Устройство связывания антитело-смола и способы
Изобретение относится к устройствам активации смол и связывания антител со смолой. Устройство для связывания антител со смолой включает в себя: емкость для перемешивания, разделенную на верхний участок и нижний участок сетчатым экраном, растянутым поперек емкости, при этом верхний участок имеет впускное отверстие, а нижний участок выпускное отверстие, а сетчатый экран имеет размер пор от приблизительно 5 мкм до приблизительно 80 мкм; мешалку, расположенную внутри верхнего участка; и дисперсионное устройство, включающее в себя удлиненную трубчатую структуру, образующую просвет, причем трубчатая структура содержит проксимальный участок, продолжающийся вертикально снаружи смесительной емкости с впускным отверстием, которое открывается вверх; дистальный участок, расположенный горизонтально внутри верхнего участка над мешалкой и содержащий закрытый конец, и множество обращенных вниз отверстий; и колено, соединяющее дистальный участок и проксимальный участок. Устройство для связывания антитело-смола быстро и эффективно активирует гранулы смолы и связывает их с антителами, предотвращая разрушение и сшивание гранул, тем самым улучшая процессы очистки колонны ниже по потоку, продлевая срок службы гранул смолы и увеличивая эффективность захвата молекул, полученных соединений смола-антитело, чтобы обеспечить улучшенное выделение и очистку молекул фактора VIII или других лекарственных соединений. 2 н. и 34 з.п. ф-лы, 4 ил.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка испрашивает преимущество и приоритет заявки США № 62/541,601, поданной 4 августа 2017 г., содержание которой включено в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее раскрытие относится к устройствам и способам активации смол и связывания антител со смолой.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Гемофилия является наследственным нарушением свертываемости крови, которое препятствует нормальному свертыванию крови и характеризуется кровоизлияниями, которые могут возникать спонтанно или после незначительной травмы. Это часто связано с дефицитом необходимого свертывающего кровь белка, фактора VIII, также известного как антигемофильный фактор (AHF). У людей, фактор VIII кодируется геном F8. Дефекты в этом гене приводят к гемофилии А («классической» гемофилии), рецессивному Х-сцепленному нарушению свертывания крови, которое приводит к увеличению времени свертывания плазмы. Другим типом гемофилии является приобретенная гемофилия A (AHA), которая встречается у пациентов, которые имеют нормальные гены F8, но вырабатывают аутоантитела, которые ингибируют фактор VIII, создавая функциональный дефицит, который препятствует коагуляции.
Предоставление внутривенного фактора VIII пациентам с гемофилией может временно улучшить свертываемость крови. Многие средства лечения гемофилии, такие как средства лечения гемофилии, продаваемые под торговыми марками RECOMBINATE, ADVATE, ADYNOVATE, HEMOFIL и OBIZUR, доступные от Shire Plc (Lexington, MA), включают рекомбинантные белки фактора VIII, синтезированные и очищенные в лаборатории.
Однако основным ограничивающим фактором при производстве таких обработок является способность выделять и очищать молекулы фактора VIII. Одним из способов является использование антител фактора VIII для захвата молекул в колонне. Антитела связывают со смолой и загружают в колонну, и через нее пропускают среду, содержащую экспрессированные молекулы фактора VIII.
Этот процесс очистки требует высокой точности для правильного манипулирования смолой. Это может быть чрезвычайно дорогостоящим, потому что смола является дорогой и может быть легко повреждена или потрачена впустую, если неправильно обработана. Когда смола недостаточно связана с антителами, между гранулами смолы может происходить сшивание. Также гранулы могут разрушаться, если со смолой не обращаться осторожно. Разрушенные или сшитые гранулы смолы могут засорить колонну, создавая избыточное противодавление и вызывая сбой процесса экстракции. Соответственно, трудности с процедурами обращения со смолой и ограничения технологии связывания смола-антитело делают процесс производства лекарств от гемофилии дорогим и сложным.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Устройство, описанное в настоящем документе, эффективно активирует гранулы смолы и связывает их с антителами, предотвращая при этом разрушение и сшивание гранул, тем самым, улучшая процессы очистки колонны ниже по потоку, продлевая срок службы гранул смолы и увеличивая эффективность захвата молекул полученных комплексных соединений смола-антитело, позволяя улучшить выделение и очистку широкого спектра биологических соединений, включая молекулы фактора VIII.
Хотя устройство, в целом, описано в настоящем документе со ссылкой на его использование для очистки FVIII, следует понимать, что устройство и связанные с ним способы полезны для связывания антител всех типов с пористыми смолами. Изобретения по настоящему изобретению могут быть применены к другим сходным смолам, в частности, для других продуктов фермент-заместительной терапии или любого другого лекарственного средства или биомолекулы, представляющих интерес. Это применимо к химическому сшиванию между белковыми или аминсодержащими лигандами и полимерной подложкой. Смола может быть агарозой, стеклом или другими известными пористыми смолами различной плотности. Используемые антитела могут быть либо поликлональными, либо моноклональными. Хотя устройство в первую очередь описано здесь как полезное для связывания антител со смолой, но изобретение совместимо с любой химией, в которой гидроксильные группы связаны с аминогруппами. Следует понимать, что изобретение полезно для любого известного антитела, которое может быть использовано для очистки аффинной хроматографии любого биологического соединения, включая пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы и любой лиганд с аминогруппами.
Устройство, в целом, представляет собой смесительное устройство, которое включает емкость с впускными отверстиями для введения гранул смолы и различных текучих сред, дисперсионную трубку для точного применения активационного раствора, сетчатый экран для поддержки гранул смолы и протекания текучих сред через него, мешалку для перемешивание гранул по мере протекания текучих сред через нее, и выпускных отверстий под экраном для слива текучих сред. Компоненты устройства могут быть изготовлены из нержавеющей стали или другого надежного материала. При работе, гранулы смолы в буферной смеси заливаются в емкость перед активацией дисперсией CNBr (бромистым цианом) и ацетонитрилом через дисперсионную трубку. Гранулы перемешиваются использованием мешалки в течение короткого периода времени (приблизительно 3 минуты или менее), прежде чем текучая среда будет сливаться через выпускное отверстие. Гранулы могут быть промыты водой или другими буферными смесями перед добавлением раствора для связывания и моноклональных антител. Гранулы и антитела инкубируются с перемешиванием в течение установленного периода времени, пока устройство поддерживает низкую температуру и контролирует рН раствора. Связанная с антителами смола захватывается на экране и удаляется из устройства для использования. Устройство может использоваться для различных типов смол и антител. Система позволяет быстро и равномерно активировать большие объемы смолы, не разрушая гранулы смолы и избегая поперечной сшивки между гранулами. Это обеспечивает более эффективное связывание смола-антитело, в то же время, контролируя химический состав для продления срока службы гранул смолы.
Ключевым аспектом устройства является дисперсионная трубка, которая оптимизирована для дисперсии активационного раствора CNBr в смолу. Это позволяет равномерно распределять CNBr в течение контролируемого периода времени и помогает быстро добавлять активационный раствор, предпочтительно, менее чем за 3 минуты. Эти факторы являются важными для гомогенного связывания антител и смолы, потому что они уменьшают вариации в добавлении раствора к смеси смола/буферная смесь, которые могут временно превышать способность буферизации буферной смеси. Такая изменчивость может привести к нежелательному поперечному сшиванию изо-мочевины, которое будет гидролизовать и увеличивать выщелачивание антител или потенциально обмениваться с другими нуклеофилами для загрязнения смолы или вызывать усиленное выщелачивание. Контроль времени активационного раствора помогает в последующем управлении процессом связывания антител, поскольку он позволяет оптимально активировать смолу с последующим быстрым добавлением антитела до потери значительного количества активированных групп на смоле.
В определенных аспектах, раскрытие относится к устройству для связывания антител со смолой. Устройство включает емкость для перемешивания, разделенную на верхний участок и нижний участок сетчатым экраном, растянутым поперек емкости, при этом верхний участок имеет, по меньшей мере, одно впускное отверстие, а нижний участок имеет, по меньшей мере, одно выпускное отверстие, а сетчатый экран имеет размер пор от 5 до 80 мкм. Устройство дополнительно включает мешалку, расположенную в верхнем участке, и дисперсионное устройство над мешалкой. Дисперсионное устройство включает удлиненную трубчатую структуру, образующую просвет. Трубчатая структура имеет проксимальный участок, продолжающийся вертикально снаружи смесительной емкости с впускным отверстием, которое открывается вверх, дистальный участок с закрытым концом и множеством обращенных вниз отверстий, расположенных горизонтально внутри верхнего участка, и колено, соединяющее дистальный участок и проксимальный участок.
Мешалка может включать в себя ротор и вращающуюся крыльчатку, содержащую ступицу и, по меньшей мере, две лопатки, продолжающиеся в противоположных направлениях перпендикулярно от ступицы. Каждая лопатка имеет ось, приблизительно поперечную оси ротора, на которой ступица выполнена с возможностью вращения. Мешалка выполнена с возможностью вращения, чтобы придавать усилие текучей среде в емкости для обеспечения подъема и удержания гранул, движущихся через экран. Экран также может иметь опорную балку, выполненную с возможностью поддержки экрана и предотвращения прогибания экрана. Экран может быть выполнен с возможностью извлечения из емкости.
Мешалка вращается со скоростью, достаточной для быстрого перемешивания гранул смолы без их разрушения. Скорость вращения мешалки может составлять примерно от 10 до 50 об/мин, и в конкретных вариантах осуществления скорость составляет 20 или 35 об/мин. В вариантах осуществления лопатки имеют фиксированный наклон и закругленные края.
В связанных аспектах, раскрытие относится к аппарату дисперсионной трубки, который включает удлиненную трубчатую структуру, образующую просвет с круглым сечением. Трубчатая структура включает проксимальный участок с обращенным вверх впускным отверстием, дистальный участок с закрытым концом и от 4 до 100, предпочтительно от 8 до 30 обращенных вниз отверстий, расположенных в два или более рядов, параллельных оси дистального участка. Ряды расположены на расстоянии приблизительно 15 и приблизительно 60 градусов друг от друга на дистальном участке. Трубчатая структура также включает в себя колено между дистальным участком и проксимальным участком, которое содержит изгиб трубчатой структуры, чтобы ориентировать впускное отверстие таким образом, чтобы оно открывалось в направлении, которое является, по существу, перпендикулярным оси дистального участка.
В некоторых вариантах осуществления, дистальный участок дисперсионного устройства имеет три параллельных ряда обращенных вниз отверстий. В некоторых вариантах осуществления, имеется от 12 до 25 обращенных вниз отверстий, а в предпочтительном варианте осуществления имеется 21 отверстие с рядами из 10, 8 и 3 отверстий. В некоторых вариантах осуществления, ряды имеют различное количество отверстий, а в других они имеют одинаковое количество отверстий. Ряды отверстий могут быть расположены на расстоянии около 15 и около 105 градусов друг от друга. Изгиб в коленном участке ориентирует дистальный участок и проксимальный участок на 60-120 градусов относительно друг друга, а в некоторых вариантах осуществления около 80-100 градусов, а в предпочтительном варианте осуществления около 90 градусов. Трубчатая структура может быть изготовлена из нержавеющей стали. Дисперсионное устройство может также включать клапан для открытия и закрытия впускного отверстия и воронку, соединяемую с впускным отверстием, для удерживания дисперсионной текучей среды перед использованием.
В связанном аспекте, раскрытие относится к способам активации смолы. Способ включает введение гранул смолы, взвешенных в воде, в смесительную емкость, причем смесительная емкость включает дисперсионное устройство, сетчатый экран с отверстиями, меньшими, чем гранулы смолы, и мешалку, расположенную над сетчатым экраном. Гранулы смолы могут содержать агарозу, такую как гранулы CL-4B или CL-2B, или гранулы агарозы, продаваемые под торговой маркой CAPTO компанией GE Healthcare Life Sciences (Marlborough, MA). Способ дополнительно включает диспергирование активационного раствора, содержащего CNBr и ацетонитрил, на гранулы смолы через дисперсионное устройство, и перемешивание мешалки в течение менее 5 минут. Затем способ включает слив активационного раствора через сетчатый экран, в результате чего гранулы из активированной смолы поддерживаются на экране.
В некоторых вариантах осуществления, способ также включает промывание гранул активированной смолы текучей средой. Промывка может включать заполнение емкости для перемешивания текучей средой, выдерживание при перемешивании мешалки, и слив текучей среды из емкости для перемешивания. Текучая среда может представлять собой буферную смесь, воду или раствор, содержащий бикарбонат натрия и хлорид натрия. Перемешивание может происходить от 10 до 40 об/мин, предпочтительно, около 20 или 35 об/мин. Выдерживание с перемешиванием может длиться менее 4 минут и, предпочтительно, менее 3 минут.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигуры 1А-С показывают виды смесительной емкости.
Фиг.1А показывает вид сбоку в разрезе;
Фиг.1В показывает вид сверху в разрезе;
Фиг.1С показывает вид спереди в разрезе.
Фигуры 2А-G показывают дисперсионную трубку и предпочтительное расположение отверстий на дисперсионной трубке.
Фиг.2А показывает вид сбоку дисперсионной трубки;
Фиг.2В показывает вид сбоку дисперсионной трубки с конкретной конфигурацией отверстий;
Фиг.2С показывает радиальное сечение дисперсионной трубки, показывающее угол, под которым просверлены отверстия;
Фиг.2D показывает вид сбоку дисперсионной трубки с расположением ряда из 8 отверстий;
Фиг.2Е показывает радиальное сечение дисперсионной трубки, показывающее угол, под которым отверстия по фиг.2D просверлены;
Фиг.2F показывает вид сбоку дисперсионной трубки с расположением ряда из 10 отверстий;
Фиг.2G показывает радиальное сечение дисперсионной трубки, показывающее угол, под которым отверстия по фиг.2F просверлены.
Фиг.3 показывает съемную удерживающую емкость или воронку для активационного раствора, и клапан, соединяющий воронку с дисперсионной трубкой.
Фигуры 4А-С показывают виды мешалки.
Фиг.4А представляет собой вид сбоку в разрезе мешалки;
Фиг.4В представляет собой вид в перспективе вверх дном мешалки и лопаток;
Фиг.4С представляет собой крупный план ступицы и лопатки по фиг.4В.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Устройства для выделения и очистки молекул из питательных сред являются неотъемлемой частью производства лекарств. Многие лекарства включают рекомбинантные белки, которые выращиваются в культуре и должны быть, затем очищены и извлечены из среды. Очистка этих соединений требует точного контроля реагентов и материалов, а также специального оборудования. Из-за сложности подготовки и использования этих материалов, необходимы устройства для создания матриц очистки для извлечения лекарств более эффективным, точным и экономически эффективным способом. Такие устройства улучшают доступность рекомбинантных белков, которые необходимы для лечения различных заболеваний.
Многие лекарства включают рекомбинантные белки, которые доставляют желаемый биохимический ответ при введении пациенту. Например, лекарства от гемофилии, такие как RECOMBINATE™ и ADVATE®, представляют собой внутривенно инъецируемые молекулы фактора VIII, которые улучшают свертывание крови у пациентов с гемофилией для контроля и предотвращения эпизодов кровотечения. Лечение этими препаратами нормализует время свертывания в течение эффективного периода дозирования, увеличивая уровни фактора VIII в плазме для временной коррекции дефекта коагуляции у этих пациентов. Заместительные препараты фактора VIII можно использовать для рутинной профилактики и уменьшения кровотечений, или их можно вводить до, во время и после операции для управления свертываемостью крови. Целью такого лечения является поддержание уровня активности фактора VIII в плазме на желаемом уровне или выше. Например, для небольших эпизодов кровотечения, таких как ранний гемартроз, легкое мышечное кровотечение или эпизоды легкого орального кровотечения, может быть желательно, вводить дозу для достижения примерно 20-40% от нормального уровня фактора VIII. Для умеренного кровотечения, такого как мышечное кровотечение, кровотечение в ротовой полости, определенный гемартроз и известная травма, может потребоваться 30-60% нормальной активности фактора VIII. Для лечения основных кровотечений, таких как значительное желудочно-кишечное кровотечение, внутричерепное, внутрибрюшное или внутригрудное кровотечение, кровотечение из центральной нервной системы, кровотечение в заглоточном или забрюшинном пространствах или в подвздошной оболочке, переломы или травмы головы, уровень фактора VIII 60-100% может быть обязательным.
RECOMBINATE™, ADVATE®, ADYNOVATE®, HEMOFIL® и OBIZUR® являются примерами молекул рекомбинантного фактора VIII, которые могут быть использованы для временной замены отсутствующего фактора VIII пациента для достижения гемостаза. ADVATE®, например, представляет собой очищенный гликопротеин, состоящий из 2,332 аминокислот, синтезированных генно-инженерной линией клеток яичника китайского хомячка. ADYNOVATE® представляет собой очищенную молекулу ADVATE®, которая ковалентно конъюгирована с одной или несколькими молекулами полиэтиленгликоля, которая уменьшает связывание с рецептором клиренса (LRP1) физиологического фактора VIII и обладает увеличенным конечным периодом полураспада. OBIZUR® является рекомбинантным аналогом свиного фактора VIII. B-домен, присутствующий во встречающемся в природе факторе VIII свиньи, заменен линкером из двадцати четырех аминокислот. После активации, полученный препарат обладает сравнимой активностью с эндогенным человеческим фактором VIII.
Для производства этих лекарств и других лекарств, которые включают рекомбинантные белки, молекулы должны быть очищены от питательных сред. Как правило, рекомбинантные клеточные линии экспрессируют белок фактора VIII и выделяют его в среду для культивирования клеток. Затем молекула очищается от среды культивирования. Процесс очистки может включать введение среды в одну или несколько иммуноаффинных хроматографических колонок, в которых матрица очистки, полученная путем иммобилизации моноклонального антитела к смоле, избирательно изолирует фактор VIII. Способ также может включать один или несколько этапов фильтрации. HEMOFIL®, например, представляет собой белок фактора VIII, выделенный из объединенной плазмы человека посредством иммуноаффинной хроматографии с использованием мышиного моноклонального антитела к фактору VIII с последующей стадией ионообменной хроматографии для дальнейшей очистки.
Моноклональные антитела особенно полезны для захвата фактора VIII и других молекул-мишеней. Матрица очистки, которая избирательно очищает молекулу-мишень, создается путем связывания антител со смолой. Подготовка смолы и связывание антител затруднены, потому что небольшие изменения в химическом составе влияют на процесс связывания и полученную матрицу очистки. Устройства, раскрытые в данном документе, обеспечивают улучшенное связывание антител с гранулами смолы. Химия процесса связывания смолы контролируется для получения комплексного соединения антитело-смола с большей эффективностью и долговечностью. При правильном изготовлении и обработке смола может прослужить несколько лет и многократно использоваться повторно, прежде чем ее нужно будет заменить. Поскольку гранулы смолы могут стоить десятки тысяч долларов за литр, для изготовителей важно иметь надежный процесс производства долговечных комплексных соединений антитело-смола без ненужного расходования количества смолы.
Как указано выше, небольшие аберрации в химии могут снизить функцию продукта смолы. Смола должна быть приготовлена быстро и точно для получения однородного продукта в больших масштабах. Раскрытые устройства обеспечивают быструю гомогенную реакцию, которая повторяется и дает стандартизированный продукт. Без таких устройств, полученный продукт смолы будет иметь микрогетерогенности, которые создают проблемы выщелачивания в смоле. Если смола не является гомогенно активированной, гранулы могут сшиваться друг с другом, создавая комки в смоле. Скопление и гетерогенность смолы приводит к проблемам наполнения в последующих протоколах очистки. Например, смола, которая группируется вместе, может быть менее проницаемой для проходящих через нее текучих сред и вызывать повышение давления в колонне. Гетерогенная смола может привести к неэффективному захвату молекулы-мишени или просто может быть непригодной для использования и должна быть выброшена.
Раскрытые устройства также предотвращают чрезмерное разрушение гранул на этапах обработки. Если разрушено более чем около 2 процентов гранул, результирующая смола будет слишком плотной и будет чрезмерно сжиматься при загрузке в колонну. Таким образом, разрушенные гранулы вызывают обратное давление в колонне. Если во время изготовления слишком много смолы будет разрушено, часть или всю смолу придется выбросить, что приведет к чрезмерным отходам и затратам. Устройства, раскрытые здесь, позволяют избежать этой и других проблем. Устройства оптимизируют подготовку смолы для обеспечения надлежащего наполнения смолы в колонне ниже по потоку.
В дополнение к улучшенной динамике текучей среды в колонне, существуют дополнительные преимущества для связывания смолы с использованием раскрытого устройства. Устройство обеспечивает большую воспроизводимость смолы, чем устройства известного уровня техники. Получающаяся смола является более однородной с точки зрения плотности лиганда, сшивания гранулы и целостности гранулы. Это обеспечивает большую стабильность, уменьшение вариаций в производственном процессе и большую производительность. В результате получается продукт с более продолжительным сроком годности, который может быть использован для большего числа производственных циклов без выщелачивания антитело/лиганд и потери способности к связыванию. Это снижает стоимость производства фермента или другого биологического препарата.
Устройства могут быть использованы для многих типов химического связывания. Для антител, связывание часто основано на аминах. Антитела могут иметь 20-30 аминогрупп и еще 20-30 карбоксильных групп. Описанная здесь технология связывания может быть использована для связывания любого антитела или даже молекулы меньшего размера. В некоторых вариантах осуществления, моноклональные антитела связываются, а в других вариантах осуществления поликлональные антитела связываются со смолой. Эта технология также может быть использована для связывания пептидов. В любом случае, целью технологии является достижение гомогенного связывания молекулы (антитела, пептида или другого вещества) с гранулами смолы. Гомогенное связывание молекул со смолой дает в результате продукт с предсказуемыми характеристиками выщелачивания и более длительным использованием.
Устройство связывания, показанное на прилагаемых фигурах, быстро и эффективно активирует смолу и связывает антитела для уменьшения отходов, повышения эффективности связывания и восстановление лекарственного средства. Как описано выше, устройство, в целом, включает в себя смесительную емкость, дисперсионную трубку, мешалку и экран.
Фигуры 1А-1С показывают устройство 100 связывания. Фиг.1А показывает вид сбоку в разрезе; Фиг.1В показывает вид сверху в разрезе; и Фиг.1С показывает вид спереди в разрезе. Устройство 100 включает смесительную емкость 110, в которой находятся другие элементы, описанные ниже, и служит в качестве емкости для перемешивания на различных этапах перемешивания. Емкость 110 имеет множество впускных отверстий 120 и выпускных отверстий 130. В верхней части емкости 110 имеется шарнирный люк 150, через который могут вводиться гранулы смолы. Гранулы смолы могут представлять собой гранулы агарозы, такие как гранулы CAPTO™, CL-4B или CL-2B, доступные от GE Healthcare Life Sciences (Marlborough, MA), и обычно вводятся в емкость 110 в водной суспензии. В емкости 110 могут быть одновременно активированы до 50 литров гранул смолы, а обычно около 22-39 литров. Находясь внутри емкости 110, гранулы поддерживаются экраном 310, который изготовлен из сетчатого материала с отверстиями приблизительно 10-80 мкм, которые являются достаточно малыми, чтобы предотвратить попадание гранул смолы в нижний участок емкости 110. В предпочтительном варианте осуществления, отверстия составляют около 30 мкм. Во время процесса активации и связывания, гранулы перемешиваются мешалкой 410 (показанной на фигурах 4A-C), которая предотвращает оседание гранул на экране и помогает поддерживать однородность.
Емкость содержит дисперсионную трубку 210, которая более подробно описана на фигурах 2A-G, через которую к гранулам добавляется активационный раствор из CNBr и ацетонитрила. Дисперсионная трубка 210 предназначена для равномерного распределения активационного раствора по гранулам, в то время как мешалка 410 удерживает их в движении для предотвращения комкования смолы. Как описано ниже, мешалка 410 вращается со скоростью, достаточной для подъема гранул и поддержания их движения, но достаточно мягкой, чтобы предотвратить разрушение гранул. После активации, активационный раствор может быть слит через сливную трубу 130, оставив активированные гранулы на экране 310.
Различные текучие среды и буферные смеси могут быть введены в емкость 110 через дисперсионную трубку 210, впускное отверстие 120 или люк 150, по желанию. Различные растворы требуются для процесса активации, процесса промывки и процесса связывания. Пример процесса связывания смолы начинается с заливки смолы в емкость 110 через люк 150. Смола включает гранулы смолы в водной суспензии. Активационный раствор CNBr и ацетонитрила диспергируется на смолу через дисперсионную трубку 210, в то время как мешалка 410 перемешивает смолу, удерживая гранулы, движущиеся поверх экрана 310. Небольшое количество ацетонитрила может быть использовано для того, чтобы прогонять активационный раствор в дисперсионной трубке. Гранулы могут быть промыты активационным раствором до 5 минут для активации смолы. Предпочтительно, активация происходит менее чем за 3 минуты. Могут быть добавлены различные буферные смеси и растворы для связывания вместе с антителами, суспендированными в растворе для связывания, чтобы связать их с гранулами. На всех этапах промывки и связывания, как и во время активации, мешалка вращается, чтобы поддерживать постоянное движение гранул, предотвращая их прилипание к экрану, и равномерно распределяя различные текучие среды и буферные смеси, и обеспечивая контакт со всеми поверхностями гранул. Этапы промывки и другие этапы перемешивания могут быть непрерывными, при этом текучая среда непрерывно течет во впускные и выпускные отверстия, или емкость может быть заполнена, и перемешивание может происходить в течение установленного периода времени, от нескольких секунд до минут или даже многих часов. Емкость 110 также содержит регуляторы температуры, чтобы содержимое могло быть инкубировано при желаемой температуре во время перемешивания. Устройство 100 также может включать в себя один или несколько датчиков 190, таких как датчик температуры и/или датчик pH, для контроля условий внутри емкости во время работы.
Экран 310 выполнен с возможностью извлечения и удерживается на месте рядом зажимов 330. Емкость 110 также включает цапфы 175, так что устройство может быть установлено на оси вращения. Это позволяет наклонять устройство, чтобы пользователь мог заполнить емкость или вылить из него жидкости по мере необходимости. Функция наклона позволяет выливать обработанную смолу из люка, а не вычерпывать ее вручную, что предотвращает дополнительную нагрузку на гранулы и экран. Цапфы 175 могут быть зафиксированы во время использования, чтобы они оставались неподвижными во время перемешивания. Важно, чтобы экран 310 и мешалка 410 оставались, по существу, горизонтальными во время перемешивания, чтобы достичь правильного движения гранул в емкости и обеспечить равномерное воздействие гранул на различные смеси текучих сред.
Фигуры 2А-G показывают дисперсионную трубку 210. Как показано на фиг.2А, дисперсионная трубка 210, в целом, представляет собой полую трубку с длинным горизонтальным участком 230, вертикальным участком 220 и коленом 240. Горизонтальный участок 230, в целом, представляет собой отрезок металлической трубки, прерывающийся отверстиями с регулярными или полу регулярными интервалами. Отрезок горизонтального участка 230 проходит через емкость. В показанном варианте осуществления, дисперсионная трубка 210 имеет множество отверстий 231, положения которых отмечены (на фигурах 2B, 2D и 2F) их расстоянием по длине трубки 210. Отверстия 231 позволяют протекать через них активационной смеси CNBr. Вместе они обеспечивают воспроизводимое гомогенное распределение активационной смеси на смоле ниже. Дисперсионная трубка 210, особенно в сочетании с мешалкой 410, предотвращает несогласованность в распределении CNBr и предотвращает локализованные всплески рН, которые могут привести к неправильному химическому связыванию и увеличению выщелачивания лиганда.
Вертикальный участок 220 дисперсионной трубки 210 выполнен с возможностью продолжения из емкости 110, тогда как горизонтальный участок 230 расположен внутри емкости 110 над мешалкой 410 и экраном 310. Вертикальный участок 220 включает впускное отверстие 225, через которое CNBr может протекать и вводиться в смесительную емкость 110. Горизонтальный участок 230 имеет закрытый конец 235 и множество отверстий 231. Хотя одно возможное расположение отверстий показано на фигурах 2B-G, также рассматриваются другие подобные расположения отверстий. Отверстия должны быть распределены вдоль горизонтального участка дисперсионной трубки для достижения достаточного покрытия смолы, которая перемешивается ниже.
Фигуры 2B-C показывают местоположения трех отверстий, просверленных вдоль нижнего края горизонтального участка 230. Фиг.2А показывает радиальное сечение дисперсионной трубки. Как изображено, отверстия расположены на расстоянии 11,75 дюйма, 15,75 дюйма и 26,50 дюйма, измеренных от оси 229 вертикального участка 220. Фиг.2С показывает поперечное сечение горизонтального участка. Как показано на фиг.2С, отверстия просверлены через нижнюю точку в горизонтальном участке.
Фигуры 2D-E показывают местоположения восьми отверстий, просверленных под углом 45 градусов от нижнего края горизонтального участка 230. Фиг.2D показывает радиальное сечение дисперсионной трубки, показывая измерения отверстий от оси 229 вертикального участка 220. Как изображено, отверстия расположены на 3,00 дюйма, 4,00 дюйма, 6,00 дюймов, 8,00 дюймов, 19,50 дюйма, 21,50 дюйма, 23,50 дюйма и 25,00 дюймов. Фиг.2Е показывает поперечное сечение горизонтального участка, указывающее угол, под которым просверлен этот набор отверстий.
Фигуры 2F-G показывают местоположения еще десяти отверстий, просверленных под углом 45 градусов, на другой стороне дисперсионной трубки 210 от набора из восьми отверстий (показанных на фиг.2D). Фиг.2F показывает радиальное сечение дисперсионной трубки, показывая измерения отверстий от оси 229 вертикального участка 220. Как изображено, отверстия расположены на 2,50 дюйма, 3,50 дюйма, 4,50 дюйма, 6,50 дюймов, 9,50 дюймов, 11,50 дюймов, 21,00 дюйм, 23,00 дюйма, 24,00 дюйма, и 26,00 дюймов. FIG.2G показывает поперечное сечение горизонтального участка, указывающее угол, под которым просверлен этот набор отверстий.
Как изображено на фигурах 2B-G, наборы отверстий расположены в трех параллельных рядах, просверленных в нижней половине горизонтального участка 230. Каждый из трех рядов имеет различное количество отверстий 231, и каждое отверстие сверлится на расстоянии вдоль горизонтального участка 230, которое отличается от расстояния всех других отверстий. Расположение отверстий является важным фактором для обеспечения равномерного распределения активационного раствора на смоле. Это расположение отверстий было найдено оптимальным на основе экспериментов по моделированию соли. Однако также могут быть использованы и другие варианты расположения отверстий. Точное количество отверстий, их отношение друг к другу, количество рядов, угол, под которым просверлены отверстия, размер отверстий и другие факторы, можно регулировать по мере необходимости.
Добавление активационной смеси с использованием дисперсионной трубки превосходит ручное добавление, поскольку оно обеспечивает большую однородность полученного продукта смолы. Как объяснено выше, смола, изготовленная раскрытым устройством связывания, функционирует иначе в колонне по сравнению со смолой, полученной другими способами. Использование дисперсионной трубки может добавить сто или более циклов к сроку службы гранул смолы.
Другим важным преимуществом дисперсионной трубки является то, что она позволяет равномерно распределить активационную смесь за очень короткий период времени. Активация смолы с CNBr должна происходить быстро, чтобы уменьшить возникновение поперечных связей. В большинстве случаев, это должно быть завершено менее чем за 5 минут, и в идеале это должно быть завершено менее чем за 3 минуты. Если процесс активации занимает значительно больше 3 минут, эффективность связывания снижается, что приводит к чрезмерному сшиванию. Дисперсионная трубка, особенно в сочетании с системой перемешивания, описанной ниже, позволяет процессу активации происходить быстро для получения смолы высокого качества. CNBr может быть добавлен до примерно 40 литров смолы, смешан и удален менее чем за 3 минуты, а в некоторых случаях менее чем за 2 минуты.
Фиг.3 показывает съемную удерживающую емкость или воронку 290 для раствора CNBr-ацетонитрил, которая может быть включена в устройство. Выпускное отверстие 291 воронки 290 находится в сообщении по текучей среде с впускным отверстием 225 на вертикальном участке 220 дисперсионной трубки. Клапан 280 управляет потоком текучей среды из воронки 290 в дисперсионную трубку 210. При использовании, съемная удерживающая емкость 290 заполняется раствором CNBr и прикрепляется к дисперсионной трубке. Съемность воронки 290 позволяет более безопасно обращаться с CNBr и избежать утечки. Смесь CNBr-ацетонитрил является коррозийной и опасной, и поэтому съемная воронка позволяет смешивать смесь под крышкой перед тем, как присоединить ее к устройству связывания.
Как только смола подготовлена для активации, клапан 280 открывается, чтобы позволить раствору проходить через дисперсионную трубку 210 и на смолу. Дисперсия обычно занимает 2-4 минуты. Раствор может быть вытеснен небольшим объемом раствора ацетонитрила, чтобы промыть оставшийся CNBr из воронки 290 и трубки 210.
Внутри емкости 110, гранулы смолы перемешиваются мешалкой 410, которая удерживает их при перемещении через экран 310. Вид сбоку в разрезе мешалки показан на фиг.4A. Мешалка включает в себя ротор 420, который представляет собой вертикальный стержень, прикрепленный к двигателю для перемешивания (не показан). Мешалка также включает лопатки 440, прикрепленные к стержню в ступице 445. На фиг.4А, лопатки 440 показаны в сечении. Вид в перспективе в перевернутом положении мешалки показан на фиг.4В для обеспечения более ясного вида конфигурации лопатки 440. Лопатки 440 вращаются для снятия гранул смолы с экрана 310. Мешалка также может включать в себя круглую раму 450, которая ограничивает крайние точки лопаток 440, и она может дополнительно включать в себя спицы 460 для дополнительной поддержки. Ссылаясь снова к фиг.4А, нижний край рамы 450 сконфигурирован так, чтобы быть параллельным с экраном (не показан), который расположен под мешалкой 410.
Лопатки 440, показанные на фиг.4А, имеют ширину 3,0 дюйма, толщину 0,25 дюйма и длину 28,0 дюймов. Однако размеры лопаток 440 могут быть разными для разных применений. В некоторых вариантах осуществления, мешалка 410 может содержать более двух лопаток. Как показано, каждая лопатка 440 имеет наклон 40 градусов относительно горизонтали. В разных вариантах осуществления, лопатки могут иметь разные углы наклона, такие как 10 градусов, 20 градусов, 30 градусов, 50 градусов, 60 градусов, 70 градусов, 80 градусов и тому подобное. Лопатки 440 могут иметь закругленные края 449, как показано на фиг.4C, который помогает предотвратить измельчение гранулы. Мешалка может быть изготовлена из нержавеющей стали или другого надежного материала. В варианте осуществления, показанном на фигурах 4A-C, мешалка выполнена с возможностью вращения по часовой стрелке, так что лопатки создают подъем вверх в текучей среде в емкости (а не выталкивают текучую среду вниз в экран).
Скорость вращения мешалки может быть отрегулирована в зависимости от типа используемых гранул смолы и необходимого количества перемешивания. Мешалка должна обеспечивать достаточную подъемную силу, чтобы удерживать гранулы в подвешенном состоянии и перемещаться по экрану, а также быстро перемешивать их, избегая разрушения или дробления. Поскольку разные гранулы оседают с разной скоростью, скорость мешалки должна регулироваться для учета разных типов гранул. Например, гранулы CAPTO™ оседают быстрее, чем гранулы CL-4B или CL-2B. В различных вариантах осуществления, мешалка может вращаться со скоростью до 60 об/мин. Предпочтительная скорость перемешивания составляет 35 об/мин. Другая предпочтительная скорость перемешивания составляет 20 об/мин. Скорость может быть определена на основе типа гранул, типа жидкости, температуры жидкости и продолжительности времени инкубации. Исходя из этих факторов, мешалка предназначена для тщательного перемешивания смолы во время процесса активации смолы и во время процесса связывания антитела. Это обеспечивает правильное перемешивание для химической дисперсии и позволяет избежать дробления/разрушения гранул смолы во время процесса связывания. Мешалка также увеличивает скорость восстановления смолы, потому что она предотвращает прилипание смолы к экрану.
В некоторых вариантах осуществления, две лопатки 440 мешалки могут быть расположены под углом в противоположных направлениях, чтобы обеспечить динамическое перемешивание смолы и суспензии в растворе внутри емкости. Другими словами, одна лопатка наклонена вниз, заставляя смолу прижиматься к экрану, в то время как другая наклонена вверх для создания подъема. В других вариантах осуществления, лопатки мешалки расположены под одним и тем же направлением. Мешалка выполнена с возможностью создания спектра обтекания, который вызывает адекватное перемешивание и суспензию смолы при вращении мешалки.
В процессе активации смолы, пока гранулы движутся, дисперсионная трубка 210, описанная выше, может использоваться для распределения активационной смеси на гранулы. Согласно различным способам, буферные смеси, и другие текучие среды могут прокачиваться через емкость во время процесса активации, промывки и связывания. Текучие среды проходят через экран вытекают через выпускное отверстие на дне сосуда, в то время как мешалка 410 удерживает гранулы, движущиеся над экраном.
Экран, показанный на фигурах 1A-C, имеет диаметр 30 дюймов с размером пор сетки 30 мкм для удержания смолы и обеспечения возможности фильтрации различных растворов и буферных смесей через сетку во время процесса связывания. Сетка может иметь размер пор всего около 5 мкм и максимум до около 80 мкм. В любом случае, размер пор должен быть достаточно маленьким, чтобы гранулы не могли пройти сквозь экран. Экран может быть одним сетчатым экраном или может состоять из двух, трех или более спеченных слоев. Topmesh TM3-BM 30 представляет собой сетку, совместимую с настоящим изобретением, поставляемую G. BOPP USA, INC. (Wappingers Falls, NY).
В одном варианте осуществления, верхний слой представляет собой фильтрующую сетку 30 мкм, спеченную с квадратной сеткой 0,850 мм и квадратной сеткой 2,0 мм для поддержки. Экран приварен к раме 30 дюймов из нержавеющей стали. Экран может удерживаться внутри емкости посредством прокладки, которая может быть снята с экрана.
Как обсуждалось выше, мешалка предназначена для достаточного перемешивания смолы, в то же время, предотвращая разрушение смолы, что может засорить экран и препятствовать эффективному восстановлению смолы. Экран является извлекаемым, поэтому он может быть очищен или заменен после обычного износа. Процесс активации связывания требует быстрой замены буферной смеси, порядка нескольких минут, когда засорение экрана приведет к более медленным скоростям обмена буферной смеси, что приведет к несоответствиям процесса и потенциальному отклонению партии.
Экран является упругим и устойчивым к разрыву или разрушению, чтобы предотвратить проникновение смолы через экран. Кроме того, структура экрана является достаточно прочной, чтобы не сгибаться и не изгибаться под весом смолы. Сгибание может привести к неоднородному перемешиванию или плохому потоку буферной смеси через устройство и может вызвать засорение сетки. Изгиб может также заблокировать выпускной клапан 130 для сосуда 110, который расположен на небольшом расстоянии ниже уровня экрана. В некоторых вариантах осуществления, перфорированная опорная пластина может быть расположена между слоями для дополнительной жесткости и долговечности. Дополнительно или в качестве альтернативы, экран может содержать опорную балку из нержавеющей стали, расположенную под экраном для поддержки центра. Включение опорных структур помогает предотвратить неоднородность в распределении гранул по экрану. Неравномерное распределение приведет к скоплению смолы и изменениям в химическом составе и выщелачивающих свойствах смолы.
Включение в описание изобретения сведений посредством ссылки
Любые и все ссылки и ссылки на другие документы, такие как патенты, патентные заявки, патентные публикации, журналы, книги, документы и веб-содержимое, которые были сделаны в рамках данного раскрытия, настоящим включены сюда посредством ссылки во всей своей полноте для любых целей.
Эквиваленты
Изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отхода от его сущности или существенных его характеристик. Таким образом, вышеприведенные варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие изобретение, описанное в данном документе.
1. Дисперсионное устройство, содержащее:
удлиненную трубчатую структуру, образующую просвет, имеющий круглое сечение, при этом трубчатая структура содержит: (а) проксимальный участок с обращенным вверх впускным отверстием; (b) дистальный участок с закрытым концом, причем дистальный участок содержит множество обращенных вниз отверстий, расположенных в три ряда параллельно оси дистального участка, и при этом три ряда расположены на расстоянии от приблизительно 15 до приблизительно 60 градусов друг от друга на дистальном участке; и (c) колено между дистальным участком и проксимальным участком, причем колено содержит изгиб в трубчатой структуре, который ориентирует впускное отверстие так, что оно открывается в направлении, которое является, по существу, перпендикулярным оси дистального участка.
2. Дисперсионное устройство по п.1, в котором дистальный участок содержит от 8 до 30 отверстий, обращенных вниз.
3. Дисперсионное устройство по п.2, в котором дистальный участок содержит точно 21 обращенное вниз отверстие.
4. Дисперсионное устройство по п.3, в котором первый из трех рядов имеет 10 отверстий, второй из трех рядов имеет 8 отверстий, а третий из трех рядов имеет 3 отверстия.
5. Дисперсионное устройство по п.1, в котором три ряда имеют различное число отверстий.
6. Дисперсионное устройство по п.1, в котором три ряда имеют одинаковое число отверстий.
7. Дисперсионное устройство по п.1, в котором три ряда, каждый из которых разнесен на угол между 30 и 60 градусами.
8. Дисперсионное устройство по п.7, в котором три ряда, каждый из которых разнесен на угол 45 градусов.
9. Дисперсионное устройство по п.1, в котором изгиб в колене ориентирует дистальный участок и проксимальный участок под углом между 60 и 120 градусами относительно друг друга.
10. Дисперсионное устройство по п.9, в котором изгиб в колене ориентирует дистальный участок и проксимальный участок под углом между 80 и 100 градусами относительно друг друга.
11. Дисперсионное устройство по п.10, в котором изгиб в колене ориентирует дистальный участок и проксимальный участок под углом точно 90 градусов относительно друг друга.
12. Дисперсионное устройство по п.1, в котором трубчатая структура содержит нержавеющую сталь.
13. Дисперсионное устройство по п.1, дополнительно содержащее клапан для открывания и закрывания впускного отверстия.
14. Дисперсионное устройство по п.1, дополнительно содержащее воронку, соединяемую с впускным отверстием.
15. Устройство для связывания антител со смолой, включающее в себя:
- емкость для перемешивания, разделенную на верхний участок и нижний участок сетчатым экраном, растянутым поперек емкости, при этом верхний участок имеет впускное отверстие, а нижний участок выпускное отверстие, а сетчатый экран имеет размер пор от приблизительно 5 мкм до приблизительно 80 мкм;
- мешалку, расположенную внутри верхнего участка; и
- дисперсионное устройство, включающее в себя удлиненную трубчатую структуру, образующую просвет, причем трубчатая структура содержит проксимальный участок, продолжающийся вертикально снаружи смесительной емкости с впускным отверстием, которое открывается вверх; дистальный участок, расположенный горизонтально внутри верхнего участка над мешалкой и содержащий закрытый конец, и множество обращенных вниз отверстий; и колено, соединяющее дистальный участок и проксимальный участок.
16. Устройство по п.15, в котором мешалка содержит ротор и вращающуюся крыльчатку.
17. Устройство по п.16, в котором крыльчатка содержит ступицу, первую лопатку и вторую лопатку, причем первая и вторая лопатки продолжаются в противоположных направлениях перпендикулярно от ступицы, при этом каждая лопатка имеет ось, поперечную к оси, на которой ступица выполнена с возможностью вращения.
18. Устройство по п.17, в котором каждая лопатка имеет фиксированный наклон.
19. Устройство по п.17, в котором каждая лопатка имеет закругленные края.
20. Устройство по п.15, в котором мешалка выполнена с возможностью приложения усилия к текучей среде в емкости, при этом усилие направлено от экрана.
21. Устройство по п.15, в котором трубчатая структура имеет круговое сечение.
22. Устройство по п.15, в котором дистальный участок имеет от 8 до 30 отверстий.
23. Устройство по п.15, в котором дистальный участок содержит точно 21 обращенное вниз отверстие.
24. Устройство по п.15, в котором отверстия расположены в три ряда, параллельных оси дистального участка.
25. Устройство по п.24, в котором каждый ряд имеет одинаковое число отверстий.
26. Устройство по п.24, в котором каждый ряд имеет разное число отверстий.
27. Устройство по п.26, в котором первый из трех рядов имеет 10 отверстий, второй из трех рядов имеет 8 отверстий, а третий из трех рядов имеет 3 отверстия.
28. Устройство по п.24, в котором три ряда, каждый из которых разнесен на угол между 30 и 60 градусами.
29. Устройство по п.24, в котором три ряда, каждый из которых разнесен на угол 45 градусов.
30. Устройство по п.15, дополнительно содержащее клапан для открывания и закрывания впускного отверстия.
31. Устройство по п.15, дополнительно содержащее воронку, соединяемую с впускным отверстием.
32. Устройство по п.15, дополнительно содержащее опорную балку, выполненную с возможностью поддержки сетчатого экрана для предотвращения прогибания сетчатого экрана.
33. Устройство по п.15, в котором экран является извлекаемым из емкости для перемешивания.
34. Устройство по п.15, в котором колено содержит изгиб в трубчатой структуре, который ориентирует впускное отверстие таким образом, что оно открывается в направлении, которое является, по существу, перпендикулярным к оси дистального участка.
35. Устройство по п.15, в котором размер пор сетки находится между 20 и 50 мкм.
36. Устройство по п.15, в котором размер пор сетки составляет 30 мкм.
