Способ выделения карбоксилэстеразы семенной плазмы человека

Авторы патента:

Голубкина Светлана Александровна (RU)

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

C12Q1/44 - эстеразу

C12N9/18 - гидролазы эфиров карбоновых кислот

Владельцы патента RU 2755887:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к способу выделения карбоксилэстеразы из семенной плазмы человека, заключающемуся в том, что выделение проводят, используя сочетание нескольких видов хроматографии, причем семенную плазму человека смешивают с анионообменным тойоперлом, уравновешенным трис-НС1 буфером, далее полученную смесь центрифугируют и собирают надосадочную жидкость, затем через колонку иммобилизованного лектина бобов солодки гладкой пропускают весь объем полученной на предшествующей стадии надосадочной жидкости, далее колонку промывают 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером, а затем элюируют связанную на колонке карбоксилэстеразу семенной плазмы человека 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0. 2 пр., 1 табл., 3 ил.

Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано, в частности, для выделения карбоксилэстеразы семенной плазмы человека.

В практике известен способ выделения карбоксилэстеразы семенной плазмы, основанный на сочетании преципитации сульфатом аммония, гель-фильтрации, ионообменной хроматографии и изоэлектрического фокусирования (Биохимическое и иммунохимическое изучение белков семенной плазмы человека. НиколаевА.А. автореферат дис. ... доктора медицинских наук / Астрахань, 1994) .

Недостатками этого метода являются:

трудоемкость;

длительность проведения;

невысокий выход продукта

недостаточная чистота конечного продукта.

Целью представленного изобретения является повышение чистоты конечного продукта, упрощение и ускорение способа очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы.

Указанный технический результат достигается тем, что семенную плазму человека смешивают с анионообменным тойоперлом, уравновешенным трис-НС1 буфером далее полученную смесь центрифугируют и собирают надосадочную жидкость, затем через колонку иммобилизованного лектина бобов солодки гладкой, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии, далее колонку промывают 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером, а затем элюируют, связанную на колонке карбоксилэстеразу семенной плазмы человека 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0.

Очистку карбоксилэстеразы семенной плазмы проводили по предлагаемому способу. В работе использовали семенную плазму, которая отделялась центрифугированием от сперматозоидов (5000g, 15 мин) и хранилась в замороженном виде при -30С без добавления консервантов и ингибиторов протеолиза. Таким образом было накоплено 1200,0 мл семенной плазмы, которая далее использовалась для выделения карбоксилэстеразы семенной плазмы.

На следующей стадии очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека использовали объединенную надосадочную жидкость. Нами обнаружена способность лектина бобов солодки гладкой (Glycyrrhiza glabra) преципитировать термостабильную эстеразу семенной плазмы человека. На рисунке (Фиг. 1. Преципитация препаратов карбоксилэстеразы семенной плазмы человека лектином бобов солодки гладкой. 1 - препарат карбоксилэстеразы семенной плазмы человека (65 мкг/мл); 2 – термостабильная фракция семенной плазмы; 3 – преципитат 50% сульфата аммония из термостабильной фракции семенной плазмы.; 4 - фракция, после аффинной хроматографии. Агаровый гель содержит полуочищенный лектин бобов солодки гладкой в конечной концентрации 0,50 мг на 100 мл агара. окраска на общий белок кумаси блю.) показана преципитация фракций поэтапной очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека по сравнению со стандартным препаратом, полученным по способу, описанному в прототипе в агаровом геле, содержащем лектин бобов солодки гладкой. Образцы № 2,3,4 стандартизованы по уровню общего белка и приведены по концентрации его к уровню в стандартном препарате карбоксилэстеразы семенной плазмы человека – 65 мкг/мл.

Снижение диаметра колец преципитации обусловлено повышением степени очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека и уменьшением количества балластных белков, способных преципитироваться лектином бобов солодки гладкой.

Заключительная стадия очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека представляет собой аффинную хроматографию карбоксилэстеразы семенной плазмы человека на иммобилизованном лектине бобов солодки гладкой. Через колонку (1,5х12см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-НCl буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии, фракции Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером, а затем элюировали, связанную на колонке карбоксилэстеразу семенной плазмы человека 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема.

Далее в таблице 1. показаны этапы очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека. Предложенный способ повышает эффективность(повышает выход конечного продукта на 52%), сокращает время и упрощает очистку карбоксилэстеразы семенной плазмы человека по сравнению со способом (Биохимическое и иммунохимическое изучение белков семенной плазмы человека
НиколаевА.А. автореферат дис. ... доктора медицинских наук / Астрахань, 1994). В прототипе очистка состоит из 5 этапов, а в нашем из 2. Главное преимущество нашего способа заключается в применении аффинной хроматографии, на малоизученном лектине растительного происхождения из бобов солодки гладкой. Этот лектин обладает высоким сродством к галактозосодержащим гликопротеинам. По нашим данным константа диссоциации лактозы с этим лектином составляет 1,34х10^-4мМ

Это позволяет однократно повысить степень очистки в 175 раз.

Самое главное, в отличие от прототипа, наш способ позволяет связать всю массу карбоксилэстеразы семенной плазмы человека, а не повторять многократно операцию хроматографии, выделяя за один сеанс не более 0,1 мг препарата.

На рис.2 (Фиг.2. Электрофорез в полиакриламидном геле. А – семенная плазма человека; В – фракция после осаждения сульфатом аммония из водно-солевого экстракта; С - карбоксилэстераза семенной плазмы– фракция после аффинной хроматографии). показано, что препарат карбоксилэстеразы семенной плазмы человека гомогенен при электрофоретическом контроле чистоты.

На фиг3. ( Фиг.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография очищенного препарата карбоксилэстеразы семенной плазмы человека. Колонка Нуклеосил С-18. 123,0х4,3мм. Элюция 0,1% ТФУ и градиент ацетонитрила от 0 до 60% за 50 мин, скорость потока 1мл/мин.) показано, что препарат карбоксилэстеразы семенной плазмы человека гомогенен при электрофоретическом и хроматографическом контроле чистоты.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример №1.

На первой стадии выделения семенную плазму человека центрифугируют далее смешивают с анионообменным тойоперлом, уравновешенным трис - НС1 буфером в соотношении 4:1, а через 1 час полученную смесь центрифугируют в течение 10 мин при 500g, собирая надосадочную жидкость. Образовавшийся осадок ионообменника промывали 4 кратным объемом стартового буфера, который также отделяли центрифугированием. Полученные надосадочные жидкости объединяли и использовали на следующей стадии очистки. Заключительная стадия очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека представляет собой аффинную хроматографию карбоксилэстеразы семенной плазмы человека на иммобилизованном лектине бобов солодки гладкой. Через колонку (1,5х12см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-НCl буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии, фракции. Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером, а затем элюировали, связанную на колонке карбоксилэстеразу семенной плазмы человека 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема (18 мл).

Пример №2

На первой стадии очистки семенную плазму смешивали с 10 mM Tris-HCl,буфер pH 7,4 в соотношении 1:1, полученную смесь смешивали с анионообменным тойоперлом ДЭАЕ, в соотношении 5:1 и инкубировали в течении 30 минут. Через 1 час указанную смесь центрифугировали в течение 5 минут при 500 об/мин. Образовавшийся осадок ионообменника промывали 5 кратным объемом стартового буфера, который также отделяли центрифугированием. Полученные надосадочные жидкости объединяли и использовали на следующей стадии очистки. Заключительная стадия очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека представляет собой аффинную хроматографию карбоксилэстеразы семенной плазмы человека на иммобилизованном лектине бобов солодки гладкой. Через колонку (1,5х12см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-НCl буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии, фракции. Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером, а затем элюировали, связанную на колонке карбоксилэстеразу семенной плазмы человека 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема (16 мл).

Предложенный нами способ :

- повышает чистоту конечного продукта;

-повышает эффективность (повышает выход конечного продукта на 45%);

-сокращает время выделения карбоксилэстеразы семенной плазмы человека;

-упрощает выделение карбоксилэстеразы семенной плазмы человека.

Способ выделения карбоксилэстеразы из семенной плазмы человека, заключающийся в том, что выделение проводят, используя сочетание нескольких видов хроматографии, отличающийся тем, что семенную плазму человека смешивают с анионообменным тойоперлом, уравновешенным трис-НС1 буфером, далее полученную смесь центрифугируют и собирают надосадочную жидкость, затем через колонку иммобилизованного лектина бобов солодки гладкой пропускают весь объем полученной на предшествующей стадии надосадочной жидкости, далее колонку промывают 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером, а затем элюируют связанную на колонке карбоксилэстеразу семенной плазмы человека 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лучевой диагностике, и может быть использовано для нейровизуализационной диагностики степени поражения проводящих путей головного мозга при энцефалитах у детей. Проводят клинико-лабораторный мониторинг.

Определение степени диссоциации апобелка a-i и способ прогнозирования структурных и функциональных свойств липопротеинов высокой плотности плазмы крови человека, контролирующих основной путь выхода холестерина из макрофагов // 2755512

Изобретение относится к области липопротеомики, метаболомики, клеточной биологии атерогенезу, структурной биологии, молекулярной кардиологии. Изобретение касается способа определения степени диссоциации апобелка A-I.

Способ оценки провоспалительной активности моноцитов // 2755493

Изобретение относится к области медицины. Способ оценки провоспалительной активности моноцитов включает выделение моноцитов в составе мононуклеарных клеток из периферической венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина с последующим наслаиванием в чашки Петри.

Способ выбора врачебного пособия у пациенток с внематочной беременностью // 2755389

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, оперативной гинекологии, акушерству. У пациентки до лечения определяют: возраст (ВЗР), количество предыдущих беременностей (Б), наличие внематочных беременностей в анамнезе (ВН), наличие спаечного процесса в малом тазу (СП), уровень β-субъединицы хорионического гонадоторопина человеческого в сыворотке крови (β-ХГЧ), стороны нидации по данным ультразвукового сканирования органов малого таза (СН), наличие/отсутствие симптомов острого живота (ОЖ).

Способ определения риска наличия кальциноза клапана аорты у пациентов 60 лет и старше // 2754946

Изобретение относится к области медицины и раскрывает способ определения риска наличия кальциноза клапана аорты у пациентов 60 лет и старше. Способ включает определение содержания аполипопротеина А-1 в сыворотке крови и расчет значения дискриминантной функции по формуле.

Способ диагностики объемных образований головного мозга // 2754836

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования и касается дифференциальной диагностики доброкачественных образований головного мозга и злокачественных опухолей. Сущность способа: исследуют цереброспинальную жидкость методом краевой дегидратации в поляризованном свете, при этом цереброспинальную жидкость предварительно центрифугируют в течение 30 мин при 10000 об/мин, затем пробу надосадочной жидкости помещают в водяную баню при +42°С на 3-5 минут и дегидратируют в течение 3-5 суток.

Способ прогнозирования риска развития острого деструктивного холецистита // 2754803

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано при прогнозировании риска развития деструктивных форм острого холецистита. Для этого в сыворотке крови определяют активность щелочной фосфатазы (ЩФ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинфосфокиназы (КФК) и гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП).

Способ диагностики нарушения фагоцитоза у детей // 2754799

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для диагностики нарушения фагоцитоза у детей при различных заболеваниях. Способ диагностики нарушения фагоцитоза у детей осуществляют путем исследования смеси, состоящей из взвеси лейкоцитов в плазме крови и взвеси пыльцевых зерен в физиологическом растворе, при этом исследование включает приготовление образца плазмы крови, содержащего 3-9×109 лейкоцитов/л, расчет количества плазмы, которое нужно удалить; приготовление взвеси частиц, выбранных из пыльцевых зерен тимофеевки, ежовника обыкновенного, лайма мелколистного, бирючины обыкновенной, превышающих размеры лейкоцитов и способных склеивать лейкоциты, определение концентрации пыльцевых зерен, исследование полученной взвеси частиц под микроскопом, подсчет количества зерен пыльцы в 10 полях зрения и определение среднего количества зерен пыльцы в одном поле зрения, смешивание взвеси лейкоцитов и зерен пыльцы в равных частях.

Способ скрининговой дифференциальной диагностики предраковых заболеваний и рака слизистой оболочки рта (сор) // 2754295

Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии, и может быть использовано для ранней диагностики и дифференциальной диагностики предраковых заболеваний слизистой оболочки рта (СОР) и плоскоклеточного рака СОР (ПР СОР). Для этого осуществляют прямое флуоресцентное иммуноцитохимическое (ФИЦХ) исследование биоматериала пациента, который получен путем самостоятельного смыва пациентом в течение 1 минуты из ротовой полости 5% раствором глюкозы после ополаскивания полости рта дистиллированной водой.

Усовершенствованная кассета для применениия при диагностике in vitro и способ ее применения // 2753866

Изобретение относится к диагностике in vitro. Раскрыто применение способа для диагностики in vitro, где указанный способ включает: обеспечение кассеты, имеющей множество рабочих объемов; перенос растворов текучих сред по меньшей мере из одного из указанного множества рабочих объемов по меньшей мере в один другой из указанного множества рабочих объемов, где указанный перенос растворов текучих сред включает линейное перемещение переносящего элемента, с последовательным обеспечением сообщения с внутренними пространствами указанных по меньшей мере некоторых из указанного множества рабочих объемов; и вентиляцию указанного по меньшей мере одного из указанного множества рабочих объемов, где указанное множество рабочих объемов включает по меньшей мере первый рабочий объем и второй рабочий объем, где указанный перенос растворов текучих сред предусматривает: расположение разрушающего клеточную мембрану материала в первом рабочем объеме; расположение открытого конца полой иглы с введением в сообщение с указанным первым рабочим объемом; всасывание, по меньшей мере, некоторой порции указанного разрушающего клеточную мембрану материала в указанную полую иглу; линейное перемещение указанного открытого конца указанной полой иглы с введением в сообщение со вторым рабочим объемом, имеющим заключенную в нем пробу; и осуществляемое неоднократно всасывание указанной пробы и по меньшей мере части указанного разрушающего клеточную мембрану материала в указанную полую иглу; и исторжение указанной пробы и по меньшей мере части указанного разрушающего клеточную мембрану материала из указанной полой иглы в указанный второй рабочий объем, тем самым смешивая указанную пробу и указанный разрушающий клеточную мембрану материал.

Фосфодиэстераза 9а в качестве маркера злокачественной опухоли предстательной железы // 2592668

Группа изобретений относится к области биотехнологии. В частности, изобретение связано с фосфодиэстеразой-9А (PDE9A) для применения ее в качестве маркера злокачественной опухоли предстательной железы, а также для применения PDE9A в качестве маркера для диагностики, детекции, мониторинга или прогнозирования злокачественной опухоли предстательной железы или прогрессии злокачественной опухоли предстательной железы, и иммуноанализом.