Способ неинвазивной диагностики фиброза миокарда трансплантированного сердца



Владельцы патента RU 2758993:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И.Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике. Определяют уровень экспрессии микроРНК-339 при диагностике фиброза миокарда трансплантата у реципиентов сердца в плазме периферической крови и при уровне выше -5,24 относительных единиц диагностируют наличие фиброза миокарда трансплантата. Способ позволяет сократить время проведения диагностики и её достоверность в любые сроки после трансплантации, а также повысить выживаемость реципиентов и улучшить результаты трансплантации сердца. 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении реципиентов сердца для диагностики фиброза миокарда трансплантата.

Успешное развитие программы трансплантации сердца содействовало решению новых задач - обеспечение длительного выживания и улучшения качества жизни пациентов с трансплантированным сердцем. Патологические процессы, протекающие в трансплантированном сердце, впоследствии могут приводить к разрастанию соединительной ткани - развитию фиброза миокарда. У реципиентов сердца в отдаленные сроки после трансплантации может развиться субклиническая хроническая сердечная недостаточность, возникающая вследствие совокупности различных патологических механизмов (артериальная гипертензия, острое отторжение и васкулопатия трансплантата, а также ряд сопутствующих заболеваний, в том числе наличие сахарного диабета, метаболического синдрома и прочее), приведших к формированию фиброза миокарда трансплантата.

Разработка малоинвазивных методов выявления осложнений в посттрансплантационном периоде - поиск новых биомаркеров - проводится с целью улучшения доклинической диагностики и увеличения продолжительности жизни реципиентов и трансплантатов.

В настоящее время ведутся активные исследования биологических агентов, способных быть индикаторами риска негативных событий, приводящих к дисфункции трансплантированного сердца. Отдельную группу сигнальных молекул, рассматриваемых в качестве перспективных кандидатов на роль таких биомаркеров, составляют МикроРНК. МикроРНК - это семейство малых эндогенных некодирующих одноцепочечных РНК длиной от 18 до 25 нуклеотидов, выступающих в качестве посттранскрипционных регуляторов, играющих ключевую роль во множестве биологических процессов. Исследования последних лет позволили выявить участие микроРНК в развитии и дифференцировке кроветворных клеток, пролиферации и апоптозе, нарушении обмена веществ, аутоиммунных заболеваниях, канцерогенезе и отторжении трансплантированных органов.

Показан диагностический потенциал оценки уровня экспрессии ряда микроРНК в образцах крови пациентов в отношении развития и течения сердечной недостаточности [The diagnostic value of circulating microRNAs in heart failure / Huang YM, Li WW, Wu J, Han M, Li ВН. // Exp Ther Med. - 2019. - 17(3): 1985-2003]. В ряде работ отмечается участие микроРНК-339 в качестве ингибитора пролиферации клеток [MicroRNA-339 inhibits human hepatocellular carcinoma proliferation and invasion via targeting ZNF689 / Hui Zeng, Jiaping Zheng, Song Wen et al. // Drug Des Devel Ther. - 2019. Vol. 13. - P. 435-445.], а также экспресия микроРНК-339 связана с нарушением регуляции свертывания белков [Blood-based microRNA profiling in patients with cardiac amyloidosis / Anselm A Derda, Angelika Pfanne, Christian Bär et al. // PLoS One. - 2018. - Vol. 3(10):e0204235.].

Показан диагностический потенциал измерения концентрации галектина-3 в образцах крови пациентов в отношении развития фиброза миокарда трансплантированного сердца [RU 2709193, С1], однако данная методика эффективна в отношении диагностики фиброза миокарда только в отдаленные сроки после трансплантации; при этом диагностическая эффективность способа имеет место при условии наличия у реципиентов эпизодов острого отторжения в анамнезе.

На сегодняшний день объективным методом верификации степени и характера острого отторжения трансплантированного сердца, васкулопатии и фиброза миокарда трансплантата является эндомиокардиальная биопсия (ЭМБ) и коронографическое исследование [Клинические рекомендации. Трансплантация сердца, наличие трансплантированного сердца, отмирание и отторжение трансплантата сердца. / Профессиональная ассоциация: Общероссийская общественная организация трансплантологов «Российское трансплантологическое общество». - 2020.] - (прототип). ЭМБ выполняются в сроки после трансплантации, предусмотренные протоколом, а также при проявлении признаков нарушения функции трансплантированного сердца.

Однако ЭМБ имеет ряд ограничений и рисков, свойственных инвазивным методам диагностики. Кроме того, при получении биоптата исследуют локальный участок, который не всегда может отражать состояние целого трансплантированного органа. Многочисленные публикации зарубежных и отечественных авторов свидетельствуют о высоком риске осложнений и неблагоприятного исхода при использовании данного метода. В связи с его трудоемкостью существует очевидная необходимость в разработке нового неинвазивного диагностического средства, которое может не только выявить наличие фиброза миокарда трансплантата, но и контролировать лечение реципиента.

Нами поставлена задача - разработать доступный, достоверный способ неинвазивной диагностики фиброза миокарда трансплантированного сердца у реципиентов сердца.

Технический результат заключается в обеспечении доступности и неинвазивности диагностики фиброза миокарда трансплантированного сердца, сокращении времени ее проведения при одновременном достижении достоверной диагностики в любые сроки после трансплантации, а также в повышении выживаемости реципиентов сердца и улучшении результатов трансплантации за счет своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии путем определения уровня экспрессии микроРНК-339 в плазме периферической крови реципиентов сердца.

Предлагаемый способ позволяет повысить выживаемость пациентов с трансплантированным сердцем и улучшить результаты трансплантации сердца за счет своевременного определения показаний к внеплановой ЭМБ путем определения уровня экспрессии микроРНК-339 в плазме периферической крови.

Нами эмпирически установлен достоверный диагностический показатель развития фиброза миокарда трансплантированного сердца, основанный на оценке уровня экспрессии микроРНК-339 в плазме периферической крови реципиентов сердца.

Использование предполагаемого маркера позволяет ограничить круг пациентов, которым требуется проведение ЭМБ для уточнения диагноза фиброза миокарда трансплантированного сердца.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Для диагностики фиброза миокарда трансплантированного сердца у реципиента в плазме периферической крови определяют уровень экспрессии микроРНК-339 по формуле:

Э=log2(2-(Ct1-Ct2)),

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-339,

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-339,

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39.

При величине Э более -5,24 диагностируют наличие фиброза миокарда трансплантата.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве материала для исследования величины экспрессии микроРНК используется плазма периферической крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.

Кровь собирают в одноразовые пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную плазму замораживают и хранят при температуре -20°С.

Уровень экспрессии микроРНК-339 определяют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, с помощью наборов реагентов SerumPlasma (Qiagen, США).

Определение проводится в соответствии с инструкцией к наборам. РНК выделяют из 100 мкл плазмы крови с использованием наборов SerumPlasma (Qiagen, США). После инкубации плазмы с фенольной смесью Qiazol добавляется 1,6×108 копий синтетической микроРНК Caenorhabditis elegans (Cel-miR-39) (Qiagen) в качестве внутреннего контроля экстракции РНК.

Выделенные образцы с тотальной РНК конвертируются путем проведения реакции обратной транскрипции в кДНК: при t°=37°C в течение 60 минут с последующей инкубацией при 95°С в течение 5 минут, охлаждением на льду и доведением объема образца деионизированной водой до 200 мкл. Далее для выявления исследуемых микроРНК выполняется ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Условия реакции ПЦР: 15 минут при t°=95°C с последующим проведением 40 циклов по 15 секунд при t°=94°C, 30 секунд при t°=55°C и 30 секунд при t°=70°C в амплификаторе.

Значение уровня экспрессии микроРНК исследуемых образцов плазмы периферической крови выражают в относительных единицах (отн.ед.) и рассчитывают по формуле:

Э=log2(2-(Ct1-Ct2)),

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-339, отн.ед.

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-339 (то есть значение порогового цикла микроРНК-339 на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе),

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39 (то есть значение порогового цикла внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39, на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе).

У реципиентов сердца с величиной экспрессии микроРНК-339 Э выше -5,24 отн.ед. в плазме периферической крови определяют наличие фиброза миокарда трансплантированного сердца.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1.

Пациенту О., 38 лет, выполнена ортопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал гладко (с первых суток и до двух лет после трансплантации). Иммуносупрессивная терапия назначена по стандартной схеме. Измеренный на 44 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-339 в плазме крови составил -3,58 относительных единиц. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностирован фиброз миокарда трансплантата. Методом ЭМБ диагноз подтвержден: был установлен диффузный фиброз миокарда.

Пример 2.

Пациенту Р., 39 лет, выполнена ортопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал гладко (с первых суток и до двух лет после трансплантации). Иммуносупрессивная терапия назначена по стандартной схеме. Измеренный на 361 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-339 в плазме крови составил -1,38 относительных единиц. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностирован фиброз миокарда трансплантата. Методом ЭМБ диагноз подтвержден: был установлен очаговый фиброз миокарда.

Пример 3.

Пациенту Б., 71 года, выполнена ортопическая трансплантация сердца. Послеоперационный период протекал гладко (с первых суток и до двух лет после трансплантации). Иммуносупрессивная терапия назначена по стандартной схеме лечения. Измеренный на 352 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-339 в плазме крови составил -11,64 относительных единиц. По данным ЭМБ признаков фиброза миокарда трансплантата не обнаружено.

Предложенный способ апробирован в клинической практике на реципиентах сердца в различные сроки после трансплантации (с первых суток и до двух лет после трансплантации). Уровень экспрессии микроРНК-339 после трансплантации выше установленного нами порогового значения наблюдался у 14 пациентов в ранние и/или отдаленные сроки после трансплантации сердца, из них в 12 случаях (86,7%) результатами ЭМБ был верифицирован фиброз миокарда трансплантированного сердца различного типа (диффузный, очаговый, диффузно-очаговый).

Специфичность предложенного способа диагностики составляет 86,7%.

Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность диагностировать наличие фиброза миокарда трансплантированного сердца в любые сроки после трансплантации.

Способ диагностики фиброза миокарда трансплантированного сердца, отличающийся тем, что в плазме периферической крови реципиента определяют уровень экспрессии микроРНК-339 по формуле:

Э=log2(2-(Ct1-Ct2)),

где

Э - уровень экспрессии микроРНК-339,

Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-339,

Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39,

и при величине Э выше -5,24 диагностируют наличие фиброза миокарда трансплантированного сердца.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммуногистохимическим методам исследования. Для оценки экспрессии белка CDX-2 в тканях проводят расчет индекса экспрессии, полученного путем суммирования паттерна экспрессии и произведения протяженности метки на интенсивность метки.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено анти-PD-L1 антитело.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа определения этно-географической группы населения, из которой происходят предки индивидуума, на основе генотипа по однонуклеотидным полиморфизмам в образце, полученном от индивидуума, где полиморфизмы определяют в таблице 1, и вероятность происхождения предков индивидуума из этно-географической группы населения вычисляют по математической формуле.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены варианты способа получения антитела, которое имеет более низкую антигенсвязывающую активность в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены варианты способа получения антитела, которое имеет более низкую антигенсвязывающую активность в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены варианты способа получения антитела, которое имеет более низкую антигенсвязывающую активность в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция.
Изобретение относится к области медицины, в частности к хирургии, и предназначено для прогнозирования исхода развития пролежней у хирургических больных. У хирургических больных осуществляют забор периферической венозной крови с последующим иммунофенотипированием с применением проточной цитометрии.

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу определения функциональной активности классического пути системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции. Способ определения функциональной активности классического пути системы комплемента человека для прогноза тяжести течения системной воспалительной реакции включает проведение реакции лизиса эритроцитов человека группы А системы АВ0 (Е(А)), сенсибилизированных анти-А моноклональными IgM антителами (Е(А)мАт) и сыворотки в условиях вероналового солевого буфера (VBS2+), инкубирование полученной пробы, далее оценивают реакцию комплемент-зависимого лизиса Е(А)мАт турбидиметрически, по снижению оптической плотности суспензии Е(А)мАт при длине волны 620 нм определяют степень лизиса эритроцитов в опытных пробах по калибровочному графику, где контроль Е(А)мАт представляет 0% лизиса, а контроль полного лизиса Е(А)мАт - 100% лизис, при определенных условиях, при этом повышенную функциональную активность классического пути системы комплемента человека отмечают при степени лизиса более 60%, при степени лизиса от 31% до 59% как нормальную и при степени лизиса менее 30% как пониженную функциональную активность системы комплемента человека.

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики и может быть использована для адоптивной иммунотерапии рассеянного склероза. Раскрыты способы отбора образца, содержащего T-клетки, для адоптивной иммунотерапии рассеянного склероза и для включения в банк клеток для указанной терапии, где указанные способы включают определение экспрессии одного или более из CD107a, IFNg, IL-2 и TNF общими лимфоцитами или CD8+ лимфоцитами в образце.
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования F.

Изобретение относится к области животноводства, ветеринарии и экологии и предназначено для определения концентрации кадмия в мышечной ткани крупного рогатого скота. Способ определения концентрации кадмия в мышечной ткани крупного рогатого скота включает анализ субстрата в виде сыворотки крови.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике. Определяют уровень экспрессии микроРНК-339 при диагностике фиброза миокарда трансплантата у реципиентов сердца в плазме периферической крови и при уровне выше -5,24 относительных единиц диагностируют наличие фиброза миокарда трансплантата. Способ позволяет сократить время проведения диагностики и её достоверность в любые сроки после трансплантации, а также повысить выживаемость реципиентов и улучшить результаты трансплантации сердца. 3 пр.

Наверх