Композиции и системы для оценки функции почек
Группа изобретений относится к медицине и касается системы для определения в режиме реального времени скорости клубочковой фильтрации почек (СКФ) у пациента, нуждающегося в этом, указанная система включает вычислительное устройство, устройство отображения, коммуникативно соединенное с указанным вычислительным устройством, источник питания, функционально соединенный с указанным вычислительным устройством, по меньшей мере одна головка датчика, функционально соединенная с кожей пациента и функционально соединенная с указанным вычислительным устройством, и по меньшей мере один индикаторный агент, выполненный с возможностью испускать флуоресценцию при воздействии видимого или ультрафиолетового света. Группа изобретений также касается системы для трансдермального определения СКФ, нормализованной на размер тела у пациента. Группа изобретений обеспечивает определение в режиме реального времени скорости клубочковой фильтрации почек у пациента. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 30 ил., 8 табл., 19 пр.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область раскрытия сущности изобретения в общем относится к способам и фармацевтическим композициям, содержащим производные пиразина, для оценки функции почек пациента, нуждающегося в этом.
Острая почечная недостаточность (ОПН) – это распространенное заболевание среди пациентов, поступающих в общехирургические отделения больниц. Приблизительно половина пациентов, у которых развивается ОПН, умирает либо непосредственно от ОПН, либо от осложнений, связанных с основным заболеванием, при этом для выживших пациентов характерно более тяжелое течение заболевания и длительная госпитализация. Считается общепринятым важность ранней диагностики, поскольку почечная недостаточность часто протекает бессимптомно и обычно необходимо тщательно отслеживать маркеры функции почек в крови. Желательно проводить динамический мониторинг функций почек пациентов, чтобы минимизировать риск острой почечной недостаточности, вызванной различными клиническими, физиологическими и патологическими состояниями. Такой динамический мониторинг особенно важен в случае больных в критическом состоянии или тяжелораненых пациентов, потому что у большого процента таких пациентов есть риск возникновения полиорганной недостаточности (ПОН), потенциально приводящей к смерти. ПОН представляет собой недостаточность функции легких, печени и почек, развивающуюся вследствие одного или нескольких из следующих заболеваний: острого повреждения легких (СОПЛ), респираторного дистресс–синдрома взрослых (РДСВ), гиперметаболизма, гипотензии, острого персистирующего очага воспаления и септического синдрома. Общие гистологические признаки гипотонии и шока, приводящих к ПОН, обычно включают некроз ткани, застой сосудов, интерстициальный и клеточный отек, кровоизлияние и микротромбы. Эти изменения обычно затрагивают легкие, печень, почки, кишечник, надпочечники, мозг и поджелудочную железу в порядке убывания частоты. Переход от ранних стадий травмы к клинической ПОН обычно соответствует определенной стадии печеночной и почечной недостаточности, а также возрастанию риска летального исхода с примерно 30% до примерно 50%.
Традиционно оценку функции почек пациента проводят путем грубого измерения мочеиспускания пациента и уровня креатинина в плазме. Эти значения часто могут быть интерпретированы некорректно, потому что они зависят от возраста, степени гидратации, почечной перфузии, мышечной массы, потребления пищи и многих других клинических и антропометрических показателей. Кроме того, отдельное значение, полученное через несколько часов после взятия пробы, может плохо коррелировать с другими физиологическими показателями, такими как кровяное давление, сердечный выброс, степень гидратации и другие специфические клинические явления (например, кровоизлияние, бактериемия, параметры ИВЛ и другие).
Хроническая болезнь почек (ХБП) – это заболевание, характеризующееся постепенной потерей функции почек с течением времени. Заболевание включает состояния, которые повреждают почки и уменьшают их способность должным образом выводить из крови человека конечные продукты обмена веществ. Осложнения от ХБП включают высокое кровяное давление, анемию (низкое содержание форменных элементов крови), слабые кости, плохое алиментарное здоровье и повреждение нервов в дополнение к повышенному риску сердечных заболеваний. По данным Национального почечного фонда, примерно две трети всех случаев ХБП вызваны диабетом или гипертензией. Помимо случаев болезни почек в семье, другие факторы риска включают возраст, этническую принадлежность, гипертензию и диабет. Определение скорости клубочковой фильтрации почек (СКФ) – наилучший тест для оценки функции почек и стадии ХБП у пациента.
СКФ является важным тестом для оценки уровня функции почек, в соответствии с которым определяют тяжесть ХБП. Как показано в Таблице 1 и на Фиг. 28, чем ниже СКФ, тем тяжелее ХБП. СКФ можно оценить на основании анализа крови, измеряющего уровень креатинина в крови в комбинации с другими факторами. Более точные и, следовательно, более информативные способы требуют введения эндогенного вещества пациенту с последующим тщательным мониторингом выведения мочи в течение определенного периода времени. В большинстве случаев это контрастные агенты (КА), которые сами по себе могут вызывать проблемы с почками. Радиоизотопы или йодированные ароматические кольца представляют собой две основные категории КА, которые применяются для определения СКФ.
Таблица 1.
| Стадия | Описание | СКФ |
| Повышенный риск | Повышение факторов риска (например, диабет, высокое кровяное давление, семейный анамнез, возраст, этническая принадлежность) | > 90 |
| 1 | Повреждение почек с нормальной функцией почек | > 90 |
| 2 | Повреждение почек с легкой потерей функции почек | 60–89 |
| 3a | От легкой до умеренной потери функции почек | 44–59 |
| 3b | От умеренной до тяжелой потери функции почек | 30–44 |
| 4 | Серьезная потеря функции почек | 15–29 |
| 5 | Почечная недостаточность; требуется диализ | < 15 |
Контраст–индуцированная нефропатия (КИН) является серьезным осложнением, связанным с применением радиоизотопов или йодированных КА. Считается, что КИН вызывается либо вазоконстрикцией почек, либо повреждением канальцев, вызванным КА. Разные исследователи определяют КИН по–разному, но наиболее распространенное определение, основанное на симптомах, испытываемых пациентом, включает повышение уровня креатинина в сыворотке по меньшей мере на 25% по сравнению с исходным уровнем на второй–пятый день после воздействия КА в отсутствие других причин острой почечной недостаточности. КИН может быть смертельна для вплоть до 20% пациентов, госпитализированных из–за этих осложнений. Чем тяжелее ХБП, тем выше риск развития КИН. Таким образом, пациенты, наиболее нуждающиеся в точных данных СКФ, подвергаются наибольшему риску развития зачастую смертельных осложнений при получении этих данных.
Что касается обычных способов мониторинга функций почек, приблизительную скорость клубочковой фильтрации (СКФ) пациента можно определить путем сбора мочи пациента на протяжении 24 часов и дальнейшего ее анализа. Данный способ, как следует из названия, обычно занимает порядка 24 часов для сбора мочи и еще несколько часов для анализа, и осложнен необходимостью тщательно собирать мочу у постели больного. К сожалению, нежелательно долгие сроки и значительная продолжительность данного способа могут привести к снижению вероятности эффективного лечения пациента и/или спасению почки (почек). Еще одним недостатком такого типа способов является то, что получение повторных данных также трудозатратно, как и получение первичных данных.
Время от времени изменения уровня креатинина в сыворотке крови пациента должны корректироваться, основываясь на значениях измерений, таких как электролиты и осмолярность мочи пациента, а также произведенных расчетов, таких как «индекс почечной недостаточности» и/или «индекс экскреции натрия». Для таких корректировок сывороточного креатинина требуется одновременный сбор дополнительных образцов сыворотки и/или мочи и, после некоторой задержки, дальнейшие расчеты, что нежелательно. Часто дозировка лекарственного средства корректируется с учетом функции почек и также, как и измеренные значения и расчеты, на которых она основывается, корректировка дозировки может быть неточной, производится с задержкой и ее сложно подвергнуть переоценке. Наконец, для клинических решений в случае больных в критическом состоянии время их принятия также важно, как и их точность.
Известно, что гидрофильные, анионные вещества, как правило, могут выводиться почками. Почечный клиренс обычно осуществляется двумя путями: клубочковая фильтрация и канальцевая секреция. Канальцевая секреция может быть охарактеризована как процесс активного транспорта, и, следовательно, вещества, выводящиеся таким путем, обычно имеют определенный размер, заряд и липофильность.
Большинство веществ, которые проходят через почки, фильтруются через клубочки (небольшая группа переплетенных капилляров в мальпигиевом теле почки). Примеры экзогенных веществ, способных подвергаться почечному клиренсу посредством клубочковой фильтрации (далее называемые «агентами СКФ»), показаны на фиг. 1 и включают креатинин (1), о–йодгиппуран (2) и 99mTc–DTPA (3). Примеры экзогенных веществ, которые способны подвергаться почечному клиренсу посредством канальцевой секреции, включают 99mTc–MAG3 (4) и другие вещества, известные в данной области. 99mTc–MAG3 (4) также широко применяется для оценки функции почек с помощью гамма–сцинтиграфии, а также путем измерения почечного кровотока. Одним из недостатков веществ, показанных на фиг.1, является то, что о–йодгиппуран (2), 99mTc–DTPA (3) и 99mTc–MAG3 (4) включают радиоизотопы, необходимые для их детекции. Даже если бы для мониторинга функции почек применялись нерадиоактивные аналоги (например, аналог о–йодгиппурана (2)) или другие нерадиоактивные вещества, такой мониторинг все равно требует применения нежелательного ультрафиолетового излучения для возбуждения этих веществ.
Производные пиразина известны в данной области для применения при мониторинге функции почек, включая те, которые раскрыты в US 8155000, US 8664392, US 8697033, US 8722685, US 7778309, US 9005581, US 9114160, US 9283288, US 9376399 и US 9480687, включенных посредством ссылки во всей своей полноте.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном из аспектов в данном документе раскрыто соединение по формуле I, где
Формула I
каждый X1 и X2 независимо представляют собой –CO2R1, –CONR1R2, –CO(AA) или –CONH(PS); каждый Y1 и Y2 независимо выбраны из группы, состоящей из –NR1R2 и
;
Z1 представляет собой одинарную связь, –CR1R2–, –O–, –NR1–, –NCOR1–, –S–, –SO– или –SO2–; каждый из R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из H, –CH2(CHOH)aH, –CH2(CHOH)aCH3, –CH2(CHOH)aCO2H, –(CHCO2H)aCO2H, –(CH2CH2O)cH, –(CH2CH2O)cCH3, –(CH2)aSO3H, –(CH2)aSO3–, –(CH2)aSO2H, –(CH2)aSO2–, –(CH2)aNHSO3H, –(CH2)aNHSO3–, –(CH2)aNHSO2H, –(CH2)aNHSO2–, –(CH2)aPO4H3, –(CH2)aPO4H2–, –(CH2)aPO4H2–, –(CH2)aPO43–, –(CH2)aPO3H2, –(CH2)aPO3H– и –(CH2)aPO32–; AA представляет собой пептидную цепь, содержащую одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из природных и неприродных аминокислот, соединенных друг с другом пептидными или амидными связями, и варианты АА могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга; PS представляет собой сульфатированную или несульфатированную полисахаридную цепь, содержащую одно или несколько моносахаридных звеньев, соединенных гликозидными связями; и «a» представляет собой число от 1 до 10, «c» представляет собой число от 1 до 100, и каждый из «m» и «n» независимо представляет собой число от 1 до 3.
В другом аспекте в данном документе раскрыта система для определения СКФ у пациента, нуждающегося в этом. Система включает вычислительное устройство, устройство отображения, коммуникативно соединенное с указанным вычислительным устройством, источник питания, который функционально соединен с указанным вычислительным устройством и обеспечивает электрическую изоляцию системы от внешних источников питания, одну или несколько головок датчиков, функционально соединенных с указанным вычислительным устройством и, по меньшей мере, один индикаторный агент, выполненный с возможностью испускать спектральную энергию при воздействии электромагнитного излучения. Вычислительное устройство выполнено с возможностью управлять и контролировать работу головок датчиков, записывать одно или несколько измерений, полученных с помощью указанных головок датчиков, и вычислять СКФ у указанного пациента на основании проведенных измерений. Одна или несколько головок датчиков содержат, по меньшей мере, один источник электромагнитного излучения и выполнены с возможностью генерировать и доставлять электромагнитное излучение, детектировать и измерять спектральную энергию, испускаемую указанным индикаторным агентом, и передавать указанное измерение, испускаемое, указанным индикаторным агентом указанному вычислительному устройству. Индикаторный агент выполнен с возможностью введения указанному пациенту и испускания спектральной энергии, которая может быть детектирована указанными головками датчиков при воздействии электромагнитного излучения.
В еще одном аспекта в данном документе раскрыта система для трансдермального определения у пациента СКФ, нормализованной на размер тела. Система включает вычислительное устройство, устройство отображения, коммуникативно соединенное с указанным вычислительным устройством, источник питания, который функционально соединен с указанным вычислительным устройством и обеспечивает электрическую изоляцию системы от внешних источников питания, одну или несколько головок датчиков, функционально соединенных с указанным вычислительным устройством и, по меньшей мере, один индикаторный агент, выполненный с возможностью испускать спектральную энергию при воздействии электромагнитного излучения. Одна или несколько головок датчиков содержат, по меньшей мере, один источник электромагнитного излучения и выполнены с возможностью генерировать и доставлять электромагнитное излучение, детектировать и измерять спектральную энергию, испускаемую указанным индикаторным агентом, и передавать указанное измерение, испускаемое, указанным индикаторным агентом указанному вычислительному устройству. Индикаторный агент выполнен с возможностью введения указанному пациенту и испускания спектральной энергии, которая может быть детектирована указанными головками датчиков при воздействии электромагнитного излучения. Вычислительное устройство выполнено с возможностью управлять и контролировать работу указанных головок датчиков, записывать одно или несколько измерений, полученных с помощью указанных головок датчиков, определять параметр затухания по данным измерения спектральной энергии в течение временного интервала измерения, определять показатель качества, связанный со спектральной энергией, измеренной в течение временного интервала измерения, применять показатель качества, чтобы определить, является ли определение параметра затухания достаточно точным или если нет, увеличивать временной интервал измерения до тех пор, пока оценка показателя качества не будет проводится с достаточной точностью, преобразовывать параметр затухания в скорректированное по размеру тела или объему распределения (Vd) нормализованное измерение СКФ с помощью индикаторного агента, и выводить результат на устройстве отображения.
В еще одном аспекте в данном документе раскрыт способ определения скорости клубочковой фильтрации (СКФ) у пациента, нуждающегося в этом. Способ включает введение указанному пациенту соединения по формуле I или его фармацевтически приемлемой соли, измерение концентрации соединения по формуле I у указанного пациента в течение временного интервала измерения и определение СКФ у указанного пациента, где в соединении по формуле I, каждый X1 и X2 независимо представляют собой
Формула I
–CO2R1, –CONR1R2, –CO(AA) или –CONH(PS); каждый Y1 и Y2 независимо выбраны из группы, состоящей из –NR1R2 и
;
Z1 представляет собой одинарную связь, –CR1R2–, –O–, –NR1–, –NCOR1–, –S–, –SO– или –SO2–; каждый из R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из H, –CH2(CHOH)aH, –CH2(CHOH)aCH3, –CH2(CHOH)aCO2H, –(CHCO2H)aCO2H, –(CH2CH2O)cH, –(CH2CH2O)cCH3, –(CH2)aSO3H, –(CH2)aSO3–, –(CH2)aSO2H, –(CH2)aSO2–, –(CH2)aNHSO3H, –(CH2)aNHSO3–, –(CH2)aNHSO2H, –(CH2)aNHSO2–, –(CH2)aPO4H3, –(CH2)aPO4H2–, –(CH2)aPO4H2–, –(CH2)aPO43–, –(CH2)aPO3H2, –(CH2)aPO3H– и –(CH2)aPO32–; AA представляет собой пептидную цепь, содержащую одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из природных и неприродных аминокислот, соединенных друг с другом пептидными или амидными связями, и варианты АА могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга; PS представляет собой сульфатированную или несульфатированную полисахаридную цепь, содержащую одно или несколько моносахаридных звеньев, соединенных гликозидными связями; и «a» представляет собой число от 1 до 10, «c» представляет собой число от 1 до 100, и каждый из «m» и «n» независимо представляет собой число от 1 до 3.
В еще одном аспекте в данном документе раскрыт способ оценки функции почек у пациента. Способ включает введение флуоресцентного соединения или его фармацевтически приемлемой соли указанному пациенту; воздействие на указанное флуоресцентное соединение электромагнитным излучением, что приводит к испусканию спектральной энергии указанным флуоресцентным соединением; детекцию спектральной энергии, испускаемой указанным флуоресцентным соединением; и оценку функции почек пациента на основе детектированной спектральной энергии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 приведены несколько известных контрастных агентов для мониторинга функции почек.
На фиг. 2 представлена система для мониторинга СКФ у пациента.
На фиг. 3A, 3B, 3C и 3D представлены графики клиренса MB–102, иллюстрирующие фармакокинетическую модель с двумя компартментами у четырех разных пациентов с разными значениями СКФ в диапазоне от 120 мл/мин (3A) до 25 мл/мин (3D).
На фиг. 4 представлен график сравнения СКФ, определенной с помощью MB–102 по сравнению с Omnipaque®.
На фиг. 5 приведена гистограмма процента извлечения MB–102 из мочи пациентов–людей через 12 часов.
На фиг. 6 приведена гистограмма концентрации MB–102 в плазме для периода полураспада у пациентов–людей.
На фиг. 7 представлен график, показывающий корреляцию с течением времени между концентрацией MB–102 в плазме и интенсивностью чрескожной флуоресценции у пациента с СКФ на уровне 117 мл/мин/1,73 м2.
На фиг. 8 представлен график, показывающий корреляцию с течением времени между концентрацией MB–102 в плазме и интенсивностью чрескожной флуоресценции у пациента с СКФ на уровне 61 мл/мин/1,73 м2.
На фиг. 9 представлен график, показывающий корреляцию с течением времени между концентрацией MB–102 в плазме и интенсивностью чрескожной флуоресценции у пациента с СКФ на уровне 23 мл/мин/1,73 м2.
На фиг. 10 представлен график корреляции трансдермально предсказанной СКФ с СКФ, измеренной по плазме с помощью MB–102, и нормализованной на площадь тела субъекта (способ исключения выбросов 1; гибридный способ смещения).
На фиг. 11 представлен график корреляции трансдермально предсказанной СКФ с СКФ, измеренной по плазме с помощью MB–102, и нормализованной на объем распределения индикаторного агента в субъекте (способ исключения выбросов 1; гибридный способ смещения).
На фиг. 12 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: СКФ по йогексолу, ненормализованная (выбросы не исключались; способ аппроксимации с фиксированным смещением).
На фиг. 13 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: СКФ по йогексолу, нормализованная на ППТ (выбросы не исключались; способ аппроксимации с фиксированным смещением).
На фиг. 14 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: СКФ по йогексолу, нормализованная на Vd (способ 1) (выбросы не исключались; способ аппроксимации с фиксированным смещением).
На фиг. 15 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: СКФ по MB–102, ненормализованная (выбросы не исключались; способ аппроксимации с фиксированным смещением).
На фиг. 16 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: СКФ по MB–102, нормализованная на ППТ (выбросы не исключались; способ аппроксимации с фиксированным смещением).
На фиг. 17 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: СКФ по MB–102, нормализованная на Vd, способ 1 (выбросы не исключались; способ аппроксимации с фиксированным смещением).
На фиг. 18 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: СКФ по MB–102, нормализованная на Vd, способ 2 (выбросы не исключались; способ аппроксимации с фиксированным смещением).
На фиг. 19 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: способ с переменным смещением (выбросы не исключались; определение СКФ по MB–102, 2 способ нормализации на Vd).
На фиг. 20 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: гибридный способ смещения (выбросы не исключались; определение СКФ по MB–102, 2 способ нормализации на Vd).
На фиг. 21 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: способ исключения выбросов 1 (гибридный способ смещения; определение СКФ по MB–102, нормализация на ППТ).
На фиг. 22 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: способ исключения выбросов 1 (гибридный способ смещения; определение СКФ по MB–102, 2 способ нормализации на Vd).
На фиг. 23 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: способ исключения выбросов 2 (гибридный способ смещения; определение СКФ по MB–102, нормализация на ППТ).
На фиг. 24 представлен график корреляции СКФ, определенной по плазме, со скоростью клиренса чрескожной флуоресценции: способ исключения выбросов 2 (гибридный способ смещения; определение СКФ по MB–102, 2 способ нормализации на Vd).
На фиг. 25 представлен график, на котором суммирована оптимизация сдвига RDTC для выбора способа смещения, применяемого при аппроксимации RDTC.
На фиг. 26 представлен график, на котором суммирована оптимизация предела допустимой ошибки для выбросов константы скорости затухания флуоресценции.
На фиг. 27 представлен график, на котором суммирована оптимизация предела допустимой ошибки для выбросов СКФ, определенной по плазме крови.
На фиг. 28 представлено графическое изображение 5 стадий хронической болезни почек в зависимости от уровня СКФ.
На фиг. 29А представлен график сравнения рСКФ с СКФ, определенной по ФК в плазме, нормализованной на площадь тела субъекта (нСКФ). На график наложена сетка ошибок, показывающая точность диагностики для разных стадий ХБП. Измерения, попадающие в рамку только с зелеными сторонами, были бы правильно диагностированы по рСКФ. Измерения, попадающие в рамку с зеленой и желтой сторонами, будут неправильно диагностированы по рСКФ на одной стадии ХБП. Измерения, попадающие в рамку с желтой и красной сторонами, будут неправильно диагностированы по рСКФ на двух стадиях ХБП.
На фиг. 29В представлен график сравнения трансдермально определенной СКФ (тСКФ) с СКФ, определенной по ФК в плазме, нормализованной на площадь тела субъекта (нСКФ). На график наложена сетка ошибок, показывающая точность диагностики для разных стадий ХБП. Измерения, попадающие в рамку только с зелеными сторонами, были бы правильно диагностированы по тСКФ. Измерения, попадающие в рамку с зеленой и желтой сторонами, будут неправильно диагностированы по тСКФ на одной стадии ХБП. Измерения, попадающие в рамку с желтой и красной сторонами, будут неправильно диагностированы по тСКФ на двух стадиях ХБП.
На фиг. 29С представлен график сравнения трансдермально определенной СКФ (тСКФ) с СКФ, определенной по ФК в плазме, нормализованной на объем распределения индикаторного агента в субъекте (нСКФ). На график наложена сетка ошибок, показывающая точность диагностики для разных стадий ХБП. Измерения, попадающие в рамку только с зелеными сторонами, были бы правильно диагностированы по тСКФ. Измерения, попадающие в рамку с зеленой и желтой сторонами, будут неправильно диагностированы по тСКФ на одной стадии ХБП. Измерения, попадающие в рамку с желтой и красной сторонами, будут неправильно диагностированы по тСКФ на двух стадиях ХБП.
На фиг. 30 представлен график трансдермально измеренной СКФ, автоматически определенной на двух участках тела в режиме реального времени.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Все ссылки в настоящем документе на «пиразин», «производное пиразина», «молекулу пиразина», «соединение пиразина» или «аналог пиразина» относятся ко всем соединениям по формуле I. Кроме того, каждая ссылка на пиразин включает все его фармацевтически приемлемые соли, если специально не указано иное. В виде солей соединения могут быть заряженными или незаряженными и могут быть протонированы с образованием соответствующего катиона или депротонированы с образованием соответствующего аниона. Все аспекты и варианты осуществления, раскрытые в данном документе, распространяются на соединения по формуле I, и конкретные примеры носят только иллюстративный характер и не ограничивают объем настоящего раскрытия.
В одном из аспектов в данном документе раскрыто производное пиразина по формуле I или его фармацевтически приемлемая соль,
Формула I
где каждый X1 и X2 независимо представляют собой –CO2R1, –CONR1R2, –CO(AA) или –CONH(PS); каждый Y1 и Y2 независимо выбраны из группы, состоящей из –NR1R2 и
;
Z1 представляет собой одинарную связь, –CR1R2–, –O–, –NR1–, –NCOR1–, –S–, –SO– или –SO2–; каждый из R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из H, –CH2(CHOH)aH, –CH2(CHOH)aCH3, –CH2(CHOH)aCO2H, –(CHCO2H)aCO2H, –(CH2CH2O)cH, –(CH2CH2O)cCH3, –(CH2)aSO3H, –(CH2)aSO3–, –(CH2)aSO2H, –(CH2)aSO2–, –(CH2)aNHSO3H, –(CH2)aNHSO3–, –(CH2)aNHSO2H, –(CH2)aNHSO2–, –(CH2)aPO4H3, –(CH2)aPO4H2–, –(CH2)aPO4H2–, –(CH2)aPO43–, –(CH2)aPO3H2, –(CH2)aPO3H– и –(CH2)aPO32–; AA представляет собой пептидную цепь, содержащую одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из природных и неприродных аминокислот, соединенных друг с другом пептидными или амидными связями, и варианты АА могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга; PS представляет собой сульфатированную или несульфатированную полисахаридную цепь, содержащую одно или несколько моносахаридных звеньев, соединенных гликозидными связями; и «a» представляет собой число от 1 до 10, «c» представляет собой число от 1 до 100, и каждый из «m» и «n» независимо представляет собой число от 1 до 3. В еще одном аспекте «a» представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.
В некоторых аспектах, по меньшей мере, один из X1 и X2 представляет собой –CO(PS) или –CO(AA). В еще одном аспекте как X1, так и X2 представляет собой –CO(AA).
(AA) представляет собой пептидную цепь, содержащую одну или несколько природных или неприродных аминокислот, соединенных друг с другом пептидными или амидными связями. Пептидная цепь (AA) может представлять собой одну аминокислоту, гомополипептидную цепь или гетерополипептидную цепь, и может быть любой подходящей длины. В некоторых вариантах осуществления природные или неприродные аминокислоты представляют собой α–аминокислоту. В еще одном аспекте α–аминокислота представляет собой D–α–аминокислоту или L–α–аминокислоту. В полипептидной цепи, содержащей две или более аминокислот, каждая аминокислота выбрана независимо от другой (других) во всех аспектах, включая, структуру боковой цепи и стереохимию, но не ограничиваясь этим. Например, в некоторых вариантах осуществления пептидная цепь может включать от 1 до 100 аминокислот, от 1 до 90 аминокислот, от 1 до 80 аминокислот, от 1 до 70 аминокислот, от 1 до 60 аминокислот, от 1 до 50 аминокислот, от 1 до 40 аминокислот, от 1 до 30 аминокислот, от 1 до 20 аминокислот или даже от 1 до 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидная цепь может включать от 1 до 100 α–аминокислот, от 1 до 90 α–аминокислот, от 1 до 80 α–аминокислот, от 1 до 70 α–аминокислот, от 1 до 60 α–аминокислот, от 1 до 50 α–аминокислот, от 1 до 40 α–аминокислот, от 1 до 30 α–аминокислот, от 1 до 20 α–аминокислот или даже от 1 до 10 α–аминокислот. В некоторых вариантах осуществления аминокислота выбрана из группы, состоящей из D–аланина, D–аргинина, D–аспарагина, D–аспарагиновой кислоты, D–цистеина, D–глутаминовой кислоты, D–глутамина, глицина, D–гистидина, D– гомосерина, D–изолейцина, D–лейцина, D–лизина, D–метионина, D–фенилаланина, D–пролина, D–серина, D–треонина, D–триптофана, D–тирозина и D–валина. В некоторых вариантах осуществления α–аминокислоты пептидной цепи (AA) выбраны из группы, состоящей из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глютамина, гистидина, гомосерина, лизина и серина. В некоторых вариантах осуществления α–аминокислоты пептидной цепи (AA) выбраны из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, гомосерина и серина. В некоторых вариантах осуществления пептидная цепь (AA) относится к одной аминокислоте (например, D–аспарагиновая кислота или D–серин).
В некоторых вариантах осуществления (AA) представляет собой одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из 21 незаменимой аминокислоты. В других аспектах АА выбран из группы, состоящей из D–аргинина, D–аспарагина, D–аспарагиновой кислоты, D–глутаминовой кислоты, D–глутамина, D–гистидина, D–гомосерина, D–лизина и D–серина. Предпочтительно AA представляет собой D–аспарагиновую кислоту, глицин, D–серин или D–тирозин. Наиболее предпочтительно АА представляет собой D–серин.
В некоторых вариантах осуществления (AA) представляет собой β–аминокислоту. Примеры β–аминокислот включают β–фенилаланин, β–аланин, 3–амино–3–(3–бромфенил)пропионовую кислоту, 3–аминобутановую кислоту, цис–2–амино–3–циклопентен–1–карбоновую кислоту, транс–2–амино–3–циклопентен–1–карбоновую кислоту, 3–аминоизомасляную кислоту, 3–амино–2–фенилпропионовую кислоту, 3–амино–4–(4–бифенилил)масляную кислоту, цис–3–аминоциклогексанкарбоновую кислоту, транс–3–аминоциклогексанкарбоновую кислоту, 3–аминоциклопентанкарбоновую кислоту, 3–амино–2–гидрокси–4–фенилмасляную кислоту, 2–(аминометил)фенилуксусную кислоту, 3–амино–2–метилпропионовую кислоту, 3–амино–4–(2–нафтил)масляную кислоту, 3–амино–5–фенилпентановую кислоту, 3–амино–2–фенилпропионовую кислоту, 4–бром–β–Phe–OH, 4–хлор–β–гомоPhe–OH, 4–хлор–β–Phe–OH, 2–циано–β–гомоPhe–OH, 2–циано–β–гомоPhe–OH, 4–циано–β–гомоPhe–ОН, 3–циано–β–Phe–OH, 4–циано–β–Phe–OH, 3,4–диметокси–β–Phe–OH, γ,γ–дифенил–β–гомоAla–ОН, 4–фтор–β–Phe–OH, β–Gln–OH, β–гомоAla–OH, β–гомоArg–OH, β–гомоGln–OH, β–гомоGlu–OH, β–гомоHyp–OH, β–гомоLeu–OH, β–гомоLys–OH, β–гомоMet–OH, β2–гомофенилаланин, β–гомоPhe–OH, β3–гомоPro–OH, β–гомоSer–OH, β–гомоThr–OH, β–гомоTrp–OH, β–гомоTrp–OMe, β–гомоTyr–OH, β–Leu–OH, β–Leu–OH, β–Lys(Z)–OH, 3–метокси–β–Phe–OH, 3–метокси–β–Phe–OH, 4–метокси–β–Phe–OH, 4–метил–β–гомоPhe–OH, 2–метил–β–Phe–OH, 3–метил–β–Phe–OH, 4–метил–β–Phe–ОН, β–Phe–OH, 4–(4–пиридил)–β–гомоAla–OH, 2–(трифторметил)–β–гомоPhe–OH, 3–(трифторметил)–β–гомоPhe–OH, 4–(трифторметил)–β–гомоPhe–OH, 2–(трифторметил)–β–Phe–OH, 3–(трифторметил)–β–Phe–OH, 4–(трифторметил)–β–Phe–OH, β–Tyr–OH, этил–3–(бензиламино)пропионат, β–Ala–OH, 3–(амино)–5–гексеновую кислоту, 3–(амино)–2–метилпропионовую кислоту, 3–(амино)–2–метилпропионовую кислоту, 3–(амино)–4–(2–нафтил)масляную кислоту, 3,4–дифтор–β–гомоPhe–OH, γ,γ–дифенил–β–гомоAla–OH, 4–фтор–β–гомоPhe–OH, β–Gln–OH, β–гомоAla–OH, β–гомоArg–OH, β–гомоGln–OH, β–гомоGlu–OH, β–гомоHyp–OH, β–гомоIle–OH, β–гомоLeu–OH, β–гомоLys–OH, β–гомоMet–OH, β–гомоPhe–OH, β3–гомопролин, β–гомоThr–OH, β–гомоTrp–OH, β–гомоTyr–OH, β–Leu–OH, 2–метил–β–гомоPhe–OH, 3–метил–β–гомоPhe–OH, β–Phe–OH, 4–(3–пиридил)–β–гомоAla–OH, 3–(трифторметил)–β–гомоPhe–OH, β–глутаминовую кислоту, β–гомоаланин, β–гомоглутаминовую кислоту, β–гомоглутамин, β–гомогидроксипролин, β–гомоизолейцин, β– гомолейцин, β–гомометионин, β–гомофенилаланин, β–гомопролин, β–гомосерин, β–гомотреонин, β–гомотриптофан, β–гомотирозин, β–лейцин, β–фенилаланин, пирролидин–3–карбоновую кислоту и β–Dab–OH, но не ограничиваясь этим.
(PS) представляет собой сульфатированную или несульфатированную полисахаридную цепь, содержащую одно или несколько моносахаридных звеньев, соединенных гликозидными связями. Полисахаридная цепь (PS) может быть любой подходящей длины. Например, в некоторых вариантах осуществления полисахаридная цепь может включать от 1 до 100 моносахаридных звеньев, от 1 до 90 моносахаридных звеньев, от 1 до 80 моносахаридных звеньев, от 1 до 70 моносахаридных звеньев, от 1 до 60 моносахаридных звеньев, от 1 до 50 моносахаридных звеньев, от 1 до 40 моносахаридных звеньев, от 1 до 30 моносахаридных звеньев, от 1 до 20 моносахаридных звеньев или даже от 1 до 10 моносахаридных звеньев. В некоторых вариантах осуществления полисахаридная цепь (PS) представляет собой гомополисахаридную цепь, состоящую из моносахаридных звеньев пентозы или гексозы. В других вариантах осуществления полисахаридная цепь (PS) представляет собой гетерополисахаридную цепь, состоящую из одного или обеих пентозных и гексозных моносахаридных звеньев. В некоторых вариантах осуществления моносахаридные звенья полисахаридной цепи (PS) выбраны из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, маннозы, ксилозы и рибозы. В некоторых вариантах осуществления полисахаридная цепь (PS) относится к одному моносахаридному звену (например, глюкозе или фруктозе). В еще одном аспекте полисахаридная цепь представляет собой аминосахар, где одна или несколько гидроксигрупп сахара заменены на аминогруппу. Соединение с карбонильной группой может быть осуществлено либо через аминогруппу, либо через гидроксигруппу.
В некоторых вариантах осуществления для производного пиразина по формуле I, по меньшей мере, один из Y1 или Y2 представляет собой
,
Z1 представляет собой одинарную связь, –CR1R2–, –O–, –NR1–, –NCOR1–, –S–, –SO– или –SO2–; каждый из R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из H, –CH2(CHOH)aH, –CH2(CHOH)aCH3, –CH2(CHOH)aCO2H, –(CHCO2H)aCO2H, –(CH2CH2O)cH, –(CH2CH2O)cCH3, –(CH2)aSO3H, –(CH2)aSO3–, –(CH2)aSO2H, –(CH2)aSO2–, –(CH2)aNHSO3H, –(CH2)aNHSO3–, –(CH2)aNHSO2H, –(CH2)aNHSO2–, –(CH2)aPO4H3, –(CH2)aPO4H2–, –(CH2)aPO4H2–, –(CH2)aPO43–, –(CH2)aPO3H2, –(CH2)aPO3H– и –(CH2)aPO32–; a, c, m и n такие, как описано в другом месте в данном документе.
В еще одном аспекте, по меньшей мере, один из Y1 и Y2 представляет собой –NR1R2, и R1 и R2 являются такими, как описано выше. В еще одном аспекте оба Y1 и Y2 представляют собой –NR1R2, и R1 и R2 являются такими, как описано выше. Альтернативно, R1 и R2 оба независимо выбраны из группы, состоящей из H, –CH2(CHOH)aCH3, –(CH2)aSO3H, –(CH2)aNHSO3H, и –(CH2)aPO3H2. В еще одном аспекте оба R1 и R2 представляют собой водород.
В любом аспекте соединения пиразина один или несколько атомов могут быть альтернативно замещены изотопно–меченным атомом того же элемента. Например, атом водорода может быть изотопно мечен дейтерием или тритием; атом углерода может быть изотопно мечен 13C или 14C; атом азота может быть изотопно мечен 14N или 15N. Изотопная метка может представлять собой стабильный изотоп или может представлять собой нестабильный изотоп (то есть радиоактивный). Молекула пиразина может содержать одну или несколько изотопных меток. Изотопная метка может быть частичной или полной. Например, молекула пиразина может быть на 50% мечена дейтерием, что дает молекуле радиоактивную подпись, которую можно легко контролировать с помощью масс–спектроскопии или другого способа. В качестве другого примера, молекула пиразина может быть мечена тритием, что дает молекуле радиоактивную подпись, которую можно отслеживать как in vivo, так и ex vivo с применением способов, известных в данной области.
Фармацевтически приемлемые соли известны в данной области. В любом аспекте в данном документе пиразин может быть в форме фармацевтически приемлемой соли. Для примера, а не для ограничения, фармацевтически приемлемые соли включают соли, описанные Berge, et al. в J. Pharm. Sci., 66(1), 1 (1977), который включен посредством ссылки во всей своей полноте с образовательной целью. Соль может быть катионной или анионной. В некоторых вариантах осуществления противоион для фармацевтически приемлемой соли выбран из группы, состоящей из ацетата, бензолсульфоната, бензоата, безилата, бикарбоната, битартрата, бромида, эдетата кальция, камсилата, карбоната, хлорида, цитрата, дигидрохлорида, эдетата, эдисилата, эстолата, эзилата, фумарата, глюцептата, глюконата, глутамата, гликоллиларсанилата, гексилрезорцината, гидрабамина, гидробромида, гидрохлорида, гидроксинафтоата, йодида, изетионата, лактата, лактобионата, малата, малеата, манделата, мезилата, метилбромида, метилнитрата, метилсульфата, муката, напсилата, нитрата, памоата, пантотената, фосфата, дифосфата, полигалактуроната, салицилата, стеарата, субацетата, сукцината, сульфата, танната, тартрата, теоклата, триэтиодида, адипата, альгината, аминосалицилата, ангидрометиленцитрата, ареколина, аспартата, бисульфата, бутилбромида, камфората, диглюконата, дигидробромида, дисукцината, глицерофосфата, гемисульфата, гидрофторида, гидрохлорида, метиленбис(салицилата), нападизилата, оксалата, пектината, персульфата, фенилэтилбарбитурата, пикрата, пропионата, тиоцианата, тозилата, ундеканоата, бензатина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, меглюмина, прокаина, бенетамина, клемизола, диэтиламина, пиперазина, трометамина, алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия, цинка, бария и висмута. Любая функциональная группа производного пиразина, способная образовывать соль, необязательно может образовывать соль с применением способов, известных в данной области. Для примера, а не в качестве ограничения, соли амингидрохлорида могут быть образованы путем добавления соляной кислоты к пиразину. Фосфатные соли могут быть образованы путем добавления фосфатного буфера к пиразину. Любая имеющаяся кислотная функциональная группа, такая как сульфоновая кислота, карбоновая кислота или фосфоновая кислота, может быть депротонирована с помощью подходящего основания с образованием соли. Альтернативно, аминогруппа может быть протонирована соответствующей кислотой с образованием соли амина. Соль может быть однозарядной, двухзарядной или трехзарядной, и при наличии нескольких противоионов, они могут быть одинаковыми или разными.
В еще одном аспекте в данном документе раскрыт способ измерения скорости клубочковой фильтрации почек (СКФ) у пациента, нуждающегося в этом. Способ включает введение пациенту соединения пиразина или его фармацевтически приемлемой соли, измерение трансдермальной флуоресценции у указанного пациента с течением времени и определение СКФ у указанного пациента. Период времени для осуществления единичного измерения СКФ называется в данном документе «временным интервалом измерения». Во многих ситуациях бывает клинически полезно осуществлять оценку СКФ с течением времени. Следовательно, в некоторых аспектах раскрытия предусмотрены множественные последовательные оценки СКФ. В некоторых аспектах множественные последовательные оценки СКФ проводятся после однократного введения индикаторного агента. Общая продолжительность времени, в течение которого проводятся измерения СКФ после однократной инъекции, будет называться в данном документе периодом ответа после однократной инъекции. В некоторых аспектах существует временное перекрытие между временными интервалами измерения. В таких случаях интервал времени, в течение которого сообщается СКФ (временной интервал ответа), не обязательно совпадает с временным интервалом измерения. Например, в одном из вариантов осуществления смежные временные интервалы измерения перекрываются на 50% и временной интервал ответа составляет половину временного интервала измерения. В некоторых аспектах временные интервалы измерения имеют разную продолжительность. В предпочтительном варианте осуществления если смежные временные интервалы измерения имеют разную продолжительность, время их перекрытия выбрано таким образом, чтобы составлять 50% меньшего из двух временных интервалов измерения. В некоторых аспектах СКФ пациента определяют с применением системы, раскрытой в другом месте в данном документе.
В еще одном аспекте временной интервал измерения автоматически корректируется в соответствии с показателем, связанным с качеством сигнала (также называемым в данном документе показателем качества). Показатель качества может основываться на оценках отношения сигнал флуоресценции/шум (SNR), отношения сигнал/фон (SBR), показателей хорошего совпадения, коэффициента корреляции или любой их комбинации. В одном из аспектов линия совпадает с логарифмом интенсивности флуоресценции в течение временного интервала измерения (или, что эквивалентно, одноэкспоненциальная функция аппроксимирует усиление флуоресценции в зависимости от времени). Разница между аппроксимирующей линией и данными («остаток аппроксимации») применяется для оценки «шума». В одном из аспектов шум представляет собой среднеквадратичное значение (RMS) остатка аппроксимации. В другом аспекте шум представляет собой медианное абсолютное отклонение (MAD) остатка аппроксимации. «Сигнал» может быть определен как амплитуда одноэкспоненциальной функции, полученной из аппроксимации. В другом аспекте сигнал выбирается как разность между аппроксимирующей флуоресценцией в начале и в конце временного интервала измерения. В другом аспекте уровень сигнала флуоресценции перед инъекцией применяется для определения «фона», а SBR вычисляется путем деления фона на уровень сигнала. В случае применения либо SNR, либо SBR в качестве показателя качества может быть определено минимальное пороговое значение, и только если показатель качества выше этого порогового значения, аппроксимация будет считаться действительной для определения СКФ. В другом аспекте в качестве показателя качества применяется предполагаемая ошибка константы времени или скорости, определяемая путем аппроксимации флуоресценции с течением времени. В этом случае аппроксимация может считаться действительной, только если вычисленный показатель качества ниже предварительно определенного порогового значения. В некоторых других аспектах аппроксимирующая константа времени или скорости определяется как сигнал, а предполагаемая ошибка от аппроксимации определяется как шум, и этот вариант SNR применяется в качестве показателя качества. В другом аспекте коэффициент корреляции применяется в качестве показателя качества. Для вычисления коэффициента корреляции может применяться любой из различных способов, известных в данной области, например, коэффициент корреляции Пирсона или коэффициент корреляции соответствия (concordance correlation coefficient). В еще одном аспекте различные показатели качества объединяются в один показатель качества, или аппроксимирующий результат считается действительным только в целях определения СКФ, если все выбранные показатели качества удовлетворительные.
В другом аспекте определяется минимальный временной интервал измерения, и показатель качества применяется для определения того, следует ли сообщать СКФ пользователю или для удлинения временного интервала измерения. В одном из таких вариантов осуществления длина временного интервала измерения автоматически увеличивается до тех пор, пока показатель качества не достигнет порогового значения, после чего СКФ сообщается пользователю. В другом аспекте предварительная аппроксимация осуществляется для константы времени или скорости, или прогнозируемой СКФ, и применяются для установки временного интервала измерения на предварительно определенную длину. В одном из вариантов осуществления минимальное время измерения установлено равным 60 минутам, после чего выполняется аппроксимация и выполняется предварительная оценка СКФ. Если предварительная оценка СКФ выше 75 мл/мин/1,73 м2, то результат сообщается пользователю, и временной интервал измерения устанавливается на 60 минут. Однако если предварительная оценка СКФ ниже 75 мл/мин/1,73 м2, то результат не сообщается пользователю, и временной интервал измерения увеличивается до 120 минут.
В другом аспекте оценивается и периодически предоставляется пользователю оставшийся период ответа после однократной инъекции. Основой для оценки оставшегося периода ответа после однократной инъекции может быть SNR, SBR или предполагаемая ошибка аппроксимации, например, способы, описанные выше для определения показателя качества, но показатель качества, применяемый для определения временного интервала измерения, и показатель качества, применяемой для определения оставшегося периода ответа после однократной инъекции, могут быть одинаковыми или разными. В некоторых аспектах в дополнение к показателю качества для оценки оставшегося периода ответа после однократной инъекции применяется аппроксимирующее время затухания флуоресценции или константа скорости. В одном из вариантов осуществления аппроксимирующая константа времени затухания флуоресценции и SNR объединяются, чтобы предсказать оставшийся период ответа после однократной инъекции. SNR масштабируется в диапазоне между минимальными и максимальными значениями от 0 до 1 и умножается на константу времени затухания флуоресценции. Далее полученное значение масштабируется для прогнозирования периода ответа после однократной инъекции. Коэффициент масштабирования – это калибровочный коэффициент, который определяется путем анализа ранее полученных данных для пациентов–людей, животных, в in vitro исследованиях, в имитационных моделях или любой их комбинации.
В еще одном аспекте, фильтрация и/или исключение выбросов применяются к данным флуоресценции до проведения аппроксимации в рамках временного интервала измерения. Примеры соответствующих фильтров включают: средний фильтр, фильтр функций с бесконечным откликом, медианный фильтр, фильтр усеченного среднего. Примеры способов исключения выбросов включают все показатели качества, описанные выше, но применяемые к временным интервалам измерений.
В некоторых аспектах показатель качества вычисляется на основе измеренной энергии эмиссии индикаторного агента как функции времени в течение временного интервала измерения. Показатель качества может применяться, чтобы определить, следует ли сообщать вычисленную СКФ. В других аспектах показатель качества применяется для принятия решения о расширении временного интервала измерения. Например, временной интервал измерения может автоматически расширяться до тех пор, пока показатель качества не будет выше предварительно определенного порогового значения, после которого пользователю сообщается СКФ.
Нормализованная на размер тела пациента СКФ определяется путем аппроксимации измеренной энергии эмиссии индикаторного агента как функции времени на протяжении временного интервала измерения к параметру затухания. В некоторых аспектах этот параметр затухания представляет собой константу скорости (или ее обратную величину, называемую константой времени) из одноэкспоненциальной аппроксимации. В некоторых аспектах смещение аппроксимирующей функции фиксируется на нуле; в других аспектах смещение является переменным членом в аппроксимации; в других аспектах фиксированное или допустимое изменение смещения зависит от предварительной оценки параметра затухания. Временной интервал измерения выбирается так, чтобы он начинался после того, как индикаторный агент уравновесился в теле, в течение периода, когда затухание интенсивности эмиссии происходит из–за почечного клиренса индикаторного агента. Аппроксимирующая константа скорости умножается на наклон калибровки, чтобы определить СКФ, нормализованную на размер тела пациента. Наклон калибровки определяется путем анализа ранее полученных данных для пациентов–людей, животных, в in vitro исследованиях, в имитационных моделях или любой их комбинации.
Поскольку физический размер пациента может влиять на оценку функционирования почек, в некоторых аспектах для дальнейшего улучшения измерения для нормализации вычисления СКФ применяется показатель размера тела. В некоторых аспектах показателем размера тела, применяемым для нормализации СКФ, является площадь поверхности тела (ППТ). В других аспектах показателем размера тела является объем распределения (Vd) индикаторного агента.
Способы и системы, раскрытые в данном документе, также позволяют осуществлять мониторинг СКФ у пациента в режиме реального времени. Кроме того, множественные измерения или определения СКФ могут быть осуществлены за одно введение индикаторного агента. В некоторых аспектах после введения индикаторного агента проводят одно измерение СКФ. В других аспектах после введения индикаторного агента проводят множественные измерения СКФ, что обеспечивает получение данных о СКФ в режиме реального времени. В некоторых таких аспектах предусмотрена оценка оставшегося времени, на протяжении которого оставшаяся концентрация индикаторного агента будет достаточной для продолжения определения СКФ.
В еще одном аспекте в данном документе раскрыт способ измерения скорости клубочковой фильтрации почек (СКФ) у пациента, нуждающегося в этом. Способ включает введение пациенту соединения пиразина или его фармацевтически приемлемой соли, измерение трансдермальной флуоресценции у указанного пациента в течение временного интервала измерения и определение СКФ у указанного пациента. В некоторых аспектах СКФ пациента определяется с применением системы, раскрытой в другом месте в данном документе.
В еще одном аспекте в данном документе раскрыт способ определения СКФ у пациента, нуждающегося в этом. Способ включает введение указанному пациенту соединения по формуле I или его фармацевтически приемлемой соли или его фармацевтически приемлемой лекарственной формы, измерение концентрации соединения по формуле I у указанного пациента с течением временного интервала измерения и определение СКФ у указанного пациента.
В некоторых аспектах и со ссылкой на вышеупомянутый способ измерение концентрации пиразина включает мониторинг трансдермальной флуоресценции у пациента. В еще одном аспекте измерение концентрации пиразина включает взятие аликвот крови у пациента и измерение концентрации пиразина с помощью ВЭЖХ или других способов, известных в данной области. Например, пиразин может содержать радиоизотоп, который можно определить количественно. В еще одном аспекте измерение концентрации пиразина может включать сбор мочи пациента в течение определенного периода времени для определения скорости, с которой почки выводят соединение из организма пациента.
В еще одном аспекте и со ссылкой на вышеупомянутый способ концентрация пиразина у пациента контролируется с помощью трансдермальной флуоресценции. Это может включать контакт медицинского устройства с кожей пациента, при этом указанное медицинское устройство выполнено с возможностью вызывать флуоресцентную реакцию в соединении по формуле I, и детектирование указанной реакции. Медицинское устройство может контактировать с кожей пациента в любом подходящем месте. Конкретные подходящие для этого места включают грудину, нижнюю часть грудины, большую грудную мышцу, окципитальный треугольник, лоб, подбородок, верхнюю часть бедра и нижнюю часть бедра. Также могут применяться другие места на пациенте в зависимости от удобства, конструкции медицинского устройства и/или медицинской потребности. В некоторых аспектах в этом способе применяется система, раскрытая в другом месте в данном документе.
В одном из аспектов вышеупомянутого способа устройство отображения применяется, чтобы предложить пользователю подключить датчик к одному или нескольким конкретным участкам тела. В одном из таких вариантов осуществления применяется интерфейс с сенсорным экраном, и пользователь получает указание прикоснуться к изображению местоположения участка на теле, к которому был прикреплен датчик, чтобы перейти к следующему этапу в процессе настройки измерения. Это обеспечивает преимущество, заключающееся в том, что невозможно разместить датчик на участках тела, которые не подходят или не являются оптимальными для определения СКФ.
В другом аспекте следующим этапом является настройка выходных уровней источника света и уровней усиления детектора. В одном из таких аспектов уровни усиления детектора и уровни источника света первоначально устанавливаются на низком уровне, а затем уровни источника света последовательно увеличиваются до тех пор, пока не будет достигнут целевой уровень сигнала. В одном из вариантов осуществления источник света является источником возбуждения для флуоресцентного агента СКФ, и ток возбуждения источника увеличивается до тех пор, пока не будет достигнут целевой сигнал флуоресценции или пока не будет достигнут предварительно определенный максимальный ток. В случае, когда максимальный ток источника достигается без достижения желаемого уровня сигнала флуоресценции, далее последовательно увеличивается усиление детектора, пока не будет достигнут целевой сигнал флуоресценции или не будет достигнута максимальная настройка усиления детектора.
В некоторых аспектах измерение коэффициента диффузного отражения кожи выполняется в дополнение к измерению флуоресценции кожи и агента СКФ. В таких аспектах сигнал диффузного отражения может применяться для определения оптимального выходного сигнала источника и уровней усиления детектора. В других аспектах измерения диффузного отражения выполняются в диапазонах длин волн для возбуждения и испускания флуоресцентного агента СКФ. В таких аспектах настройка уровней светодиодного источника и коэффициентов усиления детектора может выполняться с применением коэффициента диффузного отражения вместо уровней флуоресцентного сигнала для управления настройками. В одном из таких аспектов целевые уровни или сигналы диффузного отражения составляют от 15% до 35% уровня сигнала, при котором наблюдаются эффекты насыщения детектора или усилителя. Это создает область для колебаний сигнала, которые могут быть связаны с движением пациента или другими физиологическими изменениями. Описанные способы оптимизации выходных сигналов источника света и/или усиления детекции имеют то преимущество, что они обеспечивают возможность компенсации физиологических различий между разными пациентами или в разных участках тела у одного и того же пациента. В одном из аспектов основным фактором, который компенсируется таким образом, является содержание меланина в коже. Другие физиологические факторы, которые могут потребовать компенсации, включают кровенаполнение, содержание воды и рассеивание в объеме ткани, сигнал от которого оптически детектируется датчиком. В другом аспекте, если желаемые целевые значения сигнала не достигнуты, пользователю не разрешается продолжить измерение. Таким образом, невозможно получить неточные результаты.
Как только были успешно достигнуты желаемые уровни сигнала, в другом аспекте записывается базовый сигнал. В одном из таких аспектов оценивается стабильность базовой линии, например, путем аппроксимации наклона для зависимости сигнала от времени, и базовая линия не считается правильной, если наклон кривой не ниже предварительно определенного порогового значения. В некоторых аспектах устройство отображения дает пользователю указание не продолжать введение индикаторного агента до тех пор, пока не будет получена стабильная базовая линия. Таким образом, измерение невозможно провести, если датчик не был правильно установлен или прикреплен. Кроме того, пользователю может быть запрещено продолжать измерение, если индикаторный агент от предыдущей инъекции еще не выведен из организма до желаемой степени.
После получения стабильной базовой линии в другом аспекте вышеупомянутого способа в сосудистое пространство пациента инъецируют индикаторный агент. Введение индикаторного агента автоматически детектируется как быстрое увеличение трансдермальной флуоресценции пациента, которая измеряется с помощью одного или нескольких датчиками. Для этой цели может применяться предварительно определенное пороговое значение для скорости изменения, абсолютного изменения сигнала или относительного изменения сигнала. Об автоматической детекции агента пользователю может сообщаться на устройстве отображения, таком как монитор с сенсорным экраном. В другом аспекте, сразу после детектирования индикаторного агента применяется дополнительное пороговое значение, чтобы определить, достаточно ли индикаторного агента для начала измерения СКФ. В одном из таких аспектов измерения флуоресценции (Fmeas) и диффузного отражения (DR) объединяются таким образом, чтобы уменьшить влияние физиологических различий на объединенный результат (в данном документе называемый собственной флуоресценцией или IF), так что, например, компенсируется влияние цвета кожи на измерение. Достаточно ли индикаторного агента далее оценивается путем сравнения IF с предварительно установленным пороговым значением. В некоторых аспектах IF определяется с помощью формулы вида:
Уравнение (1)
в которой нижние индексы у DR членов уравнения относятся к измерениям, собранным в диапазонах длин волн возбуждения (ex) и испускания (em) индикаторного агента, для детектора с фильтром и для детектора без фильтра, а верхние индексы у DR членов уравнения представляют собой калибровочные коэффициенты, которые могут быть определены путем анализа ранее полученных данных для пациентов–людей, животных, в in vitro исследованиях, в имитационных моделях или любой их комбинации. Таким образом, если для точной оценки СКФ было введено недостаточно индикаторного агента, медицинскому работнику, проводящему измерение, может быть предоставлена возможность дополнительно ввести индикаторный агент или прекратить измерение.
После того, как индикаторный агент введен, в другом аспекте контролируется уравновешивание индикаторного агента во внеклеточном пространстве. В одном из аспектов временной интервал измерения не запускается, пока не будет определено, что уравновешивание произошло достаточно полно. Для оценки прогресса в уравновешивании может быть применена аппроксимация экспоненциальной функцией. Например, изменение интенсивности флуоресценции с течением времени может быть аппроксимировано одноэкспоненциальной функцией, и только после того, как аппроксимирующая константа времени стабильна, уравновешивание считается завершенным. В одном из таких аспектов пользователю доступна текущая оценка того, когда станет возможным первое определение СКФ. В другом аспекте пользователю запрещается переходить к фазе измерения до тех пор, пока не будет достигнуто достаточное уравновешивание. В одном из таких аспектов время уравновешивания сравнивают с предварительно определенным пороговым значением, и, если время уравновешивания выше этого порогового значения, пользователю не разрешается перейти к определению СКФ. Таким образом, если датчик расположен на участке, который плохо контактирует с системой кровообращения, оценка СКФ невозможна.
В некоторых аспектах временной интервал ответа, временной интервал измерения и/или период ответа после однократной инъекции основаны на конкретной проведенной медицинской оценке и могут соответствующим образом изменяться. Например, для пациентов с хронической почечной недостаточностью может быть достаточно одного определения СКФ. Тем не менее, для пациентов с острой почечной недостаточности или с риском острой почечной недостаточности более информативной является оценка СКФ в режиме реального времени или оценка динамики СКФ. В некоторых аспектах указанный временной интервал ответа будет составлять примерно 15 минут. В других аспектах указанный временной интервал ответа будет составлять примерно 30 минут, примерно один час, примерно два часа, примерно три часа, примерно пять часов, примерно восемь часов, примерно 10 часов, примерно 12 часов, примерно 18 часов, примерно 24 часа, примерно 36 часов, примерно 48 часов, примерно 72 часа, примерно 96 часов или примерно 168 часов. В некоторых аспектах временной интервал ответа будет составлять от 15 минут до 168 часов. В некоторых аспектах период ответа после однократной инъекции будет основан на концентрации для периода полувыведения соединения пиразина. Указанный период полувыведения может быть либо предварительно определен у указанного пациента, либо оценен на основании состояния здоровья указанного пациента, либо определен трансдермально с применением способов, описанных в данном документе. В некоторых аспектах указанный период ответа после однократной инъекции равен одному периоду полувыведения, двум периодам полувыведения, трем периодам полувыведения, четырем периодам полувыведения, пяти периодам полувыведения, шести периодам полувыведения, восьми периодам полувыведения или десяти периодам полувыведения. Максимальный период ответа после однократной инъекции такой, что пиразин больше не детектируется в кровотоке указанного пациента. Применяемый в данном документе термин «недетектируемый» означает, что концентрация пиразина больше не детектируется способом, применяемым для его определения. В некоторых случаях, когда из–за предела детекции прибора этот период становится чрезвычайно длительным (например, длится одну неделю), «недетектируемый» означает, что уровень концентрации упал ниже 0,39% (т.е., восемь периодов полувыведения). В еще одном аспекте временной интервал ответа будет составлять примерно от 1 до 168 часов, с шагом в один час.
Также временной интервал измерения может варьироваться в зависимости от конкретных медицинских потребностей пациента и может соответствующим образом изменяться. В некоторых аспектах он будет составлять примерно 15 минут. В других аспектах указанный временной интервал измерения будет составлять примерно 30 минут, примерно один час, примерно два часа, примерно три часа, примерно пять часов, примерно восемь часов, примерно 10 часов, примерно 12 часов, примерно 18 часов, примерно 24 часа, примерно 36 часов, примерно 48 часов, примерно 72 часа, примерно 96 часов или примерно 168 часов. В некоторых аспектах временной интервал измерения будет составлять от 15 минут до 168 часов. Может быть один или множество временных интервалов измерения на протяжении каждого периода ответа после однократной инъекции. В некоторых аспектах период ответа после однократной инъекции делится на множество временных интервалов измерения, при этом все временные интервалы измерения одинаковые. В еще одном аспекте период ответа после однократной инъекции делится на множество временных интервалов, при этом каждый временной интервал измерения выбран независимо от других и может быть таким же или отличаться от других временных интервалов измерения.
Способы и система, раскрытые в данном документе, имеют преимущество, заключающееся в автоматической корректировке в зависимости от содержания меланина в коже, так что определение СКФ является точным для широкого диапазона типов кожи и уровней пигментации. Шкала Фитцпатрика – это числовая система классификации цвета кожи человека. Она широко признана в качестве полезного инструмента для дерматологических исследований пигментации кожи человека. Оценки по шкале варьируют от типа I (очень светлая кожа с минимальной пигментацией) до типа VI (глубоко пигментированная и темно–коричневая кожа). Система и способы, раскрытые в данном документе, подходят для применения со всеми шестью типами пигментации кожи по шкале Фитцпатрика. В частности, системы и способы, раскрытые в данном документе, подходят для применения с I типом, II типом, III типом, IV типом, V типом и VI типом пигментации кожи.
В еще одном аспекте пиразин комбинируется по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым наполнителем. Указанные фармацевтически приемлемые наполнители выбраны из группы, состоящей из растворителей, агентов для регулирования рН, буферных агентов, антиоксидантов, агентов для регулирования тоничности, агентов для регулирования осмолярности, консервантов, антибактериальных агентов, стабилизирующих агентов, агентов для регулирования вязкости, сурфактантов и их комбинаций.
Фармацевтически приемлемые растворители могут быть водными или неводными растворами, суспензиями, эмульсиями или их подходящими комбинациями. Неограничивающими примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Примерами водных носителей являются вода, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевой и буферный раствор.
В качестве примера и не для ограничения фармацевтически приемлемые буферы включают ацетат, бензоат, карбонат, цитрат, дигидрофосфат, глюконат, глутамат, глицинат, гидрофосфат, лактат, фосфат, тартрат, Tris·HCl или их комбинации, имеющие рН в диапазоне от 4 до 9, предпочтительно от 5 до 8, наиболее предпочтительно от 6 до 8, еще более предпочтительно от 7,0 до 7,5. В еще одном аспекте pH находится в диапазоне от 6,7 до 7,7. Другие буферы, известные в данной области, могут быть выбраны, основываясь на конкретной форме соли полученного производного пиразина или конкретного медицинского применения. Предпочтительным буфером является фосфатно–солевой буферный раствор при физиологическом pH (приблизительно 7,2).
Примерами агентов для регулирования тоничности являются глицерин, сорбит, сахароза или, предпочтительно, хлорид натрия и/или маннит. Примеры агентов для регулирования вязкости включают бентонит, силикат кальция–магния и тому подобное. Примеры разбавителей включают этанол, метанол и тому подобное. Примеры противомикробных агентов включают хлорид бензалкония, хлорид бензетония, этилпарабен, метилпарабен и тому подобное. Примеры агентов для регулирования осмолярности включают аминоэтанол, хлорид кальция, холин, декстрозу, диэтаноламин, раствор Рингера с лактатом, меглюмин, хлорид калия, раствор Рингера, бикарбонат натрия, хлорид натрия, лактат натрия, TRIS или их комбинации. Эти примеры приведены только с иллюстративной целью и не являются исчерпывающими или ограничивающими.
Также в настоящем документе раскрыт способ оценки функции почек у пациента, нуждающегося в этом, указанный способ включает введение пациенту соединения по формуле I или его фармацевтически приемлемой соли или его фармацевтически приемлемой лекарственной формы, воздействие на указанного пациента электромагнитным излучением, что приводит к испусканию спектральной энергии указанным соединением по формуле I, детекцию спектральной энергии, испускаемой соединением, и оценку функции почек пациента на основе детектированной спектральной энергии.
В некоторых аспектах соединение по формуле I не метаболизируется пациентом; вместо этого оно полностью выводится почками с мочой без метаболизирования (например, без окисления, глюкуронидации или других конъюгаций). В некоторых аспектах, по меньшей мере, 95% соединения по формуле I не метаболизируется пациентом до выведения с мочой. В некоторых аспектах, по меньшей мере, 96% соединения по формуле I не метаболизируется пациентом до выведения с мочой. В некоторых аспектах, по меньшей мере, 97% соединения по формуле I не метаболизируется пациентом до выведения с мочой. В некоторых аспектах, по меньшей мере, 98% соединения по формуле I не метаболизируется пациентом до выведения с мочой. В некоторых аспектах, по меньшей мере, 99% соединения по формуле I не метаболизируется пациентом до выведения с мочой. В некоторых вариантах осуществления указанное соединение полностью выводится с мочой у указанного пациента быстрее предварительно определенного периода времени. В некоторых аспектах оценка функции почек у пациента может также включать определение СКФ у пациента.
Пиразин может вводиться любым подходящим способом. Способ будет зависеть от медицинских потребностей пациента и будет выбран медицинским работником, назначившим пиразин или проводящим процедуру. Примеры способов введения включают трансдермальное, пероральное, парентеральное, подкожное, энтеральное или внутривенное введение, но не ограничиваясь этим. Предпочтительно соединение пиразина будет вводиться внутривенными или трансдермальными способами. В некоторых вариантах осуществления пиразин вводится посредством одной болюсной внутривенной инъекции. В еще одном варианте осуществления пиразин вводят путем многократных болюсных внутривенных инъекций. Применяемый в данном документе термины «чрескожный» и «трансдермальный» относятся к введению через кожу пациента и являются взаимозаменяемыми.
Применяемый в данном документе термин «энтеральное введение» относится к любому способу введения, который прямо или косвенно доставляет лекарственное средство пациенту через желудочно–кишечный тракт. Примеры энтерального введения включают пероральное, сублингвальное, буккальное и ректальное введение, но не ограничиваясь этим. Применяемый в данном документе термин «парентеральное введение» относится к любому способу введения, который прямо или косвенно доставляет лекарственное средство пациенту путем инъекции или инфузии. Примеры или парентеральное введение включают внутривенное, внутриартериальное, внутрикожное, трансдермальное, подкожное и внутримышечное введение, но не ограничиваясь этим.
Также в данном документе раскрыта стабильная парентеральная композиция, содержащая производное пиразина по формуле I и фармацевтически приемлемый буферный агент. Тоничность композиции подходит для введения пациенту посредством парентерального введения. Тоничность парентеральной композиции может быть скорректирована с применением агентов для регулирования тоничности, описанных в другом месте в данном документе. pH композиции подходит для введения пациенту, нуждающемуся в этом, и может быть скорректирован с применением буфера или другого агента для регулирования pH, описанного в другом месте в данном документе. Осмолярность композиции подходит для введения пациенту, нуждающемуся в этом, и осмолярность композиции может быть скорректирована с применением агента для регулирования осмолярности, описанного в другом месте в данном документе. Композицию упаковывают в герметичный контейнер и подвергают терминальной стерилизации, чтобы уменьшить или элиминировать микробиологическую нагрузку лекарственной формы. Композиция устойчива к деградации и другим неблагоприятным химическим реакциям и имеет фармацевтически приемлемый срок годности.
Применяемый в данном документе термин «подходящий» означает пребывание в состоянии, подходящем для введения пациенту. Обнаружено, что лекарственные формы в соответствии с настоящим изобретением стабильны при комнатной температуре в течение по меньшей мере 12 месяцев и обычно стабильны при комнатной температуре в течение 12–24 месяцев.
Применяемый в данном документе термин «стерильная» композиция означает композицию, которая была доведена до состояния стерильности и впоследствии не подвергалась микробиологическому загрязнению, то есть контейнер, содержащий стерильную композицию, не был скомпрометирован. Стерильные композиции, как правило, готовятся производителями фармацевтических препаратов в соответствии с действующими правилами Надлежащей производственной практики («cGMP») Управления США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов. В некоторых аспектах композиция упакована в стерилизованный нагреванием контейнер. Контейнер может быть любым контейнером, подходящим для применения в медицинских учреждениях, например, флаконом, ампулой, мешком, бутылкой и шприцом, но не ограничиваясь этим.
В некоторых вариантах осуществления композиция может представлять собой стерильную, готовую к применению лекарственную форму для парентерального введения. Это позволяет избежать неудобств, связанных с разбавлением концентрированной парентеральной лекарственной формы инфузионными разбавителями перед инфузией или инъекцией, а также снизить риск микробиологического загрязнения во время асептических манипуляций и любой потенциальной ошибки расчета или разбавления. Альтернативно, лекарственная форма может быть твердой лекарственной формой, которую разбавляют перед введением пациенту.
Водная стерильная фармацевтическая композиция, раскрытая в данном документе, подходит для парентерального введения пациенту, нуждающемуся в этом. Например, композиция можно вводить в виде болюсной инъекции или путем внутривенной инфузии. Подходящие способы парентерального введения включают внутривенное, подкожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрисуставное и интратекальное введение. Готовая к применению лекарственная форма, раскрытая в данном описании, предпочтительно вводится путем болюсной инъекции. В некоторых вариантах осуществления композиция подходит для трансдермальной доставки в эпидермис или дерму пациента. Способы и устройства для трансдермальной доставки известны в данной области и в них применяется различные способы для доставки фармацевтической композиции пациенту.
Водная стерильная фармацевтическая композиция составлена в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями, описанные в другом месте в данном документе. Водная стерильная фармацевтическая композиция составлена таким образом, что она подходит для введения пациенту, нуждающемуся в этом. Тоничность, осмолярность, вязкость и другие параметры могут быть скорректированы с применением агентов и способов, описанных в другом месте в данном документе.
В еще одном аспекте в данном документе раскрыта водная стерильная фармацевтическая композиция для парентерального введения. Композиция содержит примерно от 0,1 до 50 мг/мл соединения пиразина по формуле I. Она также содержит примерно от 0,01 до 2M буферного агента, раскрытого в другом месте в данном документе. Она также содержит примерно от 0 до 500 мг/мл агента для регулирования осмолярности и примерно от 0 до 500 мг/мл агента для регулирования тоничности. Водная стерильная фармацевтическая композиция может также необязательно содержать один или несколько дополнительных фармацевтически приемлемых наполнителей. Примеры фармацевтически приемлемых наполнителей могут быть выбраны из группы, состоящей из растворителей, агентов для регулирования рН, буферных агентов, антиоксидантов, агентов для регулирования тоничности, агентов для регулирования осмолярности, консервантов, антибактериальных агентов, стабилизирующих агентов, агентов для регулирования вязкости, сурфактантов и их комбинаций. Конкретные примеры наполнителей раскрыты в другом месте в данном документе.
Соединение пиразина, применяемое в водной стериальной фармацевтической композиции, представляет собой любое соединение, раскрытое в данном документе. Конкретные примеры включают все соединения, полученные в примерах. Одним предпочтительным примером является (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))бис(3–гидроксипропановая кислота), которая представляет собой молекулу, проиллюстрированную в примере 12 (также называемую MB–102 или 3,6–диамино–N2,N5–бис(D–серин)–пиразин–2,5–дикарбоксамид), но не ограничиваясь этим.
pH водной стерильной фармацевтической композиции подходит для введения пациенту. В некоторых аспектах pH находится в диапазоне от 4 до 9, предпочтительно от 5 до 8, наиболее предпочтительно от 6 до 8, еще более предпочтительно от 7,0 до 7,5. В еще одном аспекте рН находится в диапазоне от 6,7 до 7,7. Еще более предпочтительно pH составляет приблизительно 7,2 в фосфатно–солевом буферном растворе.
В некоторых аспектах пиразин вводят пациенту, у которого подозревается или известно, что у него имеется по меньшей мере одна медицинская проблема с почками, и способы, раскрытые в данном документе, применяются для определения уровня почечной недостаточности или дефицита у указанного пациента. В некоторых аспектах расчетная СКФ (рСКФ) или ранее определенная СКФ у указанного пациента составляет менее 110, менее 90, менее 60, менее 30 или менее 15. рСКФ пациента определяют стандартными медицинскими способами, и такие способы известны в данной области. В некоторых аспектах у пациента будут отсутствовать или не будет подозрений на медицинские проблемы с почками. Мониторинг СКФ может проводиться как часть общей или обычной оценки состояния здоровья пациента или в качестве меры предосторожности.
Как известно в данной области техники, скорость, с которой у пациента выводятся из кровотока конечные продукты метаболизма (то есть период полувыведения), зависит от здоровья и правильного функционирования его почек. Применяемый в этом контексте термин «полностью выведенный» означает, что уровень пиразина в кровотоке снизился ниже 0,39% (т.е., в 8 периодов полураспада). Период полувыведения будет зависеть от СКФ пациента и значительно замедляется при ухудшении функционирования почек из–за болезни, возраста или других физиологических факторов. У пациента с неизвестными факторами риска, связанными с ХБП, с нормальной СКФ и/или нормальной рСКФ, период ответа после однократной инъекции составляет 24 часа. В некоторых аспектах период ответа после однократной инъекции для пациента с СКФ или рСКФ ниже 110 составляет 24 часа. Для пациента с СКФ или рСКФ ниже 90 период ответа после однократной инъекции составляет 24 часа. Для пациента с СКФ или рСКФ ниже 60 период ответа после однократной инъекции составляет 48 часов. Для пациента с СКФ или рСКФ ниже 30 период ответа после однократной инъекции составляет 48 часов. В некоторых аспектах период ответа после однократной инъекции для пациента с СКФ или рСКФ ниже 110 равен восьми периодам полувыведения. Для пациента с СКФ или рСКФ ниже 90 период ответа после однократной инъекции равен восьми периодам полувыведения. Для пациента с СКФ или рСКФ ниже 60 период ответа после однократной инъекции равен восьми периодам полувыведения. Для пациента с СКФ или рСКФ ниже 30 период ответа после однократной инъекции равен восьми периодам полувыведения.
Поскольку увеличение концентрации белка в моче пациента может свидетельствовать о какой–либо почечной недостаточности или дефиците, способы, раскрытые в данном документе, подходят для пациентов, у которых в анализах мочи наблюдается повышение уровня белка. В некоторых аспектах у пациента повышен уровень белка в моче, что можно определить стандартными медицинскими тестами (например, с помощью тест–полосок для мочи). В качестве примера и не для ограничения, анализ мочи пациента может показать увеличение альбумина, увеличение креатинина, увеличение азота мочевины в крови (т.е., тест на концентрацию азота мочевины в крови) или любую их комбинацию.
Со ссылкой на вышеупомянутый способ производное пиразина подвергается воздействию электромагнитного излучения, такого как видимый, ультрафиолетовый и/или инфракрасный свет, но не ограничиваясь этим. Пиразин может быть подвергнут воздействию электромагнитного излучения в любое подходящее время, но предпочтительно, когда производное пиразина находится внутри тела пациента. Воздействие на пиразин электромагнитным излучением приводит к испусканию пиразином спектральной энергии (например, видимый, ультрафиолетовый и/или инфракрасный свет), которая может быть детектирована с помощью соответствующего оборудования для детекции. Спектральная энергия, испускаемая производным пиразина, может характеризоваться более широким диапазоном длин волн, чем поглощаемая. В качестве примера и не для ограничения, если вариант осуществления производного пиразина поглощает свет с длиной волны около 440 нм, производное пиразина может испускать свет с длиной волны около 560 нм.
Детекция пиразина (или конкретнее, испускаемой им спектральной энергии) может быть осуществлена с помощью способов детекции оптической флуоресценции, поглощения или рассеивания света. В некоторых аспектах спектральная энергия представляет собой флуоресценцию. В некоторых вариантах осуществления детекция испускаемой спектральной энергии может быть охарактеризована как аккумуляция испускаемой спектральной энергии и генерация электрического сигнала, соответствующего аккумулированной спектральной энергии. Механизм (механизмы), применяемый для детекции спектральной энергии от производного пиразина, находящегося в теле пациента, может быть предназначен для детекции только выбранных длин волн (или диапазонов длин волн) и/или может включать один или несколько подходящих спектральных фильтров. Для воздействия на производное пиразина электромагнитным излучением и/или для детекции испускаемой им спектральной энергии, могут быть применены различные катетеры, эндоскопы, ушные клипсы, манжеты на руки, повязки на голову, поверхностные катушки, зонды для пальцев и другие медицинские устройства. Устройство, которое воздействует на пиразин электромагнитным излучением и детектирует испускаемую им спектральную энергию, может быть одним и тем же устройством или разными устройствами. То есть можно применять одно или два устройства. Детекция спектральной энергии может осуществляться за один или несколько раз с перерывами или практически непрерывно.
Определение функции почек, или СКФ, пациента основано на детектированной спектральной энергии. Для определения СКФ применяются данные, характеризующие детектированную спектральную энергию, и создается профиль интенсивность–время, свидетельствующий о клиренсе производного пиразина из тела пациента. Этот профиль может коррелировать с физиологическим или патологическим состоянием. Например, профили и/или скорости клиренса пациента могут сравниваться с известными профилями и/или скоростями клиренса для оценки функции почек пациента и для диагностики физиологического состояния пациента. В случае анализа наличия производного пиразина в физиологических жидкостях, для оценки функции почек могут быть построены и проанализированы кривые концентрация–время (предпочтительно в реальном времени). Альтернативно, профиль клиренса пациента можно сравнить с одним или несколькими ранее полученными профилями клиренса того же самого пациента, чтобы определить, изменилась ли функция почек у указанного пациента с течением времени. В некоторых аспектах оценка функции почек осуществляется с применением системы, раскрытой в другом месте в данном документа.
Физиологическую функцию можно оценить: (1) сравнивая, как по–разному нормальные и поврежденные клетки или органы выводят производное пиразина из кровотока; (2) измеряя скорость выведения или накопления пиразина в органах или тканях пациента; и/или (3) получая томографические изображения органов или тканей, содержащих пиразин. Например, клиренс из пула крови может быть измерен неинвазивно через поверхностные капилляры, такие как в мочке уха или пальце, или он может быть измерен инвазивно с применением соответствующего инструмента, такого как эндоваскулярный катетер. Трансдермальную флуоресценцию можно также контролировать неинвазивно на теле указанного пациента. Многие участки эпидермиса пациента могут быть пригодны для неинвазивного мониторинга трансдермальной флуоресценции. Участком на пациенте предпочтительно является участок, где равновесие между сосудами и тканями устанавливается относительно быстро. Примеры подходящих участков на пациенте включают грудину, нижнюю часть грудины, большую грудную мышцу, окципитальный треугольник, лоб, подбородок, верхнюю часть бедра и нижнюю часть бедра, но не ограничиваясь этим. Накопление производного пиразина в целевых клетках может быть оценено аналогичным образом.
Для проведения требуемых измерений спектральной энергии, испускаемой производным пиразина, среди прочего также может применяться модифицированный катетер легочной артерии. Обеспечение возможности применять катетер легочной артерии для детекции спектральной энергии, испускаемой указанным пиразином, является очевидным улучшением существующих катетеров легочной артерии, с помощью которых можно измерять только внутрисосудистое давление, сердечный выброс и другие производные показатели кровотока. Традиционно пациентов в критическом состоянии лечили, применяя только вышеперечисленные параметры, и для их лечения, как правило, было необходимо постоянно производить забор крови и проводить тестирования для оценки функции почек. Эти традиционные параметры представляют собой дискретные данные и часто могут быть неправильно интерпретированы для многих групп пациентов.
Для модификации стандартного катетера легочной артерии требуется только изготовить для него волоконно–оптический датчик, настроенный на конкретную длину волны. В настоящее время существуют катетеры, в которых применяется волоконно–оптическая технология для измерения насыщения смешанной венозной крови кислородом. В соответствии с одной из характеристик модифицированный катетер легочной артерии содержит оптический датчик, настроенный на конкретную длину волны, в наконечнике стандартного катетера легочной артерии. Этот оптический датчик, настроенный на конкретную длину волны, применяется для мониторинга выведения почками в зависимости от их функций специально разработанного оптически детектируемого химического соединения, такого как производные пиразина, раскрытые в данном документе. Таким образом, функцию почек можно контролировать в режиме реального времени по исчезновению/клиренсу оптически детектируемого соединения.
В некоторых аспектах соединение пиразина вводят пациенту, у которого ранее была диагностирована ХБП по меньшей мере 1 стадии. В других аспектах у указанного пациента ранее была диагностирована ХБП 2 стадии, ХБП 3 стадии, ХБП 4 стадии или ХБП 5 стадии. В еще одном аспекте, у пациента еще не была диагностирована ХБП, но есть один или несколько факторов риска, связанных с ХБП. В еще одном аспекте у пациента нет известных факторов риска ХБП.
Введение соединения пиразина осуществляется любым подходящим способом, основанным на проводимом медицинском тестировании и медицинских потребностях пациента. Подходящие способы раскрыты в другом месте в данном документе. Предпочтительно пиразин вводят путем трансдермального или внутривенного введения.
Также в данном документе раскрыта система для определения СКФ или оценки функции почек у пациента, нуждающегося в этом. Система включает вычислительное устройство, устройство отображения, коммуникативно соединенное с указанным вычислительным устройством, источник питания, который функционально соединен с указанным вычислительным устройством и обеспечивает электрическую изоляцию системы от внешних источников питания, одну или несколько головок датчиков, функционально соединенных с указанным вычислительным устройством и, по меньшей мере, один индикаторный агент, выполненный с возможностью испускать свет при воздействии электромагнитного излучения. Вычислительное устройство выполнено с возможностью управлять и контролировать работу головок датчиков, записывать одного или несколько световых измерений, полученных с помощью указанных головок датчиков, и вычислять СКФ у указанного пациента на основании проведенных световых измерений.
Следует отметить, что применяемый в данном документе термин «пара» не ограничивается прямым механическим, электрическим и/или коммуникационным соединением между компонентами, но может также включать непрямое механическое, электрическое и/или коммуникационное соединение между несколькими компонентами. Устройство отображения и одна или несколько головок датчиков могут быть соединены с вычислительным устройством посредством проводного сетевого соединения (например, Ethernet или оптоволокно), беспроводного соединения, например, радиочастота (РЧ), в частности, ЧМ–радиовещание и/или цифровое аудиовещание, стандарт 802.11 Института инженеров по электротехнике и радиоэлектронике (IEEE®) (например, 802.11(g) или 802.11(n), стандарт широкополосного доступа в микроволновом диапазоне (WIMAX®), канал беспроводной связи малого радиуса действия, такой как BLUETOOTH®, технология сотовой связи (например, глобальный стандарт мобильной связи (GSM)), линия спутниковой связи и/или любые другие подходящие способы связи. IEEE является зарегистрированным товарным знаком Института инженеров по электротехнике и радиоэлектронике, Нью–Йорк, штат Нью–Йорк. WIMAX является зарегистрированным товарным знаком WiMax Forum, Бивертон, штат Орегон. BLUETOOTH является зарегистрированным товарным знаком Bluetooth SIГ, Киркленд, штат Вашингтон.
В некоторых аспектах одна или несколько головок датчиков содержат, по меньшей мере, один источник электромагнитного излучения, генерируют и доставляют электромагнитное излучение к коже указанного пациента, детектируют и измеряют электромагнитное излучение, испускаемое указанным индикаторным агентом, и передают указанное измерение электромагнитного излучения, испускаемое указанным индикаторным агентом указанному вычислительному устройству. В системе с более, чем одной головкой датчика, головки датчика могут быть одинаковыми или разными, и испускаемое ими электромагнитное излучение может быть одинаковым или разным. В некоторых аспектах головки датчика выполнены с возможностью крепиться к коже указанного пациента. В качестве примера и не для ограничения в системе с двумя головками датчиков, одна головка датчика может испускать и контролировать электромагнитное излучение одной длины волны, тогда как вторая головка датчика может испускать и контролировать электромагнитное излучение другой длины волны. Это позволило бы сравнивать данные для повышения точности определения СКФ и информации, доступной для медицинского работника, проводящего оценку. В еще одном не ограничивающем примере в системе с двумя головками датчиков, две головки датчиков применяются для отделения кинетики локального уравновешивания от кинетики терминальной фазы. Это позволяет медицинскому работнику определить, когда уравновешивание завершено, и уменьшить артефакты из–за локального перемещения датчиков.
В некоторых аспектах индикаторный агент выполнен с возможностью введения указанному пациенту посредством внутривенного или трансдермального введения, выведения только посредством клубочковой фильтрации в почках указанного пациента, и испускания света, который может быть детектирован указанными головками датчиков при воздействии электромагнитного излучения. В некоторых аспектах индикаторный агент представляет собой пиразиновое соединение по формуле I, раскрытое в данном документе. Предпочтительно, индикаторный агент представляет собой соединение, полученное в одном из примеров. Наиболее предпочтительно, индикаторным агентом является (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))бис(3–гидроксипропановая кислота) (также называемая MB–102 или 3,6–диамино–N2,N5–бис(D–серин)пиразин–2,5–дикарбоксамид). В некоторых аспектах индикаторный агент представляет собой производное пиразина в лекарственной форме, подходящей для введения пациенту, нуждающемуся в этом. Такие лекарственные формы описаны в другом месте в данном документе.
Система для определения СКФ или оценки функции почек у пациента может быть выполнена с возможностью осуществления способов, раскрытых в данном документе, для пациента, нуждающегося в этом. Вычислительное устройство в системе может быть любым стандартным компьютером, имеющим весь необходимый функционал, включая, в частности, но не ограничиваясь этим, постоянное запоминающее устройство, процессор, способный осуществлять сложные математические вычисления, пользовательский интерфейс для связи с компьютером и устройство отображения, коммуникативно соединенное с вычислительным устройством. По существу, постоянное запоминающее устройство вычислительного устройства может хранить любую информацию, программы и данные, необходимые для выполнения функций системы для определения СКФ или оценки функции почек у пациента. Такая информация, программы и данные могут представлять собой стандарты и/или контроли, которые могут применяться для сравнения значений трансдермальной флуоресценции, собранных одной или несколькими головками датчиков, с известными значениями. В некоторых аспектах вычислительное устройство может сохранять результаты предыдущей оценки или определения СКФ у пациента, чтобы можно было сравнить результаты, полученные позднее. Это позволило бы медицинскому специалисту контролировать состояние почек пациента с течением времени. В некоторых аспектах вычислительное устройство представляет собой портативный компьютер.
В различных аспектах вычислительное устройство включает процессор и/или запоминающее устройство. В различных других аспектах процессор соединен с одним или несколькими пользовательским интерфейсом, устройством отображения и запоминающим устройством через системную шину. В одном из аспектов процессор обменивается данными с пользователем, например, информируя пользователя через устройство отображения и/или принимая входные данные пользователя через пользовательский интерфейс. Термин «процессор» в целом относится к любой программируемой системе, включая системы и микроконтроллеры, схемы с сокращенным набором команд (RISC), специализированные интегральные схемы (ASIC), программируемые логические схемы (PLC) и любые другие схемы или процессоры, способные выполнять функции, описанные в данном документе. Перечисленные выше примеры приведены только с иллюстративной целью и, таким образом, не предназначены для какого–либо ограничения определения и/или значения термина «процессор».
В различных аспектах запоминающее устройство включает одно или несколько устройств, которые позволяют хранить и извлекать информацию, такую как исполняемые команды и/или другие данные. Кроме того, запоминающее устройство включает один или несколько машиночитаемых носителей, таких как, динамическое оперативное запоминающее устройство (DRAM), статическое оперативное запоминающее устройство (SRAM), твердотельный диск и/или жесткий диск, но не ограничиваясь этим. В различных аспектах запоминающее устройство хранит исходный код приложения, код объекта приложения, данные о конфигурации, дополнительные события ввода, состояния приложения, операторы утверждения, результаты проверки и/или любые другие типы данных, но не ограничиваясь этим.
Пользовательский интерфейс сконфигурирован для приема по меньшей мере одного входного сигнала от пользователя, например, такого как оператор системы, для определения СКФ или оценки функции почек у пациента. В одном из аспектов пользовательский интерфейс включает клавиатуру, с помощью которой пользователь может вводить соответствующую информацию. В различных других аспектах пользовательский интерфейс включает указательное устройство, мышь, стилус, сенсорную индикаторную панель (например, сенсорную панель, сенсорный экран), гироскоп, акселерометр, датчик положения и/или интерфейс аудиовхода (в том числе, например, микрофон), но не ограничиваясь этим.
Устройство отображения сконфигурировано для отображения пользователю информации, такой как события ввода и/или результаты проверки. Устройство отображения также может включать адаптер дисплея, который подключен по меньшей мере к одному устройству отображения. В одном из аспектов устройство отображения может представлять собой устройство визуального отображения, такое как электронно–лучевая трубка (ЭЛТ), жидкокристаллический дисплей (ЖКД), дисплей с органическим светодиодом (ОСД) и/или дисплей с «электронными чернилами». В различных других аспектах устройство отображения включает устройство вывода звука (например, аудиоадаптер и/или динамик) и/или принтер. В некоторых аспектах устройство отображения включает сенсорный экран.
В различных аспектах вычислительное устройство обычно включает процессор. Процессор может быть запрограммирован путем кодирования операции с применением одной или нескольких исполняемых инструкций и предоставления исполняемых инструкций в устройстве памяти. В одном из аспектов процессор запрограммирован для вычисления константы времени затухания в почках в течение предварительно определенного периода времени. В одном из аспектов данные трансдермальной флуоресценции у пациента собирают в течение предварительно определенного периода времени, и строят график зависимости времени (ось X) от флуоресценции (ось Y). Скорость затухания может быть нелинейной или линейной, и для скорости затухания рассчитывается константа времени. В одном из аспектов скорость затухания является линейной для полулогарифмического (y) графика. Константа времени сравнивается с известными значениями и таким образом определяется СКФ у пациента. В некоторых аспектах скорость распада соответствует стандартной кинетике первого порядка. В еще одном аспекте скорость затухания может соответствовать мультикомпонентной фармакокинетической модели. Фиг. 3А–3D иллюстрируют модель фармакокинетики с двумя компартментами в соответствии с которой с помощью стандартного фармакокинетического программного обеспечения может быть определена константа времени затухания в почках.
Определение СКФ осуществляется с помощью линейной регрессии, исключения выбросов, вычисления коэффициента корреляции (R2) и стандартной ошибки калибровки и более подробно описано в примерах.
В данном письменном описании примеры применяются для раскрытия изобретения, включая лучший вариант осуществления изобретения, а также чтобы позволить любому специалисту в данной области техники применять изобретение на практике, включая создание и применение любых устройств или систем и осуществление любых описанных способов. Любой аспект или вариант осуществления, раскрытый в данном документе, может применяться в сочетании с любым другим аспектом или вариантом осуществления, как будет понятно специалисту в данной области. Предполагается, что другие примеры находятся в рамках формулы изобретения, если они включают структурные элементы, соответствующие буквальным формулировкам формулы изобретения, или если они включают эквивалентные структурные элементы с несущественными отличиями от буквальных формулировок формулы изобретения.
Пример 1
Получение 3,6–диамино–N2,N2,N5,N5–тетракис(2–метоксиэтил)пиразин–2,5–дикарбоксамид
Смесь 3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбоновой кислоты (200 мг, 101 ммоль), бис 2–(метоксиэтил)амина (372 мкл, 335,5 мг, 2,52 ммоль), HOBt·H2O (459 мг, 3,00 ммоль) и EDC·HCl (575 мг, 3,00 ммоль) перемешивали в ДМФА (20 мл) в течение 1 часа при комнатной температуре. Смесь концентрировали досуха и остаток распределяли между EtOAc и водой. Слои разделяли и раствор EtOAc промывали насыщенным NaHCO3 и солевым раствором. Раствор сушили над безводным Na2SO4, фильтровали и концентрировали. В результате очистки с помощью радиальной флэш–хроматографии (SiO2, 10/1 CHCl3–MeOH) получили 228,7 мг (выход 53%) соединения из примера 1 в виде оранжевой пены: 1H NMR (300 МГц, CDCl3), δ 4,92 (s, 4 H), 3,76 (кажущееся t, J=5,4 Гц, 4 H), 3,70 (apparent t, J=5,6 Гц, 4 H), 3,64 (кажущееся t, J=5,4 Гц, 4 H), 3,565 (кажущееся t, J=5,4 Гц), 3,67 (s, 6 H), 3,28 (s, 6 H). 13C NMR (75 МГц, CDCl3) δ 167,6 (s), 145,6 (s), 131,0 (s), 72,0 (t), 70,8 (t), 59,2 (q), 49,7 (t), 47,1 (t). ЖХ–МС (градиент 5–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=3,14 мин на 30 мм колонке, (M+H)+ = 429. UV/vis (100 мкМ в ФСБ) λabs=394 нм. Флуоресценция (100 нМ) λex=394 нм λem=550 нм.
Пример 2
3,6–диамино–N2,N5–бис(2,3–дигидроксипропил)пиразин–2,5–дикарбоксамид
Стадия 1. Синтез 3,6–диамино–N2,N5–бис((2,2–диметил–1,3–диоксолан–4–ил)метил)пиразин–2,5–дикарбоксамид.
Смесь 3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбоновой кислоты (350 мг, 1,77 ммоль), рацемического (2,2–диметил–1,3–диоксолан–4–ил)метанамина (933 мкл, 944 мг, 7,20 ммоль), HOBt·H2O (812 мг, 5,3 ммоль) и EDC·HCl (1,02 г, 5,32 ммоль) перемешивали в ДМФА (20 мл) в течение 16 часов при комнатной температуре. Смесь концентрировали досуха и остаток распределяли между EtOAc и водой. Слои разделяли и раствор EtOAc промывали насыщенным NaHCO3 и солевым раствором. Раствор сушили над безводным Na2SO4, фильтровали и концентрировали до получения 665 мг (выход 88%) бис–амидной диастереомерной пары в виде желтого твердого вещества: 1NMR (300 МГц, CDCl3) δ 8,38 (t, J=5,8 Гц, 2 H), 6,55 (s, 4 H), 4,21 (квинтет, J=5,8 Гц, 2 H), 3,98 (dd, J=8,4 Гц, 6,3 Гц, 2 H), 3,65 (dd, J=8,4 Гц, J=5,8 Гц, 2 H), 3,39 (кажущийся квартет – диастереотопная смесь, J=5,9 Гц, 4 H), 1,35 (s, 6 H), 1,26 (s, 6 H). 13C NMR (75 МГц, CDCl3) δ 165,7 (s), 146,8 (s), 126,8 (s), 109,2 (s), 74,8 (d), 67,2 (t), 42,2, 41,1 (t – диастереотопная пара), 27,6 (q), 26,1 (q).
Стадия 2. Продукт со стадии 1 растворяли в ТГФ (100 мл) и обрабатывали 1,0 н. HCl (2 мл). После завершения гидролиза смесь обрабатывали K2CO3 (1 г), перемешивали в течение 1 часа и фильтровали через C18 фильтр с применением метанола. Фильтрат концентрировали досуха и остаток растирали с МеОН (50 мл). Твердые вещества отфильтровывали и выбрасывали, а остаток обрабатывали эфиром (50 мл). Осадок собирали фильтрацией и сушили в высоком вакууме. В результате очистки этого материала с помощью радиальной флэш–хроматографии получили 221 мг (выход 36%) соединения из примера 2 в виде твердого оранжевого вещества: 1NMR (300 МГц, ДМСО–d6) δ 8,00 (bm, 6 H), 5,39 (bs, 2 H), 4,88 (bs, 2 H), 3,63–3,71 (сложный m, 2 H), 3,40 (dd, J=11,1, 5,10 Гц, 2 H), 3,28 (dd, J=11,1, 6,60 Гц, 2 H), 2,92 (dd, J=12,6, 3,3 Гц, 2 H), 2,65 (dd, J=12,6, 8,4 Гц, 2 H). ЖХ–МС (градиент 5–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=4,13 мин на 30 мм колонке, (M+H)+ = 345. UV/vis (100 мкМ в H2O) λabs=432 нм. λex флуоресценции=432 нм λem флуоресценции=558 нм.
Пример 3
(2S,2'S)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))бис(3–гидроксипропановая кислота)
Стадия 1. Синтез диметил 2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))(2S,2'S)–бис(3–(бензилокси)пропаноата).
Смесь 3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбоксилата натрия (300 мг, 1,24 ммоль), соли L–Ser(OBn)–OMe·HCl (647 мг, 2,64 ммоль), HOBt·H2O (570 мг, 3,72 ммоль) и EDC·HCl (690 мг, 3,60 ммоль) в ДМФА (25 мл) обрабатывали ТЭА (2 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 16 часов и концентрировали. В результате обработки, как в примере 1, получили 370 мг (выход 51%) бисамида в виде ярко–желтого порошка: 1NMR (300 МГц, CDCl3): δ 8,47 (d, J=8,74 Гц, 2 H), 7,25–7,37 (сложный m, 10 H), 5,98 (bs, 4 H), 4,85 (dt, J=8,7, 3,3 Гц, 2 H), 4,56 (ABq, J=12,6, Гц, Δν=11.9 Гц, 4 H), 3.99 (половина ABq для d, J=8,7, 3,3, Δν замаскированная, 2 H), 3,76–3,80 (половина ABq – замаскированный, 2 H), 3,78 (s, 6 H). 13C NMR (75 МГц, CDCl3) δ 170,5 (s), 165,1 (s), 146,8 (s), 138,7 (s) 128,6 (d), 128,1 (d), 127,8 (d), 126,9 (s), 73,5 (t), 69,8 (t), 53,0 (q), 52,9 (q). ЖХ–МС (градиент 5–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=4,93 мин на 30 мм колонке, (M+H)+ = 581.
Стадия 2. Синтез (2S,2'S)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)–бис(азанидил))бис(3–(бензилокси)пропановой кислоты.
Продукт со стадии 1 (370 мг, 0,64 ммоль) растворяли в ТГФ (10 мл) и обрабатывали 1,0 н. гидроксидом натрия (2,5 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 мин, завершение реакции контролировали с помощью ТСХ. Значение pH доводили примерно до 2 добавлением 1,0 н. HCl и полученный раствор экстрагировали (3х) EtOAc. Слои объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали для получения 353 мг (выход 100%) дикислоты в виде оранжевой пены: ЖХ–МС (градиент 5–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания=4,41 мин на 30 мм колонке, (M+H)+ = 553.
Стадия 3. К продукту со стадии 2 (353 мг, 0,64 ммоль) в метаноле (20 мл) добавляли 5% Pd/C (300 мг) и формиат аммония (600 мг). Полученную реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 2 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через фильтр из целита и концентрировали. Остаток перекристаллизовывали из смеси метанол–эфир для получения 191 мг (выход 80%) соединения из примера 3 в виде желтой пены: 1NMR (300 МГц, ДМСО–d6) δ 8,48 (d, J=6,9 Гц, 2 H), 6,72 (bs, 4 H), 3,95 (кажущийся квартет, J=5,1 Гц, 2 H), 3,60 (кажущийся ABq дублетов; группа с нисходящим полем с центром в 3,71, J=9,9, 5,1 Гц, 2H; группа с восходящим полем с центром в 3,48, J=9,9, 6,3 Гц, 2 H). 13C NMR (75 МГц, CDCl3) δ 172,9 (s), 164,9 (s), 147,0 (s), 127,0 (s), 62,9 (d), 55,7 (t). ЖХ–МС (градиент 5–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=1,45 мин на 30 мм колонке, (M+H)+ = 373. UV/vis (100 мкМ в ФСБ) λabs=434 нм. λex флуоресценции=449 нм, λem флуоресценции=559 нм.
Пример 4
Соль 3,6–бис(бис(2–метоксиэтил)амино)–N2,N2,N5,N5–тетракис(2–метоксиэтил)пиразин–2,5–дикарбоксамид бис(ТФУ)
Стадия 1. Синтез 3,6–дибромпиразин–2,5–дикарбоновой кислоты.
3,6–Диаминопиразин–2,5–дикарбоновую кислоту (499 мг, 2,52 ммоль) растворяли в 48% бромистоводородной кислоте (10 мл) и охлаждали до 0°C в бане с ледяной солью. К этой перемешанной смеси по каплям добавляли раствор нитрита натрия (695 мг, 10,1 ммоль) в воде (10 мл), чтобы температура оставалась ниже 5°C. Полученную смесь перемешивали в течение 3 часов при 5–15°С, за это время красная смесь превратилась в желтый раствор. Желтый раствор выливали в раствор бромида меди (2,23 г, 10,1 ммоль) в воде (100 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре. Еще через 3 часа водную смесь экстрагировали EtOAc (3х). Объединенные экстракты сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали для получения 440 мг (выход 54%) 3,6–дибромпиразин–2,5–дикарбоновой кислоты в виде бледно–желтого твердого вещества: 13C NMR (75 МГц, CDCl3) δ 164,3 (s), 148,8 (s), 134,9 (s). ВЭЖХ (градиент 5–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=2,95 мин на 250 мм колонке.
Стадия 2. Синтез 3–(бис(2–метоксиэтил)амино)–6–бром–N2,N2,N5,N5–тетракис(2–метоксиэтил)пиразин–2,5–дикарбоксамид.
Продукт со стадии 1 (440 мг, 1,36 ммоль) растворяли в ДМФА (25 мл), обрабатывали HOBt·H2O (624 мг, 4,08 ммоль) и EDC·HCl (786 мг, 4,10 ммоль) и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Добавляли бис(2–метоксиэтил)амин (620 мл, 559 мг, 4,20 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и концентрировали. Остаток распределяли между водой и EtOAc. EtOAc–слой отделяли и водный слой снова экстрагировали EtOAc. Объединенные органические слои промывали 0,5N HCl, насыщенным бикарбонатом натрия и солевым раствором. Органический слой сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали для получения 214 мг 3–(бис(2–метоксиэтил)амино)–6–бром–N2,N2,N5,N5–тетракис(2–метоксиэтил)пиразин–2,5–дикарбоксамида (выход 26%) в виде коричневого масла: ЖХ–МС (градиент 5–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=3,85 мин на 30 мм колонке, (M+H)+ = 608.
Стадия 3. К продукту со стадии 2 (116 мг, 0,19 ммоль) добавляли бис(2–метоксиэтил)амин (3,0 мл, 2,71 г, 20,3 ммоль) и «на кончике шпателя» Pd(PPh3)4. Полученную смесь нагревали до 140°С в течение 2 часов. Реакционную смесь охлаждали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш–хроматографии (SiO2, 10/1 CHCl3–MeOH). Полученный материал снова очищали с помощью хроматографии среднего давления с обращенной фазой (С18, ручной градиент 10–50% ацетонитрила в 0,1% ТФУ) для получения 12 мг (выход 10%) соединения из примера 4 в виде оранжево–коричневой пленки: ЖХ–МС (градиент 15–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=3,85 мин на 250 мм колонке, (M+H)+ = 661. UV/vis (100 мкМ в ФСБ) λabs=434 нм. λex флуоресценции=449 нм, λem флуоресценции=559 нм.
Пример 5
Соль 3,6–диамино–N2,N5–бис(2–аминоэтил)пиразин–2,5–дикарбоксамид бис(ТФУ)
Стадия 1. Синтез 3,6–диамино–N2,N5–бис[2–(трет–бутоксикарбонил)–аминоэтил]пиразин–2,5–дикарбоксамида.
Смесь 3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбоксилата натрия (500 мг, 2,07 ммоль), трет–бутил 2–аминоэтилкарбамата (673 мг, 4,20 ммоль), HOBt·H2O (836 мг, 5,46 ммоль) и EDC·HCl (1,05 г, 5,48 ммоль) в ДМФА (25 мл) перемешивали в течение 16 часов и концентрировали. В результате обработки, как в примере 1, получили 770 мг (выход 76%) бисамида в виде оранжевой пены: 1NMR (300 МГц, ДМСО–d6) основной конформер, δ 8,44 (t, J=5,7 Гц, 2 H), 6,90 (t, J=5,7 Гц, 2 H), 6,48 (bs, 4 H), 2,93–3,16 (сложный m, 8 H), 1,37 (s, 9 H), 1,36 (s, 9 H). 13C NMR (75 МГц, ДМСО–d6), конформационные изомеры δ 165,1 (s), 155,5 (bs), 155,4 (bs), 146,0 (s), 126,2 (s), 77,7 (bs), 77,5 (bs), 45,2 (bt), 44,5 (bt), 28,2 (q).
Стадия 2. К продукту со стадии 1 (770 мг, 1,60 ммоль) в хлористом метилене (100 мл) добавляли ТФУ (25 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Смесь концентрировали и остаток растворяли в метаноле (15 мл). Добавляли эфир (200 мл) и твердый оранжевый осадок отделяли фильтрованием и сушили в высоком вакууме для получения 627 мг (выход 77%) соединения из примера 5 в виде оранжевого порошка: 1NMR (300 МГц, ДМСО–d6) δ 8.70 (t, J=6 Гц, 2 H), 7,86 (bs, 6 H), 6,50 (bs, 4 H), 3,46–3,58 (m, 4 H), 3,26–3,40 (m, 4 H). 13C NMR (75 МГц, ДМСО–d6) δ 166,4 (s), 146,8 (s), 127,0 (s), 39,4 (t), 37,4 (t). ЖХ–МС (градиент 5–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=3,62 мин на 30 мм колонке, (M+H)+ = 283. UV/vis (100 мкМ в ФСБ) λabs=435 нм. λex флуоресценции=449 нм, λem флуоресценции=562 нм.
Пример 6
3,6–Диамино–N2,N5–бис(D–аспартат)–пиразин–2,5–дикарбоксамид
Стадия 1. Синтез 3,6–диамино–N2,N5–бис(бензил D–O–бензил–аспартат)–пиразин–2,5–дикарбоксамида
Смесь 3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбоксилата натрия (600 мг, 2,48 ммоль), соль Asp(OBn)–OMe–p–TosH (2,43 г, 5,00 ммоль), HOBt·H2O (919 мг, 6,00 ммоль) и EDC·HCl (1,14 г, 5,95 ммоль) в ДМФА (50 мл) обрабатывали ТЭА (4 мл). Полученную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Полученную смесь концентрировали и остаток распределяли между водой и EtOAc. EtOAc–слой отделяли и последовательно промывали насыщенным бикарбонатом натрия, водой и солевым раствором. EtOAc–раствор сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш–хроматографии (SiO2, 50/1 СНСl3–МеОН до 10/1) для получения 1,15 г бис–амида (выход 58%) в виде желтой пены: 1NMR (500 МГц, CDCl3) δ 8,61 (d, J=8,4 Гц, 2 H), 7,29–7,39 (m, 20 H), 5,85 (bs, 4 H), 5,22 (ABq, J=10,0 Гц, Δν=17,3 Гц, 4 H), 5,10 (ABq, J=12,2 Гц, Δν=34,3 Гц, 4 H), 5,06–5,09 (замаскированный m, 2 H), 3,11 (ABq для d, J=17,0, 5,14 Гц, Δν=77,9 Гц, 4 H). 13C NMR (75 МГц, CDCl3) δ 170,7 (s), 170,7 (s), 165,4 (s), 147,0 (s), 135,7 (s), 135,6 (s), 129,0 (d), 128,9 (d), 128,8 (d), 128,75 (d), 128,7 (d), 126,9 (s), 68,0 (t), 67,3 (t), 49,1 (d), 37,0 (t). ЖХ–МС (градиент 50–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=5,97 мин на 250 мм колонке, (M+H)+ = 789.
Стадия 2. К продукту со стадии 1 (510 мг, 0,65 ммоль) добавляли ТГФ (20 мл) и воду (10 мл). К перемешанной смеси добавляли 10% Pd(C) (500 мг) и формиат аммония (1 г). Полученную смесь нагревали до 60°С в течение 2 часов и оставляли охлаждаться до комнатной температуры. Смесь фильтровали через целит и концентрировали. Полученный материал снова очищали с помощью хроматографии среднего давления с обращенной фазой (C18, ручной градиент 10–70% ацетонитрила в 0,1% ТФУ) для получения 137,8 мг (выход 54%) соединения из примера 6 в виде оранжевого твердого вещества: 1NMR (300 МГц, ДМСО–d6) δ 8,62 (d, J=8,4 Гц, 2 H), 6,67 (bs, 4 H), 4,725 (dt, J=8,4, 5,4 Гц, 2 H), 2,74–2,88 (сложный m, 4 H). 13C NMR (75 МГц, ДМСО–d6) δ 172,6 (s), 165,2 (s), 147,0 (s), 126,6 (s), 60,8 (t), 49,1 (d). ЖХ–МС (градиент 5–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=4,01 мин на 250 мм колонке, (M+H)+ = 429. UV/vis (100 мкМ в ФСБ) λabs=433 нм. Флуоресценция (100 нМ) λex=449 нм, λem=558 нм.
Пример 7
3,6–Диамино–N2,N5–бис(14–оксо–2,5,8,11–тетраоксо–15–азагептадекан–17–ил)пиразин–2,5–дикарбоксамид
К раствору из примера 5 (77,4 мг, 0,15 ммоль) в ДМФА (5 мл) добавляли ТЭА (151 мг, 1,49 ммоль) и 2,5–диоксопирролидин–1–ил 2,5,8,11–тетраоксатетрадекан–14–оат (113 мг, 0,34 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии среднего давления с обращенной фазой (LiChroprep RP–18 Lobar (B) 25×310 мм – EMD chemicals 40–63 мкм, ~70 г, с 90/10 до 80/20 0,1% ТФУ–ACN) для получения 37,4 мг (выход 35%) соединения из примера 7 в виде оранжевой пленки: 1NMR (300 МГц, ДМСО–d6) δ 8.47 (t, J=5,7 Гц, 2 H), 7,96 (t, J=5,4 Гц, 2 H), 3,20–3,60 (сложный m, 36 H), 3,47 (s, 3 H), 3,46 (s, 3 H), 2,30 (t, J=6,3 Гц, 4 H). 13C NMR (75 МГц, ДМСО–d6) δ 170,2 (s), 165,1 (s), 146,0 (s), 126,2 (s), 71,2 (t), 69,7 (t), 69,6 (t), 69,5 (t), 69,4 (t), 66,7 (t), 58,0 (q), 38,2 (t), 36,2 (t). ЖХ–МС (градиент 5–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=4,01 мин на 250 мм колонке, (M+H)+ = 719. UV/vis (100 мкМ в ФСБ) λabs=437 нм. Флуоресценция (100 нМ) λex=437 нм, λem=559 нм.
Пример 8
3,6–Диамино–N2,N5–бис(26–оксо–2,5,8,11,14,17,20,23–октаокса–27–азанонакозан–29–ил)пиразин–2,5–дикарбоксамид
К раствору из примера 5 (50,3 мг, 0,10 ммоль) в ДМФА (5 мл) добавляли ТЭА (109 мг, 1,08 ммоль) и 2,5–диоксопирролидин–1–ил 2,5,8,11,14,17,20,23–октаоксагексакозан–26–оат (128 мг, 0,25 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии среднего давления с обращенной фазой (LiChroprep RP–18 Lobar (B) 25×310 мм – EMD chemicals 40–63 мкм, ~70 г, с 90/10 до 80/20 0,1% ТФУ–ACN) для получения 87,9 мг (выход 82%) соединения из примера 8 в виде оранжевой пленки: 1NMR (300 МГц, ДМСО–d6) δ 8,46 (t, J=5,7 Гц, 2 H), 7,96 (t, J=5,4 Гц, 2 H), 3,16–3,73 (сложный m, 74 H), 2,28–2,32 (m, 2 H). 13C NMR (75 МГц, ДМСО–d6) – многочисленные конформеры – δ 170,1 (s), 169,9 (s)169,8 (s), 165,1 (s), 146,0 (s), 126,2 (s), 71,2 (t), 69,7 (t), 69,6 (t), 69,5 (t), 66,7 (t), 58,0 (q), 38,2 (t), 36,2 (t). ЖХ–МС (градиент 15–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=5,90 мин на 250 мм колонке, (M+H)+ = 1071, (M+2H)2+ = 536. UV/vis (100 мкМ в ФСБ) λabs=438 нм. Флуоресценция (100 нМ) λex=438 нм, λem=560 нм.
Пример 9
3,6–Диамино–N2,N5–бис(38–оксо–2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35–додекаокса–39–азагентетраконтан–41–ил)пиразин–2,5–дикарбоксамид
К раствору из примера 5 (53,1 мг, 0,10 ммоль) в ДМФА (5 мл) добавляли ТЭА (114 мг, 1,13 ммоль) и 2,5–диоксопирролидин–1–ил 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35–додекаоксаоктатриаконтан–38–оат (144 мг, 0,21 ммоль) в ДМФА (2,0 мл) и после этого полученную смесь перемешивали в течение 16 часов. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии среднего давления с обращенной фазой (LiChroprep RP–18 Lobar (B) 25×310 мм – EMD chemicals 40–63 мкм, ~70 г, с 90/10 до 80/20 0,1% ТФУ–ACN) для получения 87,5 мг (выход 61%) соединения из примера 9 в виде оранжевой пленки: 1NMR (300 МГц, ДМСО–d6) δ 8,48 (t, J=5,7 Гц, 2 H), 7,96 (t, J=5,4 Гц, 2 H), 7,80–7,86 (m, 2 H), 5,94 (bm, 2 H), 3,30–3,60 (сложный m, 106 H), 2,26–2,33 (m, 4 H). 13C NMR (75 МГц, ДМСО–d6) δ 170,2 (s), 165,1 (s), 146,0 (s), 126,2 (s), 71,2 (t), 69,7 (t), 69,6 (t), 69,5 (t), 66,7 (t), 58,0 (q), 38,2 (t), 36,2 (t). ЖХ–МС (градиент 15–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=5,90 мин на 250 мм колонке, (M+2H)2+ = 712. UV/vis (100 мкМ в ФСБ) λabs=449 нм. Флуоресценция (100 нМ) λex=449 нм, λem=559 нм.
Пример 10
Бис(2–(ПЭГ–5000)этил)6–(2–(3,6–диамино–5–(2–аминоэтилкарбамоил)пиразин–2–карбоксамидо)этиламино)–6–оксогексан–1,5–диил дикарбамат
Раствор из примера 5 (25 мг, 0,049 ммоль) в ДМФА (30 мл) обрабатывали ТЭА (1 мл) и m–PEG2–NHS (1 г, 0,1 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 48 часов при комнатной температуре. Смесь концентрировали и остаток частично очищали с помощью гель–фильтрационной хроматографии (смола G–25, вода). Продукт концентрировали и дополнительно очищали с помощью хроматографии среднего давления с обращенной фазой (C18, ручной градиент 10–70% ацетонитрила в 0,1% ТФУ) для получения 137,8 мг (выход 54%) соединения из примера 10 в виде рыжевато–коричневого воскообразного твердого вещества: MALDI MS m/z=11393.
Пример 11
(R)–2–(6–(бис(2–метоксиэтил)амино)–5–циано–3–морфолинопиразин–2–карбоксамидо)янтарная кислота
Стадия 1. Синтез 2–амино–5–бром–3,6–дихлорпиразина.
Раствор 2–амино–6–хлорпиразина (25 г, 193,1 ммоль) в MeOH (500 мл) обрабатывали NBS (34,3 г, 193,1 ммоль), частями, более 1 часа. Полученную смесь после этого перемешивали в течение 16 часов. ТСХ анализ показал наличие небольшого количества исходного материала на этом этапе. Добавляли еще 1,4 г NBS и реакционную смесь нагревали до 50°С в течение 2 часов. Затем смесь охлаждали до 38°С и обрабатывали NCS (25,8 г, 193,1 ммоль). После этого реакционную смесь нагревали до 50°С в течение 16 часов. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры и обрабатывали водой (500 мл). Осадок собирали фильтрацией и сушили в вакуумном эксикаторе для получения 45,4 г (выход 97%) 2–амино–5–бром–3,6–дихлорпиразина в виде белого твердого вещества: 13C NMR (75 МГц, CDCl3) δ 149,9 (s), 145,6 (s), 129,6 (s), 121,5 (s). ЖХ–МС (градиент 15–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=4,51 мин на 30 мм колонке, (M+H)+ = 244, (M+H+ACN)+ = 285.
Стадия 2. Синтез 5–амино–3,6–дихлорпиразин–2–карбонитрила.
Смесь CuCN (8,62 г, 96,3 ммоль) и NaCN (4,72 г, 96,3 ммоль) нагревали в высоком вакууме до 90°C. Полученную смесь подвергали трем циклам аргон/вакуум и помещали под конечное положительное давление аргона. Смесь охлаждали до комнатной температуры и добавляли ДМФА (150 мл). Гетерогенную смесь нагревали до 130°C в течение 2,5 часов. К полученной гомогенной смеси дицианокупрата натрия добавляли раствор продукта со стадии 1 (15,6 г, 64,2 ммоль), растворенного в ДМФА (150 мл), по каплям, в течение 1 часа. Температуру постепенно повышали до 150°C и полученную смесь после этого перемешивали при этой температуре в течение 10 часов. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и выливали в воду (1 л). Полученную смесь экстрагировали EtOAc (3х) и объединенные экстракты фильтровали для удаления темного хлопьевидного твердого вещества, промывали солевым раствором, сушили (Na2SO4), снова фильтровали и концентрировали. В результате очистки с помощью колоночной флэш–хроматографии (SiO2, 10/1 гексаны–EtOAc до 3/1) получили 6,70 г (выход 55%) нитрильного продукта в виде рыжевато–коричневого твердого вещества: 13C NMR (75 МГц, CDCl3) δ 153,9 (s), 149,1 (s), 131,7 (s), 115,4 (s), 111,0 (s). ГХ–МС (температура инжекции=280°C, скорость потока гелия 1,0 мл/мин, программа температуры: 100°C (в течение 2 мин), нагревание до 300°C со скоростью 10°C/мин (в течение 2 мин), время удерживания основного пика=16,556 мин, m/z (EI) = 188, 190.
Стадия 3. Синтез 5–амино–3–(бис(2–метоксиэтил)амино)–6–хлорпиразин–2–карбонитрила.
К продукту со стадии 2 (1,00 г, 5,29 ммоль) в ACN (20 мл) добавляли бис(2–метоксиэтил)амин (3,0 мл, 2,71 г, 20,3 ммоль) и реакционную смесь после этого нагревали до 70°C в течение 16 часов. Реакционную смесь охлаждали и концентрировали. Остаток распределяли между EtOAc и водой. Органический слой отделяли и водный слой снова экстрагировали EtOAc. Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором, сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали. В результате очистки с помощью колоночной флэш–хроматографии (SiO2, 10/1 гексаны–EtOAc до 1/1) получили 950 мг (выход 63%) желаемого аддукта в виде желтого твердого вещества: 1NMR (300 МГц, CDCl3) δ 7,47 (bs, 2 H), 3,77 (t, J=5,7 Гц, 4 H), 3,52 (t, J=5,4 Гц, 4 H), 3,25 (s, 6 H). 13C NMR (75 МГц, CDCl3) δ 154,7 (s), 152,0 (s), 120,9 (s), 119,5 (s), 95,8 (s), 71,0 (t), 59,1 (q), 50,0 (t). ЖХ–МС (градиент 50–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=4,91 мин на 250 мм колонке, (M+H)+ = 286, (M+Na)+ = 308, (M+Na+ACN)+ = 349.
Стадия 4. Синтез 3–(бис(2–метоксиэтил)амино)–5–бром–6–хлорпиразин–2–карбонитрил.
К продукту со стадии 3 (1,39 г, 4,88 ммоль) в 48% бромистоводородной кислоте (20 мл) при 0°C (баня с ледяной солью) добавляли нитрит натрия (673 мг, 9,75 ммоль) в воде (10 мл), по каплям, в течение 30 мин. Полученную смесь перемешивали при 0~5°C в течение 1 часа и выливали в перемешиваемый раствор CuBr2 (1,64 г, 7,34 ммоль) в воде (100 мл). Полученную смесь после этого перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Смесь экстрагировали EtOAc (3х). Объединенные органические слои сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали. В результате очистки колоночной флэш–хроматографии (SiO2, 50/1 CHCl3–MeOH) получили 1,00 г (выход 58%) бромида в виде оранжево–коричневого твердого вещества: 1NMR (300 МГц, CDCl3) δ 3,99 (t, J=5,4 Гц, 4 H), 3,64 (t, J=5,4 Гц, 4 H), 3,35 (s, 6 H). 13C NMR (75 МГц, CDCl3) δ 152,8 (s), 140,8 (s), 133,4 (s), 117,2 (s), 108,3 (s), 70,4 (t), 59,1 (t), 50,5 (q). ЖХ–МС (градиент 50–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=4,55 мин на 250 мм колонке, (M+H)+ = 349, 351.
Стадия 5. Синтез 3–(бис(2–метоксиэтил)амино)–6–хлор–5–(фуран–2–ил)пиразин–2–карбонитрил.
Смесь продукта со стадии 4 (1,0 г, 2,87 ммоль), 2–фуранборную кислоту (643 мг, 5,75 ммоль), Cs2CO3 (3,31 г, 10,2 ммоль), TFP (35 моль%, 236 мг, 1,02 ммоль) и Pd2dba3–CHCl3 (5 моль%, 10 моль% Pd, 150 мг) подвергали 3 циклам вакуум/аргон и помещали под положительное давление аргона. Добавляли безводный диоксан (50 мл) и после этого реакционную смесь нагревали до 75°C в течение 16 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли EtOAc (100 мл) и фильтровали через средний фрит. В результате концентрирования и очистка остатка с помощью флэш–хроматографии (SiO2, 50/1 CHCl3–MeOH) получили 757 мг аддукта фурана (выход 78%) в виде рыжевато–коричневого порошка: ЖХ–МС (градиент 5–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=6,41 мин на 250 мм колонке, (M+H)+ = 337.
Стадия 6. Синтез 6–(бис(2–метоксиэтил)амино)–3–хлор–5–цианопиразин–2–карбоновой кислоты.
К хорошо перемешанной смеси ACN (11 мл), CCl4 (7 мл) и воды (11 мл) последовательно добавляли периодат натрия (1,07 г, 5,00 ммоль) и RuO2·H2O (13,3 мг, 0,10 ммоль). Полученную смесь интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут и обрабатывали бикарбонатом натрия (2,10 г, 25,0 ммоль), а затем водой (5 мл). После интенсивного перемешивания еще в течение 15 минут добавляли раствор продукта со стадии 5 (276 мг, 0,82 ммоль), растворенного в ACN (1 мл). Зеленую смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5,5 часов. Смесь переносили в делительную воронку и экстрагировали EtOAc. pH водного слоя доводили до ~3,5 и снова экстрагировали EtOAc (2х). Объединенные экстракты промывали 20% бисульфитом натрия и солевым раствором и сушили (Na2SO4). В результате фильтрации и концентрирования получили 140 мг (выход 54%) карбоновой кислоты в виде бледно–желтого твердого вещества: ЖХ–МС (градиент 5–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=5,05 мин на 250 мм колонке, (M+H)+ = 315.
Стадия 7. Синтез (R)–дибензил 2–(6–(бис(2–метоксиэтил)амино)–3–хлор–5–цианопиразин–2–карбоксамидо)сукцината.
Смесь продукта со стадии 6 (140 мг, 0,45 ммоль), EDC·HCl (128 мг, 0,67 ммоль) и HOBt·H2O (102 мг, 0,67 ммоль) в безводном ДМФА (25 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. К этой перемешанной смеси добавляли соль (R)–дибензил 2–аминосукцината p–TsOH (213 мг, 0,44 ммоль) и далее добавляли ТЭА (1 мл). После этого полученную смесь перемешивали в течение 16 часов. Реакционную смесь концентрировали и распределяли между EtOAc и насыщенным раствором бикарбоната натрия. EtOAc–слой отделяли и промывали насыщенным бикарбонатом натрия и солевым раствором, сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали для получения 240 мг (выход 88%) пиразинамида в виде оранжевой пены: ЖХ–МС (градиент 15–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=8,76 мин на 250 мм колонке, (M+H)+ = 610, (M+Na)+ = 632.
Стадия 8. (R)–дибензил 2–(6–(бис(2–метоксиэтил)амино)–5–циано–3–морфолинопиразин–2–карбоксамидо)сукцинат.
К продукту со стадии 7 (240 мг, 0,39 ммоль) добавляли морфолин (5 мл). Реакционную смесь нагревали до 70ºC в течение 2 часов. Смесь охлаждали и концентрировали. Остаток распределяли между EtOAc и водой. EtOAc–слой отделяли и промывали насыщенным бикарбонатом натрия и солевым раствором. EtOAc–слой сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали. В результате очистки с помощью колоночной флэш–хроматографии (SiO2, гексаны–EtOAc от 3:1 до 1:1) получили 199 мг (выход 75%) аддукта морфолина в виде оранжевой пены: ЖХ–МС (градиент 15–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=8,76 мин на 250 мм колонке, (M+H)+ = 661, (M+Na)+ = 683.
Стадия 9. Синтез примера 11.
К дибензиловому эфиру (115 мг, 0,17 ммоль) в ТГФ (10 мл) добавляли 1,0N гидроксид натрия (4 мл). Смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. pH доводили ~ до 2 с помощью 1,0 н. HCl и раствор концентрировали. В результате очистки с помощью хроматографии среднего давления с обращенной фазой (LiChroprep RP–18 Lobar (B) 25×310 мм – EMD chemicals 40–63 мкм, ~70 г, с 90/10 до 50/50 0,1% ТФУ–ACN) получали 32 мг (выход 27%) соединения из примера 11 в виде оранжевого твердого вещества: ЖХ–МС (градиент 15–95% ацетонитрила в 0,1% ТФУ в течение 10 мин), время удерживания одиночного пика=4,47 мин на 250 мм колонке, (M+H)+ = 481. UV/vis (100 мкМ в ФСБ) λabs=438 нм. Флуоресценция (100 нМ) λex=449 нм, λem=570 нм.
Пример 12
(2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))бис(3–гидроксипропановая кислота) («изомер D–серин» или «MB–102»)
Стадия 1: Получение дибензил 2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил) бис(азанидил))(2R,2'R)–бис(3–гидроксипропаноата)
В круглодонную колбу объемом 500 мл, снабженную адаптером Кляйзена и капельной воронкой, загружали гидрохлорид бензилового эфира D–серина (24,33 г, 105,0 ммоль) и через канюлю добавляли безводный ДМФА (300 мл). Раствор охлаждали на ледяной бане и перемешивали в течение 15 мин в атмосфере N2. DIPEA (19,16 мл, 110,0 ммоль) добавляли по каплям через капельную воронку в течение 30 минут, а еще через 30 минут охлаждающую баню убирали и добавляли дикислоту (9,91 г, 50,0 ммоль) одной порцией. Суспензию кирпично–красного цвета перемешивали в течение 30 минут и одной порцией добавляли HOBt·H2O (17,61 г, 115,0 ммоль). Через 15 минут реакционную колбу охлаждали на ледяной бане и порциями в течение 15 минут добавляли EDC·HCl (22,05 г, 115,0 ммоль). Полученную суспензию медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи (около 17 часов) в атмосфере азота.
Темный раствор концентрировали до сиропообразного остатка в высоком вакууме (температура бани 60°C), который далее распределяли между EtOAc и milli–Q H2O (по 400 мл каждого). Слои разделяли и водный слой экстрагировали EtOAc (3×200 мл). Объединенные EtOAc–экстракты последовательно промывали 0,50 М KHSO4, насыщенным NaHCO3, Н2О и насыщенным солевым раствором (по 250 мл каждый). В результате удаления растворителя при пониженном давлении получили 23,7 г оранжевого твердого вещества. Неочищенный продукт очищали флэш–хроматографией на силикагеле, применяя градиент CHCl3:MeOH, с получением бисамида (19,6 г, 71%) в виде твердого вещества оранжевого цвета: Rf 0,45 [CHCl3:MeOH (9:1, об./об.)]. 1H ЯМР (ДМСО–d6) δ 8,56 (d, J=8,0 Гц, 2 H, взаимозаменяемый с D2O), 7,40–7,33 (m, 10 H), 6,76 (s, 4 H, взаимозаменяемый с D2O), 5,37 (t, J=5,5 Гц, 2 H), 5,20 (m, 4 H), 4,66–4,63 (dt, J=8,0, 4,0 Гц, 2 H), 3,97–3,93 (m, 2 H), 3,81–3,77 (m, 2 H). 13C ЯМР (ДМСО–d6) δ 170,1, 164,9, 146,4, 135,8, 128,4, 128,0, 127,6, 125,9, 66,2, 61,1, 54,4. ОФ–ЖХ/МС (ESI) m/z 553,3 (M+H)+ (tR=4,44 мин, 5–95% B/6 мин). Элементный анализ для C26H28N6O8: C, 56,52; H, 5,11; N, 15,21. Обнаружено: C, 56,39; H, 5,11; N, 14,99.
Стадия 2. Получение (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))бис(3–гидроксипропановой кислоты)
Бисамид (7,74 г, 14,0 ммоль) гидрировали в присутствии 10% Pd/C (0,774 г) в EtOH:H2O (560 мл; 3:1, об./об.). Реакционную смесь продували аргоном и перемешивали в атмосфере водорода (медленное барботирование) при комнатной температуре в течение 5,5 часов. Реакционную смесь снова продували Ar и катализатор удаляли фильтрованием через целит. Слой промывали EtOH:H2O (400 мл; 1:1, об./об.) и объединенные фильтраты концентрировали в вакууме. Продукт высушивали в высоком вакууме. Остаток растирали с CH3CN для получения изомера D–серина (4,89 г, 94%) в виде оранжевого порошка. 1H NMR (ДМСО–d6) δ 8,46 (d, J=8,3 Гц, 2 H, взаимозаменяемый с D2O), 6,78 (br s, 4 H, взаимозаменяемый с D2O), 4,48–4,45 (dt, J=8,1, 3,9 Гц, 2H), 3,88 (dd, J=11,1, 3,9 Гц, 2 H), 3,74 (dd, J=11,1, 3,7 Гц, 2 H). 13C NMR (ДМСО–d6) δ 171,6, 164,7, 146,4, 125,9, 61,2, 54,3. ОФ–ЖХ/МС (ESI) m/z 373,2 (M+H)+ (tR=2,86 мин, 5–95% B/6 мин). Элементный анализ для C12H16N6O8: C, 38,71; H, 4,33; N, 22,57. Обнаружено: C, 38,44; H, 4,51: N, 22,33.
Пример 13
(2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))дипропионовая кислота («изомер D–аланина»)
Стадия 1. Получение диэтил 2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))(2R,2'R)–дипропионата
В инертной атмосфере в круглодонную колбу (100 мл), высушенную в пламени, снабженную магнитной мешалкой, загружали 3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбоновую кислоту (1,0 г), гидрохлорид этилового эфира D–аланина (1,86 г), EDC·HCl (2,70 г), HOBt·H2O (2,65 г) и Et3N (2,0 мл) в ДМФА (безводный, 80 мл). Летучие вещества удаляли при пониженном давлении и температуре 50°C с образованием темного полутвердого вещества. После охлаждения добавляли ацетонитрил (~ 100 мл) и раствор оставляли стоять около часа. Красный осадок выделяли центрифугированием, промывали EtOAc и сушили. Общий вес диэфира 1,30 г (3,06 ммоль, фактический выход 60,6%). Этот материал (1,3 г) применяли без дальнейшей очистки.
Стадия 2. Получение (2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))дипропионовой кислоты
Диэфир со стадии 1 (1,0 г) и LiOH (4 эквивалента) в смеси ТГФ/вода объединяли и перемешивали при температуре окружающей среды в течение нескольких часов. ВЭЖХ показала полный гидролиз. pH доводили до кислого значения добавлением ТФУ, и реакционную смесь оставляли стоять в течение ночи при температуре окружающей среды. Дикислоту получали путем очистки реакционной смеси с помощью препаративной ВЫЖХ с обращенной фазой. Программа: 99:1 A:B в течение 5 минут, затем 5:95 A:B в течение 27 минутах при скорости потока 50 мл/мин. Лямбда УФ 264 нм и флуоресценция; λx=440 нм, λm=565 нм. Фракции, содержащие желаемый продукт, объединяли и лиофилизировали (–85°С, 15 мторр) с получением твердого вещества оранжевого цвета (0,821 г, 2,41 ммоль, фактический выход 95,6%). m/z 341,13. Результаты протонного магнитного резонанса и ЯМР на ядрах углерода согласовались с предполагаемой структурой.
Пример 14
3,3'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))дипропионовая кислота («изомер β–аланина»)
Стадия 1. Получение дибензил 3,3'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))дипропионата
В инертной атмосфере в круглодонную колбу (100 мл), высушенную в пламени, загружали 3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбоновую кислоту (0,30 г), бензил 3–аминопропаноат п–толуолсульфонат (1,08 г), EDC·HCl (0,590 г), HOBt·H2O (0,582 г) и Et3N (1,50 г) в ДМФА (безводный, 40). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при температуре окружающей среды и концентрировали в вакууме до примерно 10 мл. Оставшийся ДМФА удаляли азеотропом толуола. Реакционную смесь распределяли между EtOAc (3×125 мл) и насыщенным NaHCO3 (3×100 мл). Органические слои объединяли и промывали лимонной кислотой (10% водный раствор, 100 мл) и солевым раствором (100 мл). Органический слой удаляли, сушили (безводный Na2SO4) и концентрировали в вакууме для получения кристаллического твердого вещества, 0,58 г. ТСХ (диоксид кремния на стекле, EtOAc:гексаны 1:1), Rf=0,22. Продукт очищали с помощью флэш–хроматографии на силикагеле с получением 0,49 г продукта. Масс–спектр (ES+) 521,36 (100%), 522,42 (30%), 523,34 (приблизительно 6%). ЯМР, 1H (ДМСО–d6), 400 МГц: 2,55 (4H, m), 3,41 (4H, m), 5,01 (4H, s), 6,44 (4H, s), 7,21 (10H, m), 8,41 (2H, m); 13C (ДМСО–d6): 34,18, 35,33, 66,19, 126,74, 128,52, 128,92, 136,56, 146,75, 165,63, 171,90.
Стадия 2. Получение 3,3'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))дипропионовой кислоты
Дибензиловый эфир на стадии 1 (0,92 г) объединяли с EtOH (абсолютный, 75 мл) и переносили в бутыль Фишера–Портера для реакций под давлением (6 унций), снабженную впускным и выпускным клапанами, манометром (0–100 фт/кв. дюйм изб.) и магнитной мешалкой с тефлоновым покрытием. Добавляли воду (25 мл) и 10% Pd на углероде (0,2 г, Degussa/Aldrich, мокрый), и реакционный сосуд герметизировали. После трех циклов вакуум/Ar добавляли H2 (г) из баллона для отбора проб при 10 фт/кв. дюйм в интенсивно перемешиваемый раствор. Через 3,5 часа реакционную смесь фильтровали через слой целита и полученный слой целит/катализатор промывали примерно 500 мл смеси 1:1 EtOH:H2O с получением раствора, который концентрировали в вакууме. Выделили 0,424 г твердого вещества (выход 70,5%). В ВЭЖХ/МС наблюдался только один пик на 9,3 минуте. Масс–спектр (ES+) 341,32 (100%), 342,37 (30%), 344,29 (18%), 270,30 (62%). ЯМР, 1H (ДМСО–d6), 400 МГц: 2,54 (2H, m), 3,42 (2H, m), 6,52 (2H, s), 7,21 (4H, m), 8,38 (2H, m), 11,9 (2H, bs); 13C (ДМСО–d6): 34,20, 35,33, 126,77, 146,75, 165,55, 173,57.
Пример 15
2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))ацетоуксусная кислота («изомер глицина»)
Стадия 1. Получение диэтил 2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))диацетата
В круглодонную колбу (300 мл), снабженную магнитной мешалкой, загружали 3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбоновую кислоту (5,0 г), этилглицинат гидрохлорид (5,04 г), EDC·HCl (8,1 г), HOBt·H2O (8,0 г) и DIPEA (5,9 г) в ДМФА (безводный, 200 мл). На протяжении всей реакции поддерживали атмосферу сухого аргона. Пиразин объединяли с глицинатом, и добавляли ДМФА при перемешивании в инертной атмосфере. К этой смеси добавляли основание и HOBt. Примерно через 15 минут порциями добавляли EDC в течение 45 минут, и реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в атмосфере Ar в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали в вакууме до получения вязкого полутвердого вещества. Полутвердое вещество обрабатывали толуолом (около 30 мл) и летучие вещества удаляли под вакуумом. После охлаждения образовалось твердое вещество. Неочищенный продукт растворяли в 500 мл EtOAc и перемешивали до образования двух слоев. Раствор промывали солевым раствором и насыщенным NaHCO3, и водный слой удаляли. Водный слой промывали (2х EtOAc, 150 мл), и органические слои объединяли. Органический слой промывали водным NaHSO4, насыщенным солевым раствором, сушили над Na2SO4 и концентрировали для получения твердого вещества. Фактический выход: 5,46 г. Чистота по данным ВЭЖХ анализ – 96,9%. m/z 369,2. Спектры ЯМР 1Н и 13С соответствовали предполагаемой структуре. Этот продукт применяли без дальнейшей очистки.
Стадия 2. Получение 2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))ацетоуксусной кислоты
Неочищенный продукт со стадии 1 (700 мг) растворяли в 40 мл ТГФ с 10 мл воды (деионизированная вода). Добавляли LiOH (4,2 эквивалента), и смесь перемешивали в течение ночи при температуре окружающей среды в инертной атмосфере. Анализ ВЭЖХ показал полное превращение в желаемую дикислоту (m/z=313,3). Реакционную смесь центрифугировали (3000 об/мин в течение 3 минут) и супернатант проверяли с помощью ВЭЖХ и выбрасывали. Оставшееся твердое вещество превращали в динатриевую соль обработкой NaOH (6,25 н., 2 эквивалента), и полученный раствор фильтровали (0,22 микрона). Раствор лиофилизировали для получения твердого вещества, чистота которого составила >95% по данным ВЭЖХ. Динатриевую соль превращали в дикислоту, добавляя чуть более двух эквивалентов ТФУ, и далее чистили с помощью препаративной колонки с обращенной фазой. Результаты протонного магнитного резонанса и ЯМР на ядрах углерода согласовались с предполагаемой структурой.
Пример 16
(2S,2'S)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))дипропионовая кислота («изомер L–аланина»)
Стадия 1. Получение диэтил 2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))(2S,2'S)–дипропионата
В инертной атмосфере в круглодонную колбу (100 мл), высушенную в пламени, загружали 3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбоновую кислоту (1,0 г), этил L–аланинат гидрохлорид (1,86 г), EDC·HCl (2,70 г), HOBt·H2O (2,65 г) в ДМФА (безводный, 80 мл). Добавляли триэтиламин (1,50 г). Через 16 часов при температуре окружающей среды, удаляли летучие вещества под вакуумом. Выделяли полутвердое вещество. Добавляли воду (70 мл) и смесь оставляли стоять в течение примерно часа. За это время образовывался осадок, поэтому смесь центрифугировали и выделяли твердое вещество, которое сушили на воздухе в течение ночи. Этот материал растворяли в EtOAc и промывали водой, лимонной кислотой и насыщенным бикарбонатом натрия. Органический слой сушили (безводный сульфат натрия) и концентрировали под вакуумом для получения твердого продукта (1,38 г). Чистота по данным ВЭЖХ >95%. Неочищенный продукт применяли на следующей стадии без дальнейшей очистки.
Стадия 2. Получение (2S,2'S)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))дипропионовой кислоты
Неочищенный продукт со стадии 1 (1,0 г) растворяли в ТГФ (30 мл) и добавляли LiOH·H2O (4 эквивалента), растворенный в воде (10 мл), при температуре окружающей среды. Через час летучие вещества удаляли под вакуумом. Продукт чистили с помощью препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой и лиофилизировали для получения твердого вещества с чистотой >95% желаемого двукислотного продукта. Результаты протонного магнитного резонанса и ЯМР на ядрах углерода согласовались с предполагаемой структурой.
Пример 17
2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))бис(2–метилпропановой кислоты) («изомер диметил глицина»)
Стадия 1. Получение диэтил 2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))бис(2–метилпропаноата)
В инертной атмосфере в круглодонную колбу (100 мл), высушенную в пламени, загружали 3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбоновую кислоту (1,0 г), гидрохлорид этил гем–диметил 3–аминопропановой кислоты (1,86 г), EDC·HCl (2,70 г), HOBt·H2O (2,65 г) в ДМФА (безводный, 80 мл). Реакцию инициировали добавлением триэтиламина (1,50 г) и поддерживали при температуре окружающей среды в течение 72 часов. Летучие вещества удаляли под вакуумом. Темную вязкую жидкость выделяли. После охлаждения ее растворяли в ацетонитриле (около 100 мл) и оставляли стоять около часа. Чистота образовавшегося осадка, который выделяли центрифугированием и сушили для получения 1,30 г диэтилового эфира (61%), составила >95% по данным ВЭЖХ с обращенной фазой. Этот неочищенный продукт применяли непосредственно на следующем этапе.
Стадия 2. Получение 2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис(азанидил))бис(2–метилпропановой кислоты)
Неочищенный продукт со стадии 1 (1,0 г) растворяли в смеси ТГФ:вода (40 мл:5 мл). К этой смеси добавляли LiOH в воде (2,5 эквивалента в 0,5 мл деионизированной воды). К реакционной смеси добавляли еще два эквивалента LiOH, и реакционную смесь оставляли на ночь при температуре окружающей среды. По окончании реакционную смесь подкисляли ТФУ до достижения значения pH около 4. Продукт выделяли с помощью препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой. M/Z 369,13. Результаты протонного магнитного резонанса и ЯМР на ядрах углерода согласовались с предполагаемой структурой.
Пример 18
3,6–диамино–N2,N5–бис((1R,2S,3R,4R)–1,2,3,4,5–пентагидроксипентил)пиразин–2,5–дикарбоксамид
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную магнитной мешалкой, загружали 3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбоновую кислоту (0,535 г, 2,70 ммоль), (1R,2S,3R,4R)–1–аминопентан–1,2,3,4,5–пентаол (0,978 г, 5,40 ммоль, 2,0 эквивалента) и ДМФА (40 мл). К этому добавляли триэтиламин (0,546 г, 0,76 мл, 5,40 ммоль, 2,0 эквивалента) и PyBop (3,1 г, 5,94 ммоль, 2,2 эквивалента). Через час реакцию завершали ВЭЖХ анализом, и реакционную смесь концентрировали в вакууме, поддерживая температуру ниже 40°C. Смесь растворяли в воде (10 мл), пропускали через колонку с Sephadex G–10, и фракции, содержащие флуоресцентный продукт, собирали и лиофилизировали для получения неочищенного твердого вещества. Целевой продукт, 3,6–диамино–N2,N5–бис((1R,2S,3R,4R)–1,2,3,4,5–пентагидроксипентил)пиразин–2,5–дикарбоксамид, получали с помощью препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой C–18: 160 мг, HRMS (теоретическое) M+Na=547,1970; HRMS (наблюдаемое) M+Na=547,1969.
Пример 19
Протокол оценки функции почек
Пример установки для in vivo мониторинга функции почек 10 приведен на Фиг. 2 и включает источник света 12 и систему обработки данных 14. Источник света 12 обычно включает или соединен с соответствующим устройством для воздействия светом, по меньшей мере, на часть тела пациента. Примеры соответствующих устройств, которые могут являться частью или могут быть соединены с источником света 12, включают катетеры, эндоскопы, оптоволокно, ушные клипсы, манжеты на руки, повязки на голову, налобные датчики, поверхностные катушки и зонды, но не ограничиваясь этим. Действительно, любое из устройств, способных испускать видимый и/или ближний инфракрасный свет от источника света, может применяться в установке для мониторинга функции почек 10. В одном из аспектов источниками света являются светодиоды, при этом один из светодиодов испускает свет вблизи максимума поглощения индикаторного агента, в то время как второй светодиод испускает свет вблизи максимума эмиссии флуоресценции индикаторного агента. Например, один светодиод испускает свет при 450 нм, а второй светодиод испускает свет при 560 нм.
Со ссылкой на Фиг. 2, система обработки данных 14 установки для мониторинга функции почек может быть любой подходящей системой, способной детектировать спектральную энергию и обрабатывать данные, характеризующие спектральную энергию. Например, система обработки данных 14может включать одну или несколько линз (например, для направления и/или фокусирования спектральной энергии), один или несколько фильтров (например, для исключения нежелательных длин волн спектральной энергии), фотодиод или фотоумножитель (например, для регистрации спектральной энергии и преобразования ее в электрический сигнал, характеризующий детектированную спектральную энергию), усилитель (например, для усиления электрического сигнала от фотодиода или фотоумножителя) и блок обработки (например, для обработки электрического сигнала от фотодиода или фотоумножителя). Система обработки данных 14 предпочтительно выполнена с возможностью обрабатывать полученные спектральные данные и генерировать профиль интенсивность/время и/или кривую концентрация/время, характеризующие почечный клиренс производного пиразина по настоящему изобретению у пациента 20. Действительно, система обработки данных 14 может быть выполнена с возможностью генерировать соответствующие данные о функции почек путем сравнения, как по–разному нормальные и поврежденные клетки выводят производное пиразина из кровотока, определять скорость или накопление производного пиразина в органах или тканях пациента 20, и/или получать томографические изображения органов или тканей, содержащих производное пиразина.
В качестве примера и не для ограничения в одном из аспектов система включает два кремниевых фотоумножителя. Первый фотоумножитель включает фильтр длинных частот, тогда как во втором фотоумножителе фильтр отсутствует. Такое расположение позволяет измерять как эмиссию флуоресценции, так и диффузное отражение на длинах волн возбуждения и эмиссии. В одном из таких вариантов осуществления измерение флуоресценции и диффузного отражения объединяют в измерение собственной флуоресценции, благодаря чему компенсируются различия в оптических свойствах ткани. Пример формулы для объединения измерений приведен в уравнении 1.
В одном из аспектов для определения функции почек эффективное количество производного пиразина вводят нуждающимся в этом пациентам (например, в форме для фармацевтически приемлемой композиции). По меньшей мере, часть тела пациента 20 подвергается воздействию видимого и/или ближнего инфракрасного света от источника света 12, как показано стрелкой 16. Например, свет от источника света 12 может быть доставлен через оптоволокно, которое прикреплено к уху пациента 20. Пациент может подвергаться воздействию света от источника света 12 до или после введения производного пиразина пациенту 20. В некоторых случаях может быть целесообразно генерировать фоновые или базовые показания света, испускаемого телом пациента 20 (вследствие воздействия света от источника света 12), до введения производного пиразина пациенту 20. Когда производное пиразина, которое находится в теле пациента 20, подвергается воздействию света от источника света 12, производное пиразина испускает свет (обозначено стрелкой 18), который детектируется/регистрируется системой обработки данных 14. Вначале введение производного пиразина пациенту 20, как правило, позволяет получить исходный спектральный сигнал, характеризующий начальное содержание производного пиразина у пациента 20. Далее спектральный сигнал затухает с течением времени (является функцией времени), по мере того, как производное пиразина выводится из пациент 20. Это затухание спектрального сигнала как функция времени характеризует функцию почек пациента. Кроме того, если индикаторный агент вводят в сосудистое пространство пациента, начальная кинетика отражает процесса уравновешивания индикаторного агента во всем внеклеточном пространстве пациента. В некоторых аспектах это уравновешивание завершается менее чем за 2 часа.
Например, у первого пациента с здоровой/нормальной функцией почек, спектральный сигнал может затухать до базового уровня за время Т. Тогда как спектральный сигнал, характеризующий недостаточность функции почек у второго пациента, может затухать до базового уровня за время Т+4 часа. Степень почечной недостаточности или дефицита функции почек будет влиять на продолжительность времени, необходимого для затухания сигнала до базового уровня. Чем выше степень почечной недостаточности, тем больше времени потребуется для этого. Таким образом, пациент 20 может подвергаться воздействию света от источника света 12 в течение любого периода времени, нужного для получения желаемых данных о функции почек. Аналогично, система обработки данных 14 может регистрировать/детектировать спектральную энергию в течение любого периода времени, нужного для получения желаемых данных о функции почек.
Кроме того, определение СКФ у пациента не ограничивается одним определением, основанным на однократном введении индикаторного агента. Период времени между введением индикаторного агента и моментом, когда он становится недетектируемым у пациента, может быть разделен на несколько меньших отрезков, и СКФ пациента рассчитывается для каждого меньшего отрезка. В некоторых аспектах отрезки времени могут перекрываться. В качестве примера и не для ограничения, если весь период времени до момента, когда индикаторный агент становится недетектируемым, составляет 24 часа, то этот период времени можно разделить на четыре равных отрезка по шесть часов; каждый новый отрезок времени начинается с конца предыдущего отрезка. В еще одном аспекте отрезки времени могут перекрываться. Например, каждый отдельный отрезок времени может длиться четыре часа, но отрезок времени может начинаться каждые два часа. В результате чего образуются перекрывающиеся отрезки на всем протяжении измерения. Чтобы полнее проиллюстрировать этот неограничивающий пример, если индикаторный агент был введен в момент времени 0 и стал недетектируемым через 24 часа, могут быть образованы следующие отрезки времени: 0–4 часа, 2–6 часов, 4–8 часов, 6–10 часов, 8–12 часов, 10–14 часов, 12–16 часов, 14–18 часов, 16–20 часов, 18–22 часа и 20–24 часов. СКФ пациента может быть рассчитана для каждого отрезка времен отдельно. Эти данные далее будут применены для более полной оценки состояния здоровья почек пациента. Отрезок времени может быть любой длины, которая достаточна для определения СКФ, и может составлять 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 8 часов, 10 часов или 12 часов. Кроме того, отрезки времени не должны быть идентичными во время измерения. Длина каждого отрезка времени выбирается индивидуально, без учета длины любого другого отрезка времени.
Результаты фармакокинетических исследований
В ходе клинического исследования 60 пациентам–людям вводили MB–102 ((2R,2'R)–2,2'–((3,6–диаминопиразин–2,5–дикарбонил)бис (азанидил))бис(3–гидроксипропановая кислота)), полученный в примере 12, внутривенно. Помимо осуществления способов, раскрытых в данном документе, собирали кровь и мочу. Были получены стандартные фармакокинетические данные и проведено сравнение способов, раскрытых в данном документе, со способом с Omnipaque® (йогексол), известным контрастным агентом, применяемым для определения СКФ.
На фиг. 3A–3D приведены данные, полученные от 60 пациентов–людей, на которых тестировали MB–102. Данные фармакокинетики в плазме были получены и проанализированы способами, известными в данной области, и далее их сравнивали с данными, полученными с применением способов, раскрытых в данном документе.
Фиг. 3A–3D иллюстрируют фармакокинетическую модель выведения MB–102 с двумя компартментами. Модель применима к пациентам независимо от их значений СКФ. Фиг. 3А – для пациентов с нормальной функцией почек, у которых измеренная СКФ (иСКФ) составляет 120 мл/мин. Фиг. 3B для пациентов с иСКФ 81 мл/мин. Фиг. 3C для пациентов с иСКФ 28 мл/мин. Фиг. 3D для пациентов, у которых иСКФ составляет 25 мл/мин. Первый компартмент в модели с двумя компартментами соответствует равновесию между сосудами и тканью, тогда как второй компартмент соответствует только почечной экскреции. В среднем время уравновешивания составляет примерно один час и зависит от субъекта.
На фиг.4 приведены сравнительные данные для СКФ, измеренной с применением Omnipaque® с применением традиционных способов, в сравнении с MB–102, с применением способов, раскрытых в данном документе, для пациентов, у которых рСКФ находится в диапазоне от примерно 20 до примерно 140. Данные показывают, что коэффициент корреляции равен 0,97. Это указывает на то, что с помощью способа определения СКФ пациента, применяемого в данном документе, могут быть получены аналогичные результаты по сравнению с известными способам.
В рамках 1 фазы клинического исследования MB–102 у пациентов в течение 12 часов собирали мочу для определения извлеченного количества и степени вторичного метаболизма. Как показано на фиг. 5, у пациентов с рСКФ выше 60 через 12 часов было извлечено в неметаболизированном виде более 99% МВ–102. У пациентов с иСКФ ниже 60 через 12 часов было извлечен меньший процент МВ–102, но также в неметаболизированном виде. Для пациентов с нормальной функцией почек, 1 и 2 стадиями нарушения функции почек, 12 часов было достаточно для извлечения более 99% MB–102. Учитывая фармакокинетические данные и период полувыведения из плазмы, для пациентов с более серьезным нарушением функции почек можно собирать мочу в течение более короткого периода времени.
На фиг. 6 показан период полувыведения из плазмы MB–102 для пациентов с нормальной функцией почек, почечной недостаточностью 1 стадии, почечной недостаточностью 2 стадии, почечной недостаточностью 3 стадии или почечной недостаточностью 4 стадии. Если основываться на этих данных, становится ясно, что в приведенном выше исследовании по сбору мочи, для того, чтобы весь МВ–102 был выведен из кровотока пациента нужно более 24 часов. В группе с нормальной функцией почек средний период полувыведения из плазмы составляет два часа, поэтому 12–часовой период сбора составляет примерно 6 периодов полувыведения и достаточен для выведения большей части введенной дозы. В группах со 2 и 3 стадиями почечной недостаточности средний период полувыведения из плазмы составляет 2,5 часа, поэтому 12–часовой период сбора составляет примерно 5 периодов полувыведения и также достаточен для сбора большей части введенной дозы. Однако период полувыведения 4 часа, для группы с 3 стадией почечной недостаточности, и период полувыведения 8 часов для группы с 4 стадией почечной недостаточности, не позволяют собрать всю введенную дозу в течение 12–часового периода клинического исследования.
В клиническом исследовании фармакокинетика в плазме (как функция времени) (через 2 часа после введения индикаторного агента и до конца 12–часового периода исследования) коррелирует с фармакокинетикой трансдермальной флуоресценции, измеренной на грудине пациентов. Высокие корреляции между концентрациями в плазме и интенсивностью флуоресценции наблюдались для пациентов с широким диапазоном значений СКФ. На фиг. 7, 8 и 9 приведены данные для трех отдельных пациентов со значениями СКФ от 23 мл/мин/1,73 м2 (стадия 3b почечной недостаточности) до 117 мл/мин/1,73 м2 (нормальная функция почек). Таким образом, фармакокинетика в плазме коррелирует с трансдермальной флуоресценцией для MB–102 для пациентов с широким диапазоном СКФ.
Определение трансдермальной СКФ (аппроксимация для всего набора данных)
Кинетический анализ был проведен с помощью LabView, Matlab, WinNonlin и Microsoft Excel, версия 2010, следующим образом. Данные трансдермальной флуоресценции аппроксимировали одноэкспоненциальной функцией в диапазоне от 2 часов (период после инъекции, обеспечивающий уравновешивание индикаторного агента во внеклеточном пространстве) до окончания доступных данных (обычно около 12 часов). Для каждого субъекта были осуществлены две аппроксимации: (1) со смещением, установленным на ноль, (2) с переменным смещением в допустимом диапазоне изменения. Экспоненциальная константа времени, определенная из этих аппроксимаций, называется константой времени затухания в почках (RDTC).
Линейная регрессия, исключение выбросов и вычисление коэффициента корреляции (R2) и стандартной ошибки калибровки (SEC) были выполнены в Microsoft Excel, версия 2010. Значения, обратные RDTC, коррелировали с СКФ с применением 4 различных способов для определения СКФ:
Без нормализации – СКФ, определенная по данным анализа ФК в плазме как йогексола, так и MB–102.
Нормализованная на ППТ – рост и вес применялись для оценки площади поверхности тела каждого субъекта (ППТ) в соответствии со способом Мостеллера (N Engl J Med, 1987; 317(17)). СКФ, определенную с помощью PK–анализа в плазме, делили на отношение вычисленной ППТ к 1,73 м2 (ППТ для пациента «стандартного» размера).
Нормализованная на Vd (способ 1) – СКФ, определенную с помощью PK–анализа в плазме, делили отношение объема распределения (Vd) (также определенный с помощью ФК–анализа) к 14,760 мл, Vd для пациента «стандартного» размера. Vd для пациента стандартного размера определяли, подгоняя среднее значение нСКФ для всех пациентов группы 1, чтобы оно было одинаковым для способов нормализации на Vd и ППТ. «нСКФ» применяется в данном документе для обобщенного обозначения способов (включая как ППТ, так и Vd), в которых СКФ нормализуется на размер тела.
Нормализованная на Vd (способ 2) – одноэкспоненциальная, с фиксированным на нуле смещением, аппроксимированная для зависимости концентрации MB–102 в плазме от времени, в диапазоне от 2 до 12 часов (относительно времени инъекции индикаторного агента). Величину, обратную аппроксимирующей константе времени умножали на 14,760 мл (Vd для пациента «стандартного» размера; см. выше), в результате чего получали СКФ, нормализованную на объем распределения.
Коэффициенты корреляции (R2) и стандартные ошибки калибровки (SEC) для графиков СКФ, рассчитанной по данным ФК в плазме, по сравнению с уровнем чрескожного почечного клиренса суммированы в таблице 2 и на фиг. 12–18. В соответствии с предыдущими результатами Rabito (J Nucl Med, 1993; 34(2): 199–207), в результате нормализации СКФ на ППТ увеличивается R2 и уменьшается SEC, что подтверждает гипотезу о том, что скорость почечного клиренса MB–102 может являться показателем эффективности почек, который не зависит от размера тела. Кроме того, эти результаты показывают, что объем распределения (Vd) индикаторного агента также эффективен для нормализации СКФ на стандартный размер тела. Как видно из таблицы 2, способы нормализации на размеры тела, ППТ и второй Vd, были одинаково эффективны в случаях, когда не применялись способы исключения выбросов, а смещение для аппроксимации RDTC было зафиксировано равным нулю.
Таблица 2
| Соединение СКФ | Способ нормализации СКФ | Смещение (способ) | Исключение выбросов | R2 | N | SEC | |
| Абсолютная (мл/мин) | Относительная (%) | ||||||
| Йогексол | нет | равно 0 | нет | 0,6494 | 55 | 19,0 | 25,1% |
| Йогексол | ППТ | равно 0 | нет | 0,7804 | 55 | 13,5 | 19,1% |
| Йогексол | Vd | равно 0 | нет | 0,7978 | 55 | 14,3 | 21,0% |
| MB–102 | нет | равно 0 | нет | 0,6911 | 55 | 21,0 | 24,7% |
| MB–102 | ППТ | равно 0 | нет | 0,8242 | 55 | 13,7 | 18,0% |
| MB–102 | Vd (1) | равно 0 | нет | 0,8016 | 55 | 15,8 | 20,1% |
| MB–102 | Vd (2) | равно 0 | нет | 0,8211 | 55 | 14,1 | 19,3% |
Способ аппроксимации RDTC со смещением
Кинетику трансдермальной флуоресценции аппроксимировали двумя различными способами смещения: (1) смещение фиксировано на нуле, и (2) смещение может варьироваться. На фиг. 18 и 19 приведены полученные корреляционные графики для способов с фиксированным и переменным смещением, соответственно. Следует обратить внимание, что, когда смещение фиксировано на нуле (фиг. 18), данные кластеризуются более плотно в области низкой СКФ на корреляционном графике, тогда как, когда смещение варьируется (фиг. 19), данные кластеризуются более плотно в области высокой СКФ.
Это наблюдение указывает на нестабильность базовой флуоресценции. У здоровых субъектов с высокой константой скорости почечного клиренса флуоресцентный агент выводится до окончания 12–часового периода сбора данных. Было отмечено, что у этих субъектов конечный уровень плато флуоресценции не всегда идеально совпадал с исходной базовой флуоресценцией перед инъекцией. В случае, когда у этих здоровых субъектов смещение могло варьироваться при аппроксимации, аппроксимацией удавалось компенсировать эту неопределенность базовой линии, что повышало надежность извлеченной константы скорости клиренса. Однако у многих субъектов с нарушенной функцией почек агент полностью не выводился за 12–часовой интервал измерений. Было обнаружено, что у этих субъектов в случае переменного смещения наоборот увеличивалась неопределенность аппроксимирующей константы скорости клиренса. Надежность константы скорости удавалось повысить при фиксации смещения на нуле.
На основании этих наблюдений был разработан гибридный способ смещения. В гибридном способе, если при аппроксимации с фиксированным смещением константа скорости получается высокой (т.е. здоровая функция почек), тогда допускается возможность варьирования смещения; в противном случае (т.е. нарушенная функция почек) смещение фиксируется. Оптимальная точка перехода была выбрана таким образом, чтобы максимизировать R2 и минимизировать SEC, как показано на фиг. 25. Точка перехода, показанная на оси X, выражается в виде константы времени (в единицах часов), которая представляет собой величину обратную константе скорости клиренса. Как видно на фиг. 25, оптимум константы времени находился в диапазоне от 3,5 до 4,5 часов. Корреляционный график, построенный с применением гибридного способа смещения (точка перехода: 3,5 часа), приведен на фиг. 20. Сравнение способов фиксированного, переменного и гибридного смещения, приведенное в таблице 3, показало, что в случае применения способа гибридного смещения происходит значительное увеличение R2 и снижение SEC по сравнению с другими способами.
Таблица 3
| Соединение СКФ | Способ нормализации СКФ | Смещение (способ) | Исключение выбросов | R2 | N | SEC | |
| Абсолютная (мл/мин) | Относительная (%) | ||||||
| MB–102 | ППТ | равно 0 | нет | 0,8242 | 55 | 13,7 | 18,0% |
| MB–102 | ППТ | переменное | нет | 0,7721 | 55 | 15,7 | 38,0% |
| MB–102 | ППТ | гибридный | нет | 0,8278 | 55 | 13,6 | 16,8% |
| MB–102 | Vd (1) | равно 0 | нет | 0,8016 | 55 | 15,8 | 20,1% |
| MB–102 | Vd (1) | переменное | нет | 0,8554 | 55 | 13,5 | 39,3% |
| MB–102 | Vd (1) | гибридный | нет | 0,9165 | 55 | 10,3 | 15,4% |
| MB–102 | Vd (2) | равно 0 | нет | 0,8211 | 55 | 14,1 | 19,3% |
| MB–102 | Vd (2) | переменное | нет | 0,8699 | 55 | 12,0 | 38,1% |
| MB–102 | Vd (2) | гибридный | нет | 0,9199 | 55 | 9,4 | 14,5% |
Исключение данных
У некоторых клинических субъектов датчик не был полностью прикреплен к коже в течение всех 12 часов исследования. Повторное прикрепление датчика после инъекции часто приводило к значительному сдвигу уровня сигнала. Это может быть связано с: (1) неоднородностью автофлуоресценции кожи, (2) неоднородностью фракции интерстициальной жидкости в коже или (3) изменениями эффективности передачи света в коже. Чтобы решить эту проблему в будущем, конструкция датчика была изменена таким образом, чтобы его площадь была меньше, и он лучше крепился к пациенту. Чтобы можно было применять клинические данные, некоторые данные были исключены.
Пять из 60 клинических субъектов были полностью исключены из кинетического анализа флуоресценции: (1) Субъект 1 был исключен из–за многократного перегрева датчика (у всех последующих субъектов максимально допустимый уровень мощности синего светодиода был снижен на 60%), (2) Субъекты 8, 37 и 49 были исключены, потому что датчик полностью оторвался от кожи, и первоначальный уровень сигнала не мог быть восстановлен после повторного прикрепления, (3) Субъект 46 был исключен, потому что большинство полученных от него данных было исключено на этапе предварительной обработки (вероятной причиной было непреднамеренное изменение мощности светодиода или усилителя детектора после инъекции индикаторного агента).
Были протестированы различные показатели, которые могли бы применяться в дальнейшем для исключения данных субъектов, в том числе: (1) коэффициент корреляции между IF и аппроксимацией; (2) среднеквадратичная ошибка (RMSE) IF относительно аппроксимации (3) различие между RDTC, определенной с одноэкспоненциальным и двухэкспоненциальным приближением; (4) отношение сигнал/шум, рассчитанное как амплитуда аппроксимирующего экспоненциального члена, деленная на RMSE; (5) коэффициент вариации (CV) константы скорости, аппроксимирующий на нескольких более коротких отрезках времени (например, 1–2 часа) 12–часового периода; (6) предполагаемая ошибка константы скорости, аппроксимирующая для IF; и (7) предполагаемая ошибка СКФ, определенная по данным в плазме. Ни один из этих показателей не включает предварительную информацию о коэффициенте корреляции или SEC.
В одном из аспектов в случае применения упомянутого выше способа исключения данных (6), предполагаемую ошибку константы скорости, аппроксимирующую IF, делили на константу скорости (обозначается как относительная ошибка), и были получены результаты, приведенные на фиг. 26. При исключении субъектов, у которых относительная ошибка константы скорости была больше чем 1,4–1,8%, наблюдалось значительное улучшение R2 и SEC. При выборе 1,75% в качестве порогового значения, десять из 55 субъектов были исключены. Полученные корреляционные графики приведены на фиг. 21 и 22.
Этот способ также применили в качестве показателя исключения, чтобы проверить, вносит ли ошибка в определениях СКФ по плазме какой–либо вклад в разброс данных на корреляционных графиках. На фиг. 27 показана оптимизация этого показателя. При выборе 5% в качестве порогового значения приемлемости СКФ наблюдалось небольшое улучшение R2 и SEC. Однако это потребовало исключить еще 10 субъектов, в результате число оставшихся субъектов сократилось до 35. Полученные корреляционные графики приведены на фиг. 23 и 24. Числовые данные по результатам применения различных показателей для исключения данных приведены в таблице 4.
Таблица 4
| Соединение СКФ | Способ нормализации СКФ | Смещение (способ) | Исключение выбросов | R2 | N | SEC | |
| Абсолютная (мл/мин) | Относительная (%) | ||||||
| MB–102 | ППТ | равно 0 | нет | 0,8278 | 55 | 13,6 | 16,8% |
| MB–102 | ППТ | переменное | нет | 0,8906 | 45 | 11,0 | 15,0% |
| MB–102 | ППТ | гибридный | нет | 0,8716 | 35 | 12,0 | 14,5% |
| MB–102 | Vd (1) | равно 0 | нет | 0,9165 | 55 | 10,3 | 15,4% |
| MB–102 | Vd (1) | переменное | нет | 0,9575 | 45 | 7,4 | 14,1% |
| MB–102 | Vd (1) | гибридный | нет | 0,9614 | 35 | 7,0 | 10,2% |
| MB–102 | Vd (2) | равно 0 | нет | 0,9199 | 55 | 9,4 | 14,5% |
| MB–102 | Vd (2) | переменное | нет | 0,9575 | 45 | 7,0 | 13,3% |
| MB–102 | Vd (2) | гибридный | нет | 0,9597 | 35 | 7,7 | 9,6% |
Наклон калибровки, определяемый вышеописанными способами, можно применять для генерации чрескожных измерений СКФ, скорректированных с учетом размера тела (в данном документе называемая «тСКФ»). На фиг. 10 показана корреляция между прогнозируемыми и плазменными значениями СКФ с нормализацией на ППТ. Точность калибровки можно изобразить на графике путем сравнения тСКФ с «золотым стандартом» определения скорректированной на размер тела СКФ по данным ФК анализа плазмы. На фиг. 10 приведена полученная корреляция для значений СКФ, определенных по плазме и нормализованных на площадь поверхности тела пациента (ППТ), для которой коэффициент корреляции (R2) составил 0,89. В результате применения объема распределения (Vd) вместо ППТ для коррекции с учетом размера тела, значительно улучшается корреляция и становится равной 0,96 (фиг. 11).
Если сравнивать с наиболее часто применяемым в клинической практике способом оценки СКФ, результаты для тСКФ потенциально имеют более высокую точность. Высокая точность важна при принятии клинических решений. Фиг. 28 и таблица 1 иллюстрируют 5 стадий хронической болезни почек (ХБП). Ошибочный диагноз ХБП может повлиять на курс клинического лечения. Чтобы визуализировать ошибочные диагнозы ХБП по данным измерений СКФ относительно золотого стандарта, был построен график сетки ошибок, приведенный на фиг. 29А–С. Измерения, попадающие в рамку со всеми зелеными сторонами, правильно классифицируются по стадии ХБП. Измерения, попадающие в рамку с желтыми и зелеными сторонами, неправильно диагностируются для одной стадии ХБП. Измерения, попадающие в рамку с красными и желтыми сторонами, неправильно диагностируются для двух стадий ХБП. На фиг. 29А показана сетка ошибок рСКФ для той же группы субъектов, которая участвовала в вышеописанном анализе. В этом случае у 2 из 60 субъектов была неправильно диагностирована 2 стадия ХБП, у 16 субъектов была неправильно диагностирована 1 стадия; и для 41 субъекта был правильно поставлен диагноз. В таблице 5 приведены сводные данные об ошибках диагностики ХБП в процентах от общего количества измерений. На фиг. 29В и 29С представлены графики сетки ошибок для определения трансдермальной СКФ (тСКФ). Важно отметить, что сетка ошибок тСКФ показывает отсутствие ошибочных диагнозов для двух стадий ХБП. Кроме того, в случае тСКФ, нормализованной на Vd, наблюдается существенное снижение числа ошибочных диагнозов для стадии 1, по сравнению с рСКФ (см. таблицу 5).
Таблица 5
| Способ СКФ | % измерений для ошибок диагностики стадий ХБП | ||
| 0 | ± 1 | ± 2 | |
| рСКФ | 70% | 27% | 3% |
| тСКФ, норм. на ППТ | 71% | 29% | 0% |
| тСКФ, норм. на Vd | 84% | 16% | 0% |
Определение трансдермальной СКФ (аппроксимация по интервалам)
В приведенном выше примере для определения СКФ применялись полные доступные наборы данных (т.е. после введения индикаторного агента и уравновешивания, 10 часов затухания флуоресценции). Это подходит для пациентов со стабильной функцией почек, но для пациентов с острым поражением почек или с риском его возникновения требуется проведение более быстрой и в режиме реального времени повторной оценки динамики СКФ. Даже для пациентов со стабильной функцией почек ожидание определения СКФ в течение 12 часов может быть неудобным. В таблицах 6 и 7 приведены результаты изменения временного интервала измерения и временного ответа после однократной инъекции для одной и той же группы субъектов, как уже описано выше.
Временные интервалы измерения (столбец 1 в таблицах 6 и 7) в этом примере не перекрывались, поэтому число интервалов (столбец 2 в таблицах 6 и 7), умноженное на временные интервалы измерения, соответствует общему количеству часов после уравновешивания в течение которых проводилась оценка СКФ. Наилучшие результаты были получены, когда временной интервал измерения был достаточно длинным, так что интенсивность флуоресценции существенно снижалась. Время, необходимое для достижения той же степени затухания интенсивности флуоресценции, будет изменяться в зависимости от состояния почек. Поэтому смещение было зафиксировано равным нулю, за исключением самых широких временных интервалов измерения для субъектов со здоровыми почками. Стандартная ошибка калибровки суммируется для всех субъектов (столбец 5 в таблицах 6 и 7), а также для подгрупп субъектов с нСКФ ниже или выше 75 мл/мин.
В случае применения в качестве эталона сравнения СКФ, нормализованной на ППТ, (таблица 6), для субъектов с нСКФ выше 75 применяли временной интервал измерения равный, по меньшей мере, примерно 1,5 часам, чтобы достичь точности калибровки нСКФ ниже 15 мл/мин. Для субъектов с нСКФ ниже 75, применяли временной интервал измерения равный, по меньшей мере, примерно 3 часам, чтобы достичь точности калибровки нСКФ ниже 10 мл/мин. В случае применения в качестве эталона сравнения СКФ, нормализованной на Vd, (таблица 7), эквивалентная точность калибровки нСКФ достигалась, если временной интервал измерения был равен 0,5 часам и 2 часам, соответственно. Как видно из таблиц 6 и 7, целевые показатели точности калибровки, указанные выше, сохранялись на протяжении как минимум 2 непересекающихся временных интервалов измерения. Тем не менее, значительное увеличение SEC обычно наблюдалось, когда предварительные оценки распространялись на 3 или 4 временных интервала измерения. За счет увеличения (например, удвоения или утроения) временного интервала измерения по сравнению с временным интервалом измерения, который применялся для первых двух измерений СКФ, по меньшей мере, третье измерение СКФ проводилось с эквивалентной точностью. Эти результаты показывают полезность автоматической корректировки временного интервала измерения, не только для учета различий в SNR у разных пациентов, но и для учета уменьшения SNR с течением времени, поскольку индикаторный агент постепенно выводится почками.
Таблица 6.
| Интервал измерения (ч) | Номер интервала | Смещение (способ) | N | SEC (мл/мин/1,73 м2) | ||
| Все | нСКФ < 75 |
нСКФ ≥ 75 |
||||
| 0,5 | 1 | Фиксировано | 44 | 18,8 | 19,0 | 18,2 |
| 0,5 | 2 | Фиксировано | 44 | 20,8 | 21,0 | 20,2 |
| 0,5 | 3 | Фиксировано | 44 | 21,0 | 20,8 | 21,5 |
| 0,5 | 4 | Фиксировано | 44 | 23,4 | 20,9 | 27,5 |
| 1 | 1 | Фиксировано | 44 | 16,0 | 16,4 | 15,1 |
| 1 | 2 | Фиксировано | 44 | 17,3 | 16,0 | 19,6 |
| 1 | 3 | Фиксировано | 44 | 17,4 | 16,2 | 19,5 |
| 1 | 4 | Фиксировано | 44 | 19,5 | 16,1 | 24,8 |
| 1,5 | 1 | Фиксировано | 45 | 12,0 | 11,2 | 13,3 |
| 1,5 | 2 | Фиксировано | 45 | 12,9 | 11,8 | 14,7 |
| 1,5 | 3 | Фиксировано | 45 | 17,4 | 12,4 | 24,0 |
| 1,5 | 4 | Фиксировано | 45 | 23,7 | 12,6 | 35,9 |
| 1,5 | 5 | Фиксировано | 45 | 28,5 | 18,3 | 41,1 |
| 1,5 | 6 | Фиксировано | 45 | 41,0 | 20,4 | 63,0 |
| 2 | 1 | Фиксировано | 45 | 11,4 | 10,3 | 13,0 |
| 2 | 2 | Фиксировано | 45 | 13,7 | 11,6 | 16,8 |
| 2 | 3 | Фиксировано | 45 | 21,1 | 12,1 | 31,4 |
| 2 | 4 | Фиксировано | 45 | 28,2 | 19,2 | 39,7 |
| 3 | 1 | Фиксировано | 45 | 10,7 | 9,4 | 12,7 |
| 3 | 2 | Фиксировано | 45 | 19,2 | 9,9 | 29,2 |
| 3 | 3 | Фиксировано | 45 | 29,6 | 16,5 | 44,4 |
| 4 | 1 | Фиксировано | 45 | 10,6 | 9,3 | 12,5 |
| 4 | 2 | Фиксировано | 45 | 53,3 | 11,4 | 88,0 |
| 5 | 1 | Фиксировано | 45 | 10,6 | 8,4 | 13,6 |
| 5 | 2 | Фиксировано | 45 | 19,5 | 15,6 | 25,2 |
| 5 | 1 | Переменное | 45 | 24,9 | 28,2 | 17,3 |
| 5 | 1 | Гибридный | 45 | 13,9 | 11,6 | 17,3 |
| 5 | 2 | Гибридный | 45 | 20,2 | 14,6 | 27,6 |
| 10 | 1 | Фиксировано | 45 | 11,6 | 8,1 | 16,0 |
| 10 | 1 | Переменное | 45 | 15,4 | 14,9 | 16,3 |
| 10 | 1 | Гибридный | 45 | 11,1 | 6,8 | 16,3 |
Таблица 7.
| Длина интервала (ч) | Номер интервала | Смещение (способ) | N | SEC (мл/мин/1,476e4 мл) | ||
| Все | нСКФ < 75 |
нСКФ ≥ 75 |
||||
| 0,5 | 1 | Фиксировано | 44 | 17,4 | 19,5 | 11,5 |
| 0,5 | 2 | Фиксировано | 44 | 20,2 | 22,7 | 12,8 |
| 0,5 | 3 | Фиксировано | 44 | 20,4 | 21,9 | 16,8 |
| 0,5 | 4 | Фиксировано | 44 | 22,1 | 21,8 | 22,8 |
| 1 | 1 | Фиксировано | 44 | 14,9 | 16,7 | 10,3 |
| 1 | 2 | Фиксировано | 44 | 15,6 | 15,6 | 15,4 |
| 1 | 3 | Фиксировано | 44 | 16,8 | 15,8 | 18,8 |
| 1 | 4 | Фиксировано | 44 | 19,5 | 15,7 | 25,8 |
| 1,5 | 1 | Фиксировано | 45 | 10,4 | 11,5 | 8,0 |
| 1,5 | 2 | Фиксировано | 45 | 12,6 | 12,1 | 13,6 |
| 1,5 | 3 | Фиксировано | 45 | 17,2 | 12,6 | 24,0 |
| 1,5 | 4 | Фиксировано | 45 | 25,4 | 13,3 | 39,8 |
| 1,5 | 5 | Фиксировано | 45 | 29,7 | 18,8 | 44,1 |
| 1,5 | 6 | Фиксировано | 45 | 41,1 | 20,7 | 65,0 |
| 2 | 1 | Фиксировано | 45 | 8,9 | 9,6 | 7,5 |
| 2 | 2 | Фиксировано | 45 | 14,0 | 10,8 | 18,9 |
| 2 | 3 | Фиксировано | 45 | 22,3 | 12,5 | 34,3 |
| 2 | 4 | Фиксировано | 45 | 30,7 | 20,2 | 44,9 |
| 3 | 1 | Фиксировано | 45 | 8,9 | 8,8 | 9,1 |
| 3 | 2 | Фиксировано | 45 | 19,1 | 10,6 | 29,5 |
| 3 | 3 | Фиксировано | 45 | 32,3 | 17,9 | 50,0 |
| 4 | 1 | Фиксировано | 45 | 9,5 | 8,6 | 11,1 |
| 4 | 2 | Фиксировано | 45 | 53,4 | 12,4 | 90,9 |
| 5 | 1 | Фиксировано | 45 | 9,8 | 8,0 | 12,7 |
| 5 | 2 | Фиксировано | 45 | 20,8 | 16,7 | 27,3 |
| 5 | 1 | Переменное | 45 | 23,2 | 27,3 | 11,5 |
| 5 | 1 | Гибридный | 45 | 11,0 | 10,8 | 11,5 |
| 5 | 2 | Гибридный | 45 | 19,1 | 13,8 | 26,8 |
| 10 | 1 | Фиксировано | 45 | 12,4 | 9,0 | 17,3 |
| 10 | 1 | Переменное | 45 | 11,6 | 13,0 | 7,9 |
| 10 | 1 | Гибридный | 45 | 7,0 | 6,6 | 7,9 |
Измерение трансдермальной СКФ в режиме реального времени
Способы, раскрытые в данном документе, позволяют определять трансдермальную СКФ у пациентов в режиме реального времени. После внутрисосудистой инъекции индикаторного агента субъекту был период ожидания в два часа, чтобы обеспечить уравновешивание индикаторного агента во внесосудистом пространстве. Через два часа в течение еще одного часа записывали данные от индикаторного агента до проведения первой аппроксимации для RDTC. Первую аппроксимацию RDTC проводили, фиксируя смещение на нуле. Если RDTC была меньше 3,5 часов, аппроксимацию повторяли, изменяя наклон, в противных случаях сохраняли исходное значение RDTC (с фиксированным смещением). Предполагаемую ошибку RDTC затем делили на RDTC. Если полученная относительная ошибка была меньше 1,7%, RDTC преобразовывали в СКФ, нормализованную на ППТ, умножая величину, обратную RDTC на наклон, приведенный на фиг. 23; в противном случае пользователю не сообщалось значение СКФ. После первой аппроксимации RDTC процедуру аппроксимации повторяли с интервалами приблизительно в 3 секунды, при этом последующие аппроксимации включали все данные, которые были в первой аппроксимации, а также все данные, которые были получены далее (с интервалами времени около одной секунды). Тот же самый способ применяли к данным, полученным с помощью двух датчиков: один был расположен над рукояткой грудины, а второй – над большой грудной мышцей. Результаты, полученные в режиме реального времени в процессе измерения, приведены на фиг. 30. На протяжении всего исследования соответствие между тСКФ от двух датчиков, и изменением тСКФ от двух датчиков, находилось в пределах 2 мл/мин/1,73 м2.
Исследование стабильности MB–102
Образцы MB–102 получали и хранили при 25°C и относительной влажности 60% в течение 24 месяцев. ВЭЖХ–анализ каждого образца проводили в различные моменты времени для оценки стабильности образцов. Результаты приведены в таблице 8.
Таблица 8.
| Месяцы | Чистота |
| 0 | > 99% |
| 6 | > 99% |
| 12 | 98,9% |
| 18 | 98,3% |
| 24 | 97,8% |
При введении элементов настоящего раскрытия или его вариантов осуществления термин «указанный» означает, что имеется один или несколько элементов. Термины «содержащий», «включающий» и «имеющий» предназначены для включения элементов и означают, что могут быть дополнительные элементы, отличные от перечисленных элементов.
Хотя в описании приведен пример среды вычислительной системы, варианты осуществления изобретения работают с множеством других сред или конфигураций вычислительной системы общего или специального назначения. Среда вычислительной системы не предназначена для какого–либо ограничения объема применения или функциональности любого аспекта изобретения.
Варианты осуществления изобретения могут быть описаны в общем контексте исполняемых компьютером инструкций, таких как программные модули, исполняемые одним или несколькими компьютерами или другими устройствами. Исполняемые компьютером инструкции могут быть организованы в один или несколько исполняемых компьютером компонентов или модулей. Как правило, программные модули включают, но не ограничиваясь этим, подпрограммы, программы, объекты, компоненты и структуры данных, которые выполняют конкретные задачи или реализуют конкретные абстрактные типы данных. Аспекты изобретения могут быть реализованы с любым количеством и любой организацией таких компонентов или модулей. Например, аспекты изобретения не ограничиваются конкретными исполняемыми компьютером инструкциями или конкретными компонентами или модулями, приведенными на чертежах и описанными в данном документе. Другие варианты осуществления изобретения могут включать различные исполняемые компьютером инструкции или компоненты, имеющие больше или меньше функциональных возможностей, чем проиллюстрировано или описано в данном документе. Аспекты изобретения могут также применяться на практике в распределенных вычислительных средах, где задачи выполняются удаленными устройствами обработки, которые связаны друг с другом через сети передачи данных. В распределенной вычислительной среде программные модули могут быть расположены как на локальных, так и на удаленных компьютерных носителях данных, включая запоминающие устройства.
Ввиду вышесказанного понятно, что некоторые преимущества раскрытия достигнуты, а также достигнуты и другие полезные результаты. Поскольку в вышеупомянутые способы и композиции могут быть внесены различные изменения, не выходя за рамки объема раскрытия, подразумевается, что все содержание приведенного выше описания и прилагаемых чертежей, имеет иллюстративный и не ограничивающий характер.
1. Система для определения в режиме реального времени скорости клубочковой фильтрации почек (СКФ) у пациента, нуждающегося в этом, указанная система включает:
вычислительное устройство,
устройство отображения, коммуникативно соединенное с указанным вычислительным устройством,
источник питания, функционально соединенный с указанным вычислительным устройством,
по меньшей мере одна головка датчика, функционально соединенная с кожей пациента и функционально соединенная с указанным вычислительным устройством, и
по меньшей мере один индикаторный агент, выполненный с возможностью испускать флуоресценцию при воздействии видимого или ультрафиолетового света;
где указанное вычислительное устройство выполнено с возможностью
управлять и контролировать работу указанной по меньшей мере одной головки датчика,
записывать по меньшей мере одно измерение, полученное с помощью указанной по меньшей мере одной головки датчика, и
вычислять СКФ у указанного пациента на основе указанного по меньшей мере одного измерения;
где указанная по меньшей мере одна головка датчика содержит по меньшей мере один источник видимого или ультрафиолетового света и выполнена с возможностью
генерировать и доставлять видимый или ультрафиолетовый свет,
детектировать и измерять флуоресценцию, испускаемую указанным индикаторным агентом, и
передавать указанное измерение от указанного индикаторного агента указанному вычислительному устройству;
и
где указанный индикаторный агент выполнен с возможностью
введения указанному пациенту и
испускания флуоресценции, которая может быть детектирована указанной по меньшей мере одной головкой датчика при воздействии видимого или ультрафиолетового света; где вычислительное устройство определяет СКФ у указанного пациента, коррелируя уменьшение света, испускаемого указанным индикаторным агентом в течение временного интервала измерения, с СКФ указанного пациента, и рассчитывая константу скорости или константу времени в течение временного интервала измерения;
где временной интервал измерения равен по меньшей мере 0,5 часа; и
где указанный индикаторный агент представляет собой
или его фармацевтически приемлемую соль.
2. Система по п. 1, в которой источники видимого или ультрафиолетового света и/или усиления детектированной флуоресценции настраиваются таким образом, чтобы учитывать вариации в содержании меланина в коже у разных пациентов или других оптических свойств ткани.
3. Система по п. 1, в которой индикаторный агент элиминируется посредством только клубочковой фильтрации в почках указанного пациента.
4. Система по п. 1, в которой константа скорости или константа времени напрямую связана с СКФ, нормализованной на размер тела пациента.
5. Система по п. 4, в которой показателем размера тела является площадь поверхности тела.
6. Система по п. 4, в которой показателем размера тела является объем распределения индикаторного агента.
7. Система по п. 1, в которой по меньшей мере два определения константы скорости производятся после однократной инъекции индикаторного агента, при этом мониторинг СКФ осуществляется в режиме реального времени.
8. Система по п. 1, в которой указанная константа скорости или константа времени применяется для расчета СКФ указанного пациента.
9. Система по п. 1, в которой временной интервал измерения, применяемый для вычисления константы скорости, определяется в соответствии с показателем качества, который вычисляется по данным флуоресценции, где показатель качества основан на оценках отношения сигнал флуоресценции/шум (SNR), отношения сигнал/фон (SBR), показателей хорошего совпадения, коэффициента корреляции или любой их комбинации.
10. Система по п. 4, в которой константа скорости определяется путем аппроксимации экспоненциальной функцией флуоресценции как функции времени или линейной функции к логарифму флуоресценции как функции времени.
11. Система по п. 10, в которой до проведения аппроксимации из данных флуоресценции вычитают базовый сигнал, измеренный до инъекции индикаторного агента.
12. Система по п. 11, в которой до проведения аппроксимации к данным флуоресценции применяют фильтр.
13. Система для трансдермального определения СКФ, нормализованной на размер тела у пациента, указанная система включает:
вычислительное устройство,
устройство отображения, коммуникативно соединенное с указанным вычислительным устройством,
источник питания, функционально соединенный с указанным вычислительным устройством, для поддержания электрической изоляции системы от внешних источников питания,
по меньшей мере одна головка датчика, функционально соединенная с указанным вычислительным устройством, и
по меньшей мере один индикаторный агент, выполненный с возможностью испускать флуоресценцию при воздействии видимого или ультрафиолетового света;
где указанная по меньшей мере одна головка датчика содержит по меньшей мере один источник видимого или ультрафиолетового света и выполнена с возможностью
генерировать и доставлять видимый или ультрафиолетовый свет,
детектировать и измерять флуоресценцию, испускаемую указанным индикаторным агентом, и
передавать указанное измерение от указанного индикаторного агента указанному вычислительному устройству;
где указанный индикаторный агент выполнен с возможностью
введения указанному пациенту и
испускания флуоресценции, которая может быть детектирована указанной по меньшей мере одной головкой датчика при воздействии видимого или ультрафиолетового света;
где указанное вычислительное устройство выполнено с возможностью
управлять и контролировать работу указанной по меньшей мере одной головки датчика,
записывать по меньшей мере одно измерение, полученное с помощью указанной по меньшей мере одной головки датчика,
определять константу скорости или константу времени по данным измерения флуоресценции в течение временного интервала измерения,
определять показатель качества, связанный с флуоресценцией, измеренной в течение временного интервала измерения, где показатель качества основан на оценках отношения сигнал флуоресценции/шум (SNR), отношения сигнал/фон (SBR), показателей хорошего совпадения, коэффициента корреляции или любой их комбинации,
применять показатель качества, чтобы оценить определение константы скорости или константы времени, и необязательно увеличивать временной интервал измерения,
преобразовывать константу скорости или константу времени в скорректированное по размеру тела нормализованное измерение СКФ и выводить результат на устройстве отображения;
где временной интервал измерения равен по меньшей мере 0,5 часа; и
где указанный индикаторный агент представляет собой
или его фармацевтически приемлемую соль.
