Аналитическая система для диагностики рака лёгкого при помощи свободных и ассоциированных с клетками крови циркулирующих микрорнк

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к молекулярно-генетической диагностике. Предложены способ и аналитическая система для диагностики рака легкого, включающие праймеры и TaqMan-зонды к последовательностям из 7 комбинаций 10 микроРНК: miR-107/miR-222-3p, miR-19b-3p/miR-484, miR-150-5p/miR-144-5p, miR-484/miR-374a-5p, miR-484/miR-324-5p, miR-22-5p/miR-324-5p, miR-374a-5p/miR-133b. Предложенная группа изобретений обеспечивает разработку способа дифференциальной диагностики злокачественных опухолей легкого со 100% чувствительностью, специфичностью и точностью. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 8 табл., 30 пр.

 

Изобретение относится к области диагностической медицины, а именно к молекулярно-генетической диагностике, и направлено на разработку способа неинвазивной диагностики злокачественных новообразований лёгкого, а также мониторинга эффективности противораковой терапии.

По заболеваемости рак легкого (РЛ) занимает 1-е место среди других злокачественных опухолей у мужчин в России, а по смертности - 1-е место среди мужчин и женщин как в России, так и в мире. В России в 2018 г. раком легкого заболели 48307человек. От рака лёгкого ежегодно умирает больше больных, чем от рака простаты, молочной железы и толстой кишки вместе взятых [Министерство здравоохранения РФ. Клинические рекомендации. Рак лёгкого. 2018 г.]. Именно поэтому своевременная диагностика онкологических заболеваний лёгкого и рецидивов опухолевого процесса являются важной проблемой современной онкологии.

Современные инструментальные подходы к диагностике рака легкого включают в себя рентгенографические методы (флюорография и компьютерная томография), томографические и ультразвуковые исследования, гистопатологические исследования фрагментов опухоли, полученных при помощи трансторакальной пункции или оперативного вмешательства, и образцов мокроты, забранных при помощи бронхоскопии [Vansteenkiste J, De Ruysscher D, Eberhardt WE, Lim E, Senan S, Felip E, Peters S. Early and locally advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC): ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2013;24 Suppl 6:vi89-98]. Тем не менее существующих подходов часто бывает недостаточно, для того, чтобы своевременно выявить опухоль, диагностировать тип заболевания и определить оптимальный курс терапии. Лишь в малой части случаев (15%), диагноз РЛ ставится на ранней стадии, а более половины пациентов (56%) на момент диагноза имеют отдаленные метастазы и прогноз их выживаемости существенно хуже (5-летняя выживаемость 4% против 54% на ранней стадии) [National Cancer Institute Data, https://seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb.html, данные на 19.05.2015]. Даже в лучшем случае выявление и диагностику рака лёгкого дополнительно осложняет позднее проявление заболевания, сходство симптоматических рядов с другими заболеваниями легкого, высокая внутренняя гетерогенность опухолей и сложная система гистологической классификации РЛ. Вкупе с высокой агрессивностью РЛ это может приводить к тому, что первичный выбор терапевтической стратегии оказывается малоэффективным и у пациента не остается времени на поиск альтернативных подходов [Thomas A, Liu SV, Subramaniam DS, Giaccone G. Refining the treatment of NSCLC according to histological and molecular subtypes. Nat Rev Clin Oncol. 2015;12(9):511-526].

Разработка малоинвацивной диагностики рака лёгкого, основанной на анализе циркулирующих в крови микроРНК является одним из трендов развития современной онкодиагностики [Wu KL, Tsai YM, Lien CT, Kuo PL, Hung AJ. The Roles of MicroRNA in Lung Cancer. Int J Mol Sci. 2019;20(7):1611]. МикроРНК, представляют собой класс коротких некодирующих РНК (19-24 п.н.), которые играют важную роль в регуляции клеточного цикла и апоптоза, пролиферации и дифференцировки клеток, миграции, реакции на стресс и т.д. Предполагается, что микроРНК могут контролировать экспрессию до 50% генов человека [Almeida M, Reis R, Calin G. MicroRNA history: Discovery, recent applications, and next frontiers. Mutat. Res. Fundam. Mol. Mech. Mutagen. 2011;717(1–2):1–8]. Показано, что микроРНК опухолевых клеток могут попадать во внеклеточное пространство и в биологические жидкости организма, что позволяет без использования биопсии определять фенотип опухолевой ткани на основании исследования внеклеточных микроРНК [Skog J, Wurdinger T, van Rijn S, Meijer D, Gainche L, Sena-Esteves M, Curry W, Carter B, Krichevsky A, Breakefield X. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 2008;10:1470-1476]. Тем не менее исследования последнего десятилетия показали, что определение концентрации одной или нескольких микроРНК недостаточно для диагностики онкологических заболеваний. Для разработки эффективных диагностических тестов необходим комплексный анализ достаточного количества маркеров, необходимого для устойчивой работы диагностической системы.

Известен способ диагностики немелкоклеточного рака лёгкого на основании анализа экспрессии четырех микроРНК (miR-182, miR-183, miR-210, miR-126) при помощи Taqman ОТ-ПЦР в сыворотке крови [Zhu W.Y. et al. Diagnostic Value of Serum miR-182, miR-183, miR-210, and miR-126 levels in patients with early-stage non-small cell lung cancer. PLoS One. 2016;11(4):e0153046.]. Повышение экспрессии miR-182, miR-183, miR-210 и понижение экспрессии miR-126 служило диагностическим критерием РЛ, их использование в комбинации с карциноэмбриональным антигеном позволяло выявлять больных НМКЛ I стадии с чувствительностью 81.3% при абсолютной специфичности.

Известен способ диагностики немелкоклеточного рака лёгкого на основании анализа экспрессии 10 микроРНК (miR-20a, miR-24, miR-145, miR-152, miR-199a-5p, miR-221, miR-222, miR-223, miR-320) в сыворотке крови, который позволил дифференцировать больных РЛ от здоровых доноров с чувствительностью 92.5% и специфичностью 90% [Chen X. et al., Identification of ten serum microRNAs from a genome-wide serum microRNA expression profile as novel noninvasive biomarkers for nonsmall cell lung cancer diagnosis. Int. J. Cancer. 2012;130(7):1620–1628].

Известен способ диагностики немелкоклеточного рака лёгкого на основании анализа экспрессии четырех микроРНК (miR-126, miR-145, miR-210, miR-205-5p) позволившего выявить РЛ с чувствительностью 91.5% и специфичностью 96.2% [Leng Q, Lin Y, Jiang F, Lee C, Zhan M, Fang H, Wang Y, Jiang F. A plasma miRNA signature for lung cancer early detection. Oncotarget. 2017;8(67):111902-111911].

Недостатком вышеперечисленных способов является содержание в выделенных образцах микроРНК (перед постановкой ОТ-ПЦР) балластной клеточной микроРНК в связи с использованием сыворотки крови (а не плазмы). Кроме того, данные были получены на маленькой выборке и не были верифицированы в дальнейших исследованиях (поскольку нет основанных на этих данных диагностических систем).

Наиболее близким решением к заявляемому способу - прототипом является способ диагностики рака лёгкого при помощи количественной ОТ-ПЦР в плазме крови с использованием четырёх панелей отношений микроРНК [Boeri M. et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. 2011;108(9):3713–3718], позволяющих определить пациентов с риском развития РЛ (16 отношений: 106a/451, 142-3p/92a, 17/451, 30b/92a, 30c/660, 15b/92a, 142-3p/660, 19b/660, 221/660, 197/451, 140-5p/92a, 30c/451, 140-5p/451, 28-3p/660, 140-5p/320, 140-5p/660), с диагнозом РЛ (16 отношений: 21/92a, 140-3p/17, 106a/140-3p, 140-5p/660, 19b/660, 19b/451, 17/30c, 106a/30c, 19b/92a, 15b/92a, 28-3p/92a, 28-3p/660, 17/486-5p, 15b/660, 106a/486-5p, 17/451), с риском развития агрессивной формы РЛ (10 отношений: 28-3p/660, 28-3p/451, 197/660, 106a/660, 221/660, 28-3p/486-5p, 197/486-5p, 221/451, 140-5p/486-5p, 16/197) и с агрессивной формой РЛ (10 отношений: 106a/486-5p, 28-3p/486-5p, 126/486-5p, 21/486-5p, 15b/486-5p, 197/486-5p, 221/486-5p, 17/486-5p, 148a/486-5p, 142-3p/486-5p). Метод парных отношений - значение экспрессии каждой микроРНК сравнивали со значениями экспрессии каждой из оставшихся микроРНК был использован для нормализации данных. Использование сигнатуры риска позволило дифференцировать пациентов на доклинической стадии с чувствительностью 80% и специфичностью 90%, а уровень микроРНК в сигнатуре диагноза выявил больных РЛ с чувствительностью 75% и специфичностью 100%.

Основным недостатком известного способа является использование только свободных циркулирующих микроРНК плазмы крови. Дополнительным недостатком является приготовление плазмы крови путём двойного центрифугирования при довольно высокой скорости - 1258g, что может приводить к «загрязнению» образца балластной микроРНК из клеток крови.

Задачей изобретения является создание высокоточного теста для диагностики рака лёгкого, а также мониторинга проводимой терапии с возможностью исполнения в клиниках разного уровня оснащённости оборудованием и квалифицированным персоналом, что позволяет в будущем перейти к персонализированной медицине и высокотехнологичному здравоохранению.

Техническим результатом является разработка способа дифференциальной диагностики злокачественных опухолей лёгкого со 100% чувствительностью, специфичностью и точностью, достигаемых путем анализа парных отношений экспрессии циркулирующих в крови микроРНК в пулах свободно циркулирующих и суммарных (свободных и связанных с поверхностью клеток крови) микроРНК при помощи ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) в режиме реального времени.

Технический результат достигается предлагаемым способом, при котором используют образцы крови от пациента, с предположительно поражением раком тканей лёгких, циркулирующие микроРНК плазмы крови и микроРНК суммарного пула крови, содержащего микроРНК плазмы и микроРНК, связанные с клеточной поверхностью, получают с использованием простого, быстрого и воспроизводимого способа, описанного в патенте RU 2554746, а именно при получении суммарного пула внеклеточных нуклеиновых кислот, перед разделением исследуемой крови на фракции, к образцу крови добавляют равный объем элюирующего буфера (DDB), содержащего 1 М NaCl, 0,2 М NaHCO3 (pH 9,3), 20 мМ ЭДТА или буфера, содержащего 1 М NaCl, 20 мМ ЭДТА, полученную смесь инкубируют, с последующим выделением циркулирующих микроРНК на стекловолокнистых сорбентах при помощи набора «Blood miRNA isolation Kit» (BioSilica Ltd, Россия) [E.A. Lekchnov, I.A. Zaporozhchenko, E.S. Morozkin, O.E. Bryzgunova, V.V. Vlassov, P.P. Laktionov. Protocol for miRNA isolation from biofluids. Anal Biochem. 2016;499:78-84]. Далее анализируют уровни экспрессии микроРНК методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием 10 пар микроРНК - комбинаций праймеров и TaqMan-зондов, специфичных к последовательностям 14 микроРНК (в качестве основного анализа):

miR-22-3p/miR-210

miR-107/miR-222-3p

miR-19b-3p/miR-484

miR-150-5p/miR-144-5p

miR-484/miR-374a-5p

miR-484/miR-338-3p

miR-484/miR-324-5p

let-7i-5p/miR-222-3p

miR-22-5p/miR-324-5p

miR-374a-5p/miR-133b.

При этом возможно увеличить диагностическую точность системы, с помощью исследования уровня экспрессии дополнительных 10 микроРНК (в качестве дополнительного анализа).

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:

- позволяет увеличить количество получаемой диагностической информации благодаря использованию пулов как свободных, так и связанных с поверхностью клеток крови, циркулирующих микроРНК;

- позволяет выявлять функционально-значимые для диагностики микроРНК, изменения уровня экспрессии которых принципиально для развития РЛ.

Кроме того, предлагаемый способ диагностики позволяет снизить стоимость диагностической части анализа за счет исследования уровня экспрессии 10 пар микроРНК (14 микроРНК), а не 16, как описано в прототипе.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Предлагаемые способы диагностики были апробированы на образцах крови здоровых доноров (ЗД) (n = 20), больных эндобронхитом (ЭБ) (n = 10) и пациентов со злокачественными опухолями лёгких (n = 30: немелкоклеточный РЛ (НМРЛ), плоскоклеточный РЛ (ПКРЛ), аденокарцинома лёгкого (АКЛ)) на различных стадиях заболевания. Все образцы получены из ФГБУ НМИЦ имени академика Е.Н. Мешалкина. Клинические показатели доноров указаны в таблице 1.

Таблица 1. Демографические и клинико-патологические характеристики доноров крови

	Больные раком лёгкого (n=30)	Здоровые доноры (n=20)	Больные эндобронхитом (n=10)
Возраст
Среднее±SD	62.2±5.5	54.3±8.6	61.0±5.4
Размах	55-78	42-67	57-71
Пол
муж.	28	18	10
жен.	2	2
Некурящие	2	3
Стадия РЛ
I	2
II (А, В)	14
III (А, В)	14
Гистотип
НМКЛ	30
ПКРЛ	28
АКЛ	2

Кровь от каждого донора собирают в два вакутейнера объёмом 9 мл, содержащие K₃EDTA. Кровь из одного вакутейнера используют для получения плазмы, для этого её центрифугируют при 400g при комнатной температуре 20 мин, далее переносят плазму в новую пробирку и дополнительно центрифугируют при комнатной температуре при 800g 20 мин. К крови из второго вакутейнера добавляют равный объем буфера DDB [аналогично описанному в патенте RU2554746] и, после 5 минут инкубации, центрифугируют образец при 400g при комнатной температуре 20 мин, далее переносят супернатант в новую пробирку и дополнительно центрифугируют его при 800g при комнатной температуре 20 мин. Затем 1.2 мл полученного супернатанта крови и 0.6 мл плазмы крови от здоровых доноров или больных пациентов используют для выделения суммарной циркулирующей микроРНК крови и свободной циркулирующей микроРНК плазмы крови с помощью набора для выделения микроРНК из крови (BioSilica, Россия).

МикроРНК выделяют и осаждают способом, описанным в статье «Protocol for miRNA isolation from biofluids» Anal Biochem. 2016;499:78-84, E.A. Lekchnov, I.A. Zaporozhchenko, E.S. Morozkin, O.E. Bryzgunova, V.V. Vlassov, P.P. Laktionov. Все расчеты приведены для 0.6 мл образца (плазмы крови), в случае выделения микроРНК из супернатанта крови, объем всех используемых компонентов до стадии нанесения на колонку необходимо увеличить в два раза и, соответственно, в итоге нанести на колонку в два раза больше смеси. Вначале к 0.6 мл образца последовательно добавляют 18.2 мкл 100% 2-меркаптоэтанола, 400 мкл 6.75М Gu, и 600 мкл 3.75% раствора октановой кислоты в 2М растворе ацетата натрия, pH 4.0, до конечных концентраций 1%, 1.35М и 1.5% соответственно, и инкубируют 3 минуты при комнатной температуре. Затем добавляют 1600 мкл 96% этанола, перемешивают и центрифугируют образец при 13000g в течение 3 минут, а затем наносят полученный супернатант на микроколонку производства «Биосилика» с использованием вакуумного насоса. Далее все этапы выполняют одинаково вне зависимости от первоначального объема образца, а именно, в колонку вносят 600 мкл буфера для промывки №1 (0.5 М Gu, 10 мM Трис-ацетат (pH 6.5), 50% этанол), центрифугируют на центрифуге Biofuge pico heraeus при 13000 об/мин в течение 1 минуты. После этого в колонку вносят 700 мкл буфера для промывки №2 (10 мM Tris-HCl (pH 7.5) 0.1 M NaCl, 75% этанол), центрифугируют при 13000 об/мин в течение 1 минуты. Затем переносят колонку в новую пробирку и добавляют в неё 120 мкл буфера для элюции производства «Биосилика» и инкубируют 5 минут при комнатной температуре. После этого центрифугируют при 2000 g в течение 1 минуты, с последующим центрифугированием при 13000g в течение 1 минуты. Далее колонку убирают и к полученному раствору последовательно добавляют с тщательным перемешиванием 1.5 мкл гликогена, 12 мкл 3М натрия ацетата (pH 7.4) и 130 мкл изопропанола. Полученный раствор инкубируют 30 минут при -20°С, после чего центрифугируют при 13000g, 4°С в течение 15 минут. Супернатант удаляют на фильтровальную бумагу, контролируя положение осадка на дне пробирки. К осадку добавляют 300 мкл 70% этанола, центрифугируют в течение 5 минут при 7500g и при 4°С. Супернатант удаляют на фильтровальную бумагу, контролируя положение осадка на дне пробирки. В пробирку добавляют 300 мкл 96% этанола, центрифугируют при 7500g в течение 5 минут при 4°С. Супернатант удаляют на фильтровальную бумагу, контролируя положение осадка. Сушат осадок в течение 20 мин при комнатной температуре. Сухой осадок тщательно растворяют пипетированием в 30 мкл воды и хранят при -20°С.

После выделения и осаждения микроРНК растворяют в 30 мкл воды. Концентрацию микроРНК в препаратах определяли при помощи количественной TaqMan-ПЦР после обратной транскрипции с использованием петлевых праймеров, как описано в работе Chen C. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2005;33(20):e179. Нуклеотидные последовательности праймеров для 14 микроРНК для проведения обратной транскрипции представлены в таблице 2А и в таблице 2Б для дополнительных 10 микроРНК (в качестве дополнительного анализа).

Каждая реакция обратной транскрипции объемом 20 мкл содержит 7 мкл препарата РНК, 50 нМ каждого специфичного ОТ-праймера, 1 ед. акт. ингибитора рибонуклеаз RiboLock, 100 ед. акт. обратной транскриптазы вируса лейкоза мышей M-MLV-RT, 4 мкл 5-ти кратного буфера (250 мМ трис-HCl, pH 8.3 при 25°C, 250 мМ KCl, 20 мМ MgCl₂, 50 мМ ДТТ), 0.25 мМ каждого нуклеотид трифосфата. Реакцию проводят в термоциклере TProfessional в следующих условиях: 16°C – 30 мин, 42°C – 30 мин, 70°C – 10 мин. Полученные препараты кДНК хранят при 4°C не более 1 ч.

Количественную TaqMan-ПЦР в реальном времени проводят в общем объеме 30 мкл, содержащем 2.5 мкл кДНК, 1.25 ед. акт. Taq ДНК полимеразы, 3 мкл 10х ПЦР буфера (750 мМ трис-HCl, pH 8.8 при 25°C, 200 мМ (NH₄)₂SO₄, 0.1% (v/v) Tween-20), 4 мМ MgCl₂, 0.25 мМ каждого нуклеотид трифосфата, 600 нМ микроРНК-специфичного прямого праймера, 800 нМ универсального обратного праймера и 300 нM специфического TaqMan-зонда. После прогревания реакционной смеси 95°C, 3 мин, проводят 50 циклов: 95°C – 15 сек; 60°C – 60 сек. Реакции проводили в амплификаторе iCycler iQ5. Значения порогового цикла (Cq) вычисляли при помощи программного обеспечения производителя прибора как точку пересечения кривой амплификации с уровнем фона.

Таблица 2А. Последовательности праймеров и зондов для обратной транскрипции и количественной TaqMan-ПЦР в режиме реального времени

Все микроРНК	УП: 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’
miR-22-3p	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC ACAGTT-3’ ПП: 5’-AAGCTGCCAGTTGAAG-3’ З: 5’-(FAM)-GCACTGGATACGACACAGTT–( FQ)-3’
miR-22-5p	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAAAGC-3’ ПП: 5’-GTCCAGTTCTTCAGTGGCAA-3’ З: 5’-(FAM)-TCGCACTGGATACGACTAAAGC–(BHQ1)-3’
miR-210	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGCC-3’ ПП: 5'-ACTACTGTGCGTGTGAC-3' З: 5’-(FAM)-GCACTGGATACGACTCAGCC-(FQ)-3’
miR-19b-3p	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGTT-3’ ПП: 5’-CGCTGTGCAAATCCATGCAA-3’ З: 5’-(FAM)-GCACTGGATACGACTCAGTT-(FQ)-3’
miR-107	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGATAGC-3’ ПП: 5’-CACGTAGCAGCATTGTACAG-3’ З: 5’-(FAM)-GCACTGGATACGACTGATAGC-(FQ)-3’
miR-222-3p	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCAG-3’ ПП: 5'-CCAGCTACATCTGGCTA-3' З: 5’-(FAM)-CACTGGATACGACACCCAG -(FQ)-3’
miR-484	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATCGGG-3’ ПП: 5’-TCAGGCTCAGTCCCCT-3’ З: 5’-(FAM)-GCACTGGATACGACATCGGG-(FQ)-3’
miR-150-5p	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACTGG-3’ ПП: 5’-TCTCCCAACCCTTGTAC-3’ З: 5’-(FAM)-GCACTGGATACGACCACTGG-(FQ)-3’
miR-144-5p	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTTACA-3’ ПП: 5’-CGGATATCATCATATACTGT-3’ З: 5’-(FAM)-CGCACTGGATACGACCTTACA-(FQ)-3’
miR-374a-5p	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACTTAT-3’ ПП: 5’-GTTATAATACAACCTGATAAG-3’; З: 5’-(FAM)-TCGCACTGGATACGACCACTT-(FQ)-3’
miR-338-3p	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAACAAA-3’ ПП: 5’-GACTCCAGCATCAGTGA-3’ З: 5’-(FAM)-CGCACTGGATACGACCAACAA-(FQ)-3’
miR-324-5p	ОТ: 5’- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACCA-3’ ПП: 5’-GCATCCCCTAGGGCA-3’ З: 5’-(FAM)- CGCACTGGATACGACACACCA-(FQ)-3’
miR-133b	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAGCTG-3 ПП: 5’-TGACTTTGGTCCCCTTC-3’ З: 5’-(FAM)-TCGCACTGGATACGACTAGCTG-(BHQ1)-3’
let-7i-5p	ОТ: 5’- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACAGC-3’ ПП: 5’-GTGAGGTAGTAGTTTGTG-3’ З: 5’-(FAM)- CGCACTGGATACGACAACAGC-(FQ)-3’

ОТ - петлевой праймер для обратной транскрипции

ПП - специфический прямой праймер для ПЦР в реальном времени

УП - универсальный обратный праймер для ПЦР в реальном времени

З - зонд для ПЦР в реальном времени

Таблица 2Б. Дополнительная панель микроРНК, последовательности праймеров и зондов для обратной транскрипции и количественной TaqMan-ПЦР в режиме реального времени

Все микроРНК	УП: 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’
miR-92a	ОТ: 5’- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGGC-3’ ПП: 5’-CGCTATTGCACTTGTCCCG-3’ З: 5’-(FAM)-CGCACTGGATACGACACAGGC-(BHQ)-3’
miR-378-3р	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCCTTC-3’ ПП: 5’-GACTGGACTTGGAGTCA-3’ З: 5’-(FAM)-CGCACTGGATACGACAAAGTC-(BHQ)-3’
miR-425-5р	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACG-3’ ПП: 5’-TAATGACACGATCACTCC-3’ З: 5’-(FAM)-CGCACTGGATACGACTCAACG-(BHQ)-3’
miR-30e	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTTCCA-3’ ПП: 5’-GCCCTGTAAACATCCTTGAC-3’ З: 5’-(FAM)-GCACTGGATACGACCTTCCA-(BHQ)-3’
miR-31-5р	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTAT-3’ ПП: 5’-CAGGCAAGATGCTGGCA-3’ З: 5’-(FAM)-TCGCACTGGATACGACAGCTAT-(BHQ)-3’
miR-125b-5р	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAA-3’ ПП: 5’-CGTCCCTGAGACCCTAACTT-3’ З: 5’-(FAM)-GCACTGGATACGACTCACAA-(BHQ)-3’
miR-200b-3р	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATCA-3’ ПП: 5’-GTAATACTGCCTGGTAATG-3’ З: 5’-(FAM)-CGCACTGGATACGACTCATCA-(BHQ)-3’
miR-205-5р	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGACT-3’ ПП: 5’-CCTCCTTCATTCCACCGGA-3’ З: 5’-(FAM)-GCACTGGATACGACCAGACT-(BHQ)-3’
miR-375	ОТ: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACGC-3‘ ПП: 5'-GCCCTTTGTTCGTTCGGCTC-3' З: 5’-(FAM)-TCGCACTGGATACGACTCACGC-(BHQ)-3’
miR-660	ОТ 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAACTC-3’ ПП: 5’-CCCATTGCATATCGGAG-3’ З: 5’-(FAM)-GCACTGGATACGACCAACTC-(BHQ)-3’

После проведения всех вышеописанных реакций (для основного анализа и для дополнительного) три исследуемые группы доноров разделены между собой со 100% чувствительностью и специфичностью (Таблицы 3-8).

Таблица 3. Пример использования данных об изменении экспрессии микроРНК в пуле свободно циркулирующих микроРНК плазмы крови для идентификации пациентов с РЛ

№ пациента	Диагноз	Номер аналитической системы
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
miR-22-3p/miR-210 значение отношения ≤-5.2	miR-107/miR-222-3p значение отношения ≥1.5	miR-19b-3p/miR-484 значение отношения ≤-6.1	miR-150-5p/miR-144-5p значение отношения ≤-2.5	miR-484/miR-374a-5p значение отношения ≥2.5	miR-484/miR-338-3p значение отношения ≤-3	miR-484/miR-324-5p значение отношения ≥-3	let-7i-5p/miR-222-3p значение отношения ≤-5.1	miR-22-5p/miR-324-5p значение отношения ≥-1.7	miR-374a-5p/miR-133b значение отношения ≤-1
1	РЛ		+	-	+	+		+		+	+
2	РЛ		-	-	+	+		+		-	+
3	РЛ		-	+	+	-		+		-	+
4	РЛ		-	-	-	-		-		-	-
5	РЛ		+	-	+	+		+		+	+
6	РЛ		+	+	-	+		+		-	+
7	РЛ		+	+	+	+		+		-	+
8	РЛ		-	-	+	+		+		-	+
9	РЛ		-	-	-	+		+		-	+
10	РЛ		-	-	-	+		+		+	-
11	РЛ		-	-	+	+		+		-	+
12	РЛ		-	+	+	+		+		-	+
13	РЛ		+	+	+	-		+		-	+
14	РЛ		+	-	+	+		+		+	+
15	РЛ		+	-	-	+		+		-	-
16	РЛ		+	-	-	+		+		-	+
17	РЛ		+	-	-	-		+		+	+
18	РЛ		+	-	-	-		-		+	+
19	РЛ		-	-	-	+		+		-	+
20	РЛ		+	+	+	-		-		-	+
21	РЛ		+	-	-	-		-		+	+
22	РЛ		-	+	+	+		+		+	+
23	РЛ		-	-	-	-		-		-	-
24	РЛ		+	-	+	+		+		-	+
25	РЛ		+	-	+	+		-		-	+
26	РЛ		+	+	+	-		+		+	+
27	РЛ		-	-	-	-		-		-	-
28	РЛ		+	+	+	+		+		+	+
29	РЛ		+	+	+	-		+		-	+
30	РЛ		+	-	+	-		+		-	+
1	ЭБ	+
2	ЭБ	+
3	ЭБ	+
4	ЭБ	-
5	ЭБ	+
6	ЭБ	+
7	ЭБ	+
8	ЭБ	+
9	ЭБ	-
10	ЭБ	-
1	ЗД						+		+
2	ЗД						+		+
3	ЗД						+		-
4	ЗД						-		+
5	ЗД						-		+
6	ЗД						+		+
7	ЗД						-		+
8	ЗД						-		-
9	ЗД						+		-
10	ЗД						+		+
11	ЗД						+		+
12	ЗД						-		+
13	ЗД						+		-
14	ЗД						-		+
15	ЗД						-		+
16	ЗД						-		+
17	ЗД						+		+
18	ЗД						+		+
19	ЗД						-		+
20	ЗД						-		+

У каждой аналитической системы специфичность составила 100%. Чувствительность первой -70%, второй, четвёртой и пятой систем – 60%, третьей и девятой – 33%, шестой – 50%, седьмой – 77%, восьмой – 80% и десятой – 83% (таблица 3).

Таким образом, число используемых комбинаций отношений микроРНК при анализе свободно циркулирующей микроРНК в плазме крови составило:

- Для идентификации группы больных РЛ (т.е. отделения пациентов с РЛ от всех остальных (ЭБ+ЗД)) необходимо выполнить анализ семи из 10 комбинаций, позволяющих отделить пациентов с РЛ от всех остальных с 90% чувствительностью при 100% специфичности.

- Для идентификации группы больных ЭБ (т.е. отделения пациентов с ЭБ от всех остальных (РЛ+ЗД)) необходимо выполнить анализ 1 из 10 комбинаций, позволяющих отделить пациентов с ЭБ от всех остальных с 70% чувствительностью при 100% специфичности.

- Для идентификации группы здоровых доноров (т.е. отделения ЗД от пациентов с РЛ и ЭБ (ЭБ+ЗД)) необходимо выполнить анализ двух из 10 комбинаций, позволяющих отделить ЗД от всех остальных с 95% чувствительностью при 100% специфичности.

Таким образом, использование 10 пар микроРНК при анализе свободно циркулирующей микроРНК плазмы крови позволяет с 93% чувствительностью и 100% специфичностью разделить три группы пациентов между собой. Анализ хотя бы одного из дополнительных соотношений (также обладающих высокими диагностическими показателями) уже проанализированных 14-ти микроРНК в пуле свободно циркулирующих микроРНК плазмы крови повышает точность диагностической системы (Таблица 4).

Таблица 4. Сравнение больных РЛ, ЭБ и ЗД (данные по анализу отношений экспрессии микроРНК в плазме крови)

микроРНК	Чувствительность при 100% специфичности, %	Группы разделения
miR-22-3p/miR-19b-3p	70	ЭБ vs ЗД+РЛ
let-7i-5p/miR-324-5p	50	ЗД vs ЭБ+РЛ
miR-150-5p/miR-133b	60	ЭБ vs ЗД+РЛ
miR-150-5p/miR-484	60	ЭБ vs ЗД+РЛ
miR-22-3p/miR-222-3p	50	ЭБ vs ЗД+РЛ
miR-338-3p/miR-133b	50	ЗД vs ЭБ+РЛ
miR-338-3p/miR-133b	33	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-484/miR-222-3p	77	РЛ vs ЭБ+ЗД

Кроме того, увеличить точность диагностической системы можно за счёт анализа хотя бы одного отношения из дополнительной панели микроРНК (10 микроРНК (Таблица 2Б), также обладающими высокими диагностическими показателями, а именно чувствительностью 30-80% при абсолютной специфичности (Таблица 5).

Таблица 5. Сравнение больных РЛ, ЭБ и ЗД (данные по анализу отношений экспрессии дополнительных микроРНК в плазме крови).

микроРНК	Чувствительность при 100% специфичности, %	Группы разделения
miR-19b-3p/miR-92a	30	ЭБ vs ЗД+РЛ
miR-125b-5p/miR-30e	80	ЗД vs ЭБ+РЛ
miR-660-5p/miR-30e	60	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-200b-3p/miR-30e	77	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-205-5p/miR-30e	77	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-31-5p/miR-30e	50	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-378a-3p/miR-92a	33	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-425-5p/miR-92a	33	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-375/miR-200b-3p	33	РЛ vs ЭБ+ЗД

Для увеличения чувствительности, диагностической точности и стабильности системы необходимо у каждого пациента провести анализ уровня экспрессии циркулирующей микроРНК в суммарном пуле циркулирующей микроРНК крови (свободной и связанной с поверхностью клеток крови) (Таблица 6).

Таблица 6. Пример использования данных об изменении экспрессии микроРНК в суммарном пуле циркулирующих микроРНК крови для идентификации пациентов с РЛ

№	Диагноз	Номер аналитической системы
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
miR-22-3p/miR-210 значение отношения ≤-5.2	miR-107/miR-222-3p значение отношения ≥1.5	miR-19b-3p/miR-484 значение отношения ≤-6.1	miR-150-5p/miR-144-5p значение отношения ≤-2.5	miR-484/miR-374a-5p значение отношения ≥2.5	miR-484/miR-338-3p значение отношения ≤-3	miR-484/miR-324-5p значение отношения ≥-3	let-7i-5p/miR-222-3p значение отношения ≤-5.1	miR-22-5p/miR-324-5p значение отношения ≥-1.7	miR-374a-5p/miR-133b значение отношения ≤-1
1	РЛ		+	-	+	+		+		+	+
2	РЛ		+	+	+	+		+		-	+
3	РЛ		-	+	+	-		+		+	+
4	РЛ		+	-	+	+		+		+	+
5	РЛ		+	+	-	+		+		+	+
6	РЛ		+	+	+	+		+		-	+
7	РЛ		+	+	+	+		+		+	+
8	РЛ		-	+	+	+		+		-	+
9	РЛ		-	+	-	+		+		+	+
10	РЛ		+	-	+	+		+		+	+
11	РЛ		-	-	+	+		+		-	-
12	РЛ		+	+	+	+		+		+	+
13	РЛ		+	+	+	-		+		-	+
14	РЛ		+	-	+	+		+		+	+
15	РЛ		+	+	+	+		+		-	-
16	РЛ		+	+	-	+		+		+	+
17	РЛ		+	-	-	+		-		+	+
18	РЛ		+	-	+	-		+		+	+
19	РЛ		-	+	-	+		+		-	+
20	РЛ		+	+	+	+		-		+	+
21	РЛ		+	-	+	-		+		+	+
22	РЛ		+	+	+	+		+		+	+
23	РЛ		-	-	-	+		+		-	+
24	РЛ		+	+	-	+		+		+	+
25	РЛ		+	-	+	-		+		+	+
26	РЛ		+	+	+	+		-		+	+
27	РЛ		-	+	+	+		+		-	+
28	РЛ		+	+	+	+		+		+	+
29	РЛ		+	+	+	-		+		-	+
30	РЛ		+	-	+	+		+		-	+
1	ЭБ	+
2	ЭБ	+
3	ЭБ	+
4	ЭБ	+
5	ЭБ	+
6	ЭБ	+
7	ЭБ	+
8	ЭБ	+
9	ЭБ	+
10	ЭБ	+
1	ЗД						+		+
2	ЗД						+		+
3	ЗД						+		-
4	ЗД						+		+
5	ЗД						-		+
6	ЗД						+		+
7	ЗД						+		+
8	ЗД						-		+
9	ЗД						+		-
10	ЗД						+		+
11	ЗД						+		+
12	ЗД						-		+
13	ЗД						+		+
14	ЗД						-		+
15	ЗД						+		+
16	ЗД						-		+
17	ЗД						+		+
18	ЗД						+		+
19	ЗД						+		+
20	ЗД						-		+

У каждой аналитической системы специфичность составила 100%. Чувствительность первой, седьмой и восьмой систем - 90%, второй и четвёртой – 77%, третьей и девятой – 63%, пятой – 80%, шестой – 70% и десятой – 93% (таблица 5).

Таким образом, число используемых комбинаций отношений микроРНК при анализе суммарного пула циркулирующей микроРНК в крови составило:

- Для идентификации группы больных РЛ (т.е. отделения пациентов с РЛ от всех остальных (ЭБ+ЗД)) необходимо выполнить анализ семи из 10 комбинаций, позволяющих отделить пациентов с РЛ от всех остальных с абсолютной чувствительностью при 100% специфичности.

- Для идентификации группы больных ЭБ (т.е. отделения пациентов с ЭБ от всех остальных (РЛ+ЗД)) необходимо выполнить анализ 1 из 10 комбинаций, позволяющих отделить пациентов с ЭБ от всех остальных со 100% чувствительностью при 100% специфичности.

- Для идентификации группы здоровых доноров (т.е. отделения ЗД от пациентов с РЛ и ЭБ (ЭБ+ЗД)) необходимо выполнить анализ двух из 10 комбинаций, позволяющих отделить ЗД от всех остальных с абсолютной чувствительностью при 100% специфичности.

Использование 10 основных пар микроРНК при анализе суммарного пула циркулирующей микроРНК крови позволяет с абсолютной чувствительностью и специфичностью разделить три группы пациентов между собой. Анализ хотя бы одного из дополнительных соотношений (также обладающих высокими диагностическими показателями) уже проанализированных 14-и микроРНК в суммарном пуле циркулирующих микроРНК крови повышает точность и стабильность диагностической системы (Таблица 7).

Таблица 7. Сравнение больных РЛ, ЭБ и ЗД (данные по анализу отношений экспрессии микроРНК в суммарном пуле крови)

микроРНК	Чувствительность при 100% специфичности, %	Группы разделения
miR-22-3p/miR-19b-3p	90	ЭБ vs ЗД+РЛ
let-7i-5p/miR-324-5p	70	ЗД vs ЭБ+РЛ
miR-150-5p/miR-133b	70	ЭБ vs ЗД+РЛ
miR-150-5p/miR-484	90	ЭБ vs ЗД+РЛ
miR-22-3p/miR-222-3p	80	ЭБ vs ЗД+РЛ
miR-338-3p/miR-133b	60	ЗД vs ЭБ+РЛ
miR-338-3p/miR-133b	63	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-484/miR-222-3p	77	РЛ vs ЭБ+ЗД

Кроме того, увеличить точность диагностической системы можно за счёт анализа хотя бы одного отношения из дополнительной панели микроРНК (10 микроРНК (Таблица 2Б), также обладающими высокими диагностическими показателями, а именно чувствительностью 50-93% при абсолютной специфичности (Таблица 8).

Таблица 8. Сравнение больных РЛ, ЭБ и ЗД (данные по анализу отношений экспрессии дополнительных микроРНК в суммарном пуле циркулирующих микроРНК крови)

микроРНК	Чувствительность при 100% специфичности, %	Группы разделения
miR-19b-3p/miR-92a	80	ЭБ vs ЗД+РЛ
miR-125b-5p/miR-30e	80	ЗД vs ЭБ+РЛ
miR-660-5p/miR-200b-3p	70	ЗД vs ЭБ+РЛ
miR-660-5p/miR-30e	63	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-200b-3p/miR-30e	93	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-205-5p/miR-30e	77	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-31-5p/miR-30e	80	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-378a-3p/miR-92a	90	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-425-5p/miR-92a	63	РЛ vs ЭБ+ЗД
miR-425-5p/miR-19b	50	ЗД vs ЭБ+РЛ
miR-375/miR-200b-3p	77	РЛ vs ЭБ+ЗД

Таким образом, при анализе экспрессии микроРНК в крови методом ОТ-ПЦР все три исследуемые группы доноров идентифицируются со 100% точностью.

Использование предлагаемого способа позволит повысить чувствительность и специфичность диагностики рака лёгкого.

--->

Перечень последовательностей

SEQ ID NO: 1

<110> федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный

медицинский исследовательский центр имени академика

Е.Н.Мешалкина» Минздрава России

<120> Аналитическая система для диагностики рака лёгкого при помощи

свободных и ассоциированных с клетками крови циркулирующих микроРНК

<160> 10

<210> 1

<211> 23

<212> микроРНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA 23

SEQ ID NO: 2

<210> 2

<211> 21

<212> микроРНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

AGCUACAUCUGGCUACUGGGU 21

SEQ ID NO: 3

<210> 3

<211> 23

<212> микроРНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA 23

SEQ ID NO: 4

<210> 4

<211> 22

<212> микроРНК

<213> Homo sapiens

<400> 4

UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU 22

SEQ ID NO: 5

<210> 5

<211> 22

<212> микроРНК

<213> Homo sapiens

<400> 5

UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG 22

SEQ ID NO: 6

<210> 6

<211> 22

<212> микроРНК

<213> Homo sapiens

<400> 6

GGAUAUCAUCAUAUACUGUAAG 22

SEQ ID NO: 7

<210> 7

<211> 22

<212> микроРНК

<213> Homo sapiens

<400> 7

UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG 22

SEQ ID NO: 8

<210> 8

<211> 22

<212> микроРНК

<213> Homo sapiens

<400> 8

CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUG 22

SEQ ID NO: 9

<210> 9

<211> 22

<212> микроРНК

<213> Homo sapiens

<400> 9

AGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUA 22

SEQ ID NO: 10

<210> 10

<211> 22

<212> микроРНК

<213> Homo sapiens

<400> 10

UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA 22

<---

1. Способ диагностики рака легкого, включающий следующие стадии:

- из образцов крови от пациента, с предположительно пораженных раком тканей легких, получают плазму, содержащую пул свободных циркулирующих микроРНК, и супернатант крови, содержащий суммарные пулы - свободных и связанных с поверхностью клеток крови циркулирующих микроРНК,

- выделяют циркулирующие микроРНК на стекловолокнистых сорбентах,

- анализируют уровни экспрессии 7 парных сочетаний 10 микроРНК методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием комбинаций праймеров и TaqMan-зондов:

miR-107/miR-222-3p - SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2,

miR-19b-3p/miR-484 - SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4,

miR-150-5p/miR-144-5p - SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6,

miR-484/miR-374a-5p - SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7,

miR-484/miR-324-5p - SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 8,

miR-22-5p/miR-324-5p - SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 8,

miR-374a-5p/miR-133b - SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10,

и при значении показателей отношений miR-107/miR-222-3p ≥ 1.5, miR-19b-3p/miR-484 ≤ -6.1, miR-150-5p/miR-144-5p ≤ -2.5, miR-484/miR-374a-5p ≥ 2.5, miR-484/miR-324-5p ≥ -3, miR-22-5p/miR-324-5p ≥ -1.7, miR-374a-5p/miR-133b ≤ -1 делают заключение о наличии у пациента рака легкого.

2. Способ по п.1, заключающийся в том, что микроРНК суммарного пула крови содержат микроРНК плазмы и микроРНК, связанные с клеточной поверхностью.

3. Аналитическая система для диагностики рака легкого по п.1, включающая праймеры и TaqMan-зонды к последовательностям из 7 комбинаций 10 микроРНК:

miR-107/miR-222-3p - SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2,

miR-19b-3p/miR-484 - SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4,

miR-150-5p/miR-144-5p - SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6,

miR-484/miR-374a-5p - SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7,

miR-484/miR-324-5p - SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 8,

miR-22-5p/miR-324-5p - SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 8,

miR-374a-5p/miR-133b - SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10,

а также элюирующий буфер, содержащий 1 М NaCl, 0,2 М NaHCO₃, pH 9,3, 20 мМ ЭДТА, или буфер, содержащий 1 М NaCl, 20 мМ ЭДТА.