Способ получения аминокислотного полимера
Настоящее изобретение относится к способу получения аминокислотного полимера при использовании тиоаминокислот. Способ включает стадии: (А) стадию получения первого и второго аминокислотных производных формулы H2N-CH(R)-COSH (1) (где R представляет собой боковую цепь любой аминокислоты); и (В) стадию проведения реакции окисления для упомянутых первого аминокислотного производного и второго аминокислотного производного для получения соединения формулы H2N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-SH (2) (где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты); где по меньшей мере одно из упомянутых первого аминокислотного производного и второго аминокислотного производного не содержит защитной группы; и где полимер включает от 4 до 20 аминокислот. Способ получения аминокислотного полимера является более простым и эффективным по сравнению с обычными способами получения аминокислотных полимеров. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 1 пр.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу получения аминокислотного полимера, в частности, к способу получения полимера аминокислот, связанных пептидными связями с тиоаминокислотами.
Уровень техники
Аминокислотные полимеры используются для различных целей, таких как множество промышленных продуктов, клеев для данных продуктов, а также синтетических промежуточных соединений, содержащихся в данных продуктах. Например, полиаспарагиновая кислота, которая представляет собой гомополимер аспарагиновой кислоты, используется в качестве моющих средств, удобрений, агрохимикатов, косметических средств или добавок к данным продуктам. Помимо этого, в связи со своей прочностью в последние годы привлек внимание полиаланин, содержащийся в нити паутины. Данным образом были установлены различные варианты использования для аминокислотных полимеров в качестве функциональных высокомолекулярных материалов, которые придают новые характеристики, которые обычно изначально отсутствовали, и в предстоящие годы предположительно будет наблюдаться нарастание потребностей в промышленном изготовлении аминокислотных полимеров.
В качестве способов получения аминокислотных полимеров были разработаны различные способы, такие как биологические и химические подходы, хотя в отношении различных моментов, таких как эффективность получения и качество, признается сохранение возможностей для совершенствования.
Например, для биологического подхода это включает, например, наложение ограничения по введению аминокислот, относящихся к неприродному типу, или неоднородность структуры углеводной цепи в гликопротеинах.
Помимо этого, для химического подхода в противоположность биологическому подходу допускаются свобода проектирования и контролирование структуры, но требуются стадии введения и снятия защиты во время синтезирования. По данной причине в качестве проблем указывается на побочные реакции, которые протекают во время проведения данных стадий, а также на наложение ограничений по производительности, таких как стоимость и время. В качестве одной проблемы также указывается на то, что зачастую на стадии снятия защиты необходимым является использование токсинов, характеризующихся высокой токсичностью.
В соответствии с этим, в целях усовершенствования производительности химического синтезирования, которое делает возможными свободу проектирования и контролирование структуры, желательным является усовершенствование стадий введения и снятия защиты в целях получения более простых и более быстрых, а также более безопасных стадий.
Обозначение «тиокислота» представляет собой родовой термин для соединений, содержащих тиокислотную группу (-COSH). Известные на сегодняшний день способы получения амидных связей при использовании тиокислоты представляют собой сочетание с аминокислотой, содержащей азидную группу, (источник непатентной литературы 1), способ использования S-S димера тиокислоты в качестве активного сложного эфира (источник непатентной литературы 2) и способ активирования в результате нитрозирования тиокислоты (источник непатентной литературы 3). Помимо этого, способами, известными в отношении получения пептидных связей при использовании тиоаминокислоты, являются способ использования S-S димера защищенной тиоаминокислоты в качестве активного сложного эфира (источник непатентной литературы 4) и способ использования тиоаминокислоты в качестве предшественника сложного эфира соединения HOBt (источник непатентной литературы 5).
Перечень цитирования
[Источник непатентной литературы 1] J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 7754-7755
[Источник непатентной литературы 2] Nature, Vol. 389, 4 September 1997
[Источник непатентной литературы 3] Org. Lett., Vol. 13, No. 5, 2011
[Источник непатентной литературы 4] J. Org. Chem. 2014, 79, 2377-2383
[Источник непатентной литературы 5] J. Am. Chem. Soc. 9Vol. 132, No. 47, 2010
Сущность изобретения
Проблемы, разрешаемые в изобретении
Цель настоящего изобретения заключается в предложении способа получения аминокислотного полимера более простым и эффективным образом в сопоставлении с тем, что имеет место для обычных способов получения аминокислотных полимеров.
Средства разрешения проблем
Пептидные связи между аминокислотами образуются при использовании α-аминогруппы одной аминокислоты в качестве нуклеофильной группы, что делает возможным конденсирование с карбоксильной группой другой аминокислоты. Вследствие большей вероятности вступления карбоксильной группы, активированной во время конденсирования, в реакцию с α-аминогруппами, а также с различными функциональными группами, проявляющими нуклеофильность и присутствующими в боковой цепи, необходимо ввести защиту в боковые цепи и α-аминогруппы (те, которые отличаются от участника реакции) аминокислот в целях получения полимера из аминокислот, характеризующихся контролируемой структурой.
Как это было, к удивлению, установлено в результате проведения неоднократных обширных исследований изобретателями настоящего изобретения в целях разрешения проблем настоящего изобретения, аминокислотный полимер, связанный пептидными связями, может быть эффективно получен и при отсутствии защиты α-аминогрупп и боковых цепей в случае использования для получения аминокислотного полимера тиоаминокислоты и проведения реакции окисления для них друг по отношению к другу. Как это, кроме того, к своему удивлению установили изобретатели настоящего изобретения, аминокислотный полимер может быть подобным образом получен даже в случае использования лизина, который содержит функциональную группу, характеризующуюся наличием длинной боковой цепи и проявляющую нуклеофильность, и, таким образом, предположительно требует наличия защиты в обычных способах конденсирования аминокислот. Это означает возможность использования способа получения настоящего изобретения для различных целей при отсутствии ограничения, накладываемого типом боковой цепи аминокислоты.
Настоящее изобретение имеет в своей основе вышеизложенные знания и охватывает следующие далее характеристики:
[1] Способ получения полимера аминокислот, связанных пептидными связями, характеризующийся тем, что он включает:
(А) стадию получения первого и второго аминокислотных производных, каждое из которых продемонстрировано ниже:
H2N-CH(R)-COSH (1)
(где R представляет собой боковую цепь любой аминокислоты); и
(В) стадию проведения реакции окисления для упомянутых первого аминокислотного производного и второго аминокислотного производного для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-SH (2)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты);
где, по меньшей мере, одно из упомянутых первого аминокислотного производного и второго аминокислотного производного не содержит защитной группы.
[2] Способ, соответствующий способу получения [1], где упомянутые как первое аминокислотное производное, так и второе аминокислотное производное не содержат защитной группы.
[3] Способ получения, соответствующий позициям [1] или [2] и включающий:
(С) стадию проведения реакции окисления для соединения (2), полученного на стадии (В), при использовании третьего аминокислотного производного, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-COSH (1)
(где R представляет собой боковую цепь любой аминокислоты)
для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-(NH-CH(R)-CO)2-SH (3)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты).
[4] Способ получения, соответствующий позиции [3] и характеризующийся многократным проведением стадии (С) для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)n-SH (4)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, а n представляет собой целое число, которое составляет 2 и более).
[5] Способ получения, соответствующий позициям [3] или [4], где упомянутые одно или несколько третьих аминокислотных производных не содержат защитной группы.
[6] Способ получения, соответствующий любой из позиций от [1] до [5], включающий, кроме того:
(D) стадию проведения реакции между соединением (2), полученным на стадии (В), или соединением (3) или соединением (4), полученными на стадии (С), и нуклеофильным реагентом, продемонстрированным ниже:
Н-Х (5)
(где Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se)
для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)m-X (6)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, m представляет собой любое целое число, а Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se).
[7] Способ получения, соответствующий позиции [6], где Х представляет собой заместитель, связанный через атом N или атом S.
[8] Способ получения, соответствующий позиции [4], которым является способ получения полимера, включающего от 4 до 20 аминокислот.
[9] Способ получения, соответствующий любой позиции от [1] до [8], где первое или второе аминокислотные производные или, по меньшей мере, один из упомянутых представителей более, чем одного третьего аминокислотного производного содержат незащищенную 4-аминобутильную группу в качестве боковой цепи.
[10] Способ получения, соответствующий любой позиции от [1] до [8], где боковые цепи упомянутых первого и второго аминокислотных производных и упомянутых одного или нескольких третьих аминокислотных производных являются идентичными.
[11] Способ получения, соответствующий позиции [10], где все упомянутые боковые цепи представляют собой метильные группы.
[12] Способ получения полимера представителей более, чем одной аминокислоты, связанной пептидными связями, характеризующийся тем, что он включает:
(а) стадию получения представителей более, чем одного аминокислотного производного, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-COSH (1)
(где R представляет собой боковую цепь любой аминокислоты);
(b) стадию проведения реакции окисления для упомянутых представителей более, чем одного аминокислотного производного для получения представителей более, чем одного соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)х-SH (7)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, а х представляет собой любое целое число)
и/или соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)у-S-S-(СО-CH(R)-NH)z-CO-CH(R)-NH2 (8)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, а у и z представляют собой любое целое число),
где часть или все из упомянутых представителей более, чем одного аминокислотного производного не содержат защитной группы.
[13] Способ, соответствующий позиции [12], где все из упомянутых представителей более, чем одного аминокислотного производного не содержат защитной группы.
[14] Способ, соответствующий позициям [12] или [13], где соединение, полученное на стадии (b), включает соединение (7).
[15] Способ получения, соответствующий позиции [14], включающий, кроме того:
(с1) стадию проведения реакции между соединением (7), полученным на стадии (b), и нуклеофильным реагентом, продемонстрированным ниже:
Н-Х (5)
(где Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se)
для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)х-X (9)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, х представляет собой любое целое число, а Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se).
[16] Способ получения, соответствующий позиции [15], где Х представляет собой заместитель, связанный через атом N или атом S.
[17] Способ получения, соответствующий позициям [12] или [13], где соединение, полученное на стадии (b), включает соединение (8).
[18] Способ получения, соответствующий позиции [17], включающий, кроме того:
(с2) стадию проведения реакции между соединением (8), полученным на стадии (b), и нуклеофильным реагентом, продемонстрированным ниже:
Н-Х (5)
(где Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se)
для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)у-X (10)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, у представляет собой любое целое число, а Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se)
и ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)z-X (11)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, z представляет собой любое целое число, а Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se).
[19] Способ получения, соответствующий позиции [18], где Х представляет собой заместитель, связанный через атом N или атом S.
[20] Способ получения, соответствующий любой из позиций от [12] до [19], которым является способ получения полимера, включающего от 4 до 20 аминокислот.
[21] Способ получения, соответствующий любой позиции от [12] до [20], где, по меньшей мере, один из упомянутых представителей более, чем одного аминокислотного производного содержит незащищенную 4-аминобутильную группу в качестве боковой цепи.
[22] Способ получения, соответствующий любой позиции от [12] до [21], где боковые цепи упомянутых представителей более, чем одного аминокислотного производного являются идентичными.
[23] Способ получения, соответствующий позиции [22], где все упомянутые боковые цепи представляют собой метильные группы.
[24] Способ получения, соответствующий любой позиции от [12] до [23], который предназначен для производства полипептидной библиотеки.
Как это должно быть понятным для специалистов в соответствующей области техники, в объеме настоящего изобретения охватывается изобретение любой комбинации из одной или нескольких характеристик настоящего изобретения, описанного выше.
Эффекты от изобретения
В соответствии со способом получения настоящего изобретения аминокислотные полимеры могут быть получены чрезвычайно эффективно в сопоставлении с тем, что имеет место для обычных способов с использованием защитной группы.
Помимо этого, вследствие отсутствия потребности в использовании защитной группы в способе получения настоящего изобретения легко могут быть избегнуты проблемы, играющие роль в обычных способах, в которых используют высокотоксичные реагенты для снятия защиты.
Поскольку способ получения настоящего изобретения делает возможным синтезирование больших количеств представителей более, чем одного аминокислотного полимера, он может оказаться подходящим для использования при промышленном производстве полиаминокислот или при производстве полипептидной библиотеки.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 демонстрирует полученные при использовании метода ЖХ-МС результаты для продукта непосредственно после и по истечении двух часов после реакции окисления для H-Phe-SH.
Фигура 2 демонстрирует полученные при использовании масс-спектрометрии результаты для фракций, соответствующих интервалам MS(A), MS(B) и MS(C) на фигуре 1.
Фигура 3 демонстрирует полученный при использовании метода УВЭЖХ результат по истечении одной минуты после реакции олигомеризации для H-Phe-SH и H-Ala-SH.
Фигура 4 демонстрирует полученные при использовании масс-спектрометрии результаты измерений для фракций от (А) до (I). Фракции от (А) до (I) соответствуют интервалам, соответственно, от MS(A) до MS(I) на фигуре 3.
Фигура 5 демонстрирует полученный при использовании масс-спектрометрии результат измерений для фракции (J). Фракция (J) соответствует интервалу MS(J) на фигуре 3.
Фигура 6 демонстрирует хроматограмму по току ПИТ для аналитического метода ЖХ-МС в отношении реакции олигомеризации для Phe-SH и Lys-SH.
Фигура 7 демонстрирует интегрированный спектр для метода МС, полученный исходя из хроматограммы по току ПИТ на фигуре 6 в диапазоне 2,2 – 14,0 минуты.
Фигура 8 демонстрирует спектр для метода МС в отношении олигопептида 2F2K, полученный с вершины пика в позиции 7 минут на хроматограмме по току ПИТ на фигуре 6. МСВР (ИЭР): рассчитано для C30H40N6O4S [M+2H]2 + 293,1645, установлено 293,1640.
Фигура 9 демонстрирует характер фрагментации при диссоциации ДИС для олигопептида 2F2K.
Описание вариантов осуществления
Термин «аминокислота» в настоящем документе используется в своем наиболее широком значении и включает аминокислоты природного происхождения, то есть, серин (Ser), аспарагин (Asn), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), аланин (Ala), тирозин (Tyr), глицин (Gly), лизин (Lys), аргинин (Arg), гистидин (His), аспарагиновую кислоту (Asp), глютаминовую кислоту (Glu), глютамин (Gln), треонин (Thr), цистеин (Cys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), триптофан (Trp) и пролин (Pro), а также аминокислоты неприродного происхождения, такие как варианты аминокислот. В соответствии с этим, аминокислоты в настоящем документе включают, например, L-аминокислоты; D-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты; аминокислоты, которые не будут представлять собой вещества, предназначенные для конфигурирования белков в живом организме, такие как норлейцин, β-аланин и орнитин; варианты, в которых заместитель в виде боковой цепи аминокислоты замещен еще одним другим заместителем, и тому подобное.
Термин «аминокислотное производное» в настоящем документе относится к аминокислоте, содержащей карбоксильную группу аминокислоты, превращенную в тиокислотную группу (-COSH), (также обозначаемой в настоящем документе термином «тиоаминокислота»), обычно к соответствующим соединениям, содержащим α-аминогруппу и обладающим представленной ниже структурой:
H2N-CH(R)-COSH (1)
R в соединении (1) представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, и, в соответствии с этим, R может представлять собой боковую цепь аминокислоты природного происхождения или может представлять собой соответствующую боковую цепь, замещенную боковой цепью неприродного происхождения.
В отношении способа введения тиокислотной группы в карбоксильную группу известны различные способы. Например, такие способы включают способ получения в присутствии сурьмяного катализатора (такого как Ph3SbO) в результате проведения реакции между карбоновой кислотой, соответствующей целевым тиокарбоновым кислотам, и сульфидом фосфора (Chem. Ber., 123, 2081-2082 (1990)), способ использования сероводорода в качестве сульфидирующего реагента (J. Org. Chem., 25, 180-182 (1960)), способ превращения карбоновой кислоты в галогенангидрид кислоты, а после этого проведения реакции с металлической солью сероводорода (натриевой или калиевой солью) (Org. Synth., 4, 924 (1963); Synthesis., 998-1004 (2005)), способ использования N,N-диметилформтиоамида или тиоацетамида в качестве сульфидирующего реагента в отношении галогенангидрида кислоты (Phosphorus, Sulfur, and Silicon., 178, 1661-1665 (2003)), обеспечения превращения в смешанный ангидрид кислот в результате проведения реакции между сложным эфиром хлормуравьиной кислоты и соответствующей карбоновой кислотой, а после этого проведения реакции с сероводородом (Chem. Pharm. Bull., 34, 999-1014 (1986)) и тому подобное. В настоящем изобретении при использовании данных известных способов аминокислоты превращаются в тиоаминокислоты и используются для настоящего изобретения. В альтернативном варианте, аминокислотные производные могут быть получены, например, в результате превращения карбоксильной группы в аминокислоте в сложнотиоэфирную группу и снятия защитной группы с атома серы.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения полимера аминокислот, связанных пептидными связями.
Как это полагают без ограничения себя конкретной теорией, в способе получения настоящего изобретения образование пептидных связей протекает в результате образования дисульфидных (S-S) связей между аминокислотными производными со следующей далее реакцией внутримолекулярного переноса (смотрите ниже).
[Химическая формула 1]
В соответствии с этим, в способе получения настоящего изобретения в целях обеспечения протекания реакции могут быть использованы любые способ и условия, для которых между тиоаминокислотами образуются дисульфидные связи. Такие способы и условия известны для специалистов в соответствующей области техники, и данные специалисты в соответствующей области техники могут подходящим для использования образом выбирать надлежащие способы и условия в результате обращения, например, к публикации CHEMICAL APPROACHES to the SYNTHESIS of PEPTIDES and PROTEIN Chapter 5 Formation of Disulfide Bridge pp. 209-236, 1997, CRC PRESS.
Способ получения настоящего изобретения, в частности, вышеупомянутая реакция, может быть осуществлен в результате проведения реакции окисления.
В соответствии с этим, в одном аспекте способ получения настоящего изобретения характеризуется тем, что он включает:
(А) стадию получения первого и второго аминокислотных производных, каждое из которых продемонстрировано ниже:
H2N-CH(R)-COSH (1)
(где R представляет собой боковую цепь любой аминокислоты); и
(В) стадию проведения реакции окисления для упомянутых первого аминокислотного производного и второго аминокислотного производного для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-SH (2)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты);
где, по меньшей мере, одно из упомянутых первого аминокислотного производного и второго аминокислотного производного не содержит защитной группы.
Формулировка «по меньшей мере, одно из первого аминокислотного производного и второго аминокислотного производного не содержит защитной группы» в настоящем документе обозначает то, что, по меньшей мере, одно из первого аминокислотного производного и второго аминокислотного производного не содержит какой-либо защитной группы в отношении своих боковой цепи или функциональной группы.
Термин «защитная группа» в настоящем документе обозначает защитную группу, обычно использующуюся для защиты боковых цепей и аминогрупп при синтезировании аминокислотного производного, и, например, в качестве защитной группы для гидроксильной группы может включать нижеследующее, но не ограничивается только этим: например, метильная группа, трет-бутильная группа, бензильная группа, бензоильная группа, ацетильная (Ас) группа, триметилсилильная (TMS) группа, триэтилсилильная (TES) группа, трет-бутилдиметилсилильная (TBS или TBDMS) группа и тому подобное. Защитная группа для аминогруппы может включать, например, липофильные защитные группы, защитные группы на карбонатной основе или амидной основе, такие как 9-флуоренилметоксикарбонильная (Fmoc) группа, трет-бутоксикарбонильная (Boc) группа, бензильная группа, аллилоксикарбонильная (Alloc) группа, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонильная (troc) группа, аллилоксикарбонильная группа, ацетильная группа и тому подобное.
В способе получения настоящего изобретения, который соответствует представленному выше описанию изобретения, несмотря на то, что, по меньшей мере, одно из первого аминокислотного производного или второго аминокислотного производного не содержит защитной группы, наличие защитной группы у другого аминокислотного производного не исключается. В соответствии с этим, в объем настоящего изобретения попадают оба случая, заключающиеся в использовании первого аминокислотного производного, которое содержит защитную группу, и второго аминокислотного производного, которое не содержит защитной группы, и в использовании первого аминокислотного производного, которое не содержит защитной группы, и второго аминокислотного производного, которое содержит защитную группу. Предпочтительно аминокислотные производные, которые не содержат защитной группы, используются в качестве как первого аминокислотного производного, так и второго аминокислотного производного.
В способе получения настоящего изобретения реакция окисления может быть проведена в результате нижеследующего, но без ограничения только этим: окисление при использовании окислителя и тому подобное.
На окислитель, который может быть использован в настоящем изобретении, конкретных ограничений не накладывают до тех пор, пока это будет окислитель, который может образовывать дисульфидные связи в результате окислительного сочетания для сульфанильных групп (SH) в тиокислотных группах (-COSH). Примеры такого окислителя могут включать нижеследующее, но не ограничиваются только этим: хлорид железа (III), иод и тому подобное. В одном варианте осуществления настоящего изобретения реакцию окисления проводят при использовании окислителя, например, хлорида железа (III).
В настоящем изобретении реакция окисления может быть проведена при использовании одной только воды или при использовании смешанного растворителя из воды и органического растворителя. Органические растворители, которые могут быть использованы, представляют собой нижеследующее, но не ограничиваются только этим: алифатические углеводородные растворители, такие как гексан, или циклогексан, ароматические углеводородные растворители, такие как бензол или толуол, галогенсодержащие растворители, такие как дихлорметан или хлороформ, апротонные полярные растворители, такие как этилацетат или ацетонитрил, и протонные полярные растворители, такие как этанол или метанол.
В настоящем изобретении на температуру реакции при реакции окисления конкретных ограничений не накладывают, и реакция может быть проведена, например, при комнатной температуре. На рН-условия для реакции окисления также конкретных ограничений не накладывают, и они могут находиться в диапазоне, например, рН 1 – 4.
В способе получения настоящего изобретения в зависимости от аминокислотного полимера, представляющего собой цель изготовления, боковые цепи первого и второго аминокислотных производных могут быть идентичными или различными боковыми цепями.
Способ получения настоящего изобретения может, кроме того, включать (С) стадию проведения реакции окисления для вышеупомянутого соединения (2), полученного на стадии (В), при использовании третьего аминокислотного производного, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-COSH (1)
(где R представляет собой боковую цепь любой аминокислоты)
для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-(NH-CH(R)-CO)2-SH (3)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты).
При использовании стадии (С) одну дополнительную молекулу аминокислоты связывают пептидной связью с соединением (2).
Третье аминокислотное производное может содержать, а может и не содержать защитную группу. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения третье аминокислотное производное не содержит защитной группы. Помимо этого, в зависимости от типа аминокислотного полимера, представляющего собой цель изготовления, боковая цепь третьего аминокислотного производного может включать боковую цепь, идентичную тому, что имеет место для одного или обоих представителей из первого и второго аминокислотных производных, или может быть отличной от обеих из них.
В способе получения настоящего изобретения стадия (С) может быть повторена несколько раз по мере надобности для получения соединения, продемонстрированного ниже и имеющего желательную длину:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)n-SH (4)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, а n представляет собой целое число, которое составляет 2 и более).
Данным образом может быть эффективно получен аминокислотный полимер, имеющий желательную длину и характеризующийся наличием контролируемой последовательности.
В соответствии с этим, в способе получения настоящего изобретения потенциально могут быть использованы представители более, чем одного третьего аминокислотного производного. Использованные представители более, чем одного третьего аминокислотного производного, каждый независимо от других, может содержать, а может и не содержать защитную группу. В одном предпочтительном варианте осуществления все из представителей использованных одного или нескольких третьих аминокислотных производных не содержат защитной группы. Помимо этого, в зависимости от типа аминокислотного полимера, представляющего собой цель изготовления, боковая цепь использованных представителей более, чем одного третьего аминокислотного производного, каждого независимо от других, может включать боковую цепь, идентичную тому, что имеет место для одного или обоих представителей из первого и второго аминокислотных производных, или может быть отличной от обеих из них.
В одном варианте осуществления способ получения настоящего изобретения может, кроме того, включать стадию дериватизации полученного аминокислотного полимера. Говоря конкретно, способ получения настоящего изобретения может, кроме того, включать:
(D) стадию проведения реакции между соединением (2), полученным на стадии (В), или соединением (3) или соединением (4), полученными на стадии (С), и нуклеофильным реагентом, продемонстрированным ниже:
Н-Х (5)
(где Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se)
для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)m-X (6)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, m представляет собой любое целое число, а Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se).
Данным образом аминокислотный полимер, полученный в форме SH-содержащей структуры, может быть превращен в желательную форму.
Стадия (D) может быть проведена подобно тому, что имеет место для способов дериватизации аминокислоты или пептида, хорошо известных для специалистов в соответствующей области техники. Например, для реакции между соединением (2) или (3) и нуклеофильным реагентом (5) могут быть использованы растворители на амидной основе, алифатические углеводородные растворители, такие как гексан, или циклогексан, ароматические углеводородные растворители, такие как бензол или толуол, галогенсодержащие растворители, такие как дихлорметан или хлороформ, апротонные полярные растворители, такие как этилацетат или ацетонитрил, и протонные полярные растворители, такие как этанол или метанол или вода. Данную реакцию, в частности, проводят в буферном растворе в диапазоне от кислотного до нейтрального. Примеры буферного раствора включают фосфатный буфер, раствор трис(гидроксиметил)аминометанового буфера, раствор буфера ГЭПЭС, раствор лимоннокислого буфера и тому подобное. Данные буферные растворы могут быть использованы индивидуально или в смеси из двух и более из них.
На температуру реакции со стадии (D) конкретных ограничений не накладывают, и данная реакция может быть проведена в диапазоне 0°С – 30°С, предпочтительно проведена в диапазоне 0°С – 20°С и, кроме того, предпочтительно проведена в диапазоне 0°С – 10°С. Кроме того, конкретных ограничений не накладывают и на время реакции, и данная реакция может быть проведена в диапазоне 1 минута – 5 часов, предпочтительно проведена в диапазоне 1 минута – 2 часа, а, кроме того, предпочтительно проведена в диапазоне 1 минута – 30 минут. Помимо этого, конкретных ограничений не накладывают и на рН-условия для стадии (D), и данная реакция может быть проведена в диапазоне 1 – 8, предпочтительно проведена в диапазоне 2 – 7, а, кроме того, предпочтительно проведена в диапазоне 4 – 7.
Конкретные примеры соединения (5) могут включать воду, алкиловые спирты, такие как метанол, ариловые спирты, такие как бензиловый спирт, защищенный или незащищенный гидразин, алкилтиолы, такие как этантиол, арилтиолы, такие как бензилтиол, селеновые соединения и тому подобное.
В одном варианте осуществления Х в соединении (5) представляет собой заместитель, связанный через атом N или атом S, и, в соответствии с этим, аминокислотный полимер получают, соответственно, как гидразидную структуру или в форме сложного тиоэфира.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения полимера из представителей более, чем одной аминокислоты, связанных пептидными связями, где упомянутый способ включает (а) стадию получения представителей более, чем одного аминокислотного производного, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-COSH (1)
(где R представляет собой боковую цепь любой аминокислоты); и
(b) стадию проведения реакции окисления для упомянутых представителей более, чем одного аминокислотного производного для получения представителей более, чем одного соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)х-SH (7)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, х представляет собой любое целое число)
и/или соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)у-S-S-(СО-CH(R)-NH)z-CO-CH(R)-NH2 (8)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, а у и z представляют собой любое целое число). В данном аспекте способ получения настоящего изобретения может характеризоваться тем, что он одновременно подвергает реакции окисления представителей более, чем одного аминокислотного производного. Кроме того, в данном аспекте способ получения настоящего изобретения характеризуется тем, что, по меньшей мере, часть или все из упомянутых представителей более, чем одного аминокислотного производного не содержат защитной группы.
В способе получения настоящего изобретения формулировка «часть из упомянутых представителей более, чем одного аминокислотного производного не содержит защитной группы» означает то, что представители более, чем одного аминокислотного производного, полученного на стадии (а), включают аминокислотное производное, которое не содержит защитной группы, и доля аминокислотных производных, которые не содержат защитной группы, необязательно представляет собой проблемный вопрос, хотя и предпочитается, чтобы аминокислотные производные, которые не содержат защитной группы, составляли бы предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 91%, более предпочтительно, по меньшей мере, 92%, более предпочтительно, по меньшей мере, 93%, более предпочтительно, по меньшей мере, 94%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 96%, более предпочтительно, по меньшей мере, 97%, более предпочтительно, по меньшей мере, 98%, а более предпочтительно, по меньшей мере, 99%, представителей более, чем одного аминокислотного производного. В настоящем изобретении предпочтительно все из представителей более, чем одного аминокислотного производного, полученного на стадии (а), не содержат защитной группы.
Стадия (b) является стадией одновременного проведения реакции окисления для представителей более, чем одного аминокислотного производного, полученного на стадии (а). Как это полагают без ограничения себя конкретной теорией, при одновременном проведении реакции окисления для представителей более, чем одного аминокислотного производного мономер или полимер аминокислотного производного и мономер аминокислотного производного обеспечивают протекание последовательных технологических процессов образования дисульфидной связи и внутримолекулярного метатезиса, а именно, первой реакции образования пептидной связи и второй реакции образования дисульфидной связи между полимерами аминокислотных производных.
[Химическая формула 2]
| Первая реакция | Соединение (7) |
| Вторая реакция | Соединение (8) |
АА представляет собой одну молекулу аминокислоты.
Помимо этого, как это полагают без ограничения себя конкретной теорией, в случае производства в результате проведения второй реакции соединения (аминокислотный полимер)-S-S-(аминокислотный полимер) (соединения (8)) в данной молекуле не будет протекать внутримолекулярный метатезис, но в случае присутствия в реакционной системе мономера аминокислотного производного, один из аминокислотных полимеров, который присутствует вследствие наличия дисульфидной связи, и упомянутый мономер аминокислотного производного претерпевают обменную реакцию с образованием соединения (аминокислотный полимер)-S-S-(аминокислотный мономер) (смотрите ниже), и вследствие стимулирования данной молекулой прохождения реакции внутримолекулярного переноса происходит наращивание аминокислот.
[Химическая формула 3]
| Соединение (8) |
АА представляет собой одну молекулу аминокислоты.
Между тем, как это полагают, в случае непроведения такой обменной реакции при использовании мономера аминокислотного производного аминокислотные полимеры будут образовывать дисульфидную связь друг с другом, после чего дальнейшее наращивание аминокислот больше уже не произойдет, и поэтому не смогут быть получены длинноцепочечные аминокислотные полимеры. Как это также предполагается и подтверждается исходя из примеров в настоящем документе, в случае появления возможности получения полимера, имеющего длину, соответствующую как максимум 19 аминокислотам, вероятность прохождения обменной реакции при использовании мономера аминокислотного производного будет высокой.
С другой стороны, как это полагают, в случае отсутствия доступного мономера аминокислотного производного во время получения соединения (аминокислотный полимер)-S-S-(аминокислотный полимер) обменная реакция при использовании мономера аминокислотного производного протекать не будет, и поэтому дальнейшее наращивание происходить не будет. Несмотря на то, что способ получения настоящего изобретения необязательно может, кроме того, включать стадию добавления в систему реакции мономера аминокислотного производного для обеспечения прохождения дальнейшей реакции, в любом случае специалистам в соответствующей области техники необходимо признать возможность потенциального получения соединения (8) в дополнение к соединению (7) после проведения стадии (b).
Помимо этого, в способе получения настоящего изобретения в зависимости от аминокислотного полимера, представляющего собой участника получения, все боковые цепи упомянутых представителей «более, чем одного аминокислотного производного» могут быть идентичными или могут быть различными. Например, в результате наличия всех идентичных боковых цепей упомянутых представителей «более, чем одного аминокислотного производного» способ получения настоящего изобретения может стать способом получения, который является подходящим для использования в целях получения увеличенного количества конкретной полиаминокислоты. Такая полиаминокислота может включать, например, нижеследующее, но не ограничивается только этим: полиаланин. Полиаланин может быть получен в результате получения в качестве упомянутых представителей «более, чем одного аминокислотного производного» однородной коллекции, состоящей из аминокислотных производных, содержащих метильную группу в качестве боковой цепи, а после этого проведения для нее реакции окисления. Кроме того, в результате получения и использования упомянутых представителей «более, чем одного аминокислотного производного» таким образом, чтобы они содержали бы боковые цепи 20 типов аминокислот природного происхождения, способ получения настоящего изобретения может стать способом получения, который является подходящим для использования в целях получения полипептидной библиотеки.
В одном варианте осуществления способ получения настоящего изобретения может, кроме того, включать:
(с1) стадию проведения реакции между соединением (7), полученным на стадии (b), и нуклеофильным реагентом, продемонстрированным ниже:
Н-Х (5)
(где Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se)
для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)х-X (9)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, х представляет собой любое целое число, а Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se).
Данным образом аминокислотный полимер, полученный в форме SH-содержащей структуры, может быть превращен в желательную форму.
Стадия (с1) может быть проведена подобно тому, что имеет место для способов дериватизации аминокислоты или пептида, хорошо известных для специалистов в соответствующей области техники. Для реакции между соединением (7) и нуклеофильным реагентом (5) могут быть использованы растворители на амидной основе, алифатические углеводородные растворители, такие как гексан, или циклогексан, ароматические углеводородные растворители, такие как бензол или толуол, галогенсодержащие растворители, такие как дихлорметан или хлороформ, апротонные полярные растворители, такие как этилацетат или ацетонитрил, и протонные полярные растворители, такие как этанол или метанол или вода. Данную реакцию, в частности, проводят в буферном растворе в диапазоне от кислотного до нейтрального. Примеры буферного раствора включают фосфатный буфер, раствор трис(гидроксиметил)аминометанового буфера, раствор буфера ГЭПЭС, раствор лимоннокислого буфера и тому подобное. Данные буферные растворы могут быть использованы индивидуально или в смеси из двух и более из них.
На температуру реакции со стадии (с1) конкретных ограничений не накладывают, и данная реакция может быть проведена в диапазоне 0°С – 30°С, предпочтительно проведена в диапазоне 0°С – 20°С и, кроме того, предпочтительно проведена в диапазоне 0°С – 10°С. Кроме того, конкретных ограничений не накладывают и на время реакции, и данная реакция может быть проведена в диапазоне 1 минута – 5 часов, предпочтительно проведена в диапазоне 1 минута – 2 часа, а, кроме того, предпочтительно проведена в диапазоне 1 минута – 30 минут. Помимо этого, конкретных ограничений не накладывают и на рН-условия для стадии (с1), и данная реакция может быть проведена в диапазоне 1 – 8, предпочтительно проведена в диапазоне 2 – 7, а, кроме того, предпочтительно проведена в диапазоне 4 – 7.
Конкретные примеры соединения (5) могут включать воду, алкиловые спирты, такие как метанол, ариловые спирты, такие как бензиловый спирт, защищенный или незащищенный гидразин, алкилтиолы, такие как этантиол, арилтиолы, такие как бензилтиол, и селеновые соединения.
В одном варианте осуществления Х в соединении (5) представляет собой заместитель, связанный через атом N или атом S, и, в соответствии с этим, аминокислотный полимер получают, соответственно, как гидразидную структуру или в форме сложного тиоэфира.
В еще одном варианте осуществления способ получения настоящего изобретения, кроме того, может включать:
(с2) стадию проведения реакции между соединением (8), полученным на стадии (b), и нуклеофильным реагентом, продемонстрированным ниже:
Н-Х (5)
(где Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se)
для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)у-X (10)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, у представляет собой любое целое число, а Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se)
и ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)z-X (11)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, z представляет собой любое целое число, а Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se).
Стадия (с2) является стадией получения соединений (10) и (11) в дериватизированной форме из одной молекулы соединения (8) в результате расщепления дисульфидных связей при использовании соединения (4), которое представляет собой нуклеофильный реагент.
Для специалистов в соответствующей области техники известно расщепление дисульфидной связи при использовании нуклеофильного реагента, такое как гидролиз под воздействием воды, этерификация с образованием сложного эфира под воздействием спирта, амидирование под воздействием аминосоединений, гидразидирование, тиоэтерифицирование с образованием сложного тиоэфира под воздействием тиолов и селеноэтерифицирование с образованием сложного селеноэфира под воздействием селеновых соединений. Для реакции между соединением (8) и нуклеофильным реагентом (5) могут быть использованы растворители на амидной основе, алифатические углеводородные растворители, такие как гексан, или циклогексан, ароматические углеводородные растворители, такие как бензол или толуол, галогенсодержащие растворители, такие как дихлорметан или хлороформ, апротонные полярные растворители, такие как этилацетат или ацетонитрил, и протонные полярные растворители, такие как этанол или метанол или вода. Данную реакцию, в частности, проводят в буферном растворе в диапазоне от кислотного до нейтрального. Примеры буферного раствора включают фосфатный буфер, раствор трис(гидроксиметил)аминометанового буфера, раствор буфера ГЭПЭС, раствор лимоннокислого буфера и тому подобное. Данные буферные растворы могут быть использованы индивидуально или в смеси из двух и более из них.
На температуру реакции со стадии (с2) конкретных ограничений не накладывают, и данная реакция может быть проведена в диапазоне 0°С – 30°С, предпочтительно проведена в диапазоне 0°С – 20°С и, кроме того, предпочтительно проведена в диапазоне 0°С – 10°С. Кроме того, конкретных ограничений не накладывают и на время реакции, и данная реакция может быть проведена в диапазоне 1 минута – 5 часов, предпочтительно проведена в диапазоне 1 минута – 2 часа, а, кроме того, предпочтительно проведена в диапазоне 1 минута – 30 минут. Помимо этого, конкретных ограничений не накладывают и на рН-условия для стадии (с2), и данная реакция может быть проведена в диапазоне 1 – 8, предпочтительно проведена в диапазоне 2 – 7, а, кроме того, предпочтительно проведена в диапазоне 4 – 7.
Конкретные примеры соединения (5) могут включать воду, алкиловые спирты, такие как метанол, ариловые спирты, такие как бензиловый спирт, защищенный или незащищенный гидразин, алкилтиолы, такие как этантиол, арилтиолы, такие как бензилтиол, и селеновые соединения.
В соответствии со способом получения настоящего изобретения могут быть эффективно получены, например, полимер или коллекция полимеров, содержащие 4 – 20, 5 – 20, 6 – 20, 7 – 20, 8 – 20, 9 – 20 или 10 – 20 аминокислот.
Помимо этого, поскольку способ получения настоящего изобретения делает возможным получение аминокислотного полимера, связанного пептидными связями, даже в случае использования без введенной защиты аминокислотного производного, которое содержит высокореакционно-способную боковую цепь, такого как лизин, который содержит 4-аминобутильную группу в качестве боковой цепи и, как это было сказано, требует наличия защиты в обычных реакциях конденсирования аминокислот, ему будут свойственны преимущества, заключающиеся в отсутствии ограничения по типу аминокислоты и наличие чрезвычайно высокой эксплуатационной адаптируемости.
Как это необходимо отметить, термины, использующиеся в настоящем документе, должны быть использованы для описания конкретных вариантов осуществления и не предполагают наложения ограничения на изобретение.
Помимо этого, термин «включающий» в соответствии с использованием в настоящем документе, если только содержание не будет ясно указывать на понимание другим образом, будет предполагать присутствие описанных позиций (таких как компоненты, стадии, элементы и числа) и не будет исключать присутствия других позиций (таких как компоненты, стадии, элементы и числа).
Если только не будет определено другого, то все термины, использующиеся в настоящем документе, (в том числе и научно-технические термины) будут иметь те же самые значения, что и соответствующие термины, широко признанные специалистами в соответствующей области техники в сфере технологии, к которой относится настоящее изобретение. Термины, использующиеся в настоящем документе, если только однозначно не будет определено другого, должны восприниматься как имеющие значения, согласующиеся со значениями в настоящем документе и в родственных сферах техники, и не должны восприниматься как имеющие идеализированные или избыточно формальные значения.
Термины, такие как «первый» и «второй», иногда используются для представления различных элементов, и как это необходимо признать, на данные элементы данными терминами ограничения накладываться не должны. Данные термины используются исключительно для целей проведения различия между одним элементом и другим, и, например, возможными являются описание первого элемента как второго элемента и подобным образом описание второго элемента как первого элемента без отклонения от объема настоящего изобретения.
Теперь настоящее изобретение будет более конкретно описано при использовании примеров. Однако настоящее изобретение может быть воплощено при использовании различных вариантов осуществления и не должно восприниматься как ограниченное примерами, описанными в настоящем документе.
Примеры
Вещества исходного сырья
В представленных ниже примерах использовали следующие далее вещества: N,N-диизопропилэтиламин (DIPEA), трифторуксусная кислота (TFA), триизопропилсилан (TIPS), N,N-диметил-4-аминопиридин (DMAP), дихлорметан (DCM), муравьиная кислота (FA), ацетонитрил (MeCN), гексафторфосфат (бензотриазол-1-илокси)трипирролидинофосфония (PyBOP) и трифенилметантиол.
1. Синтез тиоаминокислоты
Boc-Phe-STrt (1)
В колбе в форме баклажана размещали Boc-Phe-OH (165,4 мг, 0,62 ммоль), PyBOP (1622,1 мг, 3,12 ммоль) и Trt-SH (861,6 мг, 3,12 ммоль) и все это высушивали при пониженном давлении. После высушивания добавляли DCM (3,1 мл) и все это охлаждали до – 20°С. При – 20°С добавляли DIPEA (543,0 мкл) и все это перемешивали в атмосфере аргона на протяжении 2 часов. После этого для нейтрализации добавляли уксусную кислоту (543,0 мкл) и вслед за этим реакционный раствор концентрировали. Концентрированный остаток очищали на колонке с силикагелем (растворитель для элюирования: этилацетат : гексан = 1 : 10) для получения Boc-Phe-STrt 1 (268,4 мг, 0,51 ммоль, 82,2%).
1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 4,82 (д., 1H), 4,62 (кв., 1H), 2,99 (кв., 1H), 2,91 (м., 1H), 1,43 (с., 9H).
13C ЯМР (100 МГц, CDCl3) δ 197,7.
МСВР (ИЭР): рассчитано для C33H33NO3S [M+Na]+ 546,2073, установлено 546,2076.
H-Phe-SH (2)
К Boc-Phe-STrt 1 (268,4 мг, 0,51 ммоль) добавляли 5%-ный раствор TIPS/TFA (5,1 мл) и все это перемешивали при комнатной температуре. По истечении 10 минут реакционный раствор концентрировали и к концентрированному остатку добавляли диэтиловый простой эфир (40 мл) для выведения целевого вещества в осадок. Выпавшее в осадок целевое вещество собирали при использовании технологического процесса центрифугирования. К собранному осадку добавляли диэтиловый простой эфир и технологический процесс центрифугирования повторяли еще раз для промывания осадка. Данное промывание повторяли два раза. Осадок высушивали при обычных температуре и давлении, а после этого растворяли в 0,1%-ном растворе TFA/H2O : MeCN = 1 : 1 и лиофилизовали для получения Boc-Phe-SH 2 (91,2 мг, 0,50 ммоль, 98%).
1H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 7,73 (с., 2,5H), 7,26 (м., 5H), 3,68 (кв., 1H), 3,35 (кв., 1H), 2,92 (кв., 1H).
13C ЯМР (100 МГц, DMSO): δ 208,4, 137,4, 129,9, 128,8, 127,0, 63,9, 38,6.
МСВР (ИЭР): рассчитано для C9H10NOS [M-H]- 180,0489, установлено 180,0489.
Boc-Gly-STrt (3)
В колбе в форме баклажана размещали Boc-Gly-OH (208,2 мг, 1,19 ммоль), WSCI⋅HCl (273,4 мг, 1,43 ммоль), Trt-SH (361,3 мг, 1,31 ммоль) и DMAP (14,5 мг, 0,12 ммоль) и все это высушивали при пониженном давлении. После высушивания добавляли THF (5,9 мл) и все это перемешивали в атмосфере аргона на протяжении 16 часов при комнатной температуре. После этого добавляли этилацетат (20 мл), реакционный раствор разбавляли, органическую фазу два раза промывали при использовании каждого представителя, выбираемого из воды, насыщенного водного раствора хлорида аммония, насыщенного водного раствора гидрокарбоната натрия и насыщенного водного раствора хлорида натрия, и, в заключение, органическую фазу высушивали на сульфате магния. Сульфат магния удаляли в результате фильтрования, а после этого органическую фазу концентрировали. Остаток очищали на колонке с силикагелем (растворитель для элюирования: этилацетат : гексан = 1 : 10) для получения Boc-Gly-STrt 3 (304,6 мг, 0,70 ммоль, 59,1%).
13C ЯМР (100 МГц, CDCl3) δ 194,8.
МСВР (ИЭР): рассчитано для C26H27NO3S [M+Na]+ 456,1604, установлено 456,1601.
H-Gly-SH (4)
При использовании методики, подобной тому, что имеет место для синтезирования Н-Phe-SH 2, из вещества исходного сырья Boc-Gly-STrt 3 (304,6 мг, 0,70 ммоль) получали Н-Gly-SH 4 (63,1 мг, 0,69 ммоль, количественно).
МСВР (ИЭР): рассчитано для C2H4NOS [M-H]- 90,0019, установлено 90,0019.
Boc-Ala-STrt (5)
При использовании методики, подобной тому, что имеет место для синтезирования Boc-Phe-STrt 1, из вещества исходного сырья Boc-Ala-OH (633,4 мг, 3,35 ммоль) получали Boc-Ala-STrt 5 (1243,1 мг, 2,78 ммоль, 83,0%).
13C ЯМР (100 МГц, CDCl3) δ 198,6.
МСВР (ИЭР): рассчитано для C27H29NO3S [M+Na]+ 470,1760, установлено 470,1766.
H-Ala-SH (6)
При использовании методики, подобной тому, что имеет место для синтезирования H-Phe-SH 2, из вещества исходного сырья Boc-Ala-STrt 5 (1243,1 мг, 2,78 ммоль) получали H-Ala-SH 6 (277,7 мг, 2,64 ммоль, 95%).
1H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 7,69 (с., 3H), 3,49 (кв., 1H), 1,32 (д., 3H).
13C ЯМР (100 МГц, DMSO): δ 210,0, 58,4, 19,0.
МСВР (ИЭР): рассчитано для C2H6NOS [M-H]- 104,0176, установлено 104,0176.
Boc-Ser(tBu)-STrt (7)
При использовании методики, подобной тому, что имеет место для синтезирования Boc-Phe-STrt 1, из вещества исходного сырья Boc-Ser(tBu)-OH⋅DCHA 5 (717,6 мг, 1,62 ммоль) получали Boc-Ser(tBu)-STrt 7 (685,2 мг, 1,48 ммоль, 91,1%).
1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,44 (д., 1H), 4,33 (д., 1H), 3,76 (дд., 1H), 3,43 (дд., 1H), 1,45 (с., 9H).
13C ЯМР (100 МГц, CDCl3): δ 197,9.
H-Ser-SH (8)
При использовании методики, подобной тому, что имеет место для синтезирования H-Phe-SH 2, из вещества исходного сырья Boc-Ser(tBu)-STrt 7 (685,2 мг, 1,48 ммоль) получали H-Ser-SH 8 (173,3 мг, 1,43 ммоль, 97%).
1H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 7,69 (с., 3H), 5,11 (с., 1H), 3,96 (кв., 1H), 3,52 (м., 2H).
13C ЯМР (100 МГц, DMSO): δ 206,5, 65,0, 62,5.
МСВР (ИЭР): рассчитано для C3H6NO2S [M-H]- 120,0125, установлено 120,0125.
2. Реакция гомоолигомеризации тиоаминокислоты
Полимеризация H-Phe-SH
К соединению H-Phe-SH 2 (0,40 мг, 2,2 мкмоль), растворенному в воде (221 мкл), добавляли хлорид железа (III) FeCl3 (2,98 мг, 11,0 мкмоль), растворенный в воде (5 мкл), и все это оставляли в покое при комнатной температуре (рН = 1,26). По истечении 0 часов и 2 часов после начала реакции при использовании дозатора отмеряли 2 мкл каждого раствора, реакцию прекращали при использовании фосфатного буфера при рН 7 (20 мкл) и проводили анализ при использовании метода ЖХ-МС. На фигуре 1 продемонстрирован результат по истечении 2 часов (длина волны 220 нм) (метод анализа ЖХ-МС: С18 5 мкм, 4,6 × 100 мм, 0,1%-ный раствор FA : 0,1%-ный раствор FA в 90%-ном растворе MeCN = от 95 : 5 до 45 : 55, 20 минут, скорость течения 0,2 мл/минута).
Фигура 2 представляет собой результат масс-спектрометрии для каждого из интервалов MS(A), MS(B) и MS(C) на фигуре 1. Каждый параметр, выбираемый из значения m/z и композиции для интервалов MS(A), MS(B) и MS(C) на фигуре 1, соответствовал тому, что продемонстрировано ниже: (А) m/z = 460,4: H-FFF-OH, (B) m/z = 476,4: H-FFF-SH, (C) m/z = 1211,8: H-FFFFFFFF-SH.
3. Реакция гетероолигомеризации для тиоаминокислоты
Олигомеризация H-Phe-SH и H-Ala-SH
К смеси из соединений H-Phe-SH 2 (0,7 мг, 3,9 мкмоль) и H-Ala-SH 6 (1,0 мг, 9,5 мкмоль), растворенной в воде (520 мкл), добавляли хлорид железа (III) FeCl3 (5,2 мг, 19,2 мкмоль), растворенный в воде (5 мкл), и все это оставляли в покое при комнатной температуре (рН = 1,40). По истечении 5 минут после начала реакции при использовании дозатора отмеряли 2 мкл раствора, реакцию прекращали при использовании фосфатного буфера при рН 7 (20 мкл) и проводили анализ при использовании метода УВЭЖХ. На фигуре 3 продемонстрирован результат по истечении 1 минуты (длина волны 218 нм) (метод анализа УВЭЖХ: С18 5 мкм, 4,6 × 50 мм, 0,1%-ный раствор FA : 0,09%-ный раствор FA в 90%-ном растворе MeCN = от 95 : 5 до 5 : 95, 5 минут, скорость течения 0,2 мл/минута).
На фигуре 4 и фигуре 5 продемонстрированы композиции основных продуктов, наблюдаемых при однобуквенных представлениях F = Phe и A = Ala. Каждая из позиций от (A) до (J) на фигурах 4 и 5 соответствует результатам масс-спектрометрии согласно измерениям для фракций, продемонстрированных при использовании интервалов от MS(A) до MS(J) на фигуре 3. Фигура 5(J) представляет собой результат частичного увеличения для фигуры 4(I). Каждый параметр, выбираемый из значения m/z и композиции для интервалов от MS(A) до MS(J), соответствовал тому, что продемонстрировано ниже: (А) m/z = 322,20: H-F1A2-OH, (B) m/z = 535,35: H-F1A5-SH, (C) m/z = 327,19: H-F2-SH, m/z = 677,25: H-F1A7-SH, (D) m/z = 398,37: H-F2A1-SH, m/z = 611,24: H-F2A4-SH, (E) m/z = 687,38: H-F3A3-SH, (F) m/z = 763,57: H-F4A2-SH, (G) m/z = 839,54: H-F5A1-SH, (H) m/z = 986,51: H-F6A1-SH, (I) m/z = 1133,53: H-F7A1-SH, m/z = 1280,57: H-F8A1-SH, (J) m/z = 2067,82: H-F9A10-SH.
Максимальный пептид, наблюдавшийся при использовании масс-спектрометрии согласно анализу, проведенному по истечении 5 минут после начала реакции, был образован из 19 остатков аминокислот, и его композиция представляла собой тиокислотный пептид, включающий 9 остатков фенилаланина и 10 остатков аланина (фигура 5J).
4. Олигомеризация Phe-SH и Lys-SH
Boc-Lys(Boc)-STrt (13)
При использовании способа, по существу идентичного тому, что имеет место для вышеупомянутого синтезирования Boc-Phe-STrt 1, из Boc-Lys(Boc)-OH (1,05 г, 1,98 ммоль) получали Boc-Lys(Boc)-STrt 13 (1,10 г, 1,82 ммоль, 92%) в качестве аморфного продукта.
[α]D20 – 26,78 (c = 0,95, CHCl3), 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 7,26 (м.), 4,99 (д., 1H), 4,49(1H), 4,28 (кв., 1H), 3,05 (кв., 2H), 1,67 (м., 1H), 1,45 (с., 9H), 1,44 (с., 9H), 1,40 (м., 1H), 1,18 (м., 2H), 13C ЯМР (100 МГц, CDCl3) δ: 198,2, 156,1, 155,3, 143,6, 129,9, 127,7, 127,1, 80,1, 79,2, 70,3, 60,3, 40,0, 32,2, 29,6, 28,5, 28,3, 22,2. МСВР (ИЭР): рассчитано для C35H44N2NaO5S [M+Na]+ 627,2863, установлено 627,2861.
H-Lys-SH (14)
При использовании способа, по существу идентичного тому, что имеет место для вышеупомянутого синтезирования Н-Phe-SH 2, из Boc-Lys(Boc)-STrt 13 (840 мг, 1,33 ммоль) получали Н-Lys-SH 14 (165 мг, 1,02 ммоль, 73%) в качестве белого порошка.
[α]D20 4,73 (c = 0,74, H2O : MeCN 1 : 1), 1H ЯМР (400 МГц, D2O) δ: 3,86 (т., 1Н), 2,87 (т., 2H), 1,85 (м., 2H), 1,57 (м., 2H), 1,33 (м., 2H). 13C ЯМР (100 МГц, D2O) δ: 214,4, 62,4, 39,0, 31,4, 26,3, 21,1. МСВР (ИЭР): рассчитано для C6H13N2OS [M-Na]- 161,0754, установлено 180,0755.
Олигомеризация Phe-SH и Lys-SH
H-Phe-SH 2 (0,1 мг, 0,55 мкмоль) и H-Lys-SH 14 (0,45 мг, 2,76 мкмоль) растворяли в дегазированной воде (47,5 мкл). К данному раствору добавляли раствор FeCl3⋅6H2O (0,1 мг/мкл, 7,5 мкл), содержащий 5-кратный избыток FeCl3⋅6H2O (2,76 мкмоль). В каждый момент времени реакции реакцию для части реакционной смеси прекращали при использовании фосфатного буфера (рН 7), проводили анализ при использовании метода ЖХМС и отслеживали поступательное прохождение реакции (таблица 1, фигуры 6-9). Весь анализ при использовании метода ЖХ-МС проводили по истечении 5 минут после прекращения реакции.
Таблица. Результаты метода МСВР для олигопептидов, наблюдаемые при реакции олигомеризации для Phe-SH и Lys-SH
| Пептид FK | Заряд иона | Рассчитано для метода MS | Наблюдалось для метода MS | Погрешность (ч./млн.) |
| 1F + 1K | [M+H]+ | 310,1584 | 310,1581 | - 1,0 |
| 1F + 2K | [M+2H]2 + | 219,6303 | 219,6302 | - 0,5 |
| 1F + 3K | [M+2H]2 + | 283,6778 | 283,6774 | - 1,5 |
| 1F + 4K | [M+2H]2 + | 347,7253 | 347,7241 | - 3,5 |
| 2F + 1K | [M+H]+ | 457,2268 | 457,2259 | - 1,9 |
| 2F + 2K | [M+2H]2 + | 293,1645 | 293,1644 | - 0,2 |
| 2F + 3K | [M+2H]2 + | 357,2120 | 357,2122 | 0,6 |
| 2F + 4K | [M+2H]2 + | 421,2595 | 421,2595 | 0,1 |
| 2F + 5K | [M+3H]3 + | 323,8737 | 323,8737 | - 0,1 |
| 2F + 6K | [M+3H]3 + | 366,5721 | 366,5719 | - 0,4 |
| 3F + 1K | [M+H]+ | 604,2952 | 604,2958 | 0,9 |
| 3F + 2K | [M+2H]2 + | 366,6987 | 366,6979 | - 2,3 |
| 3F + 3K | [M+2H]2 + | 430,7462 | 430,7462 | 0 |
| 3F + 4K | [M+3H]3 + | 330,1982 | 330,1983 | 0,2 |
| 3F + 5K | [M+3H]3 + | 372,8965 | 372,8965 | 0 |
| 3F + 6K | [M+4H]4 + | 415,5949 | 415,5953 | 1,1 |
| 3F + 7K | [M+4H]4 + | 343,9717 | 343,9718 | 0,4 |
| 3F + 8K | [M+4H]4 + | 375,9954 | 375,9950 | - 1,1 |
| 4F + 1K | [M+H]+ | 374,1854 | 374,1852 | - 0,7 |
| 4F + 2K | [M+2H]2 + | 440,2329 | 440,2330 | 0,1 |
| 4F + 3K | [M+3H]3 + | 336,5227 | 336,5226 | - 0,2 |
| 4F + 4K | [M+3H]3 + | 379,2210 | 379,2209 | - 0,4 |
| 4F + 5K | [M+3H]3 + | 421,9193 | 421,9194 | 0,1 |
| 4F + 6K | [M+4H]4 + | 348,7151 | 348,7123 | - 7,9 |
| 4F + 7K | [M+4H]4 + | 380,7388 | 380,7390 | 0,6 |
| 4F + 8K | [M+4H]4 + | 412,7625 | 412,7610 | - 3,7 |
| 5F + 1K | [M+2H]2 + | 449,7197 | 449,7198 | 0,3 |
| 5F + 2K | [M+2H]2 + | 513,7671 | 513,7668 | - 0,6 |
| 5F + 3K | [M+3H]3 + | 385,5455 | 385,5458 | 0,8 |
| 5F + 4K | [M+3H]3 + | 428,2438 | 428,2440 | 0,3 |
| 5F + 4K | [M+4H]4 + | 353,4584 | 353,4582 | - 0,6 |
| 5F + 5K | [M+4H]4 + | 385,4822 | 385,4823 | 0,5 |
| 5F + 6K | [M+4H]4 + | 471,5059 | 471,5065 | 1,5 |
| 5F + 7K | [M+5H]3 + | 359,8252 | 359,8248 | - 1,0 |
| 6F + 1K | [M+2H]2 + | 523,2539 | 523,2539 | 0 |
1. Способ получения полимера аминокислот, связанных пептидными связями, отличающийся тем, что он включает:
(А) стадию получения первого и второго аминокислотных производных, каждое из которых продемонстрировано ниже:
H2N-CH(R)-COSH (1)
(где R представляет собой боковую цепь любой аминокислоты); и
(В) стадию проведения реакции окисления для упомянутых первого аминокислотного производного и второго аминокислотного производного для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-SH (2)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты);
где по меньшей мере одно из упомянутых первого аминокислотного производного и второго аминокислотного производного не содержит защитной группы; и
где полимер включает от 4 до 20 аминокислот.
2. Способ получения по п. 1, где упомянутые как первое аминокислотное производное, так и второе аминокислотное производное не содержат защитной группы.
3. Способ получения по п. 1 или 2, включающий:
(С) стадию проведения реакции окисления для соединения (2), полученного на стадии (В), при использовании третьего аминокислотного производного, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-COSH (1)
(где R представляет собой боковую цепь любой аминокислоты)
для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-(NH-CH(R)-CO)2-SH (3)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты).
4. Способ получения по п. 3, отличающийся многократным проведением стадии (С) для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)n-SH (4)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, а n представляет собой целое число, которое составляет 2 и более).
5. Способ получения по п. 3 или 4, где упомянутые одно или несколько третьих аминокислотных производных не содержат защитной группы.
6. Способ получения по любому из пп. 1-5, включающий, кроме того:
(D) стадию проведения реакции между соединением (2), полученным на стадии (В), или соединением (3) или соединением (4), полученными на стадии (С), и нуклеофильным реагентом, продемонстрированным ниже:
Н-Х (5)
(где Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se)
для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)m-X (6)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, m представляет собой любое целое число, а Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se).
7. Способ получения по п. 6, где Х представляет собой заместитель, связанный через атом N или атом S.
8. Способ получения по любому из пп. 1-7, где первое или второе аминокислотные производные или по меньшей мере один из упомянутых представителей более чем одного третьего аминокислотного производного содержат незащищенную 4-аминобутильную группу в качестве боковой цепи.
9. Способ получения по любому из пп. 1-7, где боковые цепи упомянутых первого и второго аминокислотных производных и упомянутых одного или нескольких третьих аминокислотных производных являются идентичными.
10. Способ получения по п. 9, где все упомянутые боковые цепи представляют собой метильные группы.
11. Способ получения полимера представителей более чем одной аминокислоты, связанной пептидными связями, отличающийся тем, что он включает:
(а) стадию получения представителей более чем одного аминокислотного производного, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-COSH (1)
(где R представляет собой боковую цепь любой аминокислоты); и
(b) стадию проведения реакции окисления для упомянутых представителей более чем одного аминокислотного производного для получения представителей более чем одного соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)х-SH (7)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, х представляет собой любое целое число)
и/или соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)у-S-S-(СО-CH(R)-NH)z-CO-CH(R)-NH2 (8)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, а у и z представляют собой любое целое число),
где часть или все из упомянутых представителей более чем одного аминокислотного производного не содержат защитной группы; и
где полимер включает от 4 до 20 аминокислот.
12. Способ по п. 11, где все из упомянутых представителей более чем одного аминокислотного производного не содержат защитной группы.
13. Способ по п. 11 или 12, где соединение, полученное на стадии (b), включает соединение (7).
14. Способ получения по п. 13, дополнительно включающий:
(с1) стадию проведения реакции между соединением (7), полученным на стадии (b), и нуклеофильным реагентом, продемонстрированным ниже:
Н-Х (5)
(где Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se),
для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)х-X (9)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, х представляет собой любое целое число, а Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se).
15. Способ получения по п. 14, где Х представляет собой заместитель, связанный через атом N или атом S.
16. Способ получения по п. 11 или 12, где соединение, полученное на стадии (b), включает соединение (8).
17. Способ получения по п. 16, дополнительно включающий:
(с2) стадию проведения реакции между соединением (8), полученным на стадии (b), и нуклеофильным реагентом, продемонстрированным ниже:
Н-Х (5)
(где Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se),
для получения соединения, продемонстрированного ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)у-X (10)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, у представляет собой любое целое число, а Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se),
и ниже:
H2N-CH(R)-СО-(NH-CH(R)-CO)z-X (11)
(где каждый R, каждый независимо от других, представляет собой боковую цепь любой аминокислоты, z представляет собой любое целое число, а Х представляет собой заместитель, связанный через атом, выбираемый из группы, состоящей из N, O, S и Se).
18. Способ получения по п. 17, где Х представляет собой заместитель, связанный через атом N или атом S.
19. Способ получения по любому из пп. 11-18, где по меньшей мере один из упомянутых представителей более чем одного аминокислотного производного содержит незащищенную 4-аминобутильную группу в качестве боковой цепи.
20. Способ получения по любому из пп. 11-19, где боковые цепи упомянутых представителей более чем одного аминокислотного производного являются идентичными.
21. Способ получения по п. 20, где все упомянутые боковые цепи представляют собой метильные группы.
22. Способ получения по любому из пп. 11-21, который предназначен для производства полипептидной библиотеки.
