 мл буфера HEPES 10 мМ, рН7,4.

Девять самотечных колонок (Disposable Gravity Flow Columns, 6 mL, with 20 um frits, Marvelgent Biosciences Inc.), содержащих no 5 мл ионообменного сорбента DEAE-сефароза (Pharmacia) уравновешивают буферами следующего состава: 1, 2 и 3 - HEPES 10 мМ, рН 7,0; 4, 5 и 6 - HEPES 20 мМ, рН 7,0; 7, 8 и 9 - HEPES 10 мМ, рН 7,4.

На колонку 1 наносят 10 мл аликвоты 1 белка W4, на колонку 2-5 мл аликвоты 1 белка W4, на колонку 3-2,5 мл аликвоты 1 белка W4.

На колонку 4 наносят 10 мл аликвоты 2 белка W4, на колонку 5-5 мл аликвоты 2 белка W4, на колонку 6-2,5 мл аликвоты 1 белка W4.

На колонку 7 наносят 10 мл аликвоты 3 белка W4, на колонку 8-5 мл аликвоты 3 белка W4, на колонку 9-2,5 мл аликвоты 3 белка W4.

Колонки 1, 2 и 3 с нанесенным белком W4 промывают 10 мл буфера состава HEPES 10 мМ рН 7,0. Колонки 4, 5 и 6 с нанесенным белком W4 промывают 10 мл буфера состава HEPES 20 мМ рН 7,0. Колонки 7, 8 и 9 с нанесенным белком W4 промывают 10 мл буфера состава HEPES 10 мМ рН 7,4.

Концентрированный раствор нитрата гадолиния (Acros Organics BVBA, США) в концентрации 1 М (157,2 г/л) готовят на деионизованной воде. Раствор для нанесения нитрата гадолиния на колонку получают на деионизованной воде, смешивая концентрированные растворы HEPES и нитрата гадолиния таким образом, чтобы в рабочем растворе концентрация HEPES составила 10 мМ, рН 7,0 для колонок 1, 2 и 3; 20 мМ, рН 7,0 для колонок 4, 5 и 6, 10 мМ, рН 7,4 для колонок 7, 8 и 9, а нитрата гадолиния - 1 мМ. Полученный раствор в объеме 1 мл наносят на колонки 1-9 с сорбированным белком W4.

Колонки 1, 2 и 3 с нанесенным нитратом гадолиния промывают 50 мл буфера состава HEPES 10 мМ рН 7,0; колонки 4, 5 и 6-50 мл буфера состава HEPES 20 мМ рН 7,0; колонки 7, 8 и 9-50 мл буфера состава HEPES 10 мМ рН 7,4. В момент завершения промывки колонки отбирают аликвоту объемом 1 мл для определения следов гадолиния.

Десорбцию комплекса белка W4 с ионом Gd³⁺ осуществляют 15 мл буфера состава HEPES 10 мМ рН 7,0, 0,5 М NaCl, собирая фракции по 500 мкл. Затем определяют А₄₈₈ каждой фракции на спектрофотометре Сагу 50 (Agilent, США) и объединяют фракции, А₄₈₈ которых равно или превышает 0,05. В собранной объединенной фракции объемом 2,5 мл определяют общее содержание белка по методу Бредфорд с использованием набора Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США) и калибровочной кривой, построенной с использованием сывороточного альбумина, входящего в состав набора Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США), в концентрациях 25, 50, 100, 250, 500, 1000 мкг/мл. Измерение А₅₉₅ в ходе построения калибровочного графика и при определении концентрации белка W4 производят в плоскодонных иммунологических планшетах Costar, США (каталожный №2240096) с помощью планшетного спектрофотометра Униплан (ЗАО Пикон, Россия). Образцы комплекса белка W4 с ионом Gd³⁺ вносят в реакционную смесь без разведения в объеме 5 мкл.

Для определения содержания иона Gd³⁺в образцах комплекса белка W4 с ионом Gd³⁺ используют метод атомной эмиссионной спектрофотометрии с применением установки Agilent 4200 MP-AES (Agilent, США). Для построения калибровочной кривой готовят растворы Gd(NO₃)₃ с концентрацией 5, 10, 15 и 20×10^-7% (по гадолинию), что эквивалентно 0,318, 0,636, 0,954 и 1,272×10^-7 М, используя стандартный раствор Gd(NO₃)₃ с концентрацией 1 мг/мл (0,006359 М по Gd³⁺) (Acros Organics BVBA, США) в 2% (об/об) азотной кислоте квалификации «Для атомной эмиссионной спектрофотометрии» (Merck, США). Для определения фонового поглощения готовят 2% водный раствор той же азотной кислоты.

Для проведения анализа на содержание иона Gd³⁺ отбирают 10 мкл раствора комплекса, элюированного с ионообменного сорбента (содержит 20 мкг белка), разводят деионизованной водой в 10000 раз, используя промежуточные серийные разведения в 100 раз, и выполняют определение на установке Agilent 4200 MP-AES.

С помощью калибровочной кривой устанавливают содержание Gd³⁺ в каждом образце и вычисляют молярное соотношение расчете на моль белка W4 в зависимости от условий получения комплекса. К анализу допускают образцы только с тех колонок, содержание иона Gd³⁺ в последней аликвотс объемом 1 мл, полученной при промывке колонки, не превышает 1 мкм.

Результаты определения представляют в виде Таблицы 1.

Способ получения прочного комплекса иона Gd³⁺ с искусственным рекомбинантным белком W4, отличающийся тем, что очищенный белок наносят на колонку с ионообменным сорбентом в соотношении от 1:0,5 до 1:2 мг на мл сорбента в буфере HEPES с концентрацией 10-20 мМ и рН 7,0-7,4, нитрат гадолиния в концентрации 1 мМ наносят в буфере для уравновешивания колонки в соотношении 0,2 мл на мл сорбента, при этом соотношение в комплексе составляет 1:12,19±0,11 моль Gd³⁺ на моль белка.