Комбинация антител cd30xcd16 для терапии с антагонистом pd-1
Изобретение относится к области биохимии, в частности к комбинации (i) биспецифического антитела, обладающего специфичностью к CD30 и CD16A. Также раскрыто применение указанной комбинации. Изобретение позволяет эффективно лечить заболевания, ассоциированные с CD30+ лимфомой. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 16 ил., 1 табл., 1 пр.
Настоящее изобретение относится к комбинации (i) мультифункционального антитела, обладающего специфичностью к CD30 на опухолевой клетке и обладающего специфичностью к CD16, в частности, к CD16A, на клетке-естественном киллере (NK-клетке), и (ii) антагониста PD-1, например, анти-PD-1 антитела, для лечения опухоли, в частности, лимфомы Ходжкина (ЛХ).
Поскольку NK-клетки опосредуют врожденный иммунитет и конститутивно активированы, они являются кандидатами для противораковой иммунотерапии. Биспецифическое анти-CD30/CD16A тандемное диатело (TandAb®) связывает NK-клетки через CD16A и имеет второй связывающий домен для CD30, опухолеспецифической мишени, например, лимфомных CD30+-клеток Березовского-Рид-Штернберга (Hodgkin Reed-Sternberg, HRS). Такое тандемное диатело рекрутирует и перенаправляет NK-клетки на опухолевые CD30+-клетки и связывает обе мишени с высокой аффинностью, образуя таким образом связь, за счет которой NK-клетки активируются и перенаправляются на уничтожение опухолевых клеток. Сообщалось, что это биспецифическое анти-CD30/CD16A тандемное диатело обладает более высокой цитотоксичностью, чем нативные и Fc-улучшенные антитела (см. Reusch U. et al., MABS. 2014; 6(3):727-738). Анти-CD30/CD16A тандемное диатело хорошо переносится и акивно у пациентов с лимфомой Ходжкина (см. Rothe A. et al., Blood. 2015; 125(26):4024-4031). Несмотря на эти обнадеживающие результаты, необходимы дополнительные улучшения этой нацеленной против опухоли иммунотерапии с привлечением NK-клеток.
Молекулы контрольных точек иммунного ответа представляют собой белки клеточной поверхности, например, рецепторы, которые регулируют костимулирующие или коингибиторные пути иммунного ответа. Примерами молекул контрольных точек иммунного ответа являются антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA-4), белок 1 программируемой смерти (PD-1), лиганд 1 белка программируемой смерти (PD-L1) или лиганд 2 белка программируемой смерти (PD-L2), молекулы - костимуляторы иммунного ответа на NK-клетке и костимулирующие рецепторы семьи рецепторов фактора некроза опухоли (ФНО, TNF), например, CD137.
Рецептор PD-1 (PDCD1 или CD279) опосредует коингибиторный путь. Кроме того, PD-1 связывается с PD-L1, который индуцирует коингибиторный сигнальный путь при связывании рецептор-лиганд. Путь PD-1 является контрольной точкой для ограничения опосредуемого Т-клетками иммунного ответа (Keir ME et al., Annu. Rev. Immunol. 2008;26:677-704). За счет экспрессии лигандов PD-1 на клеточной поверхности и привлечения PD-1+-эффекторных клеток иммунной системы, опухоли могут использовать сигнальный путь PD-1 чтобы избегать иммунного ответа (Weber J, Semin Oncol. 2010;37:430-9; Ansell S et al., N. Engl J. Med. 2015;372:311-319). Были изучены антагонисты PD-1, блокирующие взаимодействие между PD-1 и PD-L1, которое участвует в понижающей модуляции Т-клеточных ответов, в различных типах рака, и были предложены комбинации блокады PD-1 с блокадой CTLA-4 для регуляции адаптивного иммунитета (Dolan D, Gupta S, Cancer Control. 2014; 21:231-237). Анти-PD-l антитело пембролизумаб продемонстрировало начальную клиническую эффективность в неконтролируемых исследованиях в виде монотерапии у пациентов с лимфомой Ходжкина, которую определяли по частоте ответов. В настоящее время проводятся клинические исследования для этих типов опухоли, а также для ряда других солидных опухолей на поздних стадиях и гематологических злокачественных опухолей.
Далее, анти-CD137 антитела, которые связываются с костимулирующей молекулой CD 137 на NK-клетках, применяются в комбинации с другими моноклональными антителами, такими как ритуксимаб или леналидомид, для усиления функции NK-клеток (Miller J., Hematology 2013:247-253).
В настоящем документе предложена комбинация мультифункционального антитела, обладающего специфичностью к CD30 и CD16, в частности, к CD16A, и антагониста PD-1, в частности, анти-PD-1 антитела, для применения в способе лечения опухоли, в частности, лимфомы Ходжкина (ЛХ). Эта комбинация обеспечивает усиленное уничтожение опухолевых клеток, потому что комбинация привлекающего NK-клетки и направленного против опухоли мультифункционального антитела с иммуномодулирующим агентом имеет синергический противоопухолевый эффект за счет комплексного иммунного ответа с участием NK-клеток, Т-клеток, макрофагов и дендритных клеток. В результате это комбинированное лечение активирует все субпопуляции иммунных клеток и индуцирует их для инфильтрации опухолей. Комбинация биспецифического анти-CD30/CD16A антитела и анти-PD-1 антитела значительно усиливает начальный врожденный иммунный ответ за счет усиленной инфильтрации опухоли клетками врожденной иммунной системы, в частности, NK-клетками, макрофагами и дендритными клетками. В доклинических исследованиях лимфомы Ходжкина на животных с использованием аутологичного материала пациента, то есть полученного от пациента ксенотрансплантата (PDX) и иммунных клеток из крови (мононуклеары периферической крови (МКПК)) того же донора, привитую опухоль лечили биспецифическим анти-CD30/CD16 антителом в комбинации с иммуномодулирующим агентом, анти-PD1 антителом, как по отдельности, так и в комбинации. В то время как лечение одним агентом показало значительное снижение роста опухоли для большинства молекул в сравнении с контрольной группой лечения (нецелевой IgG), комбинация биспецифического мультифункционального анти-CD30/CD16 антитела и анти-PD-1 антитела продемонстрировала повышенную противоопухолевую эффективность. В сравнении с лечением IgG наблюдали, что у животных, получавших лечение комбинациями антитела к CD30/CD16 и анти-PD-1 антитела, популяция NK-клеток в опухоли увеличивалась. Уже через 2 дня после начала лечения (30 день) монотерапия биспецифическим анти-CD30/CD16 тандемным диателом индуцировала инфильтрацию как NK-клеток, так и макрофагов в опухоль. Этот эффект усиливался с течением времени и обе популяции иммунных клеток демонстрировали значительную опосредованную биспецифическим анти-CD30/CD16 тандемным диателом инфильтрацию опухолей к концу эксперимента (58 день). При комбинированном применении биспецифического анти-CD30/CD16 тандемного диатела и иммуномодулирующего анти-PD-1 антитела влияние на врожденный иммунный ответ в начале определялось только биспецифическим анти-CD30/CD16 тандемным диателом, но лечение анти-PD-1 антителом на самом деле приводило к более выраженной инфильтрации клеток врожденного иммунитета к концу эксперимента. Дополнительно, несмотря на небольшое увеличение количества Т-клеток у животных, получавших лечение только антителом к CD30/CD16, количество цитотоксических Т-клеток было выше у животных, получавших лечение антителом к CD30/CD16 в комбинации с агентом, модулирующим одну из молекул контрольной точки иммунного ответа.
В то время как монотерапия анти-PD-1 антителом индуцирует до определенной степени инфильтрацию Т-клетками, антитело к CD30/CD16 в комбинации с анти-PD-1 антителом увеличивает инфильтрацию опухали как CD4+, так и CD8+ Т-клетками. Т-клетки и дендритные клетки значительно индуцировались комбинацией антитела к CD30/CD16 и анти-PD-1 антитела по сравнению с монотерапией антителом к CD30/CD16 или анти-PD-1 антителом (Фиг. 8В). Комбинация антитела к CD30/CD16 и анти-PD-1 антитела успешно индуцировала инфильтрацию дендритных клеток в опухоль вскоре после введения (30 день и 40 день). Комбинация антитела к CD30/CD16 и анти-PD-1 антитела значительно увеличивала инфильтрацию опухолей всеми субпопуляциями иммунных клеток, такими как Т-клетки, NK-клетки, макрофаги и дендритные клетки по сравнению с монотерапиями антителом к CD30/CD16 и анти-PD-1 антителом, соответственно (Фиг. 8В).
Таким образом, комбинация (i) мультифункционального антитела, обладающего специфичностью к CD30 и обладающего специфичностью к CD16, в частности, к CD16A, и (ii) анти-PD-1 антитела синергетически повышает уничтожение опухолевых клеток, что приводит к значительно повышенной регрессии опухоли. Заметная регрессия опухоли достигается за счет координированного, то есть, комплексного, действия всех субпопуляций иммунных клеток, таких как CD4+ и CD8+ Т-клетки и NK-клетки, макрофаги и дендритные клетки, а также повышение внутриопухолевого количества воспалительных цитокинов, таких как, в частности, интерферон-γ (ИНФ-γ), за счет комбинированного действия привлекающего NK-клетки мультифункционального антитела и агента, модулирующего молекулу контрольной точки иммунного ответа. Комбинированная терапия, предложенная в настоящем документе, впервые демонстрирует, что эффективность индуцирования врожденного иммунного ответа привлекающим NK-клетки и направленным против опухоли антителом может быть улучшена анти-PD-1 антителом, которое, как известно, стимулирует адаптивный иммунный ответ путем блокировки сигнального пути PD-1.
Комбинацию мультифункционального антитела, обладающего специфичностью к CD30 и CD16, в частности, к CD16A, и антагониста PD-1, в частности, PD-1-антитела, применяют для повышения врожденного иммунного ответа по сравнению с ответом, обеспечиваемым только мультифункциональным антителом, обладающим специфичностью к CD30 и CD16A, в способе лечения опухоли, в частности лимфомы Ходжкина (ЛХ). В частности, врожденный иммунный ответ повышается за счет инфильтрации клеток врожденного иммунитета, в частности, макрофагов, дендритных клеток и NK-клеток в опухоль. Кроме того, повышается внутриопухолевая инфильтрация CD4+ и CD8+ Т-клеток.
Термин «врожденный иммунный ответ» относится к активации одного или более лейкоцитов врожденной иммунной системы (или неспецифической иммунной системы, или наследственной иммунной системы). Активированные лейкоциты врожденного иммунного ответа включают клетки-естественные киллеры (NK-клетки), макрофаги и дендритные клетки. Врожденная иммунная система отличается от адаптивной иммунной системы (или специфической иммунной системы), которая включает лимфоциты, такие как CD4+ или CD8+ Т-клетки.
Термин «комбинация» относится к терапии комбинацией, комбинированной терапии, или политерапии, при которой используют более одного лекарственного средства для лечения опухоли, то есть одного заболевания. В настоящем изобретении термин «комбинация» используется для комбинированной терапии, которая включает этапы введения мультифункционального антитела, обладающего специфичностью к CD30 и CD16A, например, биспецифического анти-CD30/CD16A тандемного диатела, и антагониста PD-1, например, анти-PD-1-антитела, для лечения опухоли, например, лимфомы Ходжкина. Таким образом, биспецифическое анти-CD30/CD16A тандемное диатело и анти-PD-1-антитело вводят в комбинации. В отличие от этого, термин «монотерапия» относится к терапии, которая охватывает введение только одного лекарственного средства, например, биспецифического анти-CD30/CD16A тандемного диатела или анти-PD-1-антитела.
Комбинация содержит мультифункциональное антитело для применения в иммунотерапии опухоли на основе NK-клеток. Термин «мультифункциональный» в настоящем документе означает, что антитело демонстрирует две или более различные биологические функции. Например, различные биологические функции представляет собой различные специфичности к разным антигенам. В некоторых случаях мультифункциональное антитело является мультиспецифическим, например, биспецифическим, триспецифическим и так далее. Такие мультиспецифические, например, биспецифические, связывающие белки, включают, например, биспецифические моноклональные антитела классов IgA, IgD, IgE, IgG или IgM, а также фрагменты антител или производные антител, включая, например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv-фрагменты, одноцепочечный Fv-фрагмент, тандемные одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv)2, переориентирующееся антитела с двойной аффинностью (DART™), диатело и тандемное диатело (TandAb®), одноцепочечные диатела (scDb) и флекситела («flexibody»). Термин «антитело» в настоящем документе обозначает моноклональные антитела, а также фрагменты антител и производные антител, содержащие связывающий домен антитела. Из фрагментов антител и производных антител могут быть созданы различные форматы антител, которые имеют специфичность связывания антитела, аналогичную специфичности нативного антитела, но отличаются по валидности и эффекторной функции из-за количества связывающих доменов или отсутствия Fc-области. Примеры форматов антител для биспецифических антител описаны в Spiess, С.et al., Mol Immunol. 2015 Oct; 67(2 Pt A):95-106 и Kontermann, R.E., Brinkmann, U., Drug Discov. Today 2015 Jul; 20(7):838-47.
В некоторых вариантах реализации мультифункциональное антитело является мультиспецифическим, например, биспецифическим тандемным антителом (TandAb®). Тандемное диатело конструируют путем соединения четырех вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей (VH и VL) от двух или более различных Fv-связывающих доменов в одном полипептиде. Домены располагаются таким образом, что соответствующие домены VH и VL могут образовывать пары, если две молекулы полипептида выравниваются в конфигурации «голова к хвосту». Короткие линкеры между доменами (двенадцать или менее аминокислот) препятствуют внутримолекулярному спариванию Fv-фрагментов. Формат тандемного антитела и его получение описаны в Weichel et al., European Pharmaceutical Review 2015, vol. 20:27-32, Kipriyanov SM: Methods Mol. Biol. 2009; 562:177-93 или Kipriyanov SM: Methods Mol Biol 2003; 207:323-33.
В некоторых вариантах реализации сначала вводят мультифункциональное антитело, например, биспецифическое анти-CD30/CD16A тандемное диатело, а затем вводят агент, представляющий собой иммуномодулирующую молекулу, то есть анти-PD-1 антитело. Соответственно, антитело к CD30/CD16A и анти-PD-1 антитело можно вводить соответственно, как правило, за определенный период времени. Введение мультифункционального антитела и анти-PD-1 антитела может быть выполнено разными способами, например, путем внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, местного или внутрикожного введения. В некоторых вариантах реализации путь введения зависит от вида терапии и типа соединения, содержащегося в фармацевтической композиции. Схема введения будет определяться лечащим врачом и другими клиническими факторами. Доза для любого пациента зависит от множества факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, пол, конкретное вводимое соединение, время и путь введения, вид терапии, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, применяемые одновременно. Термин «эффективная доза» относится к количеству действующего вещества, которое является достаточным для того, чтобы оказать воздействие на ход и тяжесть заболевания, что приводит к уменьшению или ремиссии такой патологии. «Эффективную дозу», пригодную для лечения опухоли, можно определить, используя известные способы. Соответственно, настоящее изобретение охватывает способ лечения, то есть комбинированную терапию, включающую этап введения субъекту с CD30+-опухолью, например, лимфомой Ходжкина, эффективных доз комбинации мультифункционального антитела и анти-PD-1 антитела, при этом мультифункциональное антитело обладает специфичностью к CD30 и CD16, например, представляет собой антитело к CD30/CD16A.
Этот иммунотерапевтический подход опосредованного антителами рекрутинга NK-клеток в опухоли с использованием мультифункциональных антител можно применять для лечения опухолей, например, лимфомы Ходжкина. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложена комбинация мультифункционального антитела, обладающего специфичностью к CD30 и CD16A, например, биспецифического анти-CD30/CD16A тандемного диатела, и анти-PD-1 антитела для применения в комбинированной терапии для лечения опухоли, например, лимфомы Ходжкина или анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ).
В некоторых вариантах реализации мультифункциональное антитело рекрутирует NK-клетки путем связывания исключительно с CD16A, изоформой CD16. Примеры CD16A-связывающих доменов антител и их создание описаны в WO 2006/125668. В некоторых вариантах реализации CD16A-связывающий домен содержит участки CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи, представленного в SEQ ID NO: 4, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи, представленного в SEQ ID NO: 5. В конкретных вариантах реализации CD16A-связывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи, представленный в SEQ ID NO: 4, и вариабельный домен легкой цепи, представленный в SEQ ID NO: 5.
Примеры связывающих доменов антител к CD30, подходящие для мультифункционального антитела согласно настоящему изобретению, раскрыты в Arndt MA et al., Blood. 1999; 94:2562-8; Schlapschy M. et al., Protein Eng Des Sel. 2004; 12:847-60 и Reusch U. et al., MABS. 2014; 6(3):727-738. В некоторых вариантах реализации CD30-связывающий домен антитела представляет собой модифицированный анти-CD30 домен иммуноглобулина IgG HRS-3 (Reusch U. et al., 2014) и содержит участки CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи, представленного в SEQ ID NO: 2, и участки CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи, представленного в SEQ ID NO: 3. В конкретных вариантах реализации анти-CD30 антитело имеет связывающие домены Fv модифицированного анти-CD30 иммуноглобулина IgG HRS-3 (Reusch U. et al., 2014) и содержит вариабельный домен тяжелой цепи, представленный в SEQ ID NO: 2, и вариабельный домен легкой цепи, представленный в SEQ ID NO: 3.
В одном из конкретных вариантов реализации настоящего изобретения мультифункциональное антитело представляет собой биспецифическое, тетравалентное тандемное антитело к CD30/CD16A, которое представляет собой гомодимер двух нековалентно связанных полипептидных цепей, при этом каждая из полипептидных цепей тандемного диатела имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. В примере 1 описано тандемное диатело к CD30/CD16A, которое специфически рекрутирует NK-клетки путем связывания исключительно с изоформой CD16A. Тандемные диатела имеют два сайта связывания для каждого антигена, но не имеют Fc-доменов. Тандемное диатело к CD30/CD16A из примера 1 имеет молекулярную массу приблизительно 104 кДа и может быть синтезировано в бактериальных клетках или в клетках млекопитающих, например, в клетках яичника китайского хомячка (СНО). Оно специфически направлено против CD30 на клетках лимфомы Ходжкина и рекрутирует и активирует NK-клетки путем связывания с CD16A. Конструкция и получение тандемного диатела описано в Reusch U. et al., MABS. 2014; 6(3):727-738, а эффективность этого тандемного диатела к CD30/CD16A описана в Rome A. et al., Blood. 2015; 125(26):4024-4031.
В некоторых вариантах реализации антагонист PD-1 представляет собой антитело к PD-1 или антитело к PD-L1. Примеры антител к PD-1 (анти-PD-1 антител) включают ниволумаб, пембролизумаб (MK3475, Keytruda), а примером антитела к PD-L1 (анти-PD-L1 антитела) является пидилизумаб.
Комбинацию мультифункционального антитела к CD30/CD16, например, биспецифического антитела к CD30/CD16A, и анти-PD-1 антитела можно применять для лечения CD30+-опухолей, таких как, например, лимфома Ходжкина или анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ).
В некоторых вариантах реализации сначала вводят антитело к CD30/CD16, например, к CD30/CD16A, например, биспецифическое анти-CD30/CD16A тандемное диатело, а затем вводят анти-PD-1 антитело. Например, анти-PD-1 антитело вводят через 10-72 ч, например, через 1 день, после введения антитела к CD30/CD16, например, биспецифического анти-CD30/CD16A тандемного диатела.
В некоторых вариантах реализации комбинация, то есть комбинированная терапия, включает введение дополнительного агента для модулирования другой молекулы контрольной точки иммунного ответа, например, антагонистического антитела, блокирующего коингибирующий путь, или агонистического антитела, индуцирующего костимулирующий путь посредством связывания с соответствующей молекулой контрольной точки иммунного ответа. Такие антитела также известны как ингибиторы контрольных точек (CPI) и агонисты контрольных точек (CPA), они описаны и клинически исследованы.
Примерами других молекул контрольных точек иммунного ответа для применения в комбинации, то есть комбинированной терапии, являются CTLA-4 и CD137.
CTLA-4 индуцирует сигнал, который ингибирует Т-клеточный ответ. Примерами антител к CTLA-4 для применения в комбинации являются ипилимумаб и тремелимумаб.
CD137 (4-1ВВ) или белок 9 суперсемейства TNF-рецепторов (TNFRSF9) представляет собой костимулирующий рецептор, который относится к суперсемейству рецепторов ФНО (TNF), член суперсемейства рецепторов факторов некроза опухоли, который участвует в регуляции активации иммунных клеток. Функциональная роль CD137 состоит в усилении ответов цитотоксических Т-клеток. Примером агонистического антитела к CD137, которое усиливает Т-клеточный ответ, является урелумаб.
В некоторых вариантах реализации комбинация, то есть комбинированная терапия, согласно настоящему изобретению дополнительно содержит антитело, выбранное из группы, состоящей из анти-CTLA4 антитела и анти-CD137 антитела.
В конкретном варианте реализации оба антитела, анти-PD-1 антитело и анти-CD137 антитело, вводят в комбинации с биспецифическим антителом к CD30/CD16. Соответственно, в этом конкретном варианте реализации комбинация, то есть комбинированная терапия, включает этапы введения биспецифического анти-CD30/CD16A антитела, анти-PD-1 антитела и анти-CTLA4 антитела.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 - показан анализ высвобождения хрома. Процент лизиса определяли после культивирования преактивированных очищенных NK-клеток при различных соотношениях эффектор: клетка-мишень (KARPAS-299) с 51Cr-меченными клетками лимфомы только в среде (без антитела) или с одним (aCD137, aPD1, aCTLA4) или с несколькими антителами (aCD137 и aPD1), где «а» представляет собой сокращение от «анти».
Фигура 2 - показан анализ высвобождения хрома. Процент лизиса определяли после культивирования преактивированных очищенных NK-клеток при различных соотношениях эффектор: клетка-мишень (KARPAS-299) с 51Cr-меченными лимфомными клетками только в среде (без антител) или с одним (aCD137, aPD1, aCTLA4) или с несколькими антителами (aCD137 и aPD1), тандемное диатело к CD30/CD16A использовали в концентрации 1 пМ, где «а» представляет собой сокращение от «анти».
Фигура 3 - показаны результаты модели in vivo на основе полученных от пациентов ксенотрансплантатов (PDX). AFM13 обозначает тандемное диатело к CD30/CD16A.
Фигура 4 - показаны результаты модели in vivo на основе полученных от пациентов ксенотрансплантатов (PDX). AFM13 обозначает тандемное диатело к CD30/CD16A.
Фигура 5 - модель in vivo на основе полученных от пациентов ксенотрансплантатов (PDX): увеличенное количество лимфоцитов у мыши, получавшей лечение тандемным диателом к CD30/CD16A.
Фигура 6 - показаны результаты четырех моделей in vivo на основе полученных от пациентов ксенотрансплантатов (PDX) в день 30: (А) размеры опухоли; IgG обозначает нецелевое контрольное IgG антитело, AFM13 обозначает тандемное диатело к CD30/CD16A, AFM22 обозначает нецелевое контрольное тандемное диатело (EGFRvIII/CD16A), анти-PD-l антитело обозначает пембролизумаб; (В) Внутриопухолевые популяции лимфоцитов.
Фигура 7 - показаны результаты четырех моделей in vivo на основе полученных от пациентов ксенотрансплантатов (PDX) на 44 день: (А) размеры опухоли; IgG обозначает нецелевое контрольное IgG антитело, AFM13 обозначает тандемное диатело к CD30/CD16A, AFM22 обозначает нецелевое контрольное тандемное диатело (EGFRvIII/CD16A), анти-PD-1 антитело обозначает пембролизумаб; (В) внутриопухолевые популяции лимфоцитов.
Фигура 8 - показаны результаты четырех моделей in vivo на основе полученных от пациентов ксенотрансплантатов (PDX) на 44 день: (А) размеры опухоли; IgG обозначает нецелевое контрольное IgG антитело, AFM13 обозначает тандемное диатело к CD30/CD16A, AFM22 обозначает нецелевое контрольное тандемное диатело (EGFRvIII/CD16A), анти-PD-1 антитело обозначает пембролизумаб; (В) Внутриопухолевые популяции лимфоцитов.
Фигура 9 - показан внутриопухолевый цитокиновый профиль четырех моделей in vivo на основе полученных от пациентов ксенотрансплантатов (PDX) в день 58
Фигура 10 - показан внутриопухолевый профиль лейкоцитов человека. Мышам линии Rag2-/-- IL2Rγnull пересадили части опухоли от пациентов с лимфомой Ходжкина в день 0 и реконструировали аутологичными полученными от пациентов МКПК посредством внутрибрбшинной инъекции в день 28. Лечение антителами началось в день 28 с внутрибрбшинной инъекции 5 мг/кг AFM13, или контрольного тандемного диатела AFM22, или IgG и инъекции анти-PD-l антитела с задержкой в один день один раз в неделю в течение трех циклов в целом. В день 30 (А, С) и в день 58 (В, D) мышей умерщвляли и подсчитывали количество инфильтрующих опухоль CD3-/CD56+NK-клеток и CD11b+/HLA-DR+/CD163+-макрофагов (А, В) или CD3+/CD8+ Т-клеток, CD3+/CD4+ Т-клеток и CD11c+/CD80+/CD86+-дендритных клеток (С, D).
Пример
Костимуляция CD137 и/или блокировка PD-1 усиливает опосредуемый NK-клетками лизис клеток-мишеней за счет биспецифического анти-CD30/CD16A тандемного диатела.
Методы
Эффективность оценивали in vitro с использованием МКПК человека, обогащенных NK-клеток и CD30+-клеток-мишеней, а также клеточной линии и моделей in vivo на основе полученных от пациентов ксенотрансплантатов с тандемным диателом к CD30/CD16A, анти-CTLA-4, анти-PD-1 или анти-CD137 антителами.
Для оценки цитотоксичности NK-клеток в отношении линий CD30+-клеток лимфомы, проводили анализ высвобождения радиоактивного хрома следующим образом: МКПК культивировали в течение 24 часов вместе с анти-CD30 антителом (10 мкг/мл) и облучали (5000 рад) опухолевые CD30+-клетки лимфомы в отношении 1:1. После 24 часов выделяли NK-клетки из этих культур путем отрицательной магнитной сортировки клеток с использованием магнитных частиц для выделения NK-клеток (Miltenyi Biotec) согласно рекомендациям производителя. Оценивали чистоту NK-клеток (чистота более 90%, как определено проточной цитометрией) перед анализом на высвобождение хрома. Клетки-мишени метили 150 мкКи 51Cr на 1×106 клеток в течение 2 часов. Процент лизиса определяли после 4 часов культивирования преактивированных очищенных NK-клеток при различных соотношениях эффектор: клетка-мишень с 51Cr-меченными клетками лимфомы только в среде или с одним или с несколькими антителами.
Наблюдали за приживлением ксенотрансплантированных кусочков опухолей (8×8 мм), полученных из хирургического образца пациента с впервые диагностированной CD30+-лимфомой (включая болезнь Ходжкина), у мышей линии Rag2-/-IL2Rγnull (n~100) и до 80 мышей с ксенотрансплантатами близкого размера (0,5 см2), случайным образом распределенным по максимум 8 группам в день 28. Осуществляли внутрибрюшинную (в.б.) инфузию аутологичных МКПК в день 28 (2×106 МКПК/мышь). Лечение начинали в день 28 и проводили еженедельно, всего делали три внутрибрюшинных инъекции, все с дозой 15 мг/кг. При комбинированной терапии дозу анти-CD30/CD16A антитела (AFM13; Reusch U. et al., MABS. 2014; 6(3):727-738) вводили в день 28, а дозу анти-CTLA4 антитела (ипилимумаб), анти-CD137 антитела (урелумаб) или анти-PD1 антитела (пембролизумаб) вводили в день 29. Размер опухоли сравнивали между группами в день 56. Всех мышей умерщвляли для иммунофенотипирования после того как эвтаназия группы становилась необходимой из-за вырастания опухоли до 700% от начального размера (приблизительно 3,5 см2), в день 58.
Количество инфильтрующих опухоль лимфоцитов человека, миелоидных клеток и количество внутриопухолевых цитокинов оценивали в дни 30, 44 и 58, то есть через 2, 16 и 30 дней после начала лечения. Определяли следующие биомаркеры: инфильтрацию NK-клеток определяли по CD3- и CD56+, инфильтрацию Т-клеток определяли по CD25+, и CD4+, CD3+ и CD4+, CD3+ и CD8+, субпопуляции NK-клеток определяли по CD56dim, CD56bright, CD 16 A, CD69; макрофаги определяли по CD11b, HL-DR и CD 163, дендритные клетки определяли по CD11c, CD80 и CD86 (Фиг. 6В, 7В и 8В).
Тандемное диатело к CD30/CD16A представляет собой антитело AFM13, описанное в Reusch U. et al., MABS. 2014; 6(3):727-738. Тандемное диатело к CD30/CD16A содержит анти-CD30 домен гибридомы HRS-3 и его конструкция и экспрессия в бактериях раскрыты в примере 19 патента WO 2006/125668.
Результаты:
Тандемное диатело к CD30/CD16A демонстрировало более высокую активность и эффективность в отношении мишени и эффекторных клеток относительно других форматов антител к CD30+ (ЕС50=15 пМ). Эти выгодные свойства определили более высокую цитотоксичность при инкубации тандемного диатела к CD30/CD16A с опухолевыми CD30+-клетками и обогащенными NK-клетками (Фиг. 2). Разовое лечение тандемным диателом к CD30/CD16A в субоптимальной концентрации (1 пМ) индуцировало зависимый от соотношения эффектор: клетка-мишень лизис CD30+-клеток лимфомы до 40% при использовании обогащенных NK-клеток. Иммуномодулирующие антитела в одиночку опосредовали лизис на существенно более низком уровне (менее 25%) (Фиг. 1). Однако добавление анти-PD-l или анти-CD137 антитела к тандемному диателу к CD30/CD16A значительно усиливало специфический лизис - до 70%, тогда как добавление анти-CTLA-4 антитела к тандемному диателу к CD30/CD16A не показало благоприятного эффекта. Наиболее впечатляющее повышение эффективности наблюдали, когда тандемное диатело к CD30/CD16A применяли вместе с комбинацией анти-PD-l антитела и анти-CD137 антитела (Фиг. 2). In vivo наблюдали синергизм комбинации тандемного диатела к CD30/CD16A и иммуномодулирующего антитела для каждого исследованного иммуномодулирующего антитела, который усиливало применение анти-PD1 антитела (регрессия у 9/10 опухолей), анти-CTLA-4 антитела (3/10) и анти-CD137 антитела (3/10), и на который влияло присутствие регуляторных Т-клеток, NK-клеток и цитокинов Т-хелперов 1 (Th1) (Фиг. 3 и 4).
По сравнению с лечением IgG у животных, получавших лечение комбинациями тандемного диатела к CD30/CD16A и анти-CTLA-4 антитела, анти-PD-1 антитела и анти-CD137 антитела, наблюдалось увеличение популяции NK-клеток в опухоли. Дополнительно, несмотря на отсутствие увеличения количества Т-клеток у животных, получавших лечение только тандемным диателом к CD30/CD16A или только анти-CTLA-4 антителом, анти-PD-1 антителом и анти-CD137 антителом, было увеличено количество цитотоксических Т-клеток, обнаруженных у животных, получавших лечение тандемным диателом к CD30/CD16A в комбинации с анти-CTLA-4 антителом, анти-PD-1 антителом и анти-CD137 антителом (Фиг. 5).
Полученные результаты говорят в пользу того, что терапия двойными антителами повышает эффективность тандемного диатела к CD30/CD16A и иммуномодулирующих антител, что приводит к заметной регрессии опухоли.
Улучшенную противоопухолевая активность тандемного диатела к CD30/CD16A в комбинации с иммуномодулирующими антителами связали с более высоким числом инфильтрующих опухоль NK-клеток и Т-клеток и увеличенным высвобождением провоспалительных цитокинов. Лечение контрольным IgG или нецелевыми тандемными CD16A-рекрутирующими диателами не индуцировало активацию неспецифических иммунных клеток, подтверждая строгую мишень-зависимую активацию NK-клеток тандемным диателом к CD30/CD16A. Комбинация тандемного диатела к CD30/CD16A с иммуномодулирующими анти-CTLA-4, анти-CD137 и анти-PD-1 антителами не только улучшает противоопухолевую активность NK-клеток, но также стимулирует инфильтрацию Т-клеток и высвобождение цитокинов в опухоль, что подтверждает взаимодействие врожденного и адаптивного (приобретенного) иммунитета.
В дополнительных экспериментах с теми же описанными выше моделями на основе полученных от пациентов ксенотрансплантатов (PDX) и анти-PD-1 антителом (пембролизумаб) оценивали размер опухоли, количество инфильтрующих опухоль лимфоцитов человека, миелоидных клеток и количество внутриопухолевых цитокинов в дни 30, 44 и 58, то есть через 2, 16 и 30 дней после начала лечения. Монотерапия тандемным диателом к CD30/CD16A была воспроизводимо более эффективной, чем монотерапия анти-PD-1 антителом, а при применении обоих агентов в комбинации наблюдали синергизм. Анализ опухолей в день 58 выявил сильную корреляцию между ингибированием роста опухоли (Фиг. 8А) и уровнем инфильтрующих опухоль NK-клеток, Т-клеток, миелоидных клеток (Фиг. 8В) и уровнем внутриопухолевых цитокинов, таких как ИФН-γ (Фиг. 9). В отличие от монотерапии анти-PD-1 антителом, которая индуцировала только инфильтрацию Т-клеток, монотерапия тандемным диателом к CD30/CD16A смогла индуцировать инфильтрацию NK-клеток и Т-клеток в опухоли, однако комбинация тандемного диатела к CD30/CD16A с анти-PD-1 антителом дополнительно усиливала инфильтрацию как NK-клеток, так и Т-клеток. Тандемное диатело к CD30/CD16A обеспечивало более значительную инфильтрацию макрофагов, чем анти-PD-1 антитело, которая увеличивалась также увеличивалась при применении обоих (Фиг. 8В), что дополнительно подтверждало взаимодействие врожденного и адаптивного иммунитета. Кроме того, анализы опухолей в более ранние моменты времени, в день 30 (Фиг. 6В) и в день 44 (Фиг. 7В), показали, что начальный иммунный ответ характеризуется инфильтрацией и активацией NK-клеток, а также инфильтрацией макрофагов, в то время как адаптивный иммунный ответ, осуществляемый Т-клетками и активированными дендритными клетками, был более выражен в день 58 (Фиг. 8В). Применение комбинации тандемного диатела к CD30/CD16A и анти-PD-1 антитела улучшает инфильтрацию и активацию всех субпопуляций иммунных клеток (Фиг. 8В). Уже через 2 дня после начала лечения (30 день) монотерапия тандемным диателом к CD30/CD16A индуцировала инфильтрацию NK-клеток и макрофагов в опухоли. Этот эффект усиливался в течение времени и обе популяции иммунных клеток демонстрировали значительную опосредованную тандемным диателом инфильтрацию опухолей к концу эксперимента (58 день). Когда тандемное диатело к CD30/CD16A применяли в комбинации с иммуномодулирующим анти-PD-1 антителом воздействие на врожденный иммунитет первоначально определялось только тандемным диателом, но лечение анти-PD-1 антителом в итоге приводило к более выраженной инфильтрации клеток врожденного иммунитета к концу эксперимента (Фиг. 10).
В заключение, эти данные показывают значительную противоопухолевую эффективность применения комбинации тандемного диатела к CD30/CD16A с анти-PD-1 антителом, блокирующим контрольную точку иммунного ответа, в моделях лимфомы Ходжкина на основе полученных от пациентов ксенотрансплантатов, опосредованную инфильтрующими опухоль лимфоцитами (CD4+ и CD8+ Т-клетками, макрофагами и дендритными клетками). Соответственно, начальный противоопухолевый ответ, индуцированный тандемным диателом к CD30/CD16A, обусловлен рекрутингом и активацией клеток врожденного иммунитета, таких как NK-клетки и макрофаги, и их активация обеспечивает взаимодействие врожденного и адаптивного иммунитета (такого как CD4 и CD8+ Т-клетки), что коррелирует с эффективным контролем роста опухоли. Эти наблюдения также коррелируют с высвобождением внутриопухолевых цитокинов, таких как ИФН-γ или ФНО-α (TNFα).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Affimed GmbH
<120> Комбинация анти-CD30xCD16 антитела с антогонистом PD-1 для терапии
<130> A 3283PCT
<160> 5
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 483
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Fv тандемное диатело
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val
130 135 140
Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr
145 150 155 160
Asn Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu
165 170 175
Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr
180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln
195 200 205
Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro
210 215 220
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
245 250 255
Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
260 265 270
Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His
275 280 285
Asp Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
305 310 315 320
Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
325 330 335
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr
340 345 350
Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro
370 375 380
Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly
385 390 395 400
Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro
405 410 415
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser
420 425 430
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
435 440 445
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
450 455 460
Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
465 470 475 480
Thr Val Leu
<210> 2
<211> 123
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> FH анти-CD30 домен
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Glu Tyr Thr Trp Phe Ala Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> VL анти-CD30 домен
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
100 105
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> VH анти-CD16A
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 106
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> VL анти-CD16A домен
<400> 5
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<---
1. Комбинация (i) биспецифического антитела, обладающего специфичностью к CD30 и CD16A, в эффективной дозе, где анти-CD30-связывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи, представленный в SEQ ID NO:2, и вариабельный домен легкой цепи, представленный в SEQ ID NO:3, и анти-CD16А-связывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи, представленный в SEQ ID NO:4, и вариабельный домен легкой цепи, представленный в SEQ ID NO:5, и (ii) антагонистического анти-PD-1 антитела в эффективной дозе, выбранного из группы, состоящей из ниволумаба и пембролизумаба, для применения в способе лечения CD30+ лимфомы.
2. Комбинация по п. 1, отличающаяся тем, что биспецифическое антитело представляет собой биспецифическое CD30/CD16A тандемное диатело.
3. Комбинация по п. 2, отличающаяся тем, что биспецифическое CD30/CD16A тандемное диатело имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1.
4. Комбинация по пп. 1-3, содержащая дополнительно агент, модулирующий молекулу контрольной точки иммунного ответа, выбранный из группы антител, состоящей из анти-CD137 антитела и анти-CTLA-4 антитела.
5. Комбинация по п. 4, содержащая биспецифическое антитело, обладающее специфичностью к CD30 и CD16A, анти-CD137 антитело и антагонистическое анти-PD-1 антитело.
6. Применение комбинации
(i) биспецифического антитела, обладающего специфичностью к CD30 и CD16A, где анти-CD30-связывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи, представленный в SEQ ID NO:2, и вариабельный домен легкой цепи, представленный в SEQ ID NO:3, и анти-CD16А-связывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи, представленный в SEQ ID NO:4, и вариабельный домен легкой цепи, представленный в SEQ ID NO:5; и
(ii) антагонистического анти-PD-1 антитела, выбранного из группы, состоящей из ниволумаба и пембролизумаба, для лечения CD30+ лимфомы.
7. Применение по п. 6, отличающееся тем, что лечение включает повышение врожденного иммунного ответа по сравнению с ответом, получаемым при применении только биспецифического антитела, обладающего специфичностью к CD30 и CD16A.
8. Применение по п. 7, отличающееся тем, что повышенный врожденный иммунный ответ представляет собой увеличенную внутриопухолевую инфильтрацию клеток врожденного иммунитета.
9. Применение по п. 8, отличающееся тем, что внутриопухолевая инфильтрация макрофагов, дендритных клеток и NK-клеток повышается.
10. Применение по п. 9, отличающееся тем, что дополнительно повышается внутриопухолевая инфильтрация CD4+ и CD8+ Т-клеток.
11. Применение по любому из пп. 6-10, отличающееся тем, что опухоль представляет собой лимфому Ходжкина.
12. Применение по любому из пп. 6-11, отличающееся тем, что биспецифическое антитело представляет собой биспецифическое CD30/CD16A тандемное диатело.
13. Применение по п. 12, отличающееся тем, что биспецифическое CD30/CD16A тандемное диатело имеет аминокислотную последовательность, как указано в последовательности SEQ ID NO:1.
14. Применение по любому из пп. 6-13, отличающееся тем, что комбинация содержит дополнительно агент, модулирующий молекулу контрольной точки иммунного ответа, выбранный из группы антител, состоящей из анти-CD137 антитела и анти-CTLA-4 антитела.
15. Применение по п. 14, отличающееся тем, что комбинация содержит биспецифическое антитело, обладающее специфичностью к CD30 и CD16A, анти-CD137 антитело и антагонистическое анти-PD-1 антитело.
16. Применение по любому из пп. 6-15, отличающееся тем, что биспецифическое антитело вводят перед антагонистическим анти-PD-1 антителом.
