Композиция зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая композицию зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина и способ ослабления гиперестезии дентина у субъекта, нуждающегося в этом, путем воздействия вышеуказанной композиции зубной пасты. В одном из вариантов реализации композиция зубной пасты содержит пептид, состоящий из аминокислотной последовательности следующей формулы KY-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (Формула 1), где R1 представляет собой аргинин (R), лизин (K) или глутамин (Q); R2 представляет собой аргинин (R) или глутамин (Q); R3, R4 и R5 представляют собой соответственно аргинин (R) или лизин (K); R6 представляет собой аспарагин (N) или серин (S); и R7 и R8 представляют собой соответственно лизин (K) или тирозин (Y). Изобретение расширяет арсенал средств для ослабления гиперестезии дентина. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 7 ил., 26 табл., 3 пр.

 

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции зубной пасты, и, более конкретно, настоящее изобретение относится к композиции зубной пасты для предотвращения или ослабления гиперестезии дентина путем индукции физиологической реминерализации дефектов дентина в составе зуба.

2. Уровень техники

Гиперестезию дентина обычно называют «повышенной чувствительностью дентина», и она является обычным симптомом, с которым сталкивалось от 8% до 57% взрослого населения. В частности, в случае заболевания пародонта, что является наиболее распространенным заболеванием в Корее, от 72,5% до 98% пациентов страдают «повышенной чувствительностью дентина» (Источник: National Health Information Portal Medical Information; http://health.cdc.go.kr/health/Main.do).

Гиперестезию дентина можно определить как боль, которая вызвана открытием дентинных канальцев, передающих все внешние раздражители к нервам пульпы. Это приводит к тому, что нерв пульпы становится более чувствительным к одному и тому же раздражителю. Несмотря на то, что в самом дентине нет никаких нервов, мы можем воспринимать температурные изменения, поскольку воздействие холода передается через дентинные канальцы к нервам внутри пульпы.

В дентине, занимающем большую часть зуба, имеются дентинные канальцы, которые проходят от пульпы к эмали. Эти канальцы заполнены жидкостью. Их диаметр увеличивается по направлению к пульпе, и они имеет закрытую структуру. Благодаря такой структуре канальцев внешние раздражители могут быстро передаваться к нерву пульпы. Если поверхность дентина повреждена, и количество открытых дентинных канальцев увеличено, то это может при вести к более чувствительной реакции на раздражитель, чем обычная реакция на него.

В настоящее время для борьбы с гиперестезией дентина известны два способа с разными принципами воздействия. Один способ основан на том, чтобы помешать передаче сигнала нерва, который передает боль, а другой - в блокировании (закупориванию) открытых дентинных канальцев для ослабления болевых симптомов, вызванных гиперестезией.

Дикалийфосфат (К₂НРО₄) широко используется в способе, связанном с воздействием на передачу сигнала нервов, которые передают боль. Тем не менее, дикалийфосфат имеет низкий эффект в отношении блокирования боли, и поэтому он должен использоваться повторно и постоянно, что не может рассматриваться как эффективный способ лечения, поскольку он ограничивает чувствительность при жевании.

Для закупоривания дентинных канальцев используют гидрофосфат кальция (СаНРО₄), фтор, оксалат, аргинин (аминокислота) и карбонат кальция (СаСО₃). В последние годы, учитывая неудобства, связанные с обращением к стоматологу по поводу гиперчувствительности дентина, на рынке появились зубные пасты для предотвращения гиперестезии или уменьшения чувствительности дентина, которые содержат в качестве активных ингредиентов фосфат кальция, стоматологический диоксид кремния, хлорид стронция, карбонат кальция или трикальцийфосфат. Однако эти вещества являются инородными материалами, отличающимися от исходного дентина, и поэтому в области периферической границы между дентином и инородным материалом может образоваться зазор. Из-за этого нерв будет снова подвергаться воздействию, поскольку инородный материал отделяется от уплотненного дентина, что вызывает рецидив повышенной чувствительности дентина.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Варианты выполнения настоящего изобретения основаны на предоставлении композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина, содержащий пептид, включающий аминокислотную последовательность следующей формулы 1:

KY-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (Формула 1)

где R1 представляет собой аргинин(R), лизин(K) или глутамин(Q);

R2 представляет собой аргинин(R) или глутамин(Q);

R3, R4 и R5 представляют собой аргинин(R) или лизин(K), соответственно;

R6 представляет собой аспарагин(N) или серин(S); и

R7 и R8 представляют собой лизин(K) или тирозин(Y), соответственно.

Варианты выполнения настоящего изобретения также основаны на предоставлении композиции зубной пасты для ухода за полостью рта, содержащей пептид, включающий любую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1-96.

Варианты выполнения настоящего изобретения предусматривают, что в состав композиции могут быть включены 0,0015-0,0025 массовых частей пептида из расчета на 100 массовых частей композиции.

Варианты выполнения настоящего изобретения предусматривают, что в состав композиции могут быть включены 31,00-33,00 массовых частей трикальцийфосфата из расчета на 100 массовых частей композиции.

Варианты выполнения настоящего изобретения предусматривают, что в состав композиции могут быть включены 0,045-0,055 массовых частей гидроксиапатита из расчета на 100 массовых частей композиции.

Варианты выполнения настоящего изобретения предусматривают, что в состав композиции зубной пасты могут входить 20-22 массовых частей очищенной воды, 33-37 массовых частей увлажнителя, 4,4-5,4 массовых частей модификатора вязкости, 1,1-1,3 массовых частей поверхностно-активного вещества, 0,8-0,9 массовых частей флаворанта и 0,04-0,06 массовых частей разбавителя из расчета на 100 массовых частей композиции.

Варианты выполнения настоящего изобретения предусматривают, что в состав композиции зубной пасты могут входить 0,15-0,25 массовых частей аминокапроновой кислоты и 1,9-2,1 массовых частей аллантоина из расчета на 100 массовых частей композиции.

Варианты выполнения настоящего изобретения предусматривают, что увлажнитель может представлять собой раствор D-сорбита, раствор PCA натрия или концентрированный глицерин, модификатор вязкости может представлять собой водную кремниевую кислоту, ксантановую камедь или CMC (натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы), поверхностно-активное вещество может представлять собой кокоилметилтаурат натрия, флаворант может представлять собой экстракт зеленого чая, экстракт ромашки, экстракт розмарина, настойку мирры, настойку ратании, настойку ромашки, мастиковое масло 40 HF-60662, экстракт прополиса, экстракт семян грейпфрута, ароматизатор мята B71228 или масло мяты перечной 81689, и разбавитель может представлять собой гидроксиапатит.

Варианты выполнения настоящего изобретения предусматривают, что увлажнитель может включать 80-83 масс.% раствора D-сорбита, 7-8 масс.% раствора PCA натрия и 10-12 масс.% концентрированного глицерина.

Варианты выполнения настоящего изобретения предусматривают, что модификатор вязкости может включать 79-85 масс.% водной кремниевой кислоты, 4-8 масс.% ксантановой камеди и 11-13 масс.% CMC.

Эффекты изобретения

Варианты выполнения настоящего изобретения предоставляют композицию зубной пасты, которая предотвращает или ослабляет гиперестезию дентина путем устранения дефектов и закупоривания открытых дентинных канальцев за счет физиологической реминерализации дентина.

Другие аспекты, преимущества и характерные особенности вариантов выполнения изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники из приведенного ниже подробного описания, которое вместе с прилагаемыми фигурами раскрывает иллюстративные варианты выполнения изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фигуре 1A представлен график, показывающий результаты сравнения эффекта действия соответствующих групп пептидов, входящих в состав композиций зубных паст для ослабления гиперестезии дентина по изобретению, на экспрессию DSPP, который представляет собой маркерный ген дифференциации одонтобластов.

На Фигуре 1В представлен график, показывающий результаты сравнения уровней экспрессии гена DSPP, маркера дифференциации одонтобластов в клетках MDPC-23, обработанных пептидами, входящими в состав композиций зубных паст для ослабления гиперестезии дентина по изобретению.

На Фигуре 1С представлен график, показывающий результаты сравнения уровней экспрессии генов DSPP, Dmp1 и Nestin, маркеров дифференциации одонтобластов в клетках MDPC-23, обработанных пептидами группы 11 и группы 12, входящих в состав композиций зубных паст для ослабления гиперестезии дентина по изобретению.

На Фигуре 1D представлен график, показывающий результаты оценки цитотоксичности пептидов, входящих в состав композиций зубных паст для ослабления гиперестезии дентина по изобретению.

На Фигуре 2 представлены результаты измерения молекулярной массы с помощью анализа MALDI-TOF для подтверждения стабильности пептида, входящего в состав композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина по изобретению. На Фигуре 2A показана молекулярная масса пептида, используемого для композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина по изобретению, в соответствии с одним вариантом выполнения изобретения. На Фигуре 2B показана молекулярная масса этого же пептида, входящего в состав композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина по изобретению в соответствии с одним вариантом выполнения изобретения.

На Фигуре 3 показана проницаемость композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина по изобретению в дентинных канальцах. Реагент для флуоресцентного окрашивания (родамин В) смешивали с пастой и обрабатывали в течение 1 минуты зуб с открытыми дентинными канальцами, а затем наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа.

На Фигуре 4 показаны результаты сравнения композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина в соответствии с вариантом выполнения изобретения (Пример 3), со Сравнительным примером 3-1 и Сравнительным примером 3-2 в отношении способности закупоривания дентинных канальцев.

На Фигуре 4 A-D показаны дентинные канальцы, которые обрабатывали только очищенной водой (Сравнительный пример 3-1), На Фигуре 4 E-H показаны дентинные канальцы, обработанные щеткой с композицией зубной пасты без пептида (Сравнительный пример 3-2). На Фигуре 4 I-L показаны дентинные канальцы, обработанные щеткой с композицией зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина в соответствии с изобретением (масштабные шкалы: A, E, I, - 100 мкм, В, F, J - 20 мкм; C, G, K - 20 мкм; D, H, L - 10 мкм). В каждом случае срезы дентина с открытыми дентинными канальцами промывали 3 раза дистиллированной водой после чистки зубов один раз в день в течение 1 минуты, а затем погружали в искусственную слюну. После повторения этого процесса в течение 2 недель оценивали эффективность закупоривания дентинных канальцев с помощью сканирующего электронного микроскопа.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее будет представлено подробное описание вариантов выполнения изобретения, примеры которых проиллюстрированы на прилагаемых фигурах, где одинаковые обозначения позиций относятся к одинаковым элементам. Следует отметить, что представленные варианты выполнения изобретения могут иметь разные формы выполнения, и они не должны ограничиваться описаниями, изложенными в данном документе. Если не указано иное, все термины, включая технические и научные термины, используемые здесь, имеют свои обычные значения, как их понимает обычный специалист в данной области техники, к которой относится изобретение. Кроме того, следует понимать, что термины, определения которых представлено в обычно используемых словарях, должны интерпретироваться как имеющие значение, которое согласуется с их значением в контексте соответствующей области техники, и они не могут интерпретироваться в идеализированном или чрезмерно формальном смысле, если это прямо не определено здесь. Кроме того, смысловые значения терминов, которые будут использоваться ниже, определены с учетом их вкладов в настоящее изобретение, и их смысловое значение может варьироваться в зависимости от намерений пользователя изобретения или практики использования изобретения.

Настоящее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на прилагаемые фигуры, на которых показаны иллюстративные варианты выполнения изобретения. Однако это раскрытие может быть реализовано в различных формах, и его не следует истолковывать как ограничивающее настоящее изобретение конкретными вариантами выполнения, описанными в данном документе, поскольку эти иллюстративные варианты выполнения изобретения представлены для того, чтобы описание давало специалистам в данной области техники полную и исчерпывающую информацию о настоящем изобретении. Поскольку в настоящем описании представлены иллюстративные раскрытия в виде примеров, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается этими примерами, и оно определяется только объемом формулы изобретения, которая представлена здесь.

Следует понимать, что при использовании в данном описании терминов «содержит» и/или «содержащий», которые определяют присутствие перечисляемых компонентов, они подразумевают, что описываемый объект может содержать больше количество компонентов, не исключая другие компоненты, если только не указано особо.

Варианты выполнения настоящего изобретения далее будут описаны более подробно.

Одонтобласт представляет собой клетку, которая синтезирует и секретирует белки и полисахариды, составляющие матрицу дентина. Это столбчатые клетки, которые контактируют с предентином (некальцинированным дентином), и они образуют слой клеток на периферии пульпы зуба. Эта дифференцированная клетка, которая является клеткой, происходящей из мезенхимальной эктодермы, участвует в кальцификации дентина. Одонтобласт на стадии своего развития контактирует с эмалью зуба, наряду с клетками зубного сосочка, участвуя в кальцификации дентина.

Пептид, входящий в состав композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина в соответствии с вариантом выполнения настоящего изобретения (далее - «пептид, промотирующий дифференциацию одонтобластов»), не проявляет цитотоксичности, но может повышать уровень экспрессии генов-маркеров дифференциации одонтобластов DSPP, Dmp1 и Nestin. При трансплантации клеток ткани пульпы в условиях in vivo, клетки ткани пульпы могут образовывать дентиновую/дентиноподобную ткань.

Пептид, промотирующий дифференциацию одонтобластов, включает мутантные пептиды, имеющие иную аминокислотную последовательность, в которой представлен по меньшей мере один другой аминокислотный остаток, при условии, что эти пептиды могут способствовать регенерации дентина или лечению гиперестезии дентина.

Аминокислотные замены в белках и полипептидах, которые обычно не изменяют активность молекулы, известны в данной области. Наиболее часто встречающиеся замены представляют собой следующие аминокислотные замены остатков Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala./Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, в обоих направлениях. Пептид может включать пептиды, которые в результате изменения или модификации аминокислотной последовательности обладают улучшенной структурной стабильностью к нагреву, воздействию pH и т.п., или которые обладают улучшенной способностью промотировать регенерацию дентина или пульпы зуба.

Например, хотя глутамин, который представляет собой кислую аминокислоту в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 по изобретению, заменен основной аминокислотой, лизином или аргинином, можно получить эффекты пептида по изобретению как такового; хотя аргинин, который представляет собой основную аминокислоту в положении 4 или 5 пептида SEQ ID NO: 1, заменен кислой аминокислотой глутамином или основной аминокислотой лизином, можно получить эффекты пептида по изобретению как такового; хотя лизин, который представляет собой основную аминокислоту в положении 6, 7 или 9 пептида SEQ ID NO: 1, заменен основной аминокислотой аргинином или ароматической аминокислотой тирозином, можно получить эффекты пептида по изобретению как такового; хотя аспарагин, который представляет собой кислую аминокислоту в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1, заменен нейтральной аминокислотой серином, можно получить эффекты пептида по изобретению как такового; и хотя тирозин, который представляет собой ароматическую аминокислоту в положении 10 пептида SEQ ID NO: 1, заменен основной аминокислотой лизином, можно получить эффекты пептида по изобретению как такового.

Таким образом, хотя кислые аминокислоты, основные аминокислоты или ароматические аминокислоты, образующие пептид по изобретению, могут быть заменены аминокислотами, имеющими такие же свойства, или заменены другими кислыми аминокислотами, основными аминокислотами, нейтральными аминокислотами или ароматическими аминокислотами, соответственно, можно получить эффекты пептида по изобретению как такового. Поэтому очевидно, что вариант пептида, имеющий последовательность, включающую один или несколько аминокислотных остатков, отличающихся от остатков аминокислотной последовательности, образующей пептид по изобретению, также охватывается определением «пептид по изобретению».

Кроме того, произвольные аминокислоты могут быть добавлены на N-конце или C-конце пептида по изобретению, и при этом могут быть получены такие же эффекты, как у пептида по изобретению. Следовательно, пептид, полученный добавлением произвольной аминокислоты на N-конце или C-конце пептида по изобретению, также охватывается определением «пептид по изобретению». Например, в качестве примера может быть приведен пептид, полученный путем добавления от 1 до 300 аминокислот на N-конце или С-конце пептида по изобретению; в качестве другого примера можно указать пептид, полученный путем добавления от 1 до 100 аминокислот на N-конце или С-конце пептида по изобретению, и в качестве еще одного примера можно указать пептид, полученный добавлением от 1 до 24 аминокислот на N-конце или С-конце пептида по изобретению.

Уровень мРНК гена DSPP в клетках MDPC-23, обработанных пептидом, промотирующим дифференциацию одонтобластов, по сравнению с уровнем мРНК гена DSPP в клетках MDPC-23, не обработанных пептидом, промотирующим дифференциацию одонтобластов (контроль), для всех случаев был выше в 1,3 раза или более (Таблицы 13-24).

Как уже сообщалось, известно, что по мере повышения уровня мРНК гена DSPP, промотируется дифференциация одонтобластов и регенерация дентина, и, следовательно, можно ожидать, что 128 видов пептидов, повышающих уровни мРНК гена Dspp, могут проявлять эффект промотирования дифференциации одонтобластов и регенерации дентина (Taduru Sreenath et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 27, Issue of July 4, pp. 24874-24880, 2003; William T. Butler et al, Connective Tissue Research, 44(Suppl. 1): 171-178, 2003).

Пептид, входящий в состав композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина, можно использовать в форме монопептида или в форме полипептида с 2 или более повторами пептида, и пептид также можно использовать в комплексной форме с лекарственным средством, обладающим терапевтическим эффектом действия в отношении заболевания дентина или пульпы зуба, где лекарственное средство связано с N-концом или C-концом пептида.

Пример 1:

Синтез пептидов для стимуляции дифференциации одонтобластов

Авторы настоящего изобретения синтезировали пептид (SEQ ID NO: 1), обладающий способностью промотировать регенерацию дентина или тканей зубной пульпы, известным способом с использованием 9-флуоренилметилоксикарбонила (Fmoc), и они синтезировали пептиды соответствующих групп (Таблицы 1-12) путем замены аминокислот синтезированного пептида.

N-KYQRRKKNKY-C (SEQ ID NO: 1)

Сначала синтезировали пептиды Группы 1 с использованием пептида SEQ ID NO: 1 или путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (Таблица 1).

Таблица 1

Пептиды Группы 1

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность(N-C)
1 2 3 4 5 6 7 8	KYQRRKKNKY KYQRRKRNKY KYQRRRKNKY KYQRRRRNKY KYQRKKKNKY KYQRKRKNKY KYQRKKRNKY KYQRKRRNKY

Затем синтезировали пептиды Группы 2 путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином или путем замены аминокислоты в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1 серином (Таблица 2).

Таблица 2

Пептиды Группы 2

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность(N-C)
9 10 11 12 13 14 15 16	KYQRRKKSKY KYQRRKRSKY KYQRRRKSKY KYQRRRRSKY KYQRKKKSKY KYQRKRKSKY KYQRKKRSKY KYQRKRRSKY

Затем синтезировали пептиды Группы 3 путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином или путем замены аминокислоты в положении 9 пептида SEQ ID NO: 1 тирозином (Таблица 3).

Таблица 3

Пептиды Группы 3

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность(N-C)
17 18 19 20 21 22 23 24	KYQRRKKNYK KYQRRKRNYK KYQRRRKNYK KYQRRRRNYK KYQRKKKNYK KYQRKRKNYK KYQRKKRNYK KYQRKRRNYK

Затем синтезировали пептиды Группы 4 путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином, путем замены аминокислоты в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1 серином, путем замены аминокислоты в положении 9 пептида SEQ ID NO: 1 тирозином или путем замены аминокислоты в положении 10 пептида SEQ ID NO: 1 лизином (Таблица 4).

Таблица 4

Пептиды Группы 4

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность(N-C)
25 26 27 28 29 30 31 32	KYQRRKKSYK KYQRRKRSYK KYQRRRKSYK KYQRRRRSYK KYQRKKKSYK KYQRKRKSYK KYQRKKRSYK KYQRKRRSYK

Затем синтезировали пептиды Группы 5 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 аргинином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином или путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (Таблица 5).

Таблица 5

Пептиды Группы 5

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность(N-C)
33 34 35 36 37 38 39 40	KYRQRKKNKY KYRQRKRNKY KYRQRRKNKY KYRQRRRNKY KYRQKKKNKY KYRQKRKNKY KYRQKKRNKY KYRQKRRNKY

Затем синтезировали пептиды Группы 6 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 аргинином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином, путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином или путем замены аминокислоты в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1 серином (Таблица 6).

Таблица 6

Пептиды Группы 6

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность(N-C)
41 42 43 44 45 46 47 48	KYRQRKKSKY KYRQRKRSKY KYRQRRKSKY KYRQRRRSKY KYRQKKKSKY KYRQKRKSKY KYRQKKRSKY KYRQKRRSKY

Затем синтезировали пептиды Группы 7 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 аргинином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином, путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином, путем замены аминокислоты в положении 9 пептида SEQ ID NO: 1 тирозином или путем замены аминокислоты в положении 10 пептида SEQ ID NO: 1 лизином (Таблица 7).

Таблица 7

Пептиды Группы 7

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность(N-C)
49 50 51 52 53 54 55 56	KYRQRKKNYK KYRQRKRNYK KYRQRRKNYK KYRQRRRNYK KYRQKKKNYK KYRQKRKNYK KYRQKKRNYK KYRQKRRNYK

Затем синтезировали пептиды Группы 8 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 аргинином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином, путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином, путем замены аминокислоты в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1 серином, путем замены аминокислоты в положении 9 пептида SEQ ID NO: 1 тирозином или путем замены аминокислоты в положении 10 пептида SEQ ID NO: 1 лизином (Таблица 8).

Таблица 8

Пептиды Группы 8

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность(N-C)
57 58 59 60 61 62 63 64	KYRQRKKSYK KYRQRKRSYK KYRQRRKSYK KYRQRRRSYK KYRQKKKSYK KYRQKRKSYK KYRQKKRSYK KYRQKRRSYK

Затем синтезировали пептиды Группы 9 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином или путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (Таблица 9).

Таблица 9

Пептиды Группы 9

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность(N-C)
65 66 67 68 69 70 71 72	KYKQRKKNKY KYKQRKRNKY KYKQRRKNKY KYKQRRRNKY KYKQKKKNKY KYKQKRKNKY KYKQKKRNKY KYKQKRRNKY

Затем синтезировали пептиды Группы 10 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином, путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином или путем замены аминокислоты в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1 серином (Таблица 10).

Таблица 10

Пептиды Группы 10

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность(N-C)
73 74 75 76 77 78 79 80	KYKQRKKSKY KYKQRKRSKY KYKQRRKSKY KYKQRRRSKY KYKQKKKSKY KYKQKRKSKY KYKQKKRSKY KYKQKRRSKY

Затем синтезировали пептиды Группы 11 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином, путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином, путем замены аминокислоты в положении 9 пептида SEQ ID NO: 1 тирозином или путем замены аминокислоты в положении 10 пептида SEQ ID NO: 1 лизином (Таблица 11).

Таблица 11

Пептиды Группы 11

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность(N-C)
81 82 83 84 85 86 87 88	KYKQRKKNYK KYKQRKRNYK KYKQRRKNYK KYKQRRRNYK KYKQKKKNYK KYKQKRKNYK KYKQKKRNYK KYKQKRRNYK

Наконец, синтезировали пептиды Группы 12 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином, путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином, путем замены аминокислоты в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1 серином, путем замены аминокислоты в положении 9 пептида SEQ ID NO: 1 тирозином или путем замены аминокислоты в положении 10 пептида SEQ ID NO: 1 лизином (Таблица 12).

Таблица 12

Пептиды Группы 12

SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность(N-C)
89 90 91 92 93 94 95 96	KYKQRKKSYK KYKQRKRSYK KYKQRRKSYK KYKQRRRSYK KYKQKKKSYK KYKQKRKSYK KYKQKKRSYK KYKQKRRSYK

Пример 2: Подтверждение эффекта промотирования регенерации дентина с использованием одонтобластов

Пример 2-1: Подтверждение эффекта действия пептидов на активность промотора DSPP (дентин сиалофосфопротеин)

Сначала культивировали клетки MDPC-23, которые представляют собой одонтобласты мыши, в среде DMED, дополненной 10% FBS, в условиях 5% CO₂ и 37°C.

Затем культивированные клетки MDPC-23 высевали в 24-луночный планшет при плотности 5 × 10⁴ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов. Затем культивированные клетки трансфицировали рекомбинантным вектором, сконструированным путем введения промотора DSPP и гена люциферазы в pGL3 вектор с использованием реагента Lipofectamine Plus™. Трансфицированные клетки MDPC-23 обрабатывали пептидами Групп 1-12, синтезированными в Примере 1, соответственно, и культивировали в течение 48 часов. Измеряли люциферазную активность в каждой из трансфицированных клеток MDPC-23, и рассчитанные средние уровни активности для соответствующих групп сравнивали друг с другом (Фиг. 1A). При этом трансфицированные клетки MDPC-23, которые не обрабатывали пептидом по изобретению, использовали в качестве контроля.

На Фиг. 1А представлен график, показывающий результаты сравнения эффектов действия каждого из пептидов соответствующих групп по изобретению на экспрессию гена-маркера дифференциации одонтобластов DSPP. Как показано на Фиг. 1A, общие уровни люциферазной активности соответствующих пептидов по настоящему изобретению были приблизительно выше в 1,3 раз и более, чем в контрольной группе, при этом показаны различия, имевшие место в каждой группе. Показано, что пептиды Группы 12 обладают наибольшим уровнем люциферазной активности. Пептиды Группы 11 показали следующий за ними высокий уровень люциферазной активности.

Таким образом подтверждено, что пептиды по изобретению эффективно активируют промотор DSPP.

Пример 2-2: Подтверждение эффекта действия пептидов на уровень экспрессии гена-маркера дифференциации одонтобластов DSPP

Клетки MDPC-23, культивированные в Примере 2-1, обрабатывали пептидами соответствующих групп, которые были синтезированы в Примере 1, и дополнительно культивировали в течение 48 часов. Затем измеряли уровни мРНК гена-маркера дифференциации одонтобластов DSPP, экспрессируемого в клетках MDPC-23, и рассчитывали отношение измеренных уровней мРНК DSPP относительно измеренных уровней мРНК DSPP в контрольной группе, соответственно (Таблицы 13-24). Кроме того, средние значения уровней мРНК Dspp, измеренных в пептидах соответствующих групп, сравнивали между группами (Фиг. 1B). При этом клетки MDPC-23, которые не обрабатывали пептидом по изобретению, использовали в качестве контроля.

Уровни экспрессии гена DSPP измеряли методом ОТ-ПЦР и методом ПЦР в режиме реального времени. Более подробно, общую РНК выделяли из клеток MDPC-23 при помощи реагента TRIzol. Для синтеза кДНК использовали 2 мкг общей РНК, 1 мкл обратной транскриптазы и 0,5 мкг праймера oligo (oligo(dT)). Синтезированную кДНК использовали в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени осуществляли на системе детекции последовательностей ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) и SYBR GREEN PCR Master Mix (Takara, Japan) с использованием праймеров, указанных ниже. Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени осуществляли в условиях: 94°C, 1 мин; 95°C, 15 сек; 60°C, 34 сек для 40 циклов. Результаты анализировали сравнительным методом расчета значений порогового цикла (CT). При этом ген Gapdh использовали в качестве внутреннего контроля. Эксперименты осуществляли в трех повторах, и в качестве измеренных значений использовали средние значения и их стандартные отклонения.

Dspp_F: 5'-ATTCCGGTTCCCCAGTTAGTA-3'(SEQ ID NO: 97)

Dspp_R: 5'-CTGTTGCTAGTGGTGCTGTT-3'(SEQ ID NO: 98)

Gapdh_F: 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'(SEQ ID NO: 99)

Gapdh_R: 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'(SEQ ID NO: 100)

Таблица 13

Эффекты действия пептидов Группы 1 на уровень мРНК гена Dspp

SEQ ID NO:	Уровень мРНК гена Dspp
	Среднее значение	Стандартное отклонение
1 2 3 4 5 6 7 8	1,754 1,646 1,464 1,855 1,639 1,746 1,864 1,639	0,132 0,092 0,221 0,102 0,057 0,091 0,132 0,032

Таблица 14

Эффекты действия пептидов Группы 2 на уровень мРНК гена Dspp

SEQ ID NO:	Уровень мРНК гена Dspp
	Среднее значение	Стандартное отклонение
9 10 11 12 13 14 15 16	1,854 1,746 1,639 1,548 1,685 1,846 1,964 1,739	0,032 0,052 0,201 0,027 0,077 0,141 0,279 0,092

Таблица 15

Эффекты действия пептидов Группы 3 на уровень мРНК гена Dspp

SEQ ID NO:	Уровень мРНК гена Dspp
	Среднее значение	Стандартное отклонение
17 18 19 20 21 22 23 24	2,117 2,319 1,931 2,553 1,893 2,412 2,171 2,212	0,209 0,092 0,102 0,099 0,132 0,072 0,281 0,111

Таблица 16

Эффекты действия пептидов Группы 4 на уровень мРНК гена Dspp

SEQ ID NO:	Уровень мРНК гена Dspp
	Среднее значение	Стандартное отклонение
25 26 27 28 29 30 31 32	2,371 2,193 1,993 2,453 1,883 2,512 2,371 2,219	0,089 0,052 0,202 0,192 0,101 0,209 0,139 0,302

Таблица 17

Эффекты действия пептидов Группы 5 на уровень мРНК гена Dspp

SEQ ID NO:	Уровень мРНК гена Dspp
	Среднее значение	Стандартное отклонение
33 34 35 36 37 38 39 40	1,712 1,931 1,983 2,319 1,597 2,116 1,712 2,219	0,091 0,172 0,102 0,292 0,301 0,211 0,191 0,212

Таблица 18

Эффекты действия пептидов Группы 6 на уровень мРНК гена Dspp

SEQ ID NO:	Уровень мРНК гена Dspp
	Среднее значение	Стандартное отклонение
41 42 43 44 45 46 47 48	1,546 1,586 1,669 1,793 1,532 1,887 1,697 1,558	0,091 0,103 0,095 0,203 0,310 0,077 0,009 0,201

Таблица 19

Эффекты действия пептидов Группы 7 на уровень мРНК гена Dspp

SEQ ID NO:	Уровень мРНК гена Dspp
	Среднее значение	Стандартное отклонение
49 50 51 52 53 54 55 56	1,923 1,887 1,601 2,019 1,592 1,437 1,663 1,701	0,192 0,007 0,082 0,135 0,222 0,341 0,094 0,109

Таблица 20

Эффекты действия пептидов Группы 8 на уровень мРНК гена Dspp

SEQ ID NO:	Уровень мРНК гена Dspp
	Среднее значение	Стандартное отклонение
57 58 59 60 61 62 63 64	2,039 1,998 1,792 2,107 2,301 1,672 1,769 1,967	0,082 0,172 0,007 0,201 0,019 0,308 0,085 0,039

Таблица 21

Эффекты действия пептидов Группы 9 на уровень мРНК гена Dspp

SEQ ID NO:	Уровень мРНК гена Dspp
	Среднее значение	Стандартное отклонение
65 66 67 68 69 70 71 72	1,723 1,627 1,777 1,432 2,011 1,927 1,879 2,011	0,072 0,291 0,027 0,410 0,081 0,105 0,060 0,009

Таблица 22

Эффекты действия пептидов Группы 10 на уровень мРНК гена Dspp

SEQ ID NO:	Уровень мРНК гена Dspp
	Среднее значение	Стандартное отклонение
73 74 75 76 77 78 79 80	2,035 2,011 1,997 2,351 1,729 2,635 2,231 1,837	0,021 0,063 0,059 0,109 0,111 0,091 0,077 0,201

Таблица 23

Эффекты действия пептидов Группы 11 на уровень мРНК гена Dspp

SEQ ID NO:	Уровень мРНК гена Dspp
	Среднее значение	Стандартное отклонение
81 82 83 84 85 86 87 88	3,092 3,361 3,572 3,702 3,670 3,705 3,888 4,021	0,152 0,098 0,209 0,301 0,088 0,137 0,072 0,301

Таблица 24

Эффекты действия пептидов Группы 12 на уровень мРНК гена Dspp

SEQ ID NO:	Уровень мРНК гена Dspp
	Среднее значение	Стандартное отклонение
89 90 91 92 93 94 95 96	4,211 4,811 4,362 4,211 4,525 3,836 4,620 5,211	0,413 0,302 0,182 0,287 0,250 0,099 0,401 0,371

Как показано в Таблицах 13-24, подтверждено, что уровни мРНК гена DSPP в экспериментальных группах, обработанных пептидом по изобретению, были выше в 1,3 раза или более по сравнению с уровнем мРНК гена DSPP в контрольной группе. В частности, подтверждено, что все пептиды Группы 11 показали повышение уровня мРНК гена DSPP в 3 раза или более, и все пептиды Группы 12 показали повышение уровня мРНК гена DSPP в 3,8 раза или более по сравнению с контролем.

Кроме того, на Фиг. 1B представлен график, демонстрирующий результаты сравнения уровней экспрессии гена-маркера дифференциации одонтобластов Dspp в клетках MDPC-23, обработанных пептидами по изобретению. Как показано на Фиг. 1B, при обработке пептидами по изобретению, уровни мРНК гена-маркера дифференциации одонтобластов Dspp были повышены, и аналогично тому, как показано на Фиг. 1A, уровни мРНК были приблизительно выше в 1,3 раза или более, чем уровни мРНК Dspp, измеренные в контрольной группе.

Пример 2-3: Подтверждение эффекта действия пептида на уровень экспрессии генов-маркеров дифференциации одонтобластов DSPP, Dmp1 и Nestin.

Результаты Примера 2-2 подтвержают, что пептиды по изобретению, промотирующие дифференциацию одонтобластов, могут повышать уровни мРНК гена Dspp и, в частности, пептиды Группы 11 и Группы 12 могут повышать уровни мРНК гена Dspp по меньшей мере в три раза или более.

Соответственно, необходимо установить, могут ли пептиды Группы 11 и Группы 12 также повышать уровни мРНК гена Dmp1 и гена Nestin, которые являются другими генами-маркерами дифференциации одонтобластов.

Указанные ниже праймеры использовали в соответствии со способом Примера 2-2. Для оценки влияния на уровни экспрессии генов Dmp1 и Nestin использовали пептиды Группы 11 и Группы 12. Измеряли эффекты действия пептида в отношении промотирования дифференциации, и сравнивали средние уровни (Фиг. 1C). При этом в качестве контрольной группы использовали клетки MDPC-23 без обработки пептидом, промотирующим дифференциацию одонтобластов.

Dmp1_F: 5'-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3'(SEQ ID NO 101)

Dmp1_R: 5'-TGTGGTCACTATTTGCCTGTG-3'(SEQ ID NO 102)

Nestin_F: 5'-CCCTGAAGTCGAGGAGCTG-3'(SEQ ID NO 103)

Nestin_R: 5'-CTGCTGCACCTCTAAGCGA-3'(SEQ ID NO 104)

На Фиг. 1C представлен график, демонстрирующий результаты сравнения уровней экспрессии генов-маркеров дифференциации одонтобластов Dspp, Dmp1 и Nestin в клетках MDPC-23, обработанных пептидами Группы 11 и Группы 12. Как показано на Фиг. 1C, при обработке клеток пептидами по изобретению, все уровни мРНК генов-маркеров дифференциации одонтобластов Dspp, Dmp1 и Nestin повышались, но уровни увеличения для каждого гена были разными. Показано, что пептиды Группы 12 более эффективны.

Поскольку известно, что каждый ген-маркер дифференциации участвует в дифференциации одонтобластов и кальцификации дентина, то необходимо проанализировать пептиды по изобретению в отношении промотирования регенерации дентина.

Пример 2-4: Оценка цитотоксичности пептидов в отношении клеток ткани пульпы

Сначала выделяли стволовые клетки из зубов мудрости 10 взрослых субъектов (возраст 18-22 года) в Школе стоматологии Сеульского Национального Университета. В частности, все эксперименты проводились после их одобрения Экспертным советом учреждения и получения информированного согласия от пациентов. Чтобы обнажить пульпу, зубы мудрости разрушали по методу Jung HS et al. (J Mol Histol. (2011)), и ткани пульпы отделяли щипцами. Каждую из отделенных тканей пульпы зуба измельчали на мелкие кусочки лезвием бритвы, помещали в чашку диаметром 60 мм, накрывали покровным стеклом и затем культивировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко.

Затем полученные клетки ткани пульпы зуба высевали в 96-луночный планшет при плотности 3 × 10³ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали пептидами Группы 11 или Группы 12 при концентрации 10 мкг/мл или 50 мкг/мл, и затем культивировали в течение 1 дня, 3 дней или 5 дней. Клетки после культивирования промывали раствором PBS, добавляли к ним 20 мкл раствора MTT и затем оставляли для протекания реакции при 37°C в течение 4 часов. После завершения реакции раствор MTT удаляли, добавляли 100 мкл DMSO и измеряли поглощение при 540 нм (Фиг. 1D). При этом в качестве контроля использовали клетки ткани пульпы, культивированные без пептида.

На Фиг. 1D представлен график, демонстрирующий результаты оценки цитотоксичности пептидов, промотирующих дифференциацию одонтобластов в клетки ткани пульпы зуба. Как показано на Фиг. 1D, выживаемость клеток ткани пульпы была на том же уровне, что и в контрольной группе, даже когда добавляли пептид, промотирующий дифференциацию одонтобластов.

Пример 3: Приготовление композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина

Стадия 1

Смешивали очищенную воду и раствор D-сорбита.

Стадия 2

Добавляли трикальцийфосфат, аминокапроновую кислоту, аллантоин, водную кремниевую кислоту, раствор PCA натрия, гидроксиапатит, пептид (SEQ ID NO: 96), обработанную ферментом стевию и ксилит, и затем перемешивали в смесителе в течение приблизительно 40 минут (условия: смешивание лопаточной мешалкой: 10-30 об/мин; получение дисперсии: 500-600 об/мин; гомогенизирование: 2400-3200 об/мин).

Стадия 3

Добавляли глицерин (концентрированный) и ксантановую камедь, и затем перемешивали в течение приблизительно 40 минут (условия: смешивание лопаточной мешалкой: 10-30 об/мин; получение дисперсии: 500-600 об/мин; гомогенизирование: 2400-3200 об/мин).

Стадия 4

Добавляли глицерин (концентрированный), натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (CMC), и затем перемешивали в течение приблизительно 40 минут (условия: смешивание лопаточной мешалкой: 10-30 об/мин; получение дисперсии: 500-600 об/мин; гомогенизирование: 2400-3200 об/мин).

Стадия 5

Добавляли кокоилметилтаурат натрия и перемешивали в течение приблизительно 20 минут (условия: смешивание лопаточной мешалкой: 10-30 об/мин; получение дисперсии: 450-650 об/мин).

Стадия 6

Добавляли экстракт зеленого чая, экстракт ромашки, экстракт розмарина, настойку мирры, настойку ратании, настойку ромашки, мастиковое масло 40, экстракт прополиса, экстракт семян грейпфрута, ароматизатор мята, масло мяты перечной, и затем перемешивали в течение приблизительно 15 минут (условия: смешивание лопаточной мешалкой: 10-30 об/мин; получение дисперсии: 450-650 об/мин).

На каждой стадии перемешивание выполняли в условиях пониженного давления (-760 мм рт. ст.).

Таблица 25

Состав композиция зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина по Примеру 3

Составная часть	Ингредиент	Содержание (% масс.)
1	Растворитель	Дистиллированная вода	21,587
	Увлажнитель	Раствор D-сорбитола	30
	Основной компонент	Трикальций фосфат	32
		Аминокапроновая кислота	0,2
	Аллантоин	2
	Модификатор вязкости	Водная кремниевая кислота	4
	Увлажнитель	Раствор PCA натрия	3
	Разбавитель	Гидроксиапатит	0,05
	Пептид, промотирующий дифференциацию одонтобластов	Пептид (SEQ ID NO: 96)	0,002
	Подсластитель агент	Обработанная ферментами стевия	0,1
Ксилит	0,1
2	Увлажнитель	Глицерин (концентрированный)	2
Модификатор вязкости	Ксантановая камедь	0,3
3	Увлажнитель	Глицерин (концентрированный)	2
Модификатор вязкости	CMC (натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы)	0,6
4	Поверхностно-активное вещество	Кокоилметилтаурат	1,2
5	Флаворант	Экстракт зеленого чая	0,01
		Экстракт ромашки	0,01
		Экстракт розмарина	0,01
		Настойка мирры	0,01
		Настойка ратании	0,01
		Настойка ромашки	0,01
		Мастиковое масло 40 HF-60662	0,001
		Экстракт прополиса	0,05
		Экстракт семян грейпфрута	0,1
		Ароматизатор мята B71228	0,05
Масло мяты перечной 81689	0,6
	Всего	100

Приготовление композиций сравнительного примера

Сравнительный пример 3-1:

Подготовленная очищенная вода такого же объема, как и в Примере 3.

Сравнительный пример 3-2:

Использовали все ингредиенты Примера 3, кроме пептида, промотирующего дифференциацию одонтобластов (SEQ ID NO: 96), и композицию готовили аналогичным образом.

Пример тестирования 1:

MALDI-TOF-анализ композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина по Примеру 3.

А. Готовили раствор композиции зубной пасты путем растворения приблизительно 0,5 г образца композиции зубной пасты по Примеру 3 приблизительно в 1 мл дистиллированной воды.

B. Центрифугировали раствор, полученный в A, приблизительно при 15000 об/мин в течение приблизительно 10 минут, и затем собирали супернатант.

C. Смешивали 2 мкл супернатанта, полученного в B, с 2 мкл раствора субстрата (10 мг/мл α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (CHCA) в 0,1% TFA/ACN (1:1, об./об.) и проводили MALDI-TOF-анализ (UltraflexIII TOF/TOF (Bruker Daltonics)) (Фиг. 2, B).

Пример тестирования 2:

Визуально оценивали проницаемость дентинных канальцев после воздействия композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина по Примеру 3.

A. Разрезание зуба для открытия дентинных канальцев

Алмазной пилой делали горизонтальный срез верхней части удаленного зуба человека, чтобы открыть дентинные канальцы, а затем зуб дважды промывали фосфатным буферным раствором в течение приблизительно 5 минут.

B. Очистка зуба со срезом

Ранее полученный зуб со срезом подвергали воздействию 0,5 М раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA, pH 7,4) в течение приблизительно 5 минут, а затем дважды промывали фосфатным буферным раствором в течение приблизительно 5 минут.

С. Добавление красящего флуоресцентного реагента к композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина по Примеру 3

Добавляли 0,1% красящего флуоресцентного реагента к композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина, содержащей пептид, промотирующий дифференциацию одонтобластов (SEQ ID NO: 96), хорошо перемешивали и затем чистили щеткой зуб со стороны среза, открывшего дентинные канальцы, в течение приблизительно 1 минуты.

D. Наблюдение за прониканием композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина.

Зуб, очищенный щеткой со стороны среза, открывшего дентинные канальцы, промывали 3 раза дистиллированной водой, а затем разрезали алмазной пилой по его длине, получая срезы толщиной приблизительно 0,5 мм, так чтобы дентинные канальцы разрезанного зуба располагались по длине среза, и глубину проникания пасты наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Фиг. 3).

Пример тестирования 3:

Наблюдение за способностью композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина по Примеру 3 закупоривать дентиные канальцы

А. Приготовление искусственной слюны

Состав искусственной слюны показан в Таблице 26, приведенной ниже.

Добавляли очищенную воду до конечной концентрации каждого компонента, указанной в Таблице 26, и затем перемешивали. В последнюю очередь добавляли фосфат калия (K₂HPO₄).

pH искусственной слюны составляет около 7,2, как и у человеческой слюны.

Таблица 26

Ингредиент	Концентрация (мМ)
CaCl2	0,7
MgCl2	0,2
К2HPO4	4
KCl	30
NaN3	0,3
HEPES	20

B. Получение образцов дентина с дентинными канальцами

Удаленный человеческий зуб разрезали по горизонтали с помощью алмазной пилы, чтобы получить образец ткани дентина толщиной 1 мм с открытыми дентинными канальцами.

Образец ткани дентина подвергли воздействию 32% раствора фосфорной кислоты в течение приблизительно 5 минут до полного открытия дентинных канальцев, а затем его трижды промывали очищенной водой в течение приблизительно 5 минут. Затем образец ткани дентина промывали 6 раз в ультразвуковом очистителе в течение приблизительно 5 минут, чтобы полностью открыть дентинные канальцы.

После этого образцы трижды промывали фосфатным буферным раствором и хранили до использования.

С. Наблюдение за способностью композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина закупоривать дентинные канальцы

Используя композицию зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина по Примеру 3, полученный образец с открытыми дентинными канальцами чистили щеткой в течение приблизительно 1 минуты, промывали 3 раза дистиллированной водой, а затем подвергали воздействию искусственной слюны в течение приблизительно 24 часов.

После повторения этого процесса в течение 2 недель, образцы трижды промывали дистиллированной водой, сушили, и затем наблюдали уровень закупоривания дентинных канальцев с помощью сканирующего электронного микроскопа (S-4700, Hitachi, Токио, Япония) (Фиг. 4, I-L).

Сравнительный пример тестирования 3-1:

Используя очищенную воду, полученную в Сравнительном примере 3-1, образец с открытыми дентинными канальцами чистили щеткой в течение приблизительно 1 минуты, промывали 3 раза дистиллированной водой, а затем подвергали воздействию искусственной слюны в течение приблизительно 24 часов.

После повторения этого процесса в течение 2 недель, образцы трижды промывали дистиллированной водой, сушили, и затем наблюдали уровень закупоривания дентинных канальцев с помощью сканирующего электронного микроскопа (Фиг. 4, A-D).

Сравнительный пример тестирования 3-2:

Используя зубную пасту, полученную в Сравнительном примере 3-1, образец с открытыми дентинными канальцами чистили щеткой в течение приблизительно 1 минуты, промывали 3 раза дистиллированной водой, а затем подвергали воздействию искусственной слюны в течение приблизительно 24 часов.

После повторения этого процесса в течение 2 недель, образцы трижды промывали дистиллированной водой, сушили, и затем наблюдали уровень закупоривания дентинных канальцев с помощью сканирующего электронного микроскопа (Фиг. 4, E-H).

Результаты Примера тестирования 1 подтверждают стабильность пептида, содержащегося в составе композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина в соответствии с вариантом выполнения настоящего изобретения. На Фиг. 2 представлены результаты измерения молекулярной массы с помощью анализа MALDI-TOF, подтверждающие стабильность пептида в составе композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина в соответствии с вариантом выполнения настоящего изобретения. На Фиг. 2А показана молекулярная масса самого пептида для использования в составе композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина в соответствии с вариантом выполнения настоящего изобретения. На Фиг. 2B показана молекулярная масса пептида, содержащегося в составе композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина в соответствии с вариантом выполнения настоящего изобретения.

Обращаясь к Фиг. 2, следует отметить, что пептид, содержащийся в составе композиции зубной пасты по Примеру 3, имеет такой же пик (молекулярная масса около 1384 Да), что и измеренное значение молекулярной массы исходного пептида. Это подтверждает стабильность пептида, промотирующего дифференциацию клеток ткани дентина, находящегося в составе композиции зубной пасты (см. Фиг.2A и Фиг. 2B).

В соответствии с Примером тестирования 2, в результате наблюдения с помощью флуоресцентного микроскопа за проницаемостью композиции зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина в соответствии с примером 3 в дентинные канальцы, как показано на Фиг. 3, в случае зуба, обработанного композицией, наблюдалась сильная флуоресценция на поверхности дентина. Кроме того, наблюдалось проникновение окрашивающего флуоресцентного реагента вдоль нижней стороны открытых дентинных канальцев.

Кроме того, на Фиг. 4 представлены результаты испытаний по Примеру тестирования 3, и Сравнительных примеров тестирования 3-1 и 3-2. На Фиг. 4 представлена серия фотографий ткани дентина, позволяющих сравнить действие композиции зубной пасты для ослабления гиперестезию дентина по Примеру 3 и композиций Сравнительных примеров 3-1 и 3-2 в отношении способности закупоривания дентинных канальцев. В частности, на Фиг. 4 A-D показаны дентинные канальцы в образцах ткани дентина, обработанные только очищенной водой (Сравнительный пример 3-1). На Фиг. 4 E-H показаны дентинные канальцы в образцах ткани дентина, обработанные композицией зубной пасты без пептида, промотирующего дифференциацию одонтобластов, (Сравнительный пример 3-2). На Фиг. 4 I-L показаны дентинные канальцы в образцах ткани дентина, обработанные композицией зубной пасты, содержащей в своем составе пептид, промотирующий дифференциацию одонтобластов, которая предотвращает или ослабляет гиперестезию дентина в соответствии с вариантом выполнения настоящего изобретения. На фотоснимках представлены масштабные шкалы: на A, E, I - 100 мкм; на B, F, J - 20 мкм; на C, G, K - 20 мкм; на D, H, L - 10 мкм.

На Фиг. 4 видно, что в образцах ткани дентина, обработанных композицией зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина в соответствии с вариантом выполнения настоящего изобретения, дентинные канальцы закупорены за счет реминерализации.

Фиг.4 представляет собой увеличенное изображение дентинных канальцев, закупоренных за счет действия содержащей пептид композиции по уходу за полостью рта, которая предотвращает или ослабляет гиперестезию дентина в соответствии с вариантом выполнения настоящего изобретения, и на ней показаны результаты реминерализации в закупоренных дентинных канальцев и на поверхности ткани дентина.

Как отмечено выше, композиция зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина в соответствии с вариантом выполнения настоящего изобретения образует тонкую пленку на дентине, и при этом прочно связывается с ионами фосфата кальция, высвобождаемыми из трикальцийфосфата, и реминерализует открытые дентинные канальцы и поверхность дентина. Другими словами, композиция зубной пасты для ослабления гиперестезии дентина в соответствии с вариантом выполнения настоящего изобретения вызывает реминерализацию не только на поверхности открытых дентинных канальцев, но также и внутри дентинных канальцев, проявляя тем самым эффект своего действия по ослаблению и/или предотвращению гиперестезии дентина.

Хотя здесь выше описаны со ссылкой на иллюстративные материалы один или несколько вариантов выполнения настоящего изобретения, однако специалистам в данной области техники понятно, что в описанные варианты могут быть внесены различные изменения по форме выполнения и в деталях выполнения без отступления от сущности и объема настоящего изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения.

«Это исследование было поддержано в рамках Проекта развития технологий Министерства малого и среднего бизнеса и стартапов в 2017 году [S2462696]»

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> HysensBio

<120> КОМПОЗИЦИЯ ЗУБНОЙ ПАСТЫ ДЛЯ ОБЛЕГЧЕНИЯ ГИПЕРЕСТЕЗИИ ДЕНТИНА

<130> LP18123PCT

<150> KR 20180053013

<151> 2018-05-09

<160> 104

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 1

Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys Asn Lys Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 2

Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg Asn Lys Tyr

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 3

Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys Asn Lys Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 4

Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg Asn Lys Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 5

Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys Asn Lys Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 6

Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys Asn Lys Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 7

Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Asn Lys Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 8

Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Arg Asn Lys Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 9

Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys Ser Lys Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 10

Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg Ser Lys Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 11

Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys Ser Lys Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 12

Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg Ser Lys Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 13

Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys Ser Lys Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 14

Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys Ser Lys Tyr

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 15

Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Ser Lys Tyr

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 16

Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Arg Ser Lys Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 17

Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys Asn Tyr Lys

1 5 10

<210> 18

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 18

Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg Asn Tyr Lys

1 5 10

<210> 19

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 19

Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys Asn Tyr Lys

1 5 10

<210> 20

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 20

Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg Asn Tyr Lys

1 5 10

<210> 21

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 21

Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys Asn Tyr Lys

1 5 10

<210> 22

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 22

Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys Asn Tyr Lys

1 5 10

<210> 23

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 23

Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Asn Tyr Lys

1 5 10

<210> 24

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 24

Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Arg Asn Tyr Lys

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 25

Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys Ser Tyr Lys

1 5 10

<210> 26

<211> 10

<212> Пептид

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Новый пептид

<400> 26

Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg Ser Tyr Lys